DE69636735T2

DE69636735T2 - Immunogene, ungiftige choleratoxinmutante

Info

Publication number: DE69636735T2
Application number: DE69636735T
Authority: DE
Inventors: Mariagrazia Pizza; Rita Maria FONTANA; Valentina Giannelli; Rino Rappuoli
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2016-07-02
Also published as: US7872114B2; ATE346930T1; EP1788087A1; PT835314E; EP0835314B1; DK0835314T3; WO1997002348A1; ES2278385T3; DE69636735D1; US20050136076A1; US20040137017A1; AU6238896A; GB9513371D0; US7632513B2; EP0835314A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft immunogene detoxifizierte Proteine von Choleratoxinen (CT) oder von hitzelabilen Toxinen (LT), die von enterotoxigenen Stämmen von Escherichia coli (E. coli) hergestellt werden, wobei die Aminosäuren an oder in Positionen entsprechend Ser-63 und Arg-192 durch eine andere Aminosäure ersetzt sind, und ihre Verwendung in Impfstoffen, die für die Prävention oder die Behandlung von Cholera oder enterotoxigenen Escherichiacoli-Infektionen verwendbar sind, und als mukosale Adjuvantien für andere immunogene Proteine. Die detoxifizierten immunogenen Proteine können unter Verwendung der rekombinanten DNA-Techniken durch ortsgerichtete Mutagenese mit einer DNA, die die Wildtyp-Toxine codiert, in geeigneter Weise hergestellt werden.
Hintergrund zur Erfindung
Cholera ist eine ansteckende Krankheit, die auf der Welt weit verbreitet ist, insbesondere in der Dritten Welt, wo sie in bestimmten Gebieten endemisch ist. Die schwerwiegenden Störungen, die sich im Darmsystem entwickeln, erweisen sich bei einem hohen Prozentsatz der erfassten Fälle der Krankheit als tödlich.
Das ätiologische Agens der Cholera ist der gram-negative Mikroorganismus Vibrio cholerae (V. cholerae). Dieser besiedelt den Darmtrakt von Individuen, die durch Nahrungsaufnahme von kontaminiertem Essen oder Wasser mit ihm in Kontakt gekommen sind, und sie vervielfachen sich zu sehr hohen Konzentrationen. Das hauptsächliche Symptom ist eine schwere Diarrhö, demzufolge ein Patient 10–15 Liter Flüssigkeit pro Tag über die Fäkalien verlieren kann. Als Ergebnis der schweren Austrocknung und des Verlustes von Elektrolyten widersteht der Patient der Infektion in 50–60% der Fälle nicht und stirbt. Die durch V. cholerae verursachte Diarrhö ist auf die Sekretion des Choleratoxins, CT, zurückzuführen, das durch Stimulierung der Aktivität des Adenylatcyclase-Enzyms wirkt, wobei Störungen auf Zellebene herbeigeführt werden.
Obwohl Cholera mittels kontrollierter und intensiver Rehydratation erfolgreich behandelt werden kann, ist im Hinblick auf vollständige Kontrolle und zukünftige Ausrottung der Krankheit die Verbreitung eines Impfstoffes wünschenswert.
Derzeit gibt es eine Impfung gegen Cholera, die aus einer parenteralen Verabreichung abgetöteter Bakterien besteht. Obwohl einige Länder auf die Impfung gegen die Krankheit bestehen, gibt es ernsthafte Zweifel hinsichtlich ihrer tatsächlichen Zweckmäßigkeit, angesichts der Tatsache, dass der derzeitige zelluläre Impfstoff in nur 50% der Fälle gegen die Folgen der Infektion schützt, und dass der Schutz zeitlich auch stark begrenzt ist, nämlich auf weniger als sechs Monate.
In Bangladesch ist eine experimentelle Studie mit Oralimpfstoff im Gange (1990–92), der aus abgetöteten Bakterien mit einem Zusatz der Untereinheit B des Choleratoxins besteht, dass als hoch immunogen bekannt ist. Dieses Produkt ist erfolgreich im Herbeiführen eines anhaltenden Schutzes ohne besondere Nebenwirkungen (Holmgren J., Clemens J., Sack DA., Sanchez J. and Svennerholm AM; „Oral Immunization against cholera" Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1988), 146, 197–204).
Das Choleratoxin gleicht den hitzelabilen Toxinen der enterotoxigenen Escherichia coli-Stämme im Hinblick auf Aminosäuresequenz, Struktur und Wirkungsweise.
Die Folgeerscheinungen einer Infektion mit einem enterotoxigenen Stamm von E. coli sind im Vergleich zu denjenigen von Cholera ähnlich, wenn auch weniger gravierend, und bestehen aus schwerer Diarrhö und Darmstörungen.
Alle CT- und LT-Toxine enthalten eine einzelne Untereinheit A (oder Protomer A), die für die enzymatische Aktivität des Toxins (hier CT-T oder LT-A) verantwortlich ist und fünf identische Untereinheiten B (oder Protomer B), die an der Bindung des Toxins an die Darmepithelzellen (hier CT-B oder LT-B) beteiligt sind.
Die Untereinheit A durchdringt die Zellmembran und bewirkt eine Aktivierung von Adenylatcyclase durch eine NAD-abhängige ADP-Ribosylierung eines GTP-bindenden Proteins, das die Aktivität des Enzyms steuert. Die klinische Wirkung davon ist die Verursachung von starken Flüssigkeitsverlusten in den Darm.
Umfangreiche Forschungen sind mit dem Choleratoxin und den hitzelabilen E. coli-Toxinen durchgeführt worden.
Die Sequenz von CT ist bekannt und beschrieben worden (Mekalanos J. J. et al. Nature 306, Seite 551 (1983)).
Die Sequenz des von den enterotoxigenen Stämmen von E. coli stammenden LT ist, wie erwähnt, zu der von CT zu 80% homolog, und sie ist ebenfalls bekannt und in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Spicer E. K. et al. (Biol. Chem. 257 p. 5716–5721 (1982)) beschreiben die Aminosäuresequenz der in Schweinen gefundenen Untereinheit A des hitzelabilen Toxins eines enterotoxigenen Stammes von E. coli.
Eine bakterielle chromosomale Form von LT ist von Pickett C. L. et al. (J. Bacteriol. 169, 5180–5187, (1987) identifiziert und sequenziert worden.
Auch die Untereinheit A von LT eines E. coli-Stammes, der bekannt ist, auf Menschen zu wirken, ist sequenziert worden (Yamamoto et al., J. Biol. Chem, 259, 5037–5044, (1984)).
Im Hinblick auf die mögliche klinische Bedeutung eines Impfstoffes gegen Cholera und enterotoxigene Bakterien gibt es ein fortlaufendes und großes Interesse an der Herstellung eines detoxifizierten Toxins, das fähig ist, gegen Cholera und enterotoxigene Bakterien zu immunisieren. Die Verfahren der Gentechnik erlauben es, dass spezifische Mutationen in die Gene, die die Toxine codieren, eingeführt werden und die Herstellung der mutierten Toxine unter Verwendung nun üblicher Verfahren für die Genexpression und Proteinreinigung.
Verschiedene Gruppen haben versucht, Genmutationen zu identifizieren, die den Verlust der Toxizitätseigenschaften der codierten Proteine umfassen. Die Studien sind vorrangig im Hinblick auf das Gen für das Toxin LT von E. coli ausgeführt worden.
Harford, S. et al. (Eur. J. Biochem. 183, Seite 311 (1989)) beschreiben die Herstellung eines für Schweine pathogenen Toxoids durch in vitro-Mutagenese des LT-A-Gens von E. coli. Die so erhaltene erfolgreiche Mutation enthielt eine Ser-61-Phe-Substitution und eine Gly-79-Lys-Substitution, wobei die erstgenannte als wichtiger angesehen wurde. Hartford et al. legen nahe, dass wegen der Ähnlichkeiten der für Menschen und Schweine pathogenen LT-A-Gene von E. coli und des CT-A-Gens, und weil angenommen wird, dass die Toxine nach einem gemeinsamen Mechanismus agieren, es möglich sein könnte, ein Cholera-Holotoxoid durch Einführung einer Ser-61-Phe-Mutation in das CT-A-Gen herzustellen.
Tsuji, T. et al. (J. Biol. Chem. 265, S. 22520 (1990)) beschreiben die Mutation des LT-A-Gens aus dem Plasmid EWD299, um eine einzelne Substitution Glu-112-Lys herzustellen, die die Toxizität der Mutante LT beeinflusst, jedoch die Immunogenität des Proteins nicht verändert.
Grant, C. C. R. et al. (Abstract B289 of the 92nd General Meeting of the American Society for Microbiology, 26–30^th May 1992) beschreiben konservative Substitutionen von Histidinen in den Positionen 44 und 70 und von Tryptophan in Position 127 in LT-A, was in signifikanten Abnahmen der Enzymaktivität resultiert.
Einige Arbeiten sind im Hinblick auf Mutationen von CT durchgeführt worden. Fontana et al., (1995) Infection and Immunity, 63 (6): 2356–2360, beschreiben die CT-K63-Mutante. Es wurde gezeigt, dass diese Mutante fähig ist, in Kaninchen neutralisierende Antikörper gegen beide Untereinheiten, A und B, zu induzieren.
Kaslow, H. R. et al. (Abstract B291 of the 92nd General Meeting of the American Society for Microbiology, 26–30^th May 1992) beschreiben eine Mutation in den Positionen Asp-9 und His-44 und ein Verkürzen nach Aminosäure 180 in CT-A, die alle im Wesentlichen die Aktivität eliminieren. Es wird gesagt, dass die Mutation von Arg-9 die Aktivität merklich abschwächt. Die Mutation an anderen Aminosäureorten hatte wenig Einfluss auf die Toxizität.
Burnette, W. N. et al. (Inf. and Immun. 59(11), 4266–4270, (1991)) beschreiben eine ortsspezifische Mutagenese von CT-A, um eine Arg-7-Lys-Mutation herzustellen, entsprechend einer bekannten detoxifizierenden Mutation in der Untereinheit A des Bordetella pertussis-Toxins. Die Mutation wirkt sich in der vollständigen Aufhebung nachweisbarer ADP-Ribosyltransferase-Aktivität aus.
Die internationale Patentanmeldung WO 92/19265 (Burnette, Kaslow and Amgen Inc.) beschreibt Mutationen von CT-A an Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, His-70 und Glu-112.
Mutationen an Glu-110 (LT und CT) und Arg-146 (LT) sind außerdem in der Literatur beschrieben worden (Lobet, Inf. Immun., 2870, 1991; Lai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 341 1983; Okamoto J. Bacteriol. 2208, 1988).
Die Kristallstruktur von LT ist von Sixma et al. (Nature, 351, 371–377, May 1991) bestimmt worden, und bestätigt die schon früher in der Literatur beschriebenen Mutageneseergebnisse, die strukturell die Signifikanz von Glu-112 und Ser-61 für die Aktivität der Untereinheit A erklären und nahelegen, dass His-44, Ser-114 und Arg-54, die sich in nächster Nachbarschaft befinden, wichtig für die Katalyse oder Erkennung sein könnten.
Es ist bekannt, dass die Entwicklung der Toxizität der Untereinheit A von CT und LT eine proteolytische Spaltung der Untereinheiten A1 und A2 um Aminosäure Arg-192 herum benötigen (Grant et al. Inf. & Immun. (1994) 62(10) 4270–4278).
Immunogene detoxifizierte Proteine umfassen die Aminosäuresequenz der Untereinheit A des Choleratoxins (CT-A), oder ein Fragment davon, oder die Untereinheit A eines hitzelabilen Toxins (LT-A) von Escherichia coli oder ein Fragment davon, wobei eine oder mehrere Aminosäuren an oder in Positionen entsprechend Val-53, Ser-63, Val-97, Tyr-104 oder Pro-106 durch eine andere Aminosäure, offenbart in WO 93/13202 (Biocine Sclavo SpA), ersetzt sind. Gegebenenfalls kann die Aminosäuresequenz andere Mutationen wie beispielsweise Substitutionen an einer oder mehreren Positionen von Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, Arg-54, Ser-61, His-70, His-107, Glu-110, Glu-112, Ser-114, Trp-127, Arg-146 oder Arg-192 einschließen.
Es ist berichtet worden, dass detoxifizierte Mutanten des Pertussis-Toxins für beides, die direkte intranasale Impfung und als mukosales Adjuvans für andere Impfstoffe, verwendbar sind (Roberts et al. Inf. & Immun. (1995) 63(6) 2100–2108). Die publizierte internationale Patentanmeldung WO 95/17211 (Biocine SpA) beschreibt die Verwendung von detoxifizierten Mutanten von CT und LT als mukosale Adjuvantien.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben entdeckt, dass eine doppelte Mutation der CT- oder LT-Aminosäuresequenz ein immunogenes detoxifiziertes Protein mit verbesserten Stabilitätseigenschaften ergibt. Obwohl wir früher gezeigt haben, dass eine Mutation an Ser-63 CT und LT detoxifiziert, haben weitere Experimente gezeigt, dass unerwarteterweise die Mutation um die Position Arg-192 die Stabilität des so erhaltenen Proteins merklich verbessert. Proteinstabilität ist ein kritischer Faktor im Design aktiver Agenzien zur Verwendung in Impfstoffen, da die Halbwertszeit eines solchen Agens mit der Wirksamkeit des Impfstoffes korreliert. Längerlebige Agenzien liefern eine bessere Impfung, indem sie die Möglichkeit bieten, den Bedarf an Adjuvantien zu reduzieren oder auch die Impfkur zu verkürzen. In gleicher Weise beeinflusst die Stabilität die Wirksamkeit eines wirksamen Agens, das in einer Zusammensetzung vorliegt, im Hinblick auf seine Adjuvansaktivität.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein immunogenes detoxifiziertes Protein bereitgestellt, das die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines Choleratoxins (CT-A), oder ein Fragment davon, oder die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines hitzelabilen Toxins (LT-A) von Escherichia coli, oder ein Fragment davon, umfasst, wobei die Aminosäuren an oder in Positionen entsprechend Ser-63 und Arg-192 durch eine andere Aminosäure ersetzt sind.
In dieser Beschreibung umfassen die Verweise auf CT und LT sowohl die verschiedenen natürlich vorkommenden Stammvarianten als auch andere Varianten, die, Veränderungen von den hier offenbarten Sequenzen umfassen, die die Immunogenität des zusammengefügten Toxoids nicht beeinflussen.
Die Aminosäuresequenzen für CT und LT sind definitiv in Domenighini et al. Molecular Microbiology (1995) 15(6) 1165–1167 beschrieben.
Die Aminosäure, die die Wildtyp-Aminosäure ersetzt, kann eine natürlich vorkommende oder eine modifizierte Aminosäure oder eine synthetische Aminosäure sein, mit der Maßgabe, dass die Mutante die notwendigen immunogenen Eigenschaften behält und eine substantiell reduzierte Toxizität zeigt. Die Substitution kann eine Deletion einer Aminosäure mit sich bringen.
Es werden im Allgemeinen Substitutionen bevorzugt, die die Amphoterie und die Hydrophilie verändern, während die sterische Wirkung der substituierten Aminosäure so weit wie möglich beibehalten wird.
Wie hier verwendet, meint der Begriff „detoxifiziert", dass die immunogene Zusammensetzung eine im Verhältnis zu ihrem natürlich vorkommenden entsprechenden Toxin eine substantiell niedrigere Toxizität zeigt. Die wesentlich niedrigere Toxizität sollte für das Protein genügend niedrig sein, um es in einer immunogenen Zusammensetzung in einer immunologisch wirksamen Menge als einen Impfstoff mit der Verursachung signifikanter Nebenwirkungen verwenden zu können. Zum Beispiel sollte das immunogene detoxifizierte Protein eine Toxizität von weniger als 0.01% der Toxizität des natürlich vorkommenden entsprechenden Toxins haben. Die Toxizität kann in CHO-Zellen der Maus gemessen werden, oder vorzugsweise durch die Bestimmung von den in Y1-Zellen herbeigeführten morphologischen Veränderungen. Der Begriff „Toxoid" meint ein genetisch detoxifiziertes Toxin.
Das immunogene Protein kann eine Untereinheit A des CT- oder LT-Toxoids sein, aber es ist vorzugsweise ein zusammengesetztes Toxinmolekül, das eine mutierte Untereinheit CT-A oder LT-A und fünf Untereinheiten B von CT oder LT umfasst. Die Untereinheit B kann eine natürlich vorkommende Untereinheit sein oder kann selbst mutiert sein.
Das immunogene Protein ist vorzugsweise eine natürlich vorkommende CT-A oder LT-A, die, wie vorstehend beschrieben, passend modifiziert wurde. Es können allerdings Austausche von konservativen Aminosäuren gemacht werden, die die Immunogenität oder die Toxizität des immunogenen Toxins nicht beeinflussen, und die vorzugsweise die Fähigkeit des immunogenen Proteins, ein mit dem Untereinheit B-Protein komplettes Toxin zu bilden, nicht beeinflussen. Außerdem kann das immunogene Protein ein Fragment von CT-A oder eine LT-A sein, mit der Maßgabe, dass das Fragment immunogen und nicht toxisch ist, und dass es wenigstens eine der konservierten Regionen enthält, die eine der Mutationen gemäß der Erfindung enthält.
Beide Positionen, Ser-63 und Arg-192, werden in dem detoxifizierten Protein der Erfindung modifiziert. Vorzugsweise wird Ser-63 durch Lys-63 ersetzt. Vorzugsweise wird Arg-192 durch Asn-192 oder Gly-192 ersetzt. Am meisten bevorzugt wird Ser-63 durch Lys-63 und Arg-192 durch Asn-192 oder Gly-192 ersetzt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung für die Verwendung als Impfstoff bereitgestellt, die ein immunogenes detoxifiziertes Protein des ersten Aspekts der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die Erfindung liefert außerdem eine Impfstoffzusammensetzung, die ein immunogenes detoxifiziertes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die Impfstoffzusammensetzung kann weiterhin ein Adjuvans umfassen. In einer anderen Ausführungsform kann die Impfstoffzusammensetzung ein zweites Antigen umfassen, das fähig ist, eine immunologische Antwort auf eine andere Krankheit hervorzurufen. In solch einer anderen Zusammensetzung agiert das immunogene detoxifizierte Protein als mukosales Adjuvans.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Impfen eines Säugers gegen Vibrio cholerae oder einen enterotoxigenen Stamm von Escherichia coli hergestellt, das die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst. Gegebenenfalls kann das immunogene detoxifizierte Protein der Erfindung als ein Adjuvans für ein zweites immunogenes Protein agieren, welches getrennt, sequentiell oder mit dem immunogenen detoxifizierten Protein der Erfindung verabreicht wird.
Die immunogenen detoxifizierten Proteine der Erfindung könnten mittels konventioneller Peptidsyntheseverfahren chemisch synthetisiert werden, aber vorzugsweise werden sie mittels rekombinanter DNA-Mittel hergestellt.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein immunogenes detoxifiziertes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung codiert.
Vorzugsweise enthält die DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz, die eine vollständige CT oder LT umfassende DNA codiert, die beide, die detoxifizierte Untereinheit A und Untereinheit B in einer polycistronischen Einheit codiert. In einer anderen Ausführungsform kann die DNA nur die detoxifizierte Untereinheit A codieren.
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der eine DNA gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung trägt.
Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung wird eine Wirtszelllinie bereitgestellt, die mit dem Vektor gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung transformiert wurde.
Die Wirtszelle kann irgendein Wirt sein, der fähig ist, CT oder LT herzustellen, vorzugsweise aber ein Bakterium, besonders bevorzugt E. coli oder V. cholerae, die passend verändert wurden, um das gewünschte immunogene detoxifizierte Protein herzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform des sechsten Aspekts der Erfindung kann die Wirtszelle selbst eine schützende Art bereitstellen, zum Beispiel ein E. coli- oder V. cholerae-Stamm, der zu einem Phänotyp mutiert ist, dem der LT- oder CT-Wildtyp fehlt und der ein immunogenes detoxifiziertes Protein des ersten Aspekts der Erfindung trägt und exprimiert.
In einer weiteren Ausführungsform des sechsten Aspekts der Erfindung ist die Wirtszelle fähig, ein chromosomales LT-A-Gen gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zu exprimieren.
Gemäß einem siebten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, das das Züchten einer Wirtszelle gemäß dem sechsten Aspekt der Erfindung umfasst.
Gemäß einem achten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion der DNA gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, das die Schritte der Durchführung einer ortsgerichteten Mutagenese mit einer DNA umfasst, die ein CT-A oder ein LT-A oder ein Fragment davon codiert.
Gemäß einem neunten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffes bereitgestellt, das das Zusammenbringen eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls mit einem Adjuvans umfasst.
Industrielle Anwendbarkeit
Das immunogene detoxifizierte Protein der Erfindung bildet die aktive Komponente einer Impfstoffzusammensetzung, die für die Prävention und die Behandlung von Cholerainfektionen oder Infektionen von enterotoxigenen Stämmen von E. coli verwendbar ist. Das immunogene detoxifizierte Protein kann außerdem als mukosales Adjuvans in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet werden. Dementsprechend sind die Zusammensetzungen für die Verwendung in der pharmazeutischen Industrie einsetzbar.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 Western-Blot der periplasmatischen Extrakte von E. coli-TG1-Stämmen, die den Wildtyp LT, die Mutanten LTG192 oder LTK63/G192 exprimieren, die die Untereinheiten A und B zeigen. Gereinigtes LTK63 ist als Kontrolle verwendet worden.
2 Western-Blot des gereinigten Wildtyps LT und der Mutanten LTK63, LTG192, LTK63/G192, die bei 37°C zu Beginn, beziehungsweise nach 15, 30 und 90 Minuten mit Trypsin behandelt wurden. (Toxin-Trypsin-Verhältnis ist 1:100, Inkubationspuffer TEAN pH 7,5).
3 Western-Blot des gereinigten Wildtyps LT und der Mutanten LTK63, LTG192, LTK63/G192, die bei 37°C zu Beginn, beziehungsweise nach 5, 15, 30, 45, 60 Minuten mit Trypsin behandelt wurden. (Toxin-Trypsin-Verhältnis ist 1:100, Inkubationspuffer TEAN pH 7,5 + 3,5 M Harnstoff).
4 Western-Blot der gereinigten Mutante LTN192, die zu Beginn beziehungsweise 15, 30, 45, 60 Minuten mit Trypsin behandelt wurde. (Toxin-Trypsin-Verhältnis ist 1:100, Inkubationspuffer TEAN pH 7,5 + 3,5 M Harnstoff).
5 Titer von Anti-LT-IgG in den Seren von Mäusen nach 36tägiger Immunisierung mit 1 μg LTK63 beziehungsweise LTK63/G192. Vier Mäuse jeder Gruppe wurden mit LTK63 oder LTK63/G192 i.n. immunisiert. Die Seren jeder Gruppe wurden vereint und Proben getestet. Titer wurden als der Reziprokwert der Verdünnung entsprechend OD₄₅₀ = 0.3 bestimmt.
6 Der Western-Blot zeigt die Expression der Mutanten CT und LT in E. coli in die proteolytische Schleife und Analyse der Resistenz gegen Trypsinbehandlung. Bahn 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, periplasmatischer Extrakt von E. coli, die Mutanten LT und CT exprimierend, mit 13,5 μg/ml Trypsin bei 37°C 15 Minuten behandelt, Bahn 8, gereinigtes CT. Bahn 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, periplasmatischer Extrakt von E. coli, die Mutanten CT und LT exprimierend, unbehandelt. Eine ungespaltene Untereinheit A des Moleküls LT und CT; A1, gespaltene Untereinheit A; Bm, Monomer B.
7 Der Western-Blot zeigt die Expression der Mutanten CT und LT im 0395 V. cholerae-Stamm in die proteolytische Schleife, um die Resistenz bei der spezifischen Protease (Hämagglutinin/Protease) zu prüfen. Bahn 1, LT gereinigt. Bahn 2, 3, 4, Überstand von V. cholerae 0395, die Mutante LT exprimierend. Bahn 5, CT gereinigt. Bahn 6, 7, 8, 9, Überstand von V. cholerae 0395, die Mutante CT exprimierend. Eine ungespaltene Untereinheit A des Moleküls LT und CT; A1, gespaltene Untereinheit A; Bm, Monomer B.
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung
Die Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, konventionelle Verfahren der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie, die in das Fachgebiet gehören, einsetzen. Solche Techniken sind ausführlich in der Literatur erklärt. Siehe z. B.
Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D. N Glover Hrsg. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); the series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller and M. P. Calos Hrsg. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Bd. 154 und Bd. 155 (Wu und Grossman, und Wu, Hrsg.), Mayer und Walker, Hrsg. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, zweite Auflage (Springer-Verlag, N. Y.), und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, BÄNDE I–IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell Hrsg. 1986).
Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren werden in dieser Anmeldung verwendet. Alle hier zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind durch Bezugnahme eingeschlossen.
Im einzelnen werden die folgenden Abkürzungen für die Aminosäuren verwendet:
Wie vorstehend erwähnt, können Beispiele von immunogenen detoxifizierten Proteinen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Polypeptide mit geringen Aminosäureveränderungen der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins neben denen mit Mutationen, die besonders erwähnt werden, einschließen.
Ein signifikanter Vorteil der Herstellung des immunogenen detoxifizierten Proteins mittels rekombinanter DNA-Verfahren anstatt der Isolierung und Reinigung eines Proteins aus natürlichen Quellen ist die Herstellung äquivalenter Mengen des Proteins bei Verwendung von weniger Startmaterial als bei Isolierung des Proteins aus einer natürlichen Quelle benötigt würde. Die Herstellung des Proteins mittels rekombinanter Verfahren erlaubt außerdem, das Protein in Abwesenheit von einigen Molekülen, die üblicherweise in Zellen anwesend sind, zu isolieren. In der Tat können Proteinzusammensetzungen völlig frei von jeglicher Spur menschlicher Proteinverunreinigungen leicht hergestellt werden, da das einzige menschliche Protein, das von dem rekombinanten nicht-menschlichen Wirt hergestellt wird, das anstehende rekombinante Protein ist. Mögliche virale Agenzien aus natürlichen Quellen und für die Menschen pathogene Virusbestandteile werden auch vermieden. Außerdem wandelt sich das genetisch detoxifizierte Toxin weniger leicht in eine Toxinform um als mehr traditionelle, chemisch detoxifizierte Toxine.
Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen jegliche Träger ein, die nicht selbst die Bildung von Antikörpern herbeiführen, die für das Individuum schädlich sind, das die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate (wie Öltropfen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Zusätzlich können diese Träger als immunstimulierende Agenzien (Adjuvantien) funktionieren.
Bevorzugte Adjuvantien zur Erhöhung der Wirkung der Zusammensetzung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Aluminiumsalze (Alaun) wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat etc., Ölemulsionsformulierungen, mit oder ohne andere spezielle immunstimulierende Agenzien wie Muramylpeptide oder Bakterienzellwandkomponenten, wie beispielsweise (1) MF59 (veröffentlichte internationale Patentanmeldung WO-A-90/14837, enthaltend 5% Squalen, 0,5% Tween^® 80, 0,5% Span^® 85 (gegebenenfalls verschiedene Mengen an MTP-PE enthaltend (siehe nachstehend), obwohl nicht notwendig) in Submikropartikel formuliert unter Verwendung eines Mikrofluidizers wie das Modell 110Y Mikrofluidizer (Microfluidics, Newton, MA 02164), (2) SAF, enthaltend 10% Squalen, 0,4% Tween 80, 5% Pluronic-blockiertes Polymer L121 und thr-MDP (siehe nachstehend) entweder in eine Submikroemulsion mikrofluidiert oder gemischt, um eine Emulsion mit größeren Partikeln zu erzeugen, und (3) RIBI^TM-Adjuvans-System (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) enthaltend 2% Squalen, 0,2% Tween^® 80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwandkomponenten aus der Gruppe bestehend aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM), und Zellwandskelett (CWS) vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM), Muramylpeptide wie N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-iso-glutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl- sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE) etc., und Cytokine, wie Interleukine (IL-1, IL-2 etc.), Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF) etc. Zusätzlich könnten Saponin-Adjuvantien, wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worchester, MA) verwendet werden oder daraus erzeugte Partikel wie ISCOMS (immunstimulierende Komplexe). Weiterhin können das komplette Freundsche Adjuvans (CFA) und das inkomplette Freundsche Adjuvans (IFA) verwendet werden. Alaun und MF59 werden bevorzugt.
Das immunogene detoxifizierte Protein der Erfindung kann als Adjuvans für ein zweites Antigen in einer immunologisch wirksamen Zusammensetzung für die Behandlung oder die Impfung des menschlichen oder tierischen Körpers verwendet werden.
Die immunogene Zusammensetzung (z. B. das Antigen, pharmazeutisch verträgliche Träger und Adjuvans) wird typischerweise Verdünnungsmittel wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerol, Ethanol, etc enthalten. Zusätzlich können Hilfsstoffe wie benetzende oder emulgierende Agentien, pH-puffernde Stoffe und ähnliche in diesen Vehikeln anwesend sein.
Typischerweise werden die immunogenen Zusammensetzungen als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen geeignet zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Vehikeln vor der Injektion können auch hergestellt werden. Das Präparat kann außerdem zur erhöhten Adjuvans-Wirkung emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, wie vorstehend unter pharmazeutisch verträgliche Träger beschrieben.
Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoffe verwendet werden, umfassen eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide sowie jede andere der vorstehend erwähnten Komponenten, je nach Bedarf. Mit „immunologisch wirksame Menge" ist gemeint, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum, entweder als Einzeldosis oder Teil einer Serie, zur Behandlung oder Prävention wirksam ist. Diese Menge variiert im Hinblick auf die Gesundheit und den physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht-menschliche Primaten, Primaten, etc.), der Kapazität des individuellen Immunsystems, Antikörper zu bilden, dem Grad des gewünschten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffes, dem von dem behandelnden Arzt festgestellten Gesundheitszustand, und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch übliche Versuche bestimmt werden kann.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden üblicherweise parenteral verabreicht, z. B. durch Injektion entweder subkutan oder intramuskulär. Zusätzliche für andere Arten der Verabreichung geeignete Formulierungen schließen orale und pulmonare Formulierungen, Suppositorien und transdermale Anwendungen ein. Die Dosierung kann ein Einzeldosenschema oder ein multiples Dosenschema sein. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulierenden Agenzien verabreicht werden.
Der hier verwendete Begriff „rekombinantes Polynucleotid" bestimmt ein Polynucleotid, von genomischem, cDNA-, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, das auf Grund seines Ursprungs oder seiner Veränderung: (1) nicht mit dem gesamten Polynucleotid oder einem Teil eines Polynucleotids, mit dem es in der Natur verbunden ist, verbunden ist (2) mit einem Polynucleotid verbunden ist, mit dem es in der Natur nicht verbunden ist, oder (3) was nicht in der Natur vorkommt.
Der hier verwendete Begriff „Polynucleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von Nucleotiden jeglicher Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Begriff bezeichnet nur die Primärstruktur des Moleküls. Dementsprechend schließt dieser Begriff doppel- und einzelsträngige DNA und RNA ein. Er schließt außerdem bekannte Arten von Modifikationen ein, zum Beispiel, auf dem Fachgebiet bekannte Markierungen, Methylierung, „Caps", Substitution von einem oder mehreren natürlich vorkommenden Nucleotid(en) mit einem Analogon, Internucleotidmodifikationen wie beispielsweise jene mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z.B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.), solche mit angehängten Einheiten wie z. B. Proteine (eingeschlossen sind z. B. Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), solche mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, etc.), solche, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle, etc.), solche, die Alkylatoren enthalten, solche mit veränderten Verknüpfungen (z.B alphaanomere Nucleinsäuren, etc.) sowie auch unveränderte Formen des Polynucleotids.
Ein „Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid, etc., das sich wie eine autonome Einheit zur Replikation von Polynucleotiden in der Zelle verhält; d. h. fähig ist zur Replikation unter der eigenen Kontrolle. Dies kann wählbare Marker einschließen.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, an den ein anderes Polynucleotidsegment angehängt ist, um so die Replikation und/oder Expression des angehängten Segments zu bewirken.
„Kontrollsequenz" bezeichnet Polynucleotidsequenzen, die für die Expression codierender Sequenzen erforderlich sind, mit denen sie verknüpft sind. Die Eigenschaften derartiger Kontrollsequenzen unterscheiden sich in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; in Prokaryonten beinhalten solche Kontrollsequenzen üblicherweise einen Promotor, eine ribosomale Bindungsstelle und eine Transkriptionsterminationssequenz; in Eukaryonten beinhalten solche Kontrollsequenzen üblicherweise Promotoren und Transkriptionsterminationssequenzen. Der Begriff "Kontrollsequenzen" beinhaltet zudem zumindest alle Bestandteile, deren Anwesenheit für die Expression erforderlich ist, und kann zudem zusätzliche Komponenten mit einschließen, deren Anwesenheit förderlich ist, wie zum Beispiel Leadersequenzen und die Sequenzen eines Fusionspartners.
„Funktionell verknüpft" bezeichnet eine Nebeneinanderstellung, wobei die so beschriebenen Komponenten in Beziehung zueinander stehen, so dass sie in beabsichtigter Weise funktionieren können. Eine Kontrollsequenz, die „funktionell verknüpft" ist mit einer codierenden Sequenz ist in einer Weise ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erfolgt, die kompatibel mit den Kontrollsequenzen sind.
Ein „offener Leserahmen" ist eine Region der Polynucleotidsequenz, die ein Polynucleotid codiert; diese Region kann einen Teil der codierenden Sequenz oder eine gesamte codierende Sequenz repräsentieren.
Eine „codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in ein Polypeptid translatiert wird, gewöhnlich mittels mRNA, wenn es unter der Kontrolle von passenden regulatorischen Sequenzen geschieht. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind durch ein Translationsstartcodon am 5'-Ende und ein Translationsstopcodon am 3'-Ende festgelegt. Eine codierende Sequenz kann cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt.
