CN1147769A - 含有副流感病毒的、用于预防猪呼吸和生殖疾病的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于副感冒病毒的病毒因子，它可做为疫苗组分用于保护猪免于呼吸及生殖道疾病。
Description
本发明涉及一种病毒因子，培养和复制该因子的方法，以及该因子单独或与其他细菌或病毒病原体共同作为疫苗组分在保护免受呼吸及生殖道疾病中的应用。
八十年代末期至九十年代初期，在北美及欧洲出现一种新的猪疾病，它象瘟疾一样传播并伴有巨大的经济损失。同时，它被正式命名为猪生殖及呼吸综合症(PRRS)。
这种传染性疾病的主要临床症状是母猪的生育力失调及小猪的呼吸道疾病和肥胖。
除这些异常之外，还有非特异性的症状发生，如食欲不振，感情淡漠，和发烧，该疾病的特征对母猪而言，是晚期流产和死胎，分娩出干尸和生命力弱的小猪。作为这种流行病的后果，是大量地发生乳腺炎-子宫炎-乳泌缺乏综合症的症状以及回复动情。
在流行区，流行病的开始阶段主要作用于乳猪和仔猪，进一步阶段则是喂肥的猪发病率升高。这时，除主要发生于呼吸道的疾病之外，其他典型的猪的疾病亦相应以增高的频率被观察到。该流行病引起了巨大的经济损失，除了直接的动物损失之外，这种损失由于其特征产品量的降低引起(产仔及断奶之后果，妊娠率，增重)。
推测主要感染因子是一种在肺泡巨噬细胞内复制的新RNA病毒。另一方面，流行病学的调查表明呼吸和生殖疾病可另外由其它病毒或病毒和细菌继发或多发感染引起和加强，因此主张不仅要保护猪免受PRRS的主要致病因子，还要免受其他引起呼吸和生殖疾病的致病因子。
本发明涉及：
1.一种针对猪呼吸道和生殖道疾病，特别是与称为PRRS的疾病综合症相关的疫苗，其特征在于含有作为抗原物质的副感冒病毒及其失活，或减毒的变体或突变体，它们以常规或重组技术制造。可以是完整的或部分的及其片段。
2.一种基于引起猪呼吸及生殖道疾病的副感冒病毒的抗原。
3.一种制备基于引起猪呼吸及生殖道疾病的副感冒病毒的抗原物质的法，其特征在于，副感冒病毒是复制的，而且从如此获得的病毒悬浮中以常规的方法分离抗原物质。
4.这种基于引起猪呼吸和生殖道疾病的副感冒病毒的抗原在诊断和/或预防这些疾病中的应用。
5.这种基于引起猪呼吸和生殖道疾病的副感冒病毒的抗原在用于探知这些疾病的诊断剂生产中的应用，和在用于预防这些疾病的疫苗生产中的应用。抗原物质是指：
1.由病毒在细胞培养物或鸡胚中复制得到的完整的，活的病毒颗粒。
2.由病毒在原代细胞培养物、永生细胞系、禽胚或在实验动物连续传代，随后在细胞培养物或鸡胚中复制而得到完整的，活的，减毒的病毒颗粒。
3.用传统方法，如化学或物理灭活而制备的完整的、杀死的病毒。
4.由在细胞培养物或鸡胚中复制的病毒制备的病毒颗粒的亚单位。
5.通过重组技术由细胞系统表达的，并可由此可操作地分开和分离的病毒颗粒的亚单位。
6.由载体系统表达的病毒抗原，借助于重组技术将病毒基因组或其部分插入到基因组载体上，如痘病毒，疱疹病毒，腺病毒或其它合适的载体系统。
优选采用2型副感冒病毒(PIV-2)。
PIV-2从猪的呼吸及生殖道中分离，特别优选来自显示出PRRS-样症状的猪。被命名为SER的PIV-2毒株是尤其合适的，按布达佩斯条约，该毒株于1993年6月12日保藏于Collection Nationale desCultures et de Microorganismes(Institut Pasteur，Paris，France)，保藏号为I-1331。
本发明的疫苗中，副感冒病毒的抗原物质可以以与其他病毒或细菌的抗原物质混合物存在。这些病毒和细菌是指：衣原体属，尤其是鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)及Chlamydia pecorum，其浓度是105-1010FU1/dose，猪丹毒杆菌，其浓度是107-1012CFU/dose，PRRS病毒，其浓度是104-109TCID2 50/dose，以及猪微小病毒，其浓度是104-109TCID2 50/dose。
尤其优选PIV-2和衣原体的混合物，特别是鹦鹉热衣原体，或Ch.pecorum，是特别优选的。
1IFU＝包含体形成单位，2TCID＝组织培养感染剂量
下列术语应用于下列过程：
共转染：两种不同的DNA序列同时导入细胞，病毒可在细胞中复制，其目的是导入含有外源DNA序列的病毒重组体。不同的DNA序列是①能够插入到穿梭载体的外源DNA序列和②纯化的载体病毒的基因组。
基因组载体：活的病原体，特别是病毒，它适于外源DNA插入，借助于外源DNA插入其基因组从而感染细胞或器官，并在那里表达外源DNA。
免疫原：在较高等生物体中引发免疫反应的肽或蛋白，可以通过外源DNA序列在载体中表达。
克隆：将外源DNA序列插入载体。
质粒：能够在原核或直核细胞中复制的染色体之外的环状DNA序列。
穿梭载体：含有其侧翼为载体病毒的DNA序列的插入外源DNA的细菌噬菌体或质粒，尤其是细菌质粒。
转染：将DNA序列转运到原核或直核细胞，其目的是诱导含有导入的DNA序列的细胞基因组的重组体。
载体：在其遗传信息中装载外源DNA序列的质粒，细菌噬菌体或病毒。
用于产生完整的活性病毒颗粒的病毒复制可以已知方式完成，一方面，可以是在作为原代细胞或永久性细胞系的动物细胞的组织培养物中完成，如猪细胞，猴细胞或牛细胞，优选猪肾细胞如克隆的永久性猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)或原代猪肾细胞EPK或猴肾细胞如永久性猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCC CCL81或其衍生物)或牛肾细胞例如永久性牛肾细胞MDBK(ATCC CCL22或其衍生物)，另一方面，在鸡胚中完成(例如Valo-Bruteier Fa.Lohmann)。
在细胞培养物中的复制以常规方式完成，即从单层或悬液培养物的形式在静态滚瓶或载体培养中完成。采用的细胞生长培养基是常规已知的培养基，如Gibco BRL GmbH，Dieselstraβe5，76344Eggenstein的产品目录所描述的，例如特别是基础必需培养基(MEM)，它含有作为必需营养物的氨基酸，维生素，盐及碳水化合物，补充以缓冲物质例如碳酸氢钠(NaHCO3)或羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)以及选择的动物血清，例如，来自牛，马或其胎儿的血清。Eagles MEM含有0.1-5g/LNaHCO3，优选0.5-3g/L，其胎牛血清浓度为体积比1-30％，优选体积比2-10％是特别优选采用的。
用于病毒复制的细胞或细胞层以常规方式生长直至几乎铺满或至最佳细胞密度。在用病毒感染它们之前，优选移去细胞生长培养基而且细胞优选用病毒复制培养基洗涤。病毒复制培养基采用所有常规已知的细胞培养基，例如，特别是，上述MEM。然后使用病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒被病毒复制培养基稀释为0.01-50MOI(感染多重性，相应于感染性病毒颗粒数/存在细胞数的比率)，优选0.1-10MOI。
病毒的复制可以加入，亦可不加入动物血清进行。当加入血清时，以1-30％体积比浓度加至复制培养基，优选2-10％体积比。
感染和病毒复制在温度为室温和40℃之间进行，优选32至39℃之间，特别优选于37℃保持几天，优选直至感染细胞被完全破坏。
感染细胞的含病毒培养基被进一步加工，例如，通过使用孔径为例如0.1-0.45μm滤器过滤和/或离心最高达10,000g移去细胞和细胞碎片。
在鸡胚中的复制按常规的方法在孵化鸡卵的尿囊腔进行。该鸡卵已被预孵化9-12天，优选10天，温度为37-39℃，优选38.5℃，相对湿度为30-90％，优选50-60％，在可商购孵箱内，优选动力驱动的孵箱。
接种之前，用于病毒复制的孵化卵在孵箱内以其尖端为支点垂直放置1-3小时，优选2小时，然后，在处理好注射点之后，用10-200μl，优选75-125μ1病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选104-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
感染和病毒复制在上述温孵条件下进行几天，优选2-5天，尤其优选3天。
打开钙质壳、神经轴膜及绒膜尿囊膜后，通过吸取获得含有病毒的尿囊液，然后通过使用孔径为例如0.1-0.45μm的滤器过滤和/或离心最高达10,000g来进行进一步的处理。
减活的活病毒通过传统方式，经连续传代和/或间歇传代来完成：一方面，可以传代于原代细胞或永久性细胞系的动物细胞的组织培养物，如猪细胞，猴细胞或牛细胞，优选猪肾细胞如克隆的永久性猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)或原代猪肾细胞EPK或猴肾细胞如永久性猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCCCCL81或其衍生物)或牛肾细胞例如永久性牛肾细胞MDBK(ATCCCCL22或其衍生物)，或狗肾细胞，如永久性狗肾细胞MDCK(ATCCCCL34或其衍生物)，另一方面，可传代于鸡胚，鸽胚或鸭胚，优选鸡胚(如Valo-Bruteier，Fa.Lohman)，或传代于实验动物，优选小型实验动物，如豚鼠、大鼠或小鼠，其中病毒复制不引起严重的疾病症状。
在细胞培养物中传代以常规方法在单层静态培养物上进行。采用的细胞生长培养基是常规已知的培养基，如Gibco BRL GmbH，DieselstraBe5，76344Eggenstein的产品目录所描述的，例如特别是基础必需培养基(MIEM)，它含有作为必需营养物的氨基酸，维生素，盐及碳水化合物，补充以缓冲物质例如碳酸氢钠(NaHCO3)或羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)以及选择的动物血清，例如，来自牛，马或其胎儿的血清。Eagles MEM含有0.1-5g/LNaHCO3，优选0.5-3g/L，其胎牛血清浓度为体积比1-30％，优选体积比2-10％是特别优选采用的。
用于病毒复制的细胞或细胞层以常规方式生长直至几乎铺满或至最佳细胞密度。在用病毒感染它们之前，优选移去细胞生长培养基而且细胞优选用病毒复制培养基洗涤。病毒复制培养基采用所有常规已知的细胞培养基，例如，特别是，上述MEM。然后使用病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒被病毒复制培养基稀释为0.01-50MOI(感染多重性，相应于感染性病毒颗粒数/存在细胞数的比率)，优选0.1-10MOI。
病毒的复制可以加入，亦可不加入动物血清进行。当加入血清时，以1-30％体积比浓度加至复制培养基，优选2-10％体积比。
感染和病毒复制在温度为室温和40℃之间进行，优选30至39℃之间保持几天，优选直至感染细胞被完全破坏。
感染细胞的含病毒培养基被用于感染新的细胞培养物(顺次传代)。
在鸡胚中的传代按已知的方法在孵化鸡卵的尿囊腔进行。该鸡卵已被预孵化9-12天，优选10天，温度为37-39℃，优选38.5℃，相对湿度为30-90％，优选50-60％，在可商购孵箱内，优选动力驱动的孵箱。
接种之前，用于病毒传代的孵化卵在孵箱内以其尖端为支点垂直放置1-3小时，优选2小时，然后，在处理好注射点之后，用10-200μl，优选75-125μl病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选104-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
感染和病毒复制在上述温孵条件下进行几天，优选2-5天，尤其优选3天。
打开钙质壳、神经轴膜及绒膜尿囊膜后，通过吸取获得含有病毒的尿囊液，它被用于感染新的经预孵化的鸡胚(顺次传代)。
在实验动物中传代采用已知的方法进行，通过胃肠外给予病毒悬液然后从实验动物的器官和组织中再回收病毒完成。
就在实验动物中传代而言，幼龄的小型实验动物是优选采用的，且其起源于SPF(特异性无病原体)品系，例如Weerschweinchen(Hsd/Win：DH，Fa.Harlan-Winkelmann GmbH，Borchen)，Ratte(Hsd/Win：WU，Fa.Harlan-Winkelmann GmbH，Borchen)或Maus(Hsd/Win：NMRI，Fa.Harlan-Winkelmann GmbH，Borchen：Balb/C/JICO，Iffa CredoBelgium)。实验动物胃肠外感染0.1-2.0ml病毒悬液，例如，通过皮内，肌肉，鼻内，腹腔，静脉，或皮下给药。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选103-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
病毒复制发生于几天之内，优选1-12天。
以已知方法，从组织中，优选实验动物的内部器官，重新分离病毒。出于此目的，从实验动物中移取内部器官，如肺，肝，脾。通过机械粉碎，如借助于剪刀和研钵，将器官或器官的一部分在病毒复制培养基中制备成细的悬液，该悬液需经进一步处理，例如，使用0.1-0.45μm滤器进行过滤和/或离心最高达10,000×g以除去细胞和细胞碎片，病毒复制培养基可是所有已知细胞培养基，例如，特别是上述MEM。
获得的含病毒的培养基用于感染新的实验动物(顺次传代)。
顺次传代的过程在相同复制体系(同源传代)或不同复制体系(异源传代)中重复几次，优选10-20次。
病毒减毒的监测是通过从来自一系列顺次传代中的最后一代的病毒悬液，实验感染完全敏感的实验动物，优选猪。
假如典型的疾病症状，如怀孕母猪流产或死胎或呼吸道疾病仍然发生，则需要从最后一次顺次传代的病毒出发，进行进一步的同源或异源连续传代。
假如典型的疾病症状不再出现，那么最后一次顺次传代的病毒如上述复制，含有病毒的培养物上清液或尿囊液的滤液或离心上清用于疫苗生产。
用于死病毒颗粒制备的病毒复制以传统方法完成，一方面，可从在原代细胞或永久性细胞系的动物细胞的组织培养物中完成，如猪细胞，猴细胞或牛细胞，优选猪肾细胞如克隆的永久性猪肾细胞PK15(ATCCCCLL33或其衍生物)或原代猪肾细胞EPK或猴肾细胞如永久性猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCC CCL81或其衍生物)或牛肾细胞例如永久性牛肾细胞MDBK(ATCC CCL22或其衍生物)，另一方面，在鸡胚中完成(例如Valo-Bruteier Fa.Lohmann)。
在细胞培养物中的复制以常规方式完成，即从单层或悬液培养物的形式在静态滚瓶或载体培养中完成。采用的细胞生长培养基是常规已知的培养基，如Gibco BRL GmbH，DieselstraBe5，76344Eggenstein的产品目录所描述的，例如特别是基础必需培养基(MEM)，它含有作为必需营养物的氨基酸，维生素，盐及碳水化合物，补充以缓冲物质例如碳酸氢钠(NaHCO3)或羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)以及选择的动物血清，例如，来自牛，马或其胎儿的血清。Eagles MEM含有0.1-5g/LNaHCO3，优选0.5-3g/L，其胎牛血清浓度为体积比1-30％，优选体积比2-10％是特别优选采用的。
用于病毒复制的细胞或细胞层以常规方式生长直至几乎铺满或至最佳细胞密度。在用病毒感染它们之前，优选移去细胞生长培养基而且细胞优选用病毒复制培养基洗涤。病毒复制培养基采用所有常规已知的细胞培养基，例如，特别是，上述MEM。然后使用病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒被病毒复制培养基稀释为0.01-50MOI(感染多重性，相应于感染性病毒颗粒数/存在细胞数的比率)，优选0.1-10MOI。
病毒的复制可以加入，亦可不加入动物血清进行。当加入血清时，以1-30％体积比浓度加至复制培养基，优选2-10％体积比。
感染和病毒复制在温度为室温和40℃之间进行，优选32至39℃之间，特别优选于37℃保持几天，优选直至感染细胞被完全破坏。
感染细胞的含病毒培养基被进一步加工，例如，通过使用孔径为例如0.1-0.45μm滤器过滤和/或离心最高达10,000g移去细胞和细胞碎片。
在鸡胚中的复制按常规的方法在孵化鸡卵的尿囊腔进行。该鸡卵已被预孵化9-12天，优选10天，温度为37-39℃，优选38.5℃，相对湿度为30-90％，优选50-60％，在可商购孵箱内，优选动力驱动的孵箱。
接种之前，用于病毒复制的孵化卵在孵箱内以其尖端为支点垂直放置1-3小时，优选2小时，然后，在处理好注射点之后，用10-200μl，优选75-125μl病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选104-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
感染和病毒复制在上述温孵条件下进行几天，优选2-5天，尤其优选3天。
打开钙质壳、神经轴膜及绒膜尿囊膜后，通过吸取获得含有病毒的尿囊液，然后通过使用孔径为例如0.1-0.45μm的滤器过滤和/或离心最高达10,000g来进行进一步的处理。
病毒的灭活通过已知的方法完成，以物理学方法，如热作用，UV或γ辐射，优选以化学方法，如通过乙醇，甲醛，β-丙烯内酯且优选乙酰氨。
化学灭活以已知方法，在具有保持反应混合物的稳定的反应温度和持续振荡的设施的合适的反应容器中进行(如发酵罐)。采用的灭活剂优选乙酰氨，特别优选2-溴乙胺溴化氢(2-BEA)，其浓度是1-10mmol/L，优选2.5-7.5mmol/L。
在加入2-BEA之前，浓度为104.0-109.0TCID50/ml，优选105.0-108.0TCID50/ml的、来自一个或多个病毒复制物的病毒悬液，被调至pH8.1-8.7，优选8.3-8.5。
灭活在4-40℃，优选23-37℃，特别优选36-37℃进行6-48小时，优选16-20小时。
灭活完成之后，通过加入水解剂中和过量2-BEA。出于此目的，特别是巯基碘酸钠以终浓度为40-80mmol/l，优选50mmol/l加入是合适的。中和在4-40℃，优选在2-8℃进行2-16小时，优选4-8小时。
用于制备亚单位的病毒复制可以已知方式完成，一方面，可以是在作为原代细胞或永久性细胞系的动物细胞的组织培养物中完成，如猪细胞，猴细胞或牛细胞，优选猪肾细胞如克隆的永久性猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)或原代猪肾细胞EPK或猴肾细胞如永久性猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCCCCL81或其衍生物)或牛肾细胞例如永久性牛肾细胞MDBK(ATCCCCL22或其衍生物)，另一方面，在鸡胚中完成(例如Valo-Bruteier Fa.Lohmann)。
在细胞培养物中的复制以常规方式完成，即从单层或悬液培养物的形式在静态滚瓶或载体培养中完成。采用的细胞生长培养基是常规已知的培养基，如Gibco BRL GmbH，DieselstraBe5，76344Eggenstein的产品目录所描述的，例如特别是基础必需培养基(MEM)，它含有作为必需营养物的氨基酸，维生素，盐及碳水化合物，补充以缓冲物质例如碳酸氢钠(NaHCO3)或羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)以及选择的动物血清，例如，来自牛，马或其胎儿的血清。Eagles MEM含有0.1-5g/LNaHCO3，优选0.5-3g/L，其胎牛血清浓度为体积比1-30％，优选体积比2-10％是特别优选采用的。
用于病毒复制的细胞或细胞层以常规方式生长直至几乎铺满或至最佳细胞密度。在用病毒感染它们之前，优选移去细胞生长培养基而且细胞优选用病毒复制培养基洗涤。病毒复制培养基采用所有常规已知的细胞培养基，例如，特别是，上述MEM。然后使用病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒被病毒复制培养基稀释为0.01-50MOI(感染多重性，相应于感染性病毒颗粒数/存在细胞数的比率)，优选0.1-10MOI。
病毒的复制可以加入，亦可不加入动物血清进行。当加入血清时，以1-30％体积比浓度加至复制培养基，优选2-10％体积比。
感染和病毒复制在温度为室温和40℃之间进行，优选32至39℃之间，特别优选于37℃保持几天，优选直至感染细胞被完全破坏。
感染细胞的含病毒培养基被进一步加工，例如，通过使用孔径为例如0.1-0.45μm滤器过滤和/或离心最高达10,000g移去细胞和细胞碎片。
在鸡胚中的复制按常规的方法在孵化鸡卵的尿囊腔进行。该鸡卵已被预孵化9-12天，优选10天，温度为37-39℃，优选38.5℃，相对湿度为30-90％，优选50-60％，在可商购孵箱内，优选动力驱动的孵箱。
接种之前，用于病毒复制的孵化卵在孵箱内以其尖端为支点垂直放置1-3小时，优选2小时，然后，在处理好注射点之后，用10-200μl，优选75-125μl病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选104-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
