DE3788408T2

DE3788408T2 - Immunverstärkung.

Info

Publication number: DE3788408T2
Application number: DE87902340T
Authority: DE
Inventors: Thomas Barnes; Philip Lehrbach; Gregory Russell-Jones
Original assignee: Bioenterprises Pty Ltd
Current assignee: Bioenterprises Pty Ltd
Priority date: 1986-04-21
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2007-04-17
Also published as: CA1331355C; US5874083A; EP0267204A1; IL82235A0; EP0267204B1; DE3788408D1; JP2581943B2; WO1987006590A1; KR910002693B1; NZ220027A; JPH01500117A; EP0267204A4; IL82235A

Description

Die Erfindung betrifft eine Klasse von Molekülen, die beim Ankoppeln an ein Immunogen die Immunreaktion des Wirtes gegenüber dem Immunogen verstärken können, unabhängig davon, ob der Komplex parenteral, enteral oder oral verabreicht wird.

Hinterlegung von Stämmen.

Es wird auf ATCC 67331 bezug genommen, das einen E. coli-Stamm betrifft, der bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U. S. A., am 2. März 1987 hinterlegt wurde.

Technologischer Hintergrund.

Um ein Tier gegen angreifende Pathogene (bakteriell, viral oder parasitisch) zu schützen, ist es häufig ratsam, das Tier mit dem gesamten Organismus oder mit solchen Untereinheiten des Pathogens zu impfen, die eine schützende Immunreaktion in dem Wirt hervorrufen. Die durch eine derartige antigene Stimulation erzeugte Immunreaktion kann oft durch die gleichzeitige Verabreichung eines immunverstärkenden Mittels oder Adjuvans verstärkt werden. Die besten dieser Mittel sind die Adjuvantien vom Depottyp (wie das vollständige Adjuvans von Freund, das unvollständige Adjuvans von Freund und Montanid). Diese Adjuvantien können die Antikörperreaktion nach der Antigeninjektion auf das etwa 50- bis 100-fache des Spiegels steigern, der bei alleiniger Injektion des Antigens erhalten wird.
Während Adjuvantien wie das vollständige Adjuvans von Freund, das unvollständige Adjuvans von Freund und Montanid die Immunreaktion auf ein Antigen im großen Umfang verstärken können, zeigen sie einige Nachteile. Bei Verwendung mit einem Antigen in einer injizierbaren Form bilden sich häufig am Injektionsort grobe Läsionen; dies ist eine Situation, in der sie zur Verwendung bei Menschen, Haustieren oder zur Fleischerzeugung bestimmten Tieren ungeeignet sind. Weiterhin versagen diese Adjuvantien bezüglich ihrer Wirkung als immunopotenzierende Mittel, wenn sie oral oder enteral verabreicht werden.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0242243 offenbart ein Hybridprotein lamB-VP1 des lamB-äußeren Membranproteins von E.coli. Eine Immunogenizität des Hybridproteins wird jedoch nicht offenbart.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0146416 betrifft ebenfalls das lamB-Protein, enthält jedoch keinerlei Information über die Adjuvans-Eigenschaften des lamB-Proteins.
Cham. Abstract 106 : 3546a, entsprechend Chem.Peptide Proteins 1986, 3, Seiten 351 bis 362 betrifft die Verknüpfung des N-terminalen Teils eines Membranproteins, des E.coli Lipoproteins, an antigenes Material zur Erzeugung einer immunologischen Reaktion auf das Antigen-Material. Der minimale N-Terminus des Lipoproteins weist die Sequenz N-palmitoyl-cys-serser auf.
Die UