CN86106632A

CN86106632A - 后天性免疫缺乏综合征(爱滋病)疫苗

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Publication number: CN86106632A
Application number: CN86106632.4A
Authority: CN
Inventors: 胡水洛克; 安东尼·波居欧
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1985-09-25
Filing date: 1986-09-25
Publication date: 1987-05-13
Anticipated expiration: 2001-09-25
Also published as: SE9102975D0; DE3690508T1; NZ217645A; HU205780B; WO1987002038A1; IL80073A; GR862412B; ES2002490A6; MY103182A; ATA256786A; SE9102974D0; PT83434B; NL8602422A; SE9102976L; IE862525L; IE59314B1; CN1020752C; GB8622987D0; SE9102974L; FR2587720A2

Abstract

本发明叙述了对与LAV/HTLVIII的表位有关的肽或蛋白质的表达，即淋巴腺病综合症和后天性免疫缺乏综合征的病原学的因素。这些病毒可用抗LAV/HTLVIII感染的病毒疫苗或多价疫苗配方成组剂。还叙述了与LAV/HTLVIII的表位有关的抗原肽和蛋白质。这些均可用重组DNA技术或化学合成制备，也可当作亚单位疫苗中的免疫原或作为诊断免疫测定中的抗原。

Description

本发明涉及几种能表达某些肽和蛋白质的病毒。这些肽和蛋白质与淋巴结病病毒（LAV）和人体T-细胞白血病病毒（HTLV-Ⅲ）的表位以及淋巴结病综合征（LAS）和后天免疫缺乏征（AIDS）的病源因素有关。

本发明涉及的能够表达导致保护性免疫应答的LAV/HTLVⅢ相关肽的病毒，可以作为免疫原用于针对LAS或AIDS的病毒疫苗配方或多功能疫苗的配方。事实上本发明涉及的传染性病毒在宿主中繁殖但不导致疾病，因而能用于活的病毒疫苗配方作为延长免疫的刺激作用，并且升高实际的免疫力。

本发明还涉及某些与LAV/HTLVⅢ表位有关的肽和蛋白质，该特定的肽或蛋白质可在LAS或AIDS亚单位疫苗配方中作为免疫原或用于多价疫苗配方或作为抗原用于LAS或AIDS的诊断免疫测定。这些肽和蛋白质可以在任何载体宿主系统中通过DNA重组技术获得或者通过化学合成方法获得。因而，本发明还涉及对DNA新顺序和载体结构的解释，这些载体和DNA包括质粒DNA和寄生于人体、动物或昆虫的病毒DNA，或者噬菌体。该噬菌体在合适的宿主中可以指导LAV/HTLVⅢ相关肽和蛋白质的表达，因而可以从相应宿主细胞中纯化上述的肽和蛋白质。本发明还描述了化学合成LAV/HTLVⅢ相关肽和蛋白质的方法。

本发明的一个具体实施例，使用重组体牛痘病毒制备LAV/HTLVⅢ外壳或核心的相关蛋白质。编码LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白或核结构蛋白的env或gag DNA顺序被分别地插入到能指导LAV/HTLVⅢ基因在合适的宿主中表达的牛痘载体。通过重组牛痘病毒产生的LAV/HTLVⅢ外壳相关蛋白，对于低于人类的灵长目动物可以作为抗原和免疫原并且能诱导体液或细胞调节的免疫。由重组体牛痘病毒产生的LAV/HTLVⅢgag相关蛋白质是具有免疫反应性的蛋白质，它含有了大部分真核蛋白的表位。

在病毒疫苗中，可以表达LAV/HTLVⅢ外壳相关蛋白的重组牛痘病毒可以单独使用，或者连同表达其他LAV/HTLVⅢ相关蛋白（如核结构蛋白）的牛痘重组体一起使用。另一方面，重组病毒产生的LAV/HTLVⅢ相关蛋白可以纯化或用化学法合成并在亚单位疫苗配方中用作免疫原。由于LAV/HTLVⅢ相关蛋白在宿主动物体内被视为“外来物”而发生由体液和/或细胞调节的免疫应答以抵御某种蛋白质或其组合体。由于这种免疫应答的存在，利用合适的疫苗配方可以保护宿主避免LAV/HTLVⅢ的随后感染。

本发明的另一个实施例，重组杆状病毒（Autogroapha californica nuclear polyhedrosis virus或Ac NPV）用于制备LAV/HTLVⅢ外壳和核的相关蛋白。编码外壳蛋白或核结构蛋白的env或gag的DNA顺序分别地被插入杆状病毒载体，该载体在合适的宿主中可以指导LAV/HTLVⅢ基因的表达。重组杆状病毒产生的LAV/HTLVⅢ蛋白经放射免疫沉淀法和ELISA测定证明具有抗原性。

本发明也提供LAV/HTLVⅢ抗原产品，在医药方面具有普遍的重要意义。如本发明所述的特定的肽和蛋白质在免疫测定法中作为试剂而使用。作为诊断工具在ELISA试验和放射免疫测定法中测定抗体对于血样、体液、组织中的LAV/HTLVⅢ的专一性。此外，这些试剂在描述LAV/HTLVⅢ的发病机制方面也是一个有使用价值的工具。

爱滋病毒

后天性免疫缺乏征是一种主要由于病人细胞调节免疫应答能力的缺乏而引起的严重的免疫缺乏征。（Gottlieb，M.et al.，1981，N.Engl.J.Med.305∶1425;Masur，J.et al.，1981，N.Engl.J.Med.305∶1431）。现举两例对该病的临床症状作描述：（a）称为淋巴结综合征（LAS）的前期，其特征为慢性的淋巴结征，白细胞减少和外周血液辅助细胞（OKT4细胞）减少导致正常外周辅助T淋巴细胞与抑制T淋巴细胞的比例（OKT4∶OKT8）从2逆转至0.1并随病情的恶化进一步下降;（b）免疫缺乏症状，特征为OKT4细胞的减少和正常OKT4与OKT8比例的逆转，淋巴细胞绝对数量减少和主要由卡氏肺囊虫引起的反复感染;对于大部分病例后期的病情最终导致患者死亡。有些患者还出现淋巴瘤和卡波济氏肉瘤的恶化现象。目前还没有方法可以活愈或治疗该疾病。

从综合各种情行的患者的流行病学数据来看，致病原因为接触传染物。下列三个小组提供的证据将有力证明AIDS的致病因素，是一种对于辅助T淋巴细胞有一种向性的逆行病毒（retrovirus）。

（a）R.C.Gallo及其同事于国家健康研究院从爱滋病及初期AIDS患者身上分离出一种使细胞致病的逆行病毒（retrovirus）（HTLVⅢ）Gallo，R.C.et al.，1984，Science 224∶500;Popovic，M.et al.，1984，Science 224∶497）他们还检测了与AIDS病患者血清中HTLVⅢ对抗的抗体。

（b）L.Montagnier及其同事于巴斯德研究院从一位患颈部淋巴结症而被怀疑患了AIDS病的患者身上分离出一种T-淋巴营性的逆行病毒（retrovirus）（LAV/HTLVⅢ）。Barre-Sinoussi，F.，et al.，1983，Science 220∶868）该小组同样还从AIDS病患者血清中得到抗LAV/HTLVlll的抗体。（Kalyansraman，V.S.，et al.，1984，Science 225∶321）甚至他们还从一位因接受了AIDS病患者的献血而染上AIDS病的患者的淋巴细胞中分离出LAV/HTLVⅢ。（Feorino，P.M.，et al.，1984，Scienee 225∶69）。

（c）J，Levy及其同事们从AIDS病患者的外周单核细胞中分离出传染性的逆行病毒（retrovirus）（术语称为AIDS病相关逆行病毒或ARV）（Levy，J.A.，et al.，1984，Science 225∶840）。

尽管三种病毒各自独立地被分离出来，但是它们也许属于共同的逆行病毒亚组（subgroup）（Levy，J.A.，et al.，1984，Science 225∶840），在此统称为LAV/HTLVⅢ。

逆行病毒的一般结构为在一个核糖蛋白的核芯外由包括外壳在内的类脂层包裹着，外壳是在细胞芽生阶段形成的。植入外壳和留在外面的是由病毒编码的糖蛋白。这些物质决定了病毒的宿主种类并和易感细胞外表的受体产生专一性反应。可以考虑中和抗体结合在外壳糖蛋白上并阻止与细胞表面受体之间的互相作用。（PP.534-535的，The Molecular Biology of Tumor Viruses，ed.J.Tooze，1973，Cold Spring Harbor Laboratory;PP.226-227 and 236-237 in，RNA Tumor Viruses，ed.R.Weiss，N.Teich，H.Varmus，and J.Coffin，1982，cold spring Harbor Laboratory.）在特殊情况下可以肯定，存在于一类T-淋巴细胞的T₄抗原为LAV/HTLVⅢ病毒的受体或受体的组成部份。（Dalgeish，A.G.，et al.，1984，Nature 312∶763;Klatzma-nn，D.，et al.，1984，Nature 312∶767）。

图1表示的为LAV/HTLVⅢ的RNA染色体。其中有三个基因常常提到。gag基因编码病毒的内部结构蛋白（核蛋白）并确定病毒的类属特性抗原。

pol基因编码与逆转录酶有关的病毒粒子。env基因编码病毒糖蛋白。及以sor和3′-orf标记的表示该染色体包含空位译读结构的区域，但是对其功能目前还不了解。

疫苗

目前使用许多方法以预防和治疗病毒感染。包括使用能引起免疫应答的疫苗、化学药剂及干扰素。传统制备疫苗的方法有使用去活病毒或使用活性碱弱病毒两种。灭活病毒是一种无害的生物药剂同时又保留了引起免疫的能力。这些“被杀死的”病毒颗粒射入宿主后引起免疫应答以抵抗此后由活病毒引起的感染。然而关键在于使用的病毒疫苗不能做到杀死所有的病毒颗粒，而且即便能够做到这一点，由于灭活的病毒在宿主中不能繁殖，免疫作用时间太短，往往需要重复进行疫苗注射。此外，灭活过程可能改变病毒蛋白而使免疫活性下降。

病毒制品经过毒性减弱作用基本上丧失了致病的能力。使病毒减毒的方法是使病毒在异常的条件下生长和/或在细胞培养中频繁地进行继代培养。然后选出毒力减低的病毒突变体，这种突变体保留了诱导免疫反应的能力。用减弱毒力的病毒因其可以在宿主中繁殖而使免疫作用时间持续很久，因而作为免疫原往往比较理想。但是使用活的疫苗也存在若干问题，其中最令人担心的是毒力的降低是否已经足够。

采用亚单位疫苗的办法与前述方法相对照。此免疫方法是仅仅针对那些有免疫学相关的蛋白质的。许多含外壳病毒编码的糖蛋白含有能诱导中和抗体的抗原表位。例如，La Crosse病毒的糖蛋白（Gonzalez-Scarano，F.，Shope，R.E.，Calisher，C.E.and Nathanson，N.，1982，Virobogy 120∶42.），新生期的小牛腹泻病毒（calf Diarrhea virus）（Matsuno，S.and Inouye，S.，1983，《感染与免疫》39∶155）Infection and Immunity委内瑞拉型马脑脊髓炎病毒（Mathews，J.H.and Roehrig，J.T.，1982，J Imm.129∶2763），Punta Toro病毒（Dalrymple，J.M.，Peters，C.J.，Smith，J.F and Gentry M.K.，1981，ln《阴性单链病毒的复制》，D.H.L.Bishop and R.W.Compans，eds.，P.167.Elsevier，New york），鼠白细胞病毒（steeves，R.A.，strand，M.and Augst，J.T.，1974，J.Virol.14∶187），及鼠乳房肿瘤病毒（Massey.，R.J.and Schochetman，G.，1981，Virology 115∶20）.亚单位疫苗的一个优点为排除了不相干的病毒物质。

疫苗常辅以佐剂。佐剂有助于提高耐受性和免疫水平，使用的免疫原的剂量较单独使用时少的得多。佐剂的作用机理是复杂的，还没有完全为人所知。其作用可能为刺激吞噬作用及内质网系统的活性，同时延迟抗体的释放及抗体的降解。佐剂的例子有如下这些，Freund′s佐剂（完全或不完全），佐剂65（含花生油，二缩甘露醇-油酸脂及硬脂酸铝），普鲁兰尼克多醇化合物L-121，Avridine，及氢氧化铝或磷酸铝或者明矾等的无机物凝胶。Freund′s佐剂已经不再使用了，因其含有非生化代谢矿物油而成为一种潜在的致癌物。

用于生产亚单位免疫的重组DNA技术包括分子克隆及克隆的病毒基因在合适的宿主中表达并获得在宿中动物体内能引起免疫中和应答的蛋白质。并且排除了其他的非表达上述特定的蛋白质的任何遗传信息。宿主没有受完全病毒的影响因为没有感染的危险性。

最近，有人提出一种对于制备亚单位疫苗很有用处的方法。（Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，1982，Proc Natl.Acad.Sci 79∶7415-7419;Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，1984，J.Virol.49∶857-864;Panicali，D.and Paoletti，E.，1982，Proc.Nat′l.Acad.Sci.79∶4927-4931）。此方法包括应用牛痘病毒作为载体，将外来的基因插入其染色体，并使之表达特定的蛋白质。重组的牛痘病毒插入外来基因后导入宿主动物，使宿主对于重组基因表达的产物产生免疫应答。因为活的重组牛痘病毒可以用作疫苗，故而此方法具备了亚单位疫苗和活疫苗的共同优点。

牛痘病毒包含一条线性的反链DNA染色体，具有大约187千对碱基对并在被感染的细胞的细胞质中复制。在这些病毒的核芯中包含一个完整的转录酶系统（包括帽子形成，甲基化和聚腺嘌呤酶）。这些系统是引起病毒感染所必须的。当这些病毒失去了核之后就丧失了感染能力。牛痘病毒的转录控制顺序（启动子）可以被牛痘的RNA聚合酶转录启动但不能被宿主细胞的RNA聚合酶启动。

只有当牛痘启动子被结合在外来基因的蛋白克隆DNA序列时，重组牛痘病毒的外来DNA才能表达。质粒载体亦称为插入载体，插入基因进行组建后再转入牛痘病毒。

一种类型的插入载体是由以下各部分组成的，（a）一个含有转录起始位点的牛痘病毒的启动子;（b）几种独特的位于转录开始位点的下游的限制性核酸内切酶克隆位点，以插入外源DNA碎片。（c）位于启动子及克隆位点侧面的非必需牛痘病毒DNA，（如TK基因），可以引导基因插入病毒的染色体，（d）一个细菌复制起始点和在大肠杆菌中的复制与选择的耐抗菌素抵抗性标记。Mackett对此类的载体例子作了叙述。（Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，1984，J.Virol.49∶857-864）。

重组牛痘病毒通过将含有外源基因的重组细菌插入质粒加入预先被牛痘病毒感染的细胞，经过转染作用而得到。在被感染的细胞中发生同源重组而使得外源性基因插入病毒染色体。被感染的细胞可通过免疫技术，DNA空斑杂化或随后可以分离的重组病毒基因的选择来筛出。这些牛痘重组体保留了它们的基本功能及感染力并可以容纳大约35千个碱基的外源DNA。外源基因的表达可以通过酶法或免疫测定法进行测定（如免疫沉淀法，放射免疫测定法或免疫吸附法）经重组牛痘感染的细胞合成的蛋白是经过糖化的，并且被运输到细胞表面形成膜糖蛋白。可以通过使用强启动子的方法或对一个单独的基因进行多考贝克隆的方法，得到较高程度的表达。

最近有人提出一种方法，对于重组蛋白的制备具有很大意义。（Pennock et al.，1984，Mol.cell Biol.4∶399;Smith et al.，1983，J.Virol.46∶584）该方法使用杆状病毒载体来表达插入其染色体的外源基因。当该杆状病毒重组体导入适合的宿主细胞后，便可表达其外源基因。

杆状病毒的原始型为Autofrapha californica核多面体病毒（Ac NPV）。Ac NPV染色体包括一个含128千对碱基的双链环状DNA，该染色体的基因图有若干个限制位点（Smith，G.E.and Summers，M.D.，1978，Virology 89∶517）病毒在被感染的细胞的核内进行复制。野生型Ac NPV感染细胞后产生两种病毒形态即闭塞或非闭塞病毒颗粒。闭塞的病毒颗粒被一种叫做多面体的蛋白包裹，该多面体蛋白是由多面体基因编码的。（参阅Virol.131∶561-565，1983）.非闭塞的病毒颗粒通过光学显微镜可以很容易地从感染细胞中观察到。当重组杆状病毒的启动子结合到外源基因的编码蛋白的DNA序列后，该重组杆状病毒的外源DNA才能被表达。质粒载体亦称为插入载体，嵌入基因而被组建，然后组建了的质粒再将嵌入基因插入Ac NPV。一种类型的插入载体是由以下各部分组成的，（a）一个含有转录起始位点的Ac NPV启动子（b）几种独特的位于转录开始位点下游的限制核酸内切酶克隆位点，以插入外源DNA碎片。（c）位于启动子及克隆位点侧面的非必需Ac NPVDNA（如多面体基因）可以引导基因插入病毒的染色体。（d）一个细菌复制原点和在大肠杆菌中的复制与选择的耐抗菌素标记。Miyamota等人对此类载体的例子作了叙述。（1985，Mol.Cell.Biol.5∶2860）。

重组杆状病毒可以通过将插入了外源基因的重组细菌质粒与杆状病毒DNA共同转源入细胞中而获得。在被感染的细胞中发生同源重组并使外源基因能插入病毒染色体。一旦外源基因插入了多面体基因，就不能再产生闭塞病毒颗粒，因而可以通过观察由于缺乏闭塞体而产生的空斑的办法把重组空斑筛选出来。被感染的细胞也可通过免疫学技术，DNA空斑杂化或重组病毒的基因选择的方法来筛选。重组病毒随后可以被分离。杆状病毒的重组体保留了它们基本的功能及感染能力。

外源基因的表达可以通过酶法或免疫测定来检测（例如免疫沉淀法，放射免疫测定法，或免疫斑点法）通过使用强启动子或对单个基因的多考贝克隆方法，可以提高表达的程度。

指导与LAV/HTLVⅢ抗原表位有关的肽或蛋白表达的病毒已被叙述。本发明表达与LAV/HTLVⅢ有关的能诱导保护性免疫应答的抗原表位的重组病毒，可被制成病毒疫苗配方，用来保护人们抵抗LAV/HTLVⅢ的感染。本发明的实施例中，用在宿主中不致病但在被感染的宿主中能表达与LAV/HTLVⅢ有关的抗原表位的具有感染性的病毒，可用以活的病毒疫苗的配方。

本发明也涉及与LAV/HTLVⅢ的抗原表位有关肽或蛋白质。那此诱导产生保护免疫应答的物质可被用在亚单位疫苗或者多价疫苗来保护人们以防LAV/HTLVⅢ的感染。另外，本发明的肽或蛋白质可用於AIDS或LAS的诊断检测。本发明的肽或蛋白质可在任何宿主细胞表达载体系统中产生并可被分离出来。这些包括，如被合适的重组病毒感染的动物或昆虫细胞;被重组质粒，柯斯质粒或噬菌体转染的细菌类的微生物，重组质粒转化后的酵母。本发明同时提供方法，工艺和被用来表达编码LAV/HTLVⅢ抗原表位基因信息的DNA的组建。另外，本发明所涉及的多肽和蛋白质能被化学法合成。

本发明的实施例中（详见实施例）编码LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白或核芯结构蛋白的基因顺序（就是LAV/HTLVⅢ的env或gag基因顺序）被插入质粒中以使牛痘病毒启动子位于LAV/HTLVⅢ基因顺序的起始蛋氨酸顺列（ATG）与5′位，使插入基因的组建位于牛痘胸腺嘧啶核苷激酶（TK）DNA序列的旁侧。这些质粒转染至预先用野生型牛痘病毒严重感染的细胞中去，这样，允许位于TK顺序旁侧的插入的LAV/HTLVⅢenv或gag基因被重组到牛痘病毒的TK基因中去。这些细胞被溶解而导致病毒在TK^-细胞上形成空斑。重组病毒在5-溴脱氧尿嘧啶存在下通过它们在这些细胞上形成空斑能力进行选择也可以通过对于组成LAV/HTLVⅢ外壳或LAV/HTLVⅢgag序列进行适当的放射性标记的探针进行DNA-DNA杂交。正杂交空斑已被纯化扩大，从而重组病毒被用来测定它们产生LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白或核心结构蛋白的能力。通过重组牛痘病毒表达的与LAV/HTLVⅢ外壳相关的蛋白质证明具有抗原性和免疫原性，并具有亚人类灵长目动物中引起体液和细胞调节免疫的能力。由重组牛痘病毒产生的与LAV/HTLVⅢgag有关的蛋白质是含有真正核心蛋白主要抗原表位的具有免疫反应性的蛋白质。

本发明的另一实施例中，LAV/HTLVⅢenv或gag顺序被插入质粒中去以便杆状病毒多面体启动子可位于3′端多面体DNA后LAV/HTLVⅢ基因的起始蛋氨酸顺序（ATG）的5′位置。这些质粒与野生型杆状DNA一起共转染至细胞中去，使得插入的LAV/HTLVⅢ基因位于被重组到杆状病毒多面体基因中去的另外的Ac NPV顺序的旁侧。细胞被溶解而形成病毒空斑，由于没有外壳的重组病毒，可用目测筛选或用带辐射标志的LAV/HTLVⅢenv或LAV/HTLVⅢgag探针筛选进行DNA-DNA杂交筛选。重组空斑已被纯化和扩大，产生的重组病毒通过产生LAV/HTLVⅢ相关蛋白能力的免疫沉淀法及SDS聚丙烯酰胺凝胶分析的方法将重组病毒筛选出来。被感染的细胞溶解物经测定具有在血清中用ELISA法检测LAV/HTLVⅢ抗体的能力。

附图说明

图1表示完整的LAV/HTLVⅢ的前病毒染色体结构。画阴影线部分为开放的阅读框。此区域编码组专一性的抗原，逆转录酶及外壳蛋白，分别由gag，pol及env代表。交叉阴影线部分代表重叠开放阅读框。图上的数字表达自作为病毒转录开始点的帽子位点数起下游的碱基对数目。限制性位点为用Bg，BglⅡ;Ec，EcoRⅠ;Hn，HindⅢ;Kp，KpnⅠ;Ss，SstⅠ来标记。

图2表示在质粒pRS-3DNA中的LAV/HTLVⅢ专一性区域（EcoRT至Sstl）的核苷酸程序，完整的LAV/HTLVⅢ外壳基因（核甘酸5766至8349）包含在LAV/HTLVⅢ的插入部分中。用于PV-env1，PV-env2及PV-env5的结构的限制性位点被指明。同时还指明了由核苷酸顺序数据推测的完整的外壳基因氨基酸顺序。

图3用图解表示包含有一份LAV/HTLVⅢ外壳蛋白编码顺序的质粒的结构，该外壳蛋白编码顺序接在一个牛痘病毒启动子的下游。LAV/HTLVⅢ外壳编码序列用方框表示，牛痘启动子用暗色的方框表示。图的下方表示牛痘启动子区域与LAV/HTLVⅢ外壳编码顺序的连接部分的核苷酸顺序。划线部分代表假定的插入基因的起始密码子及阅读框。注意在重组PV-env2的翻译顺序（Pro-Val）中的第三及四氨基酸是与LAV/HTLVⅢ外壳编码序列的第四十三及四十四个氨基酸相对应的。

图4用图解表示被插入在一牛痘病毒启动子下游的含有完整的LAV/HTLVⅢ外壳蛋白编码顺序的质粒的结构。牛痘病毒启动子用暗色的方框表示。含有完整的LAV/HTLVⅢ外壳编码区域的质粒PV-env5是分两个步骤组建的。编码区域的5′和3′部份最先分别被克隆至pGS20中形成包含有LAV/HTLVⅢ外壳基因的氨基编码终端的PV-env1和包含LAV/HTLVⅢ外壳基因的羧基编码终端的PV-env2。如图所示，这两部份在StuⅠ部位重新结合。

图5图解表示缺乏转换膜顺序的被插入在一个牛痘病毒启动子下游的，包含有LAV/HTLVⅢ外壳蛋白编码序列的质粒结构。质粒PV-env7分两步组建。PV-env5的5′部份被插入到P26中形成一个中间质粒-PV-env5/26，该中间质粒提供一个可装配的翻译终止顺序（TAA）形成一个截短的env基因。然后用TAA终止的截短的env顺序插入到PG20以组建PV-env7，其中牛痘TK基因顺序位于截短的env基因的侧面。

图6表示牛痘病毒重组体的结构及选择。实线表示牛痘病毒的胸腺嘧啶激酶（TK）基因。此TK基因也存在于质粒PV-env5 DNA中，但是在质粒中TK基因被包含有牛痘7.5K启动子（暗色方框）和LAV/HTLVⅢ外壳编码区域（空白方框）的插入基因打断。当细胞被牛痘感染后，含有被LAV/HTLVⅢ外壳基因打断的TK基因的重组质粒被导入到感染了的细胞。於是在位于插入基因侧面的TK顺序发生了重组而将LAV/HTLVⅢ外壳基因导入牛痘病毒染色体。重组产生的含LAV/HTLVⅢ外壳基因的病毒是TK^-的。

图7表示含有LAV/HTLVⅢenv基因重组牛痘病毒的染色体结构的特征。

图7A表示牛痘重组体V-env5和V-env5NY及其相关亲本牛痘株（WR及V-NY）的限制性酶分析。由限制性酶HindⅢ水解产生的DNA碎片在琼脂糖凝胶电池中被分离，经溴乙锭染色后显示出色带。

图7B表示通过将分离出来的限制性片段转移到硝化纤维素并与对LAV/HTLVⅢ外壳顺序有专一性的探查物杂化后得到的Southern斑点。

图8A表示对由牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体表达的蛋白质进行的Western免疫点斑分析。下述来源的蛋白质在7-15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行梯度电泳电转移至硝化纤维素片上：LAV/HTLVⅢ病毒蛋白（LAV/HTLVⅢ）;野生型牛痘病毒感染的细胞（WTvv）;未感染细胞（mock）;被重组病毒V-env2（V-env2），或V-env5（V-env5）感染的细胞。蛋白质对于AIDS病人血清的免疫反应性可以通过把过氧化物酶加入抗人类TgG抗体的办法进行检测。gp150，gp110和gp41表示LAV/HTLVⅢenv基因的产物。分子量用千道尔顿表示。

图8B表示在两种细胞中由牛痘-LAV/HTLVⅢenv重组体表达的蛋白质的Wertern免疫斑点分析。从BSC-40或Hela细胞中衍生的蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉（SDS-PAGE）分离并且电转移至硝化纤维片上并与LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体的集合血清进行反应。

栏1和5表示模拟感染的细胞;栏2和6野生型牛痘病毒感染的细胞;栏3和7表示由V-env5感染的细胞，栏4和8表示由V-env2感染的细胞。gp150，gp110和gp41表示LAV/HTLVⅢ-env基因产物。用标记为¹²⁵Ⅰ的蛋白A来测定免疫反应性蛋白质。

图9A表示用野生牛痘病毒（WTvv）或者重组牛痘病毒（V-env2和V-env5）感染的细胞所表达的蛋白放射免疫沉淀分析的结果。蛋白质在感染10-12小时后用³⁵S-蛋氨酸标记。细胞溶胞产物中标记蛋白与对照的人体血清（N）或AIDS病人血清（Ⅰ）反应，免疫复合物被金黄色葡萄球菌（Slaphylococcus aureus）蛋白A沉淀。免疫沉淀的蛋白在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并且用荧光照相来检测。分子量用千道尔顿表示。

图9B表示对于用本发明的牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体所表达的以³H-氨基葡糖标记的蛋白质，进行放射免疫沉淀分析的结果。Hela细胞无论是被模拟感染（栏1及5），或被野生型的牛痘病毒感染（栏2及6）或被V-env5（栏3及7）或V-env2（栏4及8）感染的都用³H-氨基葡糖标记。通过加入正常人体血清（栏1-4或LAV/HTLVⅢ血清反应阳性的个体的集合血清（栏5-8）及蛋白A使得细胞溶胞物发生免疫沉淀。免疫沉淀蛋白再用SDS-PAGE拆分。

图9C表示用“脉冲追踪”放射免疫沉淀法对于由牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体表达的LAV/HTLVⅢ外壳蛋白的分析结果。Hela细胞用野生型牛痘病毒V-env5或V-env2感染，³⁵S蛋氨酸标记，并用追踪介质基清洗。在下述时间间隔内，细胞被洗净，溶解，与LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体的集合血清发生免疫沉淀，及用SDS-PAGE分离：0小时（栏1，7，13）;0.5小时（栏2，8，14）;1小时（栏3，9，15）;2小时（栏4，10，16）;6小时（栏5，11，17）及12小时（栏6，12，18）。栏M提供包括C¹⁴标记的分子量标准。

图9D提供对被本发明的重组牛痘-LAV/HTLVⅢ病毒感染的细胞及介质中提出的与LAV/HTLVⅢ外壳相关的蛋白进行的放射免疫沉淀分析结果。Hela细胞不论被模拟感染（栏1），或野生型牛痘病毒（栏2），V-env5（栏3）或V-env2（栏4）感染，都用³⁵S蛋氨酸来标记。细胞被从介质中分离并且溶破。每个细胞溶胞物（Pellet）及介质（Supe）加入LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体的集合血清使之发生免疫沉淀。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE拆分。

图9E提供对于被本发明的重组牛痘-LAV/HTLVⅢ病毒感染的细胞及介质中的与LAV/HTLVⅢ外壳相关的蛋白进行的放射免疫沉淀分析结果。重组V-env包括完整的LAV/HTLVⅢ外壳编码顺序，而V-env7包含的LAV/HTLVⅢ外壳编码顺序缺乏跨膜（anchor）区域。Hela细胞不论被模拟感染（栏1），或被野生型牛痘病毒（栏2），V-env5（栏3）或V-env2（栏4）感染，都用³⁵S蛋氨酸来标记。细胞被从培养基中提出并且溶破。细胞溶胞物（Pellet）及介质（上清液）加入LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体的集合血清使之发生免疫沉淀。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE拆分。

图10，提供对于经重组牛痘-LAV/HTLVⅢ病毒免疫的鼠的血清样品进行的Western斑点反应分析。鼠被V-env5或V-env2重组牛痘病毒免疫。8个星期后，用被SDS-PAGE分析并已电转移至硝化纤维素片上的LAV/HTLVⅢ病毒蛋白与血清样品反应。将山羊的抗鼠免疫球蛋白结合到碱性的磷酸脂酶中，用以测定那些能被鼠血清识别的LAV/HTLVⅢ蛋白。栏a至e提供从五个接种了V-en V5的个体鼠取出的血清样品，而栏f至k则提供从五个接种了V-enV2的个体鼠的血清样品。从对LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体（AIDS）和非免疫的C57B16J鼠（NMS）得到的集合血清被分到用作正和负的对照。LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白gp150，gp110及gp41的部位已被指出。

图11，提供接种了重组牛痘病毒V-env5的弥猴的血清转化的直方图。四只猴子用皮肤划破法接种2×10⁸pfu的V-env5另四只则接种2×10⁷pfu的V-env5。一只动物被接种2×10⁷的pfu的对照牛痘疱疹的单纯的gD重组体（V-HSVgD1）。第一次接种十个星期之后，除动物NO.81之外，给于所有动物用第二次2×10⁸pfu的同一病毒的接种。采集接种前（空白方框）;初次接种后四星期（阴影线方框）;和第二次接种后四星期（实心方框）的血清样品。通过ELISA采用提纯的LAV/HTLVⅢ病毒作为靶抗原的方法来测定血清转化。

图12提供一个对于如上图11描述的经牛痘-LAV/HTLVⅢ重组病毒，V-env5免疫的弥猴血清样品进行的Western免疫斑点分析。采集初次接种前（栏pre）和第二次接种四星期后血清样品。血清被稀释五十倍后与LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白反应，该病毒粒子蛋白经SDS-PAGE拆分并通过电转移固定于硝化纤维素滤片上，电转移用一种所最有效测定两种外壳糖蛋白gp110（图12A）及gp41（图12B）的方法。被弥猴血清识别的LAV/HTLVⅢ蛋白通过将山羊抗一人类免疫球蛋白与碱性磷酸酯酶结合的方法来测定。来自LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体（AIDS）的集合血清用于正对照。真正的LAV/HTLVⅢ病毒粒子（AIDS）作为一种对照使用。

图13描述了被牛痘NY-LAV/HTLVⅢ重组病毒，V-env5NY免疫的黑猩猩血清样品的Western免疫斑点分析。两个黑猩猩用5×10⁸pfu的V-env5NY进行皮下注射，同时另一个动物用同样剂量的V-HSVgD1NY注射，从同源牛痘-NY中组建了牛痘泡疹单一病毒gD重组体。在初次注射后八周内所有动物进行了第二次注射。收集了免疫前的血清样品（栏1），初次免疫后的八周（栏2）和第二次免疫后的二周（栏3）的血清液样品。血清稀释五十倍后取出部份与通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳而被拆分和经电转移固定在硝化纤维素滤片上的LAV/HTLVⅢ病毒颗粒蛋白反应，采用最佳的gp41检测方案。LAV/HTLVⅢ的蛋白质通过与碱性磷酸酯酶相连的羊抗人体免疫球蛋白的黑猩猩血清测定的方法得到识别。收集LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体的血清作为正对照品。

图14描述了在质粒pKS-5DNA中出现的LAV/HTLVⅢ专一区域（SstⅠ至KpnⅠ）的核苷酸顺序，整个LAV/HTLVⅢgag基因（核苷酸340至1835）包括在LAV/HTLVⅢ插入物中。用于pAC-gag1组建的限制性位点已被标出。从gag基因中核苷酸顺序的数据可推论出的整个氨基酸顺序也被阐明。

图15是包含整个插入Ac NPV启动子下游的LAV/HTLVⅢgag蛋白质密码顺序的质粒pAC-gag1组建图解。pAC610克隆载体同时包含一个与多面体基因启动子对应的核苷酸顺序，并含有5′前导顺序和被位于转录起始位点下游部位的克隆位点打断的3′多面体顺序。位于-8位置的克隆位点是：EcoRⅠ，SstⅠ，SmaⅠ（Xmal），BamHⅠ，XbaⅠ和PstⅠ。SalⅠ，AccⅠ和HincⅡ不是单个。没有KpnⅠ或BglⅡ位点。

图16描述了重组Ac NPV（Ac-gag1）的组建和筛选。带阴影的方框表示多面体启动子和5′前导顺序。实心方框表示杆状病毒的多面体基因。部分基因存在于质粒pAc-gag1DNA中，被LAV/HTLVⅢgag密码区（空心方框）阻断。包含被LAV/HTLVⅢgag基因（pAc-gag1）打断的多面体基因的一部分和野生型Ac NPV DNA共同传染细胞。发生在插入基因旁位侧的多面体顺序的重组体将LAV/HTLVⅢgag基因顺序导入Ac NPV染色体中。

图17描述了从被野生型Ac PNY和使用LAV/HTLVⅢgag的特殊探针的Ac-gag1感染的Spodoptera frugiperda细胞提取的RNA的northern斑点分析。

图18描述了在被重组的杆状病毒Ac-gag1感染的细胞中表达的蛋白质的一种放射免疫沉淀分析的结果。分别在感染后24小时（栏1，2），48小时（栏3，4）及72小时（栏5，6）时用[³⁵S]蛋氨酸标志蛋白质2小时。细胞胞溶物中的标记蛋白质与作对照用的人体血清（栏1，3，5）或AIDS病人血清（栏2，4，6）进行反应，并用金黄色葡萄球菌（slaphylococcus aureus）蛋白A使免疫复合物发生沉淀。免疫沉淀的蛋白用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，可用荧火照相法进行测定。分子量单位为千道尔顿计算。

图19提供对于LAV/HTLVⅢ基因相关的蛋白质的“脉冲跟踪”放射免疫沉淀分析结果。该LAV/HTLVⅢ基因相关蛋白质取自于经本发明重组Ac NPV感染的细胞。spodoptera frugiperda（sf9）细胞被Ac-gag1感染并在感染后24小时用脉冲标记法标记5分钟。然后细胞用完全培养基洗涤并用完全培养基培养0小时（栏1，2）培养2小时（栏3，4），4小时（栏5，6）及8小时（栏7，8）。在这些期间内，细胞分别经历洗涤，溶胞及与LAV/HTLVⅢ血清反应阳性个体（栏2，4，6，8）的集合的血清或正常人体血清（栏1，3，5，7）进行免疫沉淀过程。蛋白质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳过程拆分。

图20图示五种包括与含有gag编码顺序的各种长度的LAV/HTLVⅢ染色体结扎在牛痘病毒7.5K启动子的质粒的结构，这五种质粒为PV-gag1，PV-gag2，PV-gag3，PV-gag4及PV-gag5。在这些结构中使用的pGS62克隆载体与pGS20基本相似（参见图3），所不同的是pGS20在其特别的SmaⅠ位下游具有一个独特的EcoRⅠ位点。

图21表示对于各被重组牛痘LAV/HTLVⅢ病毒（V-gag1NY，V-gag2NY，V_gag3NY，V_gag4NY及V_gag5NY），亲本牛痘病毒（V_NY）及模拟（mock）感染细胞模拟（mock）感染的细胞中进行表达的蛋白质的Western斑点（blot）分析的结果。纯化的LAV/HTLVⅢ病毒粒子（LAV/HTLVⅢ）样品可以作为正对照物。汇合的BSC-40细胞有十分之一被感染。感染可以持续12小时，在此期间收集细胞再行溶破。所有细胞的蛋白被SDS-PAGE分离，通过电转移固定在硝化纤维素上。滤片可与下述物质反应：

（1）AIDS病人血清（图21B）可以用结合了碱性磷酸酯酶的山羊抗人免疫球蛋白对其进行测定。

（2）针对已经确定为gag蛋白p25及p18的鼠单克隆抗体（图21A及21C）可以用结合于碱性磷酸酯酶的山羊抗鼠免疫球蛋白对其进行检测。

图22表示质粒pAC-env5的结构，该质粒包含有插在Ac NPV多面体启动子下游的完整的LAV/HTLVⅢ外壳的编码顺序。在前的图15表示PAC610克隆载体。

图23表示用放射免疫沉淀法对于在感染了重组杆状病毒Ac-env5的细胞中所表达的蛋白进行的分析结果。模拟感染的细胞（mock）和亲本杆状病毒株（Ac NPV）列入图中作为对照。对被感染的sf9细胞所表达的蛋白，在感染28小时之后用³⁵S蛋氨酸标记2小时。细胞的胞溶物中的标记蛋白与AIDS病人血清或针对gp110或gp41的鼠单克隆抗体反应，用金黄色葡萄球菌（slaphylococcus aureus）蛋白A使免疫复合物沉淀。免疫沉淀蛋白用SDS-PAGE分离并用荧光照相法检测。

5.发明细述

本发明针对于产生与LAV/HTLVⅢ抗原表位有关的肽或蛋白的病毒。同时也针对于可以采用DNA重组法或化学合成法制取的这些肽或蛋白。本发明中的这些可能引起防御性免疫应答的病毒或肽、蛋白，可以用作各种疫苗配方中的免疫原，以防止LAS及AIDS病的病原物质LAV/HTLVⅢ的感染。另外，本发明涉及的肽或蛋白可用作免疫学诊断分析法中抗原来以检测病人体内LAV/HTLV的特异性抗体。本发明免疫学方法所用的肽或蛋白应具有抗原性（即能与患者LAV/HTLV抗体反应），但毋须具备免疫原性（即能引起免疫应答）此外，免疫学诊断中的抗原也不必在体内引起防御性免疫应答反应。

本发明中一个实施例是使用了DNA重组技术，将编码LAV/HTLVⅢ抗原表位的核苷酸顺序插入到表达载体中，这种载体在适当的宿主细胞中指导LAV/HTLVⅢ顺序的表达。这些表达载体一宿主细胞系统可用于体外制取与LAV/HTLVⅢ有关的多肽或蛋白，这样，基因产物就能从细胞培养物中纯化出来。能引起防御性免疫应答的肽或蛋白可作为疫苗亚单位配方分中的免疫原。再者，本发明中有免疫原性或仅有抗原性的肽和蛋白就可以用作免疫诊断分析中的抗原，来检测病人体内LAV/HTLVⅢ的特异性抗体。本发明中关于肽和蛋白制取的另一层意义在于：通过表达抗原性和/或免疫原性的LAV/HTLVⅢ相关肽和蛋白的重组体内包含的核苷酸顺序，从而可以推断出肽和蛋白产物的氨基酸顺序。这些肽和蛋白可用化学法合成，并用于亚单位疫苗配方中（如果有免疫原性），或用作免疫诊断中的抗原（如果具抗原性和/或免疫原性）。当病毒作为表达载体，指导表达与能引起防御性免疫反应的LAV/HTLVⅢ抗原表位基有关的免疫原时，病毒本身便可构成疫苗。对宿主不致病的感染性重组体病毒可以用于制备提供实体免疫的活疫苗。或者，通过“杀死”病毒可制备灭活的病毒疫苗。此外，还可以制备含两个或两个以上LAV/HTLVⅢ抗原决定基的多价疫苗，或都是一个LAV/HTLVⅢ抗原表位，以及其他致病物的抗原表位都可制备。

只是出于叙述方便，本发明的方法可分为以下几个阶段：（a）编码LAV/HTLVⅢ病毒蛋白的基因或基因碎片的分离。（b）将基因或基因碎片插入表达载体。（c）识别以及表达载体在宿主中复制，表达基因能在宿主系统中的复制生长。（d）基因产物的鉴定和纯化（e）产物免疫能力的测定。（f）疫苗的配方组分。

发明实施例中描述了重组疫苗病毒杆状病毒的结构，这些病毒含有LAV/HTLVⅢ外壳基因，在被重组病毒感染的组织培养细胞中指导与LAV/HTLVⅢ外壳蛋白免疫相关的蛋白质的表达。另外，发明的另一个实施例中描述了重组牛痘病毒的结构和含LAV/HTLVⅢgag基因的重组疫苗病毒和杆状病毒的结构。其中的gag基因指导着受重组病毒感染的组织培养细胞中与核结构蛋白免疫相关的蛋白质的表达。然而此处描述的组成，方法并不仅限于表达LAV/HTLVⅢ外壳或gag基因相关的蛋白的重组病毒结构，还可用于任何表达载体系统重组体的组建，来产生与AIDS病任何致病物抗原有关的多肽。

为清晰起见，整个方法将从LAV/HTLVⅢ外壳及gag基因两方面讨论。同样的技术也可用于类似的模式来组建表达载体，产生与任何LAV/HTLVⅢ蛋白相关的多肽，以及有关病毒的多肽。这些蛋白包括但并不仅限于LAV/HTLVⅢ基因产物，如gag，pol和evn基因，以及至少四种至今称为sor，tat，3′-orf，art或trs的附属基因（参见，Fisher et al.，1986，Science 233∶655-659），

5.1编码LAV/HTLVⅢ病毒蛋白的基因或基因片段的分离。

LAV/HTLVⅢ基因的分离涉及到首先分离出含所需基因顺序（如外壳或gag）的DNA碎片。如前所述，LAV/HTLVⅢ有一个RNA基因组，于是，编码LAV/HTLVⅢ的基因相应的DNA可用以下任何一种方法获得。（a）通过从纯化病毒子中分离出来的RNA进行CDNA克隆（b）通过从LAV/HTLVⅢ感染细胞获得的含Poly（A）的RNA进行cDNA克隆（c）克隆从LAV/HTLVⅢ感染细胞纯化出来的基因组DNA。此后，这里的LAV/HTLVⅢDNA就是指编码LAV/HTLVⅢ的基因的DNA。

为了产生LAV/HTLVDNA碎片，LAV/HTLVⅢDNA可用各种限制性内切酶在一些特殊位点进行剪切。可在锰存在的条件下使用脱氧核糖核酸酶（DNase）将DNA切成碎片;也可以用物理方法剪切DNA，例如用声波。然后线形的DNA片段就可以按其大小用规范化的技术分离出来，其中包括（但不限于此方法）琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电脉，以及柱层析等技术。

假如（限制性）酶不破坏蛋白基因产物的产生抗原能力，任何一种或合并几种限制性内切酶均可用以切取含外壳或gag顺序的LAV/HTLVⅢDNA碎片。例如，一个蛋白质的抗原性位点可含有约7-14个氨基酸，那么一个如外壳多肽前体（约97，000道尔顿）大小的蛋白，就含有许多不连续的抗原位点。再考虑到其中的重迭顺序二级三级结构，一些加工过程，如酰化，糖基化，磷酰化，这样抗原部位可能含有几千个。然而许多区段的部份外壳的多肽基因顺序又可能编码在同一个抗原部位。结果是，许多限制性内切酶将组合起来用以获得DNA片段，这些片段当被插入到适当的载体中时，能够指导生成含有不同抗原决定簇的外壳特有的氨基酸顺序。

当生产出DNA碎片以后，对含所需LAV/HTLVⅢ基因的DNA碎片的鉴别可以通过各种方法来实现。首先，可以排出与相对于整个LAV/HTLVⅢ基因组的有关的DNA碎片的顺序，然后分别根据预测的氨基酸顺序与外壳蛋白或gag核蛋白的比较，来确定含外壳蛋白基因或gag基因顺序的碎片。其次，一旦整个基因组顺序被确定后，大的开放可读结构可以从5′到3′编序。由于至今为止测定过的所有逆行病毒的基因组排布，都是5′gag-pol-env-3′大的开放可读结构中邻近3′端的部位极可能构成外壳基因，而其5′端很可能构成gag基因。第三，特殊基因的鉴别可以通过识别与其他已知的逆行病毒的同源性来实现，或者是通过核酸杂交分析，或者假如顺序已知的话通过顺序比较。

另一方面，含外壳或gag基因的片的鉴别可用mRNA选择来进行在此过程中LAV/HTLVⅢDNA片段以杂交的方法用于分离互补的mRNA。分离得到的mRNA。在体外翻译产物进行免疫沉淀分析显示了需识别的mRNA，于是也鉴定出了含外壳gag蛋白基因顺序的互补LAV/HTLVⅢDNA碎片。最后用选得特定的mRNA（来自吸收的多核糖体，该核糖体系来自LAV/HTLVⅢ感染细胞）以固定受外壳或gag蛋白质指导的抗体作为模板，可以合成有射性标记的LAV/HTLVⅢcDNA（互补DNA）。这样，含放射性标记的mRNA或cDNA就可作为探针用于鉴定含外壳或gag基因顺序的LAV/HTLVⅢDNA片段。分离外壳或gag蛋白基因的方法（但不限于这方法）还包括化学合成基因顺序本身（假如顺序是已知的），或者制取编码外壳或gag基因的mRNA互补DNA（cDNA）。