„PCR" bezeichnet das Verfahren der Polymerasekettenreaktion wie beschrieben bei Saiki et al., Nature 324: 163 (1986); und Scharf et al., Science (1986) 233: 1076–1078; und U.S. 4, 683, 195; und U.S. 4, 683, 202.
Wie hier verwendet, ist x „heterolog" im Hinblick auf y, falls x nicht natürlicherweise mit y in identischer Weise verknüpft ist, d. h. x ist in der Natur nicht mit y verknüpft oder x ist nicht wie in der Natur vorkommend mit y verknüpft.
„Homologie" bezeichnet den Grad an Übereinstimmung zwischen x und y. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz von einer Form zur anderen kann mittels üblicher Verfahren bestimmt werden. Sie können zum Beispiel durch den direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotids bestimmt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Homologie durch Hybridisierung von Polynucleotiden unter Bedingungen bestimmt werden, bei denen stabile Duplexe zwischen homologen Regionen (zum Beispiel, solcher, die vor der S₁-Spaltung benutzt würden) gebildet werden, gefolgt von der Spaltung mit spezifischen Einzelstrangnucleasen, gefolgt von der Größenbestimmung der gespaltenen Fragmente.
Der hier verwendete Begriff "Polypeptid" bezeichnet ein Polymer von Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts; dementsprechend schließt die Definition eines Polypeptids Peptide, Oligopeptide, und Proteine ein. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf oder schließt aus die Modifikationen nach der Expression, wie z. B. Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und ähnliches. Umfasst durch die Definition sind zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehrere Analog(on)(a) von Aminosäuren (einschließlich z. B. unnatürlicher Aminosäuren, etc.), Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen, sowie anderen Modifikationen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, aufweisen, sowohl natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz „abgeleitet von" einer bestimmten Nucleinsäuresequenz bezeichnet ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die identisch mit der eines codierten Polypeptids in der Sequenz ist, oder eines Teils davon, wobei der Teil aus mindestens 3–5 Aminosäuren, und stärker bevorzugt aus mindestens 8–10 Aminosäuren, und noch stärker bevorzugt aus mindestens 11–15 Aminosäuren besteht, oder das mit einem codierten Polypeptid in der Sequenz immunologisch identifizierbar ist. Diese Terminologie schließt außerdem ein Polypeptid ein, das von einer bestimmten Nucleinsäuresequenz exprimiert wird.
Das Protein kann zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, entweder monoclonal oder polyclonal, die spezifisch für das Protein sind. Die Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper sind auf dem Fachgebiet bekannt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellkulturen" und vergleichbare Begriffe bezeichnen zum Beispiel Mikroorganismen, Insektenzellen, und Säugerzellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können, bzw. bereits eingesetzt wurden, und sie schließen Abkömmlinge der ursprünglichen Zelle, die transformiert wurde, ein. Es ist zu verstehen, dass die Abkömmlinge einer einzigen Elternzelle nicht notwendigerweise vollständig in Morphologie oder in der genomischen oder der Gesamt-DNA identisch mit den Orginaleltern sind, aufgrund einer natürlichen, zufälligen oder beabsichtigten Mutation. Beispiele für Säugerwirtszellen schließen chinesische Hamster-Ovarzellen (CHO) und Nierenzellen des Affen (COS) ein.
Insbesondere bezeichnet die hier verwendete "Zelllinie" eine Population von Zellen, die die Fähigkeit besitzt, in vitro kontinuierlich oder über einen langen Zeitraum hinweg zu wachsen und sich zu teilen. Oftmals stellen diese Zelllinien clonale Populationen dar, die von einer einzelnen Vorläuferzelle abstammen. Es ist auf dem Fachgebiet weiterhin bekannt, dass spontane oder herbeigeführte Veränderungen im Karyotyp während der Speicherung oder des Transfers solch clonaler Populationen vorkommen. Von der bezeichneten Zelllinie abgeleitete Zellen können daher nicht immer exakt identisch mit den Ursprungszellen oder Ursprungskulturen sein, und die bezeichnete Zelllinie enthält solche Varianten. Der Begriff "Zelllinie" beinhaltet ebenso immortalisierte Zellen. Vorzugsweise schließen Zelllinien nicht hybride Zelllinien oder Hybridome von nur zwei Zelltypen ein.
Der hier verwendete Begriff "Mikroorganismus" bezeichnet prokaryontische und eukaryontische Mikroben wie z. B. Bakterien und Pilze, der letztere umfasst Hefen und filamentöse Pilze.
Die hier verwendete "Transformation" bezeichnet das Einbringen eines exogenen Polynucleotides in eine Wirtszelle, unabhängig von der für das Einbringen verwendeten Verfahren, zum Beispiel, direkte Aufnahme, Transduktion, F-Mating oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nicht integrierter Vektor, zum Beispiel, als Plasmid, oder in einer anderen Ausführungsform integriert im Wirtsgenom erhalten bleiben.
Unter „genomisch" wird eine Sammlung oder Bibliothek von DNA-Molekülen verstanden, welche von Restriktionsfragmenten abstammen, die in Vektoren cloniert worden sind. Dies kann das gesamte oder einen Teil des genetischen Materials eines Organismus einschließen.
Unter „cDNA" wird eine komplementäre DNA-Sequenz verstanden, die mit einem komplementären DNA-Strang hybridisiert.
Unter „gereinigt" und „isoliert" wird verstanden, bezogen auf ein Polypeptid oder eine Nucleotidsequenz, dass das angegebene Molekül vorliegt, während andere biologische Makromoleküle vergleichbarer Art im Wesentlichen abwesend sind. Der hier verwendete Begriff „gereinigt" bedeutet, dass vorzugsweise mindestens 75 Gewichtsprozent, stärker bevorzugt mindestens 85 Gewichtsprozent, noch stärker bevorzugt mindestens 95 Gewichtsprozent, und am meisten bevorzugt mindestens 98 Gewichtsprozent biologische Makromoleküle derselben Art vorliegen (aber Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 können vorhanden sein).
Sobald die geeignete codierende Sequenz isoliert ist, kann sie in einer Vielzahl verschiedener Expressionssysteme exprimiert werden; zum Beispiel solcher, die mit Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefen verwendet werden.
I. Säugersysteme
Säugerexpressionssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein Säugerpromotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die fähig ist, Säuger-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) stromabwärts (3'-Position) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptionsinitiationsregion haben, die üblicherweise nahe am 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt, und eine TATA-Box, die üblicherweise 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle lokalisiert ist. Es wird angenommen, dass die TATA-Box die RNA-Polymerase-II lenkt, um die RNA-Synthese an richtiger Stelle zu beginnen. Ein Säugerpromotor wird stromaufwärts ebenfalls ein Promotorelement enthalten, das üblicherweise innerhalb 100 bis 200 bp stromaufwärts von der TATA-Box liegt. Ein Promotorelement stromaufwärts bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird und kann in jede Richtung agieren [Sambrook et al. (1989) „Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. 1.
Virale Gene in Säugern werden oft stark exprimiert und haben einen weiten Wirtsbereich; dementsprechend liefern die Sequenzen, die die viralen Gene in Säugern codieren, besonders hilfreiche Promotorsequenzen. Beispiele schließen den frühen SV40-Promotor, den LTR-Promotor des Brusttumorvirus der Maus, den starken späten Promotor des Adenovirus (Ad MLP) und den Herpes simplex-Viruspromotor ein. Zusätzlich liefern die Sequenzen, die von nicht-viralen Genen stammen, wie beispielsweise das murine Metallothionein-Gen, hilfreiche Promotorsequenzen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, abhängig davon, ob der Promotor mit Glucocorticoid in Zellen, die auf Hormone ansprechen, eingeführt werden kann.
Die Anwesenheit von Enhancerelementen (Enhancer), kombiniert mit den vorstehend beschriebenen Promotorelementen, wird üblicherweise den Expressionsspiegel erhöhen. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription auf das 1000-fache stimulieren kann, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verbunden ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Start-Stelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle liegen, entweder in normaler oder umgekehrter Richtung, oder in einem Abstand von mehr als 1000 Nucleotiden von dem Promotor entfernt [Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2. Aufl.]. Enhancerelemente, die von Viren abstammen, können besonders hilfreich sein, weil sie üblicherweise einen breiteren Wirtsbereich haben. Beispiele schließen den frühen SV40-Gen-Enhancer [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4: 761] und die vom Long Terminal Repeat (LTR) des Rous-Sarcoma-Virus [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] vom menschlichen Cytomegalovirus [Boshart et al. (1985) Cell 41: 521] stammenden Enhancer/Promotoren ein. Zusätzlich sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in Anwesenheit von Inducern aktiv, wie Hormone oder Metallionen [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Säugerzellen exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, in diesem Fall wird die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer Methionin sein, welche vom ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht, kann der N-Terminus durch eine in vitro-Inkubation mit Cyanbromid von dem Protein abgespalten werden.
In einer anderen Ausführungsform können auch fremde Proteine aus der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle geschaffen werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenz-Fragment enthält, was die Sekretion des Fremdproteins in die Säugerzellen ermöglicht. Vorzugsweise sind Prozessierungstellen zwischen dem Leader-Fragment und dem Fremdgen codiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Der Adenovirus-Triparite-Leader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die die Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen bewirkt.
Üblicherweise sind Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, die von Säugerzellen erkannt werden, regulatorische Bereiche, die am 3'-Ende des Translationsstopcodons liegen und so, zusammen mit den Promotorelementen, die codierenden Sequenzen flankieren. Das 3'-Ende der reifen mRNA wird durch ortsspezifische, post-transkriptionale Spaltung und Polyadenylierung gestaltet [Birnstiel et al. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot and Whitelaw (1988) „Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames and D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105]. Diese Sequenzen lenken die Transkription einer mRNA, welche in ein Polypeptid translatiert werden kann, das von der DNA codiert wird. Beispiele von Transkriptions-Terminator/Polyadenylierungs-Signalen schließen jene, die von SV40 stammen, ein [Sambrook et al. (1989) „Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Einige Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns (auch als Intervening-Sequenzen bezeichnet) anwesend sind. Einige cDNAs sind allerdings von Vektoren, denen Spleißsignale (auch Spleißdonor- und -akzeptor-Stellen genannt) [siehe z. B., Gothing and Sambrook (1981) Nature 293: 620] fehlen, effizient exprimiert worden. Introns sind intervenierende nicht-codierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Spleißdonor- und -akzeptor-Stellen enthalten. Sie werden durch ein Verfahren, das sich „Spleißen" nennt, entfernt, gefolgt von der Polyadenylierung des primären Transkripts [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52: 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20: 671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55: 119; Krainer and Maniatis (1988) "RNA splicing." In Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames and D. M. Glover)].
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz enthalten, zu Expressionskonstrukten zusammengefügt. Enhancer, Introns mit funktionalen Spleißdonor- und -akzeptor-Stellen und Leader-Sequenzen können auch, falls gewünscht, in ein Expressionskonstrukt eingeschlossen werden. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon, wie etwa einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), aufrechterhalten, das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie etwa in Säugerzellen oder Bakterien, fähig ist. Säugerreplikationssysteme schließen jene ein, die von Tierviren stammen, welche transagierende Faktoren zur Replikation benötigen. Zum Beispiel replizieren Plasmide, die die Replikationssysteme von Papovaviren wie beispielsweise SV40 enthalten [Gluzman (1981) Cell 23: 175], oder das Polyomavirus zu einer extrem hohen Kopienanzahl in Anwesenheit des passenden viralen T-Antigens. Zusätzliche Beispiele von Säugerreplikons schließen jene ein, die vom Rinder-Papillomavirus und Epstein-Barr-Virus stammen. Außerdem kann das Replikon zwei Replikationssysteme haben, die es ihm erlauben, aufrechterhalten zu werden, zum Beispiel, in Säugerzellen für eine Expression und in einem prokaryontischen Wirt für eine Clonierung und Amplifizierung. Beispiele für solche Säuger-Bakterien-Shuttle-Vektoren schließen pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946 und pHEBO (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074] ein.
Das verwendete Transformationsverfahren hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zur Einführung heterologer Polynucleotide in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Präzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung der(s) Polynucleotide(s) in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in den Kern ein.
Säugerzelllinien, die als Wirte für die Expression zur Verfügung stehen, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen viele immortalisierte Zelllinien ein, die bei der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, die chinesischen Hamster-Ovarzellen (CHO), HeLa-Zellen, Nierenzellen des Babyhamsters (BHK), Nierenzellen des Affen (COS), menschliche hepatozelluläre Karzinomzellen (z. B. Hep G2) und eine Anzahl anderer Zelllinien, sind aber nicht begrenzt darauf.
II. Baculovirus-Systeme
Das Polynucleotid, das das Protein codiert, kann auch in einen geeigneten Insektenexpressionsvektor eingeführt werden, und ist funktionell mit den Kontrollelementen innerhalb jenes Vektors verbunden. Die Vektorkonstruktion verwendet Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Im Allgemeinen schließen die Komponenten des Expressionssystems einen Transfervektor ein, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, welches beides enthält, ein Fragment des Baculovirus-Genoms, und eine brauchbare Restriktionsstelle für die Insertion heterologer Gene oder zu exprimierender Gene; ein Baculovirus-Wildtyp mit einer Sequenzhomologie zu dem baculovirusspezifischen Fragment in dem Transfer-Vektor (dies erlaubt die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom); und passende Insektenwirtszellen und Wachstumsmedien.
Nach Einführung der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in den Transfervektor, werden der Vektor und das virale Wildtyp-Genom in eine Insektenwirtszelle transfiziert, wo es dem Vektor und dem viralen Genom erlaubt wird, zu rekombinieren. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Material und Verfahren für ein Baculovirus/Insekten Zellexpressionssystem sind kommerziell in einer Kitform von u. a. Invitrogen, San Diego CA („MaxBac" kit) erhältlich. Diese Verfahren sind den Fachleuten allgemein bekannt und vollständig in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (nachstehend als „Summers and Smith") beschrieben.
Vor Insertion der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in das Baculovirus-Genom werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, umfassend einen Promotor, Leader (wenn gewünscht), eine codierende Sequenz von Interesse, und eine Transkriptionsterminationssequenz in einem intermediären Transplacement-Konstrukt (Transfervektor) vereinigt. Dieses Konstrukt kann ein einzelnes Gen enthalten und funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden sein; multiple Gene, jedes mit seinem eigenen Satz von regulatorischen Elementen funktionell verbunden; oder multiple Gene, die durch den gleichen Satz an regulatorischen Elementen reguliert werden. Intermediäre Transplacement-Konstrukte werden oft in einem Replikon aufrechterhalten, wie beispielsweise ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das zu einer stabilen Aufrechterhaltung im Wirt fähig ist, wie beispielsweise ein Bakterium. Das Replikon wird ein Replikationssystem haben, das es ihm erlaubt, im Wirt zur Clonierung und Amplifizierung aufrechterhalten zu werden.
Derzeit ist der am häufigsten verwendete Transfervektor für die Einführung von fremden Genen in AcNPV pAc373. Viele andere Vektoren, die den Fachleuten bekannt sind, sind ebenfalls entwickelt worden. Diese schließen beispielsweise pVL985 ein (welcher das Polyhedrin-Startcodon von ATG zu ATT verändert, und welcher eine BamHI-Clonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts von ATT einführt; siehe Luckow und Summers, Virology (1989) 17: 31.
Das Plasmid beinhaltet üblicherweise auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) und ein prokaryontisches Ampicillin-resistentes (am Gen und einen Replikationsstart für Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die fähig ist, eine Baculovirus-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. Strukturgene) in mRNA stromabwärts (von 5' nach 3') zu initiieren. Ein Promotor wird einen Transkriptionsinitiationsbereich haben, welcher üblicherweise nahe dem 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch eine zweite Domäne, die Enhancer genannt wird, haben, welche, falls anwesend, üblicherweise distal zu den Strukturgenen liegt. Die Expression kann entweder reguliert sein oder konstitutiv.
Strukturgene, die in einem viralen Infektionscyclus im Überschuss zu später Zeit transkribiert werden, liefern besonders hilfreiche Promotorsequenzen. Beispiele schließen Sequenzen ein, die von dem Gen stammen, das das virale Polyhedronprotein codiert, Friesen et al., (1986) „The Regulation of Baculovirus Gene Expression," in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127 839 und 155 476; und dem Gen, das das Protein p10 codiert, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Insekten- oder Baculovirus-Proteinen stammen, wie beispielsweise das Polyhedringen des Baculovirus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73: 409). Da anscheinend die Signale für posttranslationale Veränderungen in einer Säugerzelle (wie beispielsweise Signalpeptidspaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) von Insektenzellen erkannt werden, und die Signale, die für die Sekretion und die nukleäre Akkumulation benötigt werden, anscheinend auch zwischen Invertebratenzellen und Vertebratenzellen konserviert sind, können in einer anderen Ausführungsform Leader, die nicht von Insekten abstammen, wie solche, die von Genen abstammen, die menschliches α-Interferon, Maeda et al., (1985), Nature 315: 592; menschliches Gastrin-freisetzendes Peptid, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129; menschliches IL-2, Smith et al., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82: 8404; Maus-IL-3, (Miyajima et al., (1987) Gene 58: 273; und menschliche Glucocerebrosidase, Martin et al. (1988) DNA, 7: 99 codieren, verwendet werden, um die Sekretion in Insekten zu bewirken.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert werden oder, falls es mit den passenden regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, kann es sezerniert werden. Eine gute intrazelluläre Expression von nicht fusionierten Fremdproteinen benötigt üblicherweise heterologe Gene, die idealerweise eine kurze Leadersequenz haben, die geeignete Translationsinitiationssignale enthält, die einem ATG-Startsignal vorangehen. Falls gewünscht kann Methionin am N-Terminus von dem reifen Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanbromid abgespalten werden.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlicherweise sezerniert werden, von der Insektenzelle sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle geschaffen werden, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Leadersequenzfragment besteht, das die Sekretion des Fremdproteins in Insekten bewirkt. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid aus hydrophoben Aminosäuren, welches die Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum lenkt.
Nach Einführung der DNA-Sequenz und/oder des Gens, das das Expressionsprodukt Precursor des Proteins codiert, wird ein Insektenzellwirt mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Baculovirus-Wildtyps cotransformiert – üblicherweise durch Co-Transfektion. Der Promotor und die Transkriptionsterminationssequenz des Konstrukts wird üblicherweise einen 2–5 kb-Abschnitt des Baculovirus-Genoms umfassen. Verfahren zur Einführung heterologer DNA in die gewünschten Stellen des Baculovirus sind auf dem Fachgebiet bekannt. (Siehe Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156; und Luckow and Summers (1989)). Zum Beispiel kann die Insertion in ein Gen, wie beispielsweise das Polyhedringen, durch eine homologe doppelte Crossover-Rekombination erfolgen; die Einführung kann auch in eine Restriktionsenzymstelle erfolgen, die in das gewünschte Baculovirus-Gen eingebaut wurde. Miller et al., (1989), Bioessays 4: 91. Wenn die DNA-Sequenz anstelle des Polyhedringens in den Expressionsvektor cloniert wird, ist sie an beiden Positionen, an der 5'- und 3'-Position, von polyhedrinspezifischen Sequenzen flankiert, und ist stromabwärts vom Polyhedrinpromotor angeordnet.
Der neu gebildete Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in ein infektiöses rekombinantes Baculovirus verpackt. Homologe Rekombination findet mit geringer Häufigkeit statt (zwischen etwa 1% und etwa 5%); dementsprechend sind die meisten nach der Cotransfektion hergestellten Viren noch Wildtyp-Viren. Daher ist ein Verfahren zur Identifizierung rekombinanter Viren nötig. Ein Vorteil des Expressionssystems ist ein visuelles Merkmal, das eine Differenzierung rekombinanter Viren erlaubt. Das von dem nativen Virus hergestellte Polyhedrin-Protein wird zu einem sehr hohen Grad in den Zellkernen von infizierten Zellen zu späteren Zeiten nach der viralen Infektion hergestellt. Akkumuliertes Polyhedrin-Protein bildet Okklusionskörper, die auch eingebettete Partikel enthalten. Diese bis zu 15 μm großen Okklusionskörper sind hoch lichtbrechend, was ihnen ein leuchtendes, strahlendes Aussehen gibt, und das leicht mit dem Lichtmikroskop gesehen wird. Zellen, die mit den rekombinanten Viren infiziert sind, fehlen Occlusionskörper. Um ein rekombinantes Virus vom Wildtyp-Virus zu unterscheiden, wird der Transfektionsüberstand auf eine einzellige Schicht von Insektenzellen mittels Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, ausgestrichen. Und zwar werden die Plaques unter dem Lichtmikroskop auf die Anwesenheit (auf Wildtyp-Virus hindeutend) oder Abwesenheit (auf rekombinantes Virus hindeutend) von Okklusionskörpern durchleuchtet. „Current Protocols in Microbiolog" Vol. 2 (Ausubel et al. Hrsg.) at 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren sind für die Infektion verschiedener Insektenzellen entwickelt worden. Zum Beispiel sind rekombinante Baculoviren unter anderem entwickelt worden für: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, und Trichoplusia ni
(PCT Pub. No. WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; und allgemein Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Zellen und Zellkulturmedien sind kommerziell sowohl für die direkte als auch für die Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus/Expressionssystem erhältlich; Zellkulturtechnologie ist im allgemeinen den Fachleuten bekannt. Siehe z.B. Summers and Smith supra.
Die modifizierten Insektenzellen können nun in einem passenden Nährmedium wachsen, welches eine stabile Aufrechterhaltung des(r) in dem modifizierten Insektenwirt anwesenden Plasmids(e) erlaubt. Wo das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle ist, kann der Wirt in hoher Dichte wachsen und eine Expression herbeigeführt werden. In einer anderen Ausführungsform wird das Produkt, wo die Expression konstitutiv ist, kontinuierlich ins Medium exprimiert und das Nährmedium muss kontinuierlich zirkulieren, während das Produkt von Interesse und die aufgebrauchten Nährstoffe aufgefüllt werden. Das Produkt kann mit Verfahren wie Chromotographie z.B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, etc.; Elektrophorese, Dichtegradientenzentrifugation; Lösungsmittelextraktion, oder dergleichen gereinigt werden. Wenn benötigt, kann das Produkt, wie gewünscht, weiter gereinigt werden, um im Wesentlichen jegliche Insektenproteine zu entfernen, die auch in das Medium sezerniert werden oder aus der Lyse von Insektenzellen stammen, um so ein Produkt zu liefern, welches zumindest im Wesentlichen frei ist von Wirtsablagerungen, z. B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden.
Um eine Proteinexpression zu erhalten, werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten stammen, unter Bedingungen inkubiert, welche eine Expression der rekombinanten codierenden Proteinsequenz erlauben. Diese Bedingungen werden in Abhängigkeit von der ausgesuchten Wirtszelle variieren. Allerdings sind die Bedingungen für die Fachleute leicht zu ermitteln, basierend darauf, was auf dem Fachgebiet bekannt ist.
III. Bakterielle Systeme
Bakterielle Expressionstechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein bakterieller Promotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die fähig ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription der codierenden Sequenz (z.B. Strukturgene) stromabwärts (3'') in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird einen Transkriptionsinitiationsbereich haben, welcher üblicherweise nahe am 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt üblicherweise eine RNA-Polymerasebindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein bakterieller Promoter kann auch eine zweite Domäne haben, die Operator genannt wird, der mit einer angrenzenden RNA-Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt negativ regulierte (induzierbare) Transkription, wenn ein Genrepressorprotein den Operator binden kann und dabei die Transkription eines spezifischen Gens hemmt. Konstitutive Expression kann in Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen, wie dem Operator, vorkommen. Zusätzlich kann positive Regulation durch eine Genaktivator-Proteinbindungssequenz stattfinden, welche üblicherweise, wenn anwesend, nahe (5') zu der RNA-Polymerase-Bindungssequenz ist. Ein Beispiel eines Genaktivator-Proteins ist das Katabolit-Aktivator-Protein (CAP), das hilft, die Transkription des lac operon in Escherichia coli (E. coli) zu initiieren [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Regulierte Expression kann dementsprechend positiv oder negativ sein, wobei dadurch entweder die Transkription verstärkt oder verringert wird.
Sequenzen, die Stoffwechselenzyme codieren, liefern besonders hilfreiche Promotorsequenzen. Beispiele schließen Promotorsequenzen ein, die von Zucker metabolisierenden Enzymen stammen, wie Galaktose, Laktose (lac [Chang et al. (1977) Nature 198: 1056], und Maltose. Zusätzliche Beispiele schließen Promotorsequenzen ein, die von biosynthetischen Enzymen stammen, wie Tryptophan (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; U.S. Patent No. 4,738,921; EPO Publ. Nos. 036 776 und 121 775]. Das g-laotamase (bla)-Promotorsystem [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser)] Bakteriophage lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128] und T5 [U.S. Patent No. 4,689,406] Promotorsysteme liefern ebenfalls hilfreiche Promotorsequenzen.
Außerdem funktionieren synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, auch als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können Transkriptions-Aktivierungs sequenzen eines bakteriellen Promotors oder Bakteriophagen-Promotors mit den Operonsequenzen eines anderen bakteriellen Promotors oder Bakteriophagen-Promotors aneinandergefügt werden, um einen synthetischen Hybrid-Promotor zu schaffen [U.S. Patent No. 4,551,433]. Zum Beispiel ist der tac-Promotor ein Hybrid-trp-lac-Promotor, umfassend sowohl, trp-Promotor- als auch lac-Operon-Sequenzen, was durch den lac-Repressor reguliert wird [Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Weiterhin kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs, die die Fähigkeit haben, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und Transkription zu initiieren, einschließen. Ein natürlich vorkommender Promotor nicht-bakteriellen Ursprungs kann auch an eine kompatible RNA-Polymerase gekoppelt werden, um einen hohen Expressionsspiegel einiger Gene in Prokaryonten herzustellen. Das Bakteriophagen T7 RNA-Polymerase/Promotor-System ist ein Beispiel für ein gekoppeltes Promotorsystem [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Außerdem kann ein Hybridpromotor auch einen Bakteriophagenpromotor und eine E. coli-Operatorregion (EPO Publ. No. 267 851) umfassen.
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist auch eine effiziente Ribosomenbindungsstelle für die Expression von fremden Genen in Prokaryonten hilfreich. In E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle als die Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz bezeichnet, und sie schließt ein Initiationscodon (ATG) und eine Sequenz mit einer Länge von 3–9 Nucleotiden ein, die 3–11 Nucleotide stromaufwärts des Initiationscodons liegt [Shine et al. (1975) Nature 254: 34]. Es wird angenommen, dass die SD-Sequenz die Bindung von mRNA an die Ribosomen durch Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und der 3'-Position der 16S rRNA von E. coli anregt [Streitz et al. (1979) „Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger)]. Um Eukaryontengene und Prokaryontengene mit schwachen Ribosomenbindungsstellen zu exprimieren [Sambrook et al. (1989) „Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden werden, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus immer Methionin sein wird, welches von dem ATG-Start-Codon codiert wird. Falls gewünscht, kann Methionin am N-Terminus vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanbromid oder entweder durch in vivo- oder in vitro-Inkubation mit einer bakteriellen N-terminalen Methionin-Peptidase abgespalten werden (EPO Publ. No. 219 237).
Fusionsproteine liefern eine Alternative zur direkten Expression. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins codiert, oder ein anderes stabiles Protein, an das 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen liefern. Beispielsweise kann das Zellgen des Bakteriophagen Lambda an das 5'-Ende eines Fremdgens gebunden und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagenprotein von dem Fremdgen abzuspalten [Nagai et al. (1984) Nature 309: 810]. Fusionsproteine können auch mit Sequenzen der lacZ- [Jia et al. (1987) Gene 60: 197], trpE- [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11] und Chey- [EPO Publ. No. 324 647] Gene gemacht werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindung der zwei Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder nicht. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Solch ein Fusionsprotein wird mit der Ubiquitinregion gemacht, die vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym (z.B. Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease) behält, um das Ubiquitin von dem Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann das native Fremdprotein isoliert werden [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7: 698].
In einer anderen Ausführungsform können die Fremdproteine auch von der Zelle sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle geschaffen werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Signalpeptidsequenzfragment umfasst, das die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien ermöglicht [U.S. Patent No. 4,336,336]. Das Signalsequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren umfasst, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle (gram-negative Bakterien) liegt, sezerniert. Vorzugsweise gibt es Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können, und die zwischen dem Signalpeptidfragment und den Fremdgenen codiert werden.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Bakterienproteine stammen, wie beispielsweise dem Gen für die Proteine der äußeren Membran von E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3: 2437] und der Signalsequenz für die alkalische Phosphatase von E. coli (PhoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212]. Als ein zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des alpha-Amylasegens von verschiedenen Bacillus-Stämmen verwendet werden, um heterologe Proteine von B. subtilis zu sezernieren [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Publ. No. 244 042].
Üblicherweise sind die Transkriptionsterminationseinheiten, die von Bakterien erkannt werden, regulatorische Regionen, die in 3'-Position zu dem Translationsstopcodon liegen, und so zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, welche in ein Polypeptid translatiert werden kann, das von der DNA codiert wird. Transkriptionsterminationssequenzen schließen häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden ein, die fähig sind, Stem-Loop-Strukturen zu bilden, die bei der Beendigung einer Transkription helfen. Beispiele schließen Transkriptionsterminationssequenzen ein, die von Genen mit starken Promotoren abstammen, wie beispielsweise dem trp-Gen in E. coli sowie auch anderen biosynthetischen Genen.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, eine Signalsequenz (falls gewünscht), eine codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, zu Expressionskonstrukten zusammengefügt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replikon aufrechterhalten, wie beispielsweise einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie den Bakterien, fähig ist. Das Replikon wird ein Replikationssystem haben, das es ihm erlaubt, in einem prokaryontischen Wirt entweder zur Expression oder zur Clonierung und Amplifizierung aufrechterhalten zu werden. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid für hohe oder niedrige Kopienanzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl wird im Allgemeinen etwa 5 bis 200 Kopien haben, und üblicherweise etwa 10 bis 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl besitzt, wird vorzugsweise etwa mindestens 10 und stärker bevorzugt etwa mindestens 20 Plasmide enthalten. Entweder kann ein Vektor mit einer hohen oder niedrigen Kopienanzahl ausgesucht werden, abhängig von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt.
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte in das bakterielle Genom mit einem integrierenden Vektor integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zu dem Bakterienchromosom homologe Sequenz, die es dem Vektor erlaubt, zu integrieren. Integrationen scheinen sich aus Rekombinationen zwischen homologer DNA in dem Vektor und den bakteriellen Chromosomen zu ergeben. Zum Beispiel integrieren integrierende Vektoren, die mit DNA von verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert wurden, in das Bacillus-Chromosom (EPO Publ. No. 127 328). Integrierende Vektoren können auch von Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen umfasst sein.
Üblicherweise könnten extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte auswählbare Marker enthalten, die eine Selektion aus bakteriellen Stämmen, die transformiert worden sind, erlauben.
Auswählbare Marker können in bakteriellen Wirten exprimiert werden, und können in Gene eingeschlossen werden, die Bakterien resistent gegenüber Wirkstoffen wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469] machen. Auswählbare Marker können auch biosynthetische Gene einschließen, wie beispielsweise jene in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegen.
In einer anderen Ausführungsform können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengefasst werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen auswählbaren Marker, der entweder in einem Replikon aufrechterhalten wird oder sich in einem integrierenden Vektor, wie vorstehend beschrieben, entfaltet.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren sind für die Transformation in viele Bakterien entwickelt worden. Zum Beispiel sind die Expressionsvektoren, unter anderem, für die folgenden Bakterien entwickelt worden: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Publ. Nos. 036 259 und 063 953; PCT Publ. No. WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128; Amann et al. (1985) Gene 40: 183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; EPO Publ. Nos. 036 776, 136 829 und 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [U.S. Patent No. 4,745,056].
Verfahren, mittels derer exogene DNA in bakterielle Wirte eingeführt wird, sind auf dem Fachgebiet bekannt, und schließen üblicherweise entweder die Transformation von Bakterien ein, die mit CaCl₂ behandelt werden, oder mit anderen Agenzien, wie divalente Kationen und DMSO. DNA kann auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingeführt werden. Transformationsverfahren variieren mit der zu transformierenden bakteriellen Art. Siehe z. B. [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Publ. Nos. 036 259 und 063 953;
PCT Publ. No. WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2210; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].
IV. Hefe Expression
Hefeexpressionssysteme sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Ein Hefepromotor ist eine beliebige DNA-Sequenz, die fähig ist, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription der codierenden Sequenz (z.B. Strukturgene) stromabwärts (3') in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptionsinitiationsregion haben, welche üblicherweise nahe am 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Diese Transkriptionsinitiationsregion schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (die „TATA"-Box) und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Hefepromotor kann auch eine zweite Domäne haben, die als eine Stromaufwärts-Aktivator-Sequenz (UAS) bezeichnet wird, welche, falls anwesend, üblicherweise von den Strukturgenen weit entfernt ist. Die UAS erlaubt regulierte (induzierbare) Expression. Konstitutive Expression geschieht in der Abwesenheit einer UAS.
Regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, dabei entweder die Transkription verstärken oder vermindern.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechselweg, dementsprechend liefern Sequenzen, die Enzyme innerhalb des Stoffwechselwegs codieren, besonders hilfreiche Promotorsequenzen. Beispiele schließen Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO Publ. No. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (PyK) (EPO Publ. No. 329 203) ein. Das Hefegen PHO5, das saure Phosphatase codiert, liefert auch hilfreiche Promotorsequenzen [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].
Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, welche nicht in der Natur vorkommen, als Hefepromotoren. Zum Beispiel könnten UAS-Sequenzen eines Hefe-Promotors mit der Transkriptionsaktivierungsregion eines anderen Hefepromotors verbunden werden, um einen synthetischen Hybridpromotor zu schaffen. Beispiele von solchen Hybridpromotoren schließen die ADH-regulierende Sequenz ein, die mit der GAP-Transkriptionsaktivierungsregion (U.S. Patent Nos. 4,876,197 und 4,880,734) verbunden ist. Andere Beispiele von Hybridpromotoren schließen Promotoren ein, welche aus den regulatorischen Sequenzen einer der ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PH05-Gene bestehen, kombiniert mit der transkriptionalen Aktivierungsregion eines glycolytischen Enzym-Gens wie GAP oder PyK (EPO Publ. No. 164 556). Weiterhin kann ein Hefepromotor natürlich vorkommende Promotoren, die nicht von Hefen stammen, einschließen, die die Fähigkeit haben, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele solcher Promotoren umfassen u. a.
[Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes i the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K>N> Timmis and A. Puhler) Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11: 163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2: 109;].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, wobei die erste Aminosäure an dem N-Terminus des rekombinanten Proteins immer Methionin sein wird, welches von dem ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht, kann Methionin an dem N-Terminus von dem Protein mittels in vitro-Inkubation mit Cyanbromid abgespalten werden.
Fusionsproteine liefern eine Alternative zu Hefeexpressionssystemen, ebenso wie in Säuger-, Baculovirus- und bakteriellen Expressionssysteme. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, an das 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion der zwei Aminosäuresequenzen liefern. Zum Beispiel kann das Hefe- oder das menschliche Superoxiddismutase(SOD)-Gen mit dem 5'-Ende eines Fremdgens verknüpft und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindung der zwei Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren oder nicht. Siehe z.B. EPO Publ. No. 196 056. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Solch ein Fusionsprotein wird mit der Ubiquitinregion gemacht, die vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym (z.B. Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease) behält, um das Ubiquitin von dem Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren kann das native Fremdprotein isoliert werden (siehe, z. B. PCT Publ. No. WO 88/024066).
In einer anderen Ausführungsform können auch fremde Proteine aus der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle geschaffen werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenz-Fragment umfasst, das die Sekretion des Fremdproteins in Hefe bewirkt. Vorzugsweise gibt es Prozessierungstellen, codiert zwischen dem Leader-Fragment und dem Fremdgen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz- Fragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, umfassend hydrophobe Aminosäuren, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Hefeproteine stammen, wie beispielsweise das Hefe-Invertasegen (EPO Publ. No. 012 873; JPO Publ. No. 62,096,086) und das A-Faktor-Gen (U.S. Patent No. 4,588,684). In einer anderen Ausführungsform existieren Leader, die nicht von Hefe stammen, wie ein Interferon-Leader, die auch eine Sekretion in Hefen bewirken (EPO Publ. No. 060 057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern sind jene, die ein Fragment des alpha-Faktor-Gens von Hefe verwenden, das beides enthält, eine „Prä"-Signal-Sequenz und eine „Pro"-Region. Die Typen von alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, schließen den Prä-Pro-alpha-Faktor-Leader in voller Länge (etwa 83 Aminosäurereste) ein, ebenso wie verkürzte alpha-Faktor-Leader (üblicherweise etwa 25 bis 50 Aminosäurereste) (U.S. Patent Nos. 4,546,083 und 4,870,008; EPO Publ. No. 324 274). Zusätzliche Leader, die ein alpha-Faktor-Leader-Fragment verwenden, das eine Sekretion bewirkt, schließen Hybrid-alpha-Faktor-Leader ein, die mit einer Prä-Sequenz einer ersten Hefe, aber einer Pro-Region eines zweiten Hefealphafaktors gemacht sind (Siehe z. B., PCT Publ. No. WO 89/02463).
Üblicherweise sind Transkriptionsterminationssequenzen, die von Hefen erkannt werden, regulatorische Regionen, die in 3'-Position zu dem Translationsstopcodon liegen, und so zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in ein Polypeptid translatiert werden kann, das durch die DNA codiert wird. Beispiele einer Transkriptionsterminationssequenz und anderer von Hefe erkannter Terminationssequenzen, wie solche, die glykolytische Enzyme codieren.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (falls gewünscht), eine codierende Sequenz von Interesse und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, zu Expressionskonstrukten zusammengefügt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replikon aufrechterhalten, wie beispielsweise einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das zu einer stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt fähig ist, wie beispielsweise Hefen oder Bakterien. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme haben, das es ihm erlaubt, entweder für Expression in Hefen oder für Clonierung und Amplifikation in einem prokaryontischen Wirt aufrechterhalten zu werden. Beispiele von solchen Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren schließen YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8: 17–24], pCI/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 4642–4646] und YRp17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157] ein. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid mit hohen oder niedrigen Kopienanzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl wird im Allgemeinen etwa 5 bis 200 Kopien haben, und üblicherweise etwa 10 bis 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl besitzt, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. Ein Vektor mit einer hohen oder niedrigen Kopienanzahl kann ausgesucht werden, abhängig von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt. Siehe z. B. Brake et al., supra.
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Hefegenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise wenigsten eine zum Hefechromosom homologe Sequenz, die es dem Vektor erlaubt zu integrieren, und vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen sich aus Rekombinationen homologer DNA im Vektor und in dem Hefechromosom zu ergeben [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228–245]. Ein integrierender Vektor kann zu einem speziellen Ort in der Hefe gelenkt werden, indem die passende homologe Sequenz für einen Einschluss in den Vektor ausgesucht wird. Siehe Orr-Weaver et al., supra. Ein oder mehrere Expressionskonstrukt(e) können integrieren, was möglicherweise den Spiegel an hergestelltem rekombinantem Protein beeinflusst. [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Die in den Vektor eingeschlossenen chromosomalen Sequenzen können entweder als ein einzelnes Segment in dem Vektor auftreten, was in der Integration des gesamten Vektors resultiert, oder als zwei Segmente, die homolog zu benachbarten Segmenten in dem Chromosom sind, und das Expressionsprodukt im Vektor flankieren, was zu einer stabilen Integration nur des Expressionskonstrukts führen kann.
Üblicherweise könnten extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte auswählbare Marker enthalten, die eine Selektion von Hefestämmen erlauben, die transformiert worden sind. Auswählbare Marker könnten biosynthetische Gene einschließen, die in dem Hefewirt exprimiert werden können, wie beispielsweise ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 und das G418-Resistenzgen, welches in Hefezellen eine Resistenz gegen Tunicamycin beziehungsweise G418 überträgt. Zusätzlich kann ein passender auswählbarer Marker auch eine Hefe mit der Fähigkeit liefern, in der Anwesenheit toxischer Komponenten, wie beispielsweise Metallen, zu wachsen. Beispielsweise erlaubt die Anwesenheit von CUP1 einer Hefe, in der Anwesenheit von Kupferionen zu wachsen [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51: 351].
In einer anderen Ausführungsform können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengefasst werden. Transformationsvektoren umfassen üblicherweise einen auswählbaren Marker, der entweder in einem Replikon aufrechterhalten wird oder sich in einem integrierten Vektor, wie vorstehend beschrieben, entfaltet.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, sind für die Transformation in viele Hefen entwickelt worden. Zum Beispiel sind die Expressionsvektoren, unter anderem, für die folgenden Hefen entwickelt worden:
Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltose [Kunze, et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; U.S. Patent Nos. 4,837,148 and 4,929,555],
Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300: 706], und Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Verfahren, mittels derer exogene DNA in Hefewirte eingeführt werden, sind auf dem Fachgebiet bekannt, und schließen üblicherweise entweder die Transformation von Sphäroblasten oder intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt werden, ein. Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Hefeart. Siehe z. B.
[Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; (Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; U.S. Patent Nos. 4,837,148 and 4,929,555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].
1. Vorbereitung der LT-Mutanten
1.1. Quelle der LT-DNA
Das 2 kb lange SmaI-HindIII-Fragment des Plasmids pEWD299, das die LT-Gene und die LT-Promotorregion (Pronk et al., 1985; Spicer et al., 1981) enthält, wurde in den Blue-Script-KS-Vektor (Stratagene, San Diego, CA) subcloniert und wurde in allen folgenden Studien verwendet.
1.2. Mutationsverfahren
Ortsgerichtete Mutagenese wurde mit Einzelstrang-DNA unter Verwendung des Verfahrens von Zoller und Smith (Zoller and Smith, 1982) durchgeführt. Um die G192-Mutation einzuführen, wird das folgende Oligonucleotid verwendet:
5'-AATTCATCAGGCACAATCACA-3'
Einzelstrang-DNA von BS-LT- und BS-LTK63-Plasmiden, die den Wildtyp beziehungsweise das mutierte 1,3 kb lange SmaI-EcoRI-Fragment enthalten, wurden verwendet, um die ortsgerichtete Mutagenese mit G192-Oligonucleotiden durchzuführen. DNA-Manipulationen wurden mittels Standardverfahren durchgeführt (Sambrook et al., 1989).
1.3. Expression und Reinigung der mutierten codierenden Region
LTG192- und LTK63/G192-Mutanten wurden aus dem Periplasma rekombinanter E. coli TG1-Stämme gereinigt, die in einem 20 Liter-Fermenter gewachsen waren. Nach Zentrifugation und Ultraschallbehandlung der bakteriellen Pellets wurde die Reinigung unter Verwendung von CPG 350 (Controlled Pore Glass)-(Sigma and Electronucleonics, St. Louis, USA), A5M-Agarose-(Biorad, Richmond, USA) und Sephacryl S-200-(Pharmacia, Uppsala, Schweden) Säulen durchgeführt, wie bei Pronk et al. (Pronk et al., 1985) beschrieben. Gereinigte Proteine mit einer Konzentration, die von 0,44 bis 1,5 mg/ml reicht, wurden bei 4°C in dem Puffer TEAN pH 7,5 gelagert.
2. Herstellung von CT-Mutanten
2.1. Quelle von CT-DNA
Das 1,1 kb lange Fragment des pJM17-Plasmids (Pearson, G. D. N., et al., 1982), das das ctxAB-Gen enthält, wurde mittels PCR-Verfahren unter Verwendung folgender Oligonucleotide amplifiziert
5'-GGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAA-3' (ctxA)
und
5'-TGAAGTTTGGCGAAGCTTCTTAATTTGCCATACTAATTGCG-3' (ctxB)
Das amplifizierte XbaI-HindIII-Fragment wurde im pEMBL19-Vektor (Dente, L., et al. 1983) subcloniert und für ortsgerichtete Mutagenese verwendet (Zoller, M. J., et al. 1982).
2.2. Mutationsverfahren
Einzelstrang-DNA des pEMBL 19-CT K63-Plasmids, das das 1,1 kb lange XbaI-HindIII-Fragment enthält, und in Position 63 mutiert ist, wurde verwendet, um die ortsgerichtete Mutagenese mit G192-Oligonucleotid durchzuführen: AATGCTCCAGGCTCATCGATG.
2.3. Expression der mutierten codierenden Region
Das mutierte XbaI-HindIII-Fragment, das die zwei Mutationen (Ser63→Lys, Arg192→Gly) enthält, wurde unter der Kontrolle eines CT-Promotors in den pGEM-3-Vektor (Promega, Madison, USA) subcloniert, und so der pGEM-CTK63/G129 generiert. E. coli-TG1- und V. cholerae-NT-Stämme wurden durch Elektroporation (Sambrook, J., et al. 1989) mit pGEM-CTK/G192-Plasmid transformiert. Das Mutantenprotein CTK63/G192 wurde in das Periplasma des E. coli-Stammes und in den Kulturüberstand des V. cholerae-Stammes exprimiert. Der periplasmatische Extrakt von E. coli wurde wie beschrieben aufbereitet (Pizza M., et al. 1990).
