Hintergrund
-
Vibrio cholerae der Serogruppe 01 kann schwere Durchfallerkrankungen
auslösen, wenn es sich im Darm des infizierten Individuums durch
Freisetzung des Choleratoxins, der aktive Elektrolyten und Wasserabsonderungen
vom Darmepithelium auslöst, vervielfältigt.
-
Bei vergleichbaren Mechanismen verschiedener anderer Bakterien, zum
Beispiel Escherichia coli, kann durch die Freisetzung anderer Enterotoxine,
die mit CT verwandt oder nicht verwandt sein können, auch Durchfall
verursacht werden.
-
CT ist der Prototyp eines bakteriellen Enterotoxins. Es ist ein aus
zwei Typen von Untereinheiten gebildetes Protein: einer einfachen A-
Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 28.000 und fünf
B-Untereinheiten, jedes mit einem Molekulargewicht von 11.600. Die
B-Untereinheiten sind in einem Ring durch enge, nicht-kovalente Bindungen
vereinigt; die A-Untereinheit ist an den B-Pentamerring gebunden und
wahrscheinlich teilweise durch schwache, nicht-kovalente Wechselwirkungen in
ihm eingebracht. Die zwei Typen von Untereinheiten haben verschiedene
Aufgaben in dem Entoxikationsverfahren: die B-Untereinheiten sind für die
Zellbindung verantwortlich und die A-Untereinheit für die unmittelbare
toxische Aktivität. Die molekularen Aspekte der Toxinbindung an Darm- und
anderen Säugerzellen und die anschließenden Ereignisse, die zur Aktivierung
von Adenylatcyclase durch die intrazelluläre Wirkung der A-Untereinheit
(und in ihrem A1-Fragment) führen, sind ausführlich geklärt worden (siehe J
Holmgren, Nature 292:413-417, 1981). Unlängst wurden auch Informationen
über die Genetik und Biochemie der Choleratoxinsynthese, die
Zusammenführung und Sekretion durch V. cholerae verfügbar. CT wird durch
chromosomale strukturelle Gene für die A- bzw. B-Untereinheiten kodiert. Diese
Gene sind von verschiedenen Stämmen kloniert worden, und ihre
Nukleotidsequenzen wurden bestimmt. Die Gene der A- und B-Untereinheiten von CT
sind in einer einzigen Transkriptionseinheit, in der das A-Cistron (ctxa)
dem B-Cistron (ctxb) vorangeht, angeordnet. Studien über die Organisation
der CT-Gene in V. cholerae-Stämmen der klassischen und der E1 Tor Biotypen
haben nahegelegt, daß es zwei Kopien der CT-Gene in klassischen Biotyp-
Stämmen gibt, wohingegen nur eine Kopie in den meisten E1 Tor Stämmen (JJ
Mekalanos et al, Nature 306:551-557, 1983) vorkommt. Die CT-Synthese ist
positiv durch das Gen, toxR, das die ctx-Expression mehrfach erhöht,
reguliert (VL Miller und JJ Mekalanos, Proc Natl Acad Sci USA, 81:3471-
3475, 1984). ToxR wirkt auf den Transkriptionsgrad und ist in Stämmen
beider, der klassischen und der E1 Tor Biptypen anwesend. ToxR erhöht
wahrscheinlich die ctx-Transkription, indem es ein Regulatorprotein, das
positiv auf den ctx-Promotorbereich wirkt, kodiert. Untersuchungen von
wärmelabilem Enterotoxin (LT) in Escherichia coli (die Struktur und
Funktion der Untereinheit von LT sind mit denen von CT ziemlich ähnlich, aber
nicht identisch) haben gezeigt, daß die A- und B-Untereinheiten anfangs als
Vorläufer mit einem Leaderpeptid, das dem reifem Untereinheitprotein
vorangeht, synthetisiert werden. Diese Vorläufer werden schnell
weiterverarbeitet (d.h. das Leaderpeptid wird entfernt) und über die innere Membran
in das Periplasma transloziert, wo nicht-zusammengeführte monomerische B-
Untereinheiten pentamerisieren und sich mit der A-Untereinheit mit einer
Halbwertszeit von 1 bis 2 min verbinden. Der Weg der Toxinzusammenführung
scheint sich über das Verbinden der A-Untereinheit mit B-Monomeren oder
kleinen Oligomeren zu vollziehen. Wenn das komplette Toxin in V. cholerae
zusammengeführt ist (im Gegensatz zu E. coli, wo das Toxin im Periplasma
verbleibt), wird das Toxin über die Ol äußere Membran von V. cholerae durch
eine Art von Wechselwirkung der B-Untereinheitendomänen mit der äußeren
Membran transloziert (abgesondert) (TR Hirst & J Holmgren, Proc Natl Acad
Sci USA, 84:7418-7422, 1987; SJS Hardy et al, ibid, im Druck, 1988). Wenn
die B-Untereinheiten von CT oder LT in Abwesenheit einer der
A-Untereinheiten (verschiedene solcher Stämme wurden durch chemische Mutagenese
oder unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren durch Deletionen in
den ctxA- oder eltA-Cistronen hergestellt) expressioniert werden, bilden
die B-Untereinheiten Pentamere, die anschließend von V. cholerae über den
gleichen Weg wie für intaktes Toxin abgesondert werden, außer einer
anscheinend leicht langsameren Zusammenführung im Periplasma (TR Hirst et
al, Proc Natl Acad Sci USA, 81:2645-2649, 1984; SJS Hardy et al, ibid, im
Druck, 1988). Da die Impfung gegen Cholera durch parenterale Injektion nur
zu einem mäßigen und kurzzeitigen Schutz führt (gewöhnlich weniger als 50 %
Schutz für weniger als 6 Monate), ist die Aufmerksamkeit auf die
Entwicklung oraler Impfstoffe gewendet worden, die die intestinale Immunität
wirksamer anregen. Besondere Aufmerksamkeit wurde auf CTB-Pentamere als eine
Komponente solcher oraler Choleraimpfstoffe gerichtet (J Holmgren et al,
Nature 269:602-604, 1977). CTB ist ein wirksames orales immunisierendes
Mittel, das, wie bei großen Feldversuchen nachgewiesen wurde, Schutz gegen
Cholera und durch LT-enterotoxigenes E. coli verursachten Durchfall bietet
(J Clemens et al, Lancet ii:124-127, 1986; J Infect Dis, im Druck, 1988).
Die Trennung der B-Untereinheiten von A schließt jedes Risiko zur Reversion
der Toxizität aus, und CTB ist ohne Nebenwirkungen oral an mehr als 25.000
Leute verabreicht worden. Diese Merkmale haben CTB zu einer wichtigen
Komponente, zusammen mit getöteten gesamten Choleravibrionen, einem neuen
oralen Choleraimpfstoff, gemacht. CTB hat außerdem vor kurzem ein großes
Interesse als immunogener Träger für verschiedene andere Peptid- oder
Kohlenhydratantigene auf sich gezogen und ist auch als
Rezeptor-blockierendes und Rezeptor-regulierendes Mittel für kurzzeitige Prophylaxe von
Cholera und Durchfall durch E. coli verwendet worden (RI Glass et al, J
Infect Dis 149:495-500, 1984; ST Donta et al, ibid 157: 557-564, 1988; SJ
McKenzie and JF Halsey, J Immunological 133:1818-1824, 1984; AM Svennerholm
et al, J Clin Microbiol 24:585-590, 1986).
-
Diese Erkenntnisse haben die Notwendigkeit hervorgehoben, die Ausbeute
von CTB für die großtechnische Herstellung zu erhöhen, idealerweise unter
gleichzeitiger Verhinderung des Nachteils bei derzeitig verwendeten
Herstellungsverfahren, daß das CTB-Protein vom aktiven Toxin gereinigt
werden muß (siehe JL Tayot et al, Eur J Biochem 113:249-258, 1981).
-
Mit Hilfe von in dieser Anmeldung beschriebenen Strategien und
Verfahren hat der Anmelder daher überexpressionssysteme für CTB und CTB-
Fusionsproteine, bei denen das CTB-Gen (oder das Gen für das Hybrid-
Fusionsprotein) unter Kontrolle von starken fremden (nicht Choleratoxin)
Promotoren steht, hergestellt. Der Erfolg des Anmelders unterscheidet sich
in dieser Hinsicht von vorhergehenden Versuchen mit verschiedenen Verfahren
von JJ Mekalanos et al (Nature 306:551-557, 1983), dieses Ziel unter
Verwendung von einem der Promotoren (dem tacP Promoter), der in einem der
Beispiele des Anmelders beschrieben ist, zu erreichen, da diese Versuche,
weil sie zu einer Expression von weniger CTB als erreicht durch den
natürlichen ctx Promotor führten, fehlschlugen.
Zusammenfassung der Erfindung
-
Unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren wurden
Überexpressionsysteme für die B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) oder der
CTB-Derivate, einschließlich Fusionsproteine von CTB, erreicht.
Kennzeichnenderweise wurde in diesen Systemen die Expression des Gens, das CTB- oder CTB-
Derivatproteine kodiert, unter Kontrolle eines starken fremden (nicht
Choleratoxin) Promotors in einem Plasmid-Vektor, der ein breites
Wirtsspektrum besitzt, gebracht. Die beschriebenen Genkonstruktionen sind vom
natürlichen CT-Promotor und von toxR Expressionsregulationssystemen
unabhängig.
Zwei solcher Überexpressionsysteme sind veranschaulicht: eines, in
dem CTB auf eine induzierbare oder konstitutive Weise unter der Kontrolle
des tacP Promotors expressioniert wird und ein andereres, in dem CTB-
Expression durch den T7 RNA Polymerase-abhängigen Promotor kontrolliert
wird. In diesen Beispielen sind die Genkonstruktionen, die die
Überexpression ermöglichen, in Plasmiden, die einen breiten Wirtsbereich
besitzen, vorhanden. Dies erlaubt die Herstellung von hohen Gehalten an
CTB oder CTB-Derivaten von verschiedenen bakteriellen Spezien, z.B. E. coli
und V. cholerae, die diese Plasmide beherbergen. Die Zugänglichkeit dieser
fremden Promotor-Überexpressionsysteme zur Herstellung von CTB-Derivaten in
Form von Fusionsproteinen ist auch durch die Fusion einer synthetischen
DNA-Sequenz, die ein nicht-toxisches Decapeptid kodiert, das von dem E.
coli wärmestabilen Enterotoxin (STa) abstammt, mit dem CTB-Gen und durch
die Exprimierung dieses Genfusionsproteins in V. cholerae unter der
Kontrolle des tacP-Promotors, veranschaulicht.
Definitionen und Abkürzungen
-
Die Ausdrücke CTB und CTB-Derivate, wie sie in dieser Anmeldung
verwendet werden, definieren jedes Protein oder Peptid (mit Ausnahme von E.
coli LTB) mit Eigenschaften, die die Erkennung durch gegen das CTB-Protein,
das durch das in dieser Anmeldung beschriebene Plasmid pJS162 kodiert wird,
hergestelltes Immunserum (Antiserum) erlaubt.
-
Der Ausdruck fremder Promotor definiert jeden Promotor, der dadurch
gekennzeichnet ist, daß er unterschiedlich zu dem natürlichen ctx-Promotor
ist.
-
Der Ausdruck fremdes Leaderpeptid definiert jede Peptidsequenz in
einem Proteinmolekül, die die Translokation eines Proteins, in dieser
Anmeldung die Translokation von CTB oder CTB-Derivaten, über Zellmembranen
erleichtert, und daurch gekennzeichnet ist, daß es sich von natürlichen
Leaderpeptiden für Choleratoxinuntereinheiten unterscheidet.
-
An der Standard-Nomenklatur, wie sie zum Beispiel in EL Winnacker,
From Genes to Clones, VCH Publishers, New York (1987) verwendet wird, wird
festgehalten, um DNA-Restriktionsendonukleasen, Restriktionsseiten und
Restriktionssequenzen zu definieren. Oligodesoxynukleotide und Aminosäuren
sind durch die herkömmlichen Einbuchstaben- und
Dreibuchstaben-Abkürzungskodierungen dargestellt.
Beispiele
Beispiel 1: Rekombinantes System zur induzierbaren Überexpression von
CTB unter der Kontrolle von tacP
1.1 Genmanipulationen, um das CTB-Gen unter die Kontrolle des
induzierbaren tacP zu bringen
-
Basierend auf den theoretischen Überlegungen und vorläufigen
Experimenten wurde vom Anmelder angenommen, daß die Überexpression von CTB durch
einen fremden (nicht Choleratoxin) Promotor erreicht werden kann, wenn das
CTB-Gen so nahe wie möglich an den fremden Promotor herangebracht wird,
idealerweise unter Verhinderung, daß zwischen dem Promotor und dem CTB-Gen
nicht-CTB-kodierende DNA der V. cholerae Herkunft liegt. In diesem
Beispiel wird vom Anmelder ein Verfahren beschrieben, bei dem diese
Strategie verwendet wurde, um ein erfolgreiches Überexpressionssystem zur
CTB-Herstellung zu konstruieren, in dem das CTB-Gen unter
Expressionskontrolle des induzierbaren tacP-Promotors steht.
-
Die für den E. coli LTB-Leader kodierende DNA hat an ihrem 5' Ende
eine einzige EcoRI-Restriktionsschnittstelle, die genau stromaufwärts von
der Ribosombindungsstelle liegt, und die unlängst verwendet wurde, um das
LTB-Gen nach dem starken tacP-Promotor einzufügen, wodurch das Plasmid
pMMB68 hergestellt wurde (M Sandkvist et al, J Bacteriol 169:4570-4576,
1987). Um von dieser strategisch liegenden EcoRI-Stelle (die in dem CTB-
Gen fehlt), durch die die Expression von CTB unter Kontrolle desselben
Promotors gebracht wird, zu profitieren, hat der Anmelder sich entschlossen,
das reife CTB-Protein genetisch an das Leaderpeptid von LTB in dem Plasmid
pMMB68, das für ein breites Wirtsspektrum verwendet werden kann, zu
fusionieren. Das CTB-Gen von pCVD30 (das von dem V. cholerae 01 Stamm 0395,
klassischer Biotyp, Ogawa Serotyp abstammt) hat eine NdeI-Stelle an der
Aminosäuren (aa) Position 18 des Leaderpeptids, während das LTB-Gen eine
SacI-Erkennungsstelle am Anfang des reifen Proteins besitzt. Die Fusion
des 5' NdeI-Endes des CTB-Gens durch einen synthetischen Linker an das 3'
SacI-Ende des LTB-Gens, wie in Fig. 1A gezeigt, führt zu einer Substitution
des CTB-Leaderpeptids durch das von LTB. Das resultierende Plasmid pJS162,
das in Fig. 1B gezeigt ist, enthält das Hybrid-CTB-Gen als ein EcoRI-
HindIII DNA-Segment stromabwärts des tacP-Promotors. (Alle Figuren und
Tabellen sind im Appendix der Anmeldung zu finden).
-
Die folgenden Verfahren wurden verwendet, um die zuvor genannten
Konstruktionen zu erhalten. Das pMMB68-Plasmid im E. coli Stamm HB101 wurde
freundlicherweise von M Sandquist, Universität von Umeå zur Verfügung
gestellt. Das Plasmid pCVD30 in E. coli HB101 wurde von Dr. K Kaper,
Universität von Maryland, Baltimore, USA, erhalten. (Für eine detaillierte
Beschreibung dieser Plasmide siehe M Sandquist et al, J Bacteriol 169:
4570-4576, 1987 und JB Kaper et al, Biotechnology 2:345-349, 1984). Die
nichtphosphorylisierten Oligodesoxynukleotide, die verwendet wurden, um das SacI
3'-Ende des LTB-Leaders an die 5' NdeI-Sequenz von CTB zu binden, wurden
als einzelne Stränge vom Department of Immunology, Biomedical Center,
University of Uppsala, erworben. Diese Stränge wurden durch Mischen
äquimolarer Mengen jedes Stranges und durch Inkubieren der Mischung über Nacht
bei Raumtemperatur gepaart. Die resultierenden doppelsträngigen
Oligonukleotide hatten SacI- und NdeI-kompatible einzelsträngige Verlängerungen
und konnten deshalb direkt an SacI-HindIII-beschränktes pMMB68 gebunden
werden. Die Ligasierung wurde durch Inkubieren eines zehnfachen molaren
überschusses von Oligonukleotiden zu Plasmid-DNA über Nacht bei 4ºC mit T4-
Ligase durchgeführt. Zu der Ligasierungsmischung wurde anschließend eine
äquimolare Menge, in Bezug auf die Vektor-Plasmid-DNA, eines gereinigten
NdeI-HindIII-Fragmentes des pCVD30-Plasmids, das das CTB-Gen enthält,
gegeben, und die Ligasereaktion wurde dann bei 4ºC für weitere 18 Stunden
fortgesetzt. Die ligasierte DNA wurde daraufhin in kompetenten E. coli
HB101 Zellen unter Selektion der Ampicillinresistenz (100µg/ml)
transformiert. Alle in diesem Verfahren verwendeten Enzyme wurden von
Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland, erworben und wurden wie vom
Hersteller empfohlen verwendet. Die Reinigung der Plasmid-DNA wurde unter
Verwendung des Alkalilyse-Verfahrens und die Transformation in E. coli
wurde unter Verwendung des Kalzium-Rubidiumchlorid-Verfahrens gemäß der
detaillierten Beschreibungen von T Manniatis et al, Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, durchgeführt.
