CN101056982A - 突变的猪生殖与呼吸综合征病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基因改造PRRS病毒和编码其的多核苷酸，所述PRRS病毒经如此改造，即将E蛋白中的保守半胱氨酸缺失或改变为非半胱氨酸残基。还提供了包含所述基因改造病毒和多核苷酸的疫苗。

Description

突变的猪生殖与呼吸综合征病毒
                      发明领域
本发明提供了基因改造PRRS病毒和编码其的多核苷酸。还提供了包含所述基因改造病毒和多核苷酸的疫苗。
                      发明背景
猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)的特征在于在母猪(sow)和小母猪(gilt)中的流产、死产和其他生殖问题，以及在幼猪中的呼吸系统疾病。致病因子是PRRS病毒，其为动脉炎病毒科(Arteriviridae)和巢病毒目(orderNidovirales)的成员。在20世纪80年代后期在北美和欧洲几乎同时出现该病毒的两种不同的基因型。如今在几乎所有产猪的国家，PRRS病毒为地方性的，且被认为是影响全球猪肉工业的经济上最重要的疾病之一。
目前，抗PRRS的商业疫苗包括经改造的活疫苗和杀死的(灭活的)疫苗。杀死的疫苗因不能诱导抗PRRS病毒的异源株系的强烈免疫性而一直受到置疑。经改造的活疫苗通过在细胞培养中进行系列传代而减毒，直至毒力丧失。经改造的活疫苗引发比杀死的疫苗更广泛的保护作用，但可能遭受许多安全问题的困扰，包括残留的毒力、扩散至未疫苗接种的猪以及遗传回复至毒力。由于在减毒过程期间所发生的抗原变化，此类疫苗还可能失去一些保护不受PRRS病毒的野生强毒株侵害的能力。因此紧迫需要新的且改进的、经改造的活疫苗来保护免受PRRS的侵害。
                    附图简述
图1.在使用亲本cDNA克隆pCMV-S-P129(上面)或突变的cDNA克隆pCMV-S-P129-E-C54S(下面)转染后的4天(左)和5天(右)，MARC-145细胞中的致细胞病变效应(CPE)。
图2.亲本P129病毒(上面)和突变的P129-E-C54S病毒(下面)的空斑形态学(plaque morphology)。转染MARC-145细胞单层，用琼脂覆层进行覆盖，进行温育直至空斑变得明显，并用中性红染色以显现所述空斑。突变型病毒的空斑更小，在中央具有更完全的CPE。
图3.来自PRRS病毒的北美和欧洲分离株的E蛋白的比对。
                    序列的简述
SEQ ID NO：1    穿梭质粒PTB-Shuttle-PRRSV-3997正向穿梭引物(Primer Shuttle Forward)
SEQ ID NO：2    穿梭质粒PTB-Shuttle-PRRSV-3997反向穿梭引物(Primer Shuttle Reverse)
SEQ ID NO：3    诱变引物2b-C54s-正向
SEQ ID NO：4    诱变引物2b-C54s-反向
SEQ ID NO：5    PRRSV P129的E蛋白
SEQ ID NO：6    PRRSV 129E蛋白的cDNA
SEQ ID NO：7    突变的ORF2b
SEQ ID NO：8    突变的ORF2b的肽
SEQ ID NO：9，11，15，19，23，27
                各种C54s突变-核苷酸序列
SEQ ID NO：10，12，16，20，24，28
                各种C54s突变-肽
SEQ ID NO：13，14，17，18，21，22，25，26，29，30
                C54s突变的正向(F)和反向(R)诱变引物
                      发明概述
本发明提供了基因改造PRRS病毒，所述PRRS病毒经如此改造，即将E蛋白中的保守半胱氨酸缺失或改变为非半胱氨酸残基。
本发明进一步提供了基因改造PRRS病毒，所述PRRS病毒经如此改造，即将E蛋白中的保守半胱氨酸缺失或改变为非半胱氨酸残基，条件是该非半胱氨酸残基不是酪氨酸。
本发明进一步提供了编码上述基因改造病毒的感染性RNA分子。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码上述感染性RNA分子的DNA序列。
本发明还提供了所述病毒的生物学上纯的(即基本上无其他病毒的)培养物。
本发明进一步提供了包含编码感染性RNA分子的DNA序列的病毒载体，所述感染性RNA分子编码上述的基因改造PRRS病毒。
本发明进一步提供了转染的宿主细胞，其包含前述的病毒、感染性RNA分子、分离的多核苷酸或病毒载体中的任何一种。
本发明进一步提供了用于保护猪动物免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗以对于产生抗PRRS病毒感染的免疫保护来说有效的量包含上述基因改造PRRS病毒；上述编码基因改造PRRS病毒的感染性RNA分子；上述编码基因改造PRRS病毒的分离的多核苷酸分子(任选地以质粒的形式)；或上述编码基因改造PRRS病毒的病毒载体；以及兽医学用途可接受的载体。
本发明进一步提供了用于保护猪动物免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括用上述疫苗对所述动物进行疫苗接种，所述疫苗的量对于产生抗PRRS病毒感染的免疫保护来说是有效的。
本发明提供了用于制备基因改造PRRS病毒的方法，所述方法包括突变编码感染性RNA分子的DNA序列和用合适的表达系统来表达基因改造PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码上述PRRS病毒。
可使用在本领域中通常已知的合适的表达系统从分离的多核苷酸分子表达野生型PRRS病毒或基因改造PRRS病毒，所述表达系统的实例描述于本申请中。例如，如在下面更详细地描述的，分离的多核苷酸分子可以在体外以质粒的形式存在，所述质粒能够在合适的宿主细胞中表达所编码的病毒。
通过综述，本发明的其他特征将变得明显。
                        发明详述
我们在此处公开了通过突变或删除在病毒的E(或2b)蛋白中发现的特定半胱氨酸残基来使强毒PRRS病毒减毒的方法，包含所述减毒病毒的免疫原组合物，和通过用所述免疫原组合物进行疫苗接种来保护猪免受PRRS侵害的方法。已通过该方法减毒的PRRS病毒应当保持野生强毒株的抗原特征，从而提供比基于经细胞培养减毒的病毒的疫苗更有效的保护作用。
动脉炎病毒编码暂时称为包膜(E)蛋白的小疏水性结构蛋白。(Snijder，E.J.，等人(1999).Identification of a novelstructural protein of arteriviruses.Journal of Virology 73(8)，6335-6345)。
还不清楚E蛋白的功能，但其在所有动脉炎病毒中是保守的。马动脉炎病毒中的敲除突变已显示，E蛋白是在细胞培养中的病毒复制所必不可少的。与各自由相应的独特亚基因组RNA编码的PRRS病毒的其他结构蛋白不同，E蛋白和GP2蛋白共有单一的亚基因组RNA。ORF2b(其编码E)完全包含在更大的ORF2a(其编码GP2)中但使用不同的阅读框架。尽管ORF2b的ATG起始密码子位于ORF2a起始密码子的下游，但其处于对于翻译起始来说更有利的环境中，并且可能是从该亚基因组RNA产生的主要产物。(Wu，W.H.，等人(2001).A 10-kDastructural protein of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus encoded by ORF2b.Virology 287(1)，183-191)
北美基因型PRRS病毒通常在其E蛋白的氨基酸序列中于第49和54位上包含两个半胱氨酸残基。使用北美PRRS分离株P129的感染性cDNA克隆，单独地将C49和C54突变成丝氨酸。所获得的C49S突变是有生活力的。类似地，C54S突变也是有生活力的，并且从感染性克隆中产生高产量的子代病毒。可容易地将P129-E-C49S和P129-E-C54S病毒进行传代，并在MARC细胞上进行滴定。然而，P129-E-C54S病毒展示出改变的空斑形态学(小的、清晰的空斑)和加速的致细胞病变效应(CPE)。该突变应当在猪中导致减毒作用。
欧洲基因型PRRS病毒在第51位上包含单一的半胱氨酸残基，当比对E蛋白序列时，其正好相应于北美PRRS病毒中的C54。我们预期，欧洲PRRSV E蛋白中的C51的消除(通过缺失或置换)将会具有与细胞培养中的P129-E-C54S类似的改变的表型，并且将会在猪中被减毒。(如下面所指出的，我们将在北美PRRS和欧洲PRRS E蛋白中都存在的半胱氨酸残基称为“保守半胱氨酸”)。该类型的病毒突变单独地或与其他减毒突变相组合地在对于设计新的PRRS疫苗方面是有价值的。
                       定义
CPE是致细胞病变效应。
将此处使用的术语PRRSV“E蛋白”或“ORF2b蛋白”定义为由PRRS病毒的欧洲和美洲分离株两者的ORF2b编码的多肽。与各自由相应的独特亚基因组RNA编码的PRRS病毒的其他结构蛋白不同，E蛋白和GP2蛋白共有单一的亚基因组RNA。ORF2b(其编码E)完全包含在更大的ORF2a(其编码GP2)中但使用不同的阅读框架。尽管ORF2b的ATG起始密码子位于ORF2a起始密码子的下游，但其处于对于翻译起始来说更有利的环境中，并且可能是从该亚基因组RNA产生的主要产物(Wu等人，2001)。
术语“欧洲PRRS病毒”是指具有与在1991年左右在欧洲首先分离的PRRS病毒(参见，例如，Wensvoort，G.，等人，1991，Vet.Q.13：121-130)相关的遗传特征的任何PRRS病毒株系。“欧洲PRRS病毒”在本领域有时也称作“Lelystad病毒”。
此处使用的术语“基因改造”，除非另外指出，是指通过人干预进行基因突变。
术语“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”是指当用本发明的病毒或多核苷酸感染或转染时能够产生感染性PRRS的细胞系。这样的细胞包括猪肺泡巨噬细胞和猪肺泡巨噬细胞的衍生物、MA-104细胞和MA-104细胞的衍生物、MARC-145细胞和MARC-145细胞的衍生物。对于证明本发明的小空斑表型来说特别优选的是MARC-145细胞。术语“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”也可包括活猪体内的细胞。
对于本发明目的，术语“免疫应答”是指针对特定抗原表位或有助于所述特定抗原表位的分解或抑制的抗体和/或细胞(例如T淋巴细胞)的产生。对于本发明目的，术语“有效的免疫保护应答”、“免疫保护”等是指针对病原体的一种或多种抗原表位以在经疫苗接种的动物中保护其免受该病原体感染的免疫应答。对于本发明目的，抗病原体感染的保护不仅包括对感染的绝对预防，还包括，与未疫苗接种的被感染的动物相比，在经疫苗接种的动物中病原体感染的程度或比率的任何可检测的减少，或由病原体感染造成的疾病或任何症状或病状的严重度的任何可检测的减轻。可在以前未曾用所述病原体感染的和/或在疫苗接种时未用所述病原体感染的动物中诱导有效的免疫保护应答。也可在疫苗接种时已用所述病原体感染的动物中诱导有效的免疫保护应答。
术语“突变的”是指优选地以改变所编码的氨基酸的方式将氨基酸替代为另一种氨基酸或将编码性核苷酸替代为另一种编码性核苷酸(例如将C替代为T)，即所谓的“置换”，或任何其他突变例如“缺失”或“插入”。总是在编码性核苷酸序列中进行所述突变。
术语“北美PRRS病毒”是指具有与北美PRRS病毒分离株相关的遗传特征的任何PRRS病毒，所述北美PRRS病毒分离株例如为，但不限于大约在20世纪90年代早期在美国首先分离的PRRS病毒(参见，例如，Collins，J.E.，等人，1992，J.Vet.Diagn.Invest.4：117-126)；北美PRRS病毒分离株MN-1b(Kwang，J.等人，1994，J.Vet.Diagn.Invest.6：293-296)；PRRS的Quebec IAF-exp91株系(Mardassi，H.等人，1995，Arch.Virol.140：1405-1418)；和北美PRRS病毒分离株VR 2385(Meng，X.-J等人，1994，J.Gen.Virol.75：1795-1801)。遗传特征是指由北美PRRS病毒株系共有的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。
如此处所用的，术语“开放阅读框架”或“ORF”是指对于编码特定PRRS病毒蛋白所需的无间插性终止密码子的最小核苷酸序列。
术语“猪(porcine)”和“猪(swine)”此处可互换使用，是指为猪科成员的任何动物，例如猪(pig)。此处所用的术语“PRRS病毒”或“PRRSV”，除非另外指出，是指北美或欧洲PRRS病毒的任何株系。
如此处所用的，术语“PRRS”包括在猪中由PRRS病毒感染引起的疾病症状。此类症状的实例包括，但不限于，怀孕的雌性中的流产，以及幼猪中的缓慢生长、呼吸困难、食欲不振和死亡。如此处所用的，“不能产生PRRS”的PRRS病毒是指这样的病毒，即其能够感染猪但在猪中不产生通常与PRRS感染相关的任何疾病症状，或者产生这些症状，但与野生型有毒害感染相比具有较低的程度，或产生比野生型有毒害感染更少数量的这些症状，或同时出现这两种状况。
术语“转染的宿主细胞”实际上是指当用PRRS病毒RNA转染时，可产生第一轮PRRS病毒体的任何宿主细胞，例如美国专利5,600,66(此处引用作为参考)中所描述的宿主细胞。如果想要进一步的产毒性感染，可使用如下定义的“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”。
可使用本领域技术人员已知的重组技术，包括通过本领域中已知的定向诱变，或通过随机诱变例如通过暴露于化学诱变剂或辐射，来对多核苷酸分子进行基因突变。可通过本领域中已知的标准方法来进行所述突变，例如所描述的感染性拷贝(例如Meulenberg等人，Adv.Exp.Med.Biol，1998，440：199-206)的定向诱变(参见例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
因此，本发明进一步提供了用于制备基因改造北美PRRS病毒的方法，所述方法包括突变编码感染性RNA分子的DNA序列和使用合适的表达系统来表达所述基因改造PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码上述的PRRS病毒。可使用在本领域中通常已知的合适的表达系统从分离的多核苷酸分子表达基因改造PRRS病毒，所述表达系统的实例描述于本申请中。例如，如在下面更详细地描述的，分离的多核苷酸分子可以在体外以质粒的形式存在，所述质粒能够在合适的宿主细胞中表达所编码的病毒。
目前已知的E蛋白的特定同种型的实例是73个氨基酸的美洲PRRS的多肽，其是根据处于基因组位置12,078-12,299上的在Genbank登录号U87392(也称作VR2332)中报导的序列而预测的，和是根据在Genbank登录号AF494042(也称作P129)中的序列而预测的，且报导为蛋白AAM18560.1；和70个残基的欧洲PRRS E蛋白，其是根据处于基因组位置11,801-12,013上的Genbank登录号M96262(也称作Lelystad分离株)而预测的。
北美PRRSV E蛋白的序列是高度保守的，并且所报导的序列相互之间具有大约93％的同一性。北美和欧洲PRRSV E蛋白具有大约83％的同一性，并且(除了许多其他残基外)在VR2332和P129分离株E蛋白的第54位残基和Lelystad分离株E蛋白的第51位残基上共有保守半胱氨酸。图3允许显现我们已称为“保守半胱氨酸”的半胱氨酸，即在欧洲和美洲PRRS分离株之间保守的半胱氨酸。上面所涉及的氨基酸的编号依照所述的数据库条目。在所有其他PRRS分离株(其可能以不同方式编号)中，通过鉴定目的PRRS株系中的保守的特征氨基酸并将其与参照株系比对，可容易地完成正确的半胱氨酸的鉴定。本发明的一个目的是改造PRRS病毒或其编码性核酸，从而通过置换、缺失或插入来消除该保守半胱氨酸，因而其导致产生小的空斑表型。
通过改造本发明的编码病毒的多核苷酸而引入消除保守半胱氨酸的缺失或置换。在优选的实施方案中，缺失或插入包括导致消除所述保守半胱氨酸的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，且其中所述缺失或置换在所得的病毒中导致小的空斑表型。优选的实施方案可以是5个或更少的氨基酸的缺失或插入。
可根据物理性质以及对于二级和三级蛋白质结构的贡献对氨基酸进行分类。保守置换在本领域中被认为是将一种氨基酸置换为具有相似性质的另一种氨基酸。示例性保守置换列于下面紧接着的表A(来自WO 97/09433，第10页，于1997年3月13日公开(PCT/GB96/02197，于9/6/96提交))中。
                    表A-保守置换I
侧链特征                        氨基酸
脂肪族
非极性                              GAP
                                    ILV
极性-不带电荷                       CSTM
                                    NQ
极性-带电荷                         DE
                                    KR
芳香族                              HFWY
其他                                NQDE
可选择地，如Lehninger，[Biochemistry，第二版；WorthPublishers，Inc.NY：NY(1975)，pp.71-77]中描述的，可对保守氨基酸进行分组，如在下面紧接着的表B中所示的。
               表B-保守置换II
侧链特征                          氨基酸
非极性(疏水的)
A.脂肪族：                        ALIVP
B.芳香族：                        FW
C.含硫的：                        M
D.不明确的：                      G
不带电荷-极性
A.羟基：                          STY
B.酰胺：                          NQ
C.巯基：                          C
D.不明确的：                      G
带正电荷(碱性)：                  KRH
带负电荷(酸性)：                  DE
作为另外一种选择，示例性保守置换显示于下面紧接着的表C中。
              表C-保守置换III
原始残基                          示例性置换
Ala(A)                            Val、Leu、Ile
Arg(R)                            Lys、Gln、Asn
Asn(N)                            Gln、His、Lys、Arg
Asp(D)                            Glu
Cys(C)                            Ser
Gln(Q)                            Asn
Glu(E)                            Asp
His(H)                            Asn、Gln、Lys、Arg
Ile(I)                            Leu、Val、Met、Ala、Phe
Leu(L)                            Ile、Val、Met、Ala、Phe
Lys(K)                            Arg、Gln、Asn
Met(M)                            Leu、Phe、Ile
Phe(F)                            Leu、Val、Ile、Ala
Pro(P)                            Gly
Ser(S)                            Thr
Thr(T)                            Ser
Trp(W)                            Tyr
Tyr(Y)                            Trp、Phe、Thr、Ser
Val(V)                            Ile、Leu、Met、Phe、Ala
                基因改造PRRS病毒的制备
重组DNA技术学包括旨在在DNA水平上改造核酸的极其多样且强有力的分子生物学技术，并且使得可能在分子水平上分析和改造基因组。在该方面，病毒例如PRRS病毒，因为其基因组的小尺寸，特别易于接受这样的操作。然而，重组DNA技术不能直接应用于非逆转录RNA病毒，因为这些病毒在其复制中不包括DNA过渡步骤。对于这样的病毒，在可将重组DNA技术应用于其基因组以产生经改造的病毒之前必须产生感染性cDNA克隆。可通过下列步骤来衍生出感染性克隆：构建所研究的病毒的全长(基因组长度)cDNA(此处指以广义使用的RNA的DNA拷贝，而不仅仅指以严格意义使用的mRNA的DNA拷贝)，之后在用该全长cDNA转染的细胞中在体内合成感染性转录物。也可通过从包含完整病毒基因组的全长或连接的部分长度cDNA片段进行体外转录而获得感染性转录物。在所有情况下，转录的RNA携带已被导入所述cDNA中的所有改造，并可用于进一步传代如此经改造的病毒。
欧洲PRRS病毒分离株Lelystad病毒的感染性克隆的制备描述于下列文献中：美国专利6,268,199，Meulenberg等人，July 31，2001，其以全文在此引用作为参考。命名为P129的北美PRRS病毒分离株的感染性cDNA克隆的制备描述于下列文献中：美国专利6,500,662，Calvert等人，December 31，2002，其以全文在此引用作为参考。P129cDNA的序列公开于Genbank登录号AF494042和美国专利6,500,662，Calvert等人，December 31，2002中。下面，我们的工作使用这样的感染性克隆，所述克隆在质粒的情况下由CMV即时早期启动子表达，并被称为pCMV-S-P129，并且还公开于美国专利6,500,662，Calvert等人，December 31，2002中。如在美国专利6,500,662，Calvert等人，December 31，2002中所述，其他质粒和启动子也是合适的。
很明显，如果知道了任何目的开放阅读框的完整序列和目的氨基酸残基的位置，本领域技术人员只需查阅密码子表就能够在想要的特定位置上设计变化。
                              表D
  来自P129分离株的E蛋白的编码序列
   M   G   S   I   Q   S   L   F   D   K   I   G   Q   LATG GGG TCT ATA CAA AGC CTC TTC GAC AAA ATT GGC CAG CTTF   V   D   A   F   T   E   F   L   V   S   I   V   DTTT GTG GAT GCT TTC ACG GAA TTT TTG GTG TCC ATT GTT GATI   I   I   F   L   A   I   L   F   G   F   T   I   AATC ATC ATA TTT TTG GCC ATT TTG TTT GGC TTC ACC ATC GCCG   W   L   V   V   F   C   I   R   L   V   C   S   AGGT TGG CTG GTG GTC TTT TGC ATC AGA TTG GTT  TGC TCC GCGV   F   R   A   R   P   A   I   H   P   E   Q   L   QGTA TTC CGT GCG CGC CCT GCC ATT CAC CCT GAG CAA TTA CAGK   I   L   *AAG ATC CTA TGA
氨基酸及其代表性缩写、符号和密码子的项目表在下面列于随后的表E中。
                                  表E
  氨基酸   缩写   符号   密码子
  丙氨酸   Ala   A   GCA   GCC   GCG   GCU
  半胱氨酸   Cys   C   UGC   UGU
  天冬氨酸   Asp   D   GAC   GAU
  谷氨酸   Glu   E   GAA   GAG
  苯丙氨酸   Phe   F   UUC   UUU
  甘氨酸   Gly   G   GGA   GGC   GGG   GGU
  组氨酸   His   H   CAC   CAU
  异亮氨酸   Ile   I   AUA   AUC   AUU
  赖氨酸   Lys   K   AAA   AAG
  亮氨酸   Leu   L   UUA   UUG   CUA   CUC   CUG   CUU
  甲硫氨酸   Met   M   AUG
  天冬酰胺   Asn   N   AAC   AAU
  脯氨酸   Pro   P   CCA   CCC   CCG   CCU
  谷氨酰胺   Gln   Q   CAA   CAG
  精氨酸   Arg   R   AGA   AGG   CGA   CGC   CGG   CGU
  丝氨酸   Ser   S   AGC   AGU   UCA   UCC   UCG   UCU
  苏氨酸   Thr   T   ACA   ACC   ACG   ACU
  缬氨酸   Val   V   GUA   GUC   GUG   GUU
  色氨酸   Trp   W   UGG
  酪氨酸   Tyr   Y   UAC   UAU
如在本领域中熟知的，密码子由mRNA和其相应的cDNA分子中的三联体核苷酸序列组成。当存在于mRNA分子中时，密码子的特征在于碱基尿嘧啶(U)，但当存在于DNA中时，特征在于碱基胸苷(T)。在多核苷酸内相同氨基酸残基的密码子的简单改变将不会改变所编码的多肽的序列或结构。很明显，当提及特定的3核苷酸序列“编码”任何特定的氨基酸时，本领域普通技术人员将认识到上表提供了鉴定所讨论的特定核苷酸的手段。作为实例，如果特定的三核苷酸序列编码半胱氨酸，那么上表公开了，两个可能的三联体序列是UGC(TGC，如果在DNA中)和UGU(TGT，如果在DNA中)。丝氨酸由AGC、AGU(AGT，在DNA中)、UCA(TCA，在DNA中)和UCC(TCC，在DNA中)、UCG(TCG，在DNA中)和UCU(TCT，在DNA中)编码。为了在所编码的蛋白质中将半胱氨酸改变成丝氨酸残基，可以在编码性核酸中用AGC、AGT、TCA、TCC、TCG或TCT中的任一个替代TGC或TGT三联体。
在下文中通过举例说明性的实施例来证明就是这样的突变型蛋白E多核苷酸序列的构建。
实施例1：穿梭质粒PTB-SHUTTLE-PRRSV-3997的构建
构建穿梭质粒以有利于将特定的修饰导入全长PRRS病毒基因组cDNA克隆中。通过PCR扩增出3,997bp的片段，其代表该病毒基因组的最3’末端(核苷酸位置11,504至15,416，包括21个残基的多腺苷酸尾(polyadenosine tail))和84bp的下游载体序列。PCR反应体系包含5ng的pCMV-S-P129质粒DNA(US 6,500,662 B1)、300ng正向引物P-shuttle-Fwd(SEQ ID NO：1，5’-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3’：位置11,504至11,530)、300ng反向引物P-shuttle-Rev(SEQ ID NO：2，5’-ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC-3’：位置15,500至15,475)、1mM各dNTP、1×PCR缓冲液[10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.8)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100]和2.5U的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，使用GeneAmp PCR系统2400(Perkin Elmer)。在95℃下加热反应体系5分钟，然后在下列条件下进行35个扩增的循环：在95℃下变性30秒，在55℃下引物退火1分钟，和在72℃下延伸3分钟。使用TrueBlue MicroCartridgeTM PCR Cloning Kit XL(Genomics One；Buffalo，New York)将PCR产物克隆入pTrueBlue载体中，从而产生pTB-shuttle-PRRSV-3997。
实施例2：置换蛋白E(或2B)中的半胱氨酸残基54以产生
                  P129-E-C54S病毒
由ORF 2b编码的PRRSV P129的E蛋白在氨基酸位置49和54处包含两个半胱氨酸残基，参见SEQ ID NO：5，MGSIQSLFDKIGQLFVDAFTEFLVSIVDIIIFLAILFGFTIAGWLVVF CIRLVCSAVFRARPAIHPEQLQKIL。SEQ IDNO：5的cDNA为SEQ ID NO：6，ATGGGGTCTATACAAAGCCTCTTCGACAAAATTGGCCAGCTTTTTGTGGATGCTTTCACGGAATTTTTGGTGTCCATTGTTGATATCATCATATTTTTGGCCATTTTGTTTGGCTTCACCATCGCCGGTTGGCTGGTGGTCTTTTGCATCAGATTGGTTTGCTCCGCGGTATTCCGTGCGCGCCCTGCCATTCACCCTGAGCAATTACAGAAGATCCTATGA。