当鉴定及分离完成以后，含有我们所感兴趣的顺序的LAV/HTLVⅢDNA片段先被插入到一个克隆载体，例如一个质粒克隆载体中去，这载体将转入适当的宿主细胞以复制DNA，这样就可产生我们感兴趣的LAV/HTLVⅢ顺序序的许多考贝。这过程是将LAV/HTLVⅢDNA片段结扎到克隆载体中互补粘附着的末端上。但如果克隆载体中没有与LAV/HTLVⅢDNA片段上互补限制性位点相应的部位时，那么DNA分子的末端就需经过加工，这种加工修饰包括产生平头末端，其方法是消化末端部位的单链DNA，或者补上与末端单链DNA互补的DNA段，这样末端便可平头结扎。另外，任何需要的位点都可用将核苷酸顺序结扎到DNA末端上的方法来获得;这些结扎段可包括经特殊化学合成的编码限制性位点上能识别顺序的低核苷酸。根据其他方法，剪切后的载体和LAV/HTLVⅢDNA碎片可以用加上同聚物尾段的方法来加工。

分离的基因或cDNA或合成DNA顺序的结合所形成的重组DNA分子转化到宿主细胞，能产生基因的许多考贝。这样，只要培养转化体，从转化子中分离出重组DNA分子，就可获得大量基因，如有必要，还可以由分离出来的重组DNA分子中分离取回感兴趣的基因。

如果最终目的是将基因插入病毒表达载体如牛痘病毒或腺病毒，考虑到受病毒感染的细胞的基因重组与LAV/HTLVⅢ基因结合的重组DNA分子可被修饰，以使基因被夹在病毒顺序中间。这样，基因便可插入病毒基因组中。

整个LAV/HTLVⅢ基因现已由Wain-Hobson（Wain-Hobson，S.et al，1985，Cell 40∶9）等克隆，包含一个克隆，指定为包含一9.2千对碱基的LAV/HTLVⅢ染色体顺序中并插进λL47.1的HindⅢ位的DNA碎片的λJ19。一个含有LAV/HTLVⅢ外壳基因的特别有用的λ-J19亚克隆是PRS-3，它包括3，840个碱基对的EcoRⅠ到SstⅠ的LAV/HTLVⅢ核苷酸顺序碎片，这个碎片被插入到Puc18的EcoRⅠ和SstⅠ位置之间。PRS-3中含有的LAV/HTLVⅢ特定的DNA系位于LAV/HTLVⅢ基因组中从第5289位核苷酸EcoRⅠ位点到第9129位核苷酸的SstⅠ位置之间的区段。（Wain-Hobson，S.，et al.，1985，Cell 40∶9）：见图2，其中描述了PRS-3中所含的LAV/HTLVⅢ核苷酸顺序。然而由于核苷酸密码顺序的降解，如图2中描述的其他编码同样氨基酸顺序的DNA也可用于达到本发明中克隆LAV/HTLVⅢ基因的目的。这些包括但并不局限于含所有或部分外壳核苷酸顺序的DNA顺序，如图2所示这些顺序可被编码同种或功能相当的氨基酸残基（如相同极性的氨基酸）的不同密码子所取代这样便导致了一个暗藏的改变。

特别有用的含LAV/HTLVⅢgag基因的λJ19亚克隆是PKs-5和PSS-5。PKs5质粒含Puc18中从SstⅠ到KpnⅠ3，148碱基对的LAV/HTLVⅢ片段。PKs-5中的LAV/HTLVⅢ特定DNA系来自于LAV/HTLVⅢ基因组内从224位核苷酸的SstⅠ位点到3，372位核苷酸的KpnⅠ位点。PSS-5质粒包含Puc18中SstⅠ到SalⅠLAV/HTLVⅢ碎片的5.1千个碱基对。外壳的PSS-5的LAV/HTLVⅢ特定的DNA系来自LAV/HTLVⅢ基因组中从224位核苷酸的SstⅠ位点到5331位核苷酸的SalⅠ位点之间的区段。（Wain-Hobson，S.，et al.，1985.Cell 40∶9），见图14，其中描述了在Pks-5和PSS-5中的LAV/HTLVⅢ核苷酸顺序。但是因为密码顺序核苷酸的降解，如图14中所示，其他编码相同氨基酸顺序的DNA顺序也可用在本发明中，克隆LAV/HTLVⅢ的gag基因。这些包括但不限于含所有或部分外壳核苷酸顺序的DNA顺序。如图14所示，这些顺序可被编码同种或功能相当的氨基酸残基（例如相同极性的氨基酸）的不同密码子所取代。这样便导致一个暗藏的改变。

5.2LAV/HTLVⅢ蛋白编码顺序

插入表达载体。

编码LAV/HTLVⅢ蛋白如外壳gag或其中一部分的核苷酸顺序编码被插入到适当的表达载体，即一个具备转录，翻译插入蛋白编码顺序所需要的载体。在各种宿主一载体系统可用于蛋白编码顺序的表达。这里包括但并不限于病毒（如牛痘病毒，腺病毒等）感染的脯乳类细胞系统;病毒（如杆状病毒）感染的昆虫细胞;微生物如含酵母载体的酵母菌或者用噬菌体DNA，质粒DNA或柯斯DNA转化的细菌。这些载体的表达因素根据它们的表达能力和特性而不同。靠所应用的宿主一载体系统，许多适当的转录翻译要求素的任一项都能使用。例如，当在哺乳类细胞系统中克隆时，可使用由哺乳类细胞基因组分离出来的启动子（如鼠metallothionien启动子）或由这些细胞中生长的病毒中分离的启动子（如牛痘病毒7.5k启动子）重组DNA产生的或合成技术得到的启动子也可用于参与插入顺序的转录过程。

插入蛋白编码顺序的有效翻译同样需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及其邻近顺序。当整个的LAV/HTLVⅢ外壳或gag基因包括它自身的起始密码子及其邻近顺序被插入到适当的表达载体中时，就不再需要另行加入翻译控制信号。当只有外壳或gag编码顺序的一部分被插入时，必须提供外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与蛋白编码基因的阅读结构相协调以保证整个插入顺序的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源来的，天然的或合成的均可。

前述的DNA碎片插入至载体的方法中的任何一种方法都可用于组建含一个嵌合基因的表达载体，这个嵌合基因由适当的转录/翻译控制系统和蛋白编码顺序组成。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组（基因重组）。

在本发明实施例中选择了牛痘病毒及杆状病毒作为表达载体。但本发明并不仅限于使用牛痘病毒和杆状病毒。如前所述，可以使用的表达载体包括但不限于以下载体或它们的衍生物：人或动物病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆虫病毒如杆状病毒;酵母载体;噬菌体载体和质粒及柯斯DNA载体还有其他一些等等。

当腺病毒被用作表达载体时，将LAV/HTLVⅢ基因结扎到一个腺病毒转录一翻译控制复合体上，例如，迟生基因启动子和三联引导顺序。而后这个嵌合基因通过体外或体内重组插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区域（如区域E1或E3）将产生有活力的重组体病毒，它能在感染的宿主细胞中表达与LAV/HTLVⅢ有关的蛋白。目前，已有腺病毒的两个株（4型和7型）被获准并作为军事人员使用的疫苗。它们是最初的选为表达LAV/HTLVⅢ基因的载体。

另外，还要选择宿主细胞株，它需要能调节插入顺序的表达，或能按所期望的特殊形式修饰和加工嵌合基因的产物。始于一定启动子的表达可由于某种诱导物的存在而得到增强（如锌和钙离子对于metallothionein启动子的作用）。于是基因操纵的LAV/HTLVⅢ蛋白的表达得到了控制。如果外来基因克隆的蛋白产物对宿主细胞是致死的，这种控制就显得十分重要。此外，蛋白产物的修饰（如糖基化），加工（如剪切）对蛋白的功能也很重要。不同的宿主细胞都具特有的蛋白翻译后的加工修饰机制。通过选择适当的细胞系或宿主系统可以保证外源基因表达的蛋白的正确修饰和加工。

本发明的两个实施例中，我们分别把LAV/HTLVⅢ外壳密码顺序（分别是顺序的全部和其一部分两种形式）及LAV/HTLVⅢgag密码顺序与牛痘病毒的7.5k启动子相结扎，在各种质粒中形成了嵌合基因。这些质粒中的嵌合基因被放在牛痘病毒Tk基因同源的附加疫苗病毒顺序的侧面。嵌合基因的结构涉及到使用天然和合成的核苷酸，这些核苷酸是编码LAV/HTLVⅢenv或LAV/HTLVⅢgag顺序转录和翻译的控制信号。然后通过质粒载体和牛痘病毒基因库同源TK区域之间的体内重组，将这些嵌合基因导入疫苗病毒表达载体。这些含嵌合基因的重组病毒作为表达载体，产生LAV/HTLVⅢ外壳有关的蛋白或LAV/HTLVⅢgag有关的蛋白。

在本发明的其他实施例中，我们分别将LAV/HTLVⅢ外壳密码顺序及LAV/HTLVⅢgag密码顺序与Autographa Californica核心多面体病毒（ACNPV）的多面体启动子相结扎，在各种质粒中形成了嵌合基因。这些质粒中的嵌合基因两侧是附加的ACNPV顺序。嵌合基因的构成，涉及到天然核苷酸的使用，这些核苷酸编码LAV/HTLVⅢgag或env顺序转录翻译的控制信号。然后通过质粒载体和ACNPV基因组同源DNA之间的体内重组，将嵌合基因导入ACNPV表达载体。这些嵌合基因的重组病毒用作表达载体;以产生与LAV/HTLVⅢ外壳相关的蛋白或与LAV/HTLVⅢgag相关的蛋白。

5.3表达具有复制和表达插入基因的载体的重组体的鉴定

含有外源插入基因片段的表达载体可由三条常用途径鉴定。（a）DNA-DNA杂交（b）“标记”基因功能的出现或消失（c）插入顺序的表达。第一条途径，插入表达载体外源基因的出现，可用含有与外源插入基因同源顺序的探针的DNA-DNA杂交来测定。第二条途径，重组载体/宿主系统可在某些由于载体中外源基因的插入引起的某些“标记”基因功能（就是胸腺嘧啶激酶活力，抗菌素抗性，转化表现型，杆状病毒闭塞体的形成等等）出现或消失的基础上进行鉴定的和筛选。例如，如果LAV/HTLVⅢ基因插入到载体标志基因顺序中时，包含LAV/HTLVⅢ插入碎片的重组体可由标记基因功能的丧失进行鉴定。第三个途径，重组表达载体可通过测定重组体的外源基因表达产物进行鉴定。可在物理学，免疫学或基因产物的功能性质方面的基础上进行测定。

一旦一个特别的重组DNA分子得到鉴定和分离，可用几种方法进行繁殖，取决于这样的重组体是否构成自我复制单位（复制子）。一个自我复制单位，比如质粒，病毒，细胞等。在适合的细胞环境和生长条件下能自我繁殖。为了繁殖缺少自我复制单位的重组体必须与具有这种复制单位的分子结合为一整体。例如，某些转入宿主的表达质粒载体需要与细胞染色体结合在一起以保证繁殖和重组基因的稳定表达。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，重组表达载体就可繁殖和大量制备。

本发明的一个在例子中详细叙述的实施例中，包含LAV/HTLVⅢ的env或gag密码顺序的插入基因被插入到牛痘病毒染色体中的TK基因中，然后病毒转变成TK^-，就丧失了病毒产生胸腺嘧啶激酶的能力。这样的重组体可利用它们在含有5-溴脱氧尿嘧啶及一种使TK⁺细胞致死但不使TK^-细胞致死的核苷类似物的培养基上的生长能力来选择。

使用LAV/HTLVⅢenv或LAV/HTLVⅢgag特异探针，通过DNA-DNA杂交，对重组体进行进一步确定。TK^-重组病毒通过空斑纯化而分离。病毒株可以从被感染的组织培养细胞获得。

在例子中详细讨论的本发明的实施例中，将LAV/HTLVⅢ的env或gag密码顺序的基因碎片段插入Ac NPV染色体的多面体基因中，从而使病毒转变成非闭塞的表现型。这些重组体可观察出它们缺乏闭塞的病毒颗粒，从而被挑选出来。重组体通过Northern斑点分析法，利用LAV/HTLVⅢenv或gag专一性探针进一步被识别。重组病毒通过空斑纯化而分离，从被感染的组织培养细胞中可获得病毒株。

5.4基因表达产物的识别和纯化

具有LAV/HTLVⅢ基因的重组体被识别后，就可以分析该基因的产物。可以通过物理或免疫的方法或根据产物功能的特性对产物进行分析。免疫分析具有特别重要的意义，因其最终目的是使用基因产物及能够表达用于疫苗配方中的产物并/或在免疫测定诊断中作为抗原的重组病毒。

许多抗血清可用于分析下述的产物的免疫反应性，这些产物包括但不局限于：取自LAS或AIDS病人的血清及多价的直接针对LAV/HTLVⅢ病毒的抗血清，病毒外壳蛋白，或由gag基因编码的核芯蛋白。抗原分子包括细菌系统产生的类似物，或者含LAV/HTLVⅢ外壳抗原决定簇的合成肽，或者核芯抗原。本发明中描述的肽和蛋白的识别是基于如下两个要求：第一，与LAV/HTLVⅢ有关的蛋白仅在重组体病毒感染后的细胞中产生。第二，LAV/HTLVⅢ有关的蛋白要对AIDS病患者血清有免疫反应，或与各种针对LAV/HTLV外壳或者核芯蛋白或它们的类似物、衍生物有免疫反应。

蛋白必须有免疫反应活性，无论其来自整个基因顺序或基因顺序的一部分，还是来自两个或两个以上结扎在一起指导合成汇合蛋白的基因。这种反应活性可以通过标准的免疫学技术显示出来，如用放射免疫沉淀分析、放射性免疫竞争或，免疫斑点（immunoblots）的方法。

当LAV/HTLVⅢ有关的蛋白鉴定出来以后，可以用标准方法将其分离纯化出来，这此方法包括层析（如离子交换、亲和层析及按分子大小设计的柱层析）离心，溶解度差异、或其他分离纯化蛋白所用的标准技术。

另一方面，一旦一个有免疫反应活性的由重组体产生的LAV/HTLVⅢ有关蛋白的蛋白鉴定出来以后，该蛋白中的氨基酸顺序可由重组体中嵌合基因的核苷酸顺序推断出来。于是，这种蛋白就可通过已知的标准化学方法进行合成。（如：见Hunkapiller，M.et al.，1984，Nature 310∶105-111）

本发明实施例中的这些肽无论是来自重组DNA技术还是来自化学合成法，都包括但非仅限于如图2或图14所描述的全部氨基取顺序，还包括这样一种情况，即顺序中氨基酸残基被功能相当的氨基酸残基取代，而引起一个暗藏的顺序变化。如，顺序中一个或多个氨基酸残基被另一个功能相当的氨基酸残基（如极性相同）所取代，这就引起一个所谓的暗藏变化。顺序中某一氨基酸的取代物可以从该氨基酸所属组系的其他成员中选择。例如，非极性氨基酸（疏水的）包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。中性极性氨基酸包括酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰氨。带正电（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸。带负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸、及氨酸。

5.5重组体产物免疫活力的确定

LAV/HTLVⅢ有关的产物的免疫能力可以通过这样的方法来确定：即监测经过纯化的蛋白或合成的肽或蛋白免疫后，试验动物的免疫应答。当LAV/HTLVⅢ有关的蛋白被具感染性的重组病毒来表达时，重组病毒本身即可使试验动物免疫。试验动物可以包括老鼠、兔、黑猩猩，最终是人类的受验者。导入免疫原的方法可以包括口服，皮内注射，肌肉注射，腹膜内注射，静脉内注射，皮下注射，鼻腔内的，或其他任何标准的免疫途径。试验体的免疫应答可以通过三种途径来分析（a）用已知的技术如结合酶的免疫吸收分析（ELISA）、免疫班点（immunoblots）、放射性免疫沉淀分析等等，分析得到的生成物免疫血清对真正的LAV/HTLVⅢ病毒抗原的反应活性。（b）免疫血清在体内中和LAV/HTLVⅢ的传染的能力。（Robert-Guroff，M，1985，Nature 316∶72-74）（旨在测定抗外壳抗体），及（c）预防LAV/HTLVⅢ的感染和/或减轻被免疫的动物的感染症状。（Francis，D.P，1984，Lancet 2∶1276-1277∶Gujdusek，D.C.1985，Lancet 1∶55-56）。

5.6疫苗配方

本发明的这个实施例的目的是配制一种疫苗，该疫苗中的免疫原系与LAV/HTLVⅢ抗原决定基相关;或者该疫苗含有一种重组病毒，该重组病毒表达的免疫原针对LAV/HTLVⅢ病毒感染激起保护性应以的预防LAS或AIDS病。另外，多价疫苗配方可以制备成具有多个LAV/HTLVⅢ相关的免疫原决定簇。这样的疫苗包括但不局限于下述情况：含LAV/HTLVⅢ外壳相关决定基的疫苗单独或与其他的LAV/HTLVⅢ决定基，如gag相关决定基共同使用。这样同时包含了env及gag编码的抗原决定基的多价疫苗，在防止AIDS病的扩展很有意义。当两组病人产生针对外壳抗原簇的抗体时，其中未显示病征病人相比之下显得产生更多的抗-gag抗体。（Science，1986，233∶419）。有关研究还显示AIDS病人在早期未显示病征阶段同时产生针对外壳蛋白和核芯蛋白（gag）的抗体。

随着病情的加重，病征显现出来后，抗-gag抗体减少，同时抗外壳抗体数量保持早先水平（Science，1986，233∶282）。在疫苗配方中的gag相关的抗原决定基的包涵物，对于LAV/HTLVⅢ相关疾病的免疫预防及免疫治疗具有特殊意义。本发明的一个实施例对该包涵物的制备作了专门的描述。

多价疫苗能配入含有LAV/HTLVⅢ基因产物和/或表达插入基因产物的重组病毒。这些也能与其他抗原混合用于LAS或AIDS病和其他疾病的预防。接下来是病毒配方举例。

5.6.1病毒疫苗配方

无论是用活的重组病毒疫苗还是灭活的重组病毒疫苗都能配制。怎样选择依赖于表达LAV/HTLVⅢ相关抗原决定基的重组病毒的性质。重组病毒对被免疫的宿主具有感染力但不会致病。活的疫苗是优先选用的因为它在宿主中增殖可延长类似物的刺激对发生自然临床症状不明显的感染非常重要，因而提供了充实的长时间免疫。导入宿主动物的具有感染力的重组病毒能由它的插入基因表达LAV/HTLVⅢ的相关蛋白，从而刺激对LAV/HTLVⅢ抗原的免疫应答。免疫应答对后继LAV/HTLVⅢ挑战具有保护作用的情况下，活的重组病毒本身可被用作对AIDS病毒传染的预防疫苗。这样的重组病毒产物可被用在体外（如组织培养细胞）和体内（如自然宿主）系统的配方中。在这点上对牛痘病毒重组体尤其有用。常规制备方法和天花疫苗配方可用活的重组病毒疫苗配方。（例见Vaccinic Viruses and Factors for Vaccine Antigens，Ed，Quinnan，G.V.，Elsevier，1985，PP，109-116）。

多价活病毒疫苗可用一种或一些具有感染力的表达几种LAV/HTLVⅢ相关抗原决定基的重组病毒来制备。疫苗也可以包括表达导致其他疾病的有机体抗原表位的病毒，加上LAV/HTLVⅢ的抗原表位。例如牛痘病毒（能接纳约35千对碱基的外源DNA）被设计含有LAV/HTLVⅢ抗原表位和与其外壳和gag相关抗原表位基的编码顺序。病毒也可能编码其他LAV/HTLVⅢ的抗原表位。象这样的重组病毒本身也能在多价疫苗中被用作免疫原。疫苗的混合物或其他病毒指导不同的编码。不同LAV/HTLVⅢ和/或其他致病生物体的抗原表位表达的各种功能可被综合于多价疫苗的免疫原中。无论如何，重组病毒对被免疫的宿主是有感染力的，可以制成灭活疫苗的配方。在某种意义上灭活疫苗是“死的”它们的感染力已消失。通常用甲醛处理。在理想状况下，病毒的感染力是被破坏了但不影响其衣壳或具有病毒免疫原性的抗原决定基蛋白。为制备灭活疫苗，大量重组病素必须在培养中生长以便提供足够量的有关抗原。表达不同抗原表位的灭活病毒混合物可被用来配制多价疫苗。在某些情况下，上述方法比采用活的疫苗配方为佳，因为避免了活病毒之间的互助干扰带来的问题。在任一情况下，灭活的重组病毒或病毒混合物应与适当的佐剂一起配制以增强其抗原的免疫应答。合适的佐剂包括，但不并限于：无机凝胶如氢氧化铅，表面活性物质如溶血卵磷脂，普鲁兰尼克多元醇，聚阴离子，肽类，油性乳剂，及人体潜在佐剂如BCG（bacille calmette-Guerin）和小杆菌。（corynebacterium parvum）。

有许多方法可以用以配制上述疫苗配方，它们包括口服及通过皮内、肌肉、腹膜腔、静脉、皮下或鼻腔接触等途径，但并不仅限于这些。当在配方中利用活的病毒重组体疫苗时，则可以采用亲本野生型病毒自然感染途径，其中亲本野生型病毒在疫苗配方中用以制备重组体病毒。

5.6.2亚单位疫苗配方

对于一种病毒疫苗，在亚单位配方中，LAV/HTLVⅢ相关蛋白本身用作免疫原（而且可以是多价的）来使用。如前所述亚单位疫苗仅仅包括使宿主获得免疫所必需的相关免疫物质，以便宿主免疫。相应地，从重组体中提纯的LAV/HTLVⅢ相关蛋白能够表达LAV/HTLVⅢ抗原表位。这些表达LAV/HTLVⅢ抗原表位基的重组体包括了如前所述的病毒感染培养细胞、细菌转移株、酵母转移株或被病毒感染的昆虫（参见5.2，5.3及5.4节）。本发明的另一个实施例中，LAV/HTLVⅢ的相关肽或相关蛋白可以用化学方法合成。因而这些肽或蛋白质的氨基酸顺序可以从指导其表达的插入基因核苷酸顺序来推导。（参见5.4节）

无论免疫原是从重组体提纯的还是化学合成的，最终的产物都被调整到合适的浓度并加入合适的疫苗佐剂然后包装备用。合适的佐剂包括但不仅仅局限于：无机凝胶如氢氧化铝;表面活性剂如溶血卵磷脂、普卢兰尼克氏多元醇、聚阴离子、肽、油质乳剂及具有潜在利用价值的人体佐剂如BCG（bacille Calmette-Guerin）和小杆菌（corynebacterium parvum）。在疫苗配方中免疫原与脂质体合用或结合到多糖或其他多聚物上用作疫苗配方。

LAV/HTLVⅢ相关的肽或蛋白是一种半抗原，也就是说，因其能选择性与其同族抗体反应，而不能激发免疫应答，所以这个分子有抗原性而无免疫性。这个半抗原能以共价健接在一个载体或免疫分子上。例如;一种大分子蛋白如血清清蛋白与半抗原结合后使该半抗原具有免疫原性。这种半抗原载体可以配成一种疫苗使用。