-
Um zu bestätigen, daß die vorherbestimmten Sequenzen nach der
Klonierung erzeugt worden sind, wurde das Hybridgen in M13 subkloniert und
durch das Didesoxynukleotidverfahren von F Sanger et al, Proc Natl Acad
Sci, USA 74:5463-5467, sequenziert. Die bestimmte Sequenz bestätigte die
für den LTB-Leaderteil berichtete Sequenz (J Leong et al, Infect Immun
48:73-77, 1985) und zeigte einen hohen Gesamthomologiewert bezüglich der
zuvor berichteten E1 Tor und reifen klassischen CTB-Sequenzen (ML Gennaro &
P Greenaway, Nucleic Acids Res 11:3855-3861, 1983; H Lockman & JB Kaper, J
Biol Chem 258:13722-13726, 1983; JJ Mekalanos et al, Nature 306:551-557,
1983; A Kurosky et al, J Biol Chem 252:7257-7264, 1977; CY Lai, J Biol Chem
252:7249-7256, 1977). Ein Vergleich zwischen der rekombinanten CTB (von
einem V. cholerae 0395 klassischen Stamm) des Anmelders und den anderen
Sequenzen ist in Fig. 2 dargestellt.
1.2 Expression des tacP-kontrollierten CTB-Gens in V.
cholerae
-
Das CTB-Gen enthaltene Plasmid pJS162, das unter Kontrolle von tacP
steht (Fig. 1), wurde durch Konjugation eines Helfer-E. Coli-Stammes, S17-1
(R Simon et al, Biotechnology 2:784-791, 1983) entweder in den V. cholerae
01 Stamm JBK70 (El Tor Biotyp) (JB Kaper et al, Nature 308:655-658, 1983)
oder in andere E1 Tor oder klassische V. cholerae-Stämme übertragen. Zur
Erreichung der Übertragung wurde zuerst pJS162-Plasmid-DNA von E. coli
HB101 reisoliert und durch Transformation unter Verwendung der gleichen
Verfahren von Maniatis et al (1982), wie in dem obigen Abschnitt 1.1
beschrieben, in E. coli S17-1-Zellen eingefügt. Die transformierten S17-1-
Zellen wurden anschließend als Spenderorganismen in
Konjugationsexperimenten mit verschiedenen V. cholerae Empfängerstämmen verwendet. Die
Konjugationen wurden wie folgt durchgeführt. Die transformierten S17-1-
Spenderorganismen und die Empfänger V. cholerae Zellen wurden in 10 ml mit
geeigneten Antikörpern ergänztem LB Medium ohne Schütteln über Nacht bei
37ºC gewachsen. Von jeder Kultur wurden anschließend 3 ml der bakteriellen
Suspension mit Hilfe einer Spritze durch einen Millipore -Filter des Typ GS
0,22 µm gedrückt - erst die Spender und anschließend die
Empfängerzellkulturen - wodurch diese Zellen auf der Filteroberfläche in nahen Kontakt
miteinander gebracht wurden. Der Filter wurde anschließend vorsichtig auf
eine LB-Agarplatte ohne Antibiotika gelegt und für ungefähr 3 h bei 37ºC
inkubiert. Danach wurde der Filter in ein Reagenzglas, das 5 ml
LB-Nährbrühe enthält, überführt. Die Bakterien wurden durch Schütteln des Glases
suspendiert und ca. 0,1 mm der gemischten bakteriellen Suspension wurde
anschließend in LB-Nährbrühe mit geeigneter antibiotischer Gegenselektion der
Spenderzellen inkubiert. Die bakterielle Mischung ließ man in
LB-Nährbrühe, die 50 U/ml Polymyxin B und 100 µg/ml Ampicillin enthält, zur
Gegenselektion des Spenders, wenn V. cholerae Stämme des E1 Tor Biotyps die
Empfänger von pJS162 waren, wachsen. Wenn das Plasmid in V. cholerae Stämme
des klassischen Biotyps überführt wurde, wurden zuerst
Rifampycinresistente Derivate dieser Stämme isoliert, und in diesen Fällen wurde die
Selektion der Rifampecin-resistenten Vibrioempfängerstämme unter Verwendung
der LB-Nährbrühe, die 50 µg/ml Rifampycin und 100 µg/ml Ampicillin enthält,
durchgeführt.
-
Die CTB-Herstellung in V. cholerae Stämmen, die das Plasmid pJS162
enthalten, wurde wie folgt bestimmt. Für die Induktion mit Isopropyl-β-D-
thiogalactopyranosid (IPTG) ließ man die Kulturen bei 37ºC auf die
gewünschte optische Dichte (A&sub6;&sub0;&sub0;) in LB-Nährbrühe, die zusätzlich Antibiotika
enthielt, wachsen und anschließend wurde IPTG auf die gewünschte
Konzentration zugegeben. Das Wachstum wurde für 4 Stunden fortgesetzt und die
Zellen und Kulturüberstände wurden durch Zentrifugieren getrennt. Die
Zellpellets wurden vorsichtig gewaschen und in einem Ursprungsvolumen von
kaltem mit physiologischer Kochsalzlösung pH 7,2 gepuffertem Phosphat
resuspendiert und anschließend unter Verwendung einer Minisonde
(Branson-Ultraschallgerät) durch zwei Schallbehandlungen für 30 s aufgebrochen. Die
CTB-Gehalte in den Kulturüberständen und den aufgebrochenen Zellen wurden
danach unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers LT39 durch das GML-
ELISA-Verfahren bestimmt (A-M Svennerholm & J Holmgren, Curr Microbiol
1:19-23, 1978). Die konjugale übertragung von pJS162 in den
Toxin-entfernten JBK70 v. cholerae-Stamm führte in diesem Stamm nachdem Wachsen in LB-
Medium und der Induktion mit IPTG zur Herstellung von 40 bis 50 µg/ml CTB;
mehr als 95 % dieses CTB wurde in das Kulturmedium abgegeben (Fig. 3).
Eine CTB-Expression auf Gehalte bis zu 50/100 µg/ml wurde auch in anderen
Toxin- oder CTB-entfernten klassischen und E1 Tor Stämmen, in die das
pJS162-Plasmid übertragen wurde, erreicht, wenn man diese Stämme in
Gegenwart von IPTG wachsen ließ (Tabelle 1). Dies stellt eine markante
Überexpression von CTB dar, im Vergleich zu den Gehalten, die von vielen
untersuchten Wildtypen oder rekombinanten V. cholerae-Stämmen hergestellt
werden, einschließlich des hypertoxigenen 569B-Stamms, der derzeitig in der
Impfstoffherstellung zur CTB-Erzeugung verwendet wird. Da, wenn durch V.
cholerae hergestellt, das rekombinate CTB, das durch pJS162 kodiert ist,
extrazellulär abgesondert wird, kann es einfach in hohen Ausbeuten von den
Kulturüberständen einer dieser Stämme unter Verwendung von zum Beispiel
rezeptorspezifischer Affinitätschromatographie auf Lyso-GMI-Gangliosid (17)
gereinigt werden, siehe das unten aufgeführte Beispiel 4.
Beispiel 2 Überexpression von CTB durch Verwendung eines
konstitutiven tacP-Promotors
-
Von dieser Konstruktion wurde das CTB-Gen aus dem Plasmid pJS162, das
im obigen Beispiel 1 beschrieben ist, herausgeschnitten und anschließend in
den Plasmidvektor pKK223-1 eingefügt, der den tacP-Promotor, aber nicht das
lacIq-Gen, das im pJS162 vorhanden ist und für die IPTG-Abhängigkeit
verantwortlich ist, enthält.
