CN1249001A - 来自游动放线菌SE50/110的Acarboseacb基因簇 - Google Patents

来自游动放线菌SE50/110的Acarboseacb基因簇 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来自游动放线菌SE50/110的acarbose基因簇的生物合成基因,本发明还涉及从游动放线菌中或从假寡糖的生产者中分离该基因,本发明还涉及分离这些生物合成基因的方法,本发明还涉及所述基因编码的蛋白质,本发明还涉及上述蛋白质在异源宿主菌中的表达以及acarbose生物合成基因用于优化制备过程的用途。

Description

来自游动放线菌SE50/110的Acarbose acb基因簇
本发明涉及从放线菌，主要从游动放线菌(Actinoplane sp.)SE50/110及其突变体中分离另外的acarbose生物合成及代谢基因，这些基因与先前已知的生物合成基因位于同一基因簇，本发明还涉及这些基因用于利用游动放线菌和其他acarbose相关天然物质(假寡糖)的生产者制备acarbose及其同系物的用途，本发明还涉及这些基因用于借助生物化学/分子生物学技术优化上述制备过程的用途，此外还涉及这些基因在其他微生物中的异源表达。
大量的放线菌，特别是游动放线菌生成糖苷水解酶的类寡糖抑制剂，尤其生成具有消化活性片段的糖类裂解酶的抑制剂，这一发现构成了以前专利申请(例如，DE2064092和DE2209834)主题的一部分。被称作acarbose的化合物O-4，6-双脱氧-4-[[1S-(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟甲基)-2-环己烯-1-基]-氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖是这组物质的最强的抑制剂[DE2347782]。
Acarbose是α-糖苷酶的强抑制剂，商品名为Glucobay的acarbose被用做治疗糖尿病的口服抗糖尿病药物。
次级代谢物acarbose是由游动放线菌SE50[CBS No.79196]及其天然突变体SE50/110(CBS No.79396)[DE2209834]以及它们的筛选体和突变体生成的。上述专利申请描述了这种类型的α-糖苷酶抑制剂的分离，例如，所述德国专利申请P2209834中的实施例1～4。
在分子生物学方法中，使用基因探针能够直接从一个未定性的基因组中分离出特定的基因，这些探针，例如32P标记过的DNA片段，能够与那些广受欢迎的DNA序列特异性地结合。
进一步还发现，在目前已经研究过的这种次级代谢物的生产者中，放线菌，特别是链霉菌的生物合成基因毗邻分布在染色体上的同一基因簇中，而在质粒上这种现象却极为罕见[Hershberger C.L.，etal.(1989)]。因此，用基因探针能够分离相邻的事先未知的生物合成基因，然后阐明这些基因对于所期望的生物合成的意义。同样，用这些基因探针能够检测其他微生物体内的相应基因。
从acarbose的结构可以推断出，acarbose分子的脱氧葡萄糖部分的形成与各种抗生素的6-脱氧糖残基的生物合成过程(例如，链霉素和春日霉素等氨基糖苷，；红霉素和泰乐菌素等大环内酯；两性霉素A、两性霉素B和制霉菌素等多烯；诺道红菌素等蒽环类抗生素以及万古霉素等糖肽)一致。因此，基因探针和可以异源使用的PCR引物对，均衍生于已知的dTDP-葡萄糖脱水酶酶蛋白的高度保守区。
就游动放线菌SE50/110而言，最初用上述技术分离到一段2.2kb长的BamHI DNA片段并测定了其序列，该序列中含有acbB DNA全序列(编码dTDP-葡萄糖脱水酶)和acbA(编码Dtdp-葡萄糖合酶)和acbC(编码环化酶)的部分DNA序列[EP A 0730029/DE19507214]。其他已知参与acarbose生物合成的酶是来自游动放线菌SE50/110及其突变体的acrviosyl转移酶(为acbD所编码)[DE19626269.5]和acarbose7-磷酸转移酶(为acbK所编码)[Goeke，K.et al.(1996)；Drepper，A.，et al.(1996)]。已知在含有这种特定acrviosin残基的假寡糖中，acrviosyl转移酶能够用其他糖代替acarviosyl结合的糖残基。acarbose7-磷酸转移酶(acarbose激酶)可能参与制备一种形式的acarbose，这种形式使它本身得以被转运出细胞外。此外，acarbose7-磷酸转移酶被认为是自身防御机制的一部分。
Acarbose强烈地抑制生产菌株的胞质α葡糖苷酶，但经acarbose7-磷酸转移酶作用磷酸化后的acarbose便不再具有抑制作用，因此，细胞特异性的底物代谢不被干扰。目前已知氨基环多醇类抗生素的许多产物都具有这种特性的保护性机制。
本专利申请描述了生物合成基因簇和位于游动放线菌SE50/110的18Kb片段上的其他参与acarbose代谢的基因(参看图1～3)。在分离参与acarbose代谢的另外的基因时，令人惊奇地发现，先前已知的生物合成基因acbABC和参与了以下反应的基因一起位于同一基因簇，这些反应包括acarbose的修饰(acarviosyl转移和磷酸化，即基因acbD和acbK)，胞外和胞质内麦芽糖糊精和葡萄糖的代谢(分属α-淀粉酶和4-α-葡聚糖转移酶家族的酶)以及具有结合性能的蛋白质依赖性的糖转运(麦芽糖糊精或二糖摄入胞质内的过程)。就以一种定向的方式优化上述制备方法这一点而言，这一发现对于利用生物技术生产acarbose是切实重要的。之所以这样说是由于这一发现使得利用生物化学/分子生物学技术能够完整地获得acarbose代谢的重要部分，这样得出的一个新观点拓宽了先前专利中所强调的可能性。因此，目前可以通过以下方式影响对于acarbose的合成具有明显重要性的α-1，4葡聚糖前体的供给：淀粉/麦芽糖糊精的降解、摄入/释放以及从寡糖一直到麦芽糖阶段的胞质内变化过程，产物谱的多样性和修饰(如acarbose磷酸化)对于acarbose的分泌和释放出胞外的过程可能是重要的。
因此，本发明涉及从从游动放线菌SE50/110分离另外的生物合成基因，以及这些基因用于为进一步阐释acarbose基因簇而分离邻接DNA区域的用途。
acarbose基因簇的阐释包括acarbose生物合成基因的分离和定性，acarbose基因簇的阐释对于以一种定向的方式来改进生产过程是必不可少的，例如通过
●通过下列手段增强游动放线菌合成acarbose的能力：扩增瓶颈酶的编码基因、使用更有效的启动子以及去除或扩增调控因子。
●增加前体，尤其是来自糖代谢的前体的供给，同时优化下列转运机制：底物转运入细胞和acarbose或经修饰的化合物的分泌。
●通过切断生物合成次要成分的多余途径或者通过切断酶降解反应的多余途径，严格控制游动放线菌的产物谱从而得到所期望的主产物acarbose。
●在异源宿主菌中的表达
为了增加产物而采用一种提高了的空间/时间产率，
为了简化检测方法，以及
为了以特定方式严格控制产物谱。
●使用单个或数个acarbose生物合成基因和人工合成的或微生物生产的前体，体外合成acarbose或其同类化合物。因此，本发明公开：
一个重组DNA分子，其中包括acarbose及其同系物的生物合成基因，这些基因位于图2中所给出的基因簇中。
一个重组DNA分子，它的限制性酶切模式描绘在图1中。
含有上述基因的18Kb片段的DNA全序列列于表1，由此推导出的氨基序列表示在图3中。
表1：acb基因的特性以及Acb基因的产物
基因 基因产物b
名称  起始-末端a  AA 假定功能，相关蛋白
acbA  8914～9838  307  dTDP-葡萄糖合成酶；在与弗氏志贺氏菌RfbA(L14842)重叠217个AA中有58.1％的序列同一性
acbB  8844～7818  341  dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶；在与泥质链霉菌MtmE(Y10907)重叠327个AA中有63％的序列同一性
acbC  6628～7529  381  C7-糖环化酶，类似于脱氢奎宁酸合成酶；在与结核分枝杆菌AroB(X59509)重叠340个AA中有26.8％的序列同一性
acbD  13373～15548  724  acarviosyl转移酶，类似于其他寡聚糊精到多聚糊精转移酶或水解酶；最类似于环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶家族；在与环状芽孢杆菌CdgT蛋白(X68326)重叠734个AA中有41.1％的序列同一性
acbE  12385～9320  1021 α-淀粉酶；在与浅青紫链霉菌(X70255)重叠897个AA中有45.0％的序列同一性
acbF  17515～16537  325 具有结合蛋白质依赖性的ABC乳糖转运蛋白的类MalF膜蛋白；在与集胞蓝细菌sp.PCC6803 LacF蛋白(D90905)重叠251个AA中有29.9％的序列同一性
