CN1262664C - 基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

一种体内复制型重组猪腺病毒，其特征在于它含有一种插入猪腺病毒中的异源核苷酸序列，插入条件使后者能在体内复制并表达插入的异源核苷酸序列，并且腺病毒基因组来源于3或5血清型(PAV-3或PAV-5)腺病毒。插入在E3区的非必需区带中发生，优选地该区带包含缺失。本发明也涉及含有一种这样的猪腺病毒的重组猪疫苗。本发明进一步涉及在体内可复制并且其基因组非必需区缺失的血清型3或5猪腺病毒载体。本发明也涉及一种含有所述SEQ ID NO.5核苷酸序列的全部或部分的DNA片段。

Description

基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗
本发明涉及通过插入异源核苷酸序列重组的血清型3和血清型5猪腺病毒，这些腺病毒能在体内自主复制，并能表达这些异源序列。本发明还涉及获得的猪疫苗，用它们免疫猪的方法，缺失的复制型腺病毒载体，及获得这些腺病毒、疫苗和载体的方法。
本说明书中引用的文件以及在这些文件中引用的文件在此引用作为参考。
腺病毒是含有线性双链DNA分子的病毒，在每一末端均含有翻转的末端重复序列。腺病毒是腺病毒科家族的一部分，其引起可侵袭大量物种如猿、牛、绵羊、猪、马、鼠、犬和鸟种属的疾病。根据物种和腺病毒类型，腺病毒感染的特征可能是脑炎、肺炎、肾脏损伤、腹泻和肝炎的病征。
腺病毒基因组可因物种而不同[(T.Adrian等人，病毒学学报(Arch.Virol.)1986，91，277-290)，(J.Hamelin等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)1988，26，31-33)，(R.Assaf等人，加拿大比较医学杂志(Can.J.Comp.Med.)1983，47，460-463)，(T.Kurokawa等人，病毒学杂志(J.Virol.)1978，28，212-218)，(S.-L.Hu等人，病毒学杂志，1984，51，880-883)，(L.Zsak等人，Intervirology 1984，22，110-114)]。不同于人腺病毒，动物腺病毒具有非常有限的宿主谱，它们通常只感染属于其起源物种的动物。
在1964年第一次分离了猪腺病毒(或PAV)(D.Haig等人，比较病理学杂志(J.Comp.Pathol.)1964，74，81-84)。自从那天起，已经鉴定并描述了5种猪腺病毒血清型(Hirahara等人，兽医学杂志(J.Vet.Sci.)1990，52，407-409)。血清型1和血清型2腺病毒与腹泻有关；血清型4腺病毒与肺炎和脑炎症状有关。已根据不存在与血清型1至血清型4PAV特异抗血清的交叉中和，将一些猪腺病毒归类为第5种血清型。已分析了PAV-5基因组，并已建立了限制酶切图谱(Tuboly等人，病毒研究(Virus Res.)1995，37，49-54)。这一分析表明了在PAV-5与其他血清型的PAV的限制酶切图谱之间不存在相似性：PAV-1和PAV-2(Reddy等人，病毒学学报1995，140，195-200)，PAV-3(Reddy等人，Intervirology 1993，36，161-168)和PAV-4(Kleiboeker等人，病毒学学报1993，133，357-368)。在血清型3与5之间，存在对猪而言天然不致病的菌株。
PAV具有约32-34kbp大小的基因组。PAV-1的基因组约33.5kbp大小。PAV-2基因组约33.3kbp大小。PAV-3病毒的完整序列最近已经确定，并在GenBank数据库中申请为AF083132(P.S.Reddy等人，病毒学(Virol.)1998，251，414-426)；其大小为34094碱基对(bp)。PAV-4的基因组约32kbp大小，PAV-5基因组约33.2kbp大小。PAV-5的完整基因组，特别是E3区，尚未测序或公布。
为腺病毒设想的主要用途在人类基因治疗领域，并计划了大量构建体和系统。也提出腺病毒作为保护人类和动物免于感染多种致病病毒的免疫组合物的重组载体。
迄今为止已发展了用于构建重组腺病毒载体的两种策略(M.Eloit和M.Adam，普通病毒学杂志1995，76，1583-1589)。
第一种策略包括向腺病毒复制所必需的区域中插入表达盒，因此需要发展反式互补系统，同时也能确保病毒的复制。对于猪腺病毒，已提出E1区作为插入位点(P.S.Reddy等人，病毒研究1998，58，97-106)。这样构建的重组载体被称为“非复制型的”，因为它们不能在所施用的宿主中复制。
作为第一种策略的变化，能使用一种在目标动物中不能复制的病毒。特别是已经将PRV gD表达盒插入血清型5人腺病毒的E1A位点中，该病毒在猪中不能复制(M.Monteil等人，普通病毒学杂志1997，78，3303-3310；A.Ambriovic等人，病毒学1997，238，327-335)。
第二种策略包括向对腺病毒复制不是必需的病毒基因组区域中插入表达盒。确定腺病毒中非必需区域的困难及坚硬衣壳的存在使第二种策略难以实施。
特别地，腺病毒重要特征之一是，它们具有坚硬的衣壳，这严格限制了可包裹于其中的DNA分子的大小。通常认为能包裹相当于基因组大小105％-114％的DNA分子，根据基因组大小，其对应于约1.7-3.9kbp的插入片段。如果过大，在重组基因组中可能会发生不希望的缺失和/或重排。
在一种特定种的腺病毒与另一种的腺病毒之间，或在不同血清型的猪腺病毒之间，E3区在大小与遗传组构方面都不保守(S.Kleiboeker，病毒研究1994，31，17-25)。
PAV-3病毒的E3区大小为1179碱基对。它是一种编码至少3个开放阅读框(ORF)的复杂区域。这些ORF彼此重叠，第一个ORF也与编码一种必需蛋白质--pVIII蛋白的基因部分重叠(P.S.Reddy等人，病毒研究1995，36，97-106)。
在E3区中存在这些重叠ORF代表了为使重组腺病毒在猪中仍可复制而确定插入位点和/或缺失限制中的一个主要困难。
E3区的第二个ORF所编码的氨基酸序列显示，PAV-3腺病毒与HAV-2腺病毒(它是血清型2人腺病毒)，或与当前所知的其他任何腺病毒蛋白之间均无同源性(P.S.Reddy等人，病毒研究1995，36，97-106)。根据PAV-3E3区的第一种ORF的核苷酸序列预测的氨基酸序列与血清型2犬腺病毒(CAV-2)只有33.3％同一性。不仅是多种腺病毒4的E3区编码的蛋白质不同源，另外，E3区的ORF编码的蛋白质在PAV-3与PAV-4腺病毒之间也不显示同源性(S.B.Kleiboeker，病毒研究1994，31，17-25)。
E3区在PAV-1中大小为1162bp(有5个ORF)；在PAV-2中为1222bp(有5个ORF)(P.S.Reddy等人，病毒研究1996，43，99-109)，而在PAV-4中为1879bp(有6个ORF)。只有PAV-4病毒E3区的第四个ORF(对应于13.2kDa蛋白质)才与E3区的另一种已知ORF--编码5型人腺病毒(称作人腺病毒5或HAV-5)的14.7kDa蛋白质--显示同源性。PAV-4的E3区与其他猪腺病毒特别是PAV-3和PAV-5的E3区不显示序列同源性。
除了限定保持体内复制性质的限制的困难外，E3区的缺失也不是没有危险。E3区的缺失实际上可能对重组腺病毒的致病性具有影响。因此，已经发现，HAV-5病毒E3区的缺失提高了该病毒在棉鼠感染实验模型中的肺部致病性(Ginsberg等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1989，86，3823-3827)。
这表明，腺病毒E3区中缺失的后果必须逐情考虑，而不只是将一种特定腺病毒的发现转移给另一个。PAV-3的E3区的遗传组构是独特的，PAV-5的E3区同样如此。
由于存在复杂剪接带和聚腺苷酸化带的事实，E3区中插入位点的精确定位更加复杂，这些带是腺病毒所特有的(Imperiale等人，微生物免疫学现代主题(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)1995，199，139-171)。位于E3区中的剪接带对于位于E3区外的序列所编码的多种必需信使RNA的成熟是重要的。E3区本身位于显示高转录活性的病毒基因组的一部分(P.Sharp，1984，《腺病毒》，H.S.Ginsberg编，Plenun出版社，纽约和伦敦，173-204)；异源核苷酸序列向E3区的插入可能对重组病毒的生物活性有负面影响。另外，E3区也位于主要晚期启动子(MLP)下游，它是已经证明了插入片段转录与MLP启动子起始转录之间具有干扰的区域(Xu等人，普通病毒学杂志1995，76，1971-1980)。
因此不能将用来源于其他物种(人、牛、绵羊等)的腺病毒获得的结果用于猪腺病毒。迄今为止尚未由猪腺病毒生产复制型重组载体。
申请公司的目的在于，能向PAV-3和PAV-5病毒基因组中插入异源基因，而不明显改变其在体内复制的能力。
本发明的另一目的在于提供能被删除但复制能力不容怀疑的插入区，以提高向病毒中插入的能力。
本发明的再另一个目的在于提供保留体内复制能力的重组PAV-3和PAV-5病毒，使其能用作活重组疫苗，包括粘膜施用和/或在母体来源的抗体存在下施用的疫苗。
申请公司已成功地修饰了PAV-3和PAV-5的E3区，而同时保留体内复制能力。也能够证明插入该区域的基因的体内表达。因此，使PAV-3和PAV-5能用作复制型表达载体。
