DE68917520T2

DE68917520T2 - Verfahren und Systeme zur Herstellung von HIV-Antigenen.

Info

Publication number: DE68917520T2
Application number: DE68917520T
Authority: DE
Inventors: Hakan Drevin; Torsten B Helting; Michael F Nunn
Original assignee: FERROPAS AG
Current assignee: Helting Torsten B San Francisco Calif Us
Priority date: 1988-05-06
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1995-01-05
Anticipated expiration: 2009-05-03
Also published as: ES2059823T3; ATE110112T1; EP0343132A3; DE68917520D1; EP0343132A2; EP0343132B1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Segment einer Desoxyribonucleinsäure (DNA), das entweder ein rekombinantes HIV p24-Protein und/oder ein HIV p24-gp41-Fusionsprotein codiert und eine rekombinante DNA (rDNA), die das DNA-Segment enthält. Zellen, die mit der erfindungsgemäßen rDNA transformiert wurden, und Verfahren zur Produktion des HIV p24-gp41-Fusionsproteins werden ebenfalls betrachtet.

Hintergrund der Erfindung

Das menschliche Immunschwächevirus (HIV) gilt als ursächlicher Erreger des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS). Die Nucleinsäuresequenz des proviralen HIV-Genoms wurde abgeleitet und die Lokalisierung verschiedener Protein-codierender Regionen innerhalb des viralen Genoms wurde bestimmt.
Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung ist der Teil des HIV-Genoms, der im Stand der Technik als die gag-Region bekannt ist. Man nimmt an, daß die gag-Region ein Vorläuferprotein codiert, das gespalten wird und in drei Reifeproteine p17, p24 und p15 prozessiert wird. Das HIV p24-Protein besitzt ein offensichtliches relatives Molekulargewicht von etwa 24.000 Dalton und ist auf dem Fachgebiet als HIV-Core-Antigen bekannt, weil es das Viruscapsid bildet.
Das p24-Antigen von HIV ist von besonderem Interesse, weil Studien gezeigt haben, daß der erste Nachweis einer Anti- HIV-Antikörperbildung (Serokonversion) in infizierten Individuen das Auftreten von Antikörpern, die durch das p24- Antigen induziert werden, d.h. von anti-p24-Antikörpern ist. Zusätzlich berichteten jüngst Studien, daß das p24- Protein in Blutproben selbst vor dem Nachweis von anti- p24-Antikörpern nachgewiesen werden kann. Der Nachweis des Vorhandenseins entweder des p24-Proteins oder der anti- p24-Antikörper scheint daher die beste Möglichkeit zum Nachweis einer HIV-Infektion zum frühesten Zeitpunkt zu sein.
Ferner erscheint das p24-Antigen im Blut von infizierten Individuen begleitend mit der Abnahme der anti-p24-Antikörper in Patienten, die eine Verschlechterung ihres klinischen Zustands zeigten, der den Übergang zum voll ausgeprägten AIDS begleitet, erneut. So kann das p24-Antigen als effektiver prognostischer Marker bei Patienten in Therapie dienen.
Die Entwicklung von Immunoassays zum Nachweis von anti- p24-Antikörpern wurde durch Schwierigkeiten bezüglich der Produktion ausreichender Mengen an HIV p24-Protein, das im wesentlichen frei von immunreaktiven Verunreinigungen ist, begrenzt. Das Vorhandensein von Kontaminanten, die mit Antikörpern, die in den Patientenproben vorhanden sind, eine Immunreaktion zeigen, führt zu einer niedrigeren Assayspezifität und Empfindlichkeit und einer Erhöhung der falsch positiven Ergebnisse.
Gegenwärtig wird bei Assay auf anti-p24-Antikörper in einer Blutprobe auf dem Fachgebiet typischerweise das Vorhandensein von Verunreinigungen in HIV p24-Proteinpräparaten durch vorherige Absorption der Probe mit einem Präparat, das die Verunreinigungen enthält, überwunden. Beispielsweise berichteten Dowbenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7748-7752 (1985) über die Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren zur Produktion eines HIV p24-Fusionsproteins in E. coli. Jedoch enthielt ein immunaffinitätsgereinigtes Präparat des p24-Fusionsproteins einen Gehalt an Proteinverunreinigungen aus E. coli, der ausreicht, um eine vorherige Absorption der zu testenden Blutproben mit E. coli-Proteinextrakten nötig zu machen.
Auf ähnliche Weise berichteten Steimer et al., Virol., 150: 283-290 (1986) über die Produktion eines verstümmelten HIV p24 in E. coli. Das verstümmelte p24 wurde aus verunreinigenden E. coli-Proteinen unter Verwendung einer Ammoniumsulfatpräzipitation und Fraktionierung durch Gelfiltration unter Produktion eines p24-Antigenpräparats, das wie beschrieben, reiner als 99% ist, isoliert. Jedoch benötigte die Verwendung dieses p24-Antigenpräparats in einem Enzym-linked Immunosorbentassay (ELISA) zum Nachweis von anti-p24-Antikörpern noch die vorherige Adsorption der Blutproben mit E. coli-Proteinen. In der europäischen Patentanmeldung Nr. 85309454.8, veröffentlicht am 9. Juli 1986 (Publikationsnummer 0187041), ist ebenfalls die Expression eines HIV p24-Fusionsproteins in E. coli beschrieben.
Zwei Schwierigkeiten bei der Verwendung von gentechnisch verändertem E. coli zur Produktion eines HIV p24-Antigenpräparats, das im wesentlichen frei von verunreinigenden E. coli-Proteinen ist, sind die Unlöslichkeit und die niedrige Ausbeute des rekombinant produzierten Proteins. Beispielsweise berichteten Dowbenko et al., a.a.O., Ghrayeb et al., DNA, 5: 93-99 (1986) und Shoeman et al., Anal. Biochem., 161: 370-379 (1987), daß HIV p24-Fusionsproteine, die in E. coli produziert wurden, als unlösliche Aggregate ("Einschlußkörper") in den produzierenden Bakterien sich anhäuften. Die Aggregate, die als Körnchen in den elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Bakterien gesehen werden können, wurden in der Pelletfraktion nach der Zellyse (Aufbrechen) und der Zentrifugation gewonnen. Die Solubilisation des Proteins aus dem Pellet benötigte dann die Behandlung mit stark denaturierenden Mitteln.
Die Ausbeute an einem rekombinanten Protein aus den transformierten Bakterien steht in direktem Bezug zu seiner Translationsrate. Ein rekombinantes Protein kann nicht schneller als die langsamste Stufe im gesamten Translationsprozess synthetisiert werden. Die Initiierung der Translation, die Elongation und die Termination erwiesen sich als Stufen, deren Effizienz aus der DNA-Sequenz allein nicht vorhersagbar ist.
Beispielsweise berichteten Steimer et al., a.a.O., die Untersuchung über die Wirkung der Translationseffizienz durch Variation der drei Nucleotide 5' des Startcodons AUG in einer rDNA, die ein Amino-terminalverstümmeltes HIV p24-Protein codiert. Dieser Bereich der rDNA wurde untersucht, weil er an der Definition der Translationsinitiationsstelle (Ribosomenbindungsstelle) beteiligt ist. Steimer et al. fanden, daß die Effizienz der Translationsinitiation von der Integration mehrerer Faktoren abhängt und aus der DNA-Sequenz der Region der Ribosomenbindungsstelle nicht vorhersagbar war. Die GB-A-2 118 693 beschreibt p24- gp41-Fusionsproteine, die als unlösliche Einschlußkörper produziert wurden. Basierend auf dem elektrophoretischen Ergebnis liegt das erhaltene Fusionsprotein in keiner Weise in reiner Form vor.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Segment, umfassend eine erste Nucleotidbasensequenz, die funktionell an ihrem 3'-Ende an das 5'-Ende einer zweiten Nucleotidbasensequenz verknüpft ist. Die erste Sequenz besitzt eine Nucleotidbasensequenz der Formel:
AGGAGGGTTTTTCAT.
Die zweite Sequenz besitzt eine Nucleotidbasensequenz, die ein rekombinantes HIV p24-Protein codiert. Die Erfindung betrifft auch eine rekombinante DNA, umfassend einen Vektor, der funktionell an ein DNA-Segment geknüpft ist. Das DNA-Segment umfaßt eine erste Nucleotidbasensequenz in funktioneller Verknüpfung an ihrem 3'-Ende an das 5'-Ende einer zweiten Nucleotidbasensequenz. Die erste Sequenz besitzt eine Nucleotidbasensequenz der Formel:
AGGAGGGTTTTTCAT.
Die zweite Sequenz besitzt eine Nucleotidbasensequenz, die ein rekombinantes HIV p24-Protein codiert.
Die Erfindung betrifft ein DNA-Segment, das eine Aminosäuresequenz gemäß der Figur 1B von dem Rest 1 bis etwa Rest 257, gemäß Figur 1C von Rest 1 bis Rest 258 oder gemäß Figur 1E von Rest 1 bis Rest 283 codiert. Bevorzugt besitzt das DNA-Segment eine spezielle Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1B, 1C oder 1E.
Ebenfalls betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend einen Vektor, bevorzugt einen Expressionsvektor, in funktioneller Verknüpfung an ein erfindungsgemäßes DNA-Segment. Ein bevorzugtes rekombinantes DNA-Molekül ist pGEXp24gp41, pGEXp24gp41-2 oder pGEXp24gp41-1,2.
Das HIV p24-gp41-Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Figur 1B von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 257, gemäß Figur 1C von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 258 oder gemäß Figur 1E von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 283 ist ebenfalls betroffen.
Ferner betrifft die Erfindung eine Kultur aus Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurden und Verfahren zur produktion der erfindungsgemäßen HIV p24 oder HIV p24-gp41-Fusionsproteine unter Verwendung einer Kultur.
Ebenfalls betrifft die Erfindung ein Präparat, umfassend ein rekombinantes HIV p24-Protein. Das Präparat ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei von (a) procaryotischen Antigenen und (b) anderen HIV-verwandten Proteinen ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein diagnostisches System in Form eines Kits, umfassend in einer zur Durchführung von mindestens einem Assay ausreichenden Menge, ein erfindungsgemäßes rekombinantes HIV p24-Proteinpräparat als separat abgepacktes Reagens.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein diagnostisches System in Form eines Kits, umfassend ein erfindungsgemäßes HIV p24-gp41-Fusionsprotein. Bevorzugt enthält das diagnostische System, das HIV p24- gp41-Fusionsprotein in Bindung an eine feste Matrix.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Assay einer Probe einer Körperflüssigkeit, die das Vorhandensein von Antikörpern gegen mindestens eines der HIV-Antigene gp24 und gp41. Bei dem Verfahren bildet man ein immunreaktives Gemisch durch Vermischen der Probe der Körperflüssigkeit mit einem erfindungsgemäßen HIV p24-gp41-Fusionsprotein. Das immunreaktive Gemisch wird für eine Zeitspanne, die ausreicht, daß alle vorhandenen Antikörper mit dem Fusionsprotein unter Bildung eines immunreaktiven Produkts eine Immunreaktion eingehen, gehalten, wobei das Produkt beim Nachweis das Vorhandensein von anti-HIV-p24 und/oder anti-HIV-gp41-Antikörpern anzeigt. Bevorzugt wird das Fusionsprotein an eine feste Matrix bei der Durchführung des Verfahrens fixiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Inoculum, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten HIV p24-Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Das Inoculum ist im wesentlichen frei von (a) procaryotischen Antigenen und (b) anderen HIV-verwandten Proteinen. Das erfindungsgemäße Inoculum kann zur Behandlung einer HIV-Infektion verwendet werden.