acbG  16541～15119  252 具有结合蛋白质依赖性的ABC转运蛋白的类MalF膜蛋白；在与嗜热菌RT8.B4(L18965)重叠234个AA中有27.8％的序列同一性
acbH  (18482～17511)  322 具有结合蛋白质依赖性的ABC转运
蛋白的类MalE结合蛋白；在与变异链球菌MsME蛋白(M77351)重叠279个AA中有22.2％的序列同一性
acbK  1991～2894  300  Acarbose 7-激酶，类似于糖激酶和腺苷激酶；在与链霉菌sp.Urf2蛋白，RT8.B4(U08602)它的基因与一个编码α-淀粉酶的基因相邻
acbL  (3966～4988)  340 氧化还原酶，类似于山梨醇脱氢酶；在与流感嗜血菌HI0053蛋白L42023重叠214个AA中有26.6％的序列同一性
acbM  2890～3970  359 功能未知(无明显的相似性)
acbN  (5049～5823)  258 氧化还原酶
acbQ  1～1960  527 麦芽糖糊精葡聚糖转移酶；类MalQ蛋白，在与流感嗜血菌MalQ蛋白(L45989)重叠339个AA中有33.0％的序列同一性
acbO  5819～6627  230 功能未知(无明显的相似性)
a   对应于图3中的BglII-SstI片段上的碱基对的位置序
数，括号内的序列信息是还不完整或与不确定的阅读框
架有关；b   括号内给出的是编入数据库中时的登记号；
AA＝氨基酸；
在上下文(context)中，基因acbA和acbB极有可能编码参与acarbose生物合成的酶，因为它们各自编码的蛋白质AcbA和AcbB分别与已知的细菌dTDP-葡萄糖合成酶和dTDP-葡萄糖4，6-脱水酶具有高度的序列同一性。这些蛋白序列与这两个酶家族的代表之间的相似性，比与来自这两组的其他任意对功能相同的蛋白质之间的相似性要大得多，上述代表在所有情况下都是最接近的。在上下文中，令人奇怪的是，虽然在链霉菌蛋白质中发现了AcbA的最接近的亲缘蛋白，但是AcbB却与革兰氏阴性菌中的各种RfbB蛋白更紧密相关。然而，在其他相应的链霉菌蛋白中也出现了这种现象，例如，来自产泰乐菌素的弗氏链霉菌的TylA1和TylA2[Merson-Daviesh和Cundiffe(1994)]，它们同样是被同一基因簇中的相邻基因编码的。
基因acbC编码一种酶，该酶可能参与了acarbose的生物合成，因为酶AcbC与蛋白AroB，即与脱氢奎宁酸合成酶相关，而且随着在浅青链霉菌中的过量表达，与预想的一样，酶AcbC表达出一种酶活性，能把庚酮糖磷酸盐(例如景天庚酮糖-7-磷酸盐)转化成具有类似于Valienone和Valiolone(acarbose生物合成的可能前体)特性的产物，但这些产物与这些化合物并不相同。
基因acbK(acarbose7-激酶)，acbL(酮糖或醇糖氧化还原酶)和acbM(功能未知)以及acbN-基因(起始/终止密码子重叠表明直接连接到acbL和acbC阅读框架上)可能编码参与acarbose生物合成的酶，因为它们与acbC和可能也包括acbQ一起形成一个可能的操纵子(翻译单元)，并且可能以一种翻译中连接的方式阅读。一种特定的位于胞质中的acarbose激酶(acbK)的功能和一种可能的脱氢酶(acbL)的功能，也为直接参与细胞内acarbose代谢提供了支持；在上下文中，糖脱氢酶AcbL可能参与了C-7环多醇或6-脱氧己糖前体的合成或它们的缩合。
在游动放线菌SE50/110的基因簇中，acbD(acrviosyl转移酶)[DE19625269.5；Gokeke，K.，et al.(1996)；Drepper，A.，etal.(1996)]和acbE(α-淀粉酶)，这两个基因方向相反共用同一个启动子区域，这两种基因所编码的酶都属于淀粉酶家族，这种现象说明，淀粉降解的调节和acarbose的生成二者之间紧密相关。以下发现进一步证实了这一点，当游动放线菌的生长依靠淀粉作为碳源时，这两种酶是培养物上清中表达量最大的胞外蛋白。甚至浅青紫链霉菌中的acbE在自身启动子控制下的表达也发生上述情况(见实施例)。
基因acbH、acbF和acbG所编码物质可能是胞外糖结合蛋白AcbH以及属于ABC输入类型的一种细菌糖转运蛋白的两种典型的膜成分AcbF和AcbG。它们可能通过以下方式来参与acarbose代谢：摄入寡聚麦芽糖糊精，重复利用acarbose或者是作为把短链寡聚-α-1，4-葡聚糖(acarbose的较高同系物)吸收入细胞的运输工具。acbQ基因编码的类似于淀粉麦芽糖的基因产物(AcbQ)也能够参与这种性能的过程。
本发明进一步公开：
一种从放线菌，特别是从游动放线菌中分离acarbose生物合成基因的方法，其特征在于使用了来源于2.2kb长的BamHI片段的基因探针。这个2.2kb长的BamHI片段是借助于用PCR分离的基因探针，从已知的dTDP-葡萄糖脱水酶酶蛋白的高度保守区获得的，有关该片段的描述见专利申请[EP A 0730029/DE19507214]。
一种分离参与放线菌中acarbose-相关天然底物生物合成过程的基因的方法(例如，编码有效霉素、寡糖制菌素(trestatin)和肥胖菌素)。
一种通过下列手段增强放线菌合成acarbose能力的方法
●增加编码具有限速特性的生物合成酶基因的量，
●采用高效启动子增强具有限速特性的生物合成酶的合成，以及
●消除不合需要的调节步骤。
一种通过与限制acarbose合成的生物合成步骤相关的蛋白质技术增强放线菌合成acarbose能力的方法，或者一种避免由于生物合成酶的不合需要的逆反应而导致的产物降解的方法。
一种通过切断生物合成次要成分的多余途径或消除多余的酶降解反应，例如，失活acbD基因，严格控制游动放线菌的产物谱从而得到所期望的主产物acarbose的方法。
一种通过加快底物转运入胞或提高acarbose分泌出胞效率来改变转运机制的方法。
一种在异源宿主菌中实施表达的方法(例如，生成假寡糖的链霉菌以及在浅青紫链霉菌等其他链霉菌中，在大肠杆菌等快速生长的细菌或在酵母和真菌中)。
●    为了增加产物而提高空间/时间产率，
●    为了简化检测方法，以及
●    为了以一种定向的方式严格控制产物谱。
使用acarbose生物合成基因体外合成acarbose或其同类化合物的方法，合成过程从人工合成的或微生物生产的前体开始。
下面是本发明的详细描述。此外，本发明也通过权利要求的内容来说明。
除其他另有说明外，所有遗传工程的操作方法均按照Sambrook等人(1989)所描述的方法进行。
使用三种不同的基因探针进行筛选。它们是从质粒pAS2、pAS5/7.3和pAS6/3中得到的。质粒pAS2是通过“煮沸裂解法”或通过碱裂解结合限制性内切酶BamHI消化的方法从E.coli DH5α中制备得到的。分离所制得的2.2kb长的BamHI片段，并通过所谓切口平移的方法用32P标记的脱氧核苷酸标记上述片段。用这个放射性标记的片段作为探针分离acarbose生物合成基因，以下称该标记片段为acb探针II。第二个基因探针是从质粒pAS5/7.3中分离的。分离SphI-SstI片段并按照上述方法进行放射性标记。以下称该基因探针为探针III。第三个基因探针是从质粒pAS6/3中分离的。分离BamHI片段并按照上述方法进行放射性标记。称该探针为acb探针IV。
用两种不同的方法分离acarbose生物合成基因，具体如下：
1)用限制性内切酶SsfI、BglII和PstI消化来自游动放线菌的染色体DNA，并用凝胶层析的方法分离限制性片段，然后采用acb探针II(SstI和BglII消化)或acb探针III(PstI消化)通过Southern杂交筛选同源DNA序列。用基因探针杂交得到的SstI片段的长度大约为10.7kb，BglII片段的长约10.2kb。从凝胶中洗脱出上述10.7kb长的SstI片段和12kb长的BglII片段，并将它们分别连接到载体pUC18和pBluescript II KS中，然后克隆到E.coli DH5α中。所得质粒定名为pAS5(SstI片段)和pAS6(BglII片段)。用acb探针III杂交所得的一段2.8kb长的PstI片段与SstI片段重叠，将PstI片段克隆入pUC18载体中，得到名为pMJ1重组质粒。
2)用acb探针III和acb探针IV通过嗜斑杂交对游动放线菌基因组DNA的GEM12噬菌体文库进行筛选。总计，用acb探针III筛选到15个嗜斑，而用acb探针IV筛选到2个嗜斑，这些嗜斑中包括内含acarbose生物合成基因的总(a total of)长约38.5 kb的共线性游动放线菌DNA。这些嗜斑的特征在于更详细地命名为10/3和5/4。通过用PstI酶消化和将一个2.8kb长的PstI片段克隆入质粒pUC18中从嗜斑10/3中得到质粒pMJ1。通过用SstI酶消化和接着克隆入质粒pUC18中(SstI消化的)从嗜斑5/4中得到质粒pMJ9(6.3kb片段)。
为了测定游动放线菌10.7kb长的SstI片段(pAS5)的序列，从pUC18开始构建下述重组质粒，分析所插入的DNA片段的序列：PAS5    来自放线菌染色体DNA的10.7kb的SstI片段PAS2    来自放线菌染色体DNA的2.2kb的BamHI片段(见专利
    申请DE19507214)PAS5/15 来自pAS5的3.8kb的HindIII/SstI片段(见专利申请
    DE19625269.5)
    pAS5/15.1  ＝来自pAS5的2.6kb的HindIII/PstI片段
    pAS5/15.2  ＝来自pAS5/15.1的0.75kb的salI片段
    pAS5/15.3  ＝来自pAS5/15.1的0.5kb的salI片段
    pAS5/15.4  ＝来自pAS5/15.1的0.4kb的salI片段
    pAS5/15.5  ＝来自pAS5/15.1的0.35kb的salI片段
    pAS5/15.6  ＝来自pAS5/15.1的1.25kb的PvuII片段
    pAS5/15.7  ＝来自pAS5/15.1的0.7kb的PvuII/
               HindIII片段
    pAS5/15.9  ＝来自pAS5/15.1的0.1kb的PvuII片段
    pAS5/15.11 ＝来自pAS5/15的1.1kb的KnpI/NcoI片段
    pAS5/15.12 ＝来自pAS5/15的0.9kb的KnpI/NcoI片段用PCR方法扩增三个DNA区域，克隆得到的相应片段并测序：
    pAS5/17    ＝0.46kb的PCR片段
    pAS5/18    ＝0.26kb的PCR片段
    pAS5/19    ＝0.27kb的PCR片段pAS5/6 来自质粒pAS5的5.4kb的PstI片段
    从pAS5/6开始用外切核酸酶III和S1核酸酶制备克
    隆，然后用XhoI和SstI消化：
    pAS5/6.3-15＝5.1 kb的DNA插入片段
    pAS5/6.12-4＝4.7 kb的DNA插入片段
    pAS5/6.3-18＝4.3 kb的DNA插入片段
    pAS5/6.6-3 ＝4.2kb的DNA插入片段
        pAS5/6.9-2    ＝3.8kb的DNA插入片段
        pAS5/6.9-6    ＝3.8kb的DNA插入片段
        pAS5/6.12-6   ＝3.2kb的DNA插入片段
        pAS5/6.3-6    ＝3.0kb的DNA插入片段
        pAS5/6.15-1   ＝2.8kb的DNA插入片段
        pAS5/6.3-16   ＝2.3kb的DNA插入片段
        pAS5/6.9-1    ＝1.8kb的DNA插入片段
        pAS5/6.9-3    ＝1.2kb的DNA插入片段
        pAS5/6.6-1    ＝0.9kb的DNA插入片段
        pAS5/6.12-3   ＝0.47kb的DNA插入片段
        pAS5/6.12-2   ＝0.17kb的DNA插入片段pAS5/3    来自质粒pAS5的1.4kb的BamHI片段
        pAS5/3.1      ＝来自质粒pAS5/3的0.35kb的
                      SphI/FspI片段
        pAS5/3.2      ＝来自质粒pAS5/3的0.85kb的SphI/
                      BamHI片段
        pAS5/3.3      ＝来自质粒pAS5/3的0.55kb的SphI/
                      BamHI片段pAS5/4    来自质粒pAS5的1.2kb的BamHI片段pAS5/5    来自质粒pAS5的0.48kb的SstI/BamHI片段pAS5/7    来自质粒pAS5的1.2kb的PstI/SstI片段pAS5/7.1  来自质粒pAS5/7的0.64kb的PvuII/AccI片段pAS5/7.2  来自质粒pAS5/7的0.54kb的PstI/SphI片段pAS5/7.3  来自质粒pAS5/7的0.67kb的SphI/SstI片段pAS5/11   来自质粒pAS5的0.68kb的BglII/HindIII片段pAS5/12   来自质粒pAS5的0.63kb的BglII/PstI片段pAS5/13   来自质粒pAS5的4.8kb的BamHI/SstI片段pAS5/16   来自质粒pAS5的0.5kb的BamHI片段
为了确定DNA序列而构建的质粒包括来自质粒pAS6(参看实施例6)的内含游动放线菌的acarbose生物合成基因的片段。克隆到质粒pAS6中的DNA包括一个内含acarbose生物合成基因的6.2kb的BglII/SstI片段，pAS5中也包括这个片段。为了测定连接到pAS5中的5.9kb的BglII/SstI片段(图1)的序列，在pUC18载体的基础上构建下列重组质粒。pMJ6/6  来自质粒pAS6的5.9kb的BglII/SstI片段
    PMJ6/4.2     来自质粒pAS6/6的0.5kb的BamHI/PstI片段
    PMJ6/4.1     来自质粒pAS6/6的0.36kb的BamHI/PstI片段
    PMJ6/6.2.2   0.5kb的SalI重连片段
    PMJ6/6.2.3   3.3kb的SalI片段
    pMJ6/6.2.4   1.2kb的SalI片段
    pMJ6/6.2.5   1.0kb的SalI片段
    pMJ6/6.2.6   0.7kb的SalI片段
    pMJ6/6.2.7   0.14kb的SalI片段
    pMJ6/6.2.8   0.13kb的SalI片段
    pMJ6/8.1     1.1kb的ClaI/BamHI片段
    pMJ6/10      1.5kb的PstI/SalI片段PAS6/3来自质粒PAS6的2.8kb的BamHI片段
    PAS6/3.1     来自质粒PAS6/3的1.1kb的HincII片段
    PAS6/3.2     来自质粒PAS6/3的1.2kb的SalI片段
    PAS6/3.3     来自质粒PAS6/3的1.45kb的PstI片段
为了确定游动放线菌2.8kb长的PstI片段(pMJ1)的序列，构建下列质粒并分析插入片段的序列。
      pMJ1/1     来自质粒pMJ1的0.6kb的SphI/PstI
                 片段，SphI消化后的重连片段。
      pMJ1/2     来自质粒pMJ1的1.2kb的SalI/PstI
                 片段，SalI消化后的重连片段。
      pMJ1/3     来自质粒pMJ1的1.4kb的SstI/PstI
                 片段，SstI消化后的重连片段。
    pMJ1/4.1    来自质粒pMJ1的0.9kb的SalI片段。
用Sanger等人(1977)的方法或其衍生出的方法进行DNA测序。采用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)结合自动激光荧光标记DNA测序仪(ALF)(Pharmacia，Freiburg，Germany)完成测序。合适的荧光标记的pUC反向测序引物和正向测序引物均可以购买获得(Pharmacia，Freiburg，Germany)。长约18.0kb的BglII/PstI片段的序列列于图3。表1总结了acb基因及其所编码的产物的特性。
表2用于PCR及测序反应的引物的序列。
用于PCR扩增的引物：
质粒pAs5/17：
质粒名称            序列
acbD/E1             5′GGCGGCGATTCGGCCTGCGCGG3′
acbD/E2             5′GCGGCGATGGCATGCCTGGCG3′
质粒pAs5/18：
质粒名称            序列
acbD3               5′ACCAGGCCGAGGACGGCGCCC3′
acbD4               5′AGCGGCATGTGCTTGACGGCG3′
质粒pAs5/19：
质粒名称            序列
acbD5               5′ACCGGCTCGAACGGGCTGGCACC 3′
acbD6               5′CCCTCGACGGTGACGGTGGCG 3′扩增acb基因的引物：
带有下划线的序列区段被用来构建限制性内切酶NdeI和EcoRI的识别位点。
引物名称            序列
AS7                 5′GGAAGCTCATATGAGTGGTGTCG3
AS8                 5′CGAGACGGTACATATGCACGCGGATG3’
AS9’               5′CCGTCTCGCCCACCCGCATCACC3’
AS-C1’             5′AGGGAAGCTCATATGAGTGGTGTCGAG3’
AS-C2               5′GGTATCGCGCCAAGAATTCCTGGTGGACTG3
用于测序的引物
引物名称            序列
通用引物          5′GTAAAACGACGGCCAGT3′
反向引物          5′GAAACAGCTATGACCATG3′
用一种购自Applied Biosystems的473A气相蛋白测序仪(Forster City，CA，USA)和标准的快速印迹蛋白测序程序(standardfastblott protein sequencing programme)分析Acb蛋白的N端序列。上述蛋白测序仪、不同的程序、断裂循环以及PTH鉴定系统在测序仪的使用手册中都有详细描述(使用手册；蛋白测序系统模型473A(1989)；Applied Biosystems，Forster City，CA 94404，USA)。
用一个Applied Biosystems RP 18柱(220mm×2mm，5μ原料)联机检测PTH氨基酸。用50pmol标准液对PTH氨基酸进行鉴定和定性。用Applied Biosystems 610A测序仪资料系统处理所得资料。
蛋白测序仪所用的所有化学物质都由Applied Biosystems提供。
实施例：1.培养大肠杆菌菌株、制备质粒DNA以及DNA片段的分离
在37℃下用LB培养基培养E.coliDH5α。在选择压力(氨苄青霉素，100μg/ml)的作用下筛选得到带有质粒的菌株。在转速为270rpm的摇床上振荡培养细菌。过夜培养(OC)标明(designate)已经培养了至少16h的菌样。
从经选择培养后的过夜培养物1.5ml中提取细胞。用SDS碱裂解法[Birnboim，H.C.，J.Doly(1979)]提取质粒。
按照产品说明(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，使用专门的限制性内切酶特定地消化载体DNA。取相关的限制性内切酶5U消化10μg质粒DNA，37℃保温消化2h。为了确保消化完全，再加入等量的限制性内切酶，并将上述混合物再继续保温消化至少1h。
用水平琼脂糖凝胶电泳分离切割后的DNA，琼脂糖凝胶的浓度因DNA片段的大小而变化，其范围为0.5～1.2％。洗脱前，用无菌的手术刀片切出含有DNA片段的凝胶块并称重。然后用JET吸附试剂盒(Genomed，Bad Oeynhausen，Germany)按照说明书上的方法洗脱出上述DNA片段。2.培养游动放线菌SE50/110、制备和切割染色体DNA以及凝胶电泳分离片段
游动放线菌SE50/110在TSB培养基中30℃振荡培养3d。种培养物(5ml)在培养管中240rpm振荡培养，而培养物的主要部分在500ml的挡板烧瓶(baffled flask)中100rpm振荡培养。培养后，离心取细胞沉淀，并用TE buffer洗涤两次。
取1.5～2mg(鲜重)细胞，用酚/氯仿抽提法(Hopwood，D.A.，et al.(1985))制备总DNA。
取20μg染色体DNA，用相应的限制性内切酶(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)10U在适当的缓冲液中37℃消化2h。为了确保消化完全，再加入等量的限制性内切酶，并将上述混合物再继续保温消化至少1h。
用水平琼脂糖凝胶电泳分离切割后的DNA。用JET吸附试剂盒(见实施例1)再一次洗脱出上述DNA片段。3.acb基因探针II、acb基因探针III和acb基因探针IV的制备
按照实施例1中的方法，从质粒pAS2(见DE19507214)、pAS5/7.3和pAS6/3中制备片段，并用Gibco BRL，Eggenstein，Germany提供的切口平移系统按照前者提供的说明书对片段进行放射性标记。按照这种方法用[α-32P]dCTP(3000 Ci/mM；Amersham Buchler，Braumschweig)标记0.5～1.0μg的DNA片段。然后将混合物煮沸10分钟(变性)，立即加入杂交溶液(见实施例4)。4.把DNA转移到膜上以及DNA的杂交(Southern杂交和放射自显影)
用Southern杂交方法[Southern，E.M.(1975)]把DNA片段从琼脂糖凝胶中转移到杂交膜上。将按照实施例2的方法获得的琼脂糖凝胶在0.25M HCl中摇动20分钟。把凝胶置于3层叠放的Whatman 3 MM吸水性滤纸(Whatman，Maidstone，GB)上，然后再在上面放置一张HybondTM-N-杂交膜(Amersham Buchler，Braumschweig)同时排尽气泡。然后再在膜的上面放几层吸水纸，最后在这个洗滤垛上放置约1kg的一重物。利用0.4 M NaOH的吸取(sucking)转移DNA。在经过至少12h转移后，将尼龙滤膜放入2×SSC漂洗两次，空气中晾干。
然后，把尼龙滤膜放入50～100ml的预杂交溶液，68℃水浴振荡至少12h。在此期间更换溶液。在杂交盒中进行至少12h的杂交。使用15ml含有acb探针II(见实施例3)的杂交溶液。
然后，用6×后洗液(postwash)和1×后洗液各漂洗尼龙滤膜15分钟。在尼龙滤膜未干前，上面覆盖一层抗滑膜(clingfilm)。在配有增感屏的防光暗盒中用Hyperfilm-MP(Amersham Buchler，Braumschweig)-80℃条件下放射自显影至少16h。5.从游动放线菌总DNA中分离和克隆BglII、PstI和SstI片段
用BglII、PstI和SstI彻底消化游动放线菌染色体DNA，用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物；从凝胶中洗脱出长约9.0～12kb的SstI片段、长约11～13kb的BglII片段和长约2.5～3.5kb的PstI片段。(见实施例1)。把洗脱出的SstI片段和PstI片段分别连接到从E.coli DH5α中制备得到的并用SstI和PstI消化后的质粒载体pUC18中。该载体已经被按照产品说明书用碱性磷酸盐(Boehringer，Mannheim)预先处理过。连接反应在20μl体积的溶液中进行。混合物中目的片段与载体之间的比例为3∶1，其中含有的DNA的量为0.01～0.1μg。使用T4 DNA连接酶及其配套缓冲液(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。把洗脱出的BglII片段连接到用BamHI消化过的质粒载体pBluescript II KS中，连接反应与SstI片段和PstI片段相同。
用完全连接后的混合物[见Hanahan，D.的方法(1983)]转化E.coli DH5α的感受态细胞。把具有氨苄青霉素抗性的转化菌转移到LB-Amp选择培养平板(100μg/ml)上。6.对含有来自acarbose生物合成基因簇中的以下片段的克隆进行鉴定：10.7kb的SstI片段、12kb的BglII片段、2.8kb PstI片段和6.3kb的SstI片段
检测具有氨苄青霉素抗性的转化菌中是否含有10.7kb的SstI片段和12kb的BglII片段，其中后者采用acb探针II杂交。
上述两个克隆每个各划线10个选择性培养基平板，过夜培养，然后用3ml LB培养基把这些细菌从平板上的洗脱下来，然后从由上述两个克隆的各10块平板得到的20个pools中，提取质粒DNA[采用Birnboim，H.C.和J.Doly(1979)的方法]。为了从多接头中切除SstI片段，用限制性内切酶EcoRI和HindIII以及SstI和HindIII两两配对分别消化这20个不同的质粒提取物。然后在0.6％的琼脂糖凝胶上电泳分离限制性片段混合物，接着通过Southern转移的方法把DNA片段从琼脂糖凝胶中转移到尼龙滤膜上(见实施例4)。用acb探针II再进行一次杂交(见实施例4)。所有情况下都有一个pools与acb探针II反应成阳性，然后把它分成10个单个克隆。同样从它们中提取质粒，并按上述方法对这些质粒进行操作。发生杂交的质粒称为pAS5和pAS6。它们分别带有一个10.7 kb的SstI片段(pAS5)和一个12kb的BglII片段(pAS6)。
用PstI消化重组噬菌体10/3，然后用水平琼脂糖凝胶分离切割后的DNA；从凝胶块中洗脱出上述10.7kb的PstI片段，并将其连接到pUC18载体上。定名重组质粒为pMJ1，并将其转化到E.coli DH5α中。