因此本发明的一个主题是血清型3或5猪腺病毒，其至少含有一种插入PAV-3或PAV-5基因组的异源核苷酸序列，插入条件是能使获得的重组病毒在猪中体内复制，并表达该插入序列。这些修饰病毒在接种方面具有相当大的优势，特别是，它们甚至在母体抗体存在下仍是有效的，因而能有效地粘膜使用。
优选地，将异源序列插入基因组的非必需带特别是E3带中，该插入带含有缺失。表述“带的缺失”是指插入带的全部或部分、优选地全部缺失。换句话说，插入异源序列代替插入带的全部或部分，优选地代替该带的全部。
对于PAV-3，向E3中插入的优选带是含有P.S.Reddy等人，病毒研究1995，36-97-106所公布序列的核苷酸706-1624的全部或部分的带，其对应于GenBank AN#U10433中公布的序列的位点27794-28712。换句话说，该插入带及其可能的缺失可含有序列706-1624的全部或只是部分，和/或能在E3中延伸到限度706和/或限度1624之外，并能任选地含有完整的E3。优选地，该带含有E3、核苷酸706-1624、核苷酸1002-1624，或序列706-1002的全部或部分。特别是，至少含有序列1002-1624。
对于PAV-5，E3由SEQ ID No.5中的核苷酸序列2382-4042所限定。插入带及其可能的缺失包括E3，并含有SEQ ID No.5的核苷酸2064-4083的全部或部分，例如核苷酸2389-3861的全部或部分(图13)。换句话说，该插入带及其可能的缺失可能只含有序列2389-3861的部分，和/或能在E3中延伸到限度2389和/或限度3861之外，并能任选地含有完整E3。当进行缺失可达包含的核苷酸4083时，优选地插入剪接受体位点代替核苷酸4083。优选地，该插入带主要由核苷酸2389-3861组成。
不用说，本发明也涵盖向PAV-3和PAV-5其他菌株的核苷酸序列所限定的相应区带中的插入，其序列不同于根据本发明的参照菌株的序列。
本发明的一个主题是PAV-3或PAV-5病毒，其就大小而言具有较高的插入能力，而同时仍能在猪中体内复制。保持在宿主中的复制性质对于获得最佳保护效果是需要的，特别是粘膜使用和/或在母体来源抗体存在下使用免疫组合物。
利用如E3区全部或部分的缺失实现插入能力的提高，可缺失的E3部分位于编码pVIII蛋白的基因和编码尾丝的基因之间。特别是，本发明描述了可在PAV-3病毒E3区中进行的622bp和919bp的缺失，而同时保留重组病毒的复制性质(见实施例6-10)。本发明还描述了PAV-5病毒E3区中1472bp的缺失，产生重组病毒的相同表型特征(见实施例14-17)。
根据本发明获得的重组PAV-3或PAV-5腺病毒，对于PAV-3病毒可有利地用于插入最大约3.0kbp，对于PAV-5约3.5kbp，并在猪中表达。
因此本发明的一个主题也是尤其在E3区中缺失、而同时仍能复制的PAV-3和PAV-5载体，特别是在上述区带中缺失，即缺失所述区带的全部或部分，优选地该区带的全部。
可以插入的异源核苷酸序列是编码免疫原或免疫原的免疫活性片段如表位的序列，特别是编码猪病原体免疫原的基因或基因片段(例如表位)。
在本发明上下文中，当然能向同一病毒中插入一种以上的异源序列。特别是，可向其中插入来源于同一病毒或不同病毒的异源序列。
根据一种特殊方法，能插入组合了来源于相同病原体或不同病原体的几种片段或表位的人工序列，其被称为“多表位序列”。在后一情况中，多表位序列位于一个启动子控制下。
也能插入编码免疫调节剂的序列，特别是细胞因子，优选地猪细胞因子，如猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(poGM-CSF)、猪白细胞介素4(poIL-4)、猪IL-12或猪IL-18。
通过插入特别是来源于小核糖核酸病毒如猪水泡病毒(SVDV；B.-F.Chen等人，病毒学杂志1993，67，2142-2148)、脑心肌炎病毒(EMCV；R.J.Kaufman等人，核酸研究，1991，19，4485-4490)或口蹄疫病毒(FMDV；N.Luz和E.Beck，病毒学杂志，1991，65，6486-6494)或其他来源的被称为“IRES”(内部核糖体进入位点)的序列，也能表达插入插入座位中的几种异源基因。本领域技术人员可参照所引用的3篇文章的内容。两种基因的表达盒因而具有下列最小结构：启动子(任选的)-基因1-IRES-基因2-聚腺苷酸化信号。根据本发明的重组活疫苗因此可含有插入插入座位中的一种表达盒，该表达盒连续包含启动子，由IRES成对分隔的两种或多种基因，和聚腺苷酸化信号。
猪病原体是病毒、细菌和寄生虫，特别是选自：奥尔斯基病病毒(PRV或伪狂犬病病毒)、猪流感病毒(SIV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRS病毒)、parvovirosis病毒(PPV病毒)、猪霍乱病毒(HCV)、猪环病毒(circovirus)，特别是2型猪环病毒(猪环病毒2型、PCV2或小猪系统性消耗性综合征病毒)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)和猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。
至于奥尔斯基效价，能以其天然或分泌形式使用gB基因(RobbinsA.K.等人，病毒学杂志1987，61，2691-2701GenBank AN#M17321)、gC基因(Ishikawa K.等人，兽医微生物学(Vet.Microbiol.)1996，49，267-272GenBank AN#D49435)和/或gD基因(Riviere M.等人，病毒学杂志1992，66，3424-3434，和Hong W.Z.等人，GenBank AN#AF086702)。
至于猪流感效价，优选地使用HA基因(WO-A-98/03658，实施例10和12)(天然或分泌形式)、NA基因(Nerome K.等人，普通病毒学杂志1995，76，613-624GenBank AN#D21194)(天然或分泌形式)和/或NP基因(WO-A-98/03658，实施例11和13)。
至于PRRS效价，优选地使用来源于欧洲菌株(Meulenberg J.等人，病毒学，1993，192，62-72)和美洲菌株(Mardassi H.等人，病毒学学报1995，140，1405-1418)的ORF4基因、ORF3基因(天然或分泌形式)、ORF5基因(天然或分泌形式)、ORF6基因和/或ORF7基因。
至于猪霍乱效价，优选地使用E0基因、E1基因(天然或分泌形式)和或E2基因(天然或分泌形式)(Meyers G.等人，病毒学，1989，171，18-27)。
至于parvovirosis效价，优选地使用VP2衣壳基因(VasudevacharyaJ.等人，病毒学，1990，178，611-616)。
至于PCV2效价，优选地使用IRF1和/或ORF2基因，但优选地ORF1和ORF2(Meehan B.等人，普通病毒学杂志1998，79，2171-2179)。
在转录调节信号特别是启动子控制下插入异源序列，优选地在重组期间引入。然而，不排除在用作载体的腺病毒所固有的信号控制下表达这些异源序列。
在有用的启动子之中，优选使用强真核启动子，如劳氏肉瘤病毒LTR，优选地巨细胞病毒直接早期(CMV-IE)启动子，特别是鼠源的(MCMV-IE)或人源的(HCMV-IE)，或其他来源如来源于猪、猴、大鼠或豚鼠的启动子。
一种特别有利的方式是，CMV-IE启动子能与增强子一起使用(US-A-5,168,062、US-A-4,968,615、US-A-4,963,481)。可以有利地使用这些启动子的片段，它们保留启动子活性，优选地含有增强子，例如根据WO-A-98/00166的截短的CMV-IE启动子。进一步的细节，本领域技术人员可参照WO-A-98/00166，特别是其中的实施例12。
本发明的主题也可以是免疫原性或免疫制剂和猪疫苗，其含有根据本发明的重组腺病毒，兽医观点可接受的载体或赋形剂，和任选的佐剂。根据定义，免疫原性或免疫制剂在向动物施用后至少诱导一种免疫应答(细胞和/或体液的)。一种疫苗诱导一种保护性应答。
佐剂优选地选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和马来酸酐与(链)烯基衍生物的共聚物。
优选的化合物是尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。这些化合物被称作术语“carbomer”(Pharmeuropa第8卷，2号，1996年6月)。本领域技术人员也可查阅US-A-2 909 462，其中描述了与至少含有3个、优选地不超过8个羟基的多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子被替换为含有至少2个碳原子的不饱和脂基。优选的基团是含有2-4个碳原子的基团，如乙烯基、烯丙基和其他烯不饱和基团。不饱和基本身可含有其他取代基，如甲基。商品名为Carbopol(BF Goodrich，Ohio，美国)的产品特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中可提到Carbopol974P、934P和971P。