Kurze Zusammenfassung der Figuren

Die Figur 1, die die Übersichten 1A, 1B, 1C, 1D und 1E enthält, erläutert die Nucleotidbasensequenzen bevorzugter erfindungsgemäßer DNA-Segmente. Die Basensequenzen sind wie üblich von links nach rechts und in der Richtung 5'- Terminus T 3'-Terminus unter Verwendung des Einbuchstabennucleotidbasencodes (A=Adenin, T=Thymin, C=Cytosin und G=Guanin) angegeben. In allen Übersichten der Figur 1 stellen die Nucleotidbasen 1-4 die Shine-Dalgarno-Sequenz [Shine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:1342 (1974)] dar, definieren die Basen 1-15 eine Ribosomenbindungsstelle und definieren die Basen 16-690 einen Hauptteil des Strukturgens des rekombinanten HIV p24-Proteins.
Das Leseraster der Strukturgene, die in allen Übersichten der Figur 1 dargestellt sind, ist durch Platzierung der Sequenz des abgeleiteten Aminosäurerests des Proteins, das es codiert, über die Nucleotidsequenz angegeben, so daß der Dreibuchstabencode für jeden Aminosäurerest (Tabelle der Entsprechung) direkt über den drei Basen (Codon), das jeden Rest codiert, angegeben ist. Die Sequenz des Rests wird üblicherweise von links nach rechts und in Richtung Aminoterminus T Carboxylterminus gezeigt. Die Position in den jeweiligen Aminosäure- bzw. Nucleotidbasensequenzen des sich am weitesten rechts befindlichen Rests und der Base ist durch die Zahlen am rechten Rand der Figur angegeben. Die von der DNA codierte Aminosäuresequenz der bevorzugten rekombinanten HIV-verwandten Proteine sind über dem Strukturgen, das jedes Protein codiert, angezeigt.
Die durch die Basen 15-718, 15-793, 15-796, 15-1021 und 15-821 in den Übersichten 1A, 1B, 1C, 1D bzw. 1E angegebenen Basensequenzen erläutern bevorzugte DNA-Segmente, von denen jedes ein 5'-terminales Ende des codierenden Stranges, das eine Nucleotidbasensequenz durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease Nde I produziert wurde, d.h. ein Nde I-cohäsives Ende und ein 3'-terminales Ende des codierenden Strangs, das eine Nucleotidbasensequenz, die durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease BamH I produziert wurde, d.h. ein BamH I-cohäsives Ende, besitzt.
Das in der Übersicht 1A erläuterte rekombinante HIV p24- Protein enthält eine Aminosäuresequenz entsprechend den Resten 1-232.
Das in der Übersicht 1B dargestellte HIV p24-gp41-Fusionsprotein (p24-A5) enthält einen Amino-terminalen HIV p24- Polypeptidteil, entsprechend den Resten 1-225, einen intermediären HIV gp41-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 226-248, einen Gly-Pro-Dipeptidlinkerteil, entsprechend den Resten 249-250, und einen Carboxyl-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 251-257.
Das in der Übersicht 1C dargestellte HIV p24-gp41-2-Fusionsprotein (p24-A2) enthält einen Amino-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 1-225, einen intermediären HIV gp41-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 226-249, einen Gly-Pro-Dipeptidlinkerteil, entsprechend den Resten 250-251, und einen Carboxyl-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 252-258.
Das in der Übersicht 1D erläuterte HIV p24-gp41-1,2,1,1- Fusionsprotein (p24-A5-A2-A5-A5) enthält einen Amino-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 1- 225, vier intermediäre HIV gp41-Polypeptidteile, entsprechend den Resten 226-248, 251-274, 277-299, und 302-324, vier Gly-Pro-Dipeptidlinkerteile, entsprechend den Resten 249-250, 275-276, 300-301 und 325-326, und einen Carboxyl- terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 327-333.
Das in der Übersicht 1E erläuterte HIV p24-gp41-1,2-Fusionsprotein (p24-A5-A2) enthält einen Amino-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 1-225, zwei intermediäre HIV gp41-Polypeptidteile, entsprechend den Resten 226-248 und 251-274, zwei Gly-Pro-Dipeptidlinkerteile, entsprechend den Resten 249-250 und 275-276 und einen Carboxyl-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, entsprechend den Resten 277-283.
In Figur 2 erläutert die Übersicht A die Konstruktion der rekombinanten pGEXp24-DNA zur Expression des rekombinanten HIV p24-Proteins in E. coli. Die manipulierten und durch das Konstruktionsverfahren produzierten rekombinanten DNAs sind in der Figur durch Kreise angegeben. Die Konstruktion wird über eine Reihe von Stufen, wie durch Pfeile, die die Kreise in der Figur verknüpfen, dargestellt, und wie ausführlich in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Begrenzungen und die Erkennungsstellen für die verwendeten Restriktionsenzyme sind auf den Kreisen durch Markierungslinien, die die Kreise unterbrechen, gekennzeichnet. Die relative Anordnung der einzelnen Gene und ihre Transkriptionsrichtung sind durch die Markierungspfeile in den Kreisen angegeben.
Die Übersicht B von Figur 2 erläutert die Konstruktion des rekombinanten DNA-Plasmids pGEXp24gp41 durch Ligierung eines Oligonucleotids, das die einzelne unterstrichene Aminosäuresequenz (Peptid A5) codiert, in die Restriktionsspaltstelle PpuM I, die innerhalb des HIV p24-Strukturgens von pGEXp24 angebracht ist. Die Ligierung führte zur Bildung eines Strukturgens, das in Figur 1B gezeigt ist, das funktionell an den pGEX7-Vektor geknüpft ist, und das HIV p24-gp41-Fusionsprotein codiert, das ebenfalls in der Figur 1B (Reste 1-257) gezeigt ist.
Die Figur 3 zeigt die SDS-PAGE von Lysaten von bakteriellen Zellen, die das pGEXp24-Plasmid enthalten. Die Zellen wurden 0 Minuten (Bahn 1), 0,5 Stunden (Bahn 2), 1 Stunde (Bahn 3) und 2 Stunden (Bahn 4) bei 42ºC gehalten.
Die Figur 4 zeigt die SDS-Gelelektrophorese des gereinigten rekombinanten p24-Polypeptids aus HIV-1-gag. Die Bahn A enthält Standarde mit niedrigem Molekulargewicht, gezeigt in Kilodalton, am linken Rand (Katalog Nr. 161,030; Biorad, Richmond, CA). Die Bahnen B und C enthalten 12 bzw. 24 Mikrogramm des im wesentlichen reinen erfindungsgemäßen rekombinanten HIV p24-Proteins.
Die Figur 5 erläutert einen Western Blot, der wie in Beispiel 3E beschrieben, hergestellt wurde, wobei ein SDS- PAGE-Gel von E. coli, das mit dem pGEXp24-Plasmid tranformiert wurde, verwendet wurde. Nach Induktion bei 42ºC wurden Zellysate bei 0 Minuten (Bahn 1), 30 Minuten (Bahn 2), 1 Stunde (Bahn 3) und 2 Stunden (Bahn 4) hergestellt.
Die Figur 6 erläutert die Carboxyl-terminalen Enden des rekombinanten HIV p24-Proteins und der HIV p24-gp41-Fusionsproteine gemäß der Erfindung. Der obere Teil der Figur zeigt die Aminosäuresequenz vom Amino- zum Carboxyl-terminalen Ende und in die Richtung von links nach rechts der Polypeptide A5 und A2. Der untere Teil zeigt die Aminosäuresequenz des Carboxylterminus der erfindungsgemäßen 5 HIV-Antigene: rekombinantes HIV p24-Protein (p24), und die HIV-Fusionsproteine p24gp41, p24gp41-2, p24gp41-1,2 und p24gp41-1,2,1,1.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäure:

Alle hier definierten Aminosäurereste liegen in der natürlichen L-Konfiguration vor. Entsprechend der Standardpolypeptidnomenklatur J. Biol. Chem., 243:3557-59, (1969) sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste wie in der folgenden Tabelle der Übereinstimmungen gezeigt: TABELLE DER ÜBEREINSTIMMUNGEN SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstaben 3-Buchstaben L-Tyrosin Glycin L-Phenylalanin L-Methionin L-Alanin L-Serin L-Isoleucin L-Leucin L-Threonin L-Valin L-Prolin L-Lysin L-Histidin L-Glutamin L-Glutaminsäure L-Tryptophan L-Arginin L-Asparaginsäure L-Asparagin L-Cystein
Es wird darauf hingewiesen, daß alle Sequenzen aus Aminosäureresten, die hier typischerweise als Sequenzen aus Resten bezeichnet werden, durch Formeln wiedergegeben sind, deren links-nach-rechts Orientierung in der üblichen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxylterminus ist.

Nucleotid:

eine monomere Einheit einer DNA oder RNA, bestehend aus einer Zuckereinheit (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff-haltigen heterocyclischen Base.
Die Base ist an die Zuckereinheit über den glycosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) gebunden, und die Kombination aus Base und Zucker ist ein Nucleosid. Wenn das Nucleosid eine Phosphatgruppe, die an die 3'- oder 5'- Position der Pentose gebunden ist, enthält, wird sie als Nucleotid bezeichnet. Eine Sequenz von funktionell verknüpften Nucleotiden wird typischerweise hier als "Basensequenz" bezeichnet, und sie wird hier durch eine Formel dargestellt, deren links-nach-rechts-Orientierung in der üblichen Richtung 5'-Terminus T 3'-Terminus ist.

Basenpaar (bp):

Eine Partnerschaft aus Adenin (A) mit Thymin (T) oder Cytosin (C) mit Guanin (G) in dem doppelsträngigen DNA-Molekül.

B. DNA-Segmente

In lebenden Organismen ist die Aminosäuresequenz eines Proteins oder Polypeptids über den genetischen Code direkt mit der Desoxyribonucleinsäure (DNA)-Sequenz des Strukturgens, das das Protein codiert, verbunden. So kann das Strukturgen als Aminosäuresequenz, d.h. als Protein oder Polypeptid, das es codiert, definiert werden.
Eine wichtige und gut bekannte Besonderheit des genetischen Codes ist dessen Redundanz. D.h. für die meisten Aminosäuren, die zur Herstellung von Proteinen verwendet werden, können mehr als ein codierendes Nucleotidtriplet (Codon) einen speziellen Aminosäurerest codieren oder bezeichnen. Daher kann eine Anzahl von verschiedenen Nucleotidsequenzen eine spezielle Aminosäuresequenz codieren. Solche Nucleotidsequenzen gelten als funktionell äquivalent, da sie zur Produktion der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen führen können. Gelegentlich kann eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in eine gegebene Nucleotidsequenz eingebaut werden. Jedoch beeinflußen solche Methylierungen die codierende Beziehung in keiner Weise.
In einer Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes DNA- Segment eine erste Nucleotidbasensequenz, die eine Ribosomenbindungsstelle definiert und eine Sequenz der Formel:
AGGAGGGTTTTTCAT besitzt. Die erste Sequenz ist funktionell an ihrem 3'- Ende an das 5'-Ende einer zweiten Nucleotidbasensequenz gebunden, die ein Strukturgen mit der Fähigkeit zur Expression eines rekombinanten HIV p24-Proteins definiert. Ein bevorzugtes DNA-Segment besitzt eine Basensequenz, die durch die Basensequenz, die in Figur 1A von der Basenposition 1 zu der Basenposition 711 oder 718 gezeigt ist, wiedergegeben wird. Bevorzugte DNA-Segmente umfassen weiterhin die Basensequenz TAATAA (eine Basensequenz, die für 2 benachbarte Stopsignale steht) in funktioneller Verknüpfung an das 3'-terminale Ende des Strukturgens. In bevorzugten Ausführungsformen sind die ersten und zweiten Nucleotidbasensequenzen bei Verknüpfung nicht länger als etwa 711 Basen und bevorzugte nicht länger als etwa 10.000 Basen. Zusätzlich codiert ein erfindungsgemäßes DNA-Segment kein anderes Protein oder einen antigenidentifizierbaren Teil davon, der von der gag-Region des HIV-Genoms codiert wird.
Der hier verwendete Ausdruck "rekombinantes HIV p24-Protein" bezeichnet ein Protein mit einer Länge von etwa 231 Aminosäureresten, das eine Aminosäuresequenz, die einem natürlich vorkommenden reifen HIV p24-Protein homolog ist, besitzt. Die Nucleotidbasenreste 16-18 codieren den terminalen Methioninrest, der in allen Übersichten der Figur 1 gezeigt ist, welcher die Initiation der Proteintranslation am ATG-Codon erleichtert, wie gut bekannt ist. Jedoch wird der Masse der exprimierten Proteine das Methionin während Proteintranslation und dem Processing abgespalten, so daß ein Protein produziert wird, das bei dem Aminosäurerest 2 (Prolin) beginnt. Ein rekombinantes HIV p24-Protein ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß es wasserlöslich ist, und keine antigenen HIV p17 oder p15 Determinanten exprimiert. Die Aminosäuresequenz eines bevorzugten rekombinanten HIV p24-Proteins ist in Figur 1A von Rest 2 bis Rest 232 gezeigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält ein erfindungsgemäßes DNA-Segment eine Nucleotidbasensequenz, die ein Strukturgen mit der Fähigkeit zur Expression eines HIV p24-gp41-Fusionsproteins definiert. Der Ausdruck "HIV p24- gp41-Fusionsprotein" bezeichnet ein Protein mit einem Amino-terminalen HIV p24-Polypeptidteil, der funktionell über eine Peptidbindung an seinem Carboxyl-terminalen Ende an einen HIV gp41-Polypeptidteil geknüpft ist. Der HIV p24-Polypeptidteil besitzt eine Aminosäuresequenz entsprechend einer Sequenz, die in Figur 1B gezeigt ist, von etwa Rest 2 bis etwa Rest 225. Das HIV p24-gp41-Fusionsprotein besitzt in seiner exprimierten Form eine Aminosäuresequenz, die bei Rest 2 (Prolin) beginnt, bei der der Aminoterminale Methioninrest während der Proteintranslation und des Processings, wie vorstehend für das exprimierte HIV p24-Protein, abgespalten wird. Der HIV gp41-Polypeptidteil besitzt eine Aminosäuresequenz, entsprechend einem Polypeptid mit der Fähigkeit, mit anti-HIV-gp41-Antikörpern eine Immunreaktion zu zeigen, d.h. ein Polypeptid, das eine HIV gp41-Antigenität zeigt (ein antigenes HIV gp41- Polypeptid). Polypeptide mit einer HIV gp41-Antigenität sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Vergleiche beispielsweise das U.S. Patent Nr. 4,629,783 (Cosand), das U.S. Patent Nr. 4,735,896 (Wang et al.) und Kennedy et al., Science, 231:1556-1559 (1986).
Ein bevorzugter HIV gp41-Polypeptidteil eines HIV p24- gp41-Fusionsproteins besitzt eine Aminosäuresequenz, die von der in Figur 1B gezeigten Aminosäuresequenz von Rest 226 bis Rest 248 oder von der in Figur 1C von Rest 226 bis Rest 249 gezeigten Sequenz entspricht.
In einer Ausführungsform enthält ein HIV p24-gp41-Fusionsprotein mehr als einen HIV gp41-Polypeptidteil, beispielsweise die Kombination aus zwei verschiedenen HIV gp41-Polypeptidteilen, wiedergegeben durch die in Figur 1D gezeigte Sequenz von Rest 226 bis Rest 324, oder die in Figur 1E gezeigte Sequenz von Rest 226 bis Rest 274.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält der HIV gp41-Polypeptidteil eines HIV p24-gp41-Fusionsproteins gemäß der Erfindung mindestens 10 Aminosäurereste, aber nicht mehr als etwa 35 Aminosäurereste und besitzt bevorzugt eine Länge von etwa 15 bis etwa 25 Resten.
In bevorzugten Ausführungsformen besitzt das erfindungsgemäße DNA-Segment, das einen Teil eines HIV p24-gp41-Fusionsproteins codiert, das den HIV p24-Polypeptidteil codiert, eine Nucleotidbasensequenz entsprechend einer Sequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, wie in Figur 1B von etwa Rest 1 bis etwa Rest 225 gezeigt, und bevorzugter eine Nucleotidbasensequenz entsprechend einer Basensequenz, wie in Figur 1B von Base 16 bis Base 690 gezeigt.
In bevorzugten Ausführungsformen besitzt das erfindungsgemäße DNA-Segment, das den Teil eines HIV p24-gp41-Fusionsproteins codiert, der den HIV gp41-Polypeptidteil codiert, eine Nucleotidbasensequenz entsprechend einer Sequenz, die eine Aminosäuresequenz codiert, wie in Figur 1B von Rest 226 bis Rest 248, in Figur 1C von Rest 226 bis Rest 249, in Figur 1D von Rest 226 bis Rest 324, oder in Figur 1E von Rest 226 bis Rest 274 gezeigt. Bevorzugter besitzt der Teil des DNA-Segments, der den HIV p24-gp41-Polypeptidteil codiert, ein Nucleotidbasensegment entsprechend in der Basensequenz der in Figur 1B von der Base 691 bis zur Base 759, in Figur 1C von der Base 691 bis zur Base 762, in der Figur 1D von Base 691 bis Base 987, oder in der Figur 1E von Base 691 bis Base 837 gezeigten Sequenz.
Bevorzugter besitzt das erfindungsgemäße DNA-Segment, das ein HIV p24-gp41-Fusionsprotein codiert, eine Nucleotidbasensequenz entsprechend der in (1) Figur 1B von Base 1 bis Base 786, Base 15 bis Base 786, Base 16 bis Base 786, Base 1 bis Base 793, Base 15 bis Base 793, oder Base 16 bis Base 793; in (2) Figur 1C von Base 1 bis Base 789, Base 15 bis Base 789, Base 16 bis Base 789, Base 1 bis Base 796, Base 15 bis Base 796 oder Base 16 bis Base 796; in (3) Figur 1D von Base 1 bis Base 1014, Base 15 bis Base 1014, Base 16 bis Base 1014, Base 1 bis Base 1021, Base 15 bis Base 1021 oder Base 16 bis Base 1021; oder in (4) Figur 1E von Base 1 bis Base 864, Base 15 bis Base 864, Base 16 bis Base 864, Base 1 bis Base 871, Base 15 bis Base 871 oder Base 16 bis Base 871 gezeigten Sequenz.
In bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes DNA-Segment an ein komplementäres DNA-Segment gebunden, wodurch ein doppelsträngiges DNA-Segment gebildet wird. Bevorzugt umfaßt ein erfindungsgemäßes doppelsträngiges DNA-Segment nicht mehr als etwa 800 Basenpaare, bevorzugt nicht mehr als etwa 5000 Basenpaare und bevorzugter nicht mehr als etwa 10.000 Basenpaare. Zusätzlich sollte darauf hingewiesen werden, daß ein erfindungsgemäßes doppelsträngiges DNA-Segment bevorzugt einen einzelsträngigen cohäsiven Schwanz an einem oder beiden seiner Enden besitzt.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Segment kann leicht aus einem isolierten Virus, das von HIV-infizierten Patienten erhalten wird, hergestellt werden, oder chemisch synthetisiert werden, beispielsweise nach dem Phosphotriesterverfahren von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981).
(Auf die Offenbarung des hier genannten Stands der Technik wird somit Bezug genommen.) Natürlich können bei der chemischen Synthese des Strukturgenteils beliebige Modifikationen einfach durch Substituieren der geeigneten Basen gegen diejenigen, die einen nativen Aminosäurerest codieren, erzeugt werden. Jedoch sind die DNA-Segmente einschließlich der Sequenzen, die einem in Figur 1A, 1B, 1C, 1D oder 1E gezeigten Segment identisch sind, bevorzugt.