用SstI消化重组噬菌体5/4，然后用水平琼脂糖凝胶分离切割后的DNA；从凝胶块中洗脱出上述6.3kb的SstI片段，并将其连接到pUC18载体上。定名重组质粒为pMJ9，并将其转化到E.coli DH5α中。7.GEM12文库的构建、带有acarbose生物合成基因的重组噬菌体的分离以及噬菌体DNA的制备。
用Sau3AI部分消化游动放线菌染色体DNA。为了达到上述目的，在50μg游动放线菌染色体DNA中加入Sau3AI 0.015 U，37℃下消化30min。通过酚抽提以及氯仿和乙醇沉淀终止酶切反应，(Sambrooket al.(1989))。进一步处理DNA片段，并按照产品的说明书(PromegaHeidelberg)的方法将其连接到噬菌体载体GEM12中。用Boehringer(Mannheim)提供的DNA-包装试剂盒体外包装连接混合物。用Sambrook等人(1989)所公开的方法进行用E.coli LE392增殖噬菌体。用acb探针III和acb探针IV通过嗜斑杂交(Sambrook等人所公开的方法，1989)鉴定含有acarbose生物合成基因的噬菌体。用Sambrook等人(1989)所公开的方法从用E.coli LE392增殖后的噬菌体中制备含有acarbose生物合成基因的噬菌体DNA。8.多聚酶链反应
体外用PCR的方法扩增DNA目的区域[Mullis，K.B.，F.A.Fallona(1987)]。所有扩增反应中，均按照产品(Gibco BRL，Eggenstein)说明书使用的方法，使用Taq DNA多聚酶进行25个反应循环。在DNA富含GC时，为了抑制可能出现的次生结构，向混合物中加入5％的甲酰胺。100μl的反应体积中每种引物各加入50pmol，dNTP的反应浓度为200μM。首先，95℃DNA变性5分钟，然后在热启动的情况下向反应混合物中加入2.5 U的耐热的DNA多聚酶。在72℃下进行引物延伸，在每个循环的开始首先95℃DNA变性1分钟。反应在Biometra热循环仪中进行(Gttingen)。
表3从acarbose基因簇中PCR扩增DNA片段的方法。
表中列出了含有相应片段的重组质粒的名称。
片段大小 引物复性 引物延伸 重组质粒
 0.46kb0.26kb0.27kb  72℃、20sec68℃、20sec68℃、20sec  72℃、20sec72℃、20sec72℃、20sec  pAS5/17pAS5/18pAS5/19
9.质粒pAS5的亚克隆
为了阐明双股DNA的序列，从质粒pAS5中制备数个亚克隆。
pAS5/6用限制性内切酶PstI消化质粒pAS5，用凝胶电泳(0.7的琼脂糖凝胶)分离消化产物；从凝胶中洗脱出5.4kb的PstI片段，并将其克隆到pUC18(用PstI消化过的)中，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pAS5/3；pAS5/4；pAS5/13和pAS5/16  用限制性内切酶BamHI消化质粒pAS5，用凝胶电泳分离消化产物。片段大小如下：1.4kb的BamHI片段1.2kb的BamHI片段2.3kb的BamHI片段0.5kb的BamHI片段0.45kb的BamHI片段7.5kb的BamHI片段(＝被连接到pUC18中的4.8kb的BamHI片段)
预期用于亚克隆的片段的大小为1.4kb和0.5kb，把它们从凝胶中洗脱出来(见实施例1)。按照实施例1的方法用限制性内切酶BamHI制备用于亚克隆的pUC18载体。按照实施例5的方法进行连接反应。把0.5kb的片段连接到预先制备好的pUC18中得到亚克隆pAS5/16。亚克隆pAS 5/3是把1.4kb的片段连接到预先制备好的pUC18中得到的。亚克隆pAS 5/4是把1.2kb的片段连接到预先制备好的pUC18中得到的。亚克隆pAS 5/13是把7.5kb的片段连接到预先制备好的pUC18中得到的。
pAS5/5；pAS5/7；pAS5/11和pAS5/12用限制性内切酶BamHI和SstI、PstI和SstI、BglII和PstI以及BglII/HindIII消化质粒pAS5，用1.2％的琼脂糖凝胶分离消化产物。从琼脂糖凝胶中洗脱出目的片段(用BamHI和SstI、PstI和SstI、BamHI和PstI或BamHI/HindIII消化得到的)，并将其连接到pUC18中，然后把重组质粒转化到E.coliDH5α中。亚克隆pAS5/5包括0.48kb的SstI/BamHI片段，亚克隆pAS5/12包括0.63 kb的BglII和PstI片段，亚克隆pAS5/11包括0.68kb的BglII/HindIII片段。
pAS5/15.11；pAS5/15.12用限制性内切酶NcoI和KnpI消化质粒pAS5。从1.2％的琼脂糖凝胶中洗脱出0.9kb的NcoI/KpnI和1.1kb的NcoI/KpnI目的片段(见实施例1)，并将这两个片段克隆到载体pUCBM21中，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中得到亚克隆pAS5/15.12(0.9kb的片段)和pAS5/15.11(1.1kb的片段)。
10.质粒pAS6和pMJ6/6以及噬菌体5/4的亚克隆
pMJ6/6：用用限制性内切酶SstI消化质粒pAS6(利用载体上的限制性切割位点)，从琼脂糖凝胶中洗脱出5.9kb的SstI片段，并将其连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ6/4.1和pMJ6/4.2用限制性内切酶BamHI和PstI消化质粒pAS6/6，得到一个0.36 kb的BamHI/PstI片段和一个0.5 kb的BamHI/PstI片段，把这两个片段从凝胶中洗脱出来，并将其连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ6/6.2.2、pMJ6/6.2.3、pMJ6/6.2.4、pMJ6/6.2.5、pMJ6/6.2.6、pMJ6/6.2.7和pMJ6/6.2.8：用限制性内切酶salI消化质粒pMJ6/6，从凝胶中洗脱出所得到的大小为3.3 kb、1.2 kb、1.0 kb、0.7 kb、0.14 kb和0.13 kb片段各一个，把这些片段连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。通过消化和亚克隆得到pMJ6/6.2.2。
pMJ6/8.1：用限制性内切酶ClaI和BamHI消化质粒pMJ6/6，从凝胶中洗脱出1.1 kb的片段，并将其连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ6/10：用限制性内切酶PstI和SalI消化质粒pMJ6/6，从凝胶中洗脱出1.5 kb片段，并将其连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ6/3：用限制性内切酶BamHI消化质粒pAS6，从凝胶中洗脱出2.8 kb片段，并将其连接到pUC18中；然后把重组质粒转化到E.coliDH5α中。
pMJ6/3.1：用限制性内切酶HincII消化质粒pAS6/3，把得到的1.1 kb的片段连接到预先用HincII消化过的pUC18中，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ6/3.2：用限制性内切酶salI消化质粒pAS6/3，把得到的1.2kb的片段连接到预先用salI消化过的pUC18中，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ6/3.3：用限制性内切酶PstI消化质粒pAS6，从凝胶中洗脱出1.45 kb片段，并将其连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coliDH5α中。
11.质粒pMJ1的亚克隆
pMJ1/1：用限制性内切酶SphI消化质粒pMJ1，从凝胶中洗脱出3.3 kb的SphI片段(把0.6 kb的SphI/PstI片段连接到pUC18中)。把这个片段再连接，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ1/2：用限制性内切酶SalI消化质粒pMJ1，从凝胶中洗脱出3.9 kb的salI片段(把1.2 kb的SalI/PstI片段连接到pUC18中)。把这个片段再连接，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ1/3：用限制性内切酶SalI消化质粒pMJ1，从凝胶中洗脱出4.1kb的SstI/PstI片段(把1.4 kb的SstI/PstI片段连接到pUC18中)。把这个片段再连接，然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
pMJ1/4.1：用限制性内切酶SalI消化质粒pMJ1，从凝胶中洗脱出0.9 kb的SalI/SmaI片段，并将其连接到pUC18中。然后把重组质粒转化到E.coli DH5α中。