在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，优选EMAs(Monsanto)，它是马来酸酐与乙烯的共聚物，可以是线性的或交联的，例如与二乙烯醚交联。可参考J.Fields等人，自然，186，778-780，1960年6月4日。
根据结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMAs优选地由下列通式的基本单位形成：
其中：
-R1和R2，可以相同或不同，代表H或CH3
-X＝0或1，优选地x＝1
-Y＝1或2，且x+y＝2。
对于EMAs，x＝0而y＝2。对于carbomer，x＝y＝1。
这些聚合物在水中溶解产生一种酸性溶液，将被中和为优选地生理pH，获得可掺入实际疫苗的佐剂溶液。聚合物的羧基部分地是COO-形式。
优选地，在蒸馏水中，优选地在氯化钠存在下制备根据本发明的佐剂溶液，特别是carbomer溶液，所获得的溶液为酸性pH。通过加入到所需量(获得希望的终浓度)或大比例的含NaCl水、优选地生理盐水(6g/l NaCl)中稀释该贮存液，在一个或多个阶段中同时或随后优选地用NaOH中和(pH7.3-7.4)。使用生理pH的该溶液吸收疫苗，而不需进一步修饰，其特别以冻干形式贮存。
终免疫组合物中的聚合物浓度为0.01％-2％W/V，更特别地0.06％-1％W/V，优选地0.1％-0.6％W/V。
根据本发明的免疫原性制剂和疫苗能包含几种根据本发明的重组腺病毒，包含来源于相同和/或不同病原体的不同异源核苷酸序列。
本发明的一个主题是针对一种或多种猪病原体而免疫和接种猪的方法，包括施用有效剂量的上述免疫原性制剂和疫苗。例如，剂量可为104-107CCID50。
本发明特别涉及这些免疫原性制剂和疫苗的粘膜施用，例如经口、经鼻或经眼施用，和/或对显示母体抗体的幼小动物的施用。也能使用常规用于接种猪的其他途径(特别是肌肉内、皮内等)。
本发明的一个主题是获得重组PAV-3和PAV-5载体和掺有它们的免疫原性制剂和疫苗的方法。
本发明的一个主题是用于生产根据本发明的免疫原性制剂和疫苗而的这些载体的用途，特别是用于粘膜施用，和/或对显示母体抗体的幼小动物施用，和/或通过常规途径施用。
本发明的一个主题是PAV-5DNA的片段，其包含E3，并且在此处使用的特定菌株中具有称作SEQ ID NO.5的核苷酸序列。本发明也涉及该序列的任何片段，特别是保留PAV-5特异性的任何片段。因此本发明的一个主题是序列2064-4083及其片段，特别是PAV-5的E3序列，它在此处使用的特定菌株中由核苷酸2382-4042所限定，及其片段，特别是SEQID NO.5的序列2389-3861的全部或部分。不言而喻，本发明自动涵盖等同性序列，即不改变所述序列或该序列编码的多肽的PAV-5菌株功能性或特异性的序列。不用说，将包括由于密码简并性而不同的序列。
本发明也涉及PAV-5特异的序列，它们在能与上述序列在高严格条件下杂交方面相当，和/或与本发明的菌株有强同源性，特别是大于或等于85％、尤其90％、更特别地95％的同源性。
现在通过非限制性实施例，参照附图，利用实施方案，更详细地描述本发明，其中：
附图列表
图1：pKS-Right ITR3、pPolyII-Right ITR3和pITRsPAV3质粒的图示。
图2：pE3PAV3、pE3dl622CMV-EGFP和pE3dl622CMV-gD质粒的图示。
图3：pE3PAV3和pE3dl919质粒的限制酶切图谱。
图4：pCMV-EGFP、pCMV-gD和pgD质粒的图示。
图5：pCMV-EGFP、pgD、pE3dl919CMV-EGFP和pE3dI919CMV-gD质粒的限制酶切图谱。
图6：pE3dl622EGFP和pE3dl919EGFP质粒的限制酶切图谱。
图7：pE3dl622gD和pE3dl919CMV-gD质粒的限制酶切图谱。
图8：pCR-Right ITR5、pCR-Left ITR5、pPolyII-Right ITR5和pITR-PAV5质粒的限制酶切图谱。
图9：pE3PAV5质粒的限制酶切图谱。
图10：pE3dln472CMV-EGFP和pE3dl1472CMV-gD质粒的限制酶切图谱。
图11：pE3dl1472EGFP和pE3dl1472gD质粒的限制酶切图谱。
图12：PAV-5的物理图谱，用BamHI消化。
图13：5614碱基对的序列(PAV-5病毒的E3区和相邻序列)。
序列表
SEQ ID NO 1：寡核苷酸ITRPAV3
SEQ ID NO 2：寡核苷酸T3
SEQ ID NO 3：寡核苷酸T7
SEQ ID NO 4：寡核苷酸ITRPAV5
SEQ ID NO 5：PAV-5病毒E3区的序列
实施例：
实施例1：细胞与病毒
细胞培养基和试剂由Gibco BRL供应。培养基(含Glutamax-1的Dulbecco’s MEM，Cat#61965-026)中添加1mM丙酮酸钠(Cat#11360-039)、庆大霉素(50μg/ml，Cat#15710-031)和10％胎牛血清(Cat#10270-106批号40Q5774K)。
用PK-15细胞(ATCC号CCL33)和ST细胞(ATCC号CRL1756)培养病毒。
野生型3型猪腺病毒(＝PAV-3)，对猪不致病，从Eva Nagy博士(Guelph大学，病理学系，50Stone Road Guelph，Ontario，加拿大，NIG 2W1)的实验室获得(Reddy P.等人，病毒研究1996，43，99-109)。
野生型5型猪腺病毒(＝PAV-5)，对猪不致病，从Tadashi Hirahara博士(Kyoto Biken Laboratories Inc.，兽医微生物学部，24-16Makishima-cho，Uji-shi，Kyoto，611日本)的实验室获得(Hirahara T.等人，兽医学杂志1990，52，407-409)。
培养与传代条件：一周两次，将细胞胰蛋白酶化(用Earle’s平衡盐溶液(Gibco-BRL Cat#14155-030)稀释50倍的2.5％胰蛋白酶溶液(Sigma Cat#044-5075))，并重悬浮于培养基(1∶6稀释)中。细胞在重新培养前在5％CO2存在下37℃培养。
实施例2：酶、细菌、质粒和分子生物学技术
限制酶、用于链扩增反应的Taq聚合酶和不同DNA修饰所需的其他酶分别由New England Biolabs Inc.，Roche Diagnostics和Gibco-BRL供应。
所有这些酶都按照使用说明使用。标准分子生物学技术如《分子生物学：实验室指南》，第二版，(Sambrook等人，冷泉港实验室，纽约，1989)所述进行。
BJ5183感受态细胞(Hanahan D.，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)1983，166，557-580)如下制备：按照氯化钙技术(Sambrook等人，1989)制备指数期的这些细菌的60ml培养物。用终体积2ml的50mM CaCl2收获。300μl这种细菌悬液与100μl体积的100mM Tris-HCl pH7.4中所含的不同同源重组配偶体DNA混合，并在融化中的冰上接触30分钟，然后在+45℃下热休克处理细菌2分钟，在融化中的冰上保持10分钟，最后涂于选择培养基上。
实施例3：PAV-3和PAV-5病毒DNA的提取
病毒在实施例1的条件下在10cm2Falcon摇瓶中培养并扩增。当CPE完成后，收获细胞，通过3个循环的冷冻/融解裂解，然后通过低速离心使病毒悬液澄清。PAV-3和PAV-5病毒以氯化铯梯度(1.34g/ml)纯化，收获并纯化病毒带，然后在用蛋白酶K处理及酚/氯仿抽提后获得病毒DNA(Sambrook等人，1989)。这些DNA然后用于不同克隆或聚合酶链扩增(PCA)步骤。
实施例4：“pITRs PAV3”质粒的构建
根据实施例3制备的PAV-3病毒的基因组DNA用EcoRI消化，在琼脂糖凝胶电泳后分离245bp EcoRI D片段。然后将该片段与EcoRl预消化并去磷酸化的pBlueScript KS质粒(pBS-KS)(Stratagene Inc.LaJolla，CA)(GenBank#X52327)连接，产生被称为“pKS-EcoDPAV3”的质粒。
用pKS-EcoDPAV3质粒基质和下列寡核苷酸进行PCA反应：ITRPAV3(SEQ ID NO：1)(50-mer)5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3’和T3(SEQ ID NO：2)(20-mer)5’ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’
扩增产物(367bp)用T4DNA聚合酶处理以使末端成为平端，然后用ClaI酶消化，并与ClaI和EcoRV预消化的pBS-KS质粒连接，产生被称为“pKS-RightITR3”的质粒(图1)。
然后用BamHI和KpnI酶消化，使EcoRI D片段不含pKS-RightITR3质粒，353-bp BamHI-KpnI限制酶切片段与BamHI和KpnI预消化的pPolyII质粒(Lathe R.等人，基因，1987，57，193-201)(GenBank#G209113)连接，产生被称为“pPolyII-RightITR3”的质粒(图1)。
根据实施例3制备的PAV-3的基因组DNA用KpnI消化，以在琼脂糖凝胶电泳后分离939-bp KpnI F末端片段。该片段与KpnI预消化并去磷酸化的pBS-KS质粒连接，产生被称为“pKS-KpnFPAV3”的质粒。