-
Die gleichen Standardverfahren, die in Beispiel 1 beschrieben sind,
wurden zur Isolierung der Plasmid-DNA und zum DNA-Ausschneiden, zur
Ligasierung, zur Transformation in E. coli und zur Konjugation in V. cholerae
verwendet. Das CTB-Gen im Plasmid pJS162 wurde als ein
EcoRI-HindIII-Fragment ausgeschnitten und dann in dem EcoRI-HindIII-restriktiven Plasmid
pKK223-1 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), das den tacP-Promotor
stromaufwärts von der EcoRI-Stelle enthält, ligasiert. Dieses hergestellte
Plasmid PJ57523-1 wurde durch Transformation in E. coli HB101 eingesetzt,
und auch durch Konjugation mit Hilfe des E. coli Helferstammes S17-1 in die
V. cholerae Stämme JBK70 und JS1395 übertragen. Das lacIq-Gen in pJS162
kodiert für große Mengen des lacI-Repressors und die Abwesenheit dieses
Gens im Plasmid PJ575235-1 führt zu einer fast IPTG-unabhängigen Expression
von CTB unter der Kontrolle von tacP durch bakterielle Stämme, die das
PJ57523-1 Plasmid beherbergen. Dies wurde untersucht, indem man E. coli
101 Zellen, die das Plasmid pJS7523-1 beherbergen, in LB-Nährbrühe, die mit
100 µg/ml Ampicillin ergänzt war, bei 37ºC zu einer optischen Dichte von
A&sub6;&sub0;&sub0; 1,0 in doppelten Sätzen von Reagenzgläsern wachsen ließ und indem man
anschließend 100 µg/ml IPTG zu einem Satz, aber nicht zu dem anderen, gab,
und das Inkubieren der bakteriellen Kulturen für weitere 4 h bei 37ºC
fortsetzte. Kulturproben wurden anschließend unter Verwendung einer Minisonde
(Branson-Ultraschallgerät) zweimal jeweils 30 s lang mit Ultraschall
behandelt, um die Zellen aufzubrechen, und nach dem Zentrifugieren wurden die
ultraschallbehandelten Zellen unter Verwendung des GM1-ELISA-Verfahrens,
das auch in Beispiel 1 beschrieben ist, auf ihren CTB-Gehalt untersucht.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß relativ hohe CTB-Gehalte, 2-7 µg/ml,
in der Abwesenheit von IPTG hergestellt wurden, und diese Gehalte waren nur
zwei bis drei mal niedriger, als diejenigen, die in der Gegenwart von IPTG
erreicht wurden. Folglich zeigen die Ergebnisse, daß obwohl CTB-Expression
im pJS7523-1 immer noch durch den lacI-Lactose-Operon Repressor reguliert
wird, die Expression praktisch konstitutiv ist. Das ist wahrscheinlich auf
die Tatsache zurückzuführen, daß der chromosomal-kodierte lacI-Repressor
nicht in ausreichenden Mengen hergestellt werden kann, um wirksam an
beides, den lac-Operator im Chromosom und an tacP im Plasmid pJS7523-1, das
in großer Zahl kopiert wird, zu binden.
Beispiel 3 Expression von CTB durch den T7 RNA polymeraseabhängigen
Promotor
-
In diesem Beispiel wird dokumentiert, daß das Erreichen der
Überexpression von CTB auch durchführbar ist, indem das CTB-Gen unter die
Expressionskontrolle von einem anderen starken fremden (nicht-Choleratoxin)
Promotor, den T7-RNA plymeraseabhängigen Promotor, gebracht wird.
-
Das Strukturgen von CTB (einschließlich der LTB-Leaderpeptid
kodierenden Sequenz), das im Plasmid pJS162 enthalten ist, wurde wieder
herausgeschnitten und in den T7-5 Plasmidvektor eingefügt, der den
hochspezifischen T7-RNA polymeraseabhängigen Promotor enthält (S Tabor und CC
Richardson, Proc Natl Acad Sci USA 82:1074-1078, 1985). Die Expression mit
diesem Promotor erfordert die Gegenwart von T7-RNA Polymerase, die mit
Hilfe des komplementierenden Plasmids (pGP1-2) bereitgestellt wird; die
RNA Polymerase, die durch dieses Plasmid kodiert wird, wird selbst unter
Kontrolle eines Promotors, der durch eine Veränderung der
Wachstumstemperatur (gewöhnlich von 30ºC auf 42ºC) ausgelöst werden kann,
expressioniert.
-
Die Verfahren, die für die Isolierung der Plasmid-DNA, für das DNA-
Ausschneiden, die Ligasierung und die Transformation in D. coli und für die
konjugierte Übertragung in V. cholerae verwendet wurden, waren im
wesentlichen diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben sind. Das CTB in pJS162
wurde als ein EcoRI-HindIII-Fragment ausgeschnitten, und anschließend in
den EcoRI-HindIII aufgespaltenen Plasmidvektor pT7-5 (erhalten von Dr. S
Tabor, Harvard University, Mass, USA) eingefügt. Das resultierende neue
Plasmid wurde dann in E. coli 101, das das Plasmid pGP1-2 enthält (das auch
von Dr. Tabor erhalten wurde), transformiert. Wenn diese transformierten
E. coli Organismen in LB-Nährbrühe, die mit geeigneten Antikörpern in Bezug
auf die beiden Typen von Plasmiden, die in den Zellen enthalten sind
(Kanamycin 50 µg/ml, Ampicillin 100 µg/ml) ergänzt war, wuchsen, stellten
die Zellen keine meßbaren CTB-Gehalte bei 3º0C her, während eine
anschließende Verschiebung der Wachstumstemperatur von 30ºC auf 42ºC zur
Expression von 2-3 µg/ml CTB in E. coli führte, wie durch GM1-ELISA
untersucht. Das CTB-Gen zusammen mit dem T7-RNA-Polymeraseabhängigen Promotor
wurde anschließend auch als ein PvuII-HindIII-Insert in das ECORV-HindIII
aufgespaltete Plasmid pBR325 subkloniert. Das neue Plasmid (pJS7525) wurde
dann von einem E. coli Stamm, der das Plasmid PRK2OL3 enthält, in V.
cholerae JBK70, in das vorher das Plasmid pGP1-2 durch Konjugation von dem
gleichen E. coli Spender übertragen worden war, mobilisiert. Die
Anwesenheit dieser beiden Plasmide war möglich, weil sie kompatible
Replikationsursprünge hatten und weil pJS7525 für Chloramphenicol (und Ampicillin)
Resistenz kodiert, während pGP1-2 das Gen für Kanamycinresistenz besitzt.
Wenn man V. cholerae JBK70, enthaltend die Plasmide pJS7525 und pGP1-2, in
LB-Nährbrühe, die mit 25 µg/ml Chloramphenicol und 50 µg/ml Kanamycin
ergänzt war, bis zu einer hohen optischen Dichte bei 30ºC wachsen ließ,
stellten die Organismen nicht meßbare CTB-Gehalte her, während eine
Verschiebung der Wachstumstemperatur auf 42ºC zum vorhergesehenen T7-RNA-
Polymeraseabhängigen Anstieg der CTB-Expression auf Gehalte von 75-100
µg/ml CTB in den V. cholerae Kulturüberständen führte. Die in diesem
Beispiel beschriebenen Ergebnisse beweisen deutlich beides: daß die CTB-
Überexpression durch verschiedene fremde (nicht-Choleratoxin) Promotoren in
der Tat möglich ist und daß die Überexpression von dem toxR
Regulationssystem abhängig ist, da einer der Faktoren, der zu der hohen Überexpression
von CTB führt, wie durch toxr bewirkt, eine Wachstumstemperatur von
ungefähr 30ºC ist (MJ Bentley et al, Ann Rev Microbiol 40:577-605, 1986). Das
hier beschriebene induzierbare System war bei der optimalen Temperatur für
toxr minimal und bei einer toxR nicht-optimalen Temperatur maximal.