12.制备pAS5/6的亚克隆
用双股巢式缺失(deletion)试剂盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)制备pAS5/6亚克隆。按照实施例1的方法制备10μg pAS5/6DNA，并用XhoI和SstI各10 U消化该DNA。接下来按照产品说明书用外切核酸酶III温育20min。每隔5min从混合物中取出等份试样，其中DNA的含量约2.5μg。为了制备非突出DNA末端，上述等份试样按照产品说明书的方法均在20℃下用S1核酸酶处理30min。然后用T4 DNA连接酶再连接(religated)这些DNA分子，并克隆入E.coliDH5α中。
13.游动放线菌acarbose生物合成基因DNA序列的测定
对实施例8～11中的质粒进行序列测定。从制备的溶液(实施例1)中取出6～8μl质粒DNA进行测序反应。测序使用自动读取测序试剂盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)。采用用于dsDNA测序的标准方法。为了在序列分析中能够使用A.L.F.(自动激光荧光标记(DNA)测序仪)，测序反应的起始分子选用荧光标记的通用引物和反向测序引物(见表2)。制备凝胶的方法如下，取Hydro Link LongRanger(Serva，Heidelberg)8ml、尿素33.6g和10×TBE buffer8ml，加水补足至80ml并混合，过滤除菌并除气1分钟。加入10％(W/V)的过硫酸铵350μl和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺40μl启动聚合。在凝胶加样孔(50×50×0.05cm)中加入上述溶液。在38W下45℃恒温电泳。用1×TBE buffer做电泳缓冲液。连接到测序仪上的电脑(Compaq 386/20e)把测得的荧光转化成DNA序列，该电脑还能够控制该电泳单元(A.L.F.Manager 2.5 program；Pharmacia，Freiburg)。
14.浅青紫链霉菌的转化
用Babcock和Kendrick的方法(1988)制备浅青紫链霉菌TK23和1326的原生质体并转化，用TSB-PEG 8000培养这些细胞。
15.AcbC的过量表达
15. 1.AcbC在大肠杆菌中的过量表达
基因acbC的DNA序列显示，AcbC的翻译有两个可能的起始位点(start point)。由于具有一个更重要的核糖体结合位点的原因，AcbC的翻译很可能是从起始位点1开始的，尽管这样，这两种可能的蛋白都被过量表达。因此，大肠杆菌中的表达使用质粒pET11a和pET16b(Novagen，Heidelberg)。为了确保过量表达从优选的翻译起始位点开始，应该用pET载体的ATG起始密码子，该密码子与类大肠杆菌RBS的距离合适。为了实现这一点，就需要在acbC的起始密码子上构建NdeI识别位点。用上述寡核苷酸AS7(序列位置6617)和AS8(序列位置6638)在两个可能的起始密码子上合成NdeI识别位点。寡核苷酸AS9结合到序列位置6887处的BamHI识别序列的下游的66bp的DNA片段上。用PCR方法(实施例8)扩增用来表达两个可能的AcbC蛋白的两个DNA片段。引物在45℃复性40sec，延伸30 sec。用限制性内切酶NdeI和BamHI消化上述两扩增产物，并将它们对应连接到载体pET11a和pET16b中。从重组质粒pAS2中分离出2.2kb的BamHI片段[EP A 0730029/DE19507214]，并通过BamHI识别位点将其融合到克隆后的PCR片段中。检查了2.2kb的BamHI片段的方向后，完整的acbC基因出现在表达载体中。这些表达载体定名为pAS8/1～pAS8/4(图4)。此外，表达载体中的克隆DNA上出现完整的acbB基因阅读框(相反方向)和acbA基因的起始部分。这些载体中的每一个都能鉴定一个表达在IPTG诱导的E.coli BL21pLys培养物中的外源蛋白。表4中列出了过量表达的AcbC蛋白的大小。然而，这些蛋白都以不溶性的包涵体的形式合成的。
表4.用于大肠杆菌表达的AcbC表达载体的结构
重组质粒 起始位点 质粒载体 重组蛋白
 pAS8/1  1  pET11a  42kDa
 pAS8/2  2  pET11a  41kDa
 pAS8/3  1  PET16b  44.5kDa
 pAS8/4  2  PET16b  43.5kDa
15. 2在浅青紫链霉菌1326中过量表达AcbC蛋白
在浅青紫链霉菌1326中，用质粒载体pIJ6021表达AcbC蛋白[Takano，E.，et al.(1995)]。用PCR方法[Mullis和Fallona(1987)]从染色体DNA中扩增只含有编码区的片段。寡核苷酸ASC-1和ASC-2用于PCR扩增，在acbC基因的起始密码子2上用ASC-1引物(序列位置6089)构建一个NdeI识别序列。寡核苷酸ASC-2结合到序列位置7882上，用ASC-2构建一个EcoRI识别序列。引物在50℃复性20sec，延伸40sec。把首先得到的acbC DNA片段平端克隆到pUC18载体中，并检查PCR扩增的忠实性。把含有克隆后的acbC基因的重组质粒命名为pAS8/5.1。用限制性内切酶NdeI和EcoRI消化质粒pAS8/5.1。琼脂糖凝胶分离DNA，然后从凝胶块中洗脱出上述DNA，把用这种方法制备的片段连接到载体pIJ6021中。把重组后的表达质粒转命名为pAS8/7.2(图5)。用质粒pAS8/7.2转化浅青紫链霉菌的原生质体。得到的克隆在硫链嗜菌肽诱导的培养物中以可溶性形式过量表达AcbC蛋白(图6)。
16在浅青紫链霉菌TK23中过量表达AcbE蛋白
通过用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒，从质粒pAS5/6.9-6中分离AcbE基因。琼脂糖凝胶分离DNA，然后从凝胶块中洗脱出3.8kb的EcoRI/HindIII片段，把AcbE片段正确地连接到载体pUWL219中[J.Wehmeier，U.F.(1995)]。本发明用这些载体上游区域200bp处可能的启动子序列在浅青紫链霉菌中表达AcbE(见表5)。该重组质粒定名为pAS11(图7)。
表5基因acbE和acbD之间的顺反子间区。下划线部分是能够参与调节的反向重复序列(IR)和同向重复序列(DR)。
←    CGT GGA CCC TCT CTC GCG ATC GCT GGG ACG CTA GCC CGG CGG GAG ACG TGC CCG CAA GAA
AcbE  GCA CCT GGG AGA GAG CGC TAG CGA CCC TGC GAT CGG GCC GCC CTC TGC ACG GGC GTT CTT
               IR I
      CTT GCT GTT TTA GCA AGA AGT TTC AGA ACC GGG ACG GCA CGC TGT AGC CCA GAT CAT AGA
      GAA CGA CAA AAT GCT TCT TCA AAG TCT TGG CCC TGC CGT GCG ACA TCG GGT CTA GTA TCT
                             Hind III                             IR2
      TAC TTA AAG CTC TGC GCA AGC TTA GGG TTG AAG TGG CGG TGA TGC ATC CAT CAC TGT ATG
      ATG AAT TTC GAG ACG CGT TCG AAT CCC AAC TTC ACC GCC ACT ACG TAG GTA GTG ACA TAC
                                      IR   3                                DRI
      CGC ATC TGA ATG ACG TCT TCT GCA AGT TCT TGC AGC GGT CTC CGG GCC CTG CCC TTC CTC
      GCG TAG ACT TAC TGC AGA AGA CGT TCA AGA ACG TCG CCA GAG GCC CGG GAG GGG AAG GAG
      GTC ATC CCT TCA CAA GGA GAA GCT C     AcbD
      CAG TAG GGA AGT GTT CCT CTT CGA G     →