然后用pKS-KpnFPAV3质粒基质和下列寡核苷酸进行PCA反应：ITRPAV3(SEQ ID NO：1)(50-mer)5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCGC 3’和T7(SEQ ID NO：3)5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’
扩增产物(1086bp)用T4DNA聚合酶处理，以使末端成为平端，然后用XhoI酶消化，并与用BglII预消化并用T4DNA聚合酶处理然后用XhoI消化的pPolyII-Right ITR3质粒连接，产生被称为“pITRsPAV3”的质粒(图1)。
实施例5：pPAV3质粒的构建
pITRsPAV3质粒(实施例4)通过用ClaI消化线性化，然后与根据实施例2制备的PAV-3病毒基因组DNA共转化BJ5183感受态细菌。该共转化使得能通过大肠杆菌中的同源重组(Chartier C.等人，病毒学杂志1996，70，4805-4810)产生含有PAV-3完整克隆基因组的质粒。该质粒被命名为“pPAV3”。
实施例6：PAV-3穿梭质粒的构建
6.1.在E3区中缺失622个碱基对(小缺失)的质粒的构建
pNEB193质粒(New England BioLabs Cat#305-1)用PacI消化，用T4DNA聚合酶处理，然后自身连接，产生“pNEBPac-”质粒。
pPAV3质粒(实施例5)用KpnI和BamHI消化，分离含有E3区的4344-bp KpnI-BamHI片段(Reddy等人，病毒学，1998，251，414-426)。该片段与KpnI和BamHI预消化的pNEBPac-质粒连接，产生“pE3PAV3”质粒(图2)。核对KpnI-BamHI片段的序列，发现它与Reddy P.等人(病毒研究，1995，36，97-106和病毒学，1998，251，414-426)所公布的序列(GenBank AN#U10433和AN#AF083132)相同。本领域技术人员可查阅这些参考文献。
修饰pEGFP-F质粒(Chalfie M.等人，科学，1994，263，802-805；Clontech Cat#6074-1)以完全除去多接头。通过用BamHI消化，随后用T4DNA聚合酶处理，获得这种缺失。这样修饰的载体的自身再连接产生pCMV-EGFP质粒。然后用AsnI和MluI酶消化pCMV-EGFP质粒，用T4DNA聚合酶处理，分离1.6-kbp AsnI(平端)-MluI(平端)片段(＝CMV-EGFP表达盒)。该片段与用BsrGI和SnaBI预消化并用T4DNA聚合酶处理的pE3PAV3质粒连接，产生pE3dl622CMV-EGFP质粒(图2)。在PAV-3病毒E3区的BsrGI和SnaBI位点之间产生的缺失大小为622碱基对。该缺失从P.Reddy等人(病毒研究，1995，36，97-106)所公布的序列(GenBank AN#U10433)的核苷酸1002延伸到1624。
pCMV-gD质粒(Ambriovic A.等人，病毒学，1997，238，327-335)用SnaBI和ClaI消化，分离1.8-kbp SnaBI-ClaI片段(含有CMV启动子的3’部分和PRV gD基因)。然后用T4DNA聚合酶处理该片段，使末端成为平端，然后与SnaBI和HpaI预消化的pE3dl622CMV-EGFP质粒连接，产生pE3dl622CMV-gD质粒(图2)。
6.2.在E3区中缺失919个碱基对(大缺失)的质粒的构建
pE3PAV3质粒(见上述部分6.1)用SgrAI和SacI消化，以分离644-bp SgrAI-SacI片段。该片段用T4DNA聚合酶处理，使末端成为平端，然后与用EcoRI预消化、用T4DNA聚合酶处理、然后用SacI消化的pNEBPac-质粒(以上6.1.)连接，产生pSgrAI-SacI质粒。
pE3PAV3质粒用SnaBI和HindIII消化，以分离2.4-kbp SnaBI-HindIII片段。该片段与PmeI和HindIII预消化的pSgrAI-SacI质粒连接，产生pE3dl919质粒(图3)。在PAV-3病毒E3区的SacI与SnaBI位点之间产生的缺失大小为919碱基对。该缺失从P.Reddy等人(病毒研究，1995，36，97-106)所公布的序列(GenBank AN#U10433)的核苷酸706延伸到1624。
pCMV-gD质粒(实施例6.1)用SnaBI和ClaI消化，以分离1.8-kbp SnaBI-ClaI片段。该片段用DNA聚合酶Klenow片段处理，使末端成为平端，然后与用SnaBI和HpaI预消化、然后去磷酸化的pCMV-EGFP质粒(实施例6.1)连接，产生pgD质粒(图4)。
pCMV-EGFP质粒(实施例6.1)用AsnI和MluI消化，以分离1.8-kbp AsnI-MluI片段(CMV-EGFP盒)。该片段用DNA聚合酶Klenow片段处理，使末端成为平端，然后与用AscI预消化、用DNA聚合酶Klenow片段处理使末端成为平端、然后去磷酸化的pE3dl919质粒连接，产生pE3dl919CMV-EGFP质粒(图5)。
pgD质粒(同上)用AsnI和MluI消化，以分离2.3-kbp AsnI-MluI片段。该片段用T4DNA聚合酶处理使末端成为平端，然后与用Ascl预消化、用DNA聚合酶Klenow片段处理使末端成为平端、然后去磷酸化的pE3dl919质粒连接，产生pE3dl919CMV-gD质粒(图5)。
实施例7：重组基因组pPAV3dl622CMV-EGFP和pPAV3dl622CMV-gD的构建
pE3dl622CMV-EGFP质粒(实施例6.1)用KpnI和BamHI消化，以分离5.5-kbp KpnI-BamHI片段。该片段与通过用SnaBI酶消化而线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化导致通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl622CMV-EGFP质粒。
pE3CMVgD质粒(实施例6.1)用EcoRI和PmeI消化，以分离6.0-kbp EcoRI-PmeI片段。该片段与通过用SnaBI酶消化而线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化导致通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl622CMVgD质粒。
实施例8：重组基因组pPAV3dl919CMV-EGFP和pPAV3dl919CMV-gD的构建
pE3dl919CMV-EGFP质粒(实施例6.2)用HindIII线性化，然后与通过用SnaBI酶消化而线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化导致通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl919CMV-EGFP质粒。
pE3dl919CMV-gD质粒(实施例6.2)用HindIII线性化，然后与通过用SnaBI酶消化而线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化导致通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl919CMV-gD质粒。
实施例9：重组基因组pPAV3dl622EGFP、pPAV3dl622gD、pPAV3dl919EGFP和pPAV3dl919gD的构建(不含CMV启动子序列的编码序列的插入)
9.1.pE3dl622EGFP和pE3dl919EGFP质粒的构建
pCMV-EGFP质粒(实施例6.1.)用NheI和MluI消化，以分离1.0-kbp NheI-MluI片段。该片段用DNA聚合酶Klenow片段处理，使末端成为平端，然后与用BsrGI预消化、用DNA聚合酶Klenow片段处理、最后用SnaBI消化的pE3PAV3质粒(实施例6.1)连接，产生pE3dl622EGFP质粒(图6)。
pCMV-EGFP质粒用NheI和MluI消化，以分离1.0-kbp NheI-MluI片段。该片段用DNA聚合酶Klenow片段处理，使末端成为平端，然后与用AscI预消化、用DNA聚合酶Klenow片段处理、然后去磷酸化的pE3dl919质粒连接，产生pE3dl919EGFP质粒(图6)。
9.2.pE3dl622gD和pE3dl919gD质粒的构建
pgD质粒(实施例6.2)用XhoI和ClaI消化，以分离1.5-kbpXhoI-ClaI片段。该片段用DNA聚合酶Klenow片段处理，使末端成为平端，然后与用BsrGI预消化、用DNA聚合酶Klenow片段处理、然后用SnaBI消化的pE3PAV3质粒(实施例6.1)连接，产生pE3dl622gD质粒(图7)。
pgD质粒(实施例6.2)用XhoI和ClaI消化，以分离1.5-kbpXhoI-ClaI片段。该片段用DNA聚合酶Klenow片段处理，使末端成为平端，然后与用AscI预消化、用DNA聚合酶Klenow片段处理、最后去磷酸化的pE3dl919质粒(实施例6.2)连接，产生pE3dl919gD质粒(图7)。
9.3.pPAV3dl622EGFP、pPAV3dl622gD、pPAV3dl919EGFP和pPAV3dl919gD质粒的构建