C. Rekombinante DNA-Moleküle

Die Erfindung betrifft weiterhin eine rekombinante DNA (rDNA), die ein erfindungsgemäßes DNA-Segment in funktionelle Verknüpfung an einen Vektor umfaßt. Eine bevorzugte erfindungsgemäße rDNA ist dadurch gekennzeichnet, daß sie direkt in einem kompatiblen Wirt ein rekombinantes HIV p24-Protein oder HIV p24-gp41-Fusionsprotein exprimieren kann. Unter "direkter Expression" wird verstanden, daß die reife Polypeptidkette des Proteins durch Translation allein gebildet wird, im Gegensatz zur proteolytischen Spaltung von zwei oder mehreren terminalen Aminosäureresten aus einem größeren translatierten Vorläuferprotein. Bevorzugte erfindungsgemäße rDNAs sind die rDNA-Plasmide pGEXp24 und pGEXp24gp41, wie in den Figuren 2A bzw. 2B dargestellt, und die rDNA-Plasmide pGEXp24gp41-2 und pG- Exp24gp41-1,2, wie in Beispiel 1B beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül kann durch funktionelle Verknüpfung eines Vektors an ein erfindungsgemäßes DNA-Segment produziert werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet ein DNA- Molekül mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Zelle und an welches ein anderes DNA-Segment funktionell geknüpft werden kann, so daß die Replikation des angeknüpften Segments herbeigeführt wird. Vektoren mit der Fähigkeit, die Expression eines HIV p24-Proteins oder eines Strukturgens eines HIV p24-gp41-Fusionsproteins zu dirigieren, werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. So ist ein rekombinantes DNA-Molekül (rDNA) ein hybrides DNA-Molekül, welches mindestens zwei Nucleotidsequenzen, die normalerweise in der Natur nicht zusammen vorkommen, umfaßt.
Die Wahl des Vektors, an den ein erfindungsgemäßes DNA- Segment funktionell geknüpft wird, hängt direkt, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, von den gewünschten funktionellen Eigenschaften, d.h. der Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle ab, wobei dies Begrenzungen sind, die der Kunst der Konstruktion von rekombinanten DNA-Molekülen inhärent sind. Jedoch kann ein erfindungsgemäß betrachteter Vektor mindestens die Replikation und bevorzugt auch die Expression der rekombinanten HIV p24-Strukturgene oder der Strukturgene des HIV p24- gp41-Fusionsproteins, die in den DNA-Segmenten, an die er funktionell gebunden ist, enthalten sind, dirigieren.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt ein erfindungsgemäß betrachteter Vektor ein procaryotisches Replicon (Ori), d.h. eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit, die autonome Replikation und die extrachromosomale Aufrechterhaltung des rekombinanten DNA-Moleküls in einer procaryotischen Wirtszelle, wie einer Bakterienwirtszelle, die damit transformiert ist, zu dirigieren. Solche Replicons sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zusätzlich umfassen solche Ausführungsformen, die ein procaryotisches Replicon enthalten, typischerweise auch ein Gen, dessen Expression eine Arzneimittelresistenz einem bakteriellen Wirt, der damit transformiert wurde, verleiht. Typische Bakterienresistenzgene sind solche, die Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz verleihen.
Diejenigen Vektoren, die ein procaryotisches Replicon umfassen, können auch einem procaryotischen Promoter mit der Fähigkeit, die Expression (Transkription und Translation) des rekombinanten HIV p24-Strukturgens oder des Strukturgens des HIV p24-gp41-Fusionsproteins in einer damit transformierten bakteriellen Wirtszelle, wie E. coli, zu dirigieren, umfassen. Ein Promoter ist ein Element zur Kontrolle der Expression, das durch eine DNA-Sequenz gebildet wurde, das die Bindung der RNA-Polymerase und den Eintritt der Transkription erlaubt. Promotersequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, sind typischerweise in Plasmidvektoren, die geeignete Restriktionsspaltstellen zur Insertion eines erfindungsgemäßen DNA-Segments enthalten, vorhanden. Typisch für solche Vektorplasmide sind pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329, erhältlich von Biorad Laboratories (Richmond, CA), und pPL und pKK223, erhältlich von Pharmacia, Piscataway, N.J.
Eine Vielzahl von Verfahren wurden entwickelt, um DNA-Segmente an Vektoren über komplementäre cohäsive Enden funktionell zu verknüpfen. Beispielsweise können komplementäre homopolymere Abschnitte an das zu insertierende DNA-Segment und an die Vektor-DNA gebunden werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbindung zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen unter Bildung rekombinanter DNA-Moleküle angefügt.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsspaltstellen enthalten, bieten ein alternatives Verfahren, das DNA-Segment an die Vektoren zu knüpfen. Das DNA-Segment, das durch Restriktionsspaltung mit einer Endonuclease, wie vorstehend beschrieben, erzeugt wurde, wird mit der T4-Polymerase eines Bakteriophagen oder der DNA- Polymerase 1 von E. coli Enzyme, die überstehende einzelsträngige 3'-Enden mit ihren 3'-5'-exonucleolytischen Aktivitäten entfernen und die zurückgespaltenen 3'-Enden mit ihren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen, behandelt. Die Kombination dieser Aktivitäten erzeugt daher glattendige DNA-Segmente. Die glattendigen Segmente werden dann mit einem größeren molaren Überschuß an Linkermolekülen in Gegenwart eines Enzyms, das die Ligierung der glattendigen DNA-Moleküle katalysieren kann, wie der T4-DNA-Ligase eines Bakteriophagen, inkubiert. So sind die Reaktionsprodukte DNA-Segmente, die polymere Linkersequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor ligiert, der mit einem Enzym gespalten worden war, das Enden, die mit denjenigen des DNA-Segments kompatibel sind, produziert.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Restriktionsspaltstellen enthalten, sind im Handel von einer Vielzahl von Quellen erhältlich, einschließlich International Biotechnologies, Inc., Hew Haven, CT. Ebenso betrifft die Erfindung RNA-Äquivalente der vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle.

D. Transformierte Zellen und Kulturen

Die Erfindung betrifft auch eine procaryotische Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA- Molekül, bevorzugt einer rDNA mit der Fähigkeit, ein rekombinantes HIV p24 oder ein HIV p24-gp41-Fusionsprotein zu exprimieren, und bevorzugter dem rDNA-Plasmid pGEXp24, pGEXp24gp41, pGEXp24gp41-2 oder pGEXp24gp41-1,2 transformiert wurde. Bakterielle Zellen sind bevorzugte procaryotische Wirtszellen, und typischerweise sind sie ein E. coli-Stamm, wie beispielsweise der E. coli-Stamm DH5, erhältlich von Bethseda Research Laboratories, Inc., Bethseda, MD. Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül wird nach gut bekannten Verfahren durchgeführt, die typischerweise von dem verwendeten Vektortyp abhängen. Bezüglich der Transformation procaryotischer Wirtszellen vergleiche beispielsweise Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972); und Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Erfolgreich transformierte Zellen, d.h. Zellen, die ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül enthalten, können nach gut bekannten Techniken identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, die aus der Einschleusung einer erfindungsgemäßen rDNA stammen, unter Bildung monoclonaler Kolonien cloniert werden. Zellen aus diesen Kolonien können geerntet und lysiert werden, und ihr DNA-Gehalt kann auf das Vorhandensein der rDNA unter Verwendung eines Verfahrens, wie desjenigen von Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975) oder Berent et al., Biotech., 3:208 (1985) beschrieben ist, untersucht werden.
Zusätzlich zum direkten Assay auf das Vorhandensein von rDNA kann die erfolgreiche Transformation durch gut bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA die Expression von HIV p24 dirigieren kann. Beispielsweise produzieren erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformierte Zellen Proteine, die die HIV-Core (p24)-Antigenität zeigen. Beispiele von vermutlich transformierten Zellen werden gewonnen, und auf das Vorhandensein von HIV p24 unter Verwendung von für dieses Antigen spezifischen Antikörpern getestet, wobei solche Antikörper auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.
So betrifft zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst die Erfindung auch eine Kultur solcher Zellen, bevorzugt eine monoclonale (clonal homogen) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoclonalen Kultur abgeleitet ist, in einem Nährmedium. Bevorzugt enthält die Kultur auch ein Protein, das die HIV p24-Antigenität zeigt, und bevorzugter wasserlösliches HIV p24.
Nährmedien, die zur Züchtung der transformierten Wirtszellen nützlich sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können aus mehreren Handelsquellen bezogen werden.

E. Verfahren zur Produktion von rekombinanten HIV p24 und HIV p24-gp41-Fusionsproteinen

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von rekombinanten erfindungsgemäßen HIV p24- und HIV p24-gp41-Fusionsproteinen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Kultur angesetzt, welche ein Nährmedium, enthaltend Wirtszellen, bevorzugt E. coli-Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurden, das ein rekombinantes HIV p24-Protein oder HIV p24-gp41-Fusionsprotein exprimieren kann, enthält. Die Kultur wird für eine Zeitspanne, die ausreicht, daß die transformierten Zellen das rekombinante HIV p24-Protein oder HIV p24-gp41- Fusionsprotein exprimieren, gehalten. Das exprimierte Protein wird dann aus der Kultur isoliert.
Jedoch enthält, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, das exprimierte isolierte Protein aus Gründen des zellulären Processings typischerweise keinen Amino-terminalen Methioninrest, der auf dem anfänglichen Translationsprodukt vorhanden ist.
Verfahren zur Isolierung eines exprimierten Proteins aus einer Kultur sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, und umfassen die Fraktionierung des Protein-haltigen Teils der Kultur unter Verwendung gut bekannter biochemischer Techniken. Beispielsweise können die Verfahren der Gelfiltration, Gelchromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese, des Ionenaustauschs, Affinitätschromatographie und dergleichen, wie sie für Proteinfraktionierungen bekannt sind, verwendet werden, um die in der Kultur vorhandenen exprimierten Proteine zu isolieren. Zusätzlich können immunchemische Verfahren, wie Immunaffinität, Immunadsorption und dergleichen unter Verwendung von gut bekannten Verfahren, durchgeführt werden.

F. Rekombinantes HIV p24-Protein, HIV p24-gp41- Fusions proteine und HIV p24-A5-Konjugatpräparate

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Präparat, enthaltend ein HIV p24-Protein, das im wesentlichen sowohl von procaryotischen Antigenen (d.h. wirtszellspezifischen Antigenen) als auch anderen HIV-verwandten Proteinen frei ist.
Unter "im wesentlichen frei" wird verstanden, daß das Verhältnis von HIV p24-Protein zu den wirtszellspezifischen Antigenen mindestens 1000:1, bevorzugt 10.000:1, beträgt.
Das Vorhandensein und die Menge des verunreinigenden Proteins in einem rekombinanten Proteinpräparat kann nach gut bekannten Verfahren bestimmt werden. Bevorzugt wird der Probe des Präparats einer Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen, um das rekombinante Protein von allen vorhandenen Proteinverunreinigungen abzutrennen. Das Verhältnis der Mengen der Proteine, die in der Probe vorhanden sind, wird dann durch eine densitometrische Softlaserabtastung, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, bestimmt. Vergleiche Guilian et al., Anal. Biochem., 129:277-287 (1983).
Bevorzugt besitzt ein in dem Präparat vorhandenes HIV p24- Protein eine Aminosäuresequenz der Figur 1A von Rest 1 oder 2 bis Rest 232.
Ein HIV p24-gp41-Fusionsprotein wird erfindungsgemäß betrachtet, das eine Aminosäuresequenz entsprechend von seinem Amino-terminalen Ende bis zu seinem Carboxyl-terminalen Ende der in der Figur 1B von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 248 gezeigten Aminosäuresequenz, der in Figur 1C von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 249 gezeigten Sequenz, der in Figur 1D von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 324 gezeigten Aminosäuresequenz oder der in Figur 1E von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 274 gezeigten Aminosäuresequenz besitzt.
Ein bevorzugtes HIV p24-gp41-Fusionsprotein besitzt eine Sequenz entsprechend und bevorzugter identisch der Sequenz in Figur 1B von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 257, in Figur 1C von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 258, in Figur 1E von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 333, oder in Figur 1E von Rest 1 oder 2 bis etwa Rest 283. Ebenfalls betrachtet werden Präparate, enthaltend ein erfindungsgemäßes HIV p24-gp41- Fusionsprotein.
Bevorzugte erfindungsgemäße HIV-Antigene besitzen einen gemeinsamen Amino-terminalen Anteil, entsprechend bezüglich der Aminosäuresequenz der Sequenz in Figur 1A von Rest 1 oder 2 bis Rest 224 (d.h. ein von p24 abgeleiteter Teil) und besitzen variierende Carboxyl-terminale Enden, bevorzugt umfassend eine Aminosäuresequenz mit der Fähigkeit, immunologisch ein HIV gp41-Epitop nachzuahmen. Beispielsweise sind bevorzugte HTV p24-gp41-Fusionsproteine in Figur 6 mit mehreren in Frage kommenden Carboxyl-terminalen Enden dargestellt.
In bevorzugten Präparaten liegt das HIV p24-Protein, das HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder das HIV p24-A5-Konjugat, wie vorstehend beschrieben, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vor.
Der hier verwendete Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" bezeichnet Moleküleinheiten und Präparate, die keine allergische oder ähnliche unpassende Reaktion, wie Magenstörungen, Schwindel und dergleichen bei Verabreichung an ein Säugetier hervorrufen. Der pharmazeutisch verträgliche Träger kann eine Vielzahl von Formen, je nach der beabsichtigten Verwendung des Präparats, annehmen. In jedem Fall enthalten die Präparate mindestens etwa 0,001% bis etwa 99% an rekombinantem HIV p24-Protein, HIV p24-gp41- Fusionsprotein oder HIV p24-A5-Konjugat als Wirkstoff, typischerweise in einer Konzentration von etwa 10 ug/ml.
Als Beispiel kann ein erfindungsgemäßes rekombinantes HIV p24-Protein in flüssigen Präparaten, wie sterilen Suspensionen oder Lösungen, oder als isotone Präparate, die geeignete Konservierungsstoffe enthalten, verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßes rekombinantes HIV p24-Protein, HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder HIV p24-A5-Konjugat können auch in Form von Liposomen verwendet werden. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, leiten sich Liposomen im allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen ab. Liposomen sind aus hydratisierten Flüssigkristallen in Form von einer oder mehreren Lamellen gebildet, die in einem wäßrigen Medium dispergiert sind. Alle nicht-toxischen physiologisch verträglichen und metabolisierbaren Lipide mit der Fähigkeit zur Liposomenbildung können verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Präparate in Liposomenform können zusätzlich zu einem rekombinanten HIV p24-Protein, HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder HIV p24-A5-Konjugat, Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Exipientien und dergleichen enthalten. Die bevorzugten Lipide sind sowohl natürliche als auch synthetische Phospholipide und Phosphatidylcholine (Lecithine).
Verfahren zur Bildung von Liposomen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vergleiche beispielsweise Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Bd. XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), Seite 33 ff.
Ein Präparat, das zur Induktion von anti-p24-Antikörpern in einem Säugetier nützlich ist, kann ein erfindungsgemäßes HIV p24-Protein, HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder HIV p24-A5-Konjugat, das in das Präparat als eine neutralisierte pharmazeutisch verträgliche Salzform formuliert ist, sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids oder Antikörpermoleküls), die mit anorganischen Salzen, wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet sind. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet sind, können auch von anorganischen Basen, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet sein.
Das das HIV p24-Protein-, HIV p24-gp41-Fusionsprotein- oder HIV p24-A5-Konjugat-enthaltende Präparat wird üblicherweise parenteral, z.B. durch Injektion einer Einheitsdosis, verabreicht. Der Ausdruck "Einheitsdosis" bedeutet im Zusammenhang mit einem Präparat gemäß der Erfindung physikalisch getrennte Einheiten, die als Einzeldosen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die so berechnet ist, daß sie die gewünschte therapeutische Wirkung ergibt, zusammen mit dem benötigten Träger enthält.
Das Präparat wird auf eine mit der Dosisformulierung verträgliche Weise und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Patienten, der Fähigkeit des Immunsystems des Patienten, den Wirkstoff zu verwenden, und dem Grad der gewünschten Immunantwort ab. Genaue Mengen des Wirkstoffs, die verabreicht werden müssen, hängen von dem Urteil des praktizierenden Arztes ab und sind für jedes Individuum typisch. Jedoch liegen geeignete Dosisbereiche in der Größenordnung von 1 bis 10 ug an rekombinantem HIV p24-Protein, HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder HIV p24-A5-Konjugat pro Kilogramm Körpergewicht, je nach dem Verabreichungsweg. Typischerweise beträgt eine Einheitsdosis für einen erwachsenen Menschen 100-200 ug bei Verabreichung durch parenterale Injektion.
Es ist zu verstehen, daß die hier beschriebene pharmazeutische Formulierung zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Trägerinhaltsstoffen, sofern geeignet, ein oder mehrere weitere Inhaltsstoffe, wie Verdünnungsmittel, Puffer, geschmacksgebende Bindemittel, grenzflächenaktive Mittel, Verdicker, Gleitmittel, Konservierungsstoffe (einschließlich Antioxidantien) und dergleichen, und Substanzen, die aufgenommen wurden, um die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isoton zu machen, enthalten kann.

G. HIV p24-A5-Konjugat

Die Erfindung betrifft ein antigenes Konjugat, umfassend ein erfindungsgemäßes HIV p24-Protein in funktioneller Verknüpfung über eine Aminosäureseitengruppe an ein Polypeptid mit der Bezeichnung A5. Das Polypeptid A5 besitzt eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel:
Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu- Ile-Cys-Thr-Thr-Ala-Val-Pro-Trp-Asn-Cys.
Das Polypeptid A5 enthält als seine Aminosäuresequenz einen Teil der HIV gp41-Aminosäuresequenz und umfaßt bei Verwendung in einem HIV p24-A5-Konjugat auch den in der vorstehenden Formel am Carboxylterminus gezeigten Cystein (Cys)-Rest, um die funktionelle Verknüpfung an ein erfindungsgemäßes HIV p24-Protein zu erleichtern.
Verfahren zur funktionellen Verknüpfung von Polypeptiden über eine Aminosäureseitengruppe sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese Verfahren umfassen die Verknüpfung über ein oder mehrere Typen von funktionellen Gruppen an verschiedene Seitenketten und führen dazu, daß das jeweilige Polypeptidrückgrat covalent verknüpft (gekoppelt), aber mindestens durch eine Seitengruppe getrennt ist.
Nützliche funktionelle Gruppen für die Seitenkette umfassen &epsi;-Aminogruppen, β- oder γ-Carboxylgruppen, Thio(-SH)- Gruppen und aromatische Ringe (z.B. Tyrosin und Histidin). Verfahren zur Verknüpfung der Polypeptide unter Verwendung jeder der vorstehenden funktionellen Gruppen sind in Erlanger, Method of Enzymology, 70:85 (1980), Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., Bd. 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) und dem U.S. Patent Nr. 4,493,795 (Nestor et al.) beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Zusätzlich kann die ortsspezifische Kopplungsreaktion, wie in Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1985) beschrieben, so durchgeführt werden, daß die biologische Aktivität der Polypeptide nicht wesentlich verringert wird.
Ferner können, wie auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, sowohl das HIV p24 als auch das Polypeptid A5 in ihrer nativer Form verwendet werden, oder ihr Gehalt an funktionellen Gruppen kann durch Succinylierung der Lysinreste oder Umsetzung mit Cysteinthiolacton modifiziert werden. Eine Sulfhydrylgruppe kann auch in beide Polypeptide durch Umsetzung der Aminfunktionen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-(3-Dithiopyridyl)propionat eingearbeitet werden. Die Polypeptide können auch durch Einbau von Spacerarmen, wie Hexamethylendiamin oder anderer bifunktioneller Moleküle ähnlicher Größe modifiziert werden, um die Verknüpfung zu erleichtern.
Besonders nützlich zur Bildung von Bindungen zur Kopplung des HIV p24-Proteins und des Polypeptids A5 sind eine große Anzahl von heterobifunktionellen Reagentien, die eine Disulfidbindung am Ende einer funktionellen Gruppe und eine Peptidbindung am anderen Ende erzeugen, einschließlich N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP). Dieses Reagens erzeugt eine Disulfidbindung zwischen sich selbst und einem Cysteinrest in einem Protein und eine Amidbindung über eine &epsi;-Aminogruppe auf einem Lysin oder einer anderen freien Aminogruppe in dem anderen. Eine Vielzahl solcher Disulfid/Amid-bildenden Mittel ist bekannt. Vergleiche beispielsweise Immun. Rev., 62:185 (1982). Andere bifunktionelle Kopplungsreagentien bilden eher ein Thioester als eine Disulfidbindung. Viele dieser Thioester-bildenden Mittel sind im Handel erhältlich und umfassen reaktive Ester von 6-Maleimidocapronsäure, 2- Bromessigsäure, 2-Iodessigsäure, 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure und dergleichen. Die Carboxylgruppen können durch ihre Kombination mit Succinimid oder 1-Hydroxy-2-nitro-4-sulfonsäure, Natriumsalz, aktiviert werden. Das besonders bevorzugte Kopplungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren ist Succinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), erhalten von Pierce Company, Rockford, IL. Die vorstehende Liste soll nicht erschöpfend sein, und Modifikationen der aufgeführten Verbindungen können natürlich verwendet werden.
Das Polypeptid A5 kann nach jeder beliebigen Technik, die einem Fachmann auf dem Polypeptidgebiet bekannt ist, synthetisiert werden. Die Techniken der synthetischen Chemie, wie die Festphasensynthese vom Merrifield-Typ, sind aus Gründen der Reinheit, der Antigenspezifität, der Freiheit von unerwünschten Nebenprodukten, der Leichtigkeit der Produktion und dergleichen bevorzugt, und können nach Verfahren, die in Merrifield et al, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) und Houghten at al., Int. J. Pest. Prot. Res., 16:311-320 (1980) beschrieben sind, durchgeführt werden. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung vieler Techniken, die verfügbar sind, findet sich in J.M. Steward und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, 2. Auflage, 1976 und J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, Seite 46, Academic Press (New York), 1983 für die Festphasenpeptidsynthese und von E. Schroder und K. Kubke, "The peptides", Bd. 1, Academic Press (New York), 1965 für die klassische Synthese in Lösung, wobei auf jede Druckschrift hiermit Bezug genommen wird.

H. Diagnosesysteme

Ein erfindungsgemäßes Diagnosesystem in Form eines Kits umfaßt in einer für mindestens einen Assay ausreichenden Menge ein erfindungsgemäßes HIV p24-Protein-Präparat, ein erfindungsgemäßes HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder ein erfindungsgemäßes HIV p24-A5-Konjugat als separat abgepacktes Reagens. Die Gebrauchsanleitungen für das abgepackte Reagens werden ebenfalls typischerweise aufgenommen.
Die "Gebrauchsanweisung" umfaßt typischerweise einen faßbaren Ausdruck, der die Reagenskonzentration oder mindestens einen Parameter des Assayverfahrens, wie die relativen Mengen der Reagentien und der Probe, die vermischt werden sollen, die Zeitspannen, während derer die Gemische Reagens/Probe gehalten werden sollen, die Temperatur, Pufferbedingungen und dergleichen, bestimmt.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt ein erfindungsgemäßes Diagnosesystem weiterhin einen Marker oder Indikatoren mit der Fähigkeit die Bildung eines Komplexes, der ein rekombinantes HIV p24-Protein enthält, anzuzeigen.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Marker" und "Indikatoren" bezeichnen in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals zur Anzeige des Vorhandenseins eines Komplexes beteiligt sind. "In vivo"-Marker oder Indikatoren sind solche, die im Körper eines Menschen nützlich sind. Jeder beliebige Marker oder Indikator kann an ein exprimiertes Protein, Polypeptid oder Antikörpermolekül, das Teil eines Antikörpers oder monoclonalen Antikörperpräparats gemäß der Erfindung ist, geknüpft werden oder darin eingearbeitet werden oder getrennt verwendet werden, und diese Atome oder Moleküle können allein oder zusammen mit zusätzlichen Reagentien verwendet werden. Solche Marker sind in der Chemie der klinischen Diagnostik als solche gut bekannt und machen einen Teil dieser Erfindung nur insoweit aus, als sie mit sonst neuen Proteinen, Verfahren und/oder Systemen verwendet werden.
Das Verknüpfen von Markern, d.h. das Markieren von Polypeptiden und Proteinen, ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können durch ein Hybridom produzierte Antikörpermoleküle durch metabolischen Einbau von Radioisotop-haltigen Aminosäuren, die als Komponente in dem Kulturmedium angeboten werden, markiert werden. Vergleiche beispielsweise Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Die Techniken der Proteinkonjugation oder Kopplung über aktivierte funktionelle Gruppen sind besonders anwendbar. Vergleiche beispielsweise Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Bd. 8 Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) und das U.S. Patent Nr. 4,493,795.
Die Diagnosesysteme können auch ein spezielles Bindemittel, bevorzugt als getrennte Packung, enthalten. Ein "spezielles Bindemittel" ist eine Moleküleinheit mit der Fähigkeit zur selektiven Bindung einer Reagensart der Erfindung, aber ist selbst kein erfindungsgemäßes Proteinexpressionsprodukt, Polypeptid oder Antikörpermolekül. Beispiele für spezifische Bindungsmittel sind Antikörpermoleküle, Komplementproteine oder Fragmente davon, Protein A und dergleichen. Bevorzugt kann das spezifische Bindemittel das rekombinante Protein binden, wenn das Protein als Teil eines Komplexes vorhanden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindemittel markiert. Wenn das Diagnosesystem ein spezifisches Bindemittel, das nicht markiert ist, umfaßt, wird das Mittel typischerweise als Mittel oder Reagens zur Amplifikation verwendet. In diesen Ausführungsformen kann das markierte spezifische Bindemittel spezifisch das Mittel zur Amplifikation binden, wenn das Mittel zur Amplifikation an einen die Reagensart enthaltenden Komplex gebunden ist.
Die erfindungsgemäßen Diagnosekits können für einen "ELISA" verwendet werden, um das Vorhandensein oder die Menge von anti-HIV p24-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, wie Serum, Plasma oder Speichel, nachzuweisen. "ELISA" bezeichnet einen Enzym-linked Immunosorbentassay, dem ein an eine feste Phase gebundener Antikörper oder Antigen und ein Enzymantigen- oder Enzymantikörperkonjugat verwendet werden, um die Menge eines Antigens oder Antikörpers, die in einer Probe vorhanden ist, nachzuweisen oder quantitativ zu bestimmen. Eine Beschreibung der ELISA-Technik findet sich in Kapitel 22 der 4. Auflage von Basic and Clinical Immunology von D.P. Sites et al., veröffentlicht von Lange Medical Publications of Los Altos, CA (1982) und in den U.S. Patenten Nr. 3,654,090; Nr. 3,850,752; und Nr. 4,016043, worauf hiermit Bezug genommen wird.
So kann in bevorzugten Ausführungsformen das erfindungsgemäße HIV p24-Protein, HIV p24-gp41-Fusionsprotein oder HIV p24-A5-Konjugat an eine feste Matrix gebunden werden, wodurch ein fester Träger gebildet wird, der getrennt in den erfindungsgemäßen Diagnosesystemen abgepackt wird.
Das Reagens wird typischerweise an die feste Matrix durch Adsorption aus einem wäßrigen Medium gebunden, obwohl andere Verfahren zur Bindung, die einem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden können.
Nützliche feste Matrices sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Solche Materialien umfassen das vernetzte Dextran, das unter dem Warenzeichen SEPHADEX von Pharmacia Fine chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist; Agarose; Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von etwa 1 u bis etwa 5 mm, erhältlich von Abbott Laboratories of North Chicago, IL; Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztes Polyacrylamid, Nitrocellulose- oder Nylongewebe, wie Folien, Streifen oder Schaufeln; oder Reagensgläser, Platten, oder die Kavitäten einer Mikrotiterplatte, wie solche, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt sind.
Das HIV p24-Protein, HIV p24-gp41-Fusionsprotein, p24-A5- Konjugat, markierte spezifische Bindemittel oder Mittel zur Amplifikation jedes beliebigen hier beschriebenen Diagnosesystems können in Lösung als flüssige Dispersion oder als im wesentlichen trockenes Pulver, z.B. in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden. Wenn das Indikatormittel ein Enzym ist, kann das Substrat des Enzyms ebenfalls in einer getrennten Packung eines Systems bereitgestellt werden. Ein fester Träger, wie die vorstehend beschriebene Mikrotiterplatte, und ein oder mehrere Puffer können ebenfalls als getrennt abgepackte Elemente in diesem diagnostischen Assaysystem aufgenommen sein.
Die hier im Zusammenhang mit den Diagnosesystemen diskutierten Packungen sind diejenigen, die üblicherweise in Diganosesystemen verwendet werden. Solche Packungen umfassen Glas- und Plastik (z.B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat)-Flaschen, Ampullen, Umhüllungen aus Kunststoff oder laminierter Kunststoffolie und dergleichen.

Beispiele

Die nachstehenden Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise begrenzen.

1. Produktion der rekombinanten DNA-Moleküle

A. Isolierung des p24-Gens aus dem Gag-Gen und dessen Einschleusung in einen Expressionsvektor

Die gag-Region aus dem Plasmidclon pHXB2CG von HTLV IIIB (erhalten von Dr. Robert Gallo, National Cancer Institute, Bethseda, MD) wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoR V des Plasmids pHXB2CG isoliert, und das so erhaltene 2,86 Kilobasenfragment wurde isoliert und durch Ligierung in die EcoRV-Spaltstelle eines modifizierten pUC8-Vektors (pUC8NR) insertiert, wodurch das Plasmid pUC- GAG gebildet wurde (siehe Stufe 1 der Figur 2A).
Das Plasmid (pUCGAG) wurde mutiert, wodurch ein Translationsstartcodon ATG und eine Restriktionsspaltstelle für das Enzym Nde I (CATATG) am Beginn des p24-Strukturgens von gag durch die folgende Reihe von Manipulationen gebildet wurde (zusammengefaßt in Stufe 2 von Figur 2A). Nach Transformation von pUCGAG in den methylierungsdefekten dam-Stamm von E. coli, NEB, wurde eine Lücke in der pUC- GAG-DNA am p24-Aminoterminus durch Spalten mit den Restriktionsenzymen ClaI und PstI erzeugt, wodurch pUCGAG mit Lücken gebildet wurde, dem das kleinere DNA-Segment vom p24-Aminoterminus fehlte. 10 ug der pUCGAG-DNA mit Lücken und 10 ug der mit dem Restriktionsenzyin EcoR I gespaltenen pUCGAG-DNA wurden beide einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterworfen, und die DNA-Fragmente wurden jeweils separat von dem Agarosegel durch Elektroelution (unter Verwendung eines Probenkonzentrators, Modell 1750 von ISCO, Lincoln, NE) isoliert, vereinigt, zweimal mit einem 50/50-Gemisch aus Phenol und Chloroform extrahiert und unter Zugabe von Natriumacetat (Endkonzentration 100 mM) und drei Volumina Ethanol präzipitiert.
Die präzipitierten DNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen und in einer Konzentration von 25 ug pro ml in Wasser resuspendiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an Assoziierungspuffer (80% Formamid, 100 mM Tris, pH 8,0, 25 mM EDTA) wurden die resuspendierten DNAs durch 5-minütiges Kochen denaturiert und 30 Minuten lang bei 37ºC reassoziieren gelassen. Die reassoziierten DNAs wurden mit einem gleichen Volumen an Wasser verdünnt und in Ethanol, wie vorstehend beschrieben, präzipitiert, um die präzipitierte reassoziierte DNA zu bilden.
Die Nde I und ATG-Sequenzen wurden funktionell an den Aminoterminus des p24-Gens unter Verwendung des folgenden synthetischen Oligonucleotids:
5' CCAAAATTACCATATGCCAATCGTGCAGAAC 3'
gebunden. Die 10 Nucleotide an dem 5'-Ende und die 9 Nucleotide an dem 3'-Ende dieses Oligonucleotids sind der HTLV IIIB DNA-Sequenz (University of Wisconsin genetic database) homolog. Die dazwischenliegenden Nucleotide wurden so gewählt, um die Bildung von Sekundärstrukturen in Oligonucleotid und in der RNA, die vermutlich aus dieser Sequenz während der Expression dieser Sequenzen in E. coli gebildet wird, zu minimieren.
40 picomol des vorstehenden Oligonucleotids (synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler) wurden phosphoryliert (wie in Molecular Cloning von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seite 125, beschrieben) und mit 2,5 ug der vorstehend beschriebenen präzipitierten reassoziierten DNA vermischt. Die vermischten DNAs wurden durch 5-minütiges Erhitzen des Gemisches auf 65ºC und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur im Verlauf von einer Stunde in Ligasepuffer (a.a.O., S. 474) reassoziiert. Das so erhaltene DNA-Molekül (d.h. eine Matritze mit Lücken), das die vorstehend beschriebene präzipitierte reassoziierte DNA und die Matritze mit den Lücken mit dem reassoziierten Oligonucleotid enthielt, wurde dann in vitro in Ligasepuffer durch 3- stündige Inkubation bei 15ºC in Gegenwart von 25 umol jedes Desoxynucleosidtriphosphats, 50 umol Adenosintriphosphat und 5 Einheiten T4 DNA-Ligase und 1 Einheit Klenow- Fragment der E. coli DNA-Polymerase repariert.
Nach Transformation in kompetente Zellen des E. coli-Stammes JM83 wurden die Bakterienkolonien durch Hybridisierung an ein radioaktiv markiertes Oligonucleotid nach Übertragen der Kolonien auf Nitrocellulose (a.a.O. Seiten 250- 251, 313-329) abgesucht. Eine einzelne Kolonie wurde nach diesem Verfahren isoliert, die die folgende Plasmid-DNA- Sequenz für die Amino-terminale Sequenz des p24-Gens (pUCp40, Figur 2A) ergab:
Met Pro Ile Val ...
5' taccat ATG CCA ATC GTG ... 3'
Das DNA-Fragment aus pUCp40, das das nachstehend als p40 bezeichnete p24-p15-Fusionsprotein codierte und zwischen der durch die vorstehende Mutagenese erzeugten Nde I-Restriktionsspaltstelle und der EcoRV-Spaltstelle an dem Carboxy-terminalen Ende des gag-Gens angeordnet war, wurde dadurch isoliert, das zuerst das Plasmid pUCp40 mit Nde I und EcoR V gespalten wurde, und anschließend die getrennten Fragmente auf Agarosegelen getrennt, extrahiert und präzipitiert wurden.
Die Plasmid pGEX7-DNA wurde durch Spaltung mit Nde I und EcoR V linearisiert. Das Plasmid pGEX7 ist ein bakterieller Expressionsvektor, der als Plasmid PHAGE 38 bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 9. Juni 1988 hinterlegt wurde und die ATCC-Hinterlegungsnummer 40464 erhalten hatte.
Es enthält einen Promoter des Bakteriophagen lambda (PL), das Gen für dessen temperatursensitiven Repressor (CI 857), eine Konsensusbakterienribosomenbindungsstelle und einen Replikationsorigin (ori).
Die Spaltung von pGEX7 mit Nde I und EcoR V führt zur Erzeugung von zwei linearen Fragmenten, von denen eines die ampr und die CI857-Gene und den Replikationsorigin enthält und cohäsive Nde I und EcoR V-Enden enthält. Das vorstehend beschriebene, das p40-Gen enthaltende Nde I/EcoR V- Restriktionsfragment von puCp40, wurde dann an das das pGEX7 Nde I/EcoR V ampr-Gen enthaltende Fragment über ihre jeweiligen Nde I- bzw. EcoR V-Enden unter Bildung des Plasmids pGEXp40 ligiert (Stufe 3, Figur 2A).
Die Sequenzen von pGEXp40, die p15 codieren, wurden aus dem Plasmid pGEXp40 durch Restriktionsspaltung mit den Enzymen PpuM I und BamH I entfernt. Danach wurde das 3'-Ende des p24-Gens rekonstruiert, wie durch Stufe 4 in Figur 2A zusammengefaßt ist, durch Einschleusen der folgenden zwei synthetischen Oligonucleotide (synthetische Linker), die PpuM I und BamH I-Restriktionsspaltstellen und die Translationsstopcodons rekonstruiert:
5' GACCCGGCCATAAGGCAAGAGTTTTGTAATAAG 3'
3' GGCCGGTATTCCGTTCTCAAAACATTATTCCTAG 5'.
Das so erhaltene rDNA-Plasmid (pGEXp24) codiert die folgende Sequenz am Carboxyl-terminalen Ende von p24.
Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu * *
5' GA CCC GGC CAT AAG GCA AGA GTT TTG TAA TAA G 3'.
So enthält das rDNA-Plasmid pGEXp24 erste und zweite doppelsträngige DNA-Segmente, die funktionell über die cohäsiven Nde I und BamH I-Enden, die auf beiden Segmenten vorhanden sind, verknüpft sind. Das erste Segment enthält das Strukturgen für das rekombinante HIV p24-Protein und besitzt eine Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1A von Base 15, an dessen Nde I-Terminus (Ende des 5'-codierenden Stranges) bis Base 718, an dessen BamH I-Terminus (Ende des 3'-codierenden Stranges). Das zweite Segment ist der Expressionsvektor und ist das das Ampicillinresistenzgen (ampr) enthaltende Nde I/BamH I-Restriktionsfragment von pGEX7.

B. Produktion eines Sturkturgens, das ein Fusionsprotein codiert

pGEXp24gp41:

Das in Beispiel 1A produzierte Plasmid pGEXp24 wurde mit dem Restriktionsenzym PpuM I unter Bildung eines linearisierten pGEXp24 DNA-Segments mit cohäsiven PpuM I-Enden gespalten. Ein DNA-Segment mit cohäsiven PpuM I-Enden, das eine Aminosäuresequenz mit der Fähigkeit immunologisch ein HIV gp41-Epitop zu imitieren (Polypeptid A5), codiert, wurde an die linearisierte pGEXp24 DNA unter Bildung des rekombinanten DNA-Plasmids pGEXp24gp41 ligiert. Als Ergebnis der Ligierung enthält das Plasmid pGEXp24gp41 das Strukturgen für das HIV p24-gp41-Fusionsprotein (p24-A5), das durch die in Figur 1B von der Base 16 bis zur Base 786 gezeigte Nucleotidsequenz definiert ist. D.h. pGEXp24gp41 ist ein Plasmid, das ein erstes und ein zweites doppelsträngiges DNA-Segment in funktioneller Verknüpfung über die auf beiden Segmenten vorhandenen cohäsiven Nde I und BamH I-Enden enthält. Das erste Segment enthält das das HIV p24-gp41-Fusionsprotein codierende Strukturgen und besitzt eine Nucleotidbasensequenz der Figur 1B der Base 15, an dessen Nde I-Terminus (Ende des 5'- codierenden Stranges) bis zur Base 793, an dessen BamH I- Terminus (Ende des 3'-codierenden Stranges). Das zweite Segment ist das das ampr-Gen enthaltende Nde I/BamH I-Restriktionsfragment des Plasmids pGEX7. Das Strukturgen für das HIV p24-gp41-Fusionsprotein ist funktionell an die pGEX7-Expressionskontrollelemente, z.B. den λ-Promoter gebunden, und wird daher bei Transformation eines kompatiblen bakteriellen Wirts mit pGEXp24gp41 exprimiert.

pGEXp24gp41-2:

Ein linearisiertes pGEXp24 DNA-Segment mit cohäsiven PpuM I-Enden wurde, wie vorstehend für pGEXp24gp41 beschrieben, hergestellt. Ein DNA-Segment mit cohäsiven PpuM I-Enden, das eine Aminosäuresequenz mit der Fähigkeit immunologisch ein HIV Typ 2 (HIV-2)-Epitop (Polypeptid A2) zu imitieren, codiert, wurde an die linearisierte pGEXp24 DNA unter Bildung des rekombinanten Plasmids pGEXp24gp41-2 ligiert. Als Ergebnis der Ligierung enthält das Plasmid pGEXp24gp41-2 das Strukturgen für das HIV p24-gp41-Fusionsprotein (p24-A2), das durch die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1C von Base 16 bis Base 789 definiert ist. D.h. pGEXp24gp41-2 ist ein Plasmid, das ein erstes und ein zweites doppelsträngiges DNA-Segment in funktioneller Verknüpfung über die auf beiden Segmenten vorhandenen cohäsiven Nde I und BamH I-Enden enthält. Das erste Segment enthält das das HIV p24-gp41-2-Fusionsprotein codierende Strukturgen und besitzt die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1C von Base 15, an dessen Nde I- Terminus (Ende des 5'-codierenden Stranges) bis zur Base 796 an dessen BamH I-Terminus (Ende des 3'-codierenden Stranges). Das zweite Segment ist das das ampr-Gen enthaltende Nde I/BamH I-Restriktionsfragment des Plasmids pGEX7. Das Strukturgen für das HIV p24-gp41-2-Fusionsprotein ist funktionell an die pGEX7-Expressionskontrollelemente, d.h. den λ-Promoter, geknüpft, und wird daher bei Transformation eines kompatiblen bakteriellen Wirts mit pGEXp24gp41-2 exprimiert.