用质粒pAS11转化浅青紫链霉菌TK23的原生质体。在使用浅青紫链霉菌TK23/pAS11样品和游动放线菌样品两种情况下，在MD 50培养基上清中都能检测到大小为110 kDa的胞外蛋白(图8)。这种蛋白的大小对应于源于acbE的蛋白的分子量。通过合适的酶实验(见实施例19，2)以及通过N端氨基酸序列的测定(见实施例18)说明了这些蛋白的同一性。MD50培养基培养的对照用浅青紫链霉菌TK23/pUWL219培养物的上清中检测不到相应的蛋白。这说明acbE基因上游的可能的启动子序列(表5)启动了AcbE在用MD50培养基培养的浅青紫链霉菌TK23/pAS11中的表达。
17.凝胶电泳制备蛋白质
按照Lugtenberg方法(1975)，用变性SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，考马斯染液染色。根据样品的不同选用8％或者11％的凝胶。
凝胶组成(11％凝胶)
分离胶 积层胶
溶液A*溶液B*APS(2mg/ml)10％(W/W)的SDS0.75M的tris/HCl，pH8.80.25M的tris/HCl，pH6.8蒸馏水TEMED  8.0ml0.8ml0.64ml16ml6.56ml25μl 0.64ml0.15ml0.064ml3.2ml10μl
*见缓冲液和溶液
用SERVA蓝垂直100/C装置(凝胶体积，80×100×0.75mm)或Renner双垂直装置(凝胶体积，180×170×1mm)电泳。
用Biorad，Munich，蛋白分析确定被分析的样品的蛋白质浓度，用BSA建立校准曲线。用Sigma(Deisenhofen)提供的VIIL道尔顿标准参照物(14.2kDa～66kDa)和高分子量标准参照物作为标准，确定被分离蛋白的大小。
18.N端氨基酸序列的测定
确定源于游动放线菌的AcbE蛋白和浅青紫链霉菌TK23/pAS11克隆的N端氨基酸序列，并加以比较。为此目的，50ml培养物在MD50培养基中温育3天。离心除去细胞，上清在透析(against)缓冲液(5mM tris/HCl，pH7.5，1mM CaCl2)中透析12h。接着把上清冻干48h，然后把冻干基溶解在1.5ml的载样缓冲液中。把这样制备好的培养物上清用Renner双垂直装置(凝胶体积，180×170×3mm)通过SDS-PAGE分离。为了确保AcbE蛋白从胞外蛋白中最大限度的分离开来，实验采用了梯度凝胶电泳(5％→10％)。按照产品说明书的方法，用快速转印B33装置(Fast Blot B33 apparatus)(Biometra Go--ttingen)通过半干法把蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到聚氟乙烯(PVDF)膜上。在250mA下转移45min。电泳缓冲液1∶2稀释后(见缓冲液和溶液)用做转移缓冲液。把转移后的膜染色30min，然后用脱色液(见缓冲液和溶液)脱色。为了确定N端氨基酸的序列，测序前用50％的甲醇100μl漂洗转印样品2次，以除去多余的盐。变干后，用预先用聚凝胺处理过的转印夹片(cartridge)和滤膜进行测序。测序反应采用快速转印循环。结果见表6。
表6来自游动放线菌和浅青紫链霉菌TK23/pAS11的AcbE蛋白蛋白N端氨基酸序列的测定结果
生物体 测定的N端氨基酸序列
游动放线菌 序列1：ESPPDRPSHAEQLYL序列2：SPPDRPSHAEQLYL
浅青紫链霉菌TK23/pAS11 序列1：ESPPDRPSHAEQLYL序列2：SPPDRPSHAEQLYL
19.酶活力的测定
19. 1.valienone合成酶活力的测定
为了过量表达AcbC，用游动放线菌1326/pAS8.7.2孢子悬液温育10ml的YEME培养基。培养1～2天后，培养物处于对数生长早期。这时，用7.5μg/ml硫链嗜菌肽诱导培养物。诱导20h后收获培养物。把细胞沉淀溶解在1.5ml的冷的裂解液中(见缓冲液和溶液)，超声波小心裂解。4℃下15,000离心30分钟除去细胞碎片。AcbC的抽提物用2.5升的裂解液4℃下透析(12h)后，用于酶切实验。这种抽提物可以在-20℃的条件下保存2个月而没有明显的活力丧失。用Biorad，Munich，蛋白分析确定蛋白抽提物的蛋白成分，用SDS-PAGE实验分析15μg上述样品(图6)。酶切实验在含有40μM CoCl的20mM P缓冲液(pH7.5)中室温下进行2h。酶切实验中加入了来自AcbC抽提物的蛋白质20μg和景天庚酮糖-7-磷酸盐8mM。此外，为了抑制抽提物中非特异性磷酸酶，在反应混合物中加入2mM的NaF。反应总体积为100μ1。取反应混合物25μl，在硅酸凝胶膜上通过薄层层析(TLC)确定实验结果，实验中的流动相是丁醇/乙醇/水(9∶7∶4)。用铈试剂(见缓冲液和溶液)涂布TLC薄膜以显示上述有机化合物，然后把薄膜置于干燥箱中95℃干燥15分钟。valienone和valiolone的混合物被用作实验的标准参照物。
游动放线菌表达的AcbC蛋白特异性地转化为景天庚酮糖-7-磷酸盐(图9)。然而，上述反应产物在TLC的迁移行为不同于valienone/valiolone标准参照物所表现出的小范围迁移行为。因此，反应缓冲液减小了硅酸凝胶膜上反应产物的迁移距离的可能性可以被排除(图9，泳道5)。
19. 2.α-淀粉酶活力的确定
在含有25μg/ml硫链嗜菌肽的TSB培养基和MD50培养基中，培养游动放线菌TK23/pAS11。培养3～4天后，收获培养物。4℃离心(3500g)10min除去细胞，上清在透析缓冲液(25mM tris/HCl，pH7.5，1mM CaCl2)中4℃透析12h。取上述方法制备的上清500μl真空干燥，用1.5ml的载样缓冲液(见缓冲液和溶液)溶解得到的干基；SDS-PAGE实验分离上清中的蛋白质(图8)。在同样的条件下培养游动放线菌，取其上清作为对照。通过测量1％淀粉悬液的浑浊度来确定α-淀粉酶的活力。测量实验如下，取透析过的培养物上清100μl与淀粉悬液900μl混合，把300nm处的消光度随时间而减小的值记录下来[Virolle，M.J.，et al.(1990)]。对杆菌属(bacillus sp)的淀粉酶进行同样的研究作为对比实验。结果见图10。在该实验中，1mM的acarbose不能抑制游动放线菌MD50培养物和浅青紫链霉菌TK23/pUWL219 MD50培养物中AcbE的活力。另一方面，0.1mM的acarbose就可以抑制浅青紫链霉菌TK23/pUWL219 MD50培养物的本底活力。用0.1mM的acarbose也可以抑制上述杆菌属的α-淀粉酶。缓冲液和溶液
细菌培养基
  LB培养基：
    胰化蛋白胨               10g
    NaCl                     10g
    酵母提取物               5g
H2O                         补足至1000ml
用4 M NaOH把pH调到7.5MD50培养基：溶液I
MD50淀粉水解物                 70g
(NH4)2SO4                  5g
酵母提取物                     2g
补H2O至400ml溶液II
K2HPO4                      1g
KH2PO4                      1g
柠檬酸三钠                     5g
补H2O至400ml
用1 M NaOH把pH调到7.0溶液III
MgCl2·6H2O                  1g
FeCl3·6H2O                  0.25g
CaCl2·2H2O                  2g
补H2O至200ml混合后，过滤除菌。TSB培养基：
大豆蛋白胨肉汤(broth)(Oxoid)   30g
H2O                    至1000mlTSB PEG8000[见Babcock et al.(1988)]：
大豆蛋白胨肉汤(Oxoid)          30g/l
PEG 8000                       50g/l
高压灭菌后：
甘氨酸(20％)                   25ml
MgCl2(2.5M)                   2mlYEME[Hoop，D.A.，et al.(1985)]
酵母提取物                     30g/l
蛋白胨                   5g/l
麦芽提取物               3g/l
葡萄糖                   10g/l
蔗糖                     340g/l
高压灭菌后
MgCl2(2.5M)             2ml质粒DNA的提取液[由Birnboim和Doly(1979)改进而来]混合液I                   50mM葡萄糖
                         50mM tris/HCl(pH8.0)
                         10mM EDTA(pH8.0)
                         5mg/ml的溶菌酶混合液II                   200mM NaOH