pE3dl622EGFP质粒(实施例9.1)用KpnI和BamHI消化，然后与通过用SnaBI消化而预线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化使得能通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl622EGFP质粒。
pE3dl622gD质粒(实施例9.2)用EcoRI和PmeI消化，然后与通过用SnaBI消化而预线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl622gD质粒。
pE3dl919EGFP质粒(实施例9.1)通过用HindIII消化线性化，然后与通过用SnaBI消化而预线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl919EGFP质粒。
pE3dl919gD质粒(实施例9.2)通过用HindIII消化线性化，然后与通过用SnaBI消化而预线性化的pPAV3质粒(实施例5)一起共转化BJ5183感受态细菌。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV3dl919gD质粒。
实施例10：利用克隆到大肠杆菌中的重组PAV3基因组转染产生重组PAV3病毒
根据细胞系，用在4-12μl LipofectAMINE(Gibco-BRL Cat#18324-012)存在下稀释的、PacI预消化的2μg重组PAV-3基因组DNA，在6孔培养板中转染PK-15或ST细胞(见实施例1)，至60-80％的汇合密度。
在根据供应商推荐的条件转染后，培养细胞数天，直到出现病毒CPE。然后进行进一步的细胞培养传代，以扩增获得的重组病毒。
用pPAV3dl622CMV-EGFP质粒(实施例7)进行转染产生重组病毒vPAV3-1。
用pPAV3dl622CMV-gD质粒(实施例7)进行转染产生重组病毒vPAV3-2。
用pPAV3dl919CMV-EGFP质粒(实施例8)进行转染产生重组病毒vPAV3-3。
用pPAV3dl919CMV-gD质粒(实施例8)进行转染产生重组病毒vPAV3-4。
用pPAV3dl622EGFP质粒(实施例9.3)进行转染产生重组病毒vPAV3-5。
用pPAV3dl622gD质粒(实施例9.3)进行转染产生重组病毒vPAV3-6。
用pPAV3dl919EGFP质粒(实施例9.3)进行转染产生重组病毒vPAV3-7。
用pPAV3dl919gD质粒(实施例9.3)进行转染产生重组病毒vPAV3-8。
实施例11：pITRs PAV5质粒的构建
11.1.右端基因组片段的克隆
根据实施例3制备的PAV-5病毒的基因组DNA用EcoRI消化，在琼脂糖凝胶电泳后分离0.9-kbp EcoRI I右端片段。将该片段与用EcoRI预消化并去磷酸化的pBS-KS质粒连接，产生“pKS-Right ITR5”质粒。
然后用pKS-Right ITR5质粒基质和下列寡核苷酸进行PCA反应：ITRPAV5(SEQ ID NO：4)(50-mer)：5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3’和T3(SEQ ID NO：2)(20-mer)：5’ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’产生1.0-kbp片段。该片段与pCRII质粒(InVitrogen Original TA克隆试剂盒Cat#K2000-01)连接，产生“pCR-Right ITR5”质粒(图8)。
11.2.左端基因组片段的克隆
根据实施例3制备的PAV-5病毒的基因组DNA用HindIII消化，在琼脂糖凝胶电泳后分离1.2-kbp HindIII左端片段。将该片段与用HindIII预消化并去磷酸化的pBS-KS质粒连接，产生“pKS-Left ITR5”质粒。
然后用pKS-Left ITR5质粒基质和下列寡核苷酸进行PCA反应：ITRPAV5(SEQ ID NO：4)(50-mer)：5’CCTTAATTAAGGTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACGGA 3’和T7(SEQ ID NO：320-mer)：5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’产生1.3-kbp片段。该片段与pCRII质粒连接，产生“pCR-Left ITR5”质粒(图8)。
11.3.pPolyII-Right ITR5质粒的构建
用BamHI和HindIII消化pCR-Right ITR5质粒(实施例11.1)，以分离1.0-kbp BamHI-HindIII片段。然后将该片段与用BamHI和HindIII预消化的pPolyII质粒(见实施例4)连接，产生“pPolyII-RightITR5”质粒(图8)。
11.4.pITRsPAV5质粒的构建
用BamHI和HindIII消化pCR-Left ITR5质粒(实施例11.2)，以分离1.3-kbp BamHI-HindIII片段。然后将该片段与用BglII和HindIII预消化的pPolyII-Right ITR5质粒连接，产生“pITRs PAV5”质粒(图8)。
实施例12：pPAV5质粒的构建
通过用HindIII消化使pITRsPAV5质粒线性化，然后将获得的片段与根据实施例3制备的PAV-5病毒基因组DNA共转化BJ5183感受态细菌。该共转化通过同源重组产生含有PAV-5病毒全部基因组的质粒。该质粒被命名为“pPAV5”。
实施例13：PAV-5穿梭质粒的构建
13.1.E3PAV-5穿梭质粒的构建
用SacI和MluI消化pPAV5质粒(实施例12)，以分离含有E3区的4372-bp SacI-MluI片段。该片段与用SmaI和AscI预消化的pNEB193质粒(实施例6.1)连接，产生“pE3PAV5”质粒(图9)。
完整测序并分析克隆到pE3PAV5质粒中的SacI-MluI片段。该序列及pPAV5质粒上存在的相邻序列的分析证实，克隆片段确实代表PAV-5病毒的E3区。该区的序列(5614碱基对)(SEQ ID NO：5)在图13中列出。
13.2.在E3区中缺失1472碱基对的供体CMV-EGFP和CMV-PRV gD质粒的构建
pCMV-EGFP质粒(实施例6.1)用AsnI和MluI酶消化，然后用T4DNA聚合酶处理，以分离1.6-kbp AsnI(平端)-MluI(平端)片段。该片段与用PvuII和BglI预消化并用T4DNA聚合酶处理的pE3PAV5质粒(实施例13.1)连接，产生pE3dl1472CMV-EGFP质粒(图10)。在PvuII和BglI位点之间引入的缺失大小为1472bp。该缺失位于图13列出的序列(SEQ ID NO：5)的核苷酸2389与3861之间。
用AsnI和MluI酶消化pgD质粒(实施例6.1)，以分离2.3-kbpAsnI-MluI片段。然后用T4DNA聚合酶处理该片段使其成为平端，并与PvuII和BglI预消化并用T4DNA聚合酶处理的pE3PAV5质粒连接，产生pE3dl1472CMVgD质粒(图10)。
用NheI和MluI消化pCMV-EGFP质粒，以分离1.0-kbp NheI-MluI片段。用DNA聚合酶Klenow片段处理该片段使其成为平端，并与PvuII和BglI预消化并用T4DNA聚合酶处理的pE3PAV5质粒连接，产生pE3dl1472EGFP质粒(图11)。
用XhoI和ClaI消化pCMVgD质粒(实施例6.1)，以分离1.5-kbpXhoI-ClaI片段。用DNA聚合酶Klenow片段处理该片段使其成为平端，并与PvuII和BglI预消化并用T4DNA聚合酶处理的pE3PAV5质粒连接，产生pE3dl1472gD质粒(图12)。
实施例14：重组基因组pPAV5dl1472CMV-EGFP和pPAV5dl1472CMV-gD的构建
pE3dl1472CMV-EGFP质粒(实施例13.2)用PmeI线性化，然后与通过用BamHI酶部分消化而线性化的pPAV5质粒(实施例12)共转化BJ5183感受态细菌(BamHI A-BamHI D限制亚片段的连接位点，图12)。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV5dl1472CMV-EGFP质粒。
pE3dl1472CMVgD质粒(实施例13.2)用PmeI线性化，然后与通过用BamHI酶部分消化而线性化的pPAV5质粒(实施例12)共转化BJ5183感受态细菌(BamHI A-BamHI D限制亚片段的连接位点，图12)。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV5dl1472CMV-gD质粒。
实施例15：重组基因组pPAV5dl1472EGFP和pPAV5dl1472gD的构建(不含CMV启动子序列的编码序列的插入)
pE3dl1472EGFP质粒(实施例13.2)用PmeI线性化，然后与通过用BamHI酶部分消化而线性化的pPAV5质粒(实施例12)共转化BJ5183感受态细菌(BamHI A-BamHI D限制亚片段的连接位点，图12)。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV5dl1472EGFP质粒。