C. Produktion eines Strukturgens, das ein Fusionsprotein, das Polypeptidrepeats enthält, codiert

pGEXp24gp41-1,2,1,1:

Die Plasmide pGEXp24gp41 und pGExp24gp41-2, die gemäß Beispiel 1B hergestellt wurden, wurden getrennt vollständig mit dem Restriktionsenzym Ava II gespalten, was in jedem Fall ein doppelsträngiges DNA- Segment mit cohäsiven Ava II-Enden, der jeweils eine Aminosäuresequenz mit der Fähigkeit, immunologisch ein HIV gp41-Epitop nachzuahmen, codiert, nämlich die hier identifizierten Polypeptide A5 bzw. A2. Die das Polypeptid A5- oder das Polypeptid A2- codierenden DNA-Segmente wurden jeweils der Elektrophorese auf einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen, und die DNA-Segmente wurden jeweils getrennt von dem Gel, durch Elektroelution isoliert und, wie in Beispiel 1A beschrieben, präzipitiert.
Die präzipitierten DNA-Segmente, die die Polypeptide A5 und A2 codieren, wurden mit dem vorstehend hergestellten mit PpuM I linearisierten pGEXp24-DNA-Segment vermischt, und die drei vermischten DNA-Segmente wurden unter Bildung von Plasmiden ligiert, die eine Vielzahl an Kombinationen an eingebrachten Segmenten, wie mit der Ligierung von drei DNA-Segmenten, die alle die gleichen cohäsiven Enden besitzen, möglich ist, besitzen. Die gebildeten Plasmide wurden in E. coli transformiert, und wurden jeweils einzeln isoliert, wie vorstehend beschrieben. Die isolierten Plasmide wurden dann durch Spaltung mit Restriktionsenzymen und Elektrophorese auf 1%iger Agarose charakterisiert. Die Plasmide, die mit Pvu II gespalten wurden, wurden in den pGEXp24-DNA-Teil einmal gespalten, in den DNA-Segmenten, die das Polypeptid A5 codieren, einmal gespalten, aber wurden nicht in den DNA-Segmenten, die das Polypeptid A2 codieren, gespalten. Die mit HpA I gespaltenen Plasmide wurden gespalten, wenn sie ein DNA-Segment, das das Polypeptid A2 codiert, enthalten. Plasmide, die die DNA-Segmente enthalten, die das Polypeptid A5, A2 oder beide codieren, wurden auf der Basis ihres Spaltmusters ausgewählt und, wie vorstehend beschrieben, isoliert. Die Nucleinsäurebasensequenz wurde dann für jedes der isolierten Plasmide unter Verwendung des Sanger-Didesoxysequenzierverfahrens bestimmt, um die Struktur der kombinierten DNA-Segmente, die in jedem gebildeten Plasmid vorhanden waren, zu bestimmen.
Ein gebildetes Plasmid, pGEXp24gp41-1,2,1,1, enthält das Strukturgen für das HIV p24-gp41-1,2,1,1-Fusionsprotein (p24-A5-A2-A5-A5), definiert durch die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1D von Base 16 bis Base 1014. D.h. pGEXp24gp41-1,2,1,1 ist ein Plasmid, das ein erstes und ein zweites doppelsträngiges DNA-Segment in funktioneller Verknüpfung über die auf beiden Segmenten vorhandenen cohäsiven Nde I und BamH I-Enden enthält. Das erste Segment enthält das das HIV p24-gp41-1,2,1,1-Fusionsprotein codierende Strukturgen und besitzt die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1D von Base 15, dessen Nde I-Ende (Ende des 5'-codierenden Stranges) bis Base 1021, an dessen BamH I- Ende (Ende des 3'-codierenden Stranges). Das zweite Segment ist das das ampr-Gen enthaltende Nde I/BamH I-Restriktionsfragment von Plasmid pGEX7. Das Strukturgen für das HIV p24-gp41-1,2,1,1-Fusionsprotein ist funktionell an die PGEX7-Expressionskontrollelemente, z.B. den λ-Promoter geknüpft, und wird daher bei Transformation eines kompatiblen bakteriellen Wirts mit pGEXp24gp41-1,2,1,1 exprimiert.

pGEXp24gp41-1,2:

Das in Beispiel 1B hergestellte Plasmid pGEXp24gp41-2 wurde vollständig mit den Restriktionsenzymen Hpa I und BamH I gespalten, wodurch zwei doppelsträngige DNA-Segmente mit cohäsiven Hpa I und BamH I-Enden erzeugt wurden. Das kleinere der zwei DNA-Segmente wurde aus dem Spaltgemisch durch Gelelektrophorese, Elektroelution und Präzipitation, wie in Beispiel 1A beschrieben, isoliert.
Das Plasmid pGEXp24gp41-1,2,1,1, hergestellt gemäß Beispiel 1C, wurde auf ähnliche Weise mit Hpa I und BamH I gespalten, und das größere der beiden erhaltenen DNA-Segmente wurde auf ähnliche Weise isoliert. Das aus pGExp24gp41-2 isolierte kleine DNA-Segment und das aus pGEXp24gp41-1,2,1,1 isolierte große DNA-Segment wurden in einem äquimolaren Verhältnis gemischt und unter Bildung des Plasmids pGEXp24gp41-1,2 ligiert, das jeweils eines jedes DNA-Segments in dem produzierten Plasmid enthielt.
Das ligierte Plasmid wurde in E. coli transformiert, einzeln isoliert, und durch Spaltung mit Restriktionsenzymen und Elektrophorese wie vorstehend charakterisiert. Das Plasmid pGEXp24gp41-1,2 enthält das Strukturgen für das HIV p24-gp41-1,2-Fusionsprotein (p24-A5-A2), definiert durch die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1E von Base 16 bis Base 864. D.h. pGEXp24gp41-1,2 ist ein Plasmid, das ein erstes und ein zweites doppelsträngiges DNA-Segment in funktioneller Verknüpfung über die auf beiden Segmenten vorhandenen cohäsiven Nde I und BamH I-Enden enthält. Das erste Segment enthält das das HIV p24-gp41-1,2-Fusionsprotein codierende Strukturgen, und besitzt die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1E von Base 15 an dessen Nde I-Terminus (Ende des 5'-codierenden Stranges) bis Base 871 an dessen BamH I-Terminus (Ende des 3'-codierenden Stranges). Das zweite Seqment ist das das ampr-Gen enthaltende NdeI/BamH I-Restriktionsfragment von Plasmid pGEX7. Das Strukturgen für das HIV p24-gp41-1,2-Fusionsprotein ist funktionell an die pGEX7-Expressionskontrollelemente, z.B. den λ-Promoter, geknüpft und wird daher bei Transformation eines kompatiblen bakteriellen Wirts mit pGEXp24gp41-1,2 exprimiert.
Andere Strukturgene für HIV-verwandte p24-gp41-Fusionsproteine wurden mit anderen Kombinationen aus Polypeptid A5 hergestellt, und noch weitere Kombinationen aus Polypeptid A5 und Polypeptid A2 können unter Verwendung der vorstehend für pGEXp24gp41-1,2,1,1 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise wurden die rekombinanten DNA-Plasmide mit der allgemeinen Bezeichnung pGEXp24gp41- X, worin -X ist gleich -1,1, -1,1,1, oder -1,1,1,1,1, entsprechend den Fusionsproteinen p24-A5-A5, p24-A5-A5-A5 bzw. p24-A5-A5-A5, hergestellt.

2. Rekombinante Erzeugung der Strukturgenprodukte

A. Expression des Strukturgens für das rekombinante HIV p24-Protein

Plasmide, die den λ-Promoter (pL) enthalten, sind normalerweise in einem Bakterienstamm enthalten, der ein Lysogen des Bakteriophagen λ enthält, um die Expression des Genprodukts von Interesse während der Manipulation der DNAs zu minimieren. Die in Beispiel 1 beschriebenen Plasmide auf der Basis von pGEX7 waren alle in einem Lysogen des E. coli-Stamms MM294 enthalten. Die Expression von dem λ-Promoter von pGEX7 kann durch Transfer des Plasmids in einen nicht-infizierten bakteriellen Wirt (z.B. E. coli- Stamm W3110, erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als ATCC #27325) und Inaktivierung des cI-Repressorproteins bei 42ºC nachgewiesen werden. Das pGEXp24-Plasmid in W3110 wurde über Nacht in Luria-Brühe (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY), die 50 ug/ml Ampicillin enthielt, bei 30ºC gezüchtet, und am nächsten Morgen 1/100 in frischer Brühe verdünnt. Nach Erreichen einer optischen Dichte von 0,5 bei 550 nm wurde die Kultur in ein Wasserbad von 42ºC unter kontinuierlichem heftigem Schütteln überführt. Die Dichte der Kultur wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen, und eine Probe der Zellen wurde entnommen, um sie elektrophoretisch auf einem diskontinuierlichem Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) auf die Expression von bakteriellen Proteinen zu analysieren. Ein Beispiel dieses Typs der Analyse auf die Expression von p24 ist in Figur 3 gezeigt. Aus dem Gehalt der durch Coomassie Brilliantblau gefärbten Proteins erscheint, daß p24 zwischen 10% und 20% des gesamten zellulären Proteins nach 2-stündiger Induktion bei 42ºC ausmacht.
Die Analyse des Gehalts an p24, das in diesen Bakterien unter Verwendung des HTLV III-Antigentests von Abbott Laboratories produziert wurde, zeigt, daß p24 bei 4,3 x 10&sup8; Antigeneinheiten pro mg Bakterienprotein (bestimmt durch einen Lowry Assay) erzeugt wird.

B. Expression des Strukturgens, das das HIV p24-gp41-Fusionsprotein codiert

Der mit pGEXp24gp41 transfotmierte E. coli-Stamm wurde, wie in Beispiel 2A beschrieben, induziert und gezüchtet. Das rekombinant produzierte p24-gp41-Fusionsprotein wurde aus der transformierten Zellkultur, wie nachstehend beschrieben, isoliert.

3. Reinigung und Analyse des in E. coli exprimierten rekombinanten HIV p24-Proteins

Die Reinigung des rekombinanten HIV p24 wurde bei 4ºC durchgeführt. Alle Puffer wurden bei Raumtemperatur hergestellt und vor Gebrauch auf 4ºC gekühlt. Tris-Puffer wurden aus der Tris-Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) hergestellt und mit HCl auf den geeigneten pH-Wert eingestellt. Die Proteinkonzentration der rekombinanten HIV p24-Proteinzusammensetzung wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,29 optische Dichteeinheiten-cm-1 für eine 0,l%ige Lösung, berechnet von der theoretischen Aminosäurezusammensetzung, bestimmt (D.B. Wetlaufer, Adv. Protein Chem., 1962, 17:303-390). Die Reinheit des p24-Präparats wurde durch Anfärben der Proben, die der SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) gemäß dem Laemmli-Verfahren (Nature, 1971, 227:680-685) unterworfen worden waren, mit Coomassie Brilliantblau R-250 bewertet.

A. Zellyse und Zentrifugation

E. coli-Zellen (W3110) (17 g), die mit pGEXp24 transformiert worden waren und gemäß Beispiel 1A hergestellt worden waren, wurden in 85 ml eines Puffers, der 0,1 M Natriumphosphat (hergestellt aus NaH&sub2;PO&sub4; und mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt), 5 mM EDTA, 5 mM Benzamidin-HCl, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 x 10&supmin;&sup7; M Pepstatin A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde zweimal durch eine Druckzelle einer Frenchpresse (Katalog Nr. FA073, SLM Instruments Inc. Urbane, IL) bei 16.000 psi gepreßt, und das so erhaltene Homogenat wurde zentrifugiert (18.000 x g, 40 min). Der Überstand (79 ml) aus der Zentrifugation wurde gewonnen und erneut 1 Stunde lang bei 100.000 x g in einer L7-55 Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Rotors vom Typ 70.1 ti (Beckman Instruments, Fullerton, CA) zentrifugiert. In diesem Stadium ist das rekombinante HIV p24-Protein löslich und bleibt in dem Überstand.

B. Ammoniumsulfatfällung

Festes Ammoniumsulfat bis zu 30%iger Sättigung wurde in dem Überstand (75 ml) aus der Ultrazentrifugation zugemischt, und anschließend wurde das Salz aufgelöst, und die Lösung wurde 30 Minuten lang gerührt. Die Suspension wurde 20 Minuten lang bei 12.000 x g zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 15 ml eines Puffers, der 100 mM Tris-HCl (pH 8,5) enthielt, aufgelöst. Diese Lösung wurde 5 Stunden lang gegen 4 l eines Puffers, der 25 mM Tris-HCl enthielt (pH 8,0) dialysiert.

C. Anionenaustauschchromatographie

Das Dialysat wurde (1 ml/min) auf eine Säule (2,5 x 18 cm) aus DEAE-Sepharose, die mit 25 mM Tris-HCl, pH 8,0 (Pharmacia, Piscataway, NJ) äquilibriert worden war, aufgebracht. Nach Aufbringung der Probe wurde die Säule mit 5 Säulenvolumina Äquilibrationspuffer (2 ml/min) gewaschen. Das rekombinante p24 wurde von der Säule mit 50 mM NaCl in dem Äquilibrierungspuffer (2 ml/min) eluiert. Der pH-Wert des Eluenten aus der Anionenaustauschersäule, das p24 (67,4 mg) enthielt, wurde mit festem NaH&sub2;PO&sub4; auf 6,8 eingestellt, und das rekombinante p24 wurde durch die Zugabe von festem Ammoniumsulfat bis zu 30%iger Sättigung ausgefällt. Nach der Auflösung des Salzes wurde die Lösung 30 Minuten lang gerührt, und das das rekombinante p24 enthaltende Präzipitat wurde durch Zentrifugation (12.000 x g, 30 min) gewonnen.

D. Gelfiltration

Das Ammoniumsulfatpräzipitat wurde in 10 ml 100 mM Tris- HCl, pH 8,5, aufgelöst, und auf einer Säule (2,5 x 90 cm) aus Sephacryl 5-200 (Pharmacia), die zuvor mit einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl und 200 mM NaCl enthielt (pH 8,0), äquilibriert worden war, chromatographiert (0,5 ml/min). Die Fraktionen (4 ml), die rekombinantes p24 enthielten, wurden vereinigt (44 ml) und mittels SDS-PAGE analysiert (Fig. 4). Keine verunreinigenden Materialien konnten nach Coomassie-Färbung der Gelbahnen, die mit 12 bzw. 24 ug Protein geladen waren, sichtbar gemacht werden (Fig. 4). Die anschließende Lagerung des im wesentlichen reinen rekombinanten HIV p24-Proteins wurde bei -20ºC durchgeführt.

E. Westernblotting

Um die Expression des rekombinanten HIV p24-Proteins in mit pGEXp24 rDNA transformiertem E. coli zu bestätigen, wurden die zellulären Proteine, einschließlich des rekombinanten p24-Proteins, die durch 12,5%ige SDS-PAGE in Beispiel 2 getrennt worden waren, nach der Westernblot-Technik analysiert. Vergleiche Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4350-4354 (1979).
In Kürze, die Proteine wurden elektrophoretisch von dem SDS-PAGE-Gel auf Nitrocellulose überführt. Der so erhaltene Blot (Festphasen-gebundenes Antigen) wurde dann mit einer 1:100-Verdünnung eines HIV-Core-antigenpositiven Serums von einem AIDS-Patienten in einer Immunreaktion umgesetzt.
Die Ergebnisse dieser Westernblot-Analyse, die in Figur 5 gezeigt sind, zeigen an, daß das immunreaktive rekombinante HIV p24-Protein in nachweisbaren Mengen in transformiertem E. coli 30 Minuten nach Induktion der Expression durch Hitzeinaktivierung des cI-Repressorproteins produziert wurde.