3. Eigenschaften von LT-Mutanten
3.1. Toxizitätstest
Toxinaktivität auf Y1-Zellen. Die morphologische Veränderung, die durch LT bei adrenalen Y1-Zellen (Donta, S. T. et al., 1973) hervorgerufen wird, wird verwendet, um die toxische Aktivität von LT und LTG192 und LTK63/G192-Mutanten nachzuweisen. Der Test wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung von 50000 Zellen/Vertiefung durchgeführt. Die Ergebnisse wurden nach einer 48stündigen Inkubation abgelesen. Der Test wies 5 pg Wildtyp-Toxin/Vertiefung nach. Die LTG192-Mutante war bei 12 pg/Vertiefung toxisch, die Doppel-Mutante LTK63/G192 war bei 11 μg nicht toxisch.
Rabbit-Ileum-Loop-Test. Ausgewachsene New Zealand Kaninchen (ca. 2,5 kg) wurden für den Test verwendet. Die Kaninchen hungerten 24 Stunden vor dem Experiment. Vor der Operation wurden die Kaninchen anästhesiert und auf dem Operationstisch fixiert. Das Abdomen des Kaninchens wurde mit einem Skalpell geöffnet und der Darm entnommen. Das Cecum wurde gesucht, und 20–30 cm von diesem Trakt des Darms aus entfernt, wurden 12–14 Schleifen (jede in einer Länge von 5–6 cm) bis zu dem Ende des in Magennähe liegenden Darms gemacht. 1 ml der Probe wurde in die Schleife injiziert und das Abdomen wurde geschlossen.
Nach 18 bis 20 Stunden wurde die in der Schleife akkumulierte Flüssigkeit gesammelt und mit einer Spritze gemessen. Die Länge der Schleife wurde nochmals gemessen. Die Ergebnisse wurden als Flüssigkeitsvolumen pro Schleifenlänge (ml/cm) ausgedrückt.
3.2. Immunogenitätstests
Die mukosale Immunogenität von LTK63 und LTK63/G192 wurde getestet, indem vier Mäuse intranasal (i.n.) mit 1 μg LT K63 beziehungsweise LT K63/G192 immunisiert wurden. Für i.n.-Immunisierungen wurden Proteine in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2; PBS) resuspendiert und in ein Volumen von 30 μl (15 μl/Nasenloch) überführt. Alle Tiere wurden an den Tagen 1, 22, 36 immunisiert und Antworten wurden mittels Blutproben an den Tagen 0, 21 und 35 verfolgt. Die Mäuse wurden endgültig am Tag 56 ausgeblutet.
Toxin-spezifische Antikörper wurden unter Verwendung eines GM1-Erfassungs-ELISA gemessen. Antitoxinwerte wurden gegen das während der Immunisierung verwendete Antigen beurteilt. Die Platten wurden mit 100 μl/Vertiefung einer 1,5 μg/ml GM1-Gangliosid-(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) Lösung bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden 3mal mit PBS, 0,05% Tween 20 (PBS/T) gewaschen. 200 μl einer 1%igen BSA-Lösung wurden pro Vertiefung zugesetzt und die Platten wurden eine Stunde bei 37°C inkubiert. 100 μl des Antigens wurden pro Vertiefung zugesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Seren von jeder Maus wurden jeder Vertiefung zugesetzt, indem bei einer Verdünnung von 1:50 gestartet wurde, gefolgt von 1:2-Verdünnungen; die Serumproben wurden zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden, wie vorstehend beschrieben, gewaschen und mit Anti-Maus-Immunoglobulin G, das mit alkalischer Phosphatase (Sigma) konjugiert ist, inkubiert. Nach drei Waschungen wurde das Substrat der alkalischen Phosphatase (pNPP) zugesetzt und die Absorptionen bei 450 nm gemessen. ELISA-Titer wurden arbiträr als die zur OD450 = 0,3 passende Verdünnung bestimmt.
3.3. Stabilitätstest
Trypsin-Behandlung von LT und LT-Mutanten. 60 μg von LT und von jeder Mutante wurden mit 0,60 μg Trypsin (Sigma, St. Louis, USA) (molare Rate 100/1) in 300 μl Endvolumen von TEAN pH 7,5 (nicht denaturierende Bedingungen) oder von TEAN pH 7,5 + 3,5 M Harnstoff (denaturierende Bedingungen) bei 37°C behandelt. Es wurden Proben von 30 μl bei 0, 15, 30, 90 Minuten (unter nicht denaturierenden Bedingungen) oder bei 0, 5, 15, 30, 45, 60 Minuten (unter denaturierenden Bedingungen) gesammelt und die Reaktion wurde durch Zusatz von 10 μl 4fachen Elektrophoresepuffers (20% Dithiothreit, Bio Rad Richmond, USA; 8% Natriumdodecylsulfat, Bio Rad, Richmond, USA; 40% Glycerol RPE-ACS, Carlo Erba, Milan, Italy; 0,02% Bromphenolblau, Bio Rad, Richmond, USA; in Tris/HCL 0,25 M pH 6,8, Sigma, St Louis, USA) gestoppt und fünf Minuten auf 95°C erhitzt. Die Proben liefen auf 15%igen SDS-Minigelen und wurden mittels Western-Blotting (Towbin et al., 1979) unter Verwendung von polyclonalen Kaninchen-anti-LT-Antikörpern in einer Verdünnung von 1/300 analysiert.
3.4. Zusammenfassungen
Die Ergebnisse der Toxizitätstests zeigen, dass:
12 pg der Einzelmutante LTG192 fähig sind, eine toxische Wirkung auf Y1-Zellen herbeizuführen, während 11 μg der Doppelmutante LTK63/G192 dies nicht tun.
50 ng von LTG192 fähig sind, eine Flüssigkeitsansammlung in der Darmschleife von Kaninchen herbeizuführen, während 100 μg der Doppelmutante dies nicht tun.
Im Hinblick auf Immunogenität ist der Titer der Antitoxin-Antwort in Mäusen, die mit LTK63/G192 immunisiert wurden, größer ist als derjenige, der in Mäusen beobachtet wurde, die mit LTK63 immunisiert wurden.
Die Doppelmutante LTK63/G192 gegenüber der Proteolyse resistenter ist als die Einzelmutante LT K63. Die Untereinheit A von LT und LTK63 ist nach 15minütiger Inkubation mit Trypsin vollständig in A1 und A2 prozessiert. Die Untereinheit A von LTG192 und LTK63/G192 ist gegenüber Trypsin resistent, bis zu einer Inkubationszeit von mindestens 90 Minuten. Überdies wird die Untereinheit A von LTK63 nach 60minütiger Inkubation mit Trypsin unter denaturierenden Bedingungen vollständig abgebaut, während die Untereinheit A von LTG192 und LTK63/G192 nach 60minütiger Inkubation mit Trypsin unter denaturierenden Bedingungen nur teilweise gespalten wird.
4. Eigenschaften der CT-Mutanten
4.1. Stabilitätstest
Trypsin-Behandlung. 50 μl periplasmatischer Extrakt eines E. coli-Stammes, der die CTK63/G192-Mutante enthält, wurde mit 13,5 μg/ml Trypsin 15 Minuten lang bei 37°C behandelt. Nach Inkubation wurde der Probe 4facher Ladungspuffer zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen.
30 μl des V. cholerae-Kulturüberstandes und 30 μl des periplasmatischen Extrakt von E. coli, der mit Trypsin behandelt wurde, und unbehandelter Extrakt wurden auf ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen, und die Proteine wurden auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um ein Western-Blotting auszuführen.
4.2. Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse zeigen, dass beide, die Einzelmutante CTN192 und die Doppelmutante CTK63/G192, resistenter gegenüber Proteasen sind als das Wildtyp-Toxin. Allerdings werden diese Mutanten noch durch V. cholerae-spezifische Proteasen prozessiert.
Literaturhinweise

Dente, L., G. Cesareni, und R. Cortese. 1983. pEMBL: a new family of single stranded plasmid. Nucleic. Acid. Res. 11: 1645–1655
Donta, B. T., H. W. Moon und S. C. Whipp. 1973. Detection and use of heat-labile Escherichia coli enterotoxin with the use of adrenal cells in tissue culture. Science (Wash.DC). 183: 334
Pearson, G. D. N., und J. J. Mekalanos. 1982. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin gene in Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 2976–2980.
Pizza, M., A. Covacci, M. Bugnoli, R. Manetti und R. Rappuoli. 1990. The S1 subunit is important for pertussis toxin secretion. J. Biol. Chem. 265: 17759–17763.
Pronk, S. E., H. Hofstra, H Groendijk, J. Kingma, M, B. A. Swarte, F. Dorner, J. Drenth, W. G. J. Hol und B. Witholt. 1985. Heat-labile enterotaxin of Escherichia coli: characterization of different crystal forms. J. Biol. Chem. 260: 13580.
Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Spicer, E. K., W. M. Kavanaugh, W. S. Dallas, S. Falkow, W. Konigsberg und D. Shafer. 1981. Sequence homologies between A subunits of E. coli and V. cholerae enterotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 50.
Zoller, M. J. und M. Smith. 1982. Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA. Nucleic Acids Res. 20: 6487.

Claims

Immunogenes detoxifiziertes Protein, umfassend entweder: (a) die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines Cholera-Toxins (CT-A), oder ein Fragment davon, das die Aminosäuren an oder in Positionen entsprechend Ser-63 und Arg-192 umfasst; oder (b) die Aminosäuresequenz der Untereinheit A eines hitzelabilen Toxins (LT-A) von Escherichia coli oder ein Fragment davon, das die Aminosäuren an oder in Positionen entsprechend Ser-63 und Arg-192 umfasst, wobei die Aminosäuren an oder in Positionen entsprechend Ser-63 und Arg-192 durch eine andere Aminosäure ersetzt sind.
Impfstoffzusammensetzung, die ein immunogenes detoxifiziertes Protein gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 2, welche ferner ein Adjuvans umfasst.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 2, welche ferner ein zweites immunogenes Antigen enthält.
DNA-Sequenz, die ein immunogenes detoxifiziertes Protein gemäß Anspruch 1 codiert.
Vektor, der die DNA gemäß Anspruch 5 trägt.
Wirtszelllinie, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 6 transformiert wurde.
Verfahren zur Herstellung eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß Anspruch 1, das das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 7 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß Anspruch 5, umfassend die Schritte der Durchführung einer ortsgerichteten Mutagenese mit einer DNA, die ein CT-A oder ein LT-A oder ein Fragment davon codiert.
Verwendung eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zum Impfen eines Säugers gegen Vibrio cholerae oder einen enterotoxigenen Stamm von Escherichia coli.
Verwendung einer immunologisch wirksamen Dosis einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, in der Herstellung eines Medikaments für die Prävention oder Behandlung einer Erkrankung, die durch Vibrio cholerae oder einen enterotoxigenen Stamm von Escherichia coli verursacht wurde.
Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs gemäß Anspruch 2, das das Zusammenbringen eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß Anspruch 1 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs gemäß Anspruch 3, das das Zusammenbringen eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß Anspruch 1 mit einem Adjuvans umfasst.
Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs gemäß Anspruch 4, das das Zusammenbringen eines immunogenen detoxifizierten Proteins gemäß Anspruch 1 mit einem zweiten Antigen umfasst.