pE3dl1472gD质粒(实施例13.2)用PmeI线性化，然后与通过用BamHI酶部分消化而线性化的pPAV5质粒(实施例12)共转化BJ5183感受态细菌(BamHI A-BamHI D限制亚片段的连接位点，图12)。这种共转化通过在大肠杆菌中同源重组产生pPAV5dl1472gD质粒。
实施例16：利用克隆到大肠杆菌中的重组PAV5基因组转染，产生重组PAV5病毒
根据细胞系，用在4-12μl LipofectAMINE(Gibco-BRL Cat#18324-012)存在下稀释的、PacI预消化的2μg重组PAV-5基因组DNA，在6孔培养板中转染PK-15或ST细胞(见实施例1)，至60-80％的汇合密度。
在根据供应商推荐的条件转染后，培养细胞数天，直到出现病毒CPE。然后进行进一步的细胞培养传代，以扩增获得的重组病毒。
用pPAV5dl1472CMV-EGFP质粒(实施例14)进行转染产生重组病毒vPAV5-1。
用pPAV5dl1472CMV-gD质粒(实施例14)进行转染产生重组病毒vPAV5-2。
用pPAV5dl1472EGFP质粒(实施例15)进行转染产生重组病毒vPAV5-3。
用pPAV5dl1472gD质粒(实施例15)进行转染产生重组病毒vPAV5-4。
实施例19：根据本发明的疫苗的生产
在PK-15细胞培养中培养并扩增根据本发明获得的重组病毒。在观察到完全的细胞病变效应后收获上清液。通过低速离心除去细胞碎片使之澄清，随后离心浓缩病毒体并洗涤病毒沉淀，在培养基溶液中吸收沉淀。测定这些悬液的病毒滴度。然后任选地通过稀释调节病毒滴度，以获得10450％细胞培养感染剂量(CCID50)至107CCID50/ml的终病毒滴度。
然后能在冻干底物存在下冷冻或优选地冻干病毒悬液。
实施例20：猪的接种
在用可注射制剂用水融解或吸收冻干剂量，并任选地加入一种佐剂后，用104-107CCID50剂量的每种重组病毒接种猪。疫苗含有一种或多种表达不同免疫原的重组PAV病毒。
通过以2ml体积用针注射(肌肉内途径)或粘膜(鼻内或滴眼)(改变体积以适应每种途径)施用疫苗。
也可用无针注射器如PIGJET装置(Societe Endoscoptic，Laon，法国)进行皮内注射。
实施例21：伪狂犬病的接种/检测方案
用一种接种/检测方案评价由无佐剂重组vPAV3-2病毒(本发明的实施例10)悬液组成的疫苗的效能。
建立每组6只8-10周龄小猪，它们为在妊娠开始时即已对伪狂犬病病毒(PRV)接种的母猪所生。所有这些小猪在接种第D0天均确定具有母体抗PRV抗体。组1和组2的小猪在D0天鼻内接种1毫升(ml)滴度为107CCID50/ml的重组病毒vPAV3-2(PAV-3/PAV gD)悬液(每只鼻孔0.5ml)。组2以相同方式接种，但也在D21天接受第二次施用。组3在D0天肌肉内接受1ml滴度为107CCID50/ml的PAV-3/gD病毒悬液。组4以与组3相同的方式接种，但在D21天接受第二次病毒悬液注射。组5不接种，用作检测的阴性对照组。
所有组均在D35天通过施用2ml(每只鼻孔1ml)至少107.3pfu/ml滴度的PRV NIA3菌株悬液检测。
检测后，根据体重变化标准(delta G7)(Stellmann C.等人，生物标准杂志(J.Biol.Standard)1989，17，1-11)(检测后的D0-D7)和鼻粘膜的病毒分泌水平，并根据ELISA抗体效价和抗PRV血清中和滴度监测这些猪。
应当清楚地理解，附加权利要求所限定的本发明不限于以上说明书中所述的具体实施方案，而包括不背离本发明的内容和精神的变化。
                        序列表
<110>MERIAL
     Ecole Nationale Vinaire de Maisons ALFORT
<120>基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗
<130>PAV CN
<140>CN 00/804873
<141>2000-02-08
<150>FR 99/01813
<151>1999-02-11
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>1
ccttaattaa ggtagggata acagggtaat catcatcaat aatataccgc                 50
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>2
attaaccctc actaaaggga                                     20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>3
taatacgact cactataggg                                                 20
<210>4
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>4
ccttaattaa ggtagggata acagggtaat catcatcaat aatatacgga                50
<210>5
<211>5614
<212>DNA
<213>猪腺病毒5
<400>5
aagcttctct gccagattta acgagccaaa gcatgatgca gcaatttaga aactttaccc     60
tcgaaaggtc tggcattctt ccggcctgct gcaacgcctt tcccacggac tttgtaccca    120
tcacctataa agaatgccca ccccctctct ggggatactg ctacctcatg aggctggcca    180
actttatcat gttccacacc gatgtggctt acaacatgga aggggagggc ttgttcgaat    240
gctattgccg gtgcaacctt tgcacccctc accgatgctt ggccaccaac accgccctgt    300
taaacgaggt tcaggccatc ggcactttcg aacttcaagg tccaccaaac gaggatgggt    360
ccatgccaca cccactcaaa ctcacggccg gcgcctggac gagcgcctac cttaaaaagt    420
ttgaggaaaa agactactgt caccacacca tccaatttta cgaagaccaa tcaaaagcac    480
ccaaagcaga gttgaccgcc tgtgtcatca ctcaagccgc catcctcgcc caattacatg     540
acattaaaaa agcgcgggaa aacttcctcc ttaaaaaggg gcacggggta tacctcgacc     600
cacagaccgg agaggaactc aacacgtcca ccccctccgc cgccaacaat gccgaagcta     660
aaaactcctc gaccgggttc cctaaatctg acaaacccca tcatgaagaa gagcagaaaa     720
accaaacaga ttctgccgcc gcctcctcca actccagaag aagaggagat tatagacgag     780
gaggccgagg aatgggacga agagagcatg gattctcagg aaggattgga aaccatcgaa     840
gagctggagg aaggggaaat ccctcctacc cctccaacca ttcccaaaaa gcagcgtaga     900
tgggatcaga aacccgaatt gatcaacgcg cagaccggag gtaaggccga gtcaagatat     960
aagtcctggc gcagatacaa aaatattatt tataaaaccc tgatggccag cggctacgac    1020
gtctctttcg cgcgccgcta tcttctgttc agacacgggg tcaatattcc gaaaaatgta    1080
atccattact acaattccca ctgcagaaac caagaccccg aagaagtctg gaaggaaatc    1140
catccagtct gccaatatat ccaaagaacc agcgacgacc agagcgctaa gagctaggat    1200
ctttcccacg ttgtatgcca tcttccagca gagccgcgga gtagacagca acctcaaggt    1260
taaaaacaga tcacttcgct ctctcaccaa aagctgcttg tatcacaacc aggaatctca    1320
gcttcaaaga accttagagg acgctgaagc tctccttcac aagtactgct ccggtctgac    1380
tgcctcctct tataatgagt aaagacatcc ccacccctta cgtgtggacc tatcagcctc    1440
agctaggtca ggcggctggc gcgtcacaag actactccac ccgcatgaat tggctaagtg    1500
ccggaccgtc aatgattgac caggtgaatc agataagggt ggaacgcaat aatattttat    1560
tgcggcaggc ggcggccacg gagacgccca ggttagtgcg gaatccaccc aactggcccg    1620
cacgctacct gtaccagccc atgggtgcgc cgcaaacagt ggaacttccg cgtaatgagt    1680
tactcgaaac cgtcatgact aactctggaa tgcagttggc gggcggaggt cgcactacct    1740
gcggtataaa aggagcacac ctgagcggct caggtattca gctcaacgga gagctaccga    1800
gcgcctcttg gctgagacct gacggagtct tccagctagc tggtggcagc cgttcttctt    1860
tcagcccagg cgtcagcact ctgctgagac tagaaccatc ttcctcccta ccgagatccg    1920
gtgggattgg aagcacccaa ttcgttcaag agtttgttcc agccgtctac tttcagcctt    1980
tctccggacc acctggaaca tatcctgacg aattcatcta caactacgac atagtctctg    2040
actctgtcga cggttatgac tgatagagac gccagacttg ctgtcaccgc tctctcatcc    2100
ctgcatcaag agacctgcaa gagaagccac tgcttcacca aggccgacct caacctagcc    2160
tacttctgtg tgctgcccag cgaccttgaa gatgattgtg tgcctgactc cctccaagtc    2220
ggacacgggc ttcggcttga gcttccgtac tgcttcaaaa gctttttcat ctttaaggga    2280
ggaaaaaaat acctctgcag cgaacacctc caaaatggcc acctcaaagt ctcgtgcgac    2340
tgcgcctccc ctggcgccca tctcgacatg tttgacacac tttgccagct gtataacaac    2400
actgctcctc gtcctgattc tgtctcatct gactccgacg actgaagccg cccagccaga    2460
agtgcgcatc aaggcggtca cttacgactg gctgtgtgtg cttgacatca actgcactca    2520
ccagcagcct gtacacttaa aatggaaggg gtatgattac aagacaagcc atctcaccat    2580
caaagcaaac tcagacatct cagacgagcc cgtcatgtgt accacagaca accatcccag    2640
agaaacggcc actgttgaca ttcgagacca ctgcaaattt ccaccgaccg ttagatacat    2700
gctgaagaaa gtcctaccca tctacttcac ctttctgtca ggtgtgatgc tatgtctcgt    2760
gtttcctgca gctagatacc catcacttct gtcggctctt ccagttgcca tggctagcac    2820
cacatctagc atcactactg atgtgagtac tctgtcaaac tactccagcg aacaatctac    2880
aaccgaacat ccaaccacag caaattcaca gccttacacg gccgtggaga agacactgct    2940
tgctttgatt ccgatcctca ttgcctgcat tgtaatggtg cttgttttca catttctgct    3000
aaagaagaaa cagaaggaag taaatgacgc tggagtctac cccatataca gaccaagaag    3060
gtcgtcatcc atgtcaaagc taacacttat tactacactg tgtttactgg caaccgcaaa    3120
ctgcgaaaaa cactacaaat cttatgttga aggagaaaac gcctatcttg aaaatctatt    3180
taacaactac tgtgagctaa agtggtattg gttttatacg agacatgagg gatatgtttt    3240
ggcaaaacgc gatggcgacc acactcgtac atttgattta aaaccaaaaa acatgtatgt    3300
agatgaagat acttttgacc tgattataag aaacattgaa gtaaaaaaca ctggaatgta    3360
tgaagtagaa tatcactgtg gcacatatac aaggtctgag tactatgtag tcacagttct    3420
tccaaacatc gcagaatcat ctctaaacgt tgaatctgtg tctatcaacg gcagcatttg    3480
tcaaatctct ttacattgtg gcatcgagaa caacttagtg gaaacaagaa ttatatatga    3540
ggacaatgtc attagtgaca acaatcttat gctcagcttg aacatctcta aagaacccag    3600
cacactcact tgctttacta acacttctaa acaatctgta aaactaagtt tgaatatatc    3660
tgattattgc aaacaaccta attcaaaaca tgaaaaaatc atcctaagtg aagattcttc    3720
agaaaatgaa aagaagcaaa taatcgtttt ttcggtcaca gcggcagttg cattcctaat    3780
gattattcta ctgataatat ctttcaaacc aagactttgc ttcggaactc cagtatatgc    3840
agtcgtattg gctgccacag gggcagaagc ctcaaattgt acttgtgctg atgttaacaa    3900
cgattggtca tatgtcctag ttatcattct ttcaactcta acttgtatca gtctaattgt    3960
tggaattcta aagattattt ttctttgcct cttccgctgc ccaggcaatc atgatgatga    4020
tgatgtctaa ttgaaatcac taataaagat ttctaaacta aaattggctt tttcgttttt    4080
agcatgaaac gcgcaaagag atcaatacct acagactttg atccggttta tccatacggg    4140
aacccaccac ttaacataat tcctccattt tacagtacag atggttttca agagttccca    4200
gttacaacac tatctcttaa agtagacgac cctgttacct tttccaacac tgggggcatc    4260
acactgaaat tgggtggtgg tgttagcatc aaccaaaacg gagaactaga atcatcgtcc    4320
gtaccaacta tactaaatcc accacttgac aattccaacg gatcccttag cttaaatata    4380
ggagagggtt tacaggaaag caatggagca cttgtactct acaaagaacc accattcatt    4440
ttctcaagca acgcgctagg tatagatttg ggtaatggca tgcagctatc ggcagataaa    4500
ctgtcactaa aattgggaaa cggcttatcc ttttcatcag atggctcctt acaagttcaa    4560
acttcaccgc ctctgataaa tgggtcaagt attggtctaa acatcgcaaa ccctttttca    4620
atagactcaa atcaggcatt gtctttgcaa acggaatcat atttttctac aaacaactca    4680
ctttctttaa atgttggaga tggattgcaa accacaaaca accagctatc gcttcaggtg    4740