感染和病毒复制在上述温孵条件下进行几天，优选2-5天，尤其优选3天。
打开钙质壳、神经轴膜及绒膜尿囊膜后，通过吸取获得含有病毒的尿囊液，然后通过使用孔径为例如0.1-0.45μm的滤器过滤和/或离心最高达10,000g来进行进一步的处理。
病毒分离通过在如蔗糖密度梯度里等密度或区带离心来完成。出于此目的，在去除细胞碎片之后，含病毒的培养基或尿囊液于100,000×g区带离心直至病毒沉淀。一种更纯的病毒颗粒制剂由在具有高于含病毒培养基的密度的水溶液中区带离心得到。使用的水溶液可以是例如30-60％w/w，优选35-50％w/w的蔗糖缓冲液。通过在密度梯度中离心可获得更高的纯度。出于此目的，由细胞和细胞碎片纯化的、并经过区带离心浓缩的病毒通过等密度或区带密度梯度离心而分离，其中密度梯度为如30-50％w/w的蔗糖缓冲水性溶液，离心加速度为如100,000至150,000g。
如此获得的病毒浓缩物用去垢剂处理。
合适的去垢剂有：
阴离子表面活性剂，例如十二烷基磺酸钠，脂肪族醇醚磺酸盐，单二烷基聚乙二醇正磷酸单乙醇胺盐，烷芳基磺酸钙，脱氧胆酸钠，阳离子表面活性剂，例如十六烷基三甲基铵氯化物，两性表面活性剂，例如N-十二烷基-亚氨二丙腈二钠或卵磷酯，非离子表面活性剂，如聚氧乙烯化的蓖麻油，聚氧乙烯化的脱水山梨醇-油酸，山梨醇-硬脂酸，甘油-硬脂酸，聚氧乙烯硬脂酸，烷基苯基聚乙二醇醚。
优选地提及非离子去垢剂：
具有大于10的HLB(亲水-亲脂比)的非离子水溶乳化剂，例如：烷芳基聚乙二醇醚乳化剂NP40(Bayer AG)；聚氧乙烯烷芳基醚Renex678(Atlas化学工业)；聚氧乙烯山梨醇单棕榈 酸Tween20(Atlas)；聚氧乙烯硬脂酸Mgyi53(Atlas)；聚氧乙烯十二烷醚Atlas G3707；聚氧乙烯油醚Atlas G3920；聚氧乙烯甘露醇单月桂酸Atlas G9046T；烷基聚乙二醇醚乳化剂1371B(Bayer AG)；烷基聚乙二醇醚(油基聚乙二醇醚乳化剂1736(Bayer AG)；烷基聚乙二醇醚(十二烷基聚乙醇醚)乳化剂OX(Bayer AG)；乙氧基乙烯化的壬基酚Ninox BM-2(Stepan化学公司)；异辛酚聚乙氧基乙醇Tritone X-100(Rohm an Haas Co.)；Cremophor EL，Nonidet P40(Shell)。
去垢剂以稀释的水性溶液形式应用。应当提及：溶液中去垢剂含量应为体积比0.1-10％，优选体积比为0.5-5％，特别优选体积比1％。
去垢剂溶液以大约1∶1至10∶1的体积比加至病毒浓缩物中。优选的，去垢剂溶液对病毒浓缩物的体积为约3∶1。
去垢剂处理在温度为约0至24℃之间，优选2至8℃之持续振荡混合物而完成。去垢剂处理持续15分钟至2天，优选6至18小时。为了提高去垢剂处理效果，另外还可将混合物经超声处理。
去除在此处理中未溶解的颗粒，优选通过过滤或于例如150,000g离心。如此获得的滤液或离心上清液贮于低温(0-70℃)直至进一步处理。
含于溶胞物中的病毒颗粒的糖蛋白经外源凝集素处理而得以分离。外源凝集素是来自于植物特别是其种子、微生物、脊椎动物和无脊椎动物的蛋白或糖蛋白，它能特异性地与糖及其结合物结合。外源凝集素用于识别和结合来源于paramgxooiruses的糖蛋白。凝集素优选地用于识别甘露糖和或葡萄糖及其结合物。来自于Canavalia ensiformis，兵豆，Lathygros odoratus，Pisum sativam，蚕豆，接骨木，大豆，荆豆，Helix promatia，美洲商陆，番茄，曼陀罗，Bandeiraea simplificolia的外源凝集素是特别提及的。
外源凝集素以水溶或水不溶形式应用。水不溶形式中，它们优选地通过与内在基质偶联而固定化，内在基质可例举悬液或凝胶形式的葡聚糖，琼脂糖，或纤维素。伴刀豆球蛋白A琼脂糖，伴刀豆球蛋白Sepharose，晶状体外源凝集素Sepharose，琼脂糖-麦胚外源凝集素及螺旋发膏剂外源凝集素-Sepharose是特别提及的。
外源凝集素存在于含去垢剂及盐的溶液，悬液，或凝胶形式应用。出于此目的，溶胞物及外源凝集素溶液，外源凝集素悬液及外源凝集凝胶预先经足够量的氯化钠和已知的稳定外源凝集素的盐处理，氯化钠的浓度为0.5至2，优选0.7-1.2mol/l。溶胞物的浓缩优选通过透析完成。必需的外源凝集素盐的浓度是先有技术已知的，且是所采用的外源凝集素所特异的。外源凝集素溶液，外源凝集素悬液或外源凝集素凝胶，进一步地经处理溶胞产物采用的去垢剂以同一浓度处理，以使溶胞物和外源凝集素溶液具有同一盐及去垢剂浓度。
大约1至150mg，优选1至50mg，特别优选5至20mg的纯外源凝集被用于每ml溶液、悬液或凝胶中。足够量的外源凝集素溶液、悬液及凝胶被加入溶胞物，其中0.01至50mg，优选0.1至20mg，特别优选0.5至5mg的外源凝集素被用于每毫克总蛋白。外源凝集素处理在0至24℃，优选2至8℃，处理约10分钟至3天，优选1小时至2天完成。
外源凝集素与糖蛋白的反应亦可用柱层析方法完成，其中溶胞物与固定化在层析柱凝胶样基质中的外源凝集素接触。
糖蛋白-外源凝集素复合物通过已建立的方法从溶液或悬液中分离。可通过离心，过滤，或在层析中通过洗涤而完成。
在这些方法中获得的含外源凝集素-糖蛋白的悬液或凝胶中去垢剂或盐浓度可调至生理学可耐受范围，或通过过滤，离心，透析或其它洗涤方法而除去。
如此获得的外源凝集素-糖蛋白复合物悬液或凝胶可直接用于抗原性物质。依赖于结合到凝集素的糖蛋白含量，它们可以进一步浓缩或稀释。
外源凝集素-糖蛋白复合物的悬液或凝胶可贮于低于8℃的温度，它们亦可被冻干。
为制备抗原性物质，糖蛋白可从含外源凝集素-糖蛋白复合物的悬液或凝胶中分离。因而，用含盐蔗糖水溶液处理悬液或凝胶。
所采用的蔗糖的性质取决于所用凝集素的特异性。蔗糖的浓度是0.1至1mol/l，优选0.1至0.5mol/l，特别优选0.3至0.5mol/l。盐内容物的浓度和组成对应于含糖蛋白-外源凝集素复合物悬液或凝胶的浓度和组成。
蔗糖溶液的处理在0至大约24℃，优选2至8℃完成。处理大约15分钟至4天，优选1小时至2天，特别优选10至24小时。
以此方法洗脱的糖蛋白通过离心，过滤，或其他常规分离方法(如层析)从外源凝集素中分离。得到的制备物中去垢剂、盐及蔗糖的浓度可按上述方法调整。
如此获得的分离的糖蛋白可用作抗原性物质。糖蛋白含量可通过浓缩或稀释调整。
制备物以可溶形式贮于低于0℃贮存或以冻干形式贮存。
为了以重组方法制备病毒颗粒亚单位，首先获得病毒基因组。
为获得病毒基因组，病毒复制可以已知方式完成，一方面，可以是在作为原代细胞或永久性细胞系的动物细胞的组织培养物中完成，如猪细胞，猴细胞或牛细胞，优选猪肾细胞如克隆的永久性猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)或原代猪肾细胞EPK或猴肾细胞如永久性猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCCCCL81或其衍生物)或牛肾细胞例如永久性牛肾细胞MDBK(ATCCCCL22或其衍生物)，另一方面，在鸡胚中完成(例如Valo-Bruteier Fa.Lohmann)。
在细胞培养物中的复制以常规方式完成，即从单层或悬液培养物的形式在静态滚瓶或载体培养中完成。采用的细胞生长培养基是常规已知的培养基，如Gibco BRL GmbH，DieselstraBe5，76344Eggenstein的产品目录所描述的，例如特别是基础必需培养基(MEM)，它含有作为必需营养物的氨基酸，维生素，盐及碳水化合物，补充以缓冲物质例如碳酸氢钠(NaHCO3)或羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)以及选择的动物血清，例如，来自牛，马或其胎儿的血清。Eagles MEM含有0.1-5g/LNaHCO3，优选0.5-3g/L，其胎牛血清浓度为体积比1-30％，优选体积比2-10％是特别优选采用的。
用于病毒复制的细胞或细胞层以常规方式生长直至几乎铺满或至最佳细胞密度。在用病毒感染它们之前，优选移去细胞生长培养基而且细胞优选用病毒复制培养基洗涤。病毒复制培养基采用所有常规已知的细胞培养基，例如，特别是，上述MEM。然后使用病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒被病毒复制培养基稀释为0.01-50MOI(感染多重性，相应于感染性病毒颗粒数/存在细胞数的比率)，优选0.1-10MOI。
病毒的复制可以加入，亦可不加入动物血清进行。当加入血清时，以1-30％体积比浓度加至复制培养基，优选2-10％体积比。
感染和病毒复制在温度为室温和40℃之间进行，优选32至39℃之间，特别优选于37℃保持几天，优选直至感染细胞被完全破坏。
感染细胞的含病毒培养基被进一步加工，例如，通过使用孔径为例如0.1-0.45μm滤器过滤和/或离心最高达10,000g移去细胞和细胞碎片。
在鸡胚中的复制按常规的方法在孵化鸡卵的尿囊腔进行。该鸡卵已被预孵化9-12天，优选10天，温度为37-39℃，优选38.5℃，相对湿度为30-90％，优选50-60％，在可商购孵箱内，优选动力驱动的孵箱。
接种之前，用于病毒复制的孵化卵在孵箱内以其尖端为支点垂直放置1-3小时，优选2小时，然后，在处理好注射点之后，用10-200μl，优选75-125μl病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选104-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
感染和病毒复制在上述温孵条件下进行几天，优选2-5天，尤其优选3天。
打开钙质壳、神经轴膜及绒膜尿囊膜后，通过吸取获得含有病毒的尿囊液，然后通过使用孔径为例如0.1-0.45μm的滤器过滤和/或离心最高达10,000g来进行进一步的处理。
病毒纯化或分离通过在如蔗糖密度梯度里等密度或区带离心来完成。出于此目的，在去除细胞碎片之后，含病毒的培养基或尿囊液于100,000×g区带离心直至病毒沉淀。一种更纯的病毒颗粒制剂由在具有高于含病毒培养基的密度的水溶液中区带离心得到。使用的水溶液可以是例如30-60％w/w，优选35-50％w/w的蔗糖缓冲液。通过在密度梯度中离心可获得更高的纯度。出于此目的，由细胞和细胞碎片纯化的、并经过区带离心浓缩的病毒通过等密度或区带密度梯度离心而分离，其中密度梯度为如30-50％w/w的蔗糖缓冲水性溶液，离心加速度为如100,000至150,000g。