                         1％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)混合液III                  3M乙酸钾
                         1.8M甲酸TE buffer(pH8.0)Tris/HCl                   10mMNa2EDTA                   1mMDNA-DNA杂交液20×SSC
                         3M NaCl
                         0.3M柠檬酸钠预杂交液；
6×SSC
                         0.01M磷酸钠缓冲液，pH6.8
                         1mM EDTA
                         0.5％SDS
                         0.1％脱脂奶粉杂交液：
标记后，把acb探针加入到预杂交液中。
6×后洗液
                         6×SSC
                        0.5％SDSDNA测序：TBE buffer(pH8.0)
  1M                        Tris碱
  0.83M                     硼酸
  10mM                      EDTA蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳：5×载样缓冲液
甘油                        25ml
SDS                         5g
BPB                         2.5mg
2-巯基乙醇                  12.5ml
0.625 M Tris/HCl(pH6.8)补足至50ml电泳缓冲液
Tris/HCl(pH8.3)             25mM
甘氨酸                      190mM
SDS(W/V)                    0.1％
加SDS以前调pH溶液A
丙烯酰胺                    44g
N，N-亚甲双丙烯酰胺         0.8g
补H2O至100ml溶液B
丙烯酰胺                    30g
N，N-亚甲双丙烯酰胺         0.8g
补H2O至100ml染色液
SERVA兰                     0.15％
R-250(W/V)
甲醇(V/V)                   50％
乙酸(V/V)                   10％脱色液
       甲醇(V/V)                  25％
       乙酸(V/V)                  10％
AcbC变性液
   K2HPO4/KH2PO4(pH6.8)      50mM
   DTT 0.5mm
   2-淀粉酶测试磷酸盐缓冲液
   K2PO4/KH2PO4(PH6.8)       50mM
   KCl                            50mM
铈试剂
   磷钼酸                         1.25g
   硫酸铈试剂(IV)                 0.5g
   H2SO4                       3ml
   补H2O至                      50ml文献：Babcock，M.J.，Kendrick，K.E.(1988)
利用灰色链霉菌孢子进行DNA克隆，
J.Bacterol.170，2802～2808Birnboim，H.C.，Doly，J(1979)
快速碱抽提方法筛选重组质粒DNA
Nucleic Acids Res.：7，1513～1523Drepper，A.，Pape，H.(1996)
游动放线菌的景天庚酮糖-7-磷酸盐：纯化，特性及可能的生理功能
J.Antibiot.，49，664～669Goeke，K.，Drepper，A.，Pape，H.(1996)
用来自产acarbose游动放线菌的无细胞抽提物制备acarbose磷酸盐
J.Antibiot.，49，661～663Hanahan，D.(1983)
质粒转化大肠杆菌的研究
J.Mol.Biol.：166，557～580Hershberger C.L.，et al.，(1989)
工业用微生物的分子生物学上遗传特征
Amer.Soc.Microbiol.，p.58，p.61～67，p.147～155Hopwood，D.A.，et al.(1985)
链霉菌的遗传学操作
实验手册：The John Innes Foundation，Norwich，EnglandLugtenberg，B.，et al.，(1975)
把大肠杆菌“主要”外膜蛋白分成4个条带的电泳缓冲液
FEBS Lett.58，254～258Merson-Davies，L.A.，Cundiffe，E.(1994)
对来自弗氏链霉菌基因组TyIIBA区的5个泰乐菌素生物合成基因进行分析
Mol.Microbiol.，13，349～355Mullis，K.B.，Fallona，F.A.(1987)
用多聚酶结晶链反应体外特异性地合成DNA
Method Enzymol.，155，335～350Sambrook，J.，et al(1989)
分子克隆；实验指南，第2版
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链终止剂进行DNA序列的测定
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对凝胶电泳分离得到的DNA片段中的特异性序列的进行测
J.Mol.Biol.，98，503～521Takano E.，et al.(1995)
构建硫链嗜菌肽诱导的高拷贝数的表达载体并将其应用到链霉菌种(spp.)
Gene，166，133～137Virolle，M.J.，Morris，V.J.，Bibb，M.J.(1990)
对在培养上清和细胞抽提物便于使用的α-淀粉酶进行一种简单可靠的比浊和动力学分析
J.Industrial Microbiol.，5，295～302Wehmeier，U.F.(1995)
可以在培养基平板上实现蓝白斑筛选的新型多功能大肠杆菌-链霉菌穿梭载体
Gene，165，149～150图例图1来自游动放线菌SE50/110基因组的约18kb的测序片段的限制性酶切图谱(参见图2)。粗的黑线代表原始专利所请求保护的区域，该区域与acbBA基因部分重合(以从左到右为序)。图2 acarbose生物合成基因簇的基因图谱。图3 acarbose生物合成基因簇的DNA序列。图4由质粒pET11a和pET16b构建的用于大肠杆菌表达AcbC的重组质粒。图5由质粒pIJ6021构建的用于浅青紫链霉菌1326表达AcbC的重组质粒pAS8/7.2。图6细胞裂解物的凝胶-电泳分离(见实施例15.2)。泳道3显示的是硫链嗜菌肽诱导的浅青紫链霉菌1326/pAS8/7培养物表达的AcbC(42kDa)。图7由质粒pUWL219构建的用于浅青紫链霉菌TK23中表达AcbE的重组质粒。图8培养物上清中蛋白的凝胶-电泳分离(见实施例16)。泳道2、5和6显示的是AcbE(110kDa)的表达。图9在硅酸凝胶膜上通过薄层层析(TLC)检测AcbC的酶活性。
1)游动放线菌的抽提物
2)浅青紫链霉菌1326/pIJ6021的抽提物
3)浅青紫链霉菌1326/pAS8/7.2的抽提物(在-20℃下储存了2个月的抽提物)
4)浅青紫链霉菌1326/pAS8/7.2的抽提物(煮沸变性)
5)浅青紫链霉菌1326/pAS8/7.2的抽提物(valienone代替景天庚酮糖-7-磷酸盐作为底物)
6)valiolone/valienone标准参照物
7)景天庚酮糖
8)景天庚酮糖-7-磷酸盐
9)浅青紫链霉菌1326/pAS8/7.2的抽提物(制备的新鲜抽提物)
10)图10培养物上清中α-淀粉酶活性的测定。用MD50培养基培养细菌。煮沸变性的培养物上清中没有能检测到任何活性。实验持续的时间为6min。作为对照，样品9～11中都各加有商品化的α-淀粉酶2.8mU。

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1.包括图3中的DNA在内的acarbose生物合成基因簇。
2.包括图3中的DNA在内的acarbose基因。
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