tcaccttact ttgggttttc atctgggtcc ctgtccttat ccattgctaa catgatgaac    4800
ctcaggaaca acactctagg agtaaatgtt ggcaacggcc tgtttgttaa tccttcgaac    4860
gcaatagctg tcaatgttag agcgccttta aactatagcg gtactacaaa atccgtaacc    4920
gttgtagccg gaccaggcct caccatcagc ggggaaacac ttggctctga tataagagtg    4980
aatgctggca atgggttgtt tgctgataca caaaatgtaa gggtaaaact aggtgccggg    5040
cttatttttg actcaaatgg aaatattcaa gtaaatgtgg gttctggatt gcaaatacag    5100
aacaatgctg tggtggtggc ctcatctacc aacacctcct catccattgc aagttactca    5160
gcaagttcag catctactcc cacatcgaca tcgcccacta gcgggacata tctctacaac    5220
tatcaaatag cctttagttg ggacattgta gaaaccgatc aaaactattt catctacacg    5280
ctcagatgca ccgagattac gcctcaaaat aatcaggtcg aactcagctt cacaccgaca    5340
gacccaaact ttataagttt ctttgactac ataaacacga tgcacaccgt tgcgcatcaa    5400
atttctggtt ctactgtaac caatataccc atcaccgtga cgtacagtaa ttctagcaac    5460
caactgagga ttatcttctc ctccacggtg gttaaaaacc taacaatgac accttgggtg    5520
gcgagcgttg tcaggcataa agcaaccatt actagtggaa gtgcgtggat gggcacggct    5580
tggtagccgg cttacctgta aagtttaaac gcgt                                5614
<210>6
<211>919
<212>DNA
<213>猪腺病毒3
<400>6
cctcgaccag caccgccgcc agtgccctaa ccgctgctgc ttcgccaggg aagggattca     60
cccggagtac ttttgcatca cccgcgagca ctttgaggcc gagtgcatcc ccgactctct    120
gcaagaaggc cacggtctgc gcttcagcct ccccacgcgc tacagcgacc gccgccaccg    180
cgatggagac cgcaccatcc tcacttcgta ctactgcggc cctgcttctt tcaaagttcg    240
ctgtctctgc ggccatcctg ctcctcaccc tcttcttctc gaccttctgt gtgagctgta    300
caaccgctcg tagcgtcagc ccctacacct cccctcgcgt ccaatttctg tccgacatag    360
aaccagactc tgactcttac tcgggctctg gctctgggga cgatgaagat tatgaatatg    420
agctggctac caacacaccg aacgaagaca ttctaggcag catagtcatc aacaaccaga    480
tcgggcccaa gaccctggcc ctgggatact tttatgccgc catgcagttt gtcttctttg    540
ccatcatcat catcgtcctc atcctctact accgccgcta cgtgctggcc accgccctca    600
tcgtgcagcg ccagatgtgg tcctccgagg ccgtcctgcg gaaaaccttc tcggccaccg    660
ttgtggttac tcccccaaaa caagtcaccc cctgcaactg ctcctgccgc ttcgaggaga    720
tggtgttcta ctacaccacc tccgtcttca tgccctggtg ggcctcatcc tcctgctcac    780
cgccatggtc cgcctggcca actggatagt ggatcagatg cccagcagga accgcgcccc    840
gccgctgcca ccgcccctca cctatgtggg accctgcgcc gaggaccaca tctacgatga    900
gccaaccgta gggcaatac                                                 919
<210>7
<211>623
<212>DNA
<213>猪腺病毒3
<400>7
tgtacaaccg ctcgtagcgt cagcccctac acctcccctc gcgtccaatt tctgtccgac     60
atagaaccag actctgactc ttactcgggc tctggctctg gggacgatga agattatgaa     120
tatgagctgg ctaccaacac accgaacgaa gacattctag gcagcatagt catcaacaac     180
cagatcgggc ccaagaccct ggccctggga tacttttatg ccgccatgca gtttgtcttc     240
tttgccatca tcatcatcgt cctcatcctc tactaccgcc gctacgtgct ggccaccgcc     300
ctcatcgtgc agcgccagat gtggtcctcc gaggccgtcc tgcggaaaac cttctcggcc     360
accgttgtgg ttactccccc aaaacaagtc accccctgca actgctcctg ccgcttcgag     420
gagatggtgt tctactacac cacctccgtc ttcatgccct ggtgggcctc atcctcctgc     480
tcaccgccat ggtccgcctg gccaactgga tagtggatca gatgcccagc aggaaccgcg     540
ccccgccgct gccaccgccc ctcacctatg tgggaccctg cgccgaggac cacatctacg     600
atgagccaac cgtagggcaa tac                                             623

Claims (12)

1.一种重组血清型3猪腺病毒，其含有编码至少一种免疫原的至少一种异源核酸分子，其中异源核酸分子插入PAV-3基因组的E3区，在具体的PAV-3株中插入区如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示，籍此，重组PAV可体内复制且表达免疫原，且其中免疫原选自2型猪环病毒、伪狂犬病病毒gB、伪狂犬病病毒gC、伪狂犬病毒gD的免疫原、猪流感病毒、细小病毒VP2、猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6、猪霍乱病毒E1、猪霍乱病毒E0、猪霍乱病毒E2的免疫原。
2.权利要求1的重组PAV，其中插入区部分或全部缺失。
3.权利要求1的重组PAV，其中异源核酸编码2型猪环病毒ORF1或2型猪环病毒ORF2，或者编码2型猪环病毒ORF1和ORF2。
4.权利要求1的重组PAV，其中异源核酸编码伪狂犬病毒gB；或伪狂犬病毒gC；或伪狂犬病毒gB和gD；或伪狂犬病毒gB和gC；或伪狂犬病毒gB、gC和gD。
5.权利要求1的重组PAV，其中异源核酸编码猪流感病毒HA、猪流感病毒NA和/或猪流感病毒NP。
6.权利要求1的重组PAV，其中异源核酸编码猪霍乱病毒E1和/或猪霍乱病毒E2。
7.猪疫苗或免疫组合物，其含有至少一种权利要求1至6中任一项所述的重组PAV，和兽医学可接受的载体或赋形剂。
8.权利要求7的猪疫苗或免疫组合物，其含有一种以上的重组PAV，其中重组PAV含有不同的异源核酸分子。
9.权利要求7或8的猪疫苗或免疫组合物，其含有佐剂。
10.权利要求9的猪疫苗或免疫组合物，其中佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，或者马来酸酐与烯基衍生物的共聚物。
11.权利要求9的猪疫苗或免疫组合物，其中佐剂为carbomer。
12.权利要求9的猪疫苗或免疫组合物，其中佐剂为EMA。
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