DE69738329T2

DE69738329T2 - Zielrichten von antigenen auf den mhc-klasse i prozessierungsweg mit hilfe eines anthraxtoxin-fusionsproteins

Info

Publication number: DE69738329T2
Application number: DE69738329T
Authority: DE
Inventors: Kurt Gaithersburg KLIMPEL; Theresa J. Kensington GOLETZ; Naveen Arora; Stephen H. Bethesda LEPPLA; Jay A. Bethesda BERZOFSKY
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-09-17
Filing date: 1997-09-16
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2017-09-17
Also published as: AU4352197A; WO1998011914A1; EP0957934A1; DE69738329D1; CA2265852A1; US6592872B1; US20030198651A1; US7097965B2; EP0957934B1; AU727015B2; US20020048590A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Das Säugetiersystem reagiert auf eindringende Pathogene mit dem Aufbau von zwei breiten Verteidigungen: die zellvermittelte Reaktion und die humorale Reaktion. Virale und andere intrazelluläre Infektionen werden hauptsächlich über das zellvermittelte Immunsystem kontrolliert. Diese Kontrolle wird durch das Erkennen fremder Antigene, die auf der Zelloberfläche einer infizierten Zelle gezeigt sind, erreicht. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Vakzin, das das zellvermittelte Immunsystem stimuliert, und ein Verfahren zur Immunisierung von Säugetieren. Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zum Induzieren antigen-präsentierender Zellen zur Präsentation spezifischer Antigene mittels des MHC-Klasse-I-Processing-Verfahrens (MHC = Major Histocompatibility Complex).
Das zellvermittelte Immunsystem reagiert auf endogene Antigene, die durch das MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren präsentiert werden. Zellen können mittels dieses Processing-Verfahrens Fremdproteine, die im Zell-Zytosol vorgefunden werden, aufbereiten und relevante Peptidepitope präsentieren (Harding, in: Cellular Proteolytic Systems, S. 163–180 (1994); Carbone & Bevan, in: Fundamental Immunology, S. 541–567 (Paul, Hrsg., 1989); Townsend & Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7: 601–624 (1989)). Das MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren umfasst einen Verdau des Antigens durch den Proteasom-Komplex und Transport der resultierenden Peptide in das endoplasmatische Reticulum, wo sie an entstehende MHC-Klasse-I-Molekülen binden (Germain & Margulies, Annu. Rev. Immunol. 11: 403–450 (1993)). Zytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T-Lymphocytes = CTLs) erkennen spezifisch das von den MHC-Klasse-I-Molekülen gezeigte Fremdantigen und lysiert die antigen-präsentierende Zelle. Eine Population von T-Gedächtniszellen wird ebenfalls etabliert, die auf die Präsentation des spezifischen Antigens reagieren können. Das zelluläre Immunsystem ist damit für eine schnelle Reaktion auf eine intrazelluläre Infektion durch einen pathogenen Organismus, wie zum Beispiel ein Virus, vorbereitet.
Die Aufgabe für ein Vakzin, das das zellvermittelte Immunsystem stimuliert, ist das Liefern von Protein-Antigen zum Zell-Zytosol zum Verarbeiten und anschließenden Präsentieren durch MHC-Klasse-I-Moleküle. Verschiedene bakterielle Toxine, einschließlich Diphtherie-Toxin (DT), Pseudomonas Exotoxin A (PE), Pertussis-Toxin (PT) und die Pertussis-Adenylat-Cyclase (CYA) wurden im Bestreben verwendet, Peptid-Epitope dem Zell-Zytosol als interne oder amino-terminale Verbindung zu liefern (Stenmark et al., J. Cell Biol. 113: 1025–1032 (1991); Donnelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 3530–3534 (1993); Carbonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95: 295 (1995); Sebo et at., Infect. immun. 63: 3851–3857 (1995)). Diese Systeme sind in ihrem Gebrauch als potenzielle Vakzine beschränkt, weil sie keinen Zugriff auf den MHC-I-Processing-Verfahren für die Antigen-Präsentation bereitstellen, sondern stattdessen wahrscheinlich über einen alternativen, weniger effizienten Weg wirksam werden (vgl. Kovacsovics-Bankowski & Rock, Science 267: 243–246 (1995); Rock, Immunology Today 17: 131–137 (1996)).
WO 94/18332 betrifft Nukleinsäuren, die für ein erstes Fusionsprotein codieren, welches die Anthrax-protektive Antigen (PA)-bindende Domäne des natürlichen Anthrax-Letalfaktor(LF)-Proteins und eine Aktivität-auslösende Domäne eines zweiten Proteins umfasst. Dieses Stand der Technik-Dokument offenbart ferner eine Nukleinsäure, die für ein zweites Fusionsprotein codiert, welches die Translokationsdomäne und die LF-Bindungsdomäne des natürlichen Anthrax-PA-Proteins und eine Liganden-Domäne umfasst, die spezifisch an ein zelluläres Ziel bindet. Proteine, die von solchen Nukleinsäuren codiert sind, werden darin ebenfalls offenbart. In WO 94/18332 werden zudem Zusammensetzungen offenbart, die Bacillus anthracis Anthrax-PA und Peptide oder Protein umfassen, die an ein APABP gebunden sind, sowie Verfahren zur Verwendung der Zusammensetzungen zum Zuführen einer Aktivität zu einer Zelle (z. B. einer zytotoxischen Aktivität).
Überraschenderweise stellt die vorliegende Erfindung einen Antigenzugang zum MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren über das binäre Anthrax-Toxinsystem zur Verfügung. Das binäre Bacillus anthracis Toxin besteht aus zwei einzelnen Proteinen (Smith & Stoner, Fed. Proc. 2: 1554–1557 (1967); Leppla, in: Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease. Handbook of Natural Toxins, Bd. 8, S. 543–572 (Moss et al., Hrsg. (1995)). Das protektive Antigen (PA) bildet in Kombination mit dem Letalfaktor (LF) "Letaltoxin" oder "Anthrax"-Toxin. (Friedlander, J. Biol. Chem. 261: 7123–7126 (1986); Leppla, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 3162–3166 (1982). Zusätzlich zum Letaltoxin bildet PA in Kombination mit dem Ödemfaktor (edema factor, EF) Ödemtoxin (Friedlander, Leppla, s. o.).
In diesem System bindet PA (83 kDa) an einen Proteinrezeptor auf Zelloberflächen. PA wird dann durch eine zelluläre Protease (Furin) gespalten, und ein Amino-terminales 20 kDa-Fragment wird freigesetzt, wodurch ein 63 kDa-Fragment, PA63, an die Zelle gebunden bleibt (Leppla et al., in: Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence, S. 127–139 (Kado & Crosa, Hrsg. 1994); Klimpel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10277–10281 (1992)); Novak et al., J. Biol. Chem. 267: 17186–17193 (1992)). PA63 bindet an LF, und das binäre Anthraxtoxin wird dann über Endozytose in die Zelle transportiert. PA ermöglicht die Zuführung des LF vom Endosom zum Zytosol der Zelle (Milne et al., J. Biol. Chem. 269: 20607–20612 (1994); Milne et al., Mol. Microbiol. 15: 661–666 (1995)). LF-Fusionsproteine werden ebenfalls durch das PA in das Zytosol translokiert.
Wenn sie im Zytosol sind, werden das Anthraxtoxin und die LF-Fusionsproteine im Unterschied zu anderen binären Toxinsystemen über den MHC-Klasse-I-Processing-Weg verarbeitet. Zellen, die mit Anthraxtoxin-Fusionproteinen behandelt wurden, werden durch Antigen-spezifische CTLs erkannt und lysiert. Die Abhängigkeit vom Verarbeiten über das MHC-Klasse-I-Verfahren wurde nachgewiesen durch Behandlung Antigen-präsentierender Zellen mit Lactacystin, das die für das MHC-Klasse-I-Processing erforderliche Proteasomfunktion hemmt. Somit kann das Anthraxtoxin-System dazu benutzt werden, Vakzine zu schaffen, die das zellvermittelte Immunsystem wirksam stimulieren.
Ein Vorteil des Anthraxsystems besteht in seiner Fähigkeit zur Aufnahme großer Fusionsproteine. Im Unterschied zum Anthraxsystem sind andere bakterielle Toxinsysteme in ihrer Fähigkeit zum Zuführen großer Protein-Antigene zur Zelle eingeschränkt. Während Peptide in der Lage sind, eine zellvermittelte Immunreaktion zu stimulieren, können Antigene aus ganzen Proteinen aus zwei Gründen besser zur Verwendung in einem wirksamen Vakzin geeignet sein. Zunächst kann das für den Schutz in einem genetischen Hintergrund wesentliche Epitop in einem anderen Hintergrund irrelevant sein. Es ist deshalb für ein breit angewendetes T-Zellen-Vakzin vorteilhaft, das Volllängen-Protein zu benutzen, von dem die verschiedenen relevanten Epitope abgeleitet sind. Zum zweiten werden die von CTL erkannten Epitope vom ganzen Protein mittels spezialisierter Abbaumaschinen verarbeitet. In bestimmten Fällen ist das Verarbeiten der relevanten Epitope abhängig von den flankierenden Aminosäuresequenzen (Del Val et al., Cell 66: 1145–1153 (1991)). Da es zur Zeit nicht möglich ist, exakt vorherzusagen, welche Epitope für eine angemessene Verarbeitung von ihrem Kontext abhängig sind, ist es wichtig, das gesamte Antigen dem Zellzytosol zur optimalen Verarbeitung und Präsentation zuzuführen. Ein letzter Nachteil gegenüber anderen bakteriellen Toxinsystemen besteht darin, dass viele Individuen bereits gegen das Trägertoxin immunisiert worden sind. Allerdings wird Anthraxtoxin nicht besonders häufig zur Immunisierung verwendet.
Mit dieser Erfindung kann die effiziente Zuführung von Anthrax-Fusionsproteinen zum Zytosol sicher als Verfahren zur intrazellulären Einimpfung lebender Zellen mit ganzen Protein-Antigenen verwendet werden. Diese Antigene werden dann durch die MHC-I-Moleküle präsentiert. Dieses System schafft die Grundlage für neue, wirksame Vakzine, welche auf das zellvermittelte Immunsystem zielen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Vakzin zum Induzieren einer Immunreaktion in einem Säugetier auf ein spezifisches Antigen bereit, wobei das Vakzin eine Einheitsdosis eines binären Toxin-protektiven Antigens und des spezifischen Antigens umfasst, welches an ein binäres Toxin-protektives Antigen-bindendes Protein gebunden ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Vakzin ein Anthrax-protektives Antigen und das Antigen, welches an ein Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein gebunden ist.
In noch einer anderen Ausführungsform des Vakzins ist das protektive Antigen modifiziertes protektives Antigen.
Die bevorzugte Ausführungsform des Vakzins ist steril und umfasst physiologisch kompatible Salze, die in noch einer anderen Ausführungsform in einer wässrigen Lösung sein können.
In einer Ausführungsform des Vakzins ist das Anthrax-protektive Antigen-bindende Protein der Letalfaktor von B. anthracis.
In einer anderen Ausführungsform des Vakzins umfasst das Anthrax-protektive Antigen-bindende Protein mindestens etwa die ersten 250 Aminosäurereste des Letalfaktors von B. anthracis, und weniger als alle Aminosäurereste des Letalfaktors.
In noch einer anderen Ausführungsform des Vakzins ist das Molverhältnis von protektivem Antigen zu Antigen, das an ein protektives Antigen-bindendes Protein gebunden ist, größer als eins.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zum Immunisieren eines Säugetiers gegen ein Antigen durch Verabreichung einer sicheren und wirksamen Menge eines Vakzins bereit, das Anthrax-protektives Antigen und das an das Anthrax-protektive Antigen-bindende Protein gebundene Antigen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem weitere Ausführungsformen dieses Verfahrens zum Immunisieren mit einem Vakzin wie oben bereit.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird das Vakzin über parenterale Injektion verabreicht, in noch einer anderen Ausführungsform des Verfahrens wird das Vakzin über subkutane Injektion verabreicht.
In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens wird das Vakzin in einer Einheitsdosis verabreicht, die zwischen 10–500 ng des an das protektive Antigen-bindende Protein gebundenen Antigens pro kg des Tiers beträgt.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem ein Verfahren zum Induzieren Antigen-präsentierender Säugetierzellen zum Präsentieren spezifischer Antigene auf ihrer Zellemembran über das MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren bereit. Dieses Verfahren umfasst erstens das Selektieren von Zellen, die über den MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren spezifische Antigene verarbeiten und auf ihren Zellmembranen präsentieren können. Zweitens umfasst dieses Verfahren das Kontaktieren der Zellen mit einem Anthrax-protektiven Antigen und dem an das protektive Antigen-bindende Protein gebundenen Antigen. Drittens umfasst das Verfahren das Ermöglichen für die Zellen, das an das protektive Antigen-bindende Protein gebundene Antigen zu internalisieren, zu verarbeiten und auf ihrer Zellmembran zu präsentieren und dabei eine Antigen-präsentierende Zelle zu bilden.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens werden die Antigen-präsentierenden Zellen des Weiteren mit einer Effektor-Lymphozyte kontaktiert, welche das auf der Zellmembran vorhandene Antigen der Antigen-präsentierenden Zelle erkennt.
In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens ist das protektive Antigen modifiziertes protektives Antigen.
In noch einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens umfasst das an das protektive Antigen-bindende Protein gebundene Antigen mindestens et wa die ersten 250 Aminosäuren des Letalfaktors von B. anthracis und weniger als alle Aminosäurereste des Letalfaktors.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Molverhältnis des protektiven Antigens zu dem an das protektive Antigen-bindende Protein gebundenen Antigen größer als eins.
In noch einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Antigen-präsentierende Zelle eine dendritische Zelle.
Definitionen
Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung, die ein einschlägiger Fachmann auf dem Gebiet dieser Erfindung ihnen zumessen würde. Die folgenden Referenzen stellen für den Fachmann allgemeine Definitionen vieler der in dieser Erfindung verwendeten Begriffe bereit: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker Hrsg., 1988); und Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, oder Äquivalente zu den hier beschriebenen, in der praktischen Ausführung oder Prüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden jedoch hier die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe näher definiert.
Ein "Vakzin" ist ein Antigen-Präparat, einschließlich z. B. ein Protein, ein Peptid oder ein Polysaccharid, verabreicht zum Stimulieren des humoralen und zellulären Immunsystems des Empfängers gegen ein oder mehrere der im Vakzinpräparat vorhandenen Antigene. "Vakzination" oder "Immunisierung" ist der Vorgang des Verabreichens eines Vakzins und des Stimulierens einer Immunreaktion auf ein Antigen.
Eine "Immunreaktion" bezieht sich auf die Aktivitäten des Immunsystems, einschließlich der Aktivierung und Proliferation spezifischer zytotoxischer T-Zellen nach dem Kontakt mit einem Antigen.
Ein "Antigen" ist ein Agens, z. B. ein Protein, ein Peptid oder ein Polysaccharid, das eine Immunreaktion auslöst.
Eine "Einheitsdosis" ist eine definierte und vorher festgelegte Konzentration oder Menge des Vakzins, die eine sichere und therapeutische wirksame Menge darstellt, die im Empfänger des Vakzins das erwünschte Ergebnis produziert, z. B. eine Immunreaktion.
Das Anthrax-"protektive Antigen" (PA) ist ein 83 kDa-Protein, das von Bacillus anthracis erzeugt wird. Das PA ist eine von zwei Proteinkomponenten des von B. anthracis erzeugten Letal- oder Anthraxtoxins. Das 83 kDa PA bindet mit seinem Carboxyl-Terminus an einen Zelloberflächenrezeptor, wo es spezifisch durch eine Protease gespaltet wird, z. B. durch Furin, Clostripain oder Trypsin. Diese Enzym-Spaltung gibt ein 20 kDa Amino-terminales PA-Fragment frei, während ein 63 kDa Carboxyl-terminales PA-Fragment an den Zellenoberflächenrezeptor gebunden bleibt. Die Beschreibung protektiven Antigens umfasst funktionale Äquivalente von binärem Toxin, wie beispielsweise Protein Ib von C. perfringens.
"Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein" (APABP) bezieht sich auf ein Protein, das die PA-Bindungsstelle des LF enthält. APABP kann sich auf ein Polypeptid beziehen, das die PA-Bindungsstelle des LF darstellt, oder auf jeden größeren Abschnitt des LF, der diese Stelle enthält, einschließlich des gesamten LF-Proteins. Das APABP ist an ein zweites Protein oder Antigen gebunden. Das Antigen kann entweder am Amino- oder Carboxyl-Terminus des APABP gebunden sein. Die Beschreibung des APABP umfasst auch funktionale Äquivalente von binärem Toxin, wie beispielsweise Protein Ia von C. perfringens.
Ein Antigen ist an ein Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein (APABP) "gebunden", wenn es als Komplex mit dem APABP auf eine Weise verbunden ist, die die Translokation des gebundenen APABP-Antigenkomplexes in das Zytosol der Zelle über die Wirkung des PA erlaubt. Verfahren zur Bindung von Antigen an APABP umfassen die Bildung kovalenter Bindungen durch chemische Kopplung oder Proteinsynthese. Das an ein APABP gebundene Antigen kann als einzelnes Polypeptid von einer Nukleinsäuresequenz, die für ein einzelnes zusammenhängendes Fusionsprotein codiert, synthetisiert werden.
"Modifiziertes protektives Antigen" bezeichnet ein 63 kDa PA-Fragment, das aus der Enzym-Spaltung des 83 kDa-PA entsteht. Modifiziertes PA enthält sowohl eine Zellenoberflächenrezeptor-Bindungsstelle an seinem Carboxyl-Terminus und eine Letalfaktor-Bindungsstelle an seinem neuen Amino-Terminus. Modifiziertes PA kann durch enzymatische Spaltung in vitro oder in vivo erzeugt werden oder als rekombinantes Protein. Die Beschreibung von modifiziertem PA umfasst auch funktionale Äquivalente von binärem Toxin, wie beispielsweise modifiziertes Protein Ib von C. perfringens.
Anthrax-"Letalfaktor" (LF) ist ein 90 kDa Protein, das die zweite Proteinkomponente des B. anthracis Letal- oder Anthraxtoxins ist, zusammen mit PA. LF enthält eine PA-Bindungsstelle. Die Beschreibung des LF umfasst funktionale Äquivalente von binärem Toxin, wie beispielsweise Protein Ia von C. perfringens.
"Physiologisch kompatible Salze" sind Zusammensetzungen von Salzen, die sichere und wirksame Mittel zum Abgeben eines Vakzins an einem Empfänger sind.
"MHC-Klasse-I-Moleküle" sind Rezeptoren, die Peptid-Antigen-Liganden binden.
Das "MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren" ist ein intrazellulärer Weg, der die Bindung eines Peptid-Antigen-Liganden an ein MHC-Klasse-I-Molekül und die Präsentation des Antigen-MHC-Klasse-I-Komplexes auf der Zelloberfläche ergibt. Zuerst wird zytoplasmatisches Antigen teilweise verarbeitet (über die Wirkung von Proteasomen) und tritt in das ER als Komplex mit einem Transporter-Protein ein. Im ER gehen die MHC-Klasse-I-Moleküle eine stabile Verbindung mit dem Peptid-Antigen ein. Der Antigen-MHC-Klasse-I-Komplex passiert dann das trans-Golgi-Netzwerk in einem sekretorischen Vesikel zur Zelloberfläche. Funktional kann das Verarbeiten eines Peptid-Antigens durch das MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren mit der Verwendung von Lactacystin identifiziert werden. Lactacystin ist ein spezifischer Proteasom-Hemmer. Die Lactacystin-Hemmung der Antigen-Präsentation zeigt, dass Verarbeitung des Antigens eher von der Funktion des Proteasomkomplexes abhängig ist als von einem anderen Processing-Weg.
"Effektor"-Lymphozyten "erkennen" Antigene, die mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle assoziiert sind. Die Erkennung ist ein Antigen-spezifisches Ereignis, das über Rezeptoren auf der Zelloberfläche des Effektor-Lymphozyts stattfindet, der dann aufgrund der Stimulierung mit einem spezifischen Antigen eine Reihe von Vorgängen ausführen kann.
"Parenterale" Verabreichung eines Vakzins umfasst beispielsweise subkutane, intravenöse, intramuskuläre oder intrasternale Injektions- oder Infusionstechniken.
"Antigen-präsentierende Zellen" sind Zellen, z. B. dendritische Zellen oder Makrophagen, die Peptid-Antigene mit dem MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren verarbeiten, so dass der Antigen-MHC-Klasse-I-Komplex auf ihrer Zelloberfläche gezeigt wird.
Eine "dendritische" Zelle ist eine bewegliche, nicht-phagozytotische, adhärente Zelle, die als wirksame Antigen-präsentierende Zelle agiert und sich leicht zwischen den Lymphknoten und anderen Organen bewegt. Dendritische Zellen werden weiter in Untergruppen unterteilt, wie beispielsweise fol likulare dendritische Zellen, Lagerhans-Zellen und dendritische Epidermis-Zellen.
Die Begriffe "Molverhältnis" und molares Verhältnis werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Verhältnis von Komponenten, das entweder durch Konzentration (molar) oder Menge (Mol-) bestimmt ist.
Ein "binäres Toxin" ist ein bakterielles Toxin, das aus zwei getrennten Proteinen zusammengesetzt ist, die sich zur Ausbildung des Toxins verbinden.
"Anthraxtoxin" ist ein von B. anthracis produziertes, binäres Toxin, zusammengesetzt aus LF und PA. Anthraxtoxin kann sich auch auf das binäre Ödemtoxin von B. anthracis beziehen, zusammengesetzt aus LF und EF (edema factor/Ödemfaktor).
Detaillierte Beschreibung
1. An ein Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein gebundenes Antigen
a. Einführung
Das Anthrax-protektive Antigen-bindende Protein (APABP) ist ein Protein, das die PA-Bindungsdomäne des Anthrax-Letalfaktor-Proteins (LF) oder ein funktionales Äquivalent enthält. Der Bereich des LF, der die PA-Bindungsdomäne enthält, wurde durch Struktur-Funktionsanalyse untersucht. Die Deletionsanalyse des LF-Abschnitts eines LF-Fusionsproteins zeigt, dass sich die PA-Bindungsdomäne am Amino-Terminus des LF befindet (Arora et al., J. Biol. Chem., 268: 3334–3341 (1993)). In diesem Experiment war ein Fusionsprotein, das ein mit einem zweiten Protein fusioniertes, vollständiges LF enthielt, biologisch aktiv, d. h., dass es durch PA in die Zelle internalisiert wurde (Arora, s. o. (1993)). Ein Fusionsprotein, das Amino-terminale Reste 1–254 des LF enthielt, produzierte ebenfalls ein biologisch aktives Fusionsprotein (Arora, s. o. (1993)). Allerdings produzierte ein Fusionsprotein, das die Amino terminalen Reste 1–198 des LF enthielt, ein biologisch inaktives Fusionsprotein (Arora, s. o. (1993)).
Somit reichen die Amino-terminalen Reste 1–254 des LF für eine PA-Bindungsaktivität aus. Die Aminosäurereste 199–253 sind möglicherweise für die PA Bindungsaktivität nicht alle erforderlich. Eine Ausführungsform des APABP sind die Aminosäuren 1–254 des LF. Jede Ausführungsform, die zumindest ungefähr die Aminosäuren 1–254 des LF enthält, kann für APABP verwendet werden, beispielsweise natürliches (natives) LF. Nicht-toxische Ausführungsformen von APABP sind bevorzugt.
Das Antigen kann entweder an den Amino- oder den Carboxyl-Terminus des APABP gebunden sein. Die Position des Antigens hat keine Auswirkungen auf die PA Bindungsaktivität des APABP. In einer Ausführungsform des Antigen-APABP, wie in Beispiel 1A beschrieben, ist das Antigen an den Carboxyl-Terminus des APABP gebunden.
Der Antigen-Teil eines "an ein APABP gebundenen Antigens" (Antigen-APABP) kann jedes Protein sein, das als Antigen für ein Vakzin für Säugetiere verwendbar ist. Andere geeignete Antigene umfassen beispielsweise Proteine von infektiösen Organismen, wie etwa Cytomegalovirus-Proteine; Hepatitis-C-Proteine; Plasmodium-malariae-Proteine; Schistosoma-mansoni-Proteine; und HIV-Proteine wie NEF, RT, TAT, REV, und gp41. In Beispiel 1A ist das HIV Hüllprotein gp120 eine Ausführungsform eines solchen geeigneten Antigens. Die Verwendung von gp120 als ein Antigen wird durch Klonieren und Exprimieren von gp120 als Antigen-APABP demonstriert. In Beispiel 1B wird das Herpes-simplex-Virus-Protein NS-5b ähnlich beschrieben.
b. Klonieren und Exprimieren eines rekombinanten APABP-Antigens
Eine rekombinante Nukleinsäure, die für zwei unterschiedliche Proteine codiert, wird hergestellt, indem zunächst die Nukleinsäuren isoliert werden. Die Nukleinsäuren werden dann verbunden, so dass ein einzelnes rekombinantes Nukleinsäuremolekül gebildet wird, beispielsweise durch Verwendung von Restriktionsendonuklease-Stellen an den Enden des Moleküls zur gerichteten Ligation. Das rekombinante Molekül, das für das Fusionsprotein codiert, wird dann in einen Vektor ligiert, der zur Expression des Proteins geeignet ist. Verfahren zum Anfertigen einer rekombinanten Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein codiert, sind dem einschlägigen Fachmann bekannt (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. ed. 1989)).
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung spezifischer Nukleinsäuren, die für Fusionsproteine codieren, kombiniert die Verwendung synthetischer Oligonucleotid-Primer mit der Polymerase-Verlängerung an einer mRNA- oder DNA-Matrix. Dieses PCR-Verfahren vervielfältigt bzw. amplifiziert die verlangte Nukleotidsequenz (vgl. auch U.S. Patent Nr. 4,683,195 und 4,683,202 ). Restriktionsendonuklease-Stellen können in die Primer eingebaut werden. Die im PCR-Verfahren amplifizierten Gene können von Agarosegelen gereinigt und zusammen ligiert werden. Änderungen der natürlichen Gensequenz können durch Techniken wie die In-vitro-Mutagenese und PCR unter Anwendung von Primern, die mit entsprechenden eingebauten Mutationen geplant wurden, eingeführt werden.
Das Gen, das für ein Fusionsprotein codiert, kann in einen "Expressionsvektor", "Klonierungsvektor" oder "Vektor" eingefügt werden – Begriffe, die in der Regel Plasmide oder andere Nukleinsäure-Moleküle bezeichnen, die sich in einer gewählten Wirtszelle replizieren können. Expressionsvektoren können sich autonom replizieren, oder sie können sich replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle eingefügt werden. Häufig ist es für einen Vektor wünschenswert, in mehr als einer Wirtszelle verwendbar zu sein, z. B. in E. coli zur Klonierung und Konstruktion und in einer Säugetierzelle zur Expression. Zusätzliche Elemente des Vektors können beispielsweise Selektionsmarker und Enhancer umfassen. Selektionsmarker, wie beispielsweise Tetracyclinresistenz oder Hygromycinresistenz, erlauben die Detektion und/oder Selektion derjenigen Zellen, die mit den erwünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden (vgl. z. B. U.S.-Patent Nr. 4,704,362 ).
Welcher Vektor zum Transport der genetischen Informationen in die Zelle verwendet wird, ist ebenfalls nicht besonders kritisch. Jeder der herkömmlichen Vektoren zur Expression rekombinanter Proteine in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen kann verwendet werden.
Die Expressionsvektoren besitzen in der Regel eine Transkriptionseinheit oder eine Expressionskassette, die alle Elemente enthält, die für die Expression der DNA nötig sind, welche für ein erfindungsgemäßes Protein in den Wirtszellen codiert. Eine typische Expressionskassette enthält einen Promotor, der funktionell (in Arbeitsbeziehung) mit der für das Protein codierenden DNA-Sequenz steht. Der Promotor ist vorzugsweise etwa dieselbe Distanz von der heterologen Transkriptions-Startstelle entfernt positioniert wie von der Transkriptions-Startstelle in seinem natürlichen Kontext. Wie in der Fachwelt bekannt, können allerdings einige Variationen in dieser Distanz hingenommen werden, ohne dass die Promotorfunktion verloren geht.
In der Expressionskassette kann die DNA-Sequenz, die für das Fusionsprotein codiert, mit einer spaltbaren Signalpeptidsequenz verknüpft werden, um die Sekretion des codierten Proteins durch die transformierte Zelle auszulösen. Die Expressionskassette sollte auch stromabwärts des strukturellen Gens einen Transkriptions-Terminationsbereich aufweisen, um eine effiziente Termination zu gewährleisten. Der Terminationsbereich kann von demselben Gen gewonnen werden wie die Promotorsequenz, oder auch von einem anderen Gen.
Für eine effizientere Translation in Säugetierzellen der vom strukturellen Gen codierten mRNA werden in der Regel auch Polyadenylierungs-Sequenzen zur Expressionskassette hinzugefügt. Terminations- und Polyadenylierungs-Signale, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen die vom SV40 stammenden, oder eine partielle Genomkopie eines Gens, das bereits auf dem Expressionsvektor angesiedelt ist.