5.6.3被动免疫和抗特异基因型抗体

和用病毒或亚单位疫苗进行的主动免疫所不同的是通过控制前期形成的与LAV/HTLVⅢ的一个或多个抗原表位对抗的抗体，可以使宿主获得短期保护。因而，上述的疫苗配方能被用来生产抗体而用于被动免疫疗法。人体免疫球蛋白可以针对外源的重组免疫原激起免疫应答。此种被动免疫对于未经免疫而又在医院或其他卫生机构中冒着接触AIDS病人危险的人，提供了一种紧急的保护的基础。另一方面，这些抗体能被用于制备抗特异基因的抗体，而该抗特异基因抗体又可作为抗原，针对LAV/HTLVⅢ抗原表位面激起的免疫应答。

本发明的与LAV/HTLVⅢ相关的肽和蛋白质在免疫测定中可用作为抗原，以检测病人的各种组织和体液以及血库和医院中的血液中对付LAV/HTLVⅢ的抗体。为此，本发明的抗原可用于该技术领域中已知的任何免疫测定方法，这些方法包括（但不限于）利用下述所列举技术的竞争和非竞争测定法：辐射免疫测定、酶联免疫吸附剂测定（ELISA）“夹心片”免疫测定沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩射测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定和免疫电泳测定等。

本发明的负疫测定法可用于检查血库和病人中的血是否曾暴露在LAV/HTLVⅢ中以及监视正在医治LAS或爱滋病的病人。按照本发明，与LAV/HTLVⅢ的抗原有关的任何肽和蛋白质均可用于免疫测定。这些抗原包括但并不限于与下述基因产物env，gag.pol相关的肽和蛋白质，同时还包括但并不限于目前刚命名的另外四种基因：sor，tat，3′arf和art（或trs）。的产物相关的肽和蛋白质。在本发明的一个特别实施例中，一组抗原可在免疫测定中，用于检测病人的对准LAV/HTLVⅢ的不同表位的抗体的轮廓。本发明的另一实施例中，可以对已接种本发明疫苗配方的病人进行监督，以查明该病人以后是否暴于LAV/HTLVⅢ之中。在这类情况下，免疫测定中所用的抗原最好是本发明的肽或蛋白质，但所述的肽和蛋白质不应该是病人接种所用的疫苗配方的免疫原，因为这些接种过的个人对于疫苗配方中所用的特殊表位呈血清阳性，结果是导致试验为阳性，而不管是否暴露在病毒之中。例如，如果一个病人是用本发明的与LAV/HTLVⅢ膜相关的表位进行接种，那么该病人应当使用任何其他的与非外壳LAV/HTLVⅢ有关的蛋白质来进行LAV/HTLVⅢ感染的检查，以确定病人中是否存在对LAV/HTLVⅢ特异的抗体。因此，可以检查已接种与外壳有关的表位的病人是否存在对LAV/HTLVⅢ核心抗原或者包括但不限于是sor和3′-orf基因产物等的LAV/HTLVⅢ抗原特异的抗体。

又一实施例中，本发明的与LAV/HTLVⅢ相关的肽和蛋白质在有竟争免疫测定法中用于检出和测定病人的血、血清等内的LAV/HTLVⅢ-HTLVⅢ编码的蛋白质的存在及其数量。

6、实施例：牛痘外壳重组体

在下列各例中，各种质粒载体要建造得含有嵌合基因，其中包括位于有关痘毒的转录控制顺序下面的LAV/HTLVⅢ膜编码顺序的这些含有牛痘启动区和LAV/HTLVⅢ外壳编码顺序的嵌合基因是通过体内重组被插入中痘病毒的基因组内。对这些重组体病毒进行鉴定和提纯，而病毒原料是由受感染的组织培养细胞来制备的。已证明免疫反应性的LAV/HTLVⅢ外壳相关的蛋白质是在体外由这些重组体牛痘病毒产生的。这些重组体已在实验动物身上进行试验，以了解它们诱发中和的或保护性的免疫应答的能力，以及它们作为抗爱滋病的疫苗的可能性。下面将对本发明的该实施的每一步骤进行详细描述。

6、1.总的步骤的程序

6、1、1细胞和病毒细胞

美洲绿猴的肾细胞（BSC-40细胞，从BSC-1细胞，ATCCNo，CCL26中得到的非洲绿猴细胞一种连续系）是从R.康迪（R.Condit纽约，布法罗，纽约州立大学生化系副其教授）处得到，并在杜尔佩科（Dulbecco）改进的伊格尔培养基（DMEM，Gibco，Grand Island，NY）中繁殖，在上述培养基中还加入10%牛胚胎血清和用量各为每毫升100单位的青霉素和链霉素。人体143TK^-细胞（Rhim，J.Set al.，1975，Intl.J.Cancer 15∶23-29）是从M.博查（M.Botchan，加利福尼亚州，伯克利，加利福尼亚大学分子生物系教授）处得到，并在添加用量为25微克/毫升的6-溴脱氧尿苷（BUdR）的上述培养基中繁殖。

人的二倍体细胞（MRC-5）是取自美国典型培养物标本（ATCC NO.CCL171），并在与BSC-40所用的相同培养基中繁殖。

牛痘病毒（WR系，ATCC NO，VR-119）是从R.康迪处得到，然后在含有下列培养溶液的BSC-40细胞中增长，该培养溶液由下列成分组成：DMEM+5%丙种球蛋白游离小牛血清+100单位/毫升的青霉素+100单位/毫升的链霉素。TK重组体选自含有25微克/毫升溴脱氨尿苷（BUdR）的同样培养基中的143TK细胞，并在DMEM培养溶液中的同样细胞系上进行斑块提纯，所述溶液中还含有1%诺布尔琼脂（DIFCO.Detrait MICH），5%丙种蛋白游离小牛血清，浓度各为100单位/毫升的青霉素和链霉素，以及25微克/毫升溴脱脂氧尿苷。病毒原材料在磷酸盐缓冲盐水（PBS，每升含有8克NaCl 0.2克KCl，1.5克NaH₂PO₄和0.2克K₂HPO₄）中稀释，上述磷酸缓冲盐水添加有1毫克分子MgCl₂和0.01%牛血清白蛋白（PBSAM）。

纽约市卫生局的牛痘病毒株是从怀尔夫（wyeth）实验室（Marietta，PA）销售的天花疫苗（Dryvax Lot321501G）商品制造中提纯得到的。天花疫苗是用PBSAM（见下文）稀释，再在BSC-40细胞上接连进行斑块提纯三次。病毒原材料（以下称为v-NY）是经这种斑块提纯分离的在BSC-40细胞上制得，并用于制备重组体病毒。从v-NY得到的重组体病毒原材料被放在MRT-50细胞上繁殖。

6、1、2，DNA的制备、限制和修饰

除另有规定外，下述操作所用的全部方法均如文献（Maniatis et al.，1982.Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Larboatory）中有关部分所描述的那样：质粒DNA的制备（pp.86-96），DNA的限制消化（pp.98-106）和从低熔融温度的琼脂糖凝胶中限制碎片的提纯（pp.157-161和p.170）Klenow碎片大肠埃希杆菌DNA聚合酶反应（pp.107-114）小牛肠的碱性磷酸酶反应（pp.133-134）连接酶反应（p.146）的反应条件，切口转译探针的制备（pp.109-112）和DNA-DNA杂交方法（pp.324-325）

6、2含有与LAV/HTLVⅢENV基因连接的牛痘病毒启动区的质粒载体的结构

下面小段描述了含有前面位置为牛痘病毒转录控制顺序的LAV/HTLVⅢ膜基因的各种质粒载体的结构，这些嵌合顺序侧面与TKDNA相接。以后，这些重组体质粒载体用于将LAV/HTLVⅢ膜编码顺序通过活体内重组后插入痘苗病毒的基因组中。

在下述小段中叙述的是，LAV/HTLVⅢ膜编码顺序是从PRS-3提纯的，PRS-3是入J19的一个亚克隆（Wain-Hobson，S.，et al.，1985，Cell40∶9）并插入PGS20中所包含的牛痘7.5k启动区下方的质粒PGS20之中（Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，1984，J.Virol.49，857-864），以构成pv-env1，pv-env2，pv-env5和pv-env7。在这些结构中每个结构，嵌合基因（即将牛痘7.5k启动区连接到LAV/HTLVⅢ特异的核苷酸顺序中）侧面与牛痘TK基因顺序相接。

如前所述，PRS-3是由克隆到PUC18的ECORⅠ和SstⅠ位置的λJ19包含的LAV/HTLVⅢDNA插入物的一个3840碱基对EcoRⅠ至SstⅠ碎片组成。它是通过将J19的SstⅠ限制碎片克隆到PUC18的SstⅠ位置，以创造PBT-1，后者再用EcoRⅠ消化和重新连接。这种DNA用于改变大肠杆菌（E.coli），而质粒PRS-3被分离出来。PRS-3所包含的LAV/HTLVⅢ特异的DNA是在LAV/HTLVⅢ基因组中从位于核苷酸5289的EcoRⅠ位置至位于核苷酸9129的SstⅠ位置（wain-Hobson，S.，et al.，1985，Cell40∶9）;见图2。

6、2、1.含有与LAV/HTLVⅢ ENV基因的3编码顺序相连接的牛痘病毒启动区的质粒载体的结构

5微克PRS-3质粒DNA用限制酶KpnⅠ消化完全，所产生的碎片溶解在1%低熔融温度的琼脂糖凝胶中。然后分离出一个2.68千碱基对（Kbp）碎片，并予以提纯。该碎片含有包括顺序（5889-8349）在内的核苷酸编号为5889至8572的LAV/HTLVⅢ一特有的DNA，所述顺序为LAV/HTLVⅢ膜蛋白质的C-末端部分编码。

将上述1微克碎片与预先已用限制酶BamHⅠ线性化的0.5微克PGS20DNA混合。在由0.6微克5′-GATCCACCATGGTAC-3′-OH和0.3微克的5′-CATGGTG-3′-OH的低脱氧核苷酸联接子存在下，让这二种碎片的联接作用在4℃的温度中进行24小时。这些联结子用于：（a）将从PRS-3质粒DNA中得到的2.68千碱基对（Kbp）碎片的KpnⅠ粘性末端转化成BamHⅠ粘性末端，后者补偿裂开的PGS-20DNA的BamHⅠ粘性末端;（b）在关于LAV/HTLVⅢ膜基因顺序以及转录的mRNA的有效转译所需的核苷酸顺序的正确读码中提供一个转译起始顺序（ATG）。联结混合物用于转化大肠杆菌菌株MC1000.对从α-氨基苄青霉素具有抗药性转化突变型中得到的质粒DNA进行插入取向和在联结接点处的BamHⅠ，NcoⅠ和KpnⅠ部位的再生的试验。这种所需要的质粒pv-env-2的已确定的结构如图3，其中相应应于核苷酸编码为5889-8572（如图2所示）的LAV/HTLVⅢ膜基因的羧基编码部分是位于7.5k牛痘启动区下方。相对于DNA联结子所供给的起始ATG而言，LAV/HTLVⅢ膜顺序位于正确读码上。

6、2、2含有连接在LAV/HTLVⅢenv基因的5′编码程序上的牛痘病毒启动区的质粒载体结构

5微克PRS-3的质粒DNA用AVaⅡ限制酶消化完全，所产生的碎片溶解在1%低熔融温度的琼脂糖凝胶中。然后分离出一个0.82千碱基对碎片，并予以提纯。该碎片含有核苷酸编号为5671至6490（如图2所示）的LAV/HTLVⅢ一特有的顺序。这包括为膜蛋白质中的N-终端部分编码的顺序（核苷酸编号为5766至6490）和LAV/HTLVⅢ的5′近端未转译顺序的95碱基对。上述碎片在过量的脱氧核糖核苷酸三磷酸盐存在下，用Klenow碎片大肠杆菌DNA聚合酶处理。所得的钝端碎片被联结到0.5微克的PGS20DNA上，后者事先用SmaⅠ线性化，并用小牛肠的碱性磷酸酶（CIAP）处理。联结过程在12℃温度下进行16小时。联结混合物用于改变大肠杆菌菌株MC1000。对从α-氨基苄青霉素具有耐药性转化突变型中得到的质粒DNA进行有关痘病毒转录控制顺序的LAV/HTLVⅢ插入取向的试验。所需要的质粒pv-env1的以确定的结构示如图4，其中相应于核苷酸编号5671至6490（如图2所示）的含有其自身起始ATG的LAV/HTLVⅢ膜基因的氨基编码部分是位于牛痘7.5k启动区下方。

6、2、3含有连接在LAV/HTLVⅢenv基因的整个编码顺序上的牛痘病毒启动区的质粒载体结构

2微克PV-env1的质粒DNA用限制酶StuⅠ，PvuⅠ和XhoⅠ完全消化。所产生的碎片溶解在1%低熔融温度的琼脂糖凝胶中。pv-env1用StuⅠ和PvuⅠ裂解从而产生2个4千碱基对碎片，其中一个碎片包含LAV/HTLVⅢ的5′部分，另一个则含有PGS20;而XhoⅠ将含有PGS20的4千碱基对碎片分裂成较小的碎片，因此后者的能识别含有牛痘病毒转录控制成分和LAV/HTLVⅢ膜编码顺序中5′部分的4千碱基对StuⅠ和PvuⅠ碎片。然后将该碎片进行分离、提纯和使其联结到由pv-env2的StuⅠ和PvuⅠ限制消化所产生的6.5千碱基对碎片上。联结混合物用于改变大肠杆菌菌株MC1000。然后选出对α-氨基苄青霉素具有耐药性转化突变型。对从各个转化突变型中得到的质粒DNA试验StuⅠ和PvuⅠ限制部位的再生，以及亲本的4千碱基对和6.5千碱基对碎片存在与否。图4示出所需要的质粒pv-env5它含有相应于核苷酸编号为5766至8349（如图2所示）的，从牛痘病毒转录控制成分下方联结的LAV/HTLVⅢ的整个外壳基因。

6、2、4含有与缺少穿膜（ANCHOR）顺序的LAV/HTLVⅢenv基因相连接的牛痘病毒启动区的质粒载体结构

质粒pv-env5（10微克）用HindⅢ完全消化，所产生的碎片溶解在1%低熔融温度的琼脂凝胶中。对含有牛痘7.5启动区和LAV/HTLVⅢ的env-编码顺序的5′启动区的3千碱基对碎片进行提纯，然后用Klenow酶处理，以插入粘性未端。然后将此碎片联结到业已用EcoRⅠ消化、接着又依次用Klenow酶和小牛肠的碱性磷酸盐（CIAP）处理过的多部位克隆的载体（cloning v

ctor）p26。pv-env5的插入HindⅢ部位和质粒p26的插入EcoRⅠ部位的联结作用产生了一个与env编码顺序同相的终止密码子。这种中间结构称为pv-env5/26。

质粒pv-env5/26DNA用于改变大肠杆菌MC1000，并加以增强和提纯。然后它用BamHⅠ和HPaⅠ将其消化，所产生的碎片溶解在1%琼脂糖凝胶中。然后对含有LAV/HTLVⅢ膜编码顺序的2.1千碱基对碎片进行分离，接着再联结到先用BamHⅠ和SmaⅠ消化过的质粒PGS20上。所产生的质粒pv-env7含有联结到LAV/HTLVⅢ特有顺序上的牛痘病毒7.5k启动区，所述顺序从env起始密码子上方的96个碱基对开始，直至核苷酸编号为7698（图5）处的HindⅢ部位。因此，该质粒缺少所推测的LAV/HTLVⅢenv基因的锚顺序。

6、3含有嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重组体牛痘病毒的特性和结构

牛痘病毒的两种亲本菌株用于构成重组体病毒，即标准研究菌株WR和纽约市卫生局所保存的菌株的衍生种V-NY（见6.1.1）。

嵌合的LAV/HTLVⅢenv顺序插入到牛痘病毒基因组是通过体内重组实现的，这是由于质粒pv-env2，pv-env5和PV-env7的嵌合基因侧面与胸苷激酶（TK）基因的牛痘病毒顺序密码相接才使之成为可能。将这些质粒引入被牛痘病毒感染的细胞之中能使质粒上的TK顺序和牛痘病毒基因的相同顺序之间发生重组。嵌合基因的插入是由于在侧翼顺序中的双重组的结果。这类重组体将具有插入牛痘TK基因中的嵌合基因，因此，在表现型上是TK^-。这些TK重组体能被选出使其在添加BUdR的培养基中生长，其中BUdR对TK⁺细胞是致死的，但对TK^-细胞无致死作用。此法的一般原理已有报道（Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，1984.J.Virol.49，857-864）

6、3、1含有嵌合LAV/HTLVⅢenv基因的重组体牛痘病毒的结构

一只100毫米大小的盘子盛有80%汇集的非洲绿猴肾细胞（BSC40株）用牛痘病毒（WR菌株）感染，其中感染复数（mol）为0.05。在37℃下培养2至4小时后，用质粒pv-env2或pv-env5的DNA的酸钙的共沉淀物覆盖感染细胞。这些沉淀物是通过将0.5毫升2ZXDNA0-CaCl₂溶液逐滴加入0.5毫升2XHe BS溶液中来制备的（ZXDNA-CaCl₂溶液是将20微克质粒DNA溶于浓度为0.25克分子/升的0.5毫升氯化钨溶液中组成;每毫升2×He BS溶液中含有16毫克氯化钠，0.74毫克氯化钾，0.25毫克的磷酸氢钠的二水合物，2毫克葡萄糖和10毫克HEPES，PH为7.08）。在室温下放置30分钟以形成DNA-磷酸钙共沉淀物。沉淀被覆盖4小时后，细胞用1×He BS清洗一次，然后在2毫升15%甘油的1×He BS溶液中培养3分钟，温度为37℃，接着再用1×He BS清洗一次，再用10毫升生长培养基（DMEM+10%小牛胚胎血清+100单位/毫升青霉素+100单位/毫升链霉素）培养。两天后，得到感染细胞，并用离心分离法收集（4℃，在2000×g离心10分钟）。病毒原材料的制备方法是将这些细胞重新悬浮在1毫升PBSAM中，然后进行二次冻结和融化循环，接着再进行三次15秒的声处理。

重组体是按下述方法精选：使稀释度为10^-3的0.1毫升上述病毒原材料溶液沉积在60毫米盘子盛有汇集的人体143TK细胞，用5毫升含有下列成分的DMEM溶液覆盖（以每盘计）：1%Nobel琼脂（Difco，Detroit，MICH），5%小牛血清，25微克DMEM/毫升BUd R。经过二天沉积后，细胞通过覆盖2毫升（以每盘计）含有如上述同样拼料的琼脂培养基对其染色，其中所述培养基内除添加0.01%中性红外，其他成份均与前述相同。染色后第一天收集各斑块，并使其重新悬浮在0.5毫升PBSAM中，取出一整份的病毒悬浮液（0.25毫升），用于在选择的培养基（DMEM+10%小牛胚胎血清+100单位/毫升青霉素+100单位/毫升链霉素+25微克/毫升BUd R）中感染接种在直径为16毫米管内的汇集得到的143TK^-细胞。感染细胞是通过离心分离予以收集，然后再悬浮在含有0.5毫克/毫升胰蛋白酶和0.2毫克/毫升乙二胺四乙酸（EDTA）的100微升PBS溶液中。细胞在37℃下培养30分钟使其溶解，然后进行三次声处理，每次20秒。采用多管式过滤岐管;使细胞溶解产物收集在硝化纤维素过滤器上（Schleicher and Schuell，Arlington，MA）。通过DNA-DNA杂交（参见Mackett，M.，Smith，G.L和Moss，B.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79，7415-7419）可确定这些样品中是否存在LAV/HTLVⅢenv特有的DNA顺序。采用断口转译（nick-translation）所制备的用磷-32标记的质粒PRS-3DNA被用作杂交探针。对所述杂交探针有正杂交作用的重组体在选择性条件下（含有BUd R的培养基）在143TK^-细胞上再进行斑块提纯两次，然后又在非选择性条件下，在BSC-40细胞上提纯一次。最后由DNA-DNA杂交证实后，取BSC-40细胞上三次提纯斑块制备病毒原材料，并将其用于以后的特征记述。

重组体病毒的结构示意图如图6所示，图中用于牛痘7.5k启动区（p→）下方的LAV/HTLVⅢ膜基因顺序（env）侧面与牛痘基因组内的TK DNA顺序相接。从中痘病毒基因组和质粒pv-env5之间重组得到的病毒制原材料称为v-env5，它包含完整的LAV/HTLVⅢ膜基因。在此处实施例所描述的具体实施方法中，v-env5含有全部的膜基因以及5-近端未转译顺序的96个碱基对和3′-近端未转译顺序的223个碱基对。从pv-env2中得到的病毒原材料称为v-env2，它包含大部分的LAV/HTLVⅢ膜基因（即KpnⅠ碎片），但缺少用于为LAV/HTLVⅢ膜蛋白质的起始的42个氨基酸编码的部分顺序。由于LAV/HTLVⅢ膜蛋白质的推测的信号顺序是位于所述蛋白质中起始的49个氨基酸内，则v-env2应当产生一种不具有信号顺序的蛋白质，因此可以预期由所述重组体病毒产生的与LAV/HTLVⅢ相关的蛋白质不会输送成膜。与此相反，包含完整的LAV/HTLVⅢenv顺序的v-env5应当产生一种能输送到膜的蛋白质。从pv-env7中得到的病毒原材料称为env7，它包含LAV/HTLVⅢenv膜基因的整个N-末端，但缺少HindⅢ部位下方的顺序。由于此结构中没有所推测的穿膜（锚）顺序，人们会预期由所述重组体所产生的与LAV/HTLVⅢ相关的蛋白质被分沁进入生长培养基中。这种性质是有利于该种蛋白质的提纯，以使用其作诊断试剂或用于作为亚单元疫苗的配方

6、3、2牛痘LAV/HTLVⅢ膜重组体的限制膜式

分别从亲本牛痘病毒株WR和V-NY，以及它们的衍生种v-env5和v-env5NY中得到DNA是按业已描述的方法进行分离（Esposito et al，1981，J，Virol.Methods，2∶175-180），它们限制酶HindⅢ对其进行消化，所产生的碎片溶在0.7%琼脂糖凝胶中。由亲本株WR中得到的DNA显示典型的限制模式（图2A），与以前描述的相同（Defilippes，1982，J.Virol.43∶136-149）.v-NY的限制模式是相似的，但与WR的模式有区别。最明显的差别是HindⅢB和C碎片的长度方面，这些碎片是牛痘病毒基因组的末端碎片。重组体v-env5和v-env5NY没有它们亲本株的HindⅢJ碎片;取而代之的是观察到两个新碎片，大小分别为5.4千碱基对和3.2千碱基对。这一发现是与将LAV/HTLVⅢ膜编码顺序插入位于HindⅢJ碎片的牛痘TK基因的双重组过程的结果一致。由于在LAV/HTLV顺序中存在一个HindⅢ部位，所以通过插入产生两个碎片。这一结果也证实了相对于牛痘病TK基因的LAV/HTLVⅢ插入的取位。

6、3、3牛痘LAV/HTLVⅢ膜重组体的Southern bolt分析

由Southern blot分析证实了在重组病毒基因组的限制消化过程中产生的两个新的HindⅢ碎片的同一性。如同图7A所示一样溶解在琼脂糖凝胶的DNA碎片被转移到消化纤维素过滤器中，然后杂交到为LAV/HTLVⅢ外壳顺序的断口转译探子上。如图7B所示，仅在5.4.和3.2千碱基对碎片中发现杂交作用。这一结果证实了图6所示的重组体病毒的基因组结构。

6、4被重组体牛痘病毒感染的组织培养物细胞中与LAV/HTLVⅢ膜有关的蛋白质的表达。

携带嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重组体牛痘病毒已证明能在组织培养物中的细胞感染表达与LAV/HTLVⅢ膜相关的蛋白质。此外，还发现这是些蛋白质可与爱滋病人的血清进行免疫反应。

6、4、1利用免疫斑块法鉴别被重组体牛痘病毒感染的细胞表达的与LAV/HTLVⅢ外壳有关的蛋白质

一只100毫米盘子盛有汇集的BSC-40细胞使其受到野生型牛痘病毒或其重组体衍生种v-env5或v-env2感染，感染复数为10。感染过程进行12小时。在12小时时则要收获细胞，然后用PBS清洗一次，再进行离心分离。接着再将感染的细胞小丸悬浮在1毫升Laemmli样品缓冲液中（Laemmli，V.K，1970，nature 227∶680），加热沸腾4小时以使其溶解。一整份75微升细胞溶解液中的全部细胞蛋白质，产生电泳法，使之分解在7-15%的梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。此外，用一个已被提纯过的LAV/HTLVⅢ病毒粒子样品和一份模拟的感染细胞溶解液作为对照组。凝胶的内含物质依靠电输送移入硝化纤维素过滤器上。然后先将过滤器在5毫升含有5%无脂奶粉（牛奶）的PBS溶液中培养30分钟，温度为室温，然后在由PBS、5%无脂奶粉和取自爱滋病人的血清（热的灭活血清1∶1000的稀释度）组成的，温度也为室温的溶液中继续培养2小时。接着过滤器用含有0.05%吐温20（聚氧化乙烯山犁醇甘油一月桂酸酯）的PBS溶液将过滤器清洗5次，之后再用单独的PBS溶液清洗一次。清洗后的过滤器在室温下用5毫升含有1%正常山羊血清（热的灭活血清），并加有1∶3000稀释度的山羊抗人体免疫球蛋白一辣根过氧化物酶共轭物的PBS溶液培养2小时。所述的过滤器再用含有0.05%吐温20的PBS溶液清洗5次，接着又用TBS（0，5MNaCl+20mM Tris-PHCl，PH7.5）清洗一次。结合在过滤器上的辣根过氧化物酶共轭物可用下述方法检测：使氯萘酚着色试剂与过滤器在暗处作用10分钟，温度为室温（氯萘酚着色试剂是在使用前将A、B二种溶液混合来制备的，其中溶液A的组成为：20毫升30%冷甲醇+60毫克4氯-1-萘酚;溶液B为：60微升30%冷过氧化氢+100毫升TBS）。粘在过滤器上的，与爱滋病人血清中抗体发生反应的蛋白质可通过结合在山羊抗人体免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭物上的着色试剂来检测。

这一分析结果示如图8A，图中表明牛痘病毒重组体v-env5产生了一个包含三种蛋白质的族，其中所述的蛋白质能够特异性地与爱滋病人的血清起免疫反应。而且这类蛋白质的电泳泳动度类似于被认为是由env基因编码的真正LAV/HTLVⅢ糖蛋白质gp150，gp110和gp41（Robey，W.G.et al.，1985，Science228∶593-595）。在模拟的感染细胞或野生型牛痘病毒感染的细胞中均未产生这些蛋白质。缺少5′近端顺序的重组体v-env2产生缩短了的蛋白质，但仍然可与爱滋病人血清起免疫反应，其中所提到5′近端顺序是为LAV/HTLVⅢ膜蛋白质的推测的起始蛋氨酸和最初的42个氨基酸起编码作用。据推测，重组体v-env2中的env程序的转译起始于从在该重组体结构中所用的联结子顺序转录的AUG密码子（参见下文）。

在第二个实验中，两个细胞系（BSC-40和Hela）用v-env5和v-env2感染。在感染细胞溶解产物中的LAV/HTLVⅢ特有蛋白质是按下述的western免疫污斑法测定。

汇集的单层BSC-40或Hela细胞用重组体v-env5或v-env2感染，感染复数（moi）为每个细胞50个斑块成形单位。感染后12小时，细胞用磷酸缓冲的盐水清洗二次，然后再悬浮在Laemmli样品缓冲液中，加热类沸5分钟。感染细胞中的蛋白质用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺（SDS-PAGE）电泳分解，依靠电输送移入硝化纤维素膜上，再使之与取自LAV/HTLVⅢ/血清阳性的个体的混合血清起反应。按照氯胺T法（按照制造商的说明书）用碘-125标记（Amersham，MA）的蛋白质A可用于检测能起免疫反应的蛋白质。在图8B中，通道1和5包含取自模拟感染细胞的蛋白质;通道2和6包含取自野生型牛痘病毒感染细胞的蛋白质;通道3和7包含来自V-env5感染细胞的蛋白质;通道4和8包含来自V-env2感染细胞的蛋白质。经苷糖梯度提纯的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白质用作对照组（LAV/HTLVⅢ）;膜蛋白质gp150，gp110和gp41的位置均如图所示。分子量标准用千道尔顿表示（KD）。

在v-env5感染的细胞中，可以检测到与取自血清阳性个体的混合血清起免疫反应的三种主要蛋白质（图8B中通道3和7）。经计算，这些蛋白质的分子量为150KD，120KD和41KD，与LAV/HTLVⅢ膜糖蛋白质gp150，gp110和gp41的分子量相似。

重组体病毒v-env2缺少LAV/HTLVⅢenv的公认的信号顺序，但至少能产生三种分子量分别为99KD，68KD和40KD的能起免疫反应的多肽（见图8中通道4和8）。

6、4、2利用免疫沉淀法鉴别被重组体牛痘病毒感染的细胞表达的与LAV/HTLVⅢ膜有关的蛋白质

以下所描述的免疫沉淀测定证明，被本发明的重组体牛痘病毒感染的细胞能合成可特异地与爱滋病病人的血清发生免疫反应的蛋白质。

一只100毫米盘子盛有汇集的BSC-40细胞，使其受到野生型牛痘病毒，或其重组体v-env5，或者v-env2感染，感染复数为10。在9.5小时后感染时，用无蛋氨酸的不补充血清DMEM更换生长培养基，感染后10小时，用2毫升含有100微克/毫升的[³⁵S]-蛋氨酸的无蛋氨酸DMEM替换上述培养基，并使这一放射性标记过程在37℃温度下进行2小时。在标记过程结束时，细胞用PBS清洗一次，然后用离心法收集。将细胞丸悬浮在1毫升具有下述成分的溶解缓冲液中：1%NP-40（聚氧乙烯（9）P-tart辛基酚），0.5%脱氧胆酸钠.0.1MaCl，0.01M Tris-HCl，PH7.4和1mMEDTA，再将细胞溶解产物用Eppendort微型离心机离心分离1分钟，使之澄清。

将取自对照人群或爱滋病人的5微升热灭活的人血清加到100微升的细胞溶解产物中，以进行免疫沉淀。在4℃下培养1小时后，加入60微升活化的金色葡萄糖球菌细胞（Pansorbin Cell Calbiochem-Behiring Corp.，La Jolla，（A），在4℃下继续培养1小时。然后用Eppendorf微型离心机离心分离30秒，以收集免疫沉淀复合物，温度为4℃，接着用含有1MNaCl，0.1%NP-40，0.01M Tris-HCl和PH为7.4的溶液清洗1次，再用RIPA缓冲液[10mM Tris-HCl，PH7.2，0.15MNaCl，1%脱氧胆酸钠，1%Triton×100（聚氧乙烯（9-10）P-tart辛基酚），0.1%十二烷基硫酸钠）。经过洗涤的免疫沉淀物再次被悬浮在50微升的Llaemmli样品缓冲液中，加热沸腾1分钟，然后用Eppendorb微型离心机进行1分钟的分离。留在上层清液中的免疫沉淀后的蛋白质在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。电泳后，用考马斯篮色染料对凝胶染色，接着用水扬酸钠处理（在室温下用1M水扬酸钠处理30分钟），干燥后进行荧光照相。

这一分析结果如图9所示，它表明重组体v-env5合成能特异地与爱滋病病人血清发生免疫反应的一族蛋白质。这些蛋白质的表观分子量为160，140，120，42和40千道尔顿（KD），大致与业已报道的LAV/HTLVⅢ的与外壳相关的糖蛋白质的表观分子量相符（Robey，W.G.et al.，1985，Science 228∶593-595）.这类蛋白质既不存在于模拟感染细胞或野生型牛痘病毒感染细胞中，也不会被对照人体血清免疫沉淀。在v-env2感染细胞中，产生了一种表观分子量为95KD的去掉末端的蛋白质，并为爱滋病病人血清所识别。这种去掉末端的LAV/HTLVⅢenv有关的蛋白质很可能起始于由联接子顺序编码的AUG密码子，所述联结子顺序位于该重组体内LAV/HTLVⅢ插入物的5′近端。

6、4、3牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体病毒产生的与LAV/HTLVⅢ外壳有关的氚-葡糖胺

下面描述的射免疫沉淀测定表明，本发明的牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体病毒可产生糖基化膜蛋白质。

Hela细胞或被摸拟感染（见图9B，通道1和5），或分别被野生型牛痘病毒（通道2和6），重组体v-env5（通道3和7）或v-env2（通道4和8）感染，感染复数均为50pfu/细胞。感染后4至16小时内，将氚-葡糖胺（浓度为23微居/毫克，共计0.25微居，Amersham）加到培养基中。细胞用磷酸盐缓冲的盐水洗涤2次，然看在含有0.1M NaCl，0.01M Tris-HCl，PH7.4，1mM EDTA，1%NP-40（聚氧乙烯（9）P-tart-辛基酚）和0.5%脱氧胆酸钠的缓冲液中溶解。取出几份细胞溶解产物，或将其与正常人体血清（通道1-4）或与来自LAV/HTLVⅢ血清阳性的个体（通道5-8）中的混合血清进行混合。然后免疫反应蛋白质用带有蛋白质A的固定金色葡萄糖球菌细胞沉淀，接着用SDS-PAGE溶解，并用荧光照相检测。

用葡萄糖胺放射性同位素标记结果如图9B的通道7所示，它表明用v-env5重组体制得的蛋白质就像LAV/HTLVⅢ外壳蛋白质一样，也发生了糖基化。糖基化模式的区别可用以解释由重组体得到的蛋白质与LAV/HTLVⅢ病毒粒子糖蛋白质之间电泳泳度的细微差异。

正如从缺少信号肽的蛋白质可以预计的那样，在V-env2感染细胞中未观察到具有氚-葡萄糖胺的N连接的糖基化（图9B，通道8）。

6、4、4牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体病毒产生的与LAV/HTLVⅢ膜有关的脉冲-追踪免疫沉淀

有人提出，LAV/HTLVⅢ的gp150是一种前体，从所述的这种前体可得到外部的蛋白质gp110和穿膜蛋白质gp41。以下描述的“脉冲-跟踪”免疫沉淀测定表明从牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体制造的分子量分别为150KD，120KD和41KD蛋白质具有一种与公认的LAV/HTLVⅢ的gp150，gp110和gp41所提出的相类似的前体-产物关系。

汇集的单层Hela细胞分别用野生型牛痘病毒（见图9C，通道1-6），重组体V-env5（通道7-12），或V-env2（通道13-18）感染，感染复数均为50Pfu细胞。在10.5小时感染后，对细胞用100微居/毫升的³⁵S-蛋氨酸（大于800居里/毫克分子，Amersham）标记15分钟。接着用2毫升预先温热的跟踪培养基（Dulbecco改进的伊格尔培养基+3毫克/毫升L-蛋氨酸+5%小牛血清+100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素）洗涤一次，再加1毫升相同的培养基，然后回到培养器中。在6、4、3段中，在不同的时间，对细胞进行洗涤和溶解，而细胞溶解产物的蛋白质用来自LAV/HTLVⅢ血清阳性个体的混合血清进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质再用SDS-PAGE溶解，并用荧光照相检测。每次跟踪持续时间如下：0小时（通道1，7，13）;0.5小时（通道2，8，14）;1小时（通道3，9，15）;2小时（通道4，10，16）;6小时（通道5，11，17）和12小时（通道6，12，18）。结果如图9C所示，通道7-12表示由重组体制得的分子量分别为150KD，120KD和41KD的蛋白质，其前体一产物关系与公认的LAV/HTLVⅢgp150，gp110和gp41的前体一产物关系一致。在Hela细胞中，150KD蛋白质的处理显得慢和效率低，因为脉冲-标记六小时，150KD蛋白质中不到50%的放射性被跟踪到120KD和41KD蛋白质。初步结果表明，这种处理在用同样重组体病毒感染的某些类型的人体外周血细胞中更有效。这些实验也表明，缺少公认的LAV/HTLVⅢenv的信号顺序的env-2中的env顺序可表达为一个未经改进的87KD前体（780氨基酸），后者被处理成为一个99KD中间体，并裂成68和40KD多肽（图9C，通道13-18）。

6、4、5被牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体病毒感染的细胞的生长培养基中与LAV/HTLVⅢ膜有关的蛋白质的存在

以下描述的放射免疫沉淀测定证明，本发明的由重组体牛痘病毒产生的有免疫反应的蛋白质能用一个类似于公认的LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白的模式来表达和处理。

汇集的单层Hela细胞或用模拟感染（见图9D，通道1），或分别用野生型牛痘病毒（通道2），重组体V-env5（通道3）或V-env2（通道4）感染，感染复数均为20Pfu/细胞。细胞感染后用浓度为100微居/毫升的³⁵S-蛋氨酸（大于800居里/毫克分子，Amersham）标记10至12小时。标记结束时接着除去培养基，在12，000×g下离心分离2分钟，进行澄清，然后用来自LAV/HTLVⅢ血清阳性的个体的混合血清进行免疫沉淀。用同样血清进行免疫沉淀的感染细胞的蛋白质显示在以“丸”（Pellet）标记的板上，而从培养基中得到的蛋白质则显示以在用“Supe”标记的板上。

正如对LAV/HTLVⅢ的gp110所预期的那样，由重组体制造的120KD蛋白质也在感染的细胞培养基中检出（图9D，通道3）。这些结果证明，重组体病毒V-env5能够表达LAV/HTLVⅢenv基因，并能产生有免疫反应的蛋白质，后者按一个类似于公认的LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白的膜式被进行处理。

也正如对缺少信号肽的蛋白质所预期的那样，在V-env2感染的细胞培养基中未检出与LAV/HTLVⅢ外壳有关的多肽（图9D，通道4）。

另一方面，受V-env7感染的细胞表达一种分子量为130KD的去掉末端的蛋白质。这种蛋白质缺少含有LAV/HTLVⅢ外壳蛋白质的锚顺序的C-末端217氨基酸。这种去掉末端的蛋白质（gp130）被分泌在生长培养基中，较之gp110或其前体gp150（图9E）有效得多。同时，gp130未被有效地处理成gp110，既使裂开部位仍存在于去掉末端的分子中。

6、5LAV/HTLVⅢenv牛痘重组体病毒的免疫效力。

携带嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重组体病毒已被证明能够诱发二种品系小鼠和一种低于人类的灵长类对付LAV/HTLVⅢ的抗体反应。

6.5.1在小鼠中牛痘LAV/HTLVⅢenv牛痘重组体的免疫效力。

对于由重组体牛痘病毒V-env5和V-env2表达的蛋白质的免疫原性进行鉴定。下述实验表明，这些重组体病毒诱发对LAV/HTLVⅢ所有主要糖蛋白的免疫应答的能力。

二种品系小鼠，其中一种是近交系（C57 B16J），另一种为远交系（ICR），都用重组体病毒V-env2或V-env5接种。所有动物在接种时都已5-7周龄。采用的是下列四种接种方式：爪垫接种，尾巴划痕接种，鼻内接种和腹膜内接种。其中爪垫接种是在每只老鼠后爪垫注入25微升（5×10⁶Pfu）重组体病毒;尾巴划痕接种则是用一根分叉针将尾巴底部的皮肤摩擦，然后在划破的表面注入10微升（2×10⁷Pfu）重组体病毒放在鼠鼻中，让老鼠吸入接种物。至于腹膜内注射，是将10微升（2×10⁷Pfu）重组体病毒注入小鼠的腹膜腔中。所有病毒原材料和稀释剂均按6.1.方法制备。接种后每隔两周采集两只小鼠的血清样品，并用下面描述的与酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）和西方污斑分析法进行分析测定。

6.5.1.1由酶联免疫吸附剂证明的用牛痘-LAV/HTLVⅢenv重组体免疫的小鼠之血清转化。

6周血清样品的酶联免疫吸附剂测定数据归纳成表1。C57B16J小鼠的重组体V-env2和V-env5血清转化率分别为100%和95%。而对于ICR小鼠而言，其中V-env2血清转化率为44%;而V-env5则为100%。在通过尾部划痕方法免疫的小鼠中可以得到完全血清转化率以及酶联免疫吸附剂效价的平均值最高。

表1 用携带嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重组体病毒接种的小鼠血清转化率＊

接种后小鼠血清转化率

重组病毒接种方式 ICR C57B16J

V-env2 爪垫接种 3/3 4/5

尾巴划痕接种 3/3 4/5

鼻内接种 0/3 4/5

腹膜内接种未做 3/5

V-env5 爪垫接种 4/4 5/5

尾巴划痕接种 3/3 5/5

鼻内接种 3/3 4/5

腹膜内接种未做 5/5

＊血清转化按下文中所描述的酶联免疫吸附剂法测定，以各组血清转化的老鼠数与组内接种小鼠总数之比表示。

ELISA数据用下述方法得到：业已提纯和灭活的LAV/HTLVⅢ病毒粒子用碳酸盐缓冲剂（50nm碳酸钠，PH9.6）稀释，然后加到96-井微滴板（100微升/井，每个井含有0.2微克灭活的LAV/HTLVⅢ）。在4℃温度下放置过液，以使结合过程得以进行。将未结合的蛋白质抽出，每个井先用含有5%无脂奶粉的200微升PBS溶液洗涤，然后再用300微升的4%蔗糖溶液洗涤。将过量的蔗糖溶液抽出，使培养板在室温下干燥（1小时）。然后再将50微升含有2.5微升小鼠血清样品的PBS溶液加到每个井中，使之在37℃下反应1小时。在培养结束时，用含有0.05%吐温-20（聚氧乙烯山犁醇甘油-月硅酸酯）的PBS溶液洗井5次。再将50微升的山羊的抗鼠辣根一过氧化物酶共轭物（PBS+0.05%吐温-20的溶液进行1∶5000的稀释）加到每个井中，使之在37℃下反应45分钟。在用含有0.05%吐温-20的PBS溶液洗5次后，加入100微升柠檬酸-O-苯二胺一过氧化物底物。底物如下过程制备：将0.294克钠的二水合物和0.537克磷酸氢钠晶体（Sodium Phosphat Dibasi Crystal）溶于10毫升水中，用盐酸将PH值调节至5.0;在使用前当即加入2微升30%过氧化氢和4毫克O-苯二胺。培养板在室温下放在暗处培养30分钟。然后在每个井中加入100微升浓度为1.3当量的硫酸，使反应停止，并在490毫微米处测定反应混合物的吸光度。

表1的结果以血清阳性的老鼠数与受接种的老鼠总数之比。接种后6周收集血清样品，用ELISA对其进行分析。5只接种小鼠的血清样品用作对照组。对照组的平均ELISA效价对于ICR和C57B16J小老鼠而言分别为0.021±0.05和0.017±0.010取自受免疫接种的小鼠的血清样品的ELISA效价较之对照组高三个以上标准离差，这些血清样品被评价为阳性。

6.5.1.2经血清转化的小鼠产生对付公认的LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白的抗体是通过免疫污斑测定证明的。

为了证明用重组体病毒接种的小鼠是否产生对付公认的LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白的抗体，取自免疫接种小鼠的血清样品是按下述西方免疫污斑法测定的：5至7周龄近交系的雄性小鼠（C57B16J，Jackson实验室）是通过尾部划痕进行免疫接种，即在尾巴底部被分叉针划破处施入10微升内含2×10⁷Pfu重组体牛痘病毒的接种物。在接种后8周，在动物后眼眶窦道放血，并将血浆保持冷冻状态，直至使用为止。取出几份血清样品，加入0.2%NP-40和30%无脂奶粉，用磷酸盐缓冲盐水稀释50倍，然后使之与LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白质反应，后者已被SDS-PAGE溶解，并通过电转移法固定在硝化纤维素滤纸上。被这些血清识别的LAV/HTLVⅢ蛋白质是用与碱性磷酸酶共轭的山羊的抗小鼠免疫球蛋白来检测。

在尾部划痕处用重组体病毒接种的C57B16J组的小鼠身上所取的8周血清样品的结果示于图10。所有用重组体病毒接种的动物均产生能与LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白gp41发生反应的抗体。某些用V-env5（图10，通道a）免疫接种的动物，其血清也能识别gp150和gp110，这就表明，所述的重组体病毒能够诱发对付LAV/HTLVⅢ所有主要糖蛋白的免疫应答。

6.5.2在低于人的灵长类中牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体V-env5的免疫原性。

在两种低于人的灵长类物种弥猴（Macacafascicularies）和黑猩猩中，对牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体V-env5的免疫原性进行了研究：以下各小节所描述的结果证明，V-env5能够在所述的二个物种诱发体液参与和细胞参与的免疫性。

6.5.2.1用V-env5免疫接种的弥猴的体液应答

9只长尾巴猕猴，包括幼猕猴至成年猕猴，用于研究牛痘-LAV/HTLVⅢ重组体V-env5的免疫原性。事先对所所有动物都作了普查，以确证其体内没有对付牛痘病毒和LAV/HTLVⅢ的抗体，也不存在猴的T-亲淋巴性病毒或猴的爱滋病病毒，以及对付这些病毒的抗体。四只猴子用2×10⁸pfu的V-env5接种，另外四只则接种2×⁷10pfu的相同病毒。此外，还有一只动物接种2×10⁷pfu剂量的对照重组体牛痘病毒（牛痘-疱疹单纯性gDI）重组体V-HSgDI）。所有动物均用皮膏划痕接种。接种前，以及接种后的第4、第6和第8周采集血清和肝素化了的血样品。在首次接种后经过十周，再对所有动物进行第二次接种，所用的病毒与上次相同，剂量为2×10pfu。在整个实验过程中，所有动物都显现出典型疫苗感染的自愈合皮肤损伤和正常的生理指征。采用ELISA和西方污斑测定法分析体液应答。

为了作ELISA分析，血清试样要用含有3%无脂奶粉和0.2%NP40（聚氧乙烯（9）P-tert-辛基酚）的PBS溶液稀释50倍，然后使之与已固定在微滴井中的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白质发生反应。除所用的第二种抗体是与辣根过氧物酶共轭合的山羊抗人体抗体外，此处的ELISA操作步骤与66.5.1.1节中所描述的相同。