4. Reinigung des rekombinanten HIV p24-gp41-Proteins aus E. coli

Die Reinigung des HIV p24-gp41-Fusionsproteins p24-A5 wurde bei 4ºC durchgeführt. Alle Puffer wurden bei Raumtemperatur hergestellt und auf 4ºC vor Gebrauch abgekühlt. Die Tris-Puffer wurden aus Tris-Base hergestellt und auf den geeigneten pH-Wert mit HCl eingestellt. Das isolierte p24-A5 wurde unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,56 optischen Dichteeinheiten-cm&supmin;¹ für eine 0,1%ige Lösung, berechnet von der theoretischen Aminosäurezusammensetzung, quantitativ bestimmt (D.B. Wetlaufer, Adv. Protein Chem., 1962, 17:303-390). Die Reinheit von p24-A5 wurde durch Coomassie Blau-Färbung der Proben, die der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (12,5% Acrylamid) unterworfen worden waren, nach dem Verfahren von Laemmli (Nature, 1971, 227:680-685) bewertet.

A. Zellyse und Zentrifugation

E. coli-Zellen (W3110) (16 g), die mit pGEXp24gp41 transformiert worden waren und gemäß Beispiel 1B hergestellt worden waren, wurden in 80 ml eines Puffers, der 0,1 M Natriumphosphat (hergestellt aus NaH&sub2;PO&sub4; und mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt), 5 mM EDTA, 5 mM Benzamidin-HCl, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 x 10&supmin;&sup7; M Pepstatin A (Sigma Chemical Co.) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde zweimal durch eine Druckzelle einer French-Presse (SLM Instruments Inc., cell Katalog Nr. FA073) bei 16.000 psi geleitet, und das so erhaltene Homogenat wurde zentrifugiert (18.000 x g, 40 min). Das Pellet (2,4 g) aus der Zentrifugation wurde zurückbehalten und in 50 ml PEB-Puffer, enthaltend 0,1 M Natriumphosphat (pH 7,0), 5 mM EDTA und 5 mM Benzamidin-HCl, resuspendiert. Die Suspension wurde wie vorstehend zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet (1,7 g) wurde in 80 ml eines Puffers, enthaltend 50 mM Tris-HCl, 3 M Harnstoff, 0,5 mM PMSF und 1 x 10&supmin;&sup5; M Pepstatin A (pH 8,5) resuspendiert. Die Suspension wurde 14 Stunden lang bei 4ºC gerührt und dann wie vorstehend zentrifugiert. Der Überstand wurde abgekühlt und 3 Stunden lang gegen 2 l eines Puffers, enthaltend 25 mM Tris-HCl (pH 7,8), dialysiert und dann bei 100.000 x g 1 Stunde lang in einer Beckman L7-55- Ultrazentrifuge (Typ 70.1 Ti Rotor) zentrifugiert.

B. Kationenaustauschchromatographie

Der aus der Ultrazentrifugation von Beispiel 4A produzierte Überstand wurde gewonnen, und der pH-Wert wurde mit 2 M Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Das Material wurde dann (zweimal) gegen 2 l 25 mM Natriumacetat (pH 5,0) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule (2,5 x 15 cm) aus CM Sepharose (Pharmacia; äquilibriert mit 25 mM Natriumacetat, pH 5,0) aufgebracht (1 ml/min). Nach der Aufbringung der Probe wurde die Säule mit 5 Säulenvolumina des Äquilibrationspuffers gewaschen (2 ml/min). Das HIV p24-gp41-Fusionsprotein wurde aus der Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten in dem Äquilibrierungspuffer (1 l, 0 bis 400 mM bezüglich NaCl) eluiert. Die Fraktionen, die das Fusionsprotein in einer Reinheit > 95% (bestimmt mittels SDS-PAGE) enthielten, wurden vereinigt und bei -80ºC gelagert.

5. Herstellung eines Konjugats aus rekombinantem HIV p24- Protein und antigenem HIV gp41-Polypeptid

3 ml von im wesentlichen reinen HIV p24-Protein, etwa 0,616 mg, produziert gemäß Beispiel 3D, wurden 48 Stunden lang gegen 3 l 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,5, enthaltend 1 mM MgCl, dialysiert. Eine 10 mM Lösung aus SPDP (Pharmacia) in Ethanol wurde hergestellt und besaß einen O.D.-Wert von 0,045 bei 280 nm. 200 ul 0,8 M Na&sub2;CO&sub3; wurden mit der SPDP-Lösung vermischt, und die Absorption wurde nach 10 Minuten gemessen. Die Esterkonzentration (aktiviertes SPDP) der so behandelten SPDP-Lösung wurde berechnet und entsprach 9,66 mM.
Um das rekombinante HIV p24-SPDP-Derivat herzustellen, wurden 2 mg des rekombinanten HIV p24-Proteins (0,0083 umol) mit 0,42 umol des aktivierten SPDP (43 ul der vorstehenden SPDP-Lösung) bei Raumtemperatur 15 Minuten lang behandelt. Es wurde mit Sephadex G-10-Chromatographie durch Aufbringen der Proben auf pd 10-Säulen und Gewinnen von 2 ml des Effluenten entsalzt. Der Substitutionsgrad wurde auf etwa 3,4 mol Thiol pro mol an rekombinantem HIV p24-Protein berechnet.
Um funktionell das A5-Polypeptid an das thiolierte rekombinante HIV p24-Proteinpräparat zu knüpfen, wurden 0,162 umol des Peptids mit dem thiolierten Protein (etwa 3,5 mol Peptid pro mol p24-Polypeptid) vermischt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert (gehalten). Nach 8- stündiger Fortsetzung der Inkubation bei Raumtemperatur (etwa 20ºC) wurde die Absorption der Lösung bei 343 nm gemessen und zu 0,35 bestimmt, was anzeigt, daß 3,8 mol des thiolierten p24 hydrolysiert waren, wodurch das rekombinante HIV p24-A5-Polypeptidkonjugat (p24-A5-Konjugat) erhalten wurde.
Als Kontrolle wurde das BSA-A5-Konjugat gemäß den vorstehenden Verfahren unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) anstelle des rekombinanten HIV p24-Proteins hergestellt.

6. Enzym-linked Immunosorbentassay (ELISA)

Die Antigene wurden auf gewaschene Kunststoff-Mikroliterkavitäten (Nunc MicroWell Module, Katalog Nr. 468667) adsorbiert. Lösungen, die die Antigene p24, p24-A5-Fusionsprotein, p24-A5-Konjugat oder das BAS-A5-Konjugat, hergestellt gemäß den Beispielen 3, 4, 5 bzw. 5, in 10 ug pro ml in einer 50 mmolaren (mM) Natriumcarbonatlösung, pH 9,5, und 150 mM NaCl enthielten, wurden in den Kavitäten vermischt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gehalten. Die Beschichtungslösung wurde entfernt, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen auf den Kavitäten wurden durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur mit einer Lösung aus 3% Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V, SIGMA Chemicals) in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS: 40 g NaCl, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 5,7 g Na&sub2;HPO&sub4;, 1 g KCl, 1 g NaN&sub3; in 5 l wäßriger Lösung) blockiert. Nach dem Blockieren wurde die Platte dreimal mit Wasser gespült und trocknen gelassen, wodurch ein blockiertes Festphasen-gebundenes Antigen gebildet wurde.
Die ELISA-Assays wurden durch Vermischen von Verdünnungen von Seren von AIDS-Patienten, normalem Humanserum oder Kaninchenantisera gegen gereinigtes rekombinantes HIV p24- Protein mit den Festphasen-gebundenen Antigenen durchgeführt. Die Seren wurden in PBS, enthaltend 0,05% Tween 20- Detergent und 0,1% BSA (PTB-Puffer), verdünnt. Nach Halten der Immunreaktionsgemische für 1 Stunde bei 37ºC, um die Bildung des Immunreaktionsprodukts zu erlauben, wurden die Kavitäten dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Jeder Kavität wurde dann eine 1:1000-Verdünnung in PTB-Puffer von entweder Ziege-anti-Human-IgG, gekoppelt an alkalische Phosphatase (SIGMA Nr. A-3150) als Marker oder Schaf-anti- Kaninchen-Immunglobulin, gekoppelt an Betagalactosidase (Pharmacia) als Marker, zugemischt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC mit dem zweiten Antikörper wurden die Kavitäten fünfmal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, wenn alkalische Phosphatase als Marker verwendet wurde, gewaschen und para-Nitrophenylphosphat (SIGMA) in einem Puffer aus 10% Triethanolamin, pH 9,8, und 1 mM MgCl&sub2; wurde jeder Kavität zugemischt, und die Kavitäten wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Wenn Betagalactosidase als Marker verwendet wurde, wurden 4 ug pro ml Orthonitrophenylgalactosid (SIGMA) in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7, jeder Kavität zugemischt, und die Kavitäten wurden 2 Stunden lang bei 37ºC gehalten. Das Ausmaß der enzymatischen Reaktion wurde durch Ablesen der optischen Dichte der Lösung in den Mikrokavitäten bei 405 nm in einem BioRad Spektrophotometer überwacht.
Die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 ELISA-Ergebnisse unter Verwendung des rekombinanten HIV p24-Proteins, HIV p24-gp41-Fusionsproteins und HIV p24- gp41-Konjugats Antigen² Serum¹ Probe p24-A5-Fusion p24-A5-Konjugat BSA-A5-Konjugat Normal Kaninchen-anti-p24
¹ Die Serumproben wurden zuerst 1:20 und anschließend zweifach reihenweise verdünnt. Ein Endpunkt für die Titration der Antiseren ist gegeben, wenn die abgelesene optische Dichte unter 0,1 fiel. Normal = Serum von einem gesunden heterosexuellen Menschen. Kaninchen-anti-p24 = Serum von einem Kaninchen, das mit einem rekombinanten HIV p24-Protein immunisiert wurde.
² Die Festphasen-gebundenen Antigene waren: rekombinantes HIV p24-Protein (p24); rekombinantes HIV p24-Polypeptid A5-Protein (p24-A5-Fusion); rekombinantes HIV p24-Protein- Polypeptid A5-Konjugat (p24-A5-Konjugat); und Rinderserumalbumin-A5-Konjugat (BSA-A5-Konjugat).
³ Kein nachweisbarer Titer
Die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante HIV p24-A5-Fusionsprotein und das rekombinante HIV p24-A5-Konjugat empfindlicher bezüglich des Nachweises von anti-HIV-Antikörpern als das rekombinante HIV p24-Protein allein waren. Zusätzlich war in 2 von 5 Seren von AIDS-Patienten das rekombinante HIV p24-A5-Fusionsprotein empfindlicher bezüglich des Nachweises von anti-HIV-Antikörpern als das rekombinante HIV p24-A5-Konjugat oder das BSA-A5-Konjugat. Dies war angesichts der Tatsache, daß etwa 4 mal so viele HIV gp41-Epitope (A5-Polypeptid) zur Immunreaktion auf den Konjugaten im Vergleich zu dem Fusionsprotein vorhanden waren, besonders überraschend.

7. Reinigung des rekombinanten HIV p24-gp41-Proteins aus E. coli

Das HIV p24-gp41-Fusionsprotein p24-A5 wurde ebenfalls nach einem Verfahren, das dem in Beispiel 4 ähnlich ist, aber mit den angegebenen Ausnahmen, gereinigt.
Mit pGEXp24gp41, hergestellt gemäß Beispiel 1B, transformierte E. coli-Zellen (W3110) (50 g) wurden in einem Gewebshomogenisator (Polytron, ausgestattet mit einer 15 mm Sonde) in 250 ml Suspensionspuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, 5 mM EDTA, 5 mM Benzamidin-HCl, 0,5 mM PMSF), enthaltend 0,17% (Gew./Vol.) Lysozym (SIGMA, Grad I), suspendiert. Die Suspension wurde 40 Minuten lang unter rührender Bewegung bei 22ºC gehalten und dann auf 4ºC abgekühlt. Die gekühlte Suspension wurde dann durch eine French-Presse geleitet und zentrifugiert (18.000 x g, 40 min). Das so erhaltene Pellet (6,4 g) wurde in 150 ml PEB-Puffer resuspendiert und zentrifugiert (18.000 x g, 30 min). Das so erhaltene Pellet wurde in 100 ml eines Puffers, enthaltend 100 mM Tris-HCl, 3 M Harnstoff und 10 mM Dithiothreit, pH 8,5, resuspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang bei 4ºC gerührt und dann 40 Minuten lang bei 35.000 UpM in einem 45 Ti-Rotor (Beckman) zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde gewonnen und gegen 4 l eines Puffers, enthaltend 0,1 M Natriumphosphat und 30% gesättigtes Ammoniumsulfat, pH 6,5, dialysiert und dann 20 Minuten lang bei 18.000 x g zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 35 ml eines Puffers, enthaltend 0,1 M Natriumphosphat, 5 mM EDTA, 6 M Guanidin HCl und 10 mM Mercaptoethanol, pH 7,0, resuspendiert, wodurch eine Guanidinfusionsproteinlösung gebildet wurde.
Die Guanidinlösung wurde auf eine Säule (5,0 x 90 cm) Sephacryl S-200 (Pharmacia), die mit S-200-Puffer, enthaltend 6 M Guanidin HCl, 50 mM Tris, 5 mM EDTA und 10 mM Mercaptoethanol, pH 7,0, voräquilibriert worden war, aufgebracht. Die eluierten Fraktionen wurden gewonnen, wenn der S-200-Puffer dann auf die Säule aufgebracht wurde, und jede Fraktion wurde auf Absorption bei 280 nm (A280) überwacht, um den Proteingehalt zu bestimmen. Fraktionen, die einen Peak an eluiertem Protein enthielten, wurden vereinigt und auf einen A280-Wert von 0,5 unter Verwendung eines Puffers, enthaltend 15 mM Tris-HCl, pH 8,5, und 3 M Harnstoff, verdünnt. Jeder vereinigte Peak wurde durch SDS-PAGE, wie in Beispiel 2A beschrieben, analysiert, um die vereinigten Fraktionen, die das gereinigte HIV p24- gp41-Fusionsprotein enthielten, zu identifizieren. Der, das Fusionsprotein enthaltende, Pool wurde 4 Stunden lang und dann 14 Stunden lang gegen 4 l 15 mM Tris-HCl, pH 8,5, enthaltend 3 M Harnstoff, dialysiert, um eine dialysierte Fusionsproteinlösung, enthaltend Harnstoff, zu bilden. Die dialysierte Lösung wurde 4 Stunden lang gegen 15 mM Tris- HCl, pH 8,5, zur Bildung des dialysierten Fusionsproteins dialysiert.
Das dialysierte Fusionsprotein wurde auf eine Säule (2,6 x 20 cm) aus DEAE-Sepharose (Pharmacia), die mit 15 mM Tris- HCl, pH 8,5, voräquilibriert worden war, aufgebracht (2 ml/min). Nach der Aufbringung der Probe wurde die Säule mit 2 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers, enthaltend 10 mM NaCl, gewaschen (2 ml/min). Das HIV p24-gp41- Fusionsprotein wurde aus der Säule mit einem NaCl-Gradienten in dem Äquilibrierungspuffer (1 l, 10 bis 30 mM NaCl) eluiert. Die das Fusionsprotein in einer Reinheit von mehr als 95% (bestimmt mittels SDS-PAGE) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, um das DEAE-isolierte Fusionsprotein zu bilden.
Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen aus der DEAE-Sepharose-Säule wurde durch Zugabe von 20%iger Essigsäure auf 5,5 eingestellt und dann wurde gegen 4 l eines Puffers, enthaltend 25 mM Natriumacetat, pH 5,0, dialysiert. Das Dialysat wurde dann 1 Stunde lang bei 40.000 UpM in einem Rotor vom Typ 45 Ti in einer Beckman L7-55-Ultrazentrifuge zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand wurde auf eine Säule (2,6 x 10 cm) aus CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia), die mit einem Puffer, der 25 mM Natriumacetat enthielt und einen pH-Wert von 5,0 hatte, voräquilibriert worden war, aufgebracht (2 ml/min). Nach der Aufbringung der Probe wurde die Säule mit 200 ml des Äquilibrierungspuffers, der 30 mM NaCl enthielt, gewaschen (2 ml/min). Das HIV p24- gp41-Fusionsprotein wurde von der Säule mit einem linearen NaCl-Gradienten in einem Äquilibrierungspuffer (1 l, 30 bis 250 mM an NaCl) eluiert. Die das Fusionsprotein in einer Reinheit von mehr als 95% (bestimmt mittels SDS-PAGE) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei -20ºC gelagert, um das CM-isolierte Fusionsprotein zu bilden.

8. Reinigung des rekombinanten HIV p24-gp41-2-Proteins aus E. coli

Das HIV p24-gp41-2-Fusionsprotein p24-A2 wurde nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren mit den folgenden angegebenen Ausnahmen gereinigt. Die E. coli-Zellen wurden mit pGEXp24gp41-2-Fusionsprotein, hergestellt wie in Beispiel 1B beschrieben, transformiert. Das von den transformierten Zellen exprimierte p24-gp41-2-Fusionsprotein wurde dann, wie in Beispiel 7 beschrieben, isoliert, um das DEAE-isolierte Protein zu bilden.

9. Reinigung des rekombinanten HIV p24-gp41-1,2-Proteins aus E. coli

Das HIV p24-gp41-1,2-Fusionsprotein p24-A5-A2 wurde nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren mit den folgenden angegebenen Ausnahmen gereinigt.
Die E. coli-Zellen wurden mit pGEXp24gp41-1,2, hergestellt wie in Beispiel 1B beschrieben, transformiert, und wurden dann, wie in Beispiel 7 beschrieben, über die Stufe der Guanidinresuspension weiter verarbeitet, wodurch eine Guanidinfusionsproteinlösung, enthaltend das isolierte HIV p24gp41-1,2-Fusionsprotein, gebildet wurde.

10. Enzym-linked Immunosorbentassay (ELISA)

Ein ELISA wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, unter Verwendung der Antigene p24 oder eines der Fusionsproteine p24-A5, p24-A2 oder p24-A5-A2, hergestellt gemäß den Beispielen 3, 7, 8 bzw. 9, durchgeführt.
Die Ergebnisse der ELISA-Studien sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 ELISA-Ergebnisse unter Verwendung des rekombinanten HIV p24-Proteins und der HIV-Fusionsproteine p24-gp41, p24- gp41-2 oder p24-gp41-1,2 Serum Probe¹ p24-A5-Fusion p24-A2-Fusion p24-A5-A2 Fusion Kaninchen-anti-p24 Kaninchen-anti-gp41, HIV-1 Kaninchen-anti-gp41, HIV-2
¹ Die Serumwerte wurden zuerst 1:100 und anschließend dreifach reihenweise verdünnt. Ein Endpunkt für die Titration ist gegeben, wenn die Ablesung der optischen Dichte unter 0,2 fiel. Die Proben 13690 und F666-4 wurden von AIDS-Patienten mit einer bestätigten HIV-1-Infektion erhalten, und die Proben 2A und 2B wurden von AIDS-Patienten mit einer bestätigten HIV-2-Infektion erhalten. Kaninchen- anti-p24 = Serum von einem Kaninchen, das mit rekombinantem p24 immunisiert wurde. Kaninchen-anti-gp41, HIV-1 = Serum von einem Kaninchen, das mit dem A5-Peptid in Konjugation an BSA immunisiert wurde; Kaninchen-anti-gp41, HIV- 2 = Serum von einem Kaninchen, das mit dem A2-Peptid in Konjugation an BSA immunisiert wurde.
² Die Festphasen-gebundenen Antigene waren: rekombinantes HIV p24-Protein (p24); rekombinantes HIV p24-Polypeptid- A5-Protein (p24-A5-Fusion); rekombinantes HIV p24-Polypeptid-A2-Protein (p24-A2-Fusion); rekombinantes HIV p24- Polypeptid-A5 und A2-Protein (p24-A5-A2-Fusion).
³ Kein nachweisbarer Titer
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß die rekombinanten HIV-Fusionsproteine p24-A5, p24-A2 und p24-A5-A2 hinsichtlich des Nachweises von anti-HIV-Antikörpern empfindlicher waren als das rekombinante p24-Protein allein. Zusätzlich wird die Typspezifität durch den empfindlicheren Nachweis von anti-HIV-1-Antikörpern unter Verwendung von Fusionsproteinen, die das A5-Polypeptid enthalten, verglichen mit einem Fusionsprotein, das das A2-Polypeptid enthält, nachgewiesen. Auf ähnliche Weise wurde eine erhöhte Empfindlichkeit zum Nachweis von anti-HIV-2-Antikörpern unter Verwendung von Fusionsproteinen, die das A2-Polypeptid enthalten, verglichen mit einem Fusionsprotein, das das A5-Polypeptid enthält, beobachtet.
Die vorstehende Beschreibung und die Beispiele dienen der Erläuterung und sollen nicht als Begrenzung aufgefaßt werden. Noch andere Variationen im Rahmen und Umfang der Erfindung sind möglich, und sind einem Fachmann leicht offensichtlich.

Claims

1. DNA-Segment, umfassend eine erste Nucleotidbasensequenz in funktioneller Verknüpfung an ihrem 3'-terminalen Ende an das 5'-terminale Ende einer zweiten Nucleotidbasensequenz, wobei die erste Sequenz eine Nucleotidbasensequenz der Formel:

AGGAGGGTTTTTCAT

besitzt, und die zweite Sequenz eine Nucleotidbasensequenz, die ein rekombinantes HIV p24-Protein codiert, besitzt.

2. DNA-Segment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Sequenz eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1A von Rest 1 bis Rest 232 codiert.

3. DNA-Segment nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Segment die Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1A von Base 1 bis Base 711 besitzt.

4. DNA-Segment mit einer Nucleotidbasensequenz, die eine Aminosäuresequenz gemäß der in Figur 1B von Rest 1 bis Rest 257, Figur 1C von Rest 1 bis Rest 258, Figur 1D von Rest 1 bis Rest 333 oder Figur 1E von Rest 1 bis Rest 283 gezeigten Sequenz codiert.

5. DNA-Segment mit einer Nucleotidbasensequenz gemäß der in Figur 1B von Base 16 bis Base 786, Figur 1C von Base 16 bis Base 789, Figur 1D von Base 16 bis Base 1014 oder Figur 1E von Base 16 bis Base 864 gezeigten Sequenz.

6. Rekombinante DNA, umfassend einen Vektor in funktioneller Verknüpfung an ein DNA-Segment, wobei das DNA-Segment eine erste Nucleotidbasensequenz in funktioneller Verknüpfung an ihrem 3'-terminalen Ende an das 5'-terminale Ende einer zweiten Nucleotidbasensequenz umfaßt, wobei die erste Sequenz eine Nucleotidbasensequenz der Formel:

AGGAGGGTTTTTCAT

7. Rekombinante DNA nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Sequenz eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1A von Rest 1 bis Rest 232 codiert.

8. Rekombinante DNA nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Sequenz eine Nucleotidbasensequenz gemäß Figur 1A von Base 1 bis Base 711 oder 718 besitzt.

9. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend einen Vektor in funktioneller Verknüpfung an ein DNA-Segment, wobei das DNA- Segment ein Strukturgen definiert, das ein HIV p24-gp 41-Fusionsprotein codiert, welches eine Aminosäuresequenz gemäß der in Figur 1B von Rest 1 bis Rest 257, Figur 1C von Rest 1 bis Rest 258, Figur 1D von Rest 1 bis Rest 333 oder Figur 1E von Rest 1 bis Rest 283 gezeigten Sequenz besitzt.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Expresssionsvektor ist, und das Molekül das Fusionsprotein in einem kompatiblen Wirt exprimieren kann.

11. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend einen Vektor in funktioneller Verknüpfung an ein DNA-Segment, wobei das DNA- Segment eine Nucleotidbasensequenz gemäß der in Figur 1B von Base 1 bis Base 793, Figur 1C von Base 1 bis Base 796, Figur 1D von Base 1 bis Base 1014 oder Figur 1E von Base 1 bis Base 871 gezeigten Sequenz besitzt.

12. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein erstes und ein zweites doppelsträngiges DNA-Segment in funktioneller Verknüpfung über die auf beiden Segmenten vorhandenen cohäsiven Nde I- und BamH I-Enden, wobei das erste Segment durch eine Nucleotidbasensequenz, ausgewählt von den in

(i) Figur 1B von Base 15 an dessen cohäsivem Nde I-Ende (5'-Ende des codierenden Stranges) bis Base 793 an dessen cohäsivern BamH I-Ende (3'-Ende des codierenden Stranges),

(ii) Figur 1C von Base 15 an dessen cohäsivem Nde I-Ende (5'-Ende des codierenden Stranges) bis Base 796 an dessen cohäsivem BamH I-Ende (3'-Ende des codierenden Stranges),

(iii) der Sequenz gemäß Figur 1D von Base 15 an dessen cohäsivem Nde I-Ende (5'-Ende des codierenden Stranges) bis Base 1021 an dessen cohäsivem BamH I-Ende (3'-Ende des codierenden Stranges), und

(iv) der Sequenz gemäß Figur 1E von Base 15 an dessen cohäsivem Nde I-Ende (5'-Ende des codierenden Stranges) bis Base 871 an dessen cohäsivem BamH I-Ende (3'-Ende des codierenden Stranges),

angegebenen Sequenzen, wiedergegeben wird, und daß das zweite Segment das das Ampicilin-Resistenzgen (ampr) enthaltende Nde I/BamH I-Restriktionsfragment von pGEX7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 40464 ist.

13. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Expressionsvektor ist, und daß das Molekül das Fusionsprotein in einem kompatiblen Wirt exprimieren kann.

14. Transformierte Zellkultur, umfassend ein Nährmedium, enthaltend eine mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 6, 9 oder 11 transformierte procaryotische Wirtszelle.

15. Verfahren zur Produktion eines rekombinanten HIV p24- Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Kultur, umfassend ein Nährmedium, enthaltend mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 6 transformierte Wirtszellen, ansetzt,

b) die Kultur für eine Zeitspanne, die zur Expression des rekombinanten HIV p24-Proteins durch die Wirtszelle ausreicht, hält, und

c) das rekombinante HIV p24-Protein aus der Kultur isoliert.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA eine Nucleotidbasensequenz besitzt, die eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1A von Rest 1 bis Rest 232 codiert.

17. Verfahren zur Produktion eines HIV p24-gp41-Fusionsproteins, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Kultur, umfassend ein Nährmedium, das mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 9 oder 11 transformierte Wirtszellen enthält, ansetzt,

b) die Kultur für eine ausreichende Zeitspanne zur Expression des HIV p24-gp41-Fusionsproteins durch die Wirtszellen hält, und

c) das Fusionsprotein aus der Kultur isoliert.

18. Präparat, umfassend ein rekombinantes HIV p24-Protein, wobei das Präparat ein Verhältnis des HIV p24-Proteins zu dem wirtszellspezifischen Antigen von mindestens 1000:1 besitzt.

19. Präparat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante HIV p24-Protein eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1A von Rest 2 bis Rest 232 besitzt.

20. Diagnosesystem in Kitform, umfassend ein Präparat nach Anspruch 18 in einer Menge, die ausreicht, um mindestens einen Assay durchzuführen.

21. Diagnosesystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat an eine feste Matrix fixiert ist, und daß das rekombinante HIV p24-Protein eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1A von Rest 2 bis Rest 232 besitzt.

22. Diagnosesystem in Kitform, umfassend ein HIV p24- gp41-Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz gemäß der in Figur 1B von Rest 2 bis Rest 257, Figur 1C von Rest 2 bis Rest 258, Figur 1D von Rest 2 bis Rest 333 oder Figur 1E von Rest 2 bis Rest 283 gezeigten Sequenz, wobei das Fusionsprotein eine Reinheit bezüglich des wirtszellspezifischen Antigens von mindestens 1000:1 besitzt.

23. Diagnosesystem nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein an eine feste Matrix gebunden ist.

24. HIV p24-gp41-Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz gemäß der in Figur 1B von Rest 2 bis Rest 257, Figur 1C von Rest 2 bis Rest 258, Figur 1D von Rest 2 bis Rest 333 oder Figur 1E von Rest 2 bis Rest 283 gezeigten Sequenz, wobei das Fusionsprotein eine Reinheit bezüglich des wirtszellspezifischen Antigens von mindestens 1000:1 besitzt.

25. Verfahren zum Test einer Probe einer Körperflüssigkeit auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen mindestens eines der HIV-Antigene p24 und gp41, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein immunreaktives Gemisch durch Vermischen der Körperflüssigkeitsprobe mit einem HIV p24-gp41-Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz gemäß der in Figur 1B von Rest 2 bis Rest 257, Figur 1C von Rest 2 bis Rest 258, Figur 1D von Rest 2 bis Rest 333 oder Figur 1E von Rest 2 bis Rest 283 gezeigten Sequenz bildet,

b) das immunreaktive Gemisch für eine Zeit hält, die ausreicht, daß jeder der vorhandenen Antikörper mit dem Fusionsprotein unter Bildung eines Immunreaktionsproduktes eine Immunreaktion eingehen kann, und

c) das Vorhandensein jeder beliebigen der gebildeten Immunreaktionsprodukte und dadurch das Vorhandensein der Antikörper nachweist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein an eine feste Matrix fixiert ist.

27. Inoculum, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten HIV p24-Proteins in einen pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das Inoculum ein Verhältnis von HIV p24-Protein zu wirtszellspezifischem Antigen von mindestens 1000:1 besitzt.

28. Inoculum nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante p24-Protein eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 1A von Rest 2 bis Rest 232 besitzt.