Neben der Expressionskassette können viele Expressionsvektoren optimaler Weise Verstärker- bzw. Enhancerelemente umfassen, die die Transkription von bis zum 1.000-Fachen von angebundenen homologen oder heterologen Promotoren stimulieren. Viele Enhancerelemente, die von Viren abstammen, haben einen breiten Wirtsbereich und sind in unterschiedlichen Geweben aktiv. Beispielsweise ist der SV40 Enhancer früher Gene für viele Zelltypen geeignet. Andere Enhancer/Promotor-Kombinationen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen jene, die vom Polyomavirus, vom humanen oder Maus-Cytomegalievirus, den langen terminalen Wiederholungseinheiten (LTRs/long terminal repeats) verschiedener Retroviren, wie dem Maus-Leukämievirus, dem Maus- oder Rous-Sarkom-Virus und HIV abstammen (vgl. Enhancers and Eukaryotic Expression. (1983)).
Die Vektoren, welche für das erfindungsgemäße Protein codierende Gen enthalten, werden zur Expression in Wirtszellen transformiert. Das jeweilige Verfahren zur Einführung des genetischen Materials in die Wirtszelle zur Expression des Proteins ist nicht besonders kritisch. Jedes der gut bekannten Verfahren zur Einführung fremder Nukleotidsequenzen in Wirtszellen kann angewendet werden. Es ist nur erforderlich, dass das jeweils angewendete Verfahren in der Lage ist, mindestens ein Gen erfolgreich in die Wirtszelle einzuführen, die zur Expression des Gens imstande ist.
Transformationsverfahren, die je nach dem Typ der Wirtszelle variieren, umfassen die Elektroporation; die Transfektion unter Anwendung von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran oder anderer Substanzen; Mikroprojektil-Bombardement; Lipofektion; Infektion (wenn der Vektor ein infektiöses Agens ist); und andere Verfahren (vgl. allgemein Sambrook, s. o., und Current Protocols in Molecular Biology, s. o. (Ausubel et al., Hrsg., 1995). Der Hinweis auf Zellen, in die die oben beschriebenen Nukleinsäuren eingeführt wurden, soll auch die Nachkommen solcher Zellen einschließen.
Dem einschlägig bewanderten Fachmann sind zahlreiche prokaryotische Expressionssysteme bekannt, die sich für die Expression eines rekombinanten Proteins eignen. E. coli wird in der Regel verwendet, und andere mikrobielle Wirte, die zur Verwendung geeignet sind, umfassen Bakterien, wie Bacillus subtilus und andere Enterobacteriaceae wie Salmonella, Serratia und verschiedene Pseudomonas-Spezies. Expressionsvektoren zur Verwendung in diesen prokaryotischen Wirten enthalten vielfach ribosomale Bindungsstellen-Sequenzen zur Auslösung und Ausführung von Transkriptionen und Translationen.
Es können Wirtsbakterienzellen können werden, die so mutiert sind, dass sie verringerte oder gar keine Proteasen aufweisen, so dass die erzeugten Proteine nicht abgebaut werden. Für Bacillus-Expressionssysteme, in denen die Proteine in das Kulturmedium sekretiert werden, stehen Stämme zur Verfügung, denen es an sekretierten Proteasen mangelt.
Säugetier-Zelllinien können ebenfalls als Wirtszellen für die Expression der in der vorliegenden Erfindung benützten Polypeptide verwendet werden. Die Vermehrung von Säugetierzellen in Kultur ist per se gut bekannt (Tissue Culture (Kruse et al., Hrsg. 1973)). Wirtszelllinien können unter anderen auch Organismen wie Hefe, Fadenpilze, Pflanzenzellen oder Insektenzellen umfassen.
In einer Ausführungsform des Antigen-APABP, wie in Beispiel 1A beschrieben, wurde eine Nukleinsäure konstruiert, die für ein Fusionsprotein codiert, das Aminosäuren 1–254 des LF (SEQ ID NR: 1 und 2) und Aminosäuren 1–511 des HIV-Hüllproteins gp120 (SEQ ID NR: 3 und 4) enthält. Die Nukleinsäuren wurden mittels PCR und spezifischen Primern isoliert (SEQ ID NR: 5–8), mit Restriktionsendonuclease-Stellen an den Enden. Diese Stellen wurden zum Verbinden der Nukleinsäuren für LF und gp120 verwendet. Dieses rekombinante Nukleinsäurekonstrukt wurde in einen GST Expressions-Vektor kloniert, und das Protein wurde wie in Beispiel 1A beschrieben exprimiert und gereinigt.
Für die vorliegende Erfindung sind sowohl E. coli wie auch B. anthracis Beispiele geeigneter Expressionssysteme. In einer in Beispiel 1A beschriebenen Ausführungsform wurde das LF-gp120 Fusionsprotein von E. coli nach Standardverfahren exprimiert und gereinigt.
c. Reinigung von Antigen, das an Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein gebunden ist
Nach Proteinexpression unter Anwendung des rekombinanten Nukleinsäure-Vektor-Konstrukts wird das Protein mit Standardtechniken gereinigt, die in der Fachwelt gut bekannt sind (vgl. z. B. Colley et al., J. Biol. Chem. 64: 17619–17622 (1989); und Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Bd. 182 (Deutscher, Hrsg., 1990)).
Wenn das Expressionssystem das Sekretieren des erfindungsgemäßen Proteins von den Zellen auslöst, werden die rekombinanten Zellen gezüchtet, und das Protein wird exprimiert, danach wird das Kulturmedium zur Reinigung des sekretierten Proteins geerntet. Das Medium wird in der Regel durch Zentrifugieren oder Filtrieren zum Entfernen von Zellen und Zellentrümmern geklärt, und die Proteine können durch Adsorption an jeden geeigneten Harz konzentriert werden, wie beispielsweise CDP-Sepharose, Asialoprothrombin-Sepharose 4B oder Q Sepharose, oder durch Verwendung von Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Polyethylenglycol-Ausfällung oder durch Ultrafiltrierung. Andere in der Fachwelt bekannte Mittel sind gleichermaßen geeignet. Zusätzliche Reinigungen des Proteins lassen sich mit Standardtechniken erreichen, beispielsweise durch Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Größen-Chromatographie oder andere Proteinreinigungstechniken, die zum Erzielen von Homogenität angewendet werden. Die gereinigten Proteine werden dann zur Produktion pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet, wie nachstehend beschrieben.
Als Alternative können auch Vektoren angewendet werden, die das Protein intrazellulär exprimieren anstatt das Protein von den Zellen zu sekretieren. In diesen Fällen werden die Zellen geerntet, aufgespalten, und das Protein wird – beispielsweise mit Hilfe von Standardverfahren – vom zellulären Extrakt gereinigt. Wenn die Zelllinie eine Zellwand besitzt, kann eine Anfangsextraktion in einem salzarmen Puffer dem Protein das Pelletieren mit der Zellwandfraktion erlauben. Das Protein kann von der Zellwand mit hohen Salzkonzentrationen eluiert und dialysiert werden. Wenn die Zelllinie das Protein glykosoliert, kann das gereinigte Glykoprotein mit einer Con A Säule angereichert werden. Anionaustauschsäulen (MonoQ, Pharmacia) und Gelfiltrationssäulen können zur weiteren Reinigung des Proteins verwendet werden. Ein hochreines Präparat lässt sich auf Kosten der Aktivität durch denaturierende präparative Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erzielen.
Standardverfahren, die zur weiteren Reinigung der Proteine der Erfindung verwendet werden können, umfassen Ammoniumsulfat-Ausfällung, Affinitäts- und Fraktionssäulen-Chromatographie und Gel-Elektrophorese (vgl. allgemein Scopes, Protein Purification (1982); U.S.-Patent Nr. 4,512,922 , in dem allgemeine Verfahren zur Reinigung von Protein von rekombinant konstruierten Bakterien offenbart sind).
Rekombinante Proteine können weiter durch Druckdialyse und einen direkten Pufferaustausch in flüchtigen Puffern konzentriert werden (z. B. N-Ethylmorpholin (NEM), Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat und Pyridinacetat). Zusätzlich können Proben unmittelbar von solchen flüchtigen Puffern gefriergetrocknet werden, woraus sich ein stabiles Proteinpulver frei von Salz und Detergenzien ergibt. Zusätzlich können gefriergetrocknete Proben rekombinanter Analoge wirksam vor der Verwendung wieder in Puffern löslich gemacht werden, die mit Infusionen kompatibel sind (z. B. Phosphatgepufferte Salzlösung). Andere geeignete Puffer könnten Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Acetat, Benzoat, Malat, Citrat, Glyzin, Glutamat und Aspartat umfassen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wurde APABP-Antigen-Protein intrazellulär in E. coli exprimiert und unter Anwendung von Glutathion S-Transferase (GST) Affinität gereinigt, wie in Beispiel 1A beschrieben. In diesem Beispiel wurden die LF-gp120-codierenden Sequenzen an für GST codierende Sequenzen in dem Expressionsvektor pGEX-KG ligiert. Nach der Expression des Dreier-Fusionsproteins wurde eine Glutathion-Sepharose-4B-Säule zur raschen Reinigung des Antigen-APABP (LF-gp120) verwendet. Der GST-Teil des Dreier-Fusionsproteins kann dann mittels enzymatischer Spal tung an einer spezifischen Stelle entfernt werden, die durch einen im Dreier-Fusionsprotein vorhandenes Verbindungsstück (linker) bereitgestellt wird. Zur Verwendung als Vakzin beim Menschen ist die Entfernung des GST-Fusionsbereichs die bevorzugte Ausführungsform.
d. Verfahren zur Bindung von Antigen an APABP
Wie oben beschrieben, kann Antigen-APABP unter Anwendung rekombinanter Nukleinsäuren produziert werden, die für ein einkettige Fusionsprotein codiert. Das Fusionsprotein wird unter Anwendung von In-vivo- oder In-vitro-biologischen Systemen einkettig exprimiert.
Unter Anwendung aktueller Verfahren der chemischen Synthese kann Antigen auch chemisch an das APABP gebunden werden, um es in die Zellen zu internalisieren, wenn es mit PA verabreicht wird. Das Antigen-APABP kann gemäß den in den Beispielen aufgezeigten Verfahren empirisch auf eine Internalisierung getestet werden.