Beispiel 4 Charakterisierung des rekombinaten CTB, das durch das
Plasmid pJS162 in V. cholerae kodiert ist
-
Der Anmelder hat einige der Eigenschaften des rekombinanten CTB, das
mit Hilfe der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Konstrukte
hergestellt wurde, charakterisiert. Die Ergebnisse des Anmelders zeigen,
wie hier für gereinigtes CTB, das vom Plasmid pJS162 kodiert wird und in V.
cholerae JBK70 expressioniert wird, veranschaulicht, daß rekombinantes CTB
trotz einiger Aminosäurenunterschiede sich in jeder der untersuchten
strukturfunktionellen und immunogenen Eigenschaften nicht wesentlich von
CTB, das vom Wildtyp V. cholerae 569B Choleratoxin gereinigt wurde,
unterscheidet.
4.1 Reinigung von CTB und Bestimmung des Aminoendes
-
V. cholerae E1 Tor JBK7O Organismen, die das Plasmid pJS162
beherbergen, wurden bei 30ºC unter ständigem Schütteln in 2 1 LB-Medium, das 100
µg/ml Ampicillin und 100 µg/ml IPTG enthält, gewachsen. Nach der
Kultivierung wurden die Bakterien und bakteriellen Zelireste durch
Zentrifugieren entfernt und das rekombinante CTB durch Affinitätschromatographie
auf einer lyso-GM1 Gangliosid-Sperosil Säule unter Verwendung des
Verfahrens, das von JL Tayot et al in Eur J Biochem 113:249-258, 1981
beschrieben wird, gereinigt. Gereinigtes CTB wurde der Untersuchung der
Aminoendenreste unterzogen, wie von H von-Bahr-Lindström et al, J Prot Chem
1:257-2662, 1982 beschrieben.
-
Es ist natürlich angenommen worden, daß die Spaltung des
Vorläuferpeptids des rekombinanten CTB an einer oder beiden Erkennungsstellen der
ursprünglichen Leaderpeptidase von LTB oder CTB stattfindet. Dies und die
Tatsache, daß das rekombinante CTB ein wenig größer als natürliches CTB
ist, wie durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese
(NaDodSO&sub4;/PAGE) bestimmt, siehe Fig. 4, deutete darauf hin, daß
proteolytisches Processing des Leaderpeptids zwischen Gly, das durch den Linker
(Position -5) kodiert ist und Tyr -4 sowie auch zwischen der letzteren
Aminosäure und Ala -3 stattgefunden hat, siehe Fig. 2. Als der Rest des
behandelten CTB wieder der Aminoendbestimmung unterworfen wurde, wurden
jetzt Ala- und His-Reste identifiziert, wodurch die angenommenen
Spaltungstellen bestätigt und Beweise geliefert wurden, daß das
rekombinante CTB kurze Peptidverlängerungen an seinem Aminoende, die aus
entweder drei oder vier Aminosäuren bestehen, trägt.
4.2 Rezeptorerkennungs- und Rezeptorblockierungseigenschaften
-
Die Gegenwart der wenigen zusätzlichen Aminosäuren in CTB beeinflußten
nicht dessen Erkennung des GML-Rezeptors. Die Bindungsaffinität für
kunststoffbeschichtetes Gangliosid von rekombinantem CTB und von gereinigtem
Vergleichs-CTB des Stammes 569B (Geschenk von Dr. J Armand, Institut
Mérieux, Frankreich) wurde durch Untersuchen verschiedener Konzentrationen
unter Verwendung des GM1-ELISA Verfahrens miteinander verglichen, und es
wurden keine Unterschiede festgestellt. Die Erhaltung der hohen
Bindungsaffinität für GM1-Gangliosid wurde in der Tat bei der Reinigung von
CTB auf Lyso-GM1-Spherosil , wie oben beschrieben, ausgenutzt.
-
Außerdem wurden Experimente durchgeführt, um die Fähigkeit des
rekombinanten CTB im Vergleich zu 569B CTB die Choleratoxin-Rezeptoren im Darm
von Kaninchen zu blockieren, zu bestimmen. Diese Experimente wurden auf
eine solche Art und Weise durchgeführt, daß eines der beiden CTB-Präparate
in legierte Darmschleifen des Tieres ungefähr 10 min vor der Injektion
einer Dosis (0,2 µg) des gereinigten Choleratoxins, das dafür bekannt ist,
massive Darmflüssigkeitssekretion (Experimentelle Cholera) in Abwesenheit
von spezifischer Rezeptorblockierung zu verursachen, injiziert (die genauen
Verfahren sind von J Holmgren et al in Infect Immun 38:424-433, 1982
beschrieben worden). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante
und das 569B CTB-Präparat ähnliche Rezeptorblockierungsaktivität aufweisen.
Beide Präparate konnten vollständig die Cholerasekretion verhindern, wenn
sie kurz vor der Injektion des Choleratoxins (von 569B V. cholerae) in
ungefähr 5 cm lange legierte Darmschleifen in einer Menge von 50 µg in 1 ml
Volumen injiziert wurden. Kontrollschleifen, die allein mit Puffer
anstelle von CTB vorbehandelt und anschließend mit der gleichen Dosis des
Choleratoxins injiziert wurden, zeigten eine auffallende
Flüssigkeitsanhäufung, 1,7 ± 0,2 ml/cm, und Schleifen, die mit 10 µg oder kleineren
Mengen an CTB vor der Toxinherausforderung vorbehandelt wurden, zeigten
teilweise eine oder keine Verminderung der Flüssigkeitsanhäufung im
Vergleich zu mit Puffer vorbehandelten Kontrollen.
4.3 Oligomerisation und Fähigkeit, sich mit der
A-Untereinheit zu verbinden
-
In anderen Experimenten wurde gezeigt, daß das rekombinante CTB
außerdem in seiner Fähigkeit zu oligomerisieren und sich mit der A-Untereinheit
des Choleratoxins (CTA) zu verbinden, nicht beeinträchtigt war. Für diese
Untersuchungen wurde gereinigtes CTA (hergestellt von 569B CTB; List
Biological Laboratories) mit gereinigtem rekombinantem oder 569B CTB in
einem Molverhältnis von CTB zu CTA, das gewöhnlich in intaktem CT vorliegt,
gemischt, unter Erhalt einer Gesamtproteinkonzentration von 200 µg/ml.
Nach dem Mischen wurden die Proben mit 0,2 M Glycinpuffer pH 2,7 sauer
gemacht und anschließend durch Dialyse über Nacht gegen verschiedene Wechsel
von 0,05 M Trispuffer pH 8,0 neutralisiert. Die neutralisierten Proben
wurden dann durch GM1-ELISA mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch
für die Untereinheiten sind, wie von SJS Hardy et al in Proc Natl Acad Sci
USA, im Druck 1988, beschrieben, untersucht. Die 569B CTA-Mengen, die sich
mit rekombinatem oder mit 569B-CTB verbinden, um ein Holotoxin zu ergeben,
wurden unter Verwendung von unbehandeltem homologen Choleratoxin als
Vergleich berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Sie
veranschaulichen eine hohe Rückgewinnung von immunreaktivem CTB, was ein
direkter Hinweis auf pentamerisches eher als monomerisches CTB ist, da
bekannt ist, daß der CTB-spezifische monoklonale Bestimmungsantikörper nur
mit der B-Pentamerform reagiert. Sie zeigen außerdem eine hohe
Rückgewinnung des immunreaktiven CTA, was ein direkter Hinweis auf die CTA-
Menge, die sich mit CTB verbindet, ist, da nicht verbundenes CTA nicht an
die GM1-Kunststoffbeschichteten Vertiefungen binden würde und folglich
nicht festgestellt werden würde. Das rekombinante CTB und das gereinigte
Vergleichs-569B CTB verhielten sich in diesen Experimenten sehr ähnlich
(Tabelle 2).
4.4 Immunologische Eigenschaften von rekombinatem CTB
-
Erwachsene Kaninchen erhielten drei subkutane Immunisierungen mit 30
µg des rekombinanten CTB oder des 569B CTB in Abständen von zwei Wochen
zwischen den Injektionen. Die Proteine wurden in der ersten Impfung mit
kompletten Freunds Adjuvant verabreicht und anschließend mit inkomplettem
Adjuvant. Zwei Wochen nach der dritten Immunisierung wurde den Tieren Blut
abgenommen und das Serum wurde zur Untersuchung gesammelt.
-
Doppelte Diffusion-im-Gel-Immunpräzipitationsuntersuchungen (ad modum
Ouchterlony) wurden unter Verwendung des Mikrobehältersystems, das von C.