图11所示的结果证明第二次免疫接种后所有动物都被血清转化，尽量在第一次接种后只有两只动物已血清转化。

为确证受过免疫接种的动物产生什么抗体，第二次免疫接种后4周所采集的血清试样用西方污斑法进行分析。对于二种外壳糖蛋白gp41和gp110的最佳检测采用二种方案。为了最佳检测gp41，血清用加有30%未施行巴斯德氏消毒的牛奶和0.2%NP-40的PBS溶液稀释50倍，然后在室温下与固定在硝化纤维素滤纸上的已被提纯的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白质反应1小时。接着滤纸用加有0.2%NP-40的PBS溶液洗涤，再用加有0.2%NP-40的PBS缓冲稀释2000倍，并使之和与碱性磷酸酶其轭的山羊抗人体免疫球蛋白抗体（Zymed，CA）进行反应。而为了检测gp110，血清用加有3%未施行巴斯德氏消毒的牛奶的PBS溶液稀释50倍，然后在室温下与固定在硝化纤维滤纸上的已被提纯的LAV/HTLVⅢ病毒粒子蛋白质反应1小时。接着滤纸用加有0.01%吐温-20的PBS溶液洗涤，再用PBS缓冲液稀释2000倍，并使之和与碱性磷酸酶其轭的山羊抗人体免疫蛋白抗体（Zymed，CA）反应。以上任一方法中，第二次抗体反应后的最终洗涤均使用含有0.1克分子浓度Tris（PH9.5），0.1克分子浓度氯化钠和5毫克分子浓度氯化镁溶液。与滤纸上抗原上结合的抗体是按下述方法检测：使滤纸与含有0.1克分子浓度Tris（PH9.5），0.1克分子浓度氯化钠，5毫克分子浓度氯化镁，0.33毫克/毫升溴-氯-吲哚荃磷酸盐和0.17毫克/毫升硝基蓝四唑鎓溶液发生反应。在滤纸与上述色原反应完毕，接着用水清洗，再经空气中干燥后进行照相。

如图12B所示，所有受到二次接种的动物对gp41都显现出强烈的抗体反应。另外，其中四个动物还产生与gp110进行强烈反应的抗体。总之，图12A所示的结果证明了重组体V-env5能够诱发猕猴产生LAV/HTLVⅢ外壳特有的抗体。

6.5.2.2在用V-env5免疫接种的猕猴的细胞传参与的免疫应答

采用Ficoll-hypaque离心分离法，从第二次真皮内免疫接种后4周所得到的猕猴肝素化的血中分离外周血淋巴细胞（PBL），其中第二次接种所用的接种物或是V-env5，或者是对照的牛痘重组体病毒表达的单纯性疱症病毒糖蛋白D（V-HSVgdl）。从仅用V-env5接种一次的猕猴81以及从未受免疫接种的猕猴血中也分离出外周血淋巴细胞。这些外周血淋巴细胞悬浮在补充有10%热的灭活正常人体血清的RPMI1640培养基中（GIBCO，Grand岛，纽约），然后在最后体积为0.1毫升的培养基中取出1×10⁵外周血淋巴细胞，将其放入96井圆底培养板的井内。每个井内加入0.1毫升含有紫外（UV）光灭活的V-env5（在紫外光灭活前为1×10pfu/毫升），或未受破坏的LAV/HTLVⅢ（1毫克/毫升，约为1×10⁵TCID₅₀）的培养基，其中LAV/HTLVⅢ是采用两次蔗糖梯度离心，从LAV/HTLVⅢ感染的CEM细胞的上层清液提纯得到，而所述的CEM细胞是属于HLA DR阴性T细胞白血病系。刺激后六天，每只井PBL用1微居的氚-TdR（氚-胸苷，New England Nuclear，Boston，MA）标记6小时，然后取出细胞，测定氚-TdR的Cpm（居里/分C），由此可得到4只相同的实验井的平均值。将结合进被刺激细胞的cpm，氚-TdR除以结合进未受刺激细胞的cpm，即可计算出刺激指数。

表2

用牛痘重组体病毒表达的LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白对猕猴进行免疫接种后所得的PBL的LAV/HTLVⅢ诱发的增生反应

用于对PBL刺激的病毒

猕猴免疫未用病毒 LAV/HTLVⅢ V-env5

编号接种 cpm^＊cpm^＊SI^＊cpm^＊SI^＊

67 V-env5 1.586 7.465 4.7 60.415 38.1

68 V-env5 2.245 9.075 4.0 28.638 12.8

74 V-env5 1.585 4.732 3.0 21.487 13.6

75 V-env5 581 8.645 14.9 37.847 14.1

76 V-env5 2.479 5.987 2.5 36.657 14.8

80 V-env5 1.077 13.922 12.9 24.752 23.0

81 V-env5 965 3.985 4.1 40.572 42.0

82 V-env5 2.581 8.580 3.3 46.847 18.1

73 V-HS

VgD1 612 553 1.0- 56.217 91.9

26 无 2.911 1.822 1.0- 2.240 1.0-

27 无 1.228 1.072 1.0- 2.532 2.0

＊结合进的cpm³H-TdR

＊＊刺激指数

如表2所示，所有受过免疫接种的猕猴，包括仅接受一次V-env5接种81号猕猴，都产生一些淋巴细胞，它们的体外对LAV/HTLVⅢ刺激有专门反应而增殖。与此相反，接受过牛痘一单纯性疱诊病毒重组体V-HSVgDI的73号猕猴，其淋巴细胞仅对牛痘病毒刺激有反应而对LAV/HTLVⅢ刺激无反应。作为对照的未受免疫接种的猕猴不产生能对上述任一抗原作反应的淋巴细胞。而且，用V-env5进行免疫接种的猕猴，其淋巴细胞的反应在大小上与用V-HSVgDI接种的73号猕猴相同。这些结果表明，通过在猕猴中的重组体病毒表达LAV/HTLVⅢenv基因不会抑制在体外或体内T细胞参与的免疫反应。

为确定受过免疫接种的猕猴哪一部分淋巴细胞可受到LAV/HTLVⅢ刺激，特用二个显色免疫荧光检查受刺激的PBL以了解的存在于活化的T细胞或B细胞的IL-2受体的表现。CD4和CD8抗原是存在于T细胞之中，而CD20（Bp35）抗原是存在于B细胞之中。表3所示结果证明，几乎所有表达为IL-2受体的被病毒刺激的PBL也表达CD4或CD8抗原，而有1.5%至2%共同表达CD20（Bp35）抗原。这一结果表明受刺激的淋巴细胞是T细胞。

表3

从用LAV/HTLVⅢ或重组体牛痘病毒表达的LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白刺激接种的猕猴所得到的PBL上的IL-2受体和CD4，CD8或CD20（Bp35）抗原的表达

IL-2R+细 %IL-2R+细胞

猕猴刺激PBL 胞的总的共同表达

编号的病毒 % CD4 CD9 CD20（Bp35）

74 V-env5 27.7 48.6 52.2 2.0

80 V-env 25.6 62.4 40.0 NT

74 LAV/HTLVⅢ 14.7 50.0 59.0 1.9

80 LAV/HTLVⅢ 12.0 58.0 38.0 1.5

80 无病毒 0.3 0.3- 0.3- 0.3-

表3中结果是由以下方式得到：PBL同时用对白细胞间素-2受体（IL-2R）的藻红蛋白共轭的单克隆抗体2A3（Becton-Dickinson，Inc.，Mountain View，CA）进行染色，和CD20的与荧光素共轭的单克隆抗体1F5（Gene tic Systems Corp Seattie，WA）进行染色，和用对CD8的G10-1（Gene tic Systems Corp Seattle，WA）进行染色，或者用对CD4的T4a（Ortho Diagnostics，Baritan，N.J.）进行染色。所用的抗体饱和浓度，是通过对用带有改进的FACSⅢ分拣器的流动显微荧光计分析的淋巴细胞进行滴定所确定（Becton-Dickinson，Mountain View，CA）。二色定量分析按以前描述的方法进行（Ledbetter，J.A.，et al.，1984，Perspectives in Immunogenetics and Histcompatibility，6，119-129）。对前方位角和直角的散射门调整到包括淋巴母细胞和大量小淋巴细胞。所显示的数值是IL-2R+细胞总的百分数，以及IL-2R+细胞表达CD4，CD8或CD20（Bp35）的百分数。

已经证实T细胞受到抗原刺激后，产生了包括IL-2的淋巴激活素，而IL-2能促进T细胞和B细胞分化和/或增生，并能活化天然的杀伤细胞，杀伤细胞能溶解受包括爱滋病毒在内的各种病毒感染的细胞。因此我们要了解接受接种猕猴的T细胞在用LAV/HTLVⅢ刺激后是否产生IL-2？

为此进行了二个实验。在实验1中，从第二次用V-env5或由WR牛痘病毒株构成的V-HSVgDI进行真皮内接种4周的猕猴的肝素化血内分离出PBL。而在实验2中，从第一次用2×10⁵pfu的V-env5，V-HSVgDI或V-env5重组体病毒进行真皮内接种4周后的猕猴肝素化血内分离出PBL，其中所述的重组体病毒是由纽约卫生局的疫苗病毒株（V-env5NY）构成。使PBL悬浮在添加10%热灭活的正常人体血清的1640培养基中，再将2×10⁵PBL放入96井圆底培养皿的井中。然后在井内加入紫外光灭活的V-env5（在紫外光灭活前为1×10⁶pfu/毫升或被提纯过的LAV/HTLVⅢ（1微克/毫升）。刺激后二天，从同样的井中得到上层清液，并验证它们支持IL-2相关CTI-2细胞（由S.Gillis博士提供，Immunex Corp.，Seattle，WA）的增生能力，所以测定前要洗涤24小时，以除去IL-2。在用上层清液培养的最后6小时期间，让细胞用³H-TdR标记），然后测定结合进细胞的³H-TdR的量。通过试验人体IL-2重组体（由Gillis博士提供）对CTLL-2细胞增殖的影响所得的标准曲线，可计算出上层清液中存在的IL-2活性单位。表Ⅲ列出实验结果。

表4

用LAV/HTLVⅢ或重组体牛痘病毒表达的受接种猕猴血中PBL用LAV/HTLVⅢ爱滋病病毒外壳糖蛋白刺激后的接种或用表现为AIDS病毒外壳糖蛋白的重组体猕猴的PBL所产生的IL-2

实验1：上层清液中的IL-2（单位/毫升）

猕猴免疫刺激PBL的病毒

编号接种无病毒 LAV/HTLVⅢ V-env5

67 V-env5 0 28.0 96.5

68 V-env5 0 16.0 124.0

74 V-env5 0 9.0 52.0

73 V-HSVgDI 0 0 188.0

26 无 0 0 0

实验2：

03 V-env5 0 14.4 55.8

05 V-env5NY 0 16.8 33.3

49 V-env5NY 0 7.1 26.7

52 V-env5NY 0 2.4 27.6

59 V-HSVgDI 0 0 27.6

26 无 0 0 0

27 无 0 0 0

表4中的实验1的结果表明，受V-env5免疫接种两次的猕猴血中得到的PBL，又经V-env5或LAV/HTLVⅢ刺激后，其上层清液含有IL-2，这是为它们能够诱发CTLL-2增生所证实，后者是一种IL-2相关的细胞系。同样，如表Ⅲ的实验2所示，受V-env5免疫接种一次的编号为03猕猴，以及用同样重组体（V-env5NY，见6.3节）的“牛痘苗”菌株进行一次免疫接种的所有三只猕猴，所取出的经LAV/HTLVⅢ或V-env5刺激的PBL，在其上层清液中检测出IL-2。与此相比，从受牛痘-HSVg D-1重组体病毒免疫接种的编号为73和59的猕猴所取的PBL仅在用V-env5刺激后才产生IL-2，而用LAV/HTLVⅢ刺激后并未产生IL-2。此外，编号为26和27的未受免疫接种的猕猴，经LAV/HTLVⅢ或重组体牛痘病毒刺激后均不产生可检出量的IL-2。由于首先是带有辅助/诱导活性的T细胞在受到抗原刺激后才产生IL-2，则这些结果证明，受重组体病毒免疫接种的猕猴中确实存在辅助T细胞，后者能识别LAV/HTLVⅢ。除了这些产生IL-2的T细胞在B细胞分化产生对付LAV/HTLVⅢ外壳抗原的抗体的一可能作用外，在效应细胞（如能杀死感染细胞的病毒对细胞有毒性的T淋巴细胞或天然杀伤细胞）的分化和/或扩张过程中可能涉及到这些产生IL-2的T细胞。

6.5.2.3受V-ENV5NY免疫接种的黑猩猩的体液应答

二只幼小的黑猩猩接受属于V-env5疫苗株的V-env5NY的真皮内接种，接种物剂量为5×10⁸pfu。一只动物接受同样效价的牛痘单纯性疱症病毒gD重组体，即V-HSVgDINY的真皮接种，后者由相同亲本牛痘菌株（V-NY）如V-env5NY构成。第一次免疫接种后8周，所有动物均接受第二次接种，剂量同前。免疫接种后每隔两周采集一次血清样品，并用ELISA和西方污斑法测定LAV/HTLVⅢ特有的抗体，在整个实验过程中，所有动物都显现出牛痘病毒感染典型的自愈合皮肤损伤，以及具有正常的生理指征。

对黑猩猩血清用的ELISA方法是与猕猴血清所用的相同。表Ⅴ所示的结果表明，两只实验动物（124和149）自第一次免疫接种后8周，已发生血清转化，经接受第二次免疫接种后其抗体水平继续升高。对照动物（134）保持血清阴性。

表5

接受重组体牛痘病毒免疫接种的黑猩猩的血清样品的ELISA分析结果LAV/HTLVⅢ-特有血清抗体的ELISA读数

取样 134号黑猩猩 124号黑猩猩 149号黑猩猩

时间 V-HSVgDINY V-env5NY V-env5NY

预先抽血 0.084±0.015 0.100+0.005 0.123+0.025

第一次接

种后8周 0.085±0.010 0.185±0.020 0.403±0.027

第二次接

种后2周 0.075±0.012 0.237±0.017 0.523±0.073

为验证在受过免疫接种动物中检出的LAV/HTLVⅢ特异的抗体是对准外壳糖蛋白的，特用西方污斑对同样的血清作了分析。所用的方法最适于gp41抗体，而且与猕猴血清分析所用的相同。图13所示的结果证明，这二只接种过的动物所产生的LAV/HTLVⅢ特异的抗体确实是对准膜糖蛋白，而且这些抗体水平在第二次免疫接种后升高。

6.5.2.4接受V-env5NY免疫接种的黑猩猩的细胞参与的免疫应答

以6.5.2.3节所描述的同样动物血中分离出的外周血淋巴细胞（PBL）被用于验证这些动物的细胞参与的免疫应答。自第一次用重组牛痘病毒进行真皮内接种后4周，通过Eicoll-hypaque离心分离，从肝素化血中分离出PBL。然后将PBL接种在96井培养皿内的加有10%热灭活的正常人体血清和青霉素/链霉素的RPMI140培养基内，其中每只井含有1×10细胞。接着在井中加入未受破坏的LAV/HTLVⅢ（5微克/毫升）或LAV/HTLVⅢ外壳糖蛋白（1微克/毫升），后者是用晶状体植物凝血素层析法从已提纯的LAV/HTLVⅢ分离的。六天后，用液体闪烁计数法测定结合在细胞中的氚-胸苷。

如表4所示，受V-env5NY免疫接种的二只动物（124和149）的淋巴细胞随LAV/HTLVⅢ病毒粒子或提纯的膜蛋白（env）刺激作用而增生。与之相比，接受牛痘-单线性疱疹病毒重组体V-HSgDINY接种的134号动物不产生能识别LAV/HTLVⅢ的淋巴细胞。

表6

用牛痘组体接种的黑猩猩的细胞参与的免疫应答

接合进PBL的氚-胸苷

黑猩猩刺激的病毒

编号免疫接种无抗原 LAV/HTLVⅢ env

124 V-env5NY 2482 37，132 26，370

149 V-env5NY 375 20，292 27，115

134 V-env5NY 367 1，987 367

64 无 452 567 222

72 无 737 2，417 905

所有黑猩猩的PBL经受植物血凝素（PHA，2微克/毫升）或X-射线辐照后的人体混合异种的PBL刺激后，均显视出高水平的氚-胸苷结合，其数值分别为38，870至109，790cpm和42，172至12，067cpm。接受V-env5或V-HSVgDINY免疫接种的黑猩猩，其PBL显视出对牛痘病毒有强烈的增生反应;而未受免疫接种的黑猩猩的PBL不随牛痘病毒的刺激而增生。总之，表Ⅰ-Ⅵ和图11-13所示的结果表明，（a）重组体牛痘病毒V-env5及其在疫苗菌株中的对应物V-env5NY能够在猕猴和黑猩猩这两种次于人的灵长类动物中诱发LAV/HTLVⅢ特异的体液和细胞参与的免疫应答;（b）重组体病毒不会抑制体外或体内T细胞参与的免疫应答。

6.6由牛痘病毒的V-NY株构成的重组体的神经毒性减低

将若干份25至50微升含有5×10pfu病毒注入5只老鼠大脑内，接种后10天计算其死亡率。

表3的结果表明，由斑块提纯的组织培养物得到的疫苗病毒（V-NY菌株）及其衍生种V-env5NY和V-env2NY和V-env7NY与WR菌株及其衍生种相比，它们的神经毒性降低。由于纽约市卫生局的菌株被用作天花疫苗，因此建立在这种菌株基础上得到的重组体更适于研制人体用的疫苗。

表7

大脑内接种牛痘重组体的小鼠死亡率

接种死亡鼠数/接受注射鼠数

V-NY 0/5

V-env5NY 0/5

V-env2NY 0/5

V-env7NY 0/5

天花疫苗（Wyeth） 3/5

V-env5 5/5

V-env2 5/5

V-env7 5/5

盐水 0/5

7.实施例：杆状病毒gag重组体

在以下各实施例中，将各种质粒载体制成含有嵌合基因的这些嵌合基因包括位于Ac NPV转录控制顺序下方的LAV/HTLVⅢgag编码顺序。

这些包含Ac NPV多角体启动区和LAV/HTLVⅢgag编码顺序的嵌合基因通过体内重组被插入AcNPV基因组中。对这类重组体病毒进行鉴别和提纯，并从感染组织培养细胞中制备病毒原材料。起免疫反应的、与LAV/HTLVⅢgag相关的蛋白质已被证明系由重组体Ac NPV在体外产生。受重组体病毒的细胞被证明能显示出正免疫荧光。最后，从用重组体Ac NPV感染的细胞溶解产物，若用爱滋病人的血清处理时，则在ELISA测定中呈阳性。本发明的该实施例的每一步骤的详细说明见下述各小节。

7.1一般方法

7.1.1细胞和病毒

Spodotera frugiperda细胞，无性繁殖系sf9是从美国典型培养物收集品（ATCC No.CRL1711）中得到，并使之在Grace′s Antheraea培养基（Gibco，KC Biologicals）中繁殖，培养基含有3.3克/升的yeastolate（Difco）和3.3克/升的乳清蛋白水解产物（Difco），10%牛胚胎血清，以及0.06克/升青霉素和0.1克/升链霉素（TNM-FH培养基）。细胞在28℃温度中生长。Autographa califonica核多角体病毒系从Lois Miller博士处得到（Department of Genetics and Entomology，University of Georgia，Athens，GA30602），并在含有1%琼脂糖和0.8×TNM-FH的sf9细胞上进行斑块提纯。病毒原材料用TNM-FH进行稀释。

7.1.2DNA制备、限制和改进

限制酶是从Bethesda研究实验室购得，限制消化的条件是按制造商建议。将大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow碎片以浓度为200单位/毫升放入含有50mM Tris-HCl（PH7.5）6mM MgCl₂和10mM2-巯基乙醇的溶液之中，温度37℃，时间30分钟。

用于转染的病毒DNA是利用下述Miller，L.K.，Miller D.W和Safer，P.的方法，从野生型病毒的非闭合病毒（NOV）原材料中制得。通过垫料液含有25%蔗糖、5mM NaCl和10mMEDTA，在90，000xg温度5℃离心分离1小时将上层清液的NOV粒子制成小丸。将上层清液移去，再使病毒悬浮在0.5毫升溶解缓冲液中（10mM Tris，PH7.6，10mM EDTA，0.25%SDS）。在病毒粒子再度悬浮后，加入蛋白酶K，使最终浓度为500微克/毫升，并培养过夜（大约16小时），温度为37℃，且不时搅拌。然后用相同体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）组成的溶液萃取DNA。然后DNA通过加入1/10体积的PH为5的3M醋酸钠和2个体积的冷乙醇在-20℃下沉淀出来。在成粒后，DNA用70%乙醇洗涤，干燥，而在用于转染或限制酶分析之前悬浮在TE（10mM Tris，1mM EDTA，PH7.5）之中。质粒DNA是用下述Summers，M.D和Smith，G.E的最佳制备方法来制备的：一毫升加有适当抗菌素的Luria液体培养基（LB）是取自刚制备的培养皿中的菌落细菌细胞接种。在37℃下培养12至18小时后再将1毫升培养物转移到盛有200毫升加有抗菌素的LB的5000-1000毫升烧瓶中，接着将其放入摇动恒温器内（37℃）过夜（12-18小时）。将200毫升培养物移入离心机瓶内以2500转/分进行离心分离10分钟。移出上层清液后，让每个细胞小丸在室温下重新悬浮在30°毫升STET缓冲液（8%蔗糖、0.5Triton X-100，50mM EDTA（PH8.0）10mMTris-Cl，PH8.0），并再移入125毫升烧瓶中。每只瓶内加入3毫升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶（在STET缓冲液中新鲜制备），并旋动瓶子使之混合，在室温下培养5分钟。接下来将每只瓶子直接放在火焰上轻轻旋动，直至细胞开始凝固并转成白色。一俟气泡形成，就将烧瓶移入沸水浴中，放置45秒钟，然后再将此瓶放入冰水浴中冷却2分钟或更长些。此后将上述粘滞的混合物慢慢倒入50毫升圆底离心瓶中，在一只用SW28转子（Beckman，CA）的制备离心机中离心分离15分钟，转速为16000转/分。各管内上层清液仔细倾入50毫升活动的聚丙烯离心管中，管内还加入1个体积的异丙醇或2个体积乙醇，DNA在-80℃沉淀20分钟（或-20℃下沉淀2小时或更长些），然后在2500×9条件下离心15分钟或更长些。移去乙醇后，在小丸中加入2.5毫升萃取缓冲液（每升缓冲液中含有12.1克Tris，33.6克Na₂EDTA2 H₂O和14.9克KCl，PH为7.5），并将其旋转，以松动瓶底细胞溶解产物。接着加入10微升浓度为10毫克/毫升，R Nase A（溶解在0.1×TE中，沸腾10分钟以进行预处理），在37℃下培养30分钟。再在各管内加入约为200微克的蛋白酶K，并在45℃-50℃下培养30分钟，在这时加入250微升10%Sarkosyl，继续培养3小时或更长时间。为了制备氯化铯梯度，各管内加入浓度为10毫克/毫升的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，以每毫升DNA溶液计的用量为80微升。然后再在每只管内加入1.04克氯化铯/毫升DNA溶液，随即轻轻旋动使其溶解。在转子中进行离心分离后，即在70.1Ti固定角转子中进行离心分离以达到平衡，转速为55，000转/分，时间16小时，由此产生二个截然分开的可见的DNA带，其中上部的带包括直线的切口DNA。而下部带内含有共价键封闭的环状DNA。取出下部的带（以共价键封闭的环状DNA），放入15毫升聚乙烯离心管中，再加水使各管体积达到6毫升。用等体积异戊醇从DNA中萃取出溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，上部粉红色液相取出并倒掉。萃取过程需重复进行;直至上部液相成为无色，而底部（DNA）液相为清澈无色。此时，各管内应当留有5毫升DNA溶液（若不到此毫升数，则应加水至5毫升），然后加入2个体积无水乙醇。将其在-20℃下放置过夜，或在-80℃放置10分钟，使DNA沉淀析出。接着在2，500×g下成粒20分钟。除去所有乙醇后，再向每个小丸加入50微升0.1×TE，并使之在65℃下再次悬浮10分钟或更长时间。DNA能在4℃下保存。