Funktionelle Gruppen, die kovalent Bindungen mit den Amino- und Carboxyl-terminalen Aminosäuren oder Seitengruppen von Aminosäuren eingehen können, sind beim einschlägig bewanderten Fachmann gut bekannt. Beispielsweise umfassen funktionelle Gruppen, die an die terminale Aminogruppe binden können, Anhydride, Carbodiimide, Säurechloride und aktivierte Ester. Gleicherweise umfassen funktionelle Gruppen, die kovalente Verbindungen mit dem terminalen Carboxyl eingehen können, Amine und Alkohole. Solche funktionellen Gruppen können dazu verwendet werden, Antigen entweder am Amino- oder am Carboxyl-Terminus an das APABP zu binden. Antigen kann auch durch Interaktionen von Aminosäurerest-Seitengruppen an das APABP gebunden werden, wie die SH-Gruppe von Cystein (vgl. z. B. Thorpe et al., Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, in Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, S. 168–190 (1982); Waldmann, Science, 252: 1657 (1991); U.S.-Patent Nr. 4,545,985 und 4,894,443 ). Das Verfahren zum Anbinden eines Agens an einen Antikörper oder an ein anderes Polypeptid-Zielmolekül wird je nach der chemischen Struktur des Agens variieren.
Als Beispiel kann ein Cysteinrest an das Ende des APABP angefügt werden. Da keine anderen Cysteine im LF vorhanden sind, schafft dieses einzelne Cystein einen geeigneten Bindungspunkt, über den andere Proteine durch Disulfidbindungen chemisch angebracht werden.
Obwohl bestimmte erfindungsgemäße Verfahren so beschrieben wurden, dass LF-Fusionsproteine verwendet werden, soll dies so aufgefasst werden, dass in den Verfahren auch andere LF-Zusammensetzungen mit chemisch angebundenen Antigenen verwendet werden können.
2. Protektives Antigen
a. Einleitung
Wildtyp Anthrax-protektives Antigen (PA) in Kombination mit dem Letalfaktor (LF) ergibt das Letal-Toxin. In der vorliegenden Erfindung bindet PA an Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein, das an ein Antigen gebunden ist (Antigen-APABP). PA enthält eine zelluläre Rezeptorbindungsdomäne, eine Translokationsdomäne und eine LF-Bindungsdomäne. Jeder dieser Bereiche des Proteins spielt eine wichtige Rolle in der vorliegenden Erfindung. Protektives Antigen kann funktional auf Basis dreier spezifischer Merkmale beschrieben werden: seine zelluläre Bindungsaktivität, LF- oder Antigen-APABP-Bindungsaktivität und die intrazelluläre Zuführung von LF oder Antigen-APABP.
Die zelluläre Bindungsaktivität wurde durch Struktur-Funktions- und Deletionsanalyse des Wildtyp-PA demonstriert. Das PA bindet spezifisch an einen Zelloberflächenrezeptor, der sich in einer großen Vielfalt von Zelltypen findet (Leppla et al., in Bacterial Protein Toxins, S. 111–112 (Fehrenbach et al., Hrsg., 1988)). Struktur-Funktionsexperimente von Protease-verdautem PA ergaben, dass der Carboxyl-Terminus die Rezeptorbindungsdomäne enthält (Novak et al., J. Biol. Chem., 267: 17186–17193 (1992)). Die weitere Deletionsanalyse des Carboxyl-Terminus zeigte, dass mutiertes PA-Proteine, die am Carboxyl-Terminus um 3, 5 oder 7 Aminosäuren gekürzt sind, eine 2- bis 10-fache Reduzierung der Zellbindungsaktivität aufwiesen (Singh et al., J. Biol. Chem., 266: 15493–15497 (1991)). Außerdem ging die Bindungsaktivität verloren, nachdem 12 oder 14 Aminosäuren vom Carboxyl-Terminus entfernt wurden (Singh, s. o. (1991)).
Die LF oder Antigen-APABP-Bindungsstelle des PA wird nach der Bildung von "modifiziertem" PA freigelegt. Nach Binden an den Zellrezeptor wird das PA ("reif," 83 kDa) durch eine zelluläre Protease (Furin) enzymatisch gespalten, was ein 20 kDa Amino-terminales Fragment freisetzt und ein 63 kDa "modifiziertes" Carboxyl-terminales Fragment, gebunden an den Zellrezeptor, übrig lässt, (Leppla et al., in Molecular Mechanisms of Bacterial Virulence, S. 127–139 (Kado et al., Hrsg., 1994)). Die Fähigkeit von PA, Wildtyp-LF oder APABP-Antigen zu binden, wurde mit Protease-verdautem PA demonstriert. Ein eingeschränkter In-vitro-Trypsin-Verdau lieferte das biologisch aktive 63 kDa AP modifizierte Fragment und das 20 kDa PA freigesetzte Fragment, während ein weiterer Verdau in der Inaktivierung der biologischen Aktivität resultierte. Zusätzlich produzierte der Verdau von PA mit Chymotrypsin biologisch inaktive 37 und 47 kDa Fragmente (Novak, s. o.). Die ortsspezifische Mutagenese der Wildtyp-PA-Spaltungsstelle zeigte des Weiteren, dass für eine LF-Bindungsaktivität Spaltung erforderlich ist (Singh et al., J. Biol. Chem., 264: 19103–19107 (1989)).
PA ist an der Internalisierung und Zuführung des LF oder Antigen-APABPs zum Zytosol beteiligt. Die Konvertierung von PA zu modifiziertem PA ermöglicht die Ausbildung einer Oligomer-Form eines PA, das nach Exponieren mit niedrigem pH in späten Endosomen Kanäle in Zellmembranen ausbildet (Blaustein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 2209–2213 (1989); Milne et al., Mol. Microbiol., 10: 647–653 (1993)). Es hat sich auch gezeigt, dass PA Fusionsproteine internalisiert, die aus einem an ein zweites Protein gebundenen APABP zusammengesetzt sind (Arora et al., J. Biol. Chem., 267: 15542– 15548 (1992); Arora et al., Infect. Immun., 62: 4955–4961 (1994); Arora et al., J. Biol. Chem., 69: 26165–26171 (1994)).
In der vorliegenden Erfindung ist reifes PA (83 kDa) die bevorzugte Ausführungsform. PA, das in vitro durch Enzyme wie Trypsin, Furin und Clostripain modifiziert wurde, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Stabilität des in vitro modifizierten PA wird durch die Anwesenheit von LF oder APABP erhöht. Neben rekombinantem PA in Volllänge sind amino-terminale Deletionen bis zur 63 kDa Spaltungsstelle oder Hinzufügungen zum Volllängen-PA verwendbar. Eine rekombinante Form von modifiziertem PA ist ebenso biologisch aktiv und könnte in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Obwohl das Voranstehende spezifische Deletions- und Struktur-Funktionsanalyse von PA beschreibt, kann jede biologisch aktive Form von PA in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
b. Klonieren und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für das protektive Antigen codiert
Im Allgemeinen können vom Fachmann zum Klonieren und Exprimieren des PA dieselben Verfahren, wie oben für Antigen-APABP beschrieben, angewendet werden. Gene, die für Wildtyp- oder mutierte Proteine codieren, können durch dem Fachmann bekannte Verfahren kloniert und exprimiert werden, wie oben beschrieben. Die vorliegende Erfindung verwendet eine isolierte Nukleinsäure im Expressionsvektor pYS5, die für das PA-Protein codiert, wie in Beispiel 2 beschrieben.
3. In-vitro-Tests für MHC-Klasse-I-Präsentation und Antigenerkennung durch zytotoxische T-Lymphozyten
Die Fähigkeit von Antigen-APABP und PA, Antigene zur Modifizierung und Präsentation über den MHC-Klasse-I-Weg bereitzustellen, kann in vitro getestet werden. Zellen, die das modifizierte Antigen mit MHC-Klasse-I-Molekülen präsentieren, werden durch spezifische cytotoxische T-Zellen erkannt und getötet.
In einem typischen zytotoxischen T-Lymphozyten-Assay (CTL Assay) werden Antigen-APABP und PA einer Antigen-präsentierenden Ziel-Zelle verabreicht. Jede geeignete Zelllinie kann zum Präsentieren von Antigen benützt werden, da MHC-Klasse-I-Moleküle in den meisten Zelltypen vorhanden sind (vgl. z. B. Watson et al., Molecular Biology of the Gen, S. 880–881 (4. ed. 1987). Die im Assay verwendeten CTLs benötigen zwei spezifische Eigenschaften. Erstens müssen die CTLs auf die Erkennung des spezifischen Antigens im Antigen-APABP konditioniert sein. Diese Spezifität kann durch die Kultivierung von T-Zellen eines vorher immunisierten Säugetiers erreicht werden. Die Spezifität der CTL-Reaktion kann durch die Stimulierung und Klonierung der T-Zellen in vitro erhöht werden. Zweitens müssen die CTLs vom gleichen genetischen Hintergrund wie die Antigen-präsentierenden Zellen kommen, so dass sie das mit dem MHC-Klasse-I Molekül gezeigte Antigen spezifisch als fremd erkennen.
Um nachzuweisen, dass das Antigen vom Antigen-APABP richtig präsentiert und von CTL erkannt wird, werden Antigen-präsentierende Ziel-Zellen und Effektor-CTL-Zellen in Kultur gemischt, und Lyse der Ziel-Zellen wird beobachtet. Jedes geeignete Verfahren zum Messen der Zelllyse kann von einem Fachmann angewendet werden. Beispielsweise kann zum Messen der Lyse der Ziel-Zellen ein Radioaktivitäts-Freisetzungs-Assay angewendet werden. Nachdem die Ziel-Zellen während einer entsprechenden Zeit mit PA und Antigen-APABP behandelt worden sind, werden die Ziel-Zellen mit radioaktiven Reagenzien markiert, wie beispielsweise ⁵¹Cr, die von lebenden Zellen aufgenommen werden. Nach der Markierung werden die Ziel-Zellen gewaschen und mit spezifischen CTLs gemischt. Überstände werden nach einer entsprechenden Zeit geerntet und gezählt, um den Prozentanteil an radioaktiver Freisetzung zu bestimmen. Andere Verfahren zur Bestimmung des Ausmaßes der Zelllyse umfassen den Trypanblauausschluss, bei dem lebende Zellen, welche den Farbstoff absondern, gezählt werden und mit einer Kontrollprobe mit nicht-präsentierenden Zellen, die auf die gleiche Weise behandelt wurden, verglichen werden.
In Beispiel 3 wird eine Ausführungsform dieses Tests beschrieben. Das Beispiel verwendet Maus-Mastocytoma-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen, CTL Linie 9.23.3, die ein spezifisches gp120 Epitop erkennen, und einen ⁵¹Cr Freisetzungs-Assay für die Zelllyse.
Zur Bestätigung der Abhängigkeit des Antigen-APABP vom Processing durch den klassischen MHC-Klasse-I-Weg kann die Fähigkeit des spezifischen Proteasom-Hemmers Lactacystin zur Hemmung der Antigen-Präsentation getestet werden. Inkubieren der Maus-Mastocytoma-Zellen mit 10 μM Lactacystin für 45 Minuten vor der Zugabe von PA und LF-gp120 (aus Beispiel 1A) verringerte signifikant die Lyse der Ziel-Zellen durch CTLs. Lactacystin-Hemmung der Peptid-Präsentation zeigt, dass das Verarbeiten des Peptidepitops vom Fusionsprotein von der Funktion des Proteasom-Komplexes abhängig ist. Diese Abhängigkeit schließt die Rolle jedes alternativen Processing-Weges zum Präsentieren durch das Anthraxtoxin LF-gp120 Fusionsprotein aus.
4. In-vivo-Tests von Mäusen und anderen Säugetieren für die MHC-Klasse-I-Präsentation und Antigen-Erkennung durch das zellvermittelte Immunsystem
Säugetiere können auf die MHC-Klasse-I-Präsentation des Antigen-APABP getestet werden. Zur Immunisierung von Mäusen, Katzen und anderen Säugetieren, einschließlich Menschen, können Standardverfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, herangezogen werden. Die PA/Antigen-APABP-Zusammensetzung kann mit jedem geeigneten Verfahren verabreicht werden, beispielsweise parenteral. In einigen Beispielen können Tiere zusätzliche Injektionen der PA/Antigen-APABP-Zusammensetzung erhalten.
Die Säugetier-Subjekte können auf jede geeignete Weise auf eine Immunreaktion auf das verabreichte Antigen getestet werden. Beispielsweise können die Tiere nach der Immunisierung mit dem Antigen provoziert werden. Die Wirksamkeit der Immunisierung kann nach der Antigen-Provokation gemessen werden, indem beobachtet wird, ob das Tier Symptome der Krankheit zeigt. Tiere können auch auf krankheitsindizierende Marker getestet werden, wie auf Toxine oder virale Enzyme. Die Testtiere können mit einem CTL-Assay, wie oben beschrieben, auch auf eine spezifische, zellulär basierte Immunreaktion getestet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung (in Beispiel 4 beschrieben) wurde eine Zusammensetzung aus PA und LF-gp120 an Mäuse verabreicht. Die Mäuse erhielten eine einzelne Injektion der PA/LF-gp120-Zusammensetzung in 100 μl PBS, entweder subkutan oder intraperitoneal. Die mit der PA/LF-gp120-Zusammensetzung injizierten Mäuse wurden nach drei Wochen geopfert, und ihre Milzen wurden zur Gewinnung von CTLs geerntet. Die CTLs wurden in vitro mit einem kleinen Peptidepitop von gp120 restimuliert, um die spezifische CTL-Population zu vergrößern, die das Antigen erkennt. Die CTLs wurden dann mit Antigen-präsentierenden Zellen gemischt (mit PA/LF-gp120 behandelte Mastocytom-Zellen, wie oben und in Beispiel 3 beschrieben). Die Lyse der Antigen-präsentierenden Zellen durch die CTL-Population wird mittels Standardverfahren gemessen, beispielsweise mit dem oben und in Beispiel 3 beschriebenen ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay.
5. Herstellung eines Vakzins unter Anwendung der vorliegenden Erfindung
Je nach der beabsichtigten Verabreichungsart können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in unterschiedlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen sein. Die Zusammensetzungen werden eine Einheitsdosis der ausgewählten Proteine enthalten, einschließlich Antigen-APABP und PA, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff und können zusätzlich andere medizinische Agenzien, pharmazeutische Agenzien, Trägerstoffe, Adjuvantien, Verdünnungsmittel und Füllstoffe enthalten.
Das Verhältnis von PA zu Antigen-APABP ist per Molarüberschuss größer als 1 und vorzugsweise 2–4. "Pharmazeutisch akzeptabel" bezeichnet ein Material, das nicht biologisch oder sonst wie unerwünscht ist, d. h. das Material kann einem Individuum zusammen mit dem Fusionsprotein oder anderen Zusammensetzungen verabreicht werden, ohne unerwünschte biologische Wirkungen auszulösen oder auf schädliche Weise mit einer der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der es enthalten ist, zu interagieren.
Beispiele physiologisch akzeptabler Trägerstoffe umfassen Salzlösungen, wie beispielsweise normale Kochsalzlösung, Ringer's Lösung, PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) und allgemein Mischungen unterschiedlicher Salze, darunter Kalium- und Phosphatsalze mit oder ohne Zuckerzusätze wie Glucose. Geeignete Füllstoffe sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glyzerol und Ethanol. Nicht-toxische Hilfsstoffe, wie Benetzungsmittel, Puffer oder Emulgatoren, können der Zusammensetzung ebenfalls hinzugefügt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung sind zur Immunisierung keine Hilfsstoffe erforderlich.
Die parenterale Verabreichung ist, wenn sie angewendet wird, allgemein durch eine Injektion charakterisiert. Sterile Injektionsstoffe können als herkömmliche Formen vorbereitet werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, in fester Form zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion, oder als Emulsionen.
6. Verabreichung des Vakzins unter Verwendung der vorliegenden Erfindung
Für jeden Empfänger kann die Gesamtmenge des erforderlichen Vakzins aus Protokollen zur Immunisierung mit anderen Vakzinen abgeleitet werden. Die exakte Menge solcher benötigter Antigen-APABP und PA-Zusammensetzungen wird von Subjekt zu Subjekt variieren, abhängig von Spezies, Alter, Gewicht und Allgemeinzustand des Subjekts, von dem jeweils verwendeten Fusionsprotein, dessen Verabreichungsart und dergleichen. Allgemein wird die Dosis annähernd jener entsprechen, die für die Verabreichung anderer Vakzine typisch ist, und wird vorzugsweise im Bereich von etwa 10 ng/kg bis 1 mg/kg liegen.
Der Empfänger ist ein Säugetier, z. B. eine Katze, Hund, Pferd, Kuh, Schwein, Schaf, Ziege oder Mensch. Zwar ist die Anwendung beim Menschen bevorzugt, doch auch die veterinärmedizinische Anwendung der Erfindung ist mög lich. Beispielsweise leiden Katzen unter sogenanntem Katzen-AIDS oder dem felinen Immundefizienzvirus (FIV). Antigen-APABP und PA können als Vakzin zum Auslösen einer Immunreaktion auf FIV in Katzen verabreicht werden.
Das Vakzin wird als sterile Zusammensetzung verabreicht. Die Fusionsproteine und anderen Zusammensetzungen der Erfindung können auf jede geeignete Art verabreicht werden, z. B. parenteral (subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal), intravenös oder oral. Vorzugsweise werden die Proteine parenteral verabreicht, wobei die subkutane Verabreichung der meistbevorzugte Weg ist, weil sie die Zusammensetzung den dendritischen Zellen zuführt, die starke Antigen-präsentierende Merkmale aufweisen. Eine angemessene Evaluation der Dauer und Methode für die Zuführung des Vakzins steht ganz im Vermögen des Klinikers.
Die zeitliche Planung für die Verabreichung des Vakzins und die Anzahl der zur Immunisierung erforderlichen Dosierungen lassen sich aus Standard-Vakzin-Verabreichungsprotokollen ermitteln. In der Regel wird, wie in Beispiel 5 beschrieben, in einer Ausführungsform, eine Vakzin-Zusammensetzung in zwei Dosierungen verabreicht. Die erste Dosis wird zum gewählten Datum verabreicht, und eine zweite Dosis folgt einen Monat nach der ersten Dosis. Eine dritte Dosis kann bei Notwendigkeit verabreicht werden, und die gewünschten Zeitintervalle für die Zuführung mehrfacher Dosierungen eines bestimmten Antigen-APABPs lassen sich von einem Fachmann mittels Routine-Experimenten bestimmen (vgl. z. B. Product Information, Physician's Desk Reference (1996)).
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen nur der Illustration und sind nicht einschränkend zu verstehen. Der Fachmann erkennt ohne weiteres unterschiedliche nichtkritische Parameter, die geändert oder modifiziert werden können, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse zu erreichen.
Beispiel 1A: Konstruktion und Expression eines Anthrax-Letalfaktor/HIV-gp120-Fusionsproteins
Restriktions-Endonucleasen und DNA-modifizierende Enzyme wurden bei Life Technologies, Boehringer Mannheim oder bei den New England BioLabs erworben.
Oligonukleotide wurden unter Anwendung eines automatisierten Nukleinsäure-Synthesizers (Applied Biosystems) synthetisiert und auf Oligonukleotid-Reinigungseinsätzen (Applied Biosystems) gereinigt. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit einem GeneAmp-Kit nach den Herstellerangaben durchgeführt (Perkin-Elmer Cetus). Die Vorbereitung der Bakterien-Medien, Restriktionsverdauen, Ligation und Phosphatase-Behandlung der DNA wurden gemäß Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook, s. o.).
a. Antigen-APABP Plasmidkonstruktion
Die Konstruktion des Plasmids, das zum Exprimieren des LF-gp120 Fusionsproteins in E. coli verwendet wurde, erfolgte wie folgt. Der pGEX-KG Vektor (Pharmacia), der einen Codierungsbereich für das Glutathion-S-Transferase-Protein enthält, wurde mit PCR-amplifiziertem LF und gp120 Gen-Sequenzen ligiert, um ein Plasmid zur Codierung eines Dreiweg-Fusionsproteins herzustellen. Das Fusionsprotein enthält den 26 kDa GST-Bereich, einen 14 Aminosäurelinker, Aminosäuren 1–254 des LF (SEQ ID NR: 1–2) und Aminosäuren 1–511 von gp120 (SEQ ID NR: 3–4).
Die DNA, die für Aminosäuren 1–254 des LF codiert, wurde vom Plasmid pLF7 mit Primern amplifiziert, die einmalige XbaI und MluI-Schnittstellen an die 5' bzw. 3' Enden hinzufügten (Robertson & Leppla, Gene 44: 71–78 (1986)). Die Sequenzen des Primers waren:
Die DNA, die für die Aminosäuren 1–511 von gp120 codiert, wurde von Plasmid HXB2-env mit Primern amplifiziert, die einmalige Schnittstellen für MluI und PstI an das 5' Ende und einmalige XbaI und XhoI-Schnittstellen an das 3' Ende des amplifizierten Gens hinzufügten (Page et al., J Virol. 64: 5270–5276 (1990)). Die Primer hatten folgende Sequenzen:
Primer 4 führte eine Stoppsequenz (TAA) nach der gp120-Codiersequenz ein.
Die amplifizierten DNA-Produkte und die pGEX-KG-Plasmid-DNA wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut. Die Vektor-DNA wurde mit bakterieller Alkalischer Phosphatase über 30 Minuten dephosphoryliert. Alle drei DNA-Fragmente wurden nach Elektrophorese durch Extraktion mit Phenol-Chloroform von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt, gemischt und über Nacht bei 16°C mit T4 DNA-Ligase ligiert.
Die ligierte DNA wurde dazu verwendet, chemisch kompetente E. coli zu transformieren (DH5α, hohe Effizienz, Life Technologies). Transformierte E. coli wurden auf Ampicillin-haltigen festen Medien (50 μg/ml) selektioniert und per Restriktionsanalyse des extrahierten Plasmids überprüft. Klone, die das erwartete Restriktionsmuster aufwiesen, wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die resultierende rekombinante Nukleinsäure im pGEX-KG-Vektor wurde als LF-gp120 Fusionsproteinkonstrukt bezeichnet. Der Carboxy-terminale Rest des Linkers von pGEX-KG wurde von D auf E geändert, und vier Reste, TRLQ, wurden zwischen den LF- und gp120-Abschnitten des Konstrukts aufgrund von DNA-Manipulationen hinzugefügt. Die LF-gp120 rekombinante Nukleinsäure codiert für ein Fusionsprotein, das ein berechnetes Molekulargewicht von 114'852 Dalton und einen berechneten pI von 7.00 aufweist.
b. Expression und Reinigung des LF-gp120 Fusionsproteins
Das LF-gp120 Fusionsproteinkonstrukt wurde zur Expression des dreiteiligen Fusionsproteins (GST-LF-gp120) verwendet. Glutathion-S-Transferase (GST) verleiht dem exprimierten Fusionsprotein typischerweise eine größere Löslichkeit und ermöglicht die Reinigung des Fusionsproteins auf Glutathion-Affinitätssäulen. Der GST-Bereich kann vom Fusionsprotein durch Verdau mit einer ortsspezifischen Protease, die einen Linkerbereich im Fusionsprotein erkennt, entfernt werden. In diesem Beispiel wurde der GST-Bereich nicht entfernt, zur Verwendung als Humanvakzin wird eine Entfernung jedoch bevorzugt. Die Expression und Reinigung der GST-LF-Fusionsproteine wurde bereits beschrieben (Arora & Leppla, Infect. Immun. 62: 4955–4961 (1994)). Expression und Reinigung des LF-gp120 Fusionsproteins in E. coli wurde wie folgt durchgeführt. Der E.-coli-Stamm SG12036 wurde mit dem rekombinanten LF-gp120-Fusionsproteinkonstrukt transformiert und in Vollmedium (superbroth, 100 μg/ml Ampicillin) unter Schütteln mit 225 UpM bei 37°C gezüchtet. Wenn die Zellendichte 0.6–0.8 bei A₆₀₀ erreichte, wurde die Expression des Fusionsproteins durch Zugabe von Isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 1 mM induziert.
Nach weiteren Inkubation von 2 Stunden wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugation pelletiert und dann in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 5 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin und 10 μg/ml 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid resuspendiert. Die bakteriellen Zellen wurden durch Beschallung zerstört, und die geklärten Extrakte auf eine Glutathion-Sepharose 46 Säule gegeben, die zuvor mit Puffer (100 mM Phosphat (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100) equilibriert wurde. Die Säule wurde extensiv gewaschen, und das gebundene Fusionsprotein wurde mit 10 mM Glutathion in 50 mM Tris (pH 8,0), 0.5 mM EDTA eluiert.
Das eluierte Protein wurde durch Ultrafiltration mit einem Centriprep-30-Gerät (Amicon) konzentriert und durch Elektrophorese auf nicht-denaturierenden und SDS-Polyacrylamid-Gels (Phast gels, Pharmacia) auf Reinheit analysiert. Proteinkonzentrationen wurden im Mikro-BCA-Verfahren mit Rinderserumalbumin als Standard (Pierce) ermittelt.
Beispiel 1B: Konstruktion und Expression eines Hepatitis-C-NS-5b/Anthrax-Letalfaktor-Fusionsproteins
Ein rekombinantes Plasmid, das für ein LF-NS-5b Fusionsprotein codiert, wird unter Anwendung der in Beispiel 1a beschriebenen Methoden konstruiert, wobei die DNA-Sequenzen, welche für das Hepatitis-C-Protein NS-5b codieren, für die DNA-Sequenzen, die für gp120 codieren werden, ausgetauscht werden.
Beispiel 2: Protektiv-Antigen-Plasmid-Konstruktion und Proteinexpression und Reinigung
Protektives Antigen wurde in B. anthracis vom Expressionsvektor pYS5 exprimiert und durch etablierte Verfahren gereinigt (Singh et al., J. Biol. Chem. 264: 19103–19107 (1989); Leppla, in Methods in Enzymology, Bd. 165, S. 103–116 (Harshman Hrsg., 1988). Die mutanten PA-Moleküle PA CFD und PA--D wurden durch ortsspezifische Mutagenese konstruiert und sind bereits beschrieben worden (Singh et al., J. Biol. Chem. 269: 29039–29046 (1994)). Die mutanten PA-Moleküle wurden in Beispiel 3 als Negativkontrollen eingesetzt.
Beispiel 3: In-vitro-Prasentation von LF-gp120-Antigen durch Maus-Mastocytoma-Zellen und Lyse mit einer zytotoxischen gp120-Effektor-T-Lymphozytenzelllinie
Das LF-gp120-Fusionsprotein und PA wurden in vitro auf ihre Fähigkeit getestet, dem Zellzytosol Antigen-Proteine für das Processing und die Präsentation mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Zellenoberfläche zuzuführen. Maus-Mastocytom-Zellen dienten als Antigen-präsentierende Ziel-Zelle. Zytotoxische T-Lymphozyten, die das Peptidepitop RGPGRRAFNTI von der V3-Schleife von gp120 erkannten, wurden mit einem ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay verwendet, um die spezifische Lyse der Antigen-präsentierenden Ziel-Zellpopulation zu untersuchen. Translokationsdefiziente, mutante PA-Proteine oder die Abwesenheit von PA dienten als Kontrollen zum Nachweis, dass das Verarbeiten des Fusionsproteins auf die Internalisierung über den PA-Rezeptor angewiesen ist.
a. Zelllinien
Folgende Zelllinien wurden in diesem Beispiel verwendet. P815, ein DBA/2-abgeleitetes (H-2^d)-Mastocytom (ATCC TIB-64), wurden als Ziel-Zellen im zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Assay verwendet. Diese Zellen wurden in RPMI1640, ergänzt mit 10% FCS, gehalten. Die HIV-gp120-spezifische CTL-Linie 9.23.3 erkennt das V3-Epitop RGPGRAFVTI, das bereits beschrieben wurde (Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 3105–3109 (1988); Alexander-Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 4102–4107 (1996); Shirai et al., J. Immunol. 148: 1657–1667 (1992)). Peptid P18IIIB, das dieses Epitop erkennt, wurde mit einem automatisierten Peptidsynthetisierer erzeugt (Applied Biosystems) und vor der Verwendung mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt. Die HIV gp120-spezifische CTL-Linie wurde aus BALG/C-Milzen gewonnen, die Mäusen entnommen wurden, welche zuvor mit einem rekombinanten Vakzin-Virus, der das gp120-Protein exprimiert, immunisiert wurden. 9.23.3 CTL wurden mit 10 μm freiem P18III6-Peptid zu 5 × 10⁵ CTL und 5 × 10⁶ bestrahlten Milzzellen [3000 Rad (1 Rad = 0.01 Gy)] pro Well in einer 24-Well-Platte mit 2 ml einer 1:1-Mischung aus RPMI1640-Medium und Eagle-Hank's-Aminosäuremedium (Eagle-Hank's amino acid medium/EHAA), ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat, nicht-essenziellen Aminosäuren, Penicillin, Streptomycin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 10% fetales Kälberserum und 10% T-stim (Collaborative Biomedical Products), stimuliert.
b. ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assaymethode
Die folgende Assaymethode diente zum Messen der Ziel-Zell-Lyse durch CTLs. ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assays wurden wie zuvor beschrieben ausgeführt (A lexander et al., J. Exp. Med. 173: 849–858 (1991)). Wenn dies angemessen war, wurden die Ziel-Zellen mit PA (100 ng/ml) und/oder LF-gp120 Fusionsprotein (50 ng/ml, wenn mit 9.23.3 CTL verwendet) 12 Stunden in Serumfreiem Medium behandelt. Nach der Behandlung wurden die Ziel-Zellen (5 × 10⁵ Zellen) mit 200 μCi (1 Ci = 37 Gbq) Na₂ ⁵¹CrO₄ in 100 μl RPMI1640 2 Stunden lang bei 37°C markiert. In einigen Fällen wurden die Ziel-Zellen während der Markierung mit Peptid (1.0–10.0 μM) gepulst. Nach der Markierung wurden die Ziel-Zellen 3 Mal gewaschen und mit 3000 Zellen/Well zusammen mit der entsprechenden Anzahl an Effektor-Zellen in 96-Well-Rundbodenplatten gegeben. Die Überstände wurden nach 6 Stunden geerntet und in einem ISOMEDIC Gammazähler gezählt/gecounted (ICN, Horsham, PA). Der Mittelwert von drei Proben wurde berechnet und gemäß nachstehender Formel die prozentuale ⁵¹Cr-Freisetzung berechnet. Prozent ⁵¹Cr-Freisetzung = 100 × [(experimentelle ⁵¹Cr-Freisetzung – Kontroll-⁵¹Cr-Freisetzung)/(maximale ⁵¹Cr-Freisetzung – Kontroll-⁵¹Cr-Freisetzung)], wobei die experimentelle ⁵¹Cr-Freisetzung Zahl/Counts von Ziel-Zellen gemischt mit Effektorzellen darstellt, die Kontroll-⁵¹Cr-Freisetzung Ziel-Zellen gemischt mit dem Medium alleine (Spontanfreisetzung) und die maximale ⁵¹Cr-Freisetzung Zahl/Counts von Ziel-Zellen darstellt, die mit 2.5% Triton X-100 exponiert wurden.
c. Spezifische Zelllyse von Ziel-Zellen, die mit LF-gp120 Fusionsproteinen sensibilisiert wurden, durch HIV gp120-spezifischen CTL
Zur Messung der gp120 Antigen-Präsentation über das Processing von LF-gp120 im MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren wurde die Maus-Mastocytom-Zelllinie P815 mit PA oder PA-Mutanten und/oder LF-gp120 Fusionsprotein für 12 Stunden unter Serum-freien Bedingungen inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und zur Verwendung als Ziel-Zellen mit ⁵¹Cr markiert. Die markierten P815 Ziel-Zellen wurden in unterschiedlichen Verhältnissen mit der Effektor-CTL-Zelllinie 9.23.3 gemischt. Das Töten der Ziel-Zellpopulation wurde durch Messen der Freisetzung von ⁵¹Cr in das Medium festgestellt.
Ziel-Zellen, die mit Wildtyp-PA und LF-gp120 Fusionsprotein behandelt waren, wurden wirksam erkannt und durch die 9.23.3 CTL Linie lysiert. Die Erkennung und Lyse war abhängig von der Anwesenheit funktionalen PAs, womit demonstriert wird, dass das Processing und die Präsentation des Fusionsproteins auf die Internalisierung über den PA-Rezeptor angewiesen ist.
Die Behandlung mit einem translokationsdefizienten, mutanten PA-Protein (Singh et al., J. Biol. Chem. 269: 29039–29046 1994)) oder ohne Zugabe von PA ergab eine minimale Lyse der Ziel-Zellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine begrenzte Menge LF-gp120 extrazellulär proteolytisch abgebaut wird, so dass die Ziel-Zellen ohne aktiven Transport in das Zytosol sensibilisiert werden. Dieses Ergebnis impliziert, dass das LF-gp120 Fusionsprotein den Zugang zum Zellzytosol für ein effizientes Processing und Präsentation über den MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren benötigt. Die Behandlung mit PA allein, mutantem PA allein oder der LF-gp120-Fusion allein hat die Ziel-Zellen nicht für die Lyse sensibilisiert. Als positive Kontrolle wurde das Peptid P18IIIB zum externen Medium der Ziel-Zellen hinzugefügt. Die Inkubation der Ziel-Zellen in Anwesenheit von P18IIIB führte zur Zelllyse, wenn Effektor-Zellen hinzugefügt wurden.
Beispiel 4: In-vivo-Immunreaktion auf LF-gp120 Fusionsprotein in Mäusen
Mäuse wurden in vivo für die MHC-Klasse-I-Präsentation von gp120 und die Stimulierung spezifischer CTL durch Verwendung des LF-gp120 Fusionsproteins getestet. LF-gp120 und PA wurden Mäusen in einer Einzelinjektion der Zusammensetzung in 100 μl PBS subkutan und intraperitoneal verabreicht.
Die Testtiere wurden auf eine spezifische zellvermittelte Immunreaktion getestet, wofür ein CTL-Assay wie in Beispiel 3 beschrieben zur Anwendung kam. Mäuse, denen die PA/LF-gp120-Zusammensetzung injiziert wurde, wurden nach drei Wochen geopfert, und ihre Milzen wurden zur Gewinnung von CTLs geerntet. Die CTLs wurden in vitro mit einem in Beispiel 3 beschriebenen kleinen Peptid restimuliert, das ein gp120-Epitop erkennt. Die CTLs wurden dann mit Antigen-präsentierenden Zellen gemischt (Maus- Mastocytom-Zellen, die mit LF-gp120 und PA behandelt wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben). Lyse der Antigen-präsentierenden Zellen durch die CTL-Population wurde in einem ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay gemessen, wie oben beschrieben. Die mit der PA/LF-gp120-Zusammensetzung injizierten Mäuse zeigten eine starke CTL-Reaktion auf gp120-präsentierende Zellen.
Beispiel 5: In-vivo-Immunreaktion auf LF-gp120-Fusionsprotein in Menschen
Eine Testperson, die HIV-negativ ist, wird auf eine Immunreaktion auf eine sterile Vakzinformulierung des LF-gp120-Fusionsproteins getestet. Die sterile Vakzinformulierung ist aus einer Einheitsdosis LF-gp120 mit einem 2–4-fachen Molüberschuss von PA in PBS zusammengesetzt. Eine typische Einheitsdosis ist 10 ng LF-gp120 Fusionsprotein pro Kilogramm der Testperson. Die Vakzinformulierung wird subkutan in zwei Dosen verabreicht. Die erste Dosis wird zum gewählten Datum gegeben, eine zweite Dosis folgt einen Monat nach der ersten Dosis.
Die Immunreaktion auf das verabreichte Vakzin wird durch Testen des Subjekts auf gp120 Antikörperproduktion gemessen. Die Blutabnahme erfolgt in einem Standardplan nach einem Standardverfahren von den Testpersonen, die das Vakzin erhielten, und Antikörper gegen gp120 werden mit Standard-ELISA und Western-Blot-Techniken gemessen.
Als spezifischerer Test für die zelluläre Immunreaktion kommt ein Hauttest oder ein Test mit gereinigtem Proteinderivat (purified Protein derivative/PPD) zur Anwendung. Eine Einheitsdosis der PA/LF-gp120-Zusammensetzung in PBS wird nach Standardverfahren unter die Haut der zuvor immunisierten Testperson injiziert. Der Bereich wird nach 48–72 Stunden auf Rötung und Schwellung untersucht, die eine zelluläre Immunreaktion auf Basis einer früheren Exponierung am Antigen anzeigen (vgl. Harrison's Principles of Internal Medicine (Isselbacher et al., Hrsg., 13. Ed. 1994).

Claims

Zusammensetzung, die geeignet ist, in einem Säugetier eine Immunreaktion auf zytotoxische T-Zellen-Epitope eines Polypeptids auszulösen, wobei die Zusammensetzung eine Einheitsdosis des Anthrax-protektiven Antigens (PA) Bacillus anthracis und des an ein Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein (APABP) gebundenen Polypeptids umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein Volllängen-Protein ist, wobei das Molverhältnis des PA zu dem an das APABP gebundenen Volllängen-Protein grösser als eins ist und wobei das APABP mindestens die ersten 250 Aminosäurereste des Letalfaktors (LF) des Bacillus anthracis und weniger als alle Aminosäurereste des LF umfasst und wobei die Einheitsdosis eine Menge ist, die ausreicht, eine zytotoxische T-Lymphozyten-Immunreaktion auszulösen.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, wobei das Anthrax-protektive Antigen (PA) Bacillus anthracis ein modifiziertes PA ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung steril ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung des weiteren physiologisch kompatible Salze umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Zusammensetzung eine wässrige Lösung physiologisch kompatibler Salze ist.
Verwendung einer sicheren und wirksamen Menge eines binären, zytotoxischen T-Lymphozyten-Vakzins in der Herstellung eines Medikaments zur Generierung einer Immunreaktion in einem Säugetier gegen zytotoxische T-Zellen-Epitope eines spezifischen Volllängen-Protein-Antigens, wobei das Vakzin ein Anthrax-protektives Antigen (PA) Bacillus anthracis umfasst und das Volllängen-Protein-Antigen, das an ein nicht-toxisches Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein (APABP) gebunden ist, mindestens die ersten 250 Aminosäurereste des Letalfaktors (LF) des Bacillus anthracis und weniger als alle Aminosäurereste des LF umfasst, wobei das Volllängen-Protein-Antigen in einem Zytosol-MHC-Klasse-I-Processing-Verfahren in mehrere Epitope verarbeitet und von MHC-Klasse-I-Molekülen an zytotoxischen T-Lymphozyten präsentiert wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Anthrax-protektive Antigen (PA) Bacillus anthracis ein modifiziertes PA ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei das Vakzin steril ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Vakzin des weiteren physiologisch kompatible Salze umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Vakzin eine wässrige Lösung physiologisch kompatibler Salze ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei das Molverhältnis des Anthrax-protektiven Antigens (PA) Bacillus anthracis zu dem an ein Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein (APABP) gebundenes Antigen grösser als eins ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei das Vakzin über eine parenterale Injektion verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei das Vakzin über eine subkutane Injektion verabreicht werden soll.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 13, wobei das Vakzin in einer Einheitsdosierung verabreicht werden soll, die zwischen 10 und 500 Nanogramm eines an ein Anthrax-protektives Antigen-bindendes Protein (APABP) gebundenen Antigens pro Kilogramm des Säugetieres beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, wobei das APABP den Aminosäuren 1–254 des Letalfaktors (LF) von Bacillus anthracis entspricht.