Wadsworth in Int Arch Allergy 17:165-177, 1957 beschrieben wurde,
durchgeführt. Diese Studien wurden mit dem gereinigten rekombinanten CTB und
mit 569B CTB sowie deren entsprechenden Kaninchenimmunsera als reagierende
Komponenten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen
Immunpräzipitations-Verschmelzungsbanden ohne jegliche Spuren zwischen rekombinantem und
natürlichem CTB, was auf eine immunologische Identität hindeutet (Fig. 5).
-
Titration von Antitoxinantikörpern in den Kaninchenimmunsera gegen
rekombinantes bzw. 569B CTB wurde durch GML-ELISA unter Verwendung von
gereinigtem rekombinantem und 569B CTB als Antigene, die auf GM-1
beschichtete Platten aufgebracht wurden, durchgeführt (A-M Svennerholm et al,
J Infect Dis 147:514-521, 1983). Die Anti-CTB Titer in GML-ELISA waren für
antirekombinantes und anti-569B CTB ähnlich, und zwar im Bereich von
zwischen 4x10&sup5; - 1x10&sup6;, wie mit einer der zwei CTB-Präparate als
Festphasenantigen untersucht.
-
Neutralisierende Antikörper wurden durch das
Hautuntersuchungsverfahren von JP Craig (Nature 207:614-616, 19651 (??)) unter Verwendung
von gereinigtem 569B CT als Probetoxin untersucht. Wärmeinaktiviertes
Serum wurde in Serienverdünnungen mit dem gleichem Volumen von gereinigtem
569B, CT, 40ng/ml in physiologischer phosphatgepufferter Kochsalzlösung,
das mit 10 mg/ml Rinderserumalbumin ergänzt war, gemischt, und 0,1 ml
dieser Mischung wurden anschließend auf verbleibende Toxizität durch
intradermale Injektion untersucht. Die neutralisierenden Antitoxintiter
zwischen den Sera gegen entweder rekombinantes CTB oder 569B CTB
unterschieden sich auch nicht. Beide Typen von Antisera konnten vollständig 2
ng CT bei Konzentrationen bis zu 1x10&supmin;&sup4; neutralisieren.
Beispiel 5 tacP-gerichtete Überexpression eines Hybrid CTB
Genfusionsproteins
-
Die in Beispiel 1 beschriebenen Methoden, um das CTB-Gen unter die
Kontrolle von tacP zu bringen, schließen für Genfusionen aufgrund des
Designs die Einführung von einfachen Enzymrestriktionsschnittstellen in das
CTB-Amino-Ende ein. Die Klonierung in diese Stellen erlaubt die
Konstruktion von CTB-abstammenden Hybridproteinen, die zum Beispiel
verschiedene mutmaßliche Vaccinpeptidantigene tragen, die auch unter der
gleichen Expressionskontrolle fremder Promotoren, z.B. von tacP, stehen,
wie für CTB selbst in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die
Ausführbarkeit dieses Ansatzes wird hier durch die Fusion eines
wärmebeständigen E. coli Peptids, das mit Enterotoxin (STa) verwandt ist und
durch synthetische Oligodesoxynukleotide kodiert wird, an das Amino-Ende
von CTB in einem tacP-gerichteten Uberexpressionssystem veranschaulicht.
5.1 Beschreibung der Konstruktion
-
Plasmid pJS162, das eine einzelne SacI und eine XmaI (SmaI)
Restriktionsschnittstelle am Anschluß zwischen Leaderpeptid und gereiftem
CTB (siehe Fig. 1B) enthält, wurde mit den entsprechenden zwei Enzymen
aufgespalten und an ein synthetisches Oligonukleotid, das das mit
STa-verwandte Decapeptid Cys-Ala-Glu-Leu-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys kodiert, über die
SacI und XmaI kompatiblen Enden ligasiert (siehe Fig. 6). Das Plasmid
pJS8, das unter der Kontrolle des tacP-Promotors steht und ein Hybridgen
hat, das ein Fusionsprotein kodiert, wobei das mit STa-verwandte
Decapeptid, das von einigen zusätzlichen Aminosäuren flankiert ist, kovalent an
das Aminoende des reifen CTB gebunden wird, wurde dadurch zur Verfügung
gestellt. Die Sequenz des fusionierten, mit STa-verwandten Decapeptids
war, außer der Substitution von einem Cysteinrest durch Alanin, mit einem
Bereich des natürlichen STa identisch. Die Auswahl der Sequenz basierte
auf den vorhergehenden Erkenntnissen über die Fähigkeit eines
nichttoxischen diesen Aminosäurenaustausch enthaltenen Nonadecapeptids
spezifisch einen Anti-STa monoklonalen Antikörper, der die Fähigkeit besitzt, E.
coli STa zu neutralisieren, zu binden (A-M Svennerholm et al, FEMS
Microbiol Lett, im Druck 1988). Die hier fusionierte Sequenz ist jedoch
kürzer und enthält nur 10 Aminosäuren einschließlich von vier Cysteinen.
-
Die in dieser Konstruktion verwendeten experimentellen Verfahren und
Reagenzien sind unten aufgeführt. Der E. coli Stamm HB101 wurde als
transienter Wirt für die Plasmid-Isolierung verwendet. Der V. cholerae Stamm
JS1569 ist ein Rifampycin-resistentes Derivat des Stammes CVDLO3. E. coli
S17-1 wurde für die Konjugatübertragung der Plasmide in den Stamm JS1569
verwendet. Die Quellen und andere Eigenschaften dieser Stämme wurden in
Beispiel 1 beschrieben. Die Isolierung der Plasmid-DNA durch das
Alkalilyse-Verfahren, einschließlich des Zentrifugierens in
CsCl/Ethidiumbromidgradienten, der DNA-Transformation in E. coli und der
Konjugationen in V. cholerae wurden auch gemäß Maniatis et al (1982), wie
in Beispiel 1 spezifiziert, durchgeführt. Die Bedingungen für die
Restriktion und die Ligasierung der DNA wurden, wie vom Hersteller für die
verschiedenen Enzyme empfohlen, verwendet. Die Enzyme wurden von
Boehringer Mannheim und New England Biologics erworben. Die synthetischen
Oligodesoxynukleotide, die das mit STa-verwandte Decapeptid und angrenzende
Aminosäuren kodieren, wurden als komplementäre einzelne Stränge vom
Department of Immunology (Dr Lena Samuelsson), Biomedical Centre, Uppsala,
Schweden erworben. Nach der Paarung bei Raumtemperatur unter Bedingungen
wie in Beispiel 1 beschrieben, enthielten die synthetischen
doppelsträngigen Oligodesoxynukleotide einzeisträngige Enden, die mit SacI am 5'
Ende und mit XmaI am 3' Ende kompatibel sind.
5.2 tacP-gerichtete Expression von ST Decapeptid-CTB
Fusionsprotein
-
E. coli 101 oder V. cholerae JS1569 Kulturen, die das pJS8 Plasmid
beherbergen, ließ man unter ständigem Schütteln bei 37ºC (E. coli) oder bei
30ºC (V. cholerae) in einem flüssigen LB-Medium, das geeigneterweise
Ampicillin (100 µg/m1) und/oder Rifampycin (50 µg/m1) enthält, über Nacht
oder bis sie die gewünschte optische Dichte (600 nm) erreichten, wachsen.
Die Induktion der Expression durch den tacP-Promotor durch Isopropyl-β-D-
thio-galactopyranosid (IPTG) wurde entweder durch Zugabe von IPTG am Anfang
der Kultivierung (0,4 mM Endkonzentration) oder indem erst die Stämme bis
zu einer O.D.&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 in Abwesenheit eines Induzierers wuchsen und
anschließend IPTG zugegeben wurde und indem die Kultivierung vor dem Ernten
für weitere 4 Stunden fortgesetzt wurde, erreicht. Nach dem Wachsen wurden
die bakteriellen Zellen und Kulturüberstände durch Zentrifugieren für 5 min
in einer Mikrozentrifuge (Eppendorf) getrennt. Die Zellpellets wurden in
kalter, phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2)
resuspendiert und durch zweimalige jeweils 30 s lange Ultraschallbehandlung
(Branson-Ultraschallgerät) aufgebrochen. Die Bestimmung der STa- und CTB-
Antigene in den Überständen und Zellsonicaten erfolgte durch GM1-ELISA,
beschrieben von J Sanchez et al. in FEBS Letters 208:194-198, 1986 unter
Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen natürliches STa bzw. CTB
gerichtet sind.
-
Das mit STa-verwandte Decapeptid CTB-Hybrid, das durch pJS8 kodiert
ist, wurde anfänglich in transformierten E. coli 101, die man in Gegenwart
von IPTG wie oben beschrieben wachsen ließ, festgestellt. Das Plasmid pJS8
wurde anschließend durch Konjugation eines Helfer-E. Coli-Stammes (S17-1)
in das V. cholerae JS1569 übertragen (unter Verwendung der Verfahren wie in
Beispiel 1 beschrieben). Die Expression des Hybridgens in diesem
Organismus wurde nach der Kultivierung unter Zugabe von verschiedenen
IPTG-Konzentrationen während der logarhythmischen Wachstumsphase untersucht, und
die zelluläre Lokalisierung des Decapeptid-CTB-Proteins wurde auf eine
ähnliche Weise, wie in Beispiel 1 nur für CTB beschrieben, bestimmt. Die
Ergebnisse in Fig. 7 zeigen, daß das Hybridprotein auf eine deutlich
IPTGabhängige Weise hergestellt wurde und daß es vollständig in das
extrazelluläre Milieu abgesondert wurde. Dieser Ort des Decapeptids-CTB
erlaubte seine Reinigung durch Lyso-GM1 Affinitätschromatographie auf die
gleiche Weise wie in Beispiel 4 für rekombinantes CTB alleine beschrieben.
5.3 Eigenschaften des
Gen-Fusions-Decapeptid-CTB-Hybridproteins
-
Um die Eigenschaften des Decapeptid-CTB zu untersuchen, wurde das
Hybridprotein von den Kulturüberständen des Vibrio cholerae Stammes JS1569,
der das Plasmid pJS8 beherbergt, durch Einschritt-Affinitätschromatographie
im wesentlichen gemäß JL Tayot et al, Eur J Biochem, 113:249-258,
gereinigt.
-
5 µg gereinigtes Protein oder Vergleichs-CTB wurde anschließend der
Elektrophorese auf einem 13,5 % SDS-Polyacrylamidgel in Anwesenheit von
mercaptoethanol unterworfen. Proteinproben wurden vor der Elektrophorese
entweder gekocht oder bei Raumtemperatur in Probenpuffer stehen gelassen,
um die Proteine in ihren pentamerischen und monomerischen Formen zu
untersuchen (siehe TR Hirst & J Holmgren, Proc Natl Acad Sci USA, 84:7418-7422,
1987). Die aufgetrennten Proteine wurden daraufhin auf Nitrozellulose
elektrotransferiert, um mit Anti-STa oder Anti-CTB monoklonalen Antikörpern
zu reagieren, gefolgt von Inkubieren mit Anti-Maus IgG,das an Peroxidase
gekoppelt ist (Jackson Biologicals). Immunreaktive Proteinbanden wurden
schließlich unter Verwendung von α-Chlornaphtol-Substrat entwickelt. Die
Reaktion mit Anti-CTB zeigte Banden an den Stellen, an denen die
pentamerischen Formen des Kontroll-CTB oder des mit STa-verwandten Decapeptid-
CTB-Hybridproteins erwartet wurden. Durch Inkubieren der jeweilig
gekochten und ungekochten Proben mit Anti-STa monoklonalem Antikörper
entwickelten sich Banden, die den pentamerischen und monomerischen Formen des
Decapeptid-CTB-Proteins entsprechen, aber eine negative Reaktion mit
entweder den pentamerischen oder monomerischen Formen des Kontroll-CTBs
ergaben. Die monomerische Form von CTB reagierte nicht mit Anti-CTB, während
eine geringfügige Reaktion der monomerischen Form des Decapeptid-CTBs mit
diesem Antikörper beobachtet wurde.
-
Das Decapeptid-CTB-Protein entfaltete keine Toxizität bei den bis zu
10 µg getesteten Mengen, die im intragastralen Injektionstest der jungen
Maus verabreicht wurden. Der Test ist von A-M Svennerholm et al in FEMS
Microbiol Letters, im Druck, 1988, beschrieben worden. Gleichzeitig
untersuchtes gereinigtes natürliches STa (erhalten von Dr A-M Svennerholm) ergab
positive Jungmausteste bis zu Mengen von 1 ng, d.h. eine 10.000fach
niedrigere Dosis. Das mit STa-verwandte Decapeptid-CTB-Hybridprotein konnte
wirksam Anti-STa monoklonale Antikörper in beiden Untersuchungen (GM1-ELISA
und Immunblot) binden, siehe Fig. 7 und 8. Das Hybridprotein weiste
zusätzlich eine Anzahl an Merkmalen auf, die für den CTB-Teil
charakteristisch sind, wie die Fähigkeiten, zu pentamerisieren, an den GM1-Rezeptor
zu binden und von V. cholerae abgesondert zu werden; diese Eigenschaften
wurden unter Verwendung von Verfahren, die in Beispiel 4 für rekombinates
CTB allein beschrieben worden sind, untersucht.
-
Wenn das gereinigte Protein verwendet wurde, um Kaninchen zu
immunisieren, wurden Antikörper erhalten, die mit natürlichem STa
crossreagierten. Der Anti-STa Titer, der durch ELISA unter Verwendung eines
synthetischen, kunststoffbezogenen STa als Festphasenantigen bestimmt
wurde, stieg von einem unbestimmbaren Wert in dem Serum der Prä-Impfung auf
einen Titer von 1:2.000 nach drei subkutanen Impfungen, was sich
vorteilhaft mit den Titern, die in Kaninchen durch Impfung mit einem chemisch
abstammenden Hybridprotein erhalten werden, vergleichen läßt. Die
Immunogenität zusammen mit dem Mangel der Toxizität des mit STa-verwandten
Decapeptid-CTB Protein und seine Fähigkeit, den GML-intestinalen Rezeptor zu
erkennen, machen das Hybridprotein zu einem Toxoid-Kandidaten für die orale
Impfung gegen den mit STa verbundenem E. coli-Durchfall in Tieren und
Menschen.
Tabelle 1
Überexpression von CTB durch den tacP-Promotor in V. cholerae
-
Alle Stämme wurden für die gleiche Zeit bei 30ºC gewachsen.
-
Die Stämme, die pJS162 tragen, wurden bis auf A&sub6;&sub0;&sub0; 1,0 gewachsen,
bevor 100 µg/ml IPTG zugegeben wurden, danach wurde die Inkubation für 4
Stunden fortgesetzt.
-
bedeutet ein nichtfunktionelles (CTA-) oder funktionelles (CTA+)
CTA-Gen und/oder ein nichtfunktionelles (CTB-) oder oder funktionelles
(CTB+) CTB-Gen. Die Stämme wurden durch Gendeletion hergestellt.
-
Stämme JS1569 und JS1395 sind Rifampycin-resistente Derivate der
Stämme CVD103 bzw. CVD101 (0395 CTA-Derivat) . Der Gehalt an durch diese
letzteren Stämme hergestelltem CTB in der Abwesenheit von IPTG betrug
weniger als 0,5 µg/ml und deswegen trug es nicht wesentlich zu den Gehältern in
der Anwesenheit des Induzierers bei.
Tabelle 2 Affinität von rekombinantem CTB für CTA
-
Die Affinität von rekombinantem oder 569B CTB für CTA wurde durch ihre
Fähigkeit, sich in vitro zu verbinden, um Cholera-Holotoxin zu bilden,
untersucht. Mischungen aus CTA und CTB in einem Molverhältnis von 1:5 wurden
auf pH 7,2 gesäuert, um die CTA-Pentamere aufzuspalten. Die Verbindung
zwischen CTA und dem zugegebenen CTB wurde anschließend durch
Neutralisieren der Lösung durch Dialyse gegen Tris pH 8,0 begünstigt. Die
neutralisierten Proben wurden unmittelbar durch GM1-ELISA mit CTA- und CTB-
spezifischen monoklonalen Antikörpern untersucht.
-
Die Werte, die als Prozente angegeben sind, beziehen sich auf den
Anteil der als CT festgestellten Untereinheit, berechnet im Bezug auf die
Höchstmenge, die theoretisch Holotoxin bilden kann.
-
Figur 1A Fusionsverbindungsstellen zwischen den LTB- und CTB-
Genen. Die mit offenen Quadraten unterstrichenen Nukleotide bedeuten LTB-
Gen DNA, diejenigen, die mit gefüllten Quadraten unterstrichen sind, sind
die synthetischen Oligodesoxynukleotide, die Teil des Linkers sind und die
diejenigen, die mit Rechtecken unterstrichen sind, bedeuten CTB-Gen DNA.
Die Numerierung über den Aminosäuren bezieht sich auf ihre vorherigen
Stellen in Bezug auf die erste Aminosäure (+1) in deren entsprechenden
natürlichen Proteinen. Die Sternchen bedeuten Aminosäuren, die
ursprünglich nicht durch eines der zwei fusionierten Gene kodiert worden sind. Der
synthetische Linker stellt die SacI-Stelle wieder her und fügt eine SmaI
Erkennungssequenz ein. Nach der Fusion wurde ein Plasmid, das CTB
durch
tacP kodiert, erhalten (siehe B unten). Die gezeigte Sequenz ist durch
Desoxynucleotidsequenzieren bestätigt worden.
-
B Karte des Plasmids pJS162 mit dem CTB-Gen unter Kontrolle des
tacP-Promotors. Das Plasmid hat einen RSF1010 Replikationsursprung und ist
ungefähr 10,2 kb groß. Der große Pfeil bedeutet die Lage des tacP-
Promotors. Der Kasten mit den Sternchen stellt den Genanteil, der reifes
CTB kodiert, dar. Der Abschnitt, der das Leaderpeptid (das von LTB stammt)
kodiert, ist durch den gefüllten Kasten dargestellt. Ungefähre Lagen der
Ampicillinresistenz und lacIq -Gene sind angezeigt.
-
Figur 2 Nukleotidsequenz des CTB-Gens im pJS162-Plasmid. Nur der
Antisinn-Strang ist gezeigt, kodierte Aminosäuren sind über ihre
entsprechenden Kodone dargestellt. Der Thr-Rest, der als +1 numeriert ist, ist
die erste Aminosäure, die gewöhnlich in reifem CTB festgestellt wird,
während der Ala-Rest an der Stelle -7 (oder +1 in Klammern) die erste
Aminosäure in reifem LTB ist. Die Aminosäuren, die anfänglich nicht in
einem der beiden Proteine vorhanden sind, sind durch Sternchen angegeben.
Eine mögliche Ribosomenbindungsstelle (Shine Dalgarno Sequenz) ist
unterstrichen (SD). Die vertikalen Pfeile bedeuten die Peptidbindungen, die
gespalten werden, um reifes rekombinantes CTB freizusetzen. Die
Aminosäuren in der 569B-CTB-Proteinsequenz, die mit denen der von uns
angenommenen CTB-DNA-Sequenz nicht übereinstimmen, sind in Klammern
dargestellt, CTB-Reste des El Tor Stammes, die sich von denen des Anmelders
unterscheiden, und diejenigen in klassischem 569B-CTB sind in Klammern und
in fett dargestellt.
-
Figur 3 Induktion der CTB-Expression durch IPTG in V. cholerae
JBK70 (pJS162) Die CTB-Gehalte (Ordinate), die als Äquivalente des
gereinigten 569B-CTB-Proteins ausgedrückt sind, wurden durch GM1-ELISA
unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers bestimmt. Die
tatsächlichen Konzentrationen in den Zellpellets waren 10-fach niedriger
als in der grafischen Darstellung gezeigt (Zellen x 10).
-
Figur 4 PAGE der gekochten und ungekochten CTB-Proben. Gleiche
Mengen des rekombinaten CTB-Proteins (Bahnen 1 und 2) oder des
Vergleichs-569B-CTB (Bahnen 3 und 4) wurden in einem 13,5 % Polyacrylamid NaDodSO&sub4;-Gel
nach der Behandlung in Probenpuffer für 5 Minuten bei 100ºC (Bahnen 1 und
3) oder bei Raumtemperatur (Bahnen 2 und 4) der Elektrophorese unterworfen.
Ein Molekulargewichtmarker (Biorad) mit den ungefähren Größen von
Proteinstandarden (kDa) wird gezeigt (MW) . Die langsamere Migration des
rekombinanten CTBs, im Vergleich zum 569B CTB ist bei der Untersuchung der
Monomere
(Bm) nur leicht bemerkbar, aber ist bei den oligomerischen
(pentamerischen) Formen (Bp) offensichtlicher.
-
Figur 5 Ouchterlony doppelte-Diffusionsanalyse in einem Gel von
569B-CTB (Vertiefungen B und F) und rekombinantem CTB (Vertiefungen G und
D), die mit Kaninchenantisera (wobei die Vertiefungen A und E
antirekombinantes CTB und die Vertiefung C Anti-569B-CTB enthielten) reagiert
wurden.
-
Figur 6 Fusion des mit Sta-verwandtem Decapeptids an CTB. Ein
synthetisches Oligodesoxynukleotid (das durch die dicken Großbuchstaben
gekennzeichnet ist) mit einfachsträngigen Verlängerungen, die mit den SacI
und XmaI-Restriktionsenden kompatibel sind, wurde am DNA-Bereich, der das
Aminoende von CTB im Plasmid pJS162 kodiert, eingefügt. Die Einfügung der
synthetischen Oligonukleotide wurde so durchgeführt, daß der ursprüngliche
Leserahmen in dem CTB-Gen beibehalten wurde, wodurch ein Hybridgen, das ein
Fusionsprotein kodiert, das eine Peptidverlängerung enthält, die das mit
CTA verwandte Peptid (durch Sternchen gekennzeichnet) am Aminoende von CTB
(erste Aminosäure, die durch die Zahl +1 gekennzeichnet ist) enthält,
entsteht. Die Aminosäuren, die durch (+) angezeigt sind, sind Aminosäuren,
die durch die gekennzeichneten Oligonukleotide, von denen angenommen wird,
daß sie ein Teil des mit STa in Bezug stehenden Decapeptids bilden,
kodiert. Stromaufwärts der ersten Aminosäure (Arg) befindet sich ein
Leaderpeptid für CTB, das von einem Gen, das LTB kodiert, abstammt, eine
Ribosomenbindungstelle (S/D) und der tacP-Promotor für die Expression des
Hybridgens (siehe Plasmid pJS162 in Figur 1B).
-
Figur 7 Induktion des mit STa verwandten Decapeptids-CTB-
Hybridgen-Expression durch IPTG in V. cholerae jBK70, enthaltend das
Plasmid pJS8. Die Zellen wurden in flüssigem Medium auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 in
Abwesenheit eines Induzierers gewachsen und anschließend wurde IPTG in den
angegebenen Konzentrationen zugegeben, und die Kultivierung der Bakterien
für weitere 4 Stunden fortgesetzt, bevor die bakteriellen Zellen und
Kulturüberstände geerntet wurden, wie im Text beschrieben.
Hybridproteingehälter (Ordinate) wurden durch GM1-ELISA unter Verwendung eines
spezifischen monoklonalen Anti-STa-Antikörpers (ST 1:3, der freundlicherweise
von Dr. A.M. Svennerholm, Göteborg, Schweden zur Verfügung gestellt wurde)
bestimmt. Ein gereinigtes mit STa verwandtes
Decapeptid-CTB-Hybridproteinpräparat wurde als Vergleichsprobe verwendet. Die Sternchen bedeuten
Hybridproteinkonzentrationen des Hybridproteins in den Überständen und die
offenen Quadrate zellverbundene Konzentration, die nach Zerstörung der
Zellen durch Ultraschallbehandlung bestimmt wurden.
-
Figur 8 Untersuchung durch Immunblotting des mit STa verwandten
Decapeptid-CTB-Hybridproteins nach
Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelektrophorese, gefolgt von Elektrotransferierung der aufgetrennten
Proteine auf Nitrozellulosepapier. Bahnen A-D zeigen Reaktionsbilder von
ungekochtem gereinigtem 569B-CTB (Bahn A), gekochtem CTB (Bahn B),
ungekochtem mit STa verwandten Decapeptid-CTB (Bahn C) und gekochtem mit
STa verwandten Decapeptid-CTB (Bahn D) nach der Entwicklung mit
Anticholeratoxin-monoklonalen Antikörpern Wi7:5. Bahnen E-H zeigen die
Reaktionsbilder, die für die gleichen Proteine erhalten werden, nach der
Entwicklung mit Anti-STa-monoklonalen Antikörpern 1:3. Die Pfeile zeigen
die Migrationslagen der Vergleichsproteine mit bekannten Molekulargewichten
(in kilo daltons angezeigt), die auf dem gleichen Gel liefen.