质粒DNA也按Maniatis等所描述的方法制备：[（Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory（PP.8696）]。DNA连接酶是从New England Biolabs购进，使用时加入50mM Tris-HCl（PH7.8），10mM Mg Cl₂，20mM DTT，1mM ATP，使DNA浓度为10，000单位/毫升。在琼脂凝胶中的DNA分析是按下述ManiatiS等所提供的方法进行（1982，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory）。

7.2含有联结到LAV/HTLVⅢgag基因（PAC-gag1）的编码顺序的Ac NPV启动区的质粒载体结构

下述各小节描述含有LAV/HTLVⅢgag基因编码顺序的质粒载体的结构，其中所述的基因位于Ac NPV转录控制程序之后，但位于多角体DNA之前。这些重组体质粒载体以后用于将LAV/HTLVⅢgag编码顺序通过体内重组插入杆状病毒的基因组。

在以下各小节中，LAV/HTLVⅢgag编码顺序（图14）是从PKS-5中进行提纯，后者是λJ19的亚无性繁殖系（Wain-Hobson，S.，et.al，1985，Cell 40∶9），并被插入pAC610中所包含的杆状病毒的多角体启动区下方的质粒Ac610之中，以构成PAC-gagⅠ（图15）。在这一结构中，LAV/HTLVⅢ特异的核苷酸顺序位于多角体基因顺序前面的多角体启动区形成一个嵌合基因之前。

如前所述，PKS-5是由λJ19中所包含的LAV/HTLVⅢDNA插入物的一个3，148碱基对SstⅠ至KpnⅠ的碎片组成的、其中λJ19克隆进PUC18的SstⅠ和KpnⅠ部位。它是通过将J19的SstⅠ限制碎片克隆进PUC18的SstⅠ部位，以创造PBT-1，后者用KpnⅠ消化后再进行联接。这种DNA用于转化大肠杆菌，并分离出质粒PKS-5。PKS-5所包含的LAV/HTLVⅢ特异的DNA位于LAV/HTLVⅢ基因组中从位于核苷酸224的SstⅠ部位至位于核苷酸3372的KpnⅠ部位（Wain-Hobson，S.et al.，1985，Cell 40∶9;也可看图14）。

10微克PKS-5用Hincll和SstⅠ消化完全，产生的碎片再溶解在1%低熔融温度琼脂糖凝胶中。将1818碱基对碎片（约为0.20微克）从凝胶中除去。该碎片包含图14所示的从核苷酸编号224至2042的LAV/HTLVⅢ特有的顺序。它包括整个gag基因编码区。

5微克PAc610用SmaⅠ和SstⅠ消化至完全，然后在1%低熔融琼脂糖凝胶上分级;DNA带（约0.4微克）从凝胶中除去（图15）。

两块凝胶片在65℃下熔化10分钟，而3微升的1818碱基对LAV/HTLVⅢ特有碎片（用Hincll SstⅠ消化）联结到1微升的PAc610（用SmaⅠ和SstⅠ消化）中，总体积40微升。然后在23℃（室温下）培养16小时，然后这种联结的混合物在65℃下加热10分钟，用于转化大肠杆菌株HB101。对于从对氨基苄青霉素有耐药性转化实变型取出的质粒DNA进行试验，从确定是否存在LAV/HTLVⅢ插入体。这一质粒PAc-gag的结构示于图15。

7.3含有嵌合的LAV/HTLVⅢgag基因（Ac-gag1）的重组体杆状病毒的结构

Ac NPV是用斑块法提纯，在Sf9细胞上繁殖。按前面描述的方法将野生型Ac NPVDNA进行分离以及PAc-gag1提纯（见7.1.2节）。

由于PAc-gag1的gag顺序侧向是与ACNPV编码顺序相接，因此使得要通过体内重组来实现将嵌合的LAV/HTLVⅢgag基因插入Ac NPV基因组成为可能。PAc-gag1质粒DNA与野生型Ac NPVDNA共同转染可以使该质粒的多角体顺序和Ac NPV基因组的同种顺序之间发生重组。嵌合基因的插入是由于侧翼顺序重组的结果。这类重组体将具有插入Ac NPV多角体基因的嵌合基因，因此不能产生闭合体（occlusionbodg）。通过目视检查缺少闭合体病毒可以选出重组体斑块。

将1微克1Ac NPVDNA，5微克PAc-gag1和15微克小牛胸腺DNA进行混合和用乙醇沉淀。所得沉淀物用70%乙醇洗涤，然后放在组织培养通风罩下进行空气干燥，接着再使之悬浮在437微升水中，并加入0.25M氯化铝（将63微升的2M CaCl₂加到437微升的DNA水溶液中）。在使空气鼓包通过500微升2×HEBS同时，逐滴加入DNA溶液（每4秒钟一滴）。每毫升2×HEBS中含有16毫克NaCl，2毫克1D-葡萄糖，0.75毫克氯化钾和0.5毫克NaHPO·12HO等，PH为7.1）。该混合物在室温下培养30分钟，然后倒入一只60毫米的组织培养皿，此培养皿盛有2毫升包含10%牛胎盘血清（FBS）和抗生素（无Yestolate或乳清蛋白水解产物）的Grace′s昆虫培养基，其中含有3×10⁶Sf9细胞。接着将DNA溶液逐滴加入细胞中，培养皿在28℃下培养4小时。以后再用含有FBS和抗菌素的4毫升Grace′s培养基对其进行洗涤，再在含有FBS，抗菌素和20%二甲亚砜的Grace′s培养基中培养90秒种。

培养平皿用完全培养基洗涤三次，再在28℃下用4毫升完全培养基继续培养。5天后，收集上层清液，在1000×g条件下澄清5分钟。在Sf9细胞上对病毒原材料进行滴定，用目视检查辨认非闭合的斑块，然后将非闭合斑块检出，再成斑两次。这些斑块在Sf9细胞上扩张，制成病毒原材料以供以后特征记述之用，图16为重组体结构示意图。

7.4用重组体杆状病毒感染的组织培养细胞中的与LAV/HTLVⅢgag相关的蛋白质表达

携带嵌合LAV/HTLVⅢgag基因的重组体Ac NPV被证明能够在组织培养物的感染细胞上表达与LAV/HTLVⅢgag有关的RNA和蛋白质。这些也被发现是能与爱滋病人的血清发生免疫反应。

7.4.1受Ac-gag1感染的细胞中的LAV/HTLVⅢgag特异的RNA的鉴别

将十只盛有Sf9细胞（每只培养皿约有10⁷细胞）的100毫米培养皿用野生型Ac PNV或其重组体，Ac-gag1感染，感染复数为4。感染后24小时取出细胞，用含有0.01M Tris-HCl PH为7.2的0.15M Nacl洗涤两次。再按有关文献介绍的方法分离多腺苷酸化的RNA（Purchio，A.F.and Fareed，G，G.，1979，J.Virol.29∶763-769）。接着使RNA在1%琼脂糖-甲醛凝胶中分级（Lehrach，H.，et al.，1979，Biochemistry 16∶4743-4251），而后转入尼龙过滤器（Hubond）并用紫外光照射。使该过滤器与含有下列物质溶液的磷-35标记的PKS-5DNA相混杂，时间16小时，温度42℃，所述溶液有下列组成：0.9M NaCl 150mM磷酸钠（PH7.0），5mM EDTA，0.1%SDS，4×Denhardts、0.4mg/ml tRNA，0.25mg/ml小牛胸腺DNA和50%甲酰胺。用0.1%SDS和0.25×SSC组成的溶液，在温度60℃将过滤器洗涤4次，时间30分钟，洗毕，利用Lightening Plus强化筛网使过滤器暴露到Cronex 4x-射线软片。图17表明，在重组体Ac NPV感染的细胞中检出一个2.2千碱对的宽带，而上野生型感染细胞中则未发现。

7.4.2利用免疫沉淀法鉴定用重组体杆状病毒感染的细胞表达的与LAV/HTLVⅢgag相关的蛋白质。

以下描述的免疫沉淀测定法证明，用本发明的重组体杆状病毒感染的细胞能合成与爱滋病病人血清发生特异免疫反应的蛋白质。

将Sf9细胞接种到60毫米培养皿上（每个培养皿有5×10⁶只细胞，并用Ac-gag1中的野生型Ac NPV感染。在感染后24、48和72小时，原先培养基用无蛋氨酸的培养其更换，细胞上28℃下培养30分钟。在这以后培养基用含有100微克/毫升[³⁵S]蛋氨酸的无蛋氨酸培养基更换，标记过程在28℃下需进行2小时。

在标记结束后，细胞用含有0.01M Tris-Hcl（PH7.2）和0.15M NaCl的溶液洗涤两次，然后离心分离法收集。每只60毫米培养皿中取出的细胞丸再悬浮在1毫升溶解缓冲液中，所述溶解缓冲溶液组成如下：1%NP-40（聚氧乙烯（9）P-tart-辛基酚），0.5脱氧胆酸钠，0.1M NaCl，0.01M Tris-HCl（PH7.4）和1mM EDTA，细胞溶解产物在100，000Xy条件下离心分离30分钟，以进行澄清。

将取自对照人群或爱滋病人的热灭活的人体血清4微升，加到500毫升细胞溶解产物中，以进行免疫沉淀。在4℃下培养半小时后，加入80微升活化的Staphylococcus aureus细胞（Pansorbin cell，Calbiochem-Behring Corp.，La Jolla，CA），在4℃下继续培养半小时。免疫沉淀复合物是在4℃下在Sorvall A384转子中以转速为5000转/分离心分离5分钟加以收集，然后用含有1MNa Cl，0.1%NP-40和0.01M Tris-Hcl，PH为7的溶液洗涤一次，接着再用RIRA缓冲液（10mM Tris-HCl，PH7.2，0.15MNaCl，1%脱氧胆酸钠，1%月桂基硫酸钠，1%Triton X-100）洗涤三次。将经洗涤的免疫沉淀物再次悬浮在80微升的Laemmli样品缓冲液中，加热沸腾1分钟后在Sorvall A384转子中以转速为5000转/分离心分离5分钟。存在于上层清液内的免疫沉淀的蛋白质在10%SDS聚丙稀酰胺凝胶中用电脉法进行分析。电脉后，凝胶用Coomassie蓝色染料着色，继而用水扬酸钠处理（30分钟，室温，1M水扬酸钠），干燥后进行荧光照相。

有人提出，成熟的gag蛋白质（24，000道尔顿，P-24;16，000道尔顿，P16;1400道尔顿，P-14）可从一种较大的55000道尔顿前体蛋白质中处理得到。图14表示分子量为67，000，55，000，40，000，34，000，32，000和24，000道尔顿的蛋白质能有效地被爱滋病人的血清免疫沉淀。

为了验证图18中描述的任何有免疫反应的蛋白质之间是否存在前体/产物关系，特进行了脉冲-跟踪实验。Sf9细胞按照上面描述的方法进行感染。感染后24小时，细菌用[³⁵S]蛋氨酸标记5分钟;接着用完全培养基洗涤。并在完全培养基中培养2、4和8小时。在这些时间内，收集三个不同时间的细胞，然后进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质，在如上所述的10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级。图19表示该实验的一个荧光照相片。数据表明，P67，P55，P40，P34和P32在5分钟后结合标记。在8小时追踪后，在P67和P55中，标记减少，而上P34中标记增加。在P40的放射性标记量保持相对恒定。

7.4.3用ELISA鉴别与LAV/HTLVⅢgag相关的蛋白质

十只100毫升培养皿，每只盛有10⁷Sf9细胞，用Ac-gag1感染。在感染后24小时，收集细胞，用含用0.01M Tris-HCl（PH7.2）和0.15M NaCl的溶液洗涤两次，然后冷冻-融化三次。接着在冰浴中用2毫升含有0.5%NP-40的PBS的溶液破坏细胞5分钟。将细胞溶解产物在1000×g条件下离心分离10分钟，移去上层清液。加入4毫升碳酸盐缓冲液（50mM碳酸钠，PH9.6）混合物在Eppenderf离心机中旋转20分钟。移去上层清液，如表Ⅲ所示用碳酸盐缓冲液稀释。这些细胞溶解产物被用于涂在96井微滴培养皿上，放置过夜，温度4℃（50微升/井）。第二天在每只井中加入300微滴保护性（封闭）试剂（5%无脂奶粉，0.01%乙基汞硫代水扬酸钠，0.01%抗泡沫剂A的10×PBS溶液），室温下培养45分钟。取出封闭试剂，再在每只井中加入用封闭试剂稀释100倍的50微升人体血清。加入前，稀释的血清（爱滋病病人血清或正常人血清）先在37℃温度下培养45分钟。

使每只井在37℃下反应1小时，然后用含有氯化钠和吐温-20（聚氧乙烯，甘油-月桂酸脱水山犁醇脂）洗涤三次。每只井内加入100微升山羊抗人体辣根过氧化物酶共轭物（用含有0.01%乙基汞硫代水扬酸钠的正常山羊血清稀释1000倍），并使之在37℃反应1小时。培养皿经洗涤后，每只井内再加入100微升缓冲基质和色原试剂的溶液，其中缓冲基质为过氧化氢、柠檬酸、磷酸盐缓冲剂;色原试剂为在二甲基亚砜中的四甲基联苯胺。培养皿在室温下培养30分钟。接着每只井中加入100微升的3N硫酸，使反应终止。在450nm处测定反应混合物的光吸收率，参考吸收率为630nm。所得结果示于表Ⅷ，其中TR1、Y-1、CF22C和CF9是爱滋病人血清，而2、16、21和48是正常人体血清。

总之，图17-19和表8所示结果表明，所述的重组体杆状病毒能够：（a）表达插入的LAV/HTLVⅢgag基因，（b）改进或处理这种基因产物，（c）产生与爱滋病人血清发生特异免疫反应的抗原蛋白质。

表8

ELISA测定的吸收率数值Ac-gag1细胞溶解物稀释度

试验

抗血清 50^-1100^-1200^-1400^-1800^-11000^-1

爱滋病

TR1 2.619 2.471 2.235 2.076 1.786 1.499

2.504 2.479 2.216 2.119 1.877 1.500

Y-1 2.502 2.354 2.046 1.564 1.298 1.014

2.305 2.306 2.006 1.595 1.282 1.078

CF22 C2.486 2.317 1.924 1.393 1.009 0.811

2.319 2.241 1.838 1.331 1.068 0.848

CF9 2.303 2.110 1.339 0.855 0.636 0.512

2.209 2.012 1.305 0.850 0.659 0.455

正常人：

2 0.221 0.204 0.312 0.199 0.228 0.222

0.229 0.187 0.176 0.227 0.208 0.210

16 0.176 0.175 0.217 0.131 0.144 0.129

0.165 0.135 0.139 0.210 0.175 0.145

21 0.193 0.190 0.216 0.189 0.237 0.165

0.205 0.176 0.170 0.199 0.197 0.224

48 0.200 0.185 0.217 0.177 0.190 0.134

0.249 0.169 0.163 0.175 0.173 0.143

8、实施例：牛痘gag基因重组体

在以下的实施例中，构成的质粒载体含有包括位于牛痘病毒的转录控制区的下方的LAV/HTLVⅢgag基因编码顺序的嵌合基因。含有牛痘病毒7.5k启动区和LAV/HTLVⅢgag基因顺序的嵌合基因经体内重组被插入到牛痘病毒的基因中。将这种重组的病毒进行鉴别和提纯并且由受感染的组织培养细胞制备病毒原种。在体外试验中可显示出重组牛痘病毒所产生具有免疫反应的LAV/HTLVⅢgag基因的有关蛋白质。以下的章节将详细地叙述本发明的这一实施例的每个步骤。本实施例中所采用的一般工艺如6.1节中所述。

8.1含有一种联结在LAV/HTLVⅢgag基因的编码顺序上的牛痘病毒启动子的质粒载体的构成。

含有联结在具有gag编码顺序的LAV/HTLVⅢ基因组的不同长度上的牛痘病毒7.5k启动区的五种质粒载体得到构成。LAV/HTLVⅢgag编码顺序源是λJ19（Wain-Hobson等人、Cell 40∶1985）的两种有关的亚克隆PKS-5和PSS-5。质粒PKS-5含有-3148碱基对，即在PUC18的相应位置上插入的LAV/HTLVⅢDNA的SstⅠ对KPnⅠ（核苷酸编号224对3372）的碎片。质粒PSS-5含有-5107碱基对，即在PUC18的相应位置上插入的LAV/HTLVⅢDNA的SstⅠ对SalⅠ（核苷酸编号224对5221）的碎片。以PKS-5或者PSS-5衍生的gag编码顺序的不同长度插入到质粒PGS62中，除了具有一个位于单-SmaⅠ位下方的单-EcoRⅠ位之外（参见图20），它与PGS20相同（Mackett等人、，1984，J·Virol，49∶857-864）。被插入到PGS62中的LAV/HTLVⅢ的种顺序均始于位于gag基因的始密码子的上方的76碱基对的ThaⅠ（FnuDⅡ）位（核苷酸257）。质粒PV-gag1、PV-gag2、PV-gag3、PV-gag4以及PV-gag5含有从ThaⅠ位分别经EcoRⅠ（为4194）、KpnⅠ（为3372）、EcoRⅤ（为2523）、BclⅠ（为1975）或者BglⅡ（为1642）位的LAV/HTLVⅢ种顺序。参照图20对每种质粒的结构作以下叙述会更为方便。

PV-gag1的构成：由限制性内切酶ThaⅠ和EcoRⅠ完全消化5微克质粒Pss-5DNA。在1%LMP琼酯糖凝胶上分离所得的碎片。分离出含有LAV/HTLVⅢgag编码顺序的3.9Kbp碎片并被联结到上述用SmaⅠ和EcoRⅠ消化的PGS62上。联结混合物用以使大肠杆菌HB101（E·Coli HB101）转化和选择抗氨苄青霉素克隆。通过限制分析对个体克隆的质粒中3.9Kbp插入物的存在及EcoRⅠ接合位上再生的情况进行测定。所得的构成体含有gag和蛋白酶（Prt）基因的完整的编码顺序以及大部分Pol基因的开放读码，直到核苷酸4194的EcoRⅠ位。

PV-gag2的构成：由限制性内切酶将ThaⅠ和SmaⅠ完全消化5微克质粒PKS-5。PKS-5的SmaⅠ位系邻近KpnⅠ位，该位置是在LAV/HTLVⅢ衍生且插入的顺序和PUC18质粒多克隆位之间接合。在1%LMP琼脂糖凝胶上分离所得的碎片。分离得到含有LAV/HTLVⅢgag顺序的3.2Kbp的碎片并且被联结到上述用SmaⅠ预先消化和用CIAP处理的PGS62DNA上。联结混合物用以使E·Coil HB101转化和选择抗氨苄青霉素的克隆。试验由对个体克隆得到的质粒是否存在3.1Kpb碎片进行测定，并由限制性分析确定插入物的定位。PV-gag2所得的构成体含有完整的gag基因、Prt基因以及一部分Pol基因的开放读码，直到核苷酸3372的KpnⅠ位。

PV-gag3的构成：除了由ThaⅠ产生2.3Kbp碎片和用于在SmaⅠ位插入至PGS62的PKS-5的EcoRⅤ联结之外，与PV-gag2相似。PV-gag3的最终结构含有完整的gag和Prt基因以及一小部分并合到3′部分的牛痘病毒TK基因的Pol基因。

PV-gag4的构成：由SstⅠ和BclⅠ完全消化5微克质粒PSS-5DNA。提纯含有LAV/HTLVⅢgag顺序的所得的碎片。使这种碎片联结到上述事先用SstⅠ和BamHⅠ切割的质粒载体PIC19R（Marsh等人·，1984，Gene32∶481-485）上构成一中间体质粒。gag顺序插入到PIC19R的BamHⅠ位中导致LAV/HTLVⅢ顺序中的BclⅠ位并置在克隆载体的这种多位中的EcoRⅠ位。由限制性内切酶ThaⅠ和EcoRⅠ消化这种中间构成而产生1.72Kbp可易于在SmaⅠ和EcoRⅠ位插入到质粒PGS62中的碎片。PV-gag4的最终构成物含有完整的LAV/HTLVⅢgag基因和一部分并合到3′部分的牛痘病毒TK基因上的Prt基因。

质粒PV-gag5的构成系利用与PV-gag4相同的两步策略。用限制性内切酶SstⅠ和BglⅡ消化5微克PSS-5。分离含有LAV/HTLVⅢgag顺序的1.42Kbp碎片，并在1%LMP琼脂糖凝胶上分离提纯，在SstⅠ和BglⅡ位上插入质粒PIC19R。将在BglⅡ位上的gag顺序联结到其PIC19R上的相应位置上使（a）在具有gag开放读码的相中产生一终止密码子和（b）斜接于BglⅡ位并置于多克隆位质粒上的邻接的EcoRⅠ位。然后，用ThaⅠ和EcoRⅠ消化这种中间构成体。提纯含有LAV/HTLVⅢgag顺序的1.39Kbp碎片并在SmaⅠ和EcoRⅠ位上联结在质粒PGS62上。最终形成质粒PV-gag5，含有大多数而不是所有的结扎在一码中翻译终止顺序上的gag（直到BglⅡ位）的编码顺序。

8.2含有嵌合LAV/HTLVⅢgag基因的重组牛痘病毒的构成

按适用于V-env5和V-env2的构成（参见6.3节）的相同报告达到嵌合LAV/HTLVⅢgag基因自质粒载体PV-gag1、PV-gag2、PV-gag3、PV-gag4及PV-gag5中插入到牛痘病毒基因组中。在以下的一些实施例中，所有的重组病毒均由噬菌斑净化的New York City Board of Health菌种（V-NY，参见6.1.1节）构成。选择TK^-重组体并在发展成为适用于以后的鉴定的病毒原种之前以噬菌斑净化三次。将自PV-gag1、PV-gag2、PV-gag3、PV-gag4及PV-gag5中衍生的重组病毒分别称之V-gag1NY、V-gag2NY、V-gag3NY、V-gag4NY及V-gag5NY。

8.3在经重组体牛痘病毒感染的组织培养细胞中

LAV/HTLVⅢgag有关蛋白质的表达

带有上述的嵌合LAV/HTLVⅢgag基因的重组体牛痘病毒能够表达组织培养中细胞感染时LAV/HTLVⅢgag的有关蛋白质。这些重组体中的一些重组体能够使前体gag蛋白质P55加工成成熟的蛋白质P25和P18。业已发现，这些蛋白质是能与AIDS病人血清和（或）以防gag蛋白质P25或P18的单克隆抗体呈免疫反应。

在10moi下，由亲本类型牛痘病毒（V-NY）或者用其重组衍生物：V-gag1NY、V-gag2NY、V-gag3NY、V-gag4NY或V-gag5NY在60毫米培养皿中使所含的BSC-40细胞受到感染。感染进行12小时，然后收获细胞，用PBS洗涤一次，再离心收集。使受感染的细胞片状沉淀物在0.3毫升Laemmli试样缓冲液中再悬浮并沸腾4分钟使其溶解。在取20微升细胞溶解液在15%SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳，以分离整个蛋白组份。作为控制品要包括净化的LAV/HTLVⅢ病毒粒子及作为模型的被感染细胞溶解液的等分试样。