使用基于PCR的定向诱变，用丝氨酸替代在位置54(P129基因组中的核苷酸位置12,221-12,223)上的半胱氨酸残基。使用穿梭质粒pTB-shuttle-PRRSV-3997作为模板，使用诱变引物2b-C54S-Fwd(SEQ ID NO：3，5′-GCATCAGATTGGTT AGCTCCGCGGTATTCCG-3′：核苷酸位置12,207至12,238)和2b-C54S-Rev(SEQ ID NO：4，5′-CGGAATACCGCGGA GCTAACCAATCTGATGC-3′：核苷酸位置12,207至12,238)。突变的密码子以下划线标示。使用5ngpTB-shuttle-PRRSV-3997质粒DNA，各300ng的正向和反向引物，各1mM浓度的dCTP、dGTP、dATP和dTTP，1×PCR缓冲液[10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.8)、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100]，和2.5U的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)来进行PCR扩增。在下列条件下将样品进行16个循环的扩增：在94℃下变性30秒，在55℃下引物退火1分钟，和在68℃下引物延伸12分钟30秒。在PCR循环后，用10U的DpnI消化PCR产物以除去甲基化的质粒DNA模板。使用4μl包含所述经突变的质粒的PCR-Dpn I消化反应体系通过热激来转化大肠杆菌XL1-Blue细胞，并将其涂板在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上。随机挑选菌落并培养过夜。使用QIAprep spinminiprep试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。通过核苷酸测序来证实存在想要的从半胱氨酸至丝氨酸的突变(C54S)，并将所得的质粒称为pTB-shuttle-E-C54S。突变的ORF2b的序列显示于SEQ ID NO：7中，ATGGGGTCTATACAAAGCCTCTTCGACAAAATTGGCCAGCTTTTTGTGGATGCTTTCACGGAATTTTTGGTGTCCATTGTTGATATCATCATATTTTTGGCCATTTTGTTTGGCTTCACCATCGCCGGTTGGCTGGTGGTCTTTTGCATCAGATTGGTTAGCTCCGCGGTATTCCGTGCGCGCCCTGCCATTCACCCTGAGCAATTACAGAAGATCCTATGA，和所编码的肽显示于SEQ ID NO：8中，MGSIQSLFDKIGQLFVDAFTEFLVSIVDIIIFLAILFGFTIAGWLVVFCIRLVSSAVFRARPAIHPEQLQKIL。
穿梭质粒pTB-shuttle-E-C54S和野生型全长基因组克隆pCMV-S-P129都包含唯一的Eco47 III和BsrG I位点(分别为位置285和1,192，以及位置11,785和12,692)。用Eco47 III和BsrG I消化各质粒。从pTB-shuttle-E-C54S凝胶纯化出908bp的Eco47III-BsrG I片段，和从pCMV-S-P129凝胶纯化出17,984bp的Eco47III-BsrG I片段。使用T4 DNA连接酶(Invitrogen)连接所述两个片段以构建C54S-修饰的全长基因组cDNA克隆。用10μl的连接反应产物转化大肠杆菌菌株DH5-α。从含有氨苄青霉素的LB板上选择菌落并制备质粒DNA。基于Xma I消化图谱，选择全长克隆。对所选择的克隆进行测序以确认在所述全长基因组cDNA克隆中存在C54S修饰。将所得的质粒称为pCMV-S-P129-E-C54S。
将MARC-145细胞在37℃和5％CO2下培养在补充有8％胎牛血清(FBS；Gibco BRL)、氨苄青霉素(100U/ml)和链霉素(50μg/ml)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。将细胞接种在35mm直径的培养皿中并生长至70％的汇合。使用Lipofectin(Invitrogen)，用2μg的pCMV-S-P129-E-C54S或亲本pCMV-S-P129质粒DNA转染细胞，进行24小时。将转染的细胞于37℃在补充有8％FBS的DMEM中温育5天。从转染后3天观察到PRRSV特异性致细胞病变效应(CPE)，并在转染后5天看到该效应进一步扩散至相邻的细胞。使用非结构蛋白nsp2和nsp3的兔抗血清和N-特异性MAb SDOW17，通过免疫荧光细胞染色来确认CPE的特异性。在转染后5天收获来自转染的细胞的培养物上清液并将其称为‘1-代P129-E-C54S’(P1)。使用该1-代病毒接种新的MARC-145细胞，并将第5天的收获物称为‘2-代’(P2)。以与P2相同的方法制备‘3-代’病毒。将各病毒传代物1ml等分试样贮存于-80℃下直至使用。通过空斑测定法滴定P129-E-C54S病毒的各传代物，1-、2-和3-代的滴定度分别被测定为1.5×104、5×105和1×104pfu/ml。从pCMV-S-P129产生野生型P129病毒，并平行地对其进行滴定，所得的1-、2-和3-代的滴定度分别为1×103、1×104和5×105pfu/ml。
相对于P129亲本病毒，P129-E-C54S病毒诱导了不同的致细胞病变效应(CPE)的形成(显示出CPE出现的缓慢起始)和展示了小空斑表型。用亲本cDNA克隆PCMV-S-P129或突变型cDNA克隆pCMV-S-P129-E-C54S转染MARC-145细胞导致受感染细胞的可见转化灶，并且在大约转染后第4天之后，由P129-E-C54S病毒介导的CPE在大小上和由P129亲本病毒介导的CPE非常相似，但在表现上更慢。然而，此后(大约转染后第5天之后)，该突变型病毒导致快速且广泛的CPE，在转化灶内存在成片的死亡或脱离的细胞，然而亲本病毒在相同的时间期间只显示出转化灶大小的适度增加。在图1中图解说明了CPE的差异。病毒滴定度与该CPE的差异相符，在前两个病毒传代期间突变体比亲本产生更多的子代病毒(但在第三个传代中产生更少的子代)。空斑形态学的差异显示于图2中。相对于亲本P129空斑，P129-E-C54S病毒产生直径更小的且形态学不同的空斑。P129-E-C454S空斑更清晰，这是由于空斑中心的细胞比在P129空斑中更快速和更完全地死亡和脱离而造成的。尽管可存在许多关于小空斑表型的生物学解释，但观察到小空斑是P129-E-C54S病毒比其亲本更慢地在细胞间扩散的直接证据。可将该特征用于本发明以从强毒亲本病毒产生减毒的(毒力更低的)活疫苗病毒。
事实上，有产生小空斑表型并且其自身在其天然宿主中被减毒的病毒的许多实例(Mathew等人，The extracellular domain ofvaccinia virus protein B5R affects plaque phenotype，extracellular enveloped virus release，and intracellular actintail formation.Journal of Virology.72(3)：2429-38，(1998)；Engelstad等人，The vaccinia virus 42-kDa envelope protein isrequired for the envelopment and egress of extracellular virusand for virus virulence.Virology.194(2)：627-37，(1993)；Lewis等人，An African swine fever virus ERV1-ALR homologue，9GL，affects virion maturation and viral growth in macrophages andviral virulence in swine.Journal of Virology.74(3)：1275-85，(2000)；Lee等人，Common E protein determinants for attenuationof glycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitisand West Nile viruses.Journal of Virology.78(15)：8271-80(2004)；Frampton等人，Contribution of gene products encodedwithin the unique short segment of equine herpesvirus 1 tovirulence in a murine model.Virus Research.90(1-2)：287-301，(2002)；Lee等人，Mechanism of virulence attenuation ofglycosaminoglycan-binding variants of Japanese encephalitisvirus and Murray Valley encephalitis virus.Journal of Virology.76(10)：4901-11，(2002)；Butrapet等人，Attenuation markers ofa candidate dengue type 2 vaccine virus，strain 16681(PDK-53)，are defined by mutations in the 5′noncoding region andnonstructural proteins 1 and 3.Journal of Virology.74(7)：3011-9，(2000))。下列来源于美国专利公开号2002/0012670的实施例，提供了比较PRRS病毒的2个不同株系的毒力特征的明确的指导。
      实施例3：第54位半胱氨酸残基的回复抗性突变
通过改变单个密码子中的单个核苷酸(从TGC(半胱氨酸)至AGC(丝氨酸))产生实施例2中描述的C54S突变。尽管足以确定突变的表型，但可预测，由于随机突变和自然选择的原因，所得的病毒可能以相对较高的频率回复至亲本序列(和亲本表型)。本发明的优选的实施方案，特别是对于疫苗目的的实施方案，可包含多个核苷酸置换和/或缺失，其设计用于使第54位上的残基回复至半胱氨酸的概率最小化，和使其他侧翼残基(特别是第51-57位残基)突变成半胱氨酸的概率最小化。遗传密码子的检查揭示出，半胱氨酸只由两种密码子(TGT和TGC)编码。使用需要两个或三个单独的核苷酸突变事件才变成半胱氨酸密码子的密码子要优于只需要一个所述突变事件的密码子。此类“回复抗性(reversion resistant)”突变的实例显示于表F中，并希望用于进行代表性的说明而不是进行限制。本领域技术人员可想到回复抗性突变的许多其他实例。
突变C54S-2(参见表F)导致与C54S突变相同的氨基酸改变，但丝氨酸密码子的选择从AGC变为TCG。因此，产生半胱氨酸密码子需要两个独立的核苷酸突变，从而相对于C54S减少了表型回复的概率。突变C54S-3在第54位上整合了相同的丝氨酸密码子，但也改变了亮氨酸52(从TTG至CTG)、缬氨酸53(从GTT至GTA)和丝氨酸55(从TCC至TCG)的密码子。结果，这三个密码子不太可能突变成半胱氨酸密码子，从而不太可能功能性地对于第54位上的半胱氨酸残基的不存在作出补充。在CS54-55AA突变中，C54和S55都被突变以编码丙氨酸残基。与丝氨酸一样，丙氨酸具有小的、不带电荷的侧链，但缺少半胱氨酸的形成二硫键或与金属离子相互作用的能力。四种可能的丙氨酸密码子中的两种(GCG和GCA)与半胱氨酸密码子十分不同，这样为了产生半胱氨酸密码子必须改变所有三个核苷酸。因此，丙氨酸置换是进一步减少表型回复的概率的优选方法。最后，在CS54-55delA突变中，缺失了第54位的密码子。此外，将丝氨酸55改变成丙氨酸，并且改变了亮氨酸52和缬氨酸53的密码子。预期这些突变型病毒的表型回复是极其罕见的。
当设计回复抗性突变时，有时可以如此挑选可选择的密码子，即产生或破坏限制性内切酶识别位点。这些差异可用作区分突变的和非突变的质粒和病毒的方便的标记。在突变C54S-3、CS54-55AA和CS54-55delA(表F)的情况下，S55密码子TCC至TCG(丝氨酸)或GCG(丙氨酸)的突变导致天然出现的SacII限制位点(CCGCGG)的破坏。
因为ORF2b与ORF2a(其在不同的阅读框架中编码GP2)重叠，所以在改造ORF2b中的密码子的过程中，必须小心不要将终止密码子引入ORF2a中。在一些情况下，对ORF2b的密码子改变可改变由ORF2a编码的氨基酸序列。这些改变对GP2蛋白功能的影响可能难以预测且最好凭经验确定。
                                              表F
  标号   核苷酸序列(显示了基因组位置12,212-12,232)。突变的核苷酸以下划线标示。   氨基酸序列(E蛋白残基51-57)。突变的残基以下划线标示。   正向(F)和反向(R)诱变引物(对于前两个引物对，基因组位置12,207-12,238；对于剩下的引物对，基因组位置12,203-12,242)。突变的核苷酸以下划线标示。
  WT(“野生型”，亲本)   SEQ ID NO：9AGATTG GTTTGCTCCGCGGTA   SEQ ID NO：10RLVCSAV   不可应用
  C54S   SEQ ID NO：11AGATTGGTT AGCTCCGCGGTA   SEQ ID NO：12RLV SSAV   SEQ ID NO：13F-GCATGAGATTGGTT AGCTCCGCGGTATTCCGSEQ ID NO：14R-CGGAATACCGCGGAGC TAACCAATCTCATGC
  C54S-2   SEQ ID NO：15AGATTGGTTT CGTCCGCGGTA   SEQ ID NO：16RLV SSAV   SEQ ID NO：17F-GCATGAGATTGGTTT CGTCCGCGGTATTCCGSEQ ID NO：18R-CGGAATACCGCGGA CGAAACCAATCTCATGC
  C54S-3   SEQ ID NO：19AGA CTGGT AT CGTC GGCGGTA   SEQ ID NO：20RLV SSAV   SEQ ID NO：21F-TTTTGCATGAGA CTGGT AT CGTC GGCGGTATTCCGTGCGSEQ ID NO：22R-CGCACGGAATACCGC CGA CGA TACCA GTCTCATGCAAAA
  CS54-55AA   SEQ ID NO：23AGA CTGGTG GCGGC GGCGGTA   SEQ ID NO：24RLV AAAV   SEQ ID NO：25F-TTTTGCATGAGA CTGGTG GCGGC GGCGGTATTCCGTGCGSEQ ID NO：26R-CGCACGGAATACCGC CG CCGCCACCA GTCTCATGCAAAA
  CS54-55delA   SEQ ID NO：27AGA CTGGTG ——GC GGCGGTA   SEQ ID NO：28RLV -AAV   SEQ ID NO：29F-TTTTGCATGAGA CTGGTG GC GGCGGTATTCCGTGCGSEQ ID NO：30R-CGCACGGAATACCGC CG CCACCA GTCTCATGCAAAA
            实施例4：减毒作用的建立
在每个试验中包括每组至少10只来源于无PRRSV农场的小母猪。
动物经检测无PRRS病毒特异性血清抗体且对于PRRSV是阴性的。试验中包括的所有动物的来源和品种都相同。随机地将动物分配至各组。
在怀孕的第90天通过鼻内施用1ml PRRSV(105 TCID50/鼻孔)进行攻击。每个测试方案至少具有三个组：一个组用于P129攻击；一个测试组用于用可能减毒的病毒进行攻击；和一个严格的对照组。
当严格对照在研究的整个时间期间都保持PRRSV阴性，并且与严格对照相比，在受P129攻击的组中出生至少少25％的活的健康小猪时，该研究被认为是有效的。
减毒，换句话说就是较小的毒力，其被定义为一个或多个确定生殖性能的参数的统计学上显著的改变：
与受P129感染的组相比，测试组(可能减毒的病毒)的下列参数中的至少一个参数显著地减少是优选的：
a.)死产的频率
b.)在怀孕的第112天或之前流产
c.)干尸化(mummified)小猪的数目
d.)活力较低和虚弱的小猪的数目
e.)断奶前死亡率
此外，与受P129感染的组相比，测试组的下列参数中的一个参数显著增加是优选的：
f.)断奶的小猪的数目/母猪
g.)出生的活的健康小猪的数目/母猪。
                        疫苗
减毒株对于疫苗的配制是有价值的。如果本疫苗保护猪免受PRRS病毒的感染，则其是有效的。如果在将疫苗给一个或多个未受侵害的猪施用后，随后用生物学上纯的病毒分离株(例如，VR 2385、VR 2386、P129等)进行攻击，与通常由所述分离株在未受保护的相似猪中造成的这些改变或症状相比(即相对于合适的对照)，导致任何宏观或组织病理学变化(例如，肺的损伤)和/或疾病症状的严重度减轻，那么该疫苗保护猪抵抗PRRS病毒的感染。更特别地，可通过下列方法来显示本疫苗是有效的：将所述疫苗给一个或多个有此需要的合适的猪施用，然后在适当长度的时间(例如，4周)后，用生物学上纯的PRRSV分离株的大样品(10(3-7)TCID(50))进行攻击。然后，在大约1周后从受攻击的猪中抽取血液样品，然后尝试从血液样品中分离该病毒(例如，参见下面实施例VIII中示例性的病毒分离方法)。分离出高水平的病毒(类似于未疫苗接种的、受攻击的对照猪)是疫苗可能无效的指标。不能分离出病毒，或分离出的病毒量减少，是疫苗可能有效的指标。
因此，可定量(即，与合适的对照组相比，愈合的(consolidated)肺组织的百分比的减少)或定性(例如，从血液中分离出PRRSV，通过免疫测定法在肺、扁桃体或淋巴节组织样品中检测出PRRSV抗原)地评价本疫苗的功效。可定量(例如，温度/发烧)、半定量(例如，呼吸窘迫[在下面详细地解释]的严重度)或定性(例如，一种或多种症状的存在或不存在，或一种或多种症状例如发绀、肺炎、心脏和/或大脑损伤等的严重度的减轻)地评价猪生殖和呼吸系统疾病的症状。
未受侵害的猪是还未暴露于猪生殖和呼吸系统疾病感染因子或已暴露于猪生殖和呼吸系统疾病感染因子但未显示所述疾病的症状的猪。受侵害的猪是显示PRRS的症状或可从其中分离出PRRSV的猪。
可按照公认的惯例包含可接受的用于动物(包括人(如果适用的话))的载体例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，来配制本发明的疫苗，也可将本发明的疫苗配制成用于促进持续释放。稀释剂包括水、盐溶液、葡萄糖、乙醇、甘油等。用于等渗性的添加剂，除其他以外，包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。稳定剂，除其他以外，包括白蛋白。其他合适的疫苗媒介物和添加剂，包括特别地可用于配制改造活疫苗的那些，对于本领域技术人员来说是已知的或将是显然的。参见，例如，Remington′s PharmaceuticalScience，第18版，1990，Mack Publishing，其在此引用作为参考。
本发明的疫苗还可进一步包含一种或多种另外的免疫调节组分，例如，除其他以外，佐剂或细胞因子。可用于本发明疫苗的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.，Hamilton，Mont.)、明矾、无机凝胶(mineral gel)例如氢氧化铝凝胶、水包油型乳液、油包水型乳液例如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)、AMPHIGEN佐剂、皂苷、QuilA或其他皂苷级分、单磷酰基脂质A和阿夫立定脂质-胺佐剂。用于本发明疫苗的水包油型乳液的非限制性实例包括改良的SEAM62和SEAM1/2制剂。改良的SEAM62是包含5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)SPAN85去污剂(ICI Surfactants)、0.7％(v/v)TWEEN80去污剂(ICI Surfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200pg/ml Quil A、100[mgr]g/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油型乳液。改良的SEAM 1/2是包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)SPAN85去污剂、0.7％(v/v)Tween 80去污剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A和50μg/ml胆固醇的水包油型乳液。可包含在所述疫苗中的其他免疫调节剂包括，例如，一种或多种白细胞介素、干扰素或其他已知的细胞因子。
任选地，可将本发明的疫苗配制成用于持续释放本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体。这些持续释放制剂的实例包括与生物相容性聚合物的复合物相组合的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体，所述生物相容性聚合物为例如，聚(乳酸)、聚(乳酸-共-羟乙酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。药物递送媒介物中的可降解的聚合物的结构、选择和用途已在几个出版物中进行了综述，所述出版物包括A.Domb等人，1992，Polymers for AdvancedTechnologies 3：279-292，其在此引用作为参考。选择和使用在药物制剂中的聚合物的其他指导可在本领域内已知的文献中找到，所述文献是例如M.Chasin和R.Langer(eds)，1990，″BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems″in：Drugs and thePharmaceutical Sciences，第45卷，M.Dekker，N.Y.，其也在此引用作为参考。可选择地，或另外地，可将病毒、质粒或病毒载体微胶囊化以改善施用和效能。用于微胶囊化抗原的方法在本领域是熟知的，并且包括例如在美国专利3,137,631、美国专利3,959,457、美国专利4,205,060、美国专利4,606,940、美国专利4,744,933、美国专利5,132,117和国际专利公开号WO 95/28227中描述的技术，所述文献全部在此引用作为参考。
也可使用脂质体以提供病毒、质粒或病毒载体的持续释放。关于如何制备和使用脂质体制剂的详细内容可在，除其他以外，美国专利4,016,100、美国专利4,452,747、美国专利4,921,706、美国专利4,927,637、美国专利4,944,948、美国专利5,008,050和美国专利5,009,956中找到，所述文献全部在此引用作为参考。
可通过常规方法，即从低剂量的病毒、质粒或病毒载体开始，然后增加剂量并同时监测效果，来确定上述疫苗中任一种的有效量。可在单次施用疫苗后或在多次施用疫苗后获得有效量。当确定最佳剂量/动物时，可考虑已知的因素。这些因素包括动物的物种、大小、年龄和一般状况，动物中其他药物的存在，等等。优选地，在考虑来自其他动物研究的结果后选择实际剂量。
检测是否已获得足够的免疫应答的一个方法是在疫苗接种后测定动物中的血清转变和抗体滴度。疫苗接种的时间方案和加强免疫的次数(若有的话)，优选地将由医生或兽医基于所有相关因素(其中一些因素在上面进行了描述)的分析来确定。
可使用已知的技术，考虑可由本领域技术人员确定的因素例如待疫苗接种的动物的体重，来测定本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量。本发明疫苗中的本发明病毒的剂量优选地为大约101至大约109pfu(空斑形成单位)，更优选地为大约102至大约108pfu，和最优选地为大约103至大约107pfu。本发明疫苗中的本发明质粒的剂量优选地为大约0.1μg至大约100mg，更优选地为大约1μg至大约10mg，更加优选地为大约10μg至大约1mg。本发明疫苗中的本发明感染性RNA分子的剂量优选地为大约0.1至大约100mg，更优选地为大约1μg至大约10mg，更加优选地为大约10μg至大约1mg。本发明疫苗中的本发明病毒载体的剂量优选地为大约101pfu至大约109pfu，更优选地为大约102pfu至大约108pfu，和更加优选地为大约103至大约107pfu。合适的给药体积为大约0.5ml至大约10ml，和更优选地为大约1ml至大约5ml。
本发明进一步提供了制备包含此处描述的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的疫苗的方法，该方法包括将有效量的本发明的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体之一与药物或兽医学用途可接受的载体组合。
此外，可如美国专利6,500,662中所描述的来改造本发明的减毒活疫苗以编码异源抗原表位，所述异源抗原表位通过使用已知的重组技术而被插入PRRS病毒基因组内)。用作用于本发明的异源抗原表位的抗原表位包括来自除了PRRS病毒外的猪病原体的抗原表位，其包括，但不限于来自选自猪细小病毒、猪圆环病毒、猪轮状病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus)、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸系统冠状病毒(porcine respiratory coronavirus)、典型猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、脑心肌炎病毒、猪副粘病毒、大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoni)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthraci)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、产气英膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、大肠杆菌(Escherichia coli)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothdix rhusiopathiae)、副猪嗜血菌(Haemophilusparasuis)、钩端螺旋体属物种(Leptospira spp.)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、似马链球菌(Streptococcus equismilis)和猪链球菌(Streptococcussuis)的猪病原体的抗原表位。编码来自上述猪病原体的抗原表位的核苷酸序列在本领域是已知的，并且可从公共基因数据库例如由NCBI提供的GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html)获得。
根据本申请的全部内容，包括详述，本发明的另外特征和变化形式对于本领域技术人员来说将会是明显的，并且希望所有这些特征用作本发明的方面。同样地，可将此处描述的本发明的特征重新组合入也希望用作本发明的方面的另外实施方案中，无论特征的组合是否在上面被明确地提及作为本发明的方面或实施方案。此外，只有在此处被描述为对本发明至关重要的这样的限制应当被视为是重要的；而希望将此处未被描述为至关重要的限制性条件的本发明变化形式视作本发明的方面。很清楚，可以以与在前面的描述和实施例中特别地进行描述的方式不同的方式来实施本发明。
根据上面的教导可能对本发明进行许多修饰和变化，并且因此在本发明的范围之内。
此处引用的所有出版物的全部公开内容在此引用作为参考。
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     Calvert，Jay G.
     Lee，Changhee
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<151>2004-11-11
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<170>PatentIn version 3.3
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Claims (15)

1.包含至少一种下列物质的组合物：
a)基因改造PRRS病毒，其这样改造，即E蛋白中的保守半胱氨酸残基被突变；
b)编码a)的基因改造PRRS病毒的感染性RNA分子；
c)分离的多核苷酸分子，其包含编码b)的感染性RNA分子的DNA序列。
2.权利要求1的组合物，其中所述保守半胱氨酸被缺失或用非半胱氨酸残基替代。
3.权利要求2的组合物，其中所述半胱氨酸用另一个非半胱氨酸残基替代，条件是该残基不是酪氨酸。
4.权利要求1的组合物，其中所述保守半胱氨酸用丝氨酸替代或用丝氨酸的保守性置换替代。
5.权利要求1的组合物，其中所述保守半胱氨酸用选自丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的氨基酸残基替代。
6.权利要求1的组合物，其中所述保守半胱氨酸用选自丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基替代。
7.权利要求1至6的组合物，其中使所述保守半胱氨酸突变具有抗回复的特性，以最小化第54位上的残基回复成半胱氨酸的可能性。
8.权利要求1的组合物，其中所述PRRS病毒是北美PRRS病毒或欧洲PRRS病毒。
9.权利要求1的组合物，其中所述改造导致小空斑表型病毒。
10.用于保护猪动物免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗以对于产生抗PRRS病毒感染的免疫保护来说有效的量包含权利要求1至9中任一项的组合物和兽医学用途可接受的载体。
11.用于保护猪动物免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括用权利要求10的疫苗对所述动物进行疫苗接种，所述疫苗的量对于产生抗PRRS病毒感染的免疫保护来说是有效的。
12.转染的宿主细胞，其包含权利要求1至9中任一项的组合物。
13.用于制备基因改造北美PRRS病毒的方法，所述方法包括：
a)突变编码感染性RNA分子的DNA序列以产生基因改造PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，其中将E蛋白中的保守半胱氨酸改变成非半胱氨酸残基；和
b)将所述基因改造北美PRRS病毒导入能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞中。
14.权利要求13的方法，其中所述能够支持PRRS复制的宿主细胞是MARC-145细胞。
15.权利要求13的方法，其中所述能够支持PRRS复制的宿主细胞包含在活的猪动物体内。
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