为获得编码免疫原性蛋白的合适的基因，首先从纯化病毒颗粒中分离病毒基因组。天然病毒RNA优选通过用含去垢剂和蛋白酶的水性溶液处理纯化的病毒颗粒获得。
采用阴离子、阳离子、两性离子、和非离子去垢剂。离子去垢剂，优选十二烷基磺酸钠，优选地以体积比0.1-10％，优选体积比0.5-3％的浓度采用。
采用的蛋白酶是在去垢剂存在时起作用的蛋白酶，例如链霉蛋白酶和，优选蛋白K。蛋白酶以0.01-10mg/ml，优选0.05-0.5mg/ml的浓度使用。
优选地，采用补充以Rnase抑制剂的水性缓冲溶液。
缓冲物质是弱酸强碱盐例如三(羧甲基)-氨基-甲烷，和强酸弱碱盐例如一价磷酸盐和其混合物。优选使用三(羟甲基)-氨基甲烷。采用的缓冲物质的浓度应保证pH不破坏RNA的，优选pH为6-8.5，特别优选7-8。
使用的RNase抑制剂如核糖核苷-vanadyl复合物，蛋白质抑制剂(如RNAguard/Pharmacia)或优选二乙基焦碳酸酯(DEPC)浓度是体积比0.01-2％，优选体积比0.1-0.5％。
病毒溶胞产物的亲脂性物质使用溶剂如苯酚、氯仿或其混合物抽提。抽提以一步或多步完成。
RNA从保留的水相中沉淀，其中水性溶液中含有醇，例如乙醇或异丙醇，单价氯或乙酸盐如氯化钠，乙酸钠或乙酸钾。
乙醇浓度为40至100％体积比，优选60至80％体积比，氯或乙酸盐的浓度为0.01至1mol/l，优选0.1至0.8mol/l。
沉淀的RNA从水性溶液中通过例如离心并再溶于水性溶液如DEPC水回收。水性溶液优选含有缓冲物质例如三羟甲基氨基甲烷，浓度为1-100mmol/l，优选10-50mmol/l，可能补充以乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为0.1-10mmol/l，优选1-10mmol/l或二巯苏糖醇(DTT)，浓度为0.1-10mmol/l，优选1-10mmol/l。
分离的RNA贮于低于-65℃温度中。
其它用于RNA分离的方法有例如用异硫氰酸胍抽提RNA，随后用氯化铯密度梯度离心病毒溶胞物的方法。
RNA分离方法在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)的分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989。
使用分离的病毒基因组完成合适的基因的鉴定，例如，通过：
a)使用已知基因探针进行基因组RNA/DNA杂交。使用的合适的基因探针是具有相关病毒毒株的免疫原的已知基因的核苷酸序列的DNA探针，例如，猿猴病毒5或狗副感冒病毒2。
b)制备互补DNA(cDNA)，将cDNA克隆至如细菌质粒如pBR322中以富集病毒DNA，用已知基因探针杂交克隆DNA。使用的合适的基因探针是具有相关病毒毒株如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的免疫原的已知基因的核苷酸序列的DNA探针。
c)制备互补DNA(cDNA)以及将cDNA克隆到质粒表达载体如pUC18/19或pUC118/119或λ-细菌噬菌体表达载体例如λgt11及其衍生物或λZAP或λORF8中。基因鉴定借助于抗体来探测其表达抗原来完成，其中的抗体通过例如免疫荧光或免疫沉淀可直接或间接探测。合适抗体能与相关病毒毒株例如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的免疫原反应。
d)制备互补DNA(cDNA)，以及将cDNA克隆到例如细菌质粒中以富集病毒DNA。测序克隆的病毒DNA，并使用相关病毒毒株如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的已知序列来调查序列同源性。
e)用相关病毒毒株如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的已知序列来调查序列同源性，并在制备过程中测序cDNA。
f)方法a)至e)的组合。
RNA/DNA及DNA/DNA杂交，cDNA制备，将DNA克隆至质粒及细菌噬菌体载体，DNA测序及表达的免疫原的免疫探测之方法在下面描述：
-J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989
-F.M.Ausubel，分子生物学当今技术1987-1988，John Wiley&Sons，New York，1987
-A.Mayr，病毒学操作方法，第三卷，Grustav Fischer Verlag，Sruttgart，1989
使用上述方法，这些基因可从被探测为编码一种或多种免疫原的核苷酸序列挑选出来。例如，序列中给出了2型副感冒病毒的神经氨酸酶-血细胞凝集素的核苷酸序列及相应的氨基酸序列，该毒株以保藏号为I-1331保存于CNCM。
表达基因以产生免疫原通过例如如下方法完成：
a)将互补DNA形式的基因稳定整合到细胞的细胞DNA中。该基因已预先克隆到合适的穿梭载体中。其合适的病毒是，例如猿猴病毒40(SV40)及适于选择并在原核细胞(例如大肠杆菌)中复制并拥有用于在高等细胞中表达的调控元件的质粒表达载体。
合适的质粒表达载体是例如基于SV40的质粒载体，例如pMSG、pSVT7或pMT2，或基于EB病毒的质粒载体，例如pHEBo或p205。
按上述方法分离和纯化克隆的DNA，并通过转染插入真核细胞。
合适的细胞是动物细胞，特别是永久性细胞系，例如猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)，猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCC CCL81或其衍生物)，牛肾细胞MDBK(ATCC CCL22或其衍生物)，或兔肾细胞RK-13(ATCC CCL37)。
转染通过例如磷酸钙-DNA共沉淀或DEAE/葡聚糖法，脂质体法或电穿孔法完成。
用于将选择基因克隆至合适载体，及将克隆基因转染高等细胞的方法在J.SambrooK，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989和F.M.Ausubel，当今分子生物学方法1987-1988，John Wiley&Sons，New York，1987中得到详述。
借助于直接或间接例如用免疫荧光或免疫沉淀方法检测的抗体，来检测从上述方法处理的细胞的细胞培养物上清液或细胞溶胞物中表达的免疫原的存在。合适的抗体是那些与相关病毒毒株，例如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的免疫原反应的抗体。
b)将互补DNA形式的基因克隆到原核或真核细胞的合适的表达载体中。
合适的载体是例如(i)细菌质粒表达载体，(ii)用于细菌的病毒表达载体或(iii)用于表达克隆基因的真核细胞的病毒表达载体。
关于(i)：
合适细菌质粒表达载体是例如pUC18/19或pUC118/119。当DNA被克隆到质粒之后，它被插入原核细胞，优选细菌，并复制。合适细菌是例如大肠杆菌K12及其衍生物。
质粒通过例如磷酸钙-DNA共沉淀或电穿孔参入原核细胞。
关于(ii)：
用于细菌的合适的病毒表达载体是λ噬菌体例如λgt11及衍生物，λZAP或λORF8。λ噬菌体载体的复制可特别在大肠杆菌例如E.ColiK12及其衍生物。
关于(iii)：
用于真核细胞的合适的病毒表达载体是例如猿猴病毒40，腺病毒，疱疹单式病毒或杆状病毒。病毒载体的复制在合适的细胞系统中完成。将选择的基因克隆在合适的表达载体中，及其在合适表达系统中的应用在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989和F.M.Ausubel，当今分子生物学方法1987-1988，John Wiley&Sons，New York，1987中得到详述。
表达的免疫原被用作抗原，它们直接以表达系统(培养基质和/或细胞)形式，或者在通过生化或免疫学方法制备和纯化优选浓缩或稀释之后。
合适的纯化方法是例如亲合或凝胶层析方法，在其中免疫原从表达系统中分离，优选在去垢剂处理之后。
为制备由载体系统表达的病毒抗原，首先获得病毒基因组。
为获得病毒基因组，病毒复制可以已知方式完成，一方面，可以是在作为原代细胞或永久性细胞系的动物细胞的组织培养物中完成，如猪细胞，猴细胞或牛细胞，优选猪肾细胞如克隆的永久性猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)或原代猪肾细胞EPK或猴肾细胞如永久性猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCCCCL81或其衍生物)或牛肾细胞例如永久性牛肾细胞MDBK(ATCCCCL22或其衍生物)，另一方面，在鸡胚中完成(例如Valo-Bruteier Fa.Lohmann)。
在细胞培养物中的复制以常规方式完成，即从单层或悬液培养物的形式在静态滚瓶或载体培养中完成。采用的细胞生长培养基是常规已知的培养基，如Gibco BRL GmbH，DieselstraBe5，76344Eggenstein的产品目录所描述的，例如特别是基础必需培养基(MEM)，它含有作为必需营养物的氨基酸，维生素，盐及碳水化合物，补充以缓冲物质例如碳酸氢钠(NaHCO3)或羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(Hepes)以及选择的动物血清，例如，来自牛，马或其胎儿的血清。Eagles MEM含有0.1-5g/LNaHCO3，优选0.5-3g/L，其胎牛血清浓度为体积比1-30％，优选体积比2-10％是特别优选采用的。
用于病毒复制的细胞或细胞层以常规方式生长直至几乎铺满或至最佳细胞密度。在用病毒感染它们之前，优选移去细胞生长培养基而且细胞优选用病毒复制培养基洗涤。病毒复制培养基采用所有常规已知的细胞培养基，例如，特别是，上述MEM。然后使用病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒被病毒复制培养基稀释为0.01-50MOI(感染多重性，相应于感染性病毒颗粒数/存在细胞数的比率)，优选0.1-10MOI。
病毒的复制可以加入，亦可不加入动物血清进行。当加入血清时，以1-30％体积比浓度加至复制培养基，优选2-10％体积比。
感染和病毒复制在温度为室温和40℃之间进行，优选32至39℃之间，特别优选于37℃保持几天，优选直至感染细胞被完全破坏。
感染细胞的含病毒培养基被进一步加工，例如，通过使用孔径为例如0.1-0.45μm滤器过滤和/或离心最高达10,000g移去细胞和细胞碎片。
在鸡胚中的复制按常规的方法在孵化鸡卵的尿囊腔进行。该鸡卵已被预孵化9-12天，优选10天，温度为37-39℃，优选38.5℃，相对湿度为30-90％，优选50-60％，在可商购孵箱内，优选动力驱动的孵箱。
接种之前，用于病毒复制的孵化卵在孵箱内以其尖端为支点垂直放置1-3小时，优选2小时，然后，在处理好注射点之后，用10-200μl，优选75-125μl病毒悬液进行感染。病毒悬液中，病毒在病毒复制培养基中稀释至101-107TCID50/ml(每ml悬液50％培养物感染剂量＝50％的所采用的细胞被感染的稀释度)浓度，优选104-105TCID50/ml。作为病毒复制培养基的细胞培养基是常规已知的，例如，特别是采用上述MEM。
感染和病毒复制在上述温孵条件下进行几天，优选2-5天，尤其优选3天。
打开钙质壳、神经轴膜及绒膜尿囊膜后，通过吸取获得含有病毒的尿囊液，然后通过使用孔径为例如0.1-0.45μm的滤器过滤和/或离心最高达10,000g来进行进一步的处理。
病毒分离或纯化通过在如蔗糖密度梯度里等密度式区带离心来完成。出于此目的，在去除细胞碎片之后，含病毒的培养基或尿囊液于100,000×g区带离心直至病毒沉淀。一种更纯的病毒颗粒制剂由在具有高于含病毒培养基的密度的水溶液中区带离心得到。使用的水溶液可以是例如30-60％w/w，优选35-50％w/w的蔗糖缓冲液。通过在密度梯度中离心可获得更高的纯度。出于此目的，由细胞和细胞碎片纯化的、并经过区带离心浓缩的病毒通过等密度或区带密度梯度离心而分离，其中密度梯度为如30-50％w/w的蔗糖缓冲水性溶液，离心加速度为如100,000至150,000g。
为获得编码免疫原性蛋白的合适的基因，首先从纯化病毒颗粒中分离病毒基因组。天然病毒RNA优选通过用含去垢剂和蛋白酶的水性溶液处理纯化的病毒颗粒获得。
采用阴离子、阳离子、两性离子、和非离子去垢剂。离子去垢剂，优选十二烷基磺酸钠，优选地以体积比0.1-10％，优选体积比0.5-3％的浓度采用。
采用的蛋白酶是在去垢剂存在时起作用的蛋白酶，例如链霉蛋白酶和，优选蛋白K。蛋白酶以0.01-10mg/ml，优选0.05-0.5mg/ml的浓度使用。
优选地，采用补充以Rnase抑制剂的水性缓冲溶液。
缓冲物质是弱酸强碱盐例如三(羧甲基)-氨基-甲烷，和强酸弱碱盐例如一价磷酸盐和其混合物。优选使用三(羟甲基)-氨基甲烷。采用的缓冲物质的浓度应保证其pH不破坏RNA，优选pH为6-8.5，特别优选7-8。
使用的RNase抑制剂如核糖核苷-vanadyl复合物，蛋白质抑制剂(如RNAguard/Pharmacia)或优选二乙基焦碳酸酯(DEPC)浓度是体积比0.01-2％，优选体积比0.1-0.5％。
病毒溶胞产物的亲脂性物质使用溶剂如苯酚、氯仿或其混合物抽提。抽提以一步或多步完成。
RNA从保留的水相中沉淀，其中水性溶液中含有醇，例如乙醇或异丙醇，单价氯或乙酸盐如氯化钠，乙酸钠或乙酸钾。
乙醇浓度为40至100％体积比，优选60至80％体积比，氯或乙酸盐的浓度为0.01至1mol/l，优选0.1至0.8mol/l。
沉淀的RNA从水性溶液中通过例如离心并再溶于水性溶液如DEPC水回收。水性溶液优选含有缓冲物质例如三羟甲基氨基甲烷，浓度为1-100mmol/l，优选10-50mmol/l，可能补充以乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度为0.1-10mmol/l，优选1-10mmol/l或二巯苏糖醇(DTT)，浓度为0.1-10mmol/l，优选1-10mmol/l。
分离的RNA贮于低于-65℃温度中。
其它用于RNA分离的方法有例如用异硫氰酸胍抽提RNA，随后用氯化铯密度梯度离心病毒溶胞物的方法。
RNA分离方法在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)的分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989。
使用分离的病毒基因组完成合适的基因的鉴定，例如，通过：
a)使用已知基因探针进行基因组RNA/DNA杂交。使用的合适的基因探针是具有相关病毒毒株的免疫原的已知基因的核苷酸序列的DNA探针，例如，猿猴病毒5或狗副感冒病毒2。
b)制备互补DNA(cDNA)，将cDNA克隆至如细菌质粒如pBR322中以富集病毒DNA，用已知基因探针杂交克隆DNA。使用的合适的基因探针是具有相关病毒毒株如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的免疫原的已知基因的核苷酸序列的DNA探针。
c)制备互补DNA(cDNA)以及将cDNA克隆到质粒表达载体如pUC18/19或pUC118/119或λ-细菌噬菌体表达载体例如λgt11及其衍生物或λZAP或λORF8中。基因鉴定借助于抗体来探测其表达抗原来完成，其中的抗体通过例如免疫荧光或免疫沉淀可直接或间接探测。合适抗体能与相关病毒毒株例如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的免疫原反应。
d)制备互补DNA(cDNA)，以及将cDNA克隆到例如细菌质粒中以富集病毒DNA。测序克隆的病毒DNA，并使用相关病毒毒株如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的已知序列来调查序列同源性。
e)用相关病毒毒株如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的已知序列来调查序列同源性，并在制备过程中测序cDNA。
f)方法a)至e)的组合。
RNA/DNA及DNA/DNA杂交，cDNA制备，将DNA克隆至质粒及细菌噬菌体载体，DNA测序及表达的免疫原的免疫探测之方法在下面描述：
-J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989
-F.M.Ausubel，分子生物学当今技术1987-1988，John Wiley&Sons，New York，1987
-A.Mayr，病毒学操作方法，第三卷，Grustav Fischer Verlag，Sruttgart，1989
使用上述方法，这些基因可从被探测为编码一种或多种免疫原的核苷酸序列挑选出来。例如，序列中给出了2型副感冒病毒的神经氨酸酶-血细胞凝集素的核苷酸序列及相应的氨基酸序列，该毒株以保藏号为I-1331保存于CNCM。
编码一个或多个免疫原(外源DNA)的基因被插入当感染细胞或生物体时表达外源基因的基因组载体。载体病毒和载体细菌适于此目的。例如，使用具有已知插入位点能接受0.1至多达20KB(1,000碱基对)外源DNA的稳定基因组的DNA病毒，例如牛痘病毒，疱疹病毒或腺病毒。
出于此目的，必须(α)首先将基因插入穿梭载体中，穿梭载体含有侧翼为载体病毒的DNA序列的外源DNA，(β)通过将穿梭载体和载体病毒共转染将基因插入载体病毒基因组。
合适的穿梭载体是质粒或细菌噬菌体载体。
标准质粒载体的例子是pBR322、pUC18/19、pAT153、pACYC185或pSP64/65，细菌噬菌体的载体例子是λgt10/11，λZAP或M13mp18/19。
(α)基因插入穿梭载体：
首先，在其插入位点载有载体病毒的DNA片段被插入穿梭载体DNA。出于此目的，载体病毒基因组的已知插入位点的DNA序列，及穿梭载体的DNA用限制性内切核酸酶(内切酶)处理，以产生适于插入的末端。以此方法制备的穿梭载体DMA用过量的待插入DNA片段，例如，大约以1∶5的比例混合。DNA混合物用DNA连接酶处理以将DNA片段与载体共价连接。
使用的穿梭质粒参入原核或真核细胞，优选细菌，及被复制。合适的例如大肠杆菌K12及其衍生物。
选择载有含有片段的质粒的细菌。
穿梭质粒基因组的插入位点的克隆，其插入原或真核细胞，转化细菌的复制和选择在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989和F.M.Ausubel，当今分子生物学方法1987-1988，John Wiley&Sons，NewYork，1987中得到详述。
假如需要的话，所谓的“多聚接头”被插入到载体病毒的插入位点。多聚接头是具有至少两个顺次排列的明确的限制性酶切位点的DNA序列。
为此，带有DNA片段的插入位点用只使该片段在一处打开的限制性酶处理。制得的片段与多聚接头和DNA连接酶共保温，以特异插入确切的限制性酶切部位。
多聚接头可以插入分离的DNA片段，或载有克隆到穿梭载体中的DNA片段的插入部位。
如果多聚接头插入到分离的DNA片段，它们应被插入到穿梭载体中。当使用穿梭质粒时，它被参入到原式真核细胞，优选细菌中并在其中复制。合适的是大肠杆菌K12及其衍生物。含有包含DNA片段的质粒的细菌被选择。
如果多聚接头被插入到克隆到穿梭载体中的DNA片段中，它们将复制且选择。
编码一个或多个免疫原(外源DNA)的基因被插入插入位点。
假如需要的话，载有DNA片段的插入位点的部分序列被预先去除，为此用限制性酶处理DNA片段，并将生成的DNA片段分离。
为插入外源DNA，分离的DNA片段或克隆到穿梭载体中的含插入位点的DNA片段被一种或多种限制酶切，该片段在插入位点或在插入多聚接头处被打开。外源DNA以例如借助于DNA连接酶被插入以此方式制备的插入位点。
如果外源DNA插入到分离的DNA片段中，然后，它们将被插入穿梭载体。当使用穿梭质粒时，它将参入原式真核细胞，优选细菌，并在其中复制。合适的例如大肠杆菌K12及其衍生物。含有含外源DNA的质粒的细菌被选择。
如果外源DNA被插入到克隆到穿梭载体的DNA片段，它们被复制且被选择。
用于制备穿梭载体的方法在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989和F.M.Ausubel，当今分子生物学方法1987-1988，John Wiley&Sons，New York，1987中得到详述。(β)外源DNA插入到载体病毒基因组：
下列方法可用于将外源DNA插入载体病毒基因组：
(i)将穿梭载体DNA和分离的天然载体病毒DNA共转染合适细胞，
(ii)用穿梭载体DNA转染合适细胞，用载体病毒感染，
(iii)用载体病毒感染合适细胞，用穿梭载体DNA转染。
适于此目的的方法在J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis(编者)，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989和F.M.Ausubel，当今分子生物学方法1987-1988，John Wiley&Sons，New York，1987中得到详述。
方法(i)，以磷酸钙DNA共沉淀的形式完成，是优选的。结束时，下列步骤是必须的：
(1)穿梭载体复制、分离且进一步纯化。穿梭载体DNA的纯化通过等密度梯度离心，例如在氯化铯密度梯度中完成。
载体病毒复制且纯化。分离病毒基因组且进一步纯化。载体病毒DNA的纯化通过等密度梯度离心，例如在氯化铯密度梯度中完成。
(2)环状的或优选线性穿梭载体DNA用于共转染。
线性穿梭载体DNA通过例如用限制性酶处理纯化DNA而获得。限制性酶优选在插入外源DNA上无识别位点的，即不分割外源DNA序列的。
(3)载体病毒DMA和穿梭载体DNA以0.01-0.1×10-12mol/l载体病毒DNA/1-3×10-12mol/l穿梭载体DNA的比率混合。
(4)DNA混合物与例如磷酸钙共沉淀并转移到合适细胞内。
合适的细胞是动物细胞，特别是永久性细胞系，例如猪肾细胞PK15(ATCC CCLL33或其衍生物)，猴肾细胞BGM(Flow03-240或其衍生物)或Vero(ATCC CCL81或其衍生物)，牛肾细胞MDBK(ATCC CCL22或其衍生物)，或兔肾细胞RK-13(ATCC CCL37)。
亦可用其他方法完成共转染。这些方法可被提及为例如DEAE/葡聚糖法，脂质体法或电穿孔法。
(5)细胞可以按照例如上面进一步描述的方法来培养。假如细胞病理性遗传学效应发生，载体病毒的克隆通过单噬菌斑纯化方法分离，且进一步复制。
单个噬菌斑纯化的方法在A.Mayr的病毒学操作方法，第一卷，Gustav Fischer出版社，Stuttgart1974有描述。
(6)重组载体病毒的选择可通过下列方式完成：通过(i)探测外源基因的表达或(ii)探测插入到载体病毒基因组的外源DNA，如DNA/RNA杂交。(i)：探测外源DNA表达通过，例如，借助于抗体而完成。合适的抗体是那些与相关病毒毒株，例如猿猴病毒5或狗副感冒病毒2的免疫原反应的抗体。外源DNA的基因产物可以通过例如免疫荧光或免疫沉淀来探测。(ii)：探测插入的外源DNA可以通过用相应外源基因的基因探针进行杂交来完成。
稳定的重组体截体病毒以已知的传统方法复制，例如上面进一步描述的，分离并进一步加工用作抗原性物质。
本发明的疫苗中，抗原性物质以其本身或以制剂的形式出现。可以提及的这些制剂的成份是药用溶剂或稀释剂，佐剂，保存剂，及悬浮启动剂或增溶剂如乳化剂。
抗原性物质在疫苗制剂中被用作生物活性物质。
为制备活疫苗，抗原性物质以活病毒颗粒形式应用，为了稳定，向其中加入添加剂，任选地加入抗泡沫剂和保存剂，为了提高贮存性能，活疫苗被冻干。使用疫苗之前，冷干产品再用溶剂，如蒸馏水，纯净水或0.9％盐水配制。
从细胞基质中纯化的病毒颗粒以至少106CID50/ml浓度在pH-缓冲的水溶液中与保护性胶质或稳定剂混合，例如纤维素，葡聚糖，胶原，火棉胶或硬脂酸，且任选地补充以抗泡沫剂，例如三丁基磷酸盐，异丙醇或硅酮油以及保存剂，例如硫柳汞，或乙基汞硫代水杨酸钠，装入合适的容器且冻干。
为制备灭活疫苗，所用的抗原性物质是完整的杀死的病毒颗粒，其浓度是104.0-109.0CID50/ml，优选105.0-108.0CID50/ml，在将病毒颗粒灭活或片段化(亚单位化)之前，每一疫苗剂量含有浓度为10-250mg蛋白，优选10-100mg蛋白。将抗原性物质与常规制剂辅助物质如溶剂或稀释剂，佐剂，保存剂，悬浮启动剂，或增溶剂，pH调节因子及任选的抗泡沫剂混合，而存在于疫苗中。
可以提及的溶剂或稀释剂是蒸馏水，纯净水，生理盐水及细胞培养液。特别是使用上面提及的E-MEM和磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)。
可以提及的佐剂是：
1)无机盐例如羟氧化铝，磷酸铝，磷酸钙，高岭土或硅石。优选地采用体积比10-50％，优选体积比25-3 5％的羟氧化铝凝胶，其羟氧化铝含量为1-50％(w/v)，优选2-3％(w/v)。
2)油性佐剂例如非毒性矿物油(例如液体石蜡，Draceol)，植物油(例如卵磷脂，花生油)或动物油(角鲨烷，角鲨烯)，它们以体积比1-40％，优选1-15％被采用。
3)亲水或疏水性多聚物如聚氧乙烯和聚氧丙烯。合成的预制块共聚体(如PluronicL101，PluronicL121，PluronicL122，Tetronic1501)是优选的，其浓度是体积比1-10％。
4)来源于细菌的佐剂，例如百日咳毒素(百日咳分枝杆菌)，伤塞沙门氏菌分裂素或细菌内毒素例如脂多糖(LPS，例如来自分枝杆菌属或沙门氏菌属)以及LPS类似物或衍生物例如脂质A，单磷酰脂质A(MPL)，二磷酰脂质A(DPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，胞壁酰基二肽(MDP)或釉质酰基(adamantyl)二肽(AdDP)及其衍生物。优选采用的MDP衍生物或AdDP的浓度是0.0001-10％(w/v)。
5)有机可分散于水的佐剂如胆甾醇，明胶，磷脂酰胆碱，多糖(例如酵母聚糖，琼脂)，脂肪胺(例如二甲基十六烷基胺/DDA，N，N十八烷基，N’，N’-二(2-羟甲基)丙烷二胺/Avridin)，DEAE-葡聚糖或皂草苷(来源于肥皂草的皮)或皂草苷衍生物。
6)单价因子(Monokine)和淋巴因子，例如白介素-1，白介素-2或γ-干扰素。
7)1)至6)的可能的组合。
可以提及的保存剂是浓度最高达1％的福尔马林，浓度最高达0.5％的酚和苯甲醇，山梨酸，苯甲酸，苯甲酸钠，及其衍生物，如2-(乙基汞巯基)苯甲酸钠(硫柳汞，乙基汞硫代水杨酸钠，乙基汞硫代水杨酸钠)或4-(乙基汞-巯基)苯磺酸钠(thiomerfonaze)。浓度为0.01％至0.5％的硫柳汞优选采用。
可以提及的悬浮启动剂和增溶剂是非毒性表面活性物质例如植物蛋白，藻酸盐，纤维素，磷脂，特别是基于乙二醇醚例如聚乙二醇的物质及其衍生物。聚乙二醇(PEG)200，300，400，600，和900及PEG衍生物(Span，Arlacel，Tween，Myri，Brij)是优选采用的，特别优选的是Tween80，其浓度为0.05-5％体积比，优选0.2-1％体积比。
可以提及的pH调节剂是例如氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠和碳酸钾，乙酸，酒石酸和柠檬酸或羟甲基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)。
可以提及的抗泡沫剂是三丁基磷酸盐，异丙醇，硅油， Antifoam或Baysilon抗泡沫剂EBI。
本发明的副感冒病毒能够引起猪呼吸道及生殖道疾病，以下列途径获得：
从显示出PRRS样症状的病猪中取出器官，并经受病毒分离处理。感染群中病弱小猪尤为合适。从合适动物体中取出内部器官，特别是肺，肝，肾及脾。这些器官的一部分或器官的混合物在生理上可耐受的溶液中均浆以给出悬液，器官的比例最高达大约10％(w/v)。上述的Eagles基本必需培养基(E-MEM)是一种特别合适的溶液通过于1500×g离心从细胞或细胞碎片中分离悬液。离心上清液的进一步纯化是通过过滤。合适滤器的孔径为0.2-5μm，优选0.2-0.45μm。
从器官优选肺建立原代细胞培养，用以观察细胞病理基因效应(CPE)之发生。为此用蛋白酶酶切剪碎组织。生理水性溶液中的，浓度为0.1-0.5％(w/v)，优选0.125-0.25％(w/v)的胰蛋白酶特别适于此目的。胰蛋白消化于20-37℃，优选室温进行2-8小时。未消化组织用纱布过滤而分离。胰酶消化的细胞经500-1500×g离心而回收。细胞沉降物重悬于合适生长培养基，例如描述的E-MEM，以105-106细胞/ml培养基接种到培养器皿中。基于生长速度，生长培养基每3-7天更换一次。每日观察细胞生长及CPE的发生。另外，于固定的2-7天的时间间隔检查细胞培养物上清液的凝血特征。
离心上清液或器官匀浆滤出液或原代器官培养物的细胞培养物上清液以1∶1至1∶1000，优选1∶10至1∶100加至原代或永久性哺乳动物细胞培养物中，于32-39℃，优选37℃温孵几日。用于此目的的细胞层生长至20-100％，优选80％-100％铺满。每日观察细胞培养物CPE的发生。另外，于固定的2-7天的时间间隔检查细胞培养物上清液的凝血特征。假如无病毒复制的迹象，细胞培养物上清液于提及的稀释度在新鲜细胞培养物中进一步传代，该过程可重复两遍或更多遍。
假如出现了病毒复制迹象，通过进一步传代病毒适用于细菌培养。
从流产母猪的子宫中取出未出生的小猪，该母猪来自具有PRRS-样症状的猪群。从原代肺细胞培养物并通过细胞系培养物上清液的顺次传代，可能从小猪的肺中分离出细胞病理基因因子。其特征是有被膜的血凝集的单链RNA病毒，直径为约200nm，电镜下可观察到副粘病毒的形态。用抗副感冒病毒2型(P1-2)抗血清Western印迹检测该病毒蛋白质。在同一检测系统中，制备的抗分离的病毒抗血清检测P1-2毒株“SV5”，因而证实了分离的病毒和副感冒病毒II型之间的血清型联系。
这种被称为“SER”的副感冒病毒分离物于1993年6月12日保藏于法国巴黎巴斯德研究所，“Collection Nationale de Cultures etde Microorganismes”，保藏号为I-1331。
分离的病毒可用动物细胞培养物大规模复制。纯化的抗原制备物可从病毒悬液以合适的技术方法制备(离心，切向过滤)。可用于诊断的出发材料及预防猪呼吸及生殖疾病，特别是PRRS。
实施例1分离副感冒病毒分离物“SER”
可以解剖安死的、来自表现出PRRS-样症状的猪群的流产母猪，从其子宫中取出小猪，并从小猪肺中分离“SER”。- PK15细胞(克隆的猪肾细胞，ATCC No.CCL33)- 含Earl’s盐的Eagles基本必需培养基(E-MEM)：
含酚红培养基的E-MEM粉
(e.g.Gibco BRL072-0110) 用于配制100l
非必需氨基酸母液100× 1000ml
硫酸新霉素盐 3g
硫酸多粘菌素B盐 3MU
纯净水(EP8) 补足至100l- 非必需氨基酸母液100×：
丙氨酸(EP752) 8.9g
天冬酰胺-水合物(GP10) 15.0g
L-天冬氨酸 13.2g
甘氨酸(EP614) 7.5g
谷氨酸(EP750) 14.7g
脯氨酸(EP785) 11.5g
丝氨酸(EP788) 10.5g
纯净水(EP8) 补足至10l- 胎牛血清(FCS，e.g.Gibco BRL012-06290)- 生长培养基：含2.0g/l碳酸氢钠和2％FCS的E-MEM- 保持培养基：含0.85g/l碳酸氢钠和5％FCS的E-MEM- 0.25％胰蛋白酶溶液(e.g.Gibco BRL043-05050)- PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)：
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4×12H2O 2.9g
纯净水(EP8) 补足至1000ml- 组织培养瓶，80cm2(Roux flask，e.g.Greiner658170)
在无菌条件下，取出小猪肺的一部分并用剪刀剪碎，用0.25％胰蛋白酶溶液酶切处理。胰酶处理于室温搅拌4小时完成。未消化的大片组织用无菌纱布滤去。滤液通过低速离心于PBS中洗三遍(1000g，10min)。细胞接种到盛有补充了5％FCS的E-MEM80cm2培养瓶中，浓度是105细胞/ml于37℃温孵。每4-5天更换培养基。每天镜检原代细胞的生长，特别注意观察细胞病理基因效应(CPE)的发生。大约两周之后，观察到CPE：形式为圆形的，萎缩的细胞，铺展的趋势减缓。原代细胞的培养物上清液用维持培养基以1∶10稀释，并接种到生产于80cm2瓶中的PK-15细胞的铺满的单层上(接种体积：40ml)。每一细胞的非感染培养亦作为对照而进行。接种7天后，CPE建立起来，开始破坏单层。冻融培养物，将上清以1∶10接种到新鲜培养物上，6-7天之后，用鸡胚细胞检测其上清液的血凝集作用。在第4代中，温孵6天的培养物展示了约100％的细胞病理基因效应。血凝集阳性的培养物上清液贮于-70℃。实施例2副感冒病毒分离物“SER”材料：- 原始种副感冒病毒分离物“SER”- PK-15细胞(克隆的猪肾细胞)，ATCC No.CCL33)- 含Earle’s盐的Eagles基本必需培养基(E-MEM)：
含酚红的E-MEM粉(e.g.Gibco BRL
072-0110) 用于配制100l
非必需氨基酸母液100× 1000ml
新霉素硫酸盐 3g
多粘菌素B硫酸盐 3MU
纯净水(EP8) 补足至100l- 胎牛血清(FCS，e.g.Gibco BRL012-06290)- 生长培养基：含2.0g/l碳酸钠和2％FCS的E-MEM- 维持培养基：含0.85g/l碳酸氢钠和5％FCS的E-MEM- 组织培养瓶，80cm2(Roux flask，e.g.Greiner658170)- 多槽板园盘，6,000cm2(e.g.Nunc164327)方法：
将铺满了PK-15细胞的组织培养瓶中的生长培养基倾出，覆以40ml用维持培养基以1∶50稀释的病毒原始种(masterseed)。于37℃温孵7天后，将组织培养瓶的内容物经冻融处理和超声悬浮，用维持培养基补足到3,000ml体积，然后接种长满了PK-15细胞的多槽园盘。于37℃温孵7天后，收获培养物上清液贮于-70℃直到进一步加工。实施例3灭活疫苗的生产(副感冒病毒分离物“SER”)材料：- 副感冒病毒分离物“SER”，来自病毒复制的细胞培养物上清液- 2-溴乙胺溴化氢(2-BEA)0.5M母液：
2-溴乙胺溴化氢(2-BEA，
BrCH2CH2NH2HBr，Merck820176) 102.5g
纯净水(EP8) 补足至1000ml- 巯基磺酸钠2.5M母液：
Na2S2O3×5H2O(EP414) 620.5g
纯净水(EP8) 补足至1000ml- 氢氧化铝悬液3％(e.g.Superfos)- Quil A1％母液
Quil A(e.g.Superfos) 10.0g
纯净水(EP8) 补足至1000ml- 乙基汞硫代水杨酸钠2％母液
乙基汞硫代水杨酸钠(C9H9HgNaO2S) 50.0g
纯净水(EP8) 补足至1000ml- PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)：
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4×12H2O 2.9g
纯净水(EP8) 补足至1000ml
在细胞培养物中复制的病毒上清液从细胞及细胞碎片中通过10,000×g离心而纯化。以此方法纯化的病毒悬液其病毒颗粒浓度是106.0CID50/ml，来源于一个或多个病毒收获物，转移至无菌容器中。用氢氧化钠溶液(2NNaOH)将pH调至8.4。加入0.5M2-溴乙胺溴氢酸溶液(2-BEA)，并持续搅拌，直到2-BEA终浓度为5mmol/l。病毒灭活于37℃进行18小时。然后于4℃加入2.5M巯基磺酸钠溶液至终浓度最高可达50mmol/l以中和灭活剂。
向62ml灭菌病毒悬液加入31ml无菌氢氧化铝悬液(3％Al(OH)3，pH7.3)混合物于4℃搅拌2小时。加入1.25mlQuil A(2％溶液)和0.1ml乙基汞硫代水杨酸钠(2％溶液)后，用PBS缓冲液将混合物补齐到100ml于4℃再搅拌20小时。成品疫苗装于多种剂量容器内贮于4℃。
所有年龄组的猪的接种通过皮下给药2ml此种疫苗而完成。
包含公开的编码猿猴病毒5免疫原的核苷酸序列的出版物：希伯特，S.W.，佩特森，R.G和兰波，R.A.(1985)副粘病毒猿猴病毒5的凝血素-神经氨酶蛋白：mRNA的核苷酸序列预示了N末端膜锚蛋白。病毒学杂志，54，1-6。希伯特，S.W.，佩特森，R.G和兰波，R.A.(1985)副粘病毒猿猴病毒5的一个预先未识别的小亲水蛋白，SH。病毒学杂志，55，744-751。佩特森，R.G.，哈里斯，T.J.R.和兰波，R.A.(1984)副粘病毒猿猴病毒5mRNA的分析和基因排列。病毒学，138，310-323。佩特森，R.G.，哈里斯，T.J.R.和兰波，R.A.(1984)副粘病毒猿猴病毒5的融合蛋白：预告一高度亲水糖蛋白的mRNA核酸序列。美国国立科学院院报，81，6706-6710。佩特森，R.G.，希伯特，S.W.和兰波，R.A.(1985)副粘病毒猿猴病毒5的生物活性融合和凝血素/神经胺酶蛋白由克隆cDNA在细胞表面的表达。美国国立科学院院报82，7520-7524。托马斯，S.，兰波，R.A.和佩特森，R.G.(1988)由两种编码副粘病毒SV5的氨基共同末端蛋白P和V的副模板核苷酸分化而来的两种mRNA。细胞，54，891-902。
序列表(1)普通资料：(i)申请人：
(A)姓名：Bayer AG
(B)街道：Bayerwerk
(C)城市：Leverkusen
(E)国家：Deutschland
(F)邮编：(ZIP)：D-51368
(G)电话：0214/3066400
(H)电传：0214/303482
(I)电报：85101-265byd(ii)发明名称：用于预防猪呼吸及生殖疾病的疫苗(iii)序列数：4(vi)计算机可读形式：
(A)媒介类型：Floppy disk
(B)计算机：IBM PC compatible
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：
(A)长度：1698bp
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设的：非(ix)特点：
(A)名称/键：CDS
(B)位点：1..1695(xi)序列描述SEQ ID NO：1：ATG GTT GCA GAA GAT GCC CCT GTT AGG GGC ACT TGC CGA GTA TTA TTT 48Met Val Ala Glu Asp Ala Pro Val Arg Gly Thr Cys Arg Val Leu Phe1 5 10 15CGA ACA ACA ACT TTA ATT TTT CTA TGC ACA CTA CTA GCA TTA AGC ATC 96Arg Thr Thr Thr Leu Ile Phe Leu Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ser Ile
20 25 30TCT ATC CTT TAT GAG AGT TTA ATA ACC CAA AAG CAA ATC ATG AGC CAC 144Ser Ile Leu Tyr Glu Ser Leu Ile Thr Gln Lys Gln Ile Met Ser His
35 40 45GCA GGA TAC ACT CGA TCT AAT TCT AGA TTA GGA AGT ATC ACT GAT CTT 192Ala Gly Tyr Thr Arg Ser Asn Ser Arg Leu Gly Ser Ile Thr Asp Leu
50 55 60CTT AAT AAT ATT CTC TCT GTC GCA AAT CAG ATT ATA TAT AAC TCT GCA 240Leu Asn Asn Ile Leu Ser Val Ala Asn Gln Ile Ile Tyr Asn Ser Ala65 70 75 80GTC GCT CTA CCT CTA CAA TTG GAC ACT CTT GAA TCA ACA CTC CTT ACA 288Val Ala Leu Pro Leu Gln Leu Asp Thr Leu Glu Ser Thr Leu Leu Thr
85 90 95GCC ATT AAG TCT CTT CAA ACC AGT GAC AAG CTA GAA CAG AAC TGC TCG 336Ala Ile Lys Ser Leu Gln Thr Ser Asp Lys Leu Glu Gln Asn Cys Ser
100 105 110TGG GGT GCT GCA CTG ATT AAT AAT AAT AGA TAC ATT AAT GGC ATC AAT 384Trp Gly Ala Ala Leu Ile Asn Asn Asn Arg Tyr Ile Asn Gly Ile Asn
115 120 125CAG TTC TAT TTT TCA ATT GCT GAG GGT CGC AAT CTG ACA CTT GGC CCA 432Gln Phe Tyr Phe Ser Ile Ala Glu Gly Arg Asn Leu Thr Leu Gly Pro
130 135 140CTT CTT AAT ATA CCT AGT TTC ATT CCA ACT GCC ACG ACA CCA GAG GGC 480Leu Leu Asn Ile Pro Ser Phe Ile Pro Thr Ala Thr Thr Pro Glu Gly145 150 155 160TGC ACC AGG ATC CCA TCA TTC TCG CTC ACC AAG ACA CAC TGG TGT TAT 528Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Thr Lys Thr His Trp Cys Tyr
165 170 175ACA CAC AAT GTT ATC CTG AAT GGA TGC CAG GAT CAT GTA TCC TCA AAT 576Thr His Asn Val Ile Leu Asn Gly Cys Gln Asp His Val Ser Ser Asn
180 185 190CAA TTT GTT TCC ATG GGA ATC ATT GAA CCC ACT TCT GCC GGG TTT CCA 624Gln Phe Val Ser Met Gly Ile Ile Glu Pro Thr Ser Ala Gly Phe Pro
195 200 205TCC TTT CGA ACC CTA AAG ACT CTA TAT CTC AGC GAT GGG GTC AAT CGT 672Ser Phe Arg Thr Leu Lys Thr Leu Tyr Leu Ser Asp Gly Val Asn Arg
210 215 220AAG AGC TGC TCT ATC AGT ACA GTT CCG GGG GGT TGT ATG ATG TAC TGT 720Lys Ser Cys Ser Ile Ser Thr Val Pro Gly Gly Cys Met Met Tyr Cys225 230 235 240TTT GTC TCT ACT CAA CCA GAG AGG GAT GAC TAC TTT TCT ACC GCT CCT 768Phe Val Ser Thr Gln Pro Glu Arg Asp Asp Tyr Phe Ser Thr Ala Pro
245 250 255CCA GAA CAA CGA ATT ATT ATA ATG TAC TAT AAT GAT ACA ATC GTG GAG 816Pro Glu Gln Arg Ile Ile Ile Met Tyr Tyr Asn Asp Thr Ile Val Glu
260 265 270CGC ATA ATT AAT CCA CCC GGG GTA CTA GAT GTA TGG GCA ACA TTG ACC 864Arg Ile Ile Asn Pro Pro Gly Val Leu Asp Val Trp Ala Thr Leu Thr
275 280 285CCA GGA ACA GGA AGC GGG GTA TAT TAT TTA GGT TGG GTG CTC TTT CCA 912Pro Gly Thr Gly Ser Gly Val Tyr Tyr Leu Gly Trp Val Leu Phe Pro
290 295 300ATA TAT GGC GGC GTG ATT AAA GAT ACG AGT TTA TGG AAT AAT CAA GCA 960Ile Tyr Gly Gly Val Ile Lys Asp Thr Ser Leu Trp Asn Asn Gln Ala305 310 315 320AAT AAA TAC TTT ATC CCC CAG ATG GTT GCT CCT CTC TGC TCA CAA AAC 1008Asn Lys Tyr Phe Ile Pro Gln Met Val Ala Ala Leu Cys Ser Gln Asn
325 330 335CAG GCA ACT CAA GTC CAA AAT GCT AAG TCA TCA TAC TAT AGC AGC TGG 1056Gln Ala Thr Gln Val Gln Asn Ala Lys Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Trp
340 345 350TTT GGC AAT CGA ATG ATT CAG TCT GGG ATC CTG GCA TGT CCT CTT CAA 1104Phe Gly Asn Arg Met Ile Gln Ser Gly Ile Leu Ala Cys Pro Leu Gln
355 360 365CAG GAT CTA ACC AAT GAG TGT TTA GTT CTG CCC TTT TCT AAT GAT CAG 1152Gln Asp Leu Thr Asn Glu Cys Leu Val Leu Pro Phe Ser Asn Asp Gln
370 375 380GTG CTT ATG GGT GCT GAA GGG AGA TTA TAC ATG TAT GGT GAC TCG GTG 1200Val Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Leu Tyr Met Tyr Gly Asp Ser Val385 390 395 400TAT TAC TAC CAA AGA AGC AAT AGT TGG TGG CCT ATG ACC ATG CTG TAT 1248Tyr Tyr Tyr Gln Arg Ser Asn Ser Trp Trp Pro Met Thr Met Leu Tyr
405 410 415AAG GTA ACC ATA ACA TTC ACT AAT GGT CAG CCA TCT GCT ATA TCA GCT 1296Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Asn Gly Gln Pro Ser Ala Ile Ser Ala
420 425 430CAG AAT GTG CCC ACA CAG CAG GTC CCT AGA CCT GGG ACA GGA GCC TGC 1344Gln Asn Val Pro Thr Gln Gln Val Pro Arg Pro Gly Thr Gly Ala Cys
435 440 445TCT GCA ACA AAT AGA TGT CCC GGT TTT TGC TTG AAA GGA GTG TAT GCT 1392Ser Ala Thr Asn Arg Cys Pro Gly Phe Cys Leu Lys Gly Val Tyr Ala
450 455 460GAT GCC TGG TTA CTG ACC AAC CCT TCG TCT ACC AGT ACA TTT GGA TCA 1440Asp Ala Trp Leu Leu Thr Asn Pro Ser Ser Thr Ser Thr Phe Gly Ser465 470 475 480GAA GCA ACC TTC ACT GGT TCT TAT CTC AAC GCA GCA ACT CAG CGT ATC 1488Glu Ala Thr Phe Thr Gly Ser Tyr Leu Asn Ala Ala Thr Gln Arg Ile
485 490 495AAT CCG ACG ATG TAT ATC GCG AAC AAC ACA CAG ATC ATA AGC TCA CAG 1536Asn Pro Thr Met Tyr Ile Ala Asn Asn Thr Gln Ile Ile Ser Ser Gln
500 505 510CAA TTT GGA TCA AGC GGT CAA GAA GCA GCA TAT AGC CAC ACA ACT TGT 1584Gln Phe Gly Ser Ser Gly Gln Glu Ala Ala Tyr Ser His Thr Thr Cys
515 520 525TTT AGG GAC ACA GGC TCT GTT ATG GTA TAC TGT CTC TAT ATT ATT GAA 1632Phe Arg Asp Thr Gly Ser Val Met Val Tyr Cys Leu Tyr Ile Ile Glu
530 535 540TTG TCC TCA TCT CTC TTA GGA CAA TTT CAG ATT GTC CCA TTT ATC CGT 1680Leu Ser Ser Ser Leu Leu Gly Gln Phe Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg545 550 555 560CAG GTG ACA CTA TCC TAA 1698Gln Val Thr Leu Ser
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(A)名称/键：CDS
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1095 1100 1105CCT GCA ACT CTT GGA ACA AGA TAA 1656Pro Ala Thr Leu Gly Thr Arg1110 1115(2)SEQ ID NO：4信息：(i)序列特征：
(A)长度：551氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO：4：Met Gly Thr Ile Ile Gln Phe Leu Val Val Ser Cys Leu Leu Ala Gly1 5 10 15Ala Gly Ser Pro Asp Pro Ala Ala Leu Met Gln Ile Gly Val Ile Pro
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165 170 175Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Asn Cys Lys Ala Gln Asp Ala Ile Ile
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195 200 205Asn Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Ser Pro Ile Thr Ile Gln Ala Leu
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530 535 540Pro Ala Thr Leu Gly Thr Arg545 550
Claims (5)
1.一种抗猪呼吸及生殖道疾病的疫苗，其特征在于，它含有作为抗原性物质的副感冒病毒及其变体及其突变体，它们是以活的、死的、减毒的形式或通过重组技术制备的形式，以完整的颗粒或其部分或其亚基存在。
2.一种基于引起猪呼吸及生殖道疾病的副感冒病毒的抗原性物质。
3.一种生产基于引起猪呼吸道及生殖道疾病的副感冒病毒的抗原性物质的方法，其特征在于，副感冒病毒被复制，抗原性物质从如此获得的病毒悬液中以常规方法分离。
4.基于引起猪呼吸及生殖道疾病的副感冒病毒的抗原性物质在诊断和/或预防这些疾病中的应用。
5.基于引起猪呼吸及生殖道疾病的副感冒病毒的抗原性物质在制备检测这些疾病的诊断剂、及制备预防这些疾病的疫苗中的应用。
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