使凝胶中的含有物电转移到硝化纤维过滤片的纸上。首先使过滤片与AIDS病人血清反应或者与以防gag蛋白质P25和P18的单克隆抗体的组合物反应。在彻底洗涤之后，再使过滤片与碱性磷酸酶（AP-共轭）共轭的山羊抗人体的免疫球蛋白抗体反应（当使用病人血清时）或者与AP共轭的山羊抗鼠免疫球蛋白抗体反应，（当使用鼠的单克隆抗体时）。第一、二种抗体反应条件以及洗涤条件如6.4.1节中所述。第二次抗体反应之后，用加有0.1M NaCl和5m MgCl₂的0.1M Tris（PH9.5）作最后洗涤。由使过滤片与含有0.1M Tris（PH9.5缓冲液）、0.1M NaCl、5mMMg Cl₂以一个含有0.1M Tris（PH9.5缓冲液）0.1M NaCl，5mMMgCl₂，0.33mg/ml磷酸溴氯吲哚（bromo-chloroindolgl phosphate）以及0.17mg/ml氮兰四唑的溶液反应检测过滤片上结合成抗原的抗体。使过滤器与色素源反应之后，在水中漂清，空干和照相。

图21所示为这分析结果。V-gag1NY和V-gag2NY重组体含有完整的gag和prt基因。这些重组体表达与LAV/HTLVⅢ的主要gag蛋白质P55、P40、P25及P18共同迁移的有关蛋白质的LAV/HTLVⅢ的一个家族。这些蛋白质是与AIDS病人血清（图21B）和抗P25和P18的鼠单克隆抗体（图21A）免疫反应的产物。V-gag3NY在组体含有gag和prt基因，但是其Pol开放读码被联结在具有牛痘TK基因的羧基未端部分的相中。V-gag3NY还能够表达最初的gag基因产物P55。然而，P55的处理效率似乎比V-gag1NY和V-gag2NY的低，因为用V-gag3NY感染的细胞溶解液中P55比P25和P18少得多。重组体V-gag4NY含有完整的gag基因，但是只有部分prt基因。它合成了一种尺寸与P55相似，LAV/HTLVⅢ的有关的蛋白质。重组体V-gag5NY含有仅部分gag基因，表达一种43KD的截短的蛋白质（图21c）。虽然，V-gag4NY和V-gag5NY似乎却不能有效地处理它们有关蛋白质的最初gag，它们是对抗P25和P18的单克隆抗体的免疫反应的产物。总之，尽管它们处理能力不同，但五种重组体却都能表达具有免疫反应性的蛋白质，它系含有LAV/HTLVⅢ核心蛋白质的主要表位。

9、实施例：杆状病毒外壳重组体

在以下的实施中，构成的质粒载体含有包括位于ACNPV的转录控制顺序下游的LAV/HTLVⅢenv编码顺序的嵌合基因。把含有Ae Np V多面体启动区和LAV/HTLVⅢenv编码顺序的嵌合基因经在体内重组合插入到ACNPV的基因组中。鉴定和提纯重组病毒，由受感染的细胞的上清液制备病毒原种。业已表明，在体外试验中重组杆状病毒可产生具有免疫反应LAV/HTLVⅢenv的有关蛋白质。以下小节中将详细地叙述本发明的这一实施例的每一个步骤。本实施例中所采用的一般工艺如7.1节中所述。

9.1含有联结在LAV/HTLVⅢenv基因的编码顺序上的AcNPV启动区的质粒载体的构成

从PV-env5中提纯LAV/HTLVⅢenv编码顺序，它用于构成业已以有关蛋白质的env基因表示的重组牛痘病毒V-env5。BamHT位两端位于最接近的与96碱基对5′位和223碱基对3′位接近未翻译的顺序在一起的PV-env5中的env编码区的侧面。这种质粒（它也含有一内部BamHT部位）经用限制性内切酶BamHT的部分消化产生仅含有LAV/HTLVⅢ的特定顺序的2.9Kbp碎片。使这种碎片（大约0.5微克）用1%LMP琼酯糖凝胶分离和提纯并被联结在0.5微克质粒载体PAC610上，PAC610系事先用BamHT线性化和用CIAP处理。联结的混合物可用以使E·coli菌株Mc1000转变并选择抗氨苄青霉素的菌落。在有LAV/HTLVⅢenv顺序存在（亦即.用BamHT消化产生2.3Kbp和0.54Kbp碎片）的情况下试验由单个转变体组成的质粒DNA对以及对插入物的定位用LAV/HTLVⅢenv顺序在正确位置中插入的质粒经纯化并以PAC-env5表示。其结构示于图22。

9.2含有嵌合LAV/HTLVⅢenv基因的杆状病毒重组体的构成

如7.3节所述，通过体内重组作用达到把嵌合的AV/HTLVⅢenv基因插入到AVNPV基因组中。再如同一节所述，使ACNPVDNA（1mg）、PAC-env5DNA（5mg）及牛犊胸腺DNA（15mg）转染到sf9细胞中。在用4毫升完全培养基于28℃下培育5天之后，收集上清液并在1000×g下离心澄清10分钟。在Sf9细胞上滴定病毒原种，并且首先用以下所述的M、D、Summers和G、E、Smith的噬菌斑杂交化测定法鉴定重组病毒：

将Sf9细胞接种在60×15毫米的培养平板上，在无血清的TNM-FH培养基中，每块平板上的细胞密度为2.5×10。细胞附着之后，去除培养基，在每地平板上加入一毫升稀释的病毒接种物。在27℃下培育1小时后，去除每块平板上的所有接种物菌，把4毫升LMP琼脂覆层慢慢地加在每块平板的边缘上。覆层凝固之后，平板在湿的环境中培养4-6天，或者一直到良好地形成噬菌斑。然后使平板干燥过夜或更长此时间使板放置在不湿的环境中。在达到足够的干燥时，去除琼脂覆层，把干燥的硝化纤维素沾片放在平板中所保持的细胞的顶部。用溶液A（0.005M Tris-Hcl，PH7.4，0.15MNacl）使Whatman3MM的47毫米湿纸饱和并放在硝基纤维素滤片之上，俟渗开后，将硝化纤维素滤片小心地移开，并把它放在以溶液B（0.5N NaoH，1.5M Nacl）饱和的Whatman过滤纸上。2-3分钟后，用纸巾上将硝化纤维过滤纸空气中吸干然后转移到用溶液C（1.0M Tris-Hcl，PH7.4，1.5M Nacl）饱和的Whatman过滤纸上。2-3分钟后，在纸巾上使硝化纤维过滤纸在空气下干，再慢慢地浸入业装满溶液D（0.3M Nacl，0.03M拧檬酸钠）的陪替氏培养皿中洗涤。尔后，取出在纸巾上干燥，再在真空中80℃下烘2小时。使滤片与32P标记PRS-3杂交作为探测剂。挑取重组病毒并再滴定在Sf9细胞上。用肉眼鉴别未密封的噬菌斑。这些经三次以上提纯噬菌斑用于制备以下研究中用的病毒原种。

9.3在由重组杆状病毒Ac-envs感染的组织培养细胞中有关蛋白质的LAV/HTLVⅢenv的表示

业已表明，带嵌合的LAV/HTLVⅢenv基因的重组ACNPV是能够在细胞在组织培养中感染时表示LAV/HTLVⅢenv的有关蛋白质。并且指出，这些蛋白质是与AIDS病人血清以及与限定LAV/HTLVⅢ包膜糖蛋白gp110和gp41的单克隆抗体能呈免疫反应。

用野生型ACNPV或者其重组AC-env5在5moi下使在100毫米培养皿上接种的Sf9细胞（1×10）感染。在感染28小时以后，在没有血清补给的情况下，介质由无蛋氨酸的培养基取代并培养30分钟。完毕后，用含有100uci/ml[³⁵S]蛋氨酸的2毫升无蛋氨酸培养基取代该培养基，使能在28℃下标记化2小时。标记期结束，用PBS洗涤细胞两次，然后如6、4、2节中所述，在1毫升溶解缓冲液中再悬浮。如6、4、2节中所述，用AIDS病人血清也可同样用gp110或gp41的鼠的单克隆抗体进行免疫沉淀。

这种分析结果指出似图23所表示的重组病毒Ac-env5主要合成了一种LAV/HTLVⅢ外壳的有关150KD的蛋白质。因为与由牛痘重组V-env5合成的gp150共同迁移和与AIDS病人血清以及抗gp110和gp41的单克隆抗体的免疫反应，所以这种蛋白质代表糖基化前体外壳蛋白质gp150。这种分子处理是不充分的，因为在两小时标记期内检测不出gp110或gp41。然而，因为gp110和gp41的两者大多数表位均处于前体上，所以这种蛋白质作为诊断剂和作为免疫源是具有潜在的价值的。

10、微生物的存放

携带所列质粒的以下大肠杆菌（E·coli）菌株业已存放在美国、伊利诺斯州（IL）、皮奥里亚（Peorial）的农业研究培养收集部（NRRL），存取编号如下：

E.Coli 菌株质粒存取编号

K12 MC1000 PV-env1 NRRL B-18003

K12 MC1000 PV-emv2 NRRL B-18004

K12 MC1000 PV-env5 NRRL B-18005

K12 MC1000 PV-env7 NRRL B-18110

K12 HB101 PV-gag1 NRRL B-18111

K12 HB101 PAC-gag1 NRRL B-18105

K12 NF1829 PACenv5 NRRL B-18109

以下重组病毒业已存放在美国马里兰州（MD）、罗克1维尔（Rockville）的美国典型培养收集，存取编号如下：

重组病毒存取编号

V-env2 ATCC VR2114

V-env5 ATCC VR2113

V-env7 ATCC VR2148

V-env5NY ATCC VR2149

V-gag1NY ATCT VR2150

AC-gag1 ATCT VR2147

AC-env5 ATCT VR2151

本发明并不限于微生物和所存放的病毒的范围，因为存放实例仅作为本发明的一个方面的个别说明，功能上相当的任何微生物或者病毒均在本发明的范围之内。确实，除了本文说明和叙述的这些之外，本领域的技术人员根据上述的说明和附图显然可以对本发明作出各种的改进。这种改进仍在以下权利要求的范围之内。

还应指出，核苷酸所有碱基对的尺寸是近似的，用于说明的目的。

Claims

1、一种重组病毒，其特征在于所述重组病毒的基因组包括一编码LAV/HTLVⅢ的表位的核苷酸或者它的抗原部份，所述的抗原部分处于调节基因表示的第二核苷酸顺序的控制之下，以致于在用病毒感染的宿主中表达与LAV/HTLVⅢ的表位有关的肽或蛋白质。

2、根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于编码LAV/HTLVⅢ的表位的核苷酸顺序包括LAV/HTLVⅢ的外壳基因的或者编码抗原的肽或蛋白质的它的任何部分的核苷酸顺序。

3、根据权利要求2所述的重组病毒，其特征在于外壳基因核苷酸顺序包括基本上如图2所示的核苷酸顺序，从核苷酸编号5767到8549，或者编码抗原的肽或蛋白质的它的任何部分的核苷酸顺序。

4、根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于感染宿主中表示的肽或蛋白质与LAV/HTLVⅢ的外壳表位或者它的任何抗原的部分有关。

5、根据权利要求4所述的重组病毒，其特征在于外壳表位包括具有基本上如图2所示的氨基酸顺序的肽或蛋白质，氨基酸残基编号从1到861，或者它的任何的抗原部分。

6、根据权利要求1、2、3、4或5所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括外壳的病毒。

7、根据权利要求6所述的重组病毒，其特征在于所述的病毒系以牛痘病毒组成。

8、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2113的重组牛痘病毒V-env5或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

9、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2114的重组牛痘病毒V-env2或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

10、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2148的重组牛痘病毒V-env7或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

11、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2149的重组牛痘病毒V-env5NY或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

12、根据权利要求1、2、3、4或5所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括杆状病毒。

13、根据权利要求12所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括核多角体病病毒。

14、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2151的重组杆状病毒AC-env5或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

15、根据权利要求1、2、3、4或5所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括裸露的病毒。

16、根据权利要求15所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括腺病毒。

17、根据权利要求1、2、3、4或5所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括噬菌体。

18、根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于编码LAV/HTLVⅢ的表位的核苷酸顺序包括LAV/HTLVⅢgag基因的或者编码抗原的肽或蛋白质的它的任何部分的核苷酸顺序。

19、根据权利要求18所述的重组病毒，其特征在于gag基因核苷酸顺序以实质上如图14所示的核苷酸顺序所组成核苷酸编号从340到1835，或者为核苷酸顺序编码抗原的肽或蛋白质的任何部分。

20、根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于感染宿主中表示的肽或者蛋白质与LAV/HTLVⅢ的核心蛋白质的表位，或者与其任何抗原部分有关。

21、根据权利要求20所述的重组病毒，其特征在于所述的表位包括具有基本上如图14所示的氨基酸顺序，氨基酸残基编号从1到500的肽或蛋白质，或者其任何抗原部分。

22、根据权利要求18、19、20或21所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病毒包括外壳的病毒。

23、根据权利要求22所述的重组病毒，其特征在于所述的重组病包括毒牛痘病毒。

24、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2150的重组体牛痘病毒V-gag1NY或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

25、根据权利要求18、19、20或21所述的重组体病毒，其特征在于所述的重组体病毒包括杆状病毒。

26、根据权利要求25所述的重组体病毒，其特征在于所述的杆状病毒包括核多面体病毒。

27、一种如在ATCC存放、存取编号为VR2147的重组体杆状病毒AC-gag1，或者一突变体、重组体或者其遗传工程的衍生种。

28、根据权利要求18、19、20或21所述的重组病毒，其特征在于所述的重组体病毒包括裸露的病毒。

29、根据权利要求28所述的重组体病毒，其特征在于所述的重组体病毒包括腺病毒。

30、根据权利要求18、19、20或21所述的重组体病毒，其特征在于所述的重组体病毒包括噬菌体。

31、一种与LAV/HTLVⅢ的表位有关的实质上纯的抗原肽或者蛋白质。

32、根据权利要求31所述的肽或者蛋白质，其特征在于所述的表位包括LAV/HTLVⅢ的外壳糖蛋白表位。

33、根据权利要求32所述的肽或蛋白质，特征在于所述的肽或蛋白质具有包括基本上如图2所示的氨基酸顺序，氨基酸残基编号从1到861或者其任何抗原部分中的氨基酸顺序。

34、根据权利要求32或33所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质系在含有编码处于调节基因表示的第二核苷酸顺序的控制之下以致可以在表示肽或蛋白质的核苷酸顺序的细胞培养液中提纯。

35、根据权利要求34所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的细胞培养液包括微生种。

36、根据权利要求35所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的微生种包括细菌。

37、根据权利要求35所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的微生种包括酵母。

38、根据权利要求34所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的培养细胞包括动种细胞株。

39、根据权利要求38所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质用由如在ATCC存放、存取编号为VR2113的重组牛痘病毒V-env5或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种感染的动种细胞制备。

40、根据权利要求38所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质用由如在ATCC存放、存取编号为VR2114的重组牛痘病毒V-env2或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种感染的动种细胞制备。

41、根据权利要求38所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质用由如在ATCC存放、存取编号为2148的重组牛痘病毒V-env7或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种感染的动种细胞制备。

42、根据权利要求38所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质用由在ATCC存放、存取编号为VR2149在重组体牛痘病毒V-env5NY或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种感染的动种细胞制备。

43、根据权利要求34所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的培养细胞包括昆虫细胞株。

44、根据权利要求43所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质用由如在ATCC存放、存取编号为VR2151的重组杆状病毒AC-env5或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种所感染的昆虫细胞制备。

45、根据权利要求31所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的表位包括LAV/HTLVⅢ的核心蛋白质表位。

46、根据权利要求45所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质具有包括基本上如图14所示的氨基酸顺序，氨基酸残基从1到500或者其任一个抗原部分的氨基酸顺序。

47、根据权利要求45或46所述的肽或蛋白质，其特征在于所述的肽或蛋白质自含有编码处于调节基因表示的第二核苷酸顺序的控制之下以致于可以表示肽或蛋白质的肽或蛋白质的核苷酸顺序的细胞培养液中提纯。

48、根据权利要求47所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的培养细胞包括微生种。

49、根据权利要求48所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的微生种包括细菌。

50、根据权利要求48所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的微生种包括酵母。

51、根据权利要求47所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的培养细胞包括动种细胞株。

52、根据权利要求51所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的肽或蛋白质用由如在ATCC存放、存取编号为VR2150的重组体牛痘病毒V-gag1NY或者以一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种感染的动种细胞制备。

53、根据权利要求47所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的培养细胞包括昆虫细胞株。

54、根据权利要求53所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的肽或蛋白质用如在ATCC存放、存取编号为VR2147的重组体杆状病毒AC-gag1或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种感染的昆虫细胞制备。

55、根据权利要求31、32、33、45或46所述的肽或蛋白质，其特征在于所说的肽或蛋白质系由化学合成。

56、一种活的病毒疫苗配方组剂，包括权利要求1、2、3、4或5中所述的病毒，其特征在于所说的病毒在不使被接种的宿主引起疾病的情况下感染的。

57、根据权利要求56所述的活的病毒疫苗组剂，其特征在于所说的病毒包括外壳病毒。

58、根据权利要求57所述的活的病毒疫苗组剂，其特征在于所说的外壳病毒包括牛痘病毒。

59、一种活的病毒疫苗配方组剂，其特征在于所说的组剂包括权利要求8所述的牛痘病毒V-env5的感染剂量。

60、一种活的病毒疫苗配方组剂，其特征在于所说的组剂包括权利要求9所述的牛痘病毒V-env2的感染剂量。

61、一种活的病毒疫苗配方组剂，其特征在于所说的组剂包括权利要求10所述的牛痘病毒V-env7的感染剂量。

62、一种活的病毒疫苗配方组剂，其特征在于所说的配方组剂包括权利要求11所述的牛痘病毒V-env5NY的感染剂量。

63、一种根据权利要求56所述的活的病毒疫苗组剂，其特征在于所说的病毒包括裸露的病毒。

64、根据权利要求63所述的活的病毒疫苗组剂，其特征在于所说的裸露病毒包括腺病毒。

65、一种多价活的病毒疫苗配方组剂，包括权利要求2、3、4或5所述的重组体病毒和权利要求18、19、20或21所述的重组病毒，其特征在于所说的病毒在不使被接种宿主引起疾病在情况下受感染的。

66、根据权利要求65所述的多价疫苗，其特征在于所说的每种重组体病毒包括外壳病毒。

67、根据权利要求66所述的多价活的病毒疫苗，其特征在于所说的每种外壳病毒包括牛痘病毒。

68、一种多价疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下病毒的感染剂量：

（a）权利要求8的牛痘病毒V-env5、权利要求9的V-env2、权利要求10的V-env7或者权利要求11的V-env5NY;

（b）权利要求24的牛痘病毒V-gag1NY。

69、一种失活病毒疫苗配方组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求1、2、3、4或5所述的病毒在非传染的情况下的有效剂量并与药用载体混合。

70、一种失活病毒疫苗配方组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求6所述的外壳病毒在非传染的情况下的有效剂量并与药用载体混合。

71、一种失活病毒疫苗组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求7所述的牛痘病毒在非传染的情况下有效剂量并与药用载体混合。

72、一种失活病毒疫苗配方组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求8所述的牛痘病毒V-env5在非传染情况下有效剂量并与药用载体混合。

73、一种失活病毒疫苗组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求9所述的牛痘病毒V-env2在非传染情况下有效剂量并与药用载体混合。

74、一种失活病毒疫苗组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求10所述的牛痘病毒V-env7在非传染情况下有效剂量并与药用载体混合。

75、一种失活病毒疫苗配方组剂，其特征在于所述的组剂包括权利要求11所述的牛痘病毒V-env5NY在非传染情况下有效剂量并与药用载体混合。

76、一种多价失活病毒疫苗组剂，其特征在于所述的组剂包括以下病毒的有效剂量：

（a）权利要求2、3、4或5所述的表示有关LAV/HTLVⅢ的表位的外壳的重组病毒;

（b）权利要求18、19、20或21所述的表示有关LAV/HTLVⅢ表位的核心的重组病毒。

77、根据权利要求76所述的多价失活病毒疫苗配方组剂，其特征在于每种重组病毒包括外壳病毒。

78、根据权利要求77所述的多价失活病毒疫苗组剂，其特征在于每种外壳病毒包括牛痘病毒。

79、一种多价失活病毒疫苗配方组剂，其特征在于所述的组剂包括以下病毒的有效剂量：

（a）权利要求8的牛痘病毒V-env5、权利要求9的V-env2、权利要求10的V-env7或权利要求11的V-env5NY;

（b）权利要求24的牛痘病毒Vgag1NY。

80、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求32或33的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

81、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求34的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

82、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求35的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

83、一种亚单位疫苗组剂，其特征在于免疫原包括权利要求36的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

84、一种亚单位疫苗组剂，其特征在于免疫原包括权利要求37的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

85、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求38的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

86、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求39的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

87、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求40的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

88、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求41的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

89、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求42的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

90、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求43的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

91、一种亚单位疫苗配方组剂，其特征在于免疫原包括权利要求44的肽或蛋白质的有效剂量并与药用载体混合。

92、一种多价亚单位疫苗配方组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求45或46的第二肽或蛋白质并与药用裁体混合。

93、一种多价亚单位疫苗配方组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求47的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

94、一种多价亚单位疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求48的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

95、一种多价亚单位疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求49的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

96、一种多价亚单位疫苗配方组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求50的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

97、一种多价亚单位疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求51的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

98、一种多价亚单位疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求52的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

99、一种多价亚单位疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求53的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

100、一种多价亚单位疫苗组剂，其特征在于所说的组剂包括以下的肽或蛋白质的有效剂量：

（a）权利要求32或33的第一肽或蛋白质;

（b）权利要求54的第二肽或蛋白质并与药用载体混合。

101、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PV-env1。

102、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求101的重组DNA载体。

103、一种细菌，其特征在于所说的细菌含有权利要求101的重组DNA载体。

104、根据权利要求103的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18003的大肠杆菌或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

105、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PV-env2。

106、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求105的重组DNA载体。

107、一种细菌，其特征在于所说的细菌含有权利要求105的重组DNA载体。

108、根据权利要求107的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18004的大肠杆菌，或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

109、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PV-env5。

110、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求109重组DNA载体。

111、一种细菌，其特征在于所说的细菌含有权利要求109的重组DNA载体。

112、根据权利要求111所述的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18005的大肠杆菌，或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

113、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PV-env7。

114、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求113的重组DNA载体。

115、一种细菌，其特征在于所说的细菌含有权利要求113的重组DNA载体。

116、根据权利要求115所述的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18110的大肠杆菌，或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

117、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PV-gag1。

118、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求117的重组DNA载体。

119、一种细菌，其特征在于所说的细菌含有权利要求117的重组DNA载体。

120、根据权利要求119所述的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18111，或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

121、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PAC-gag1。

122、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求121的重组DNA载体。

123、一种细菌，其特征在于所说的机体含有权利要求121的重组DNA载体。

124、根据权利要求123所述的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18105大肠杆菌，或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。

125、一种重组DNA载体，其特征在于所说的载体包括PAC-env5。

126、一种单细胞机体，其特征在于所说的机体含有权利要求125的重组DNA载体。

127、一种细菌，其特征在于所说的细菌含有权利要求125的重组DNA载体。

128、根据权利要求127所述的细菌，其特征在于所说的细菌包括如由NRRL存放、存取编号为B-18109，或者一突变体、重组体或其遗传工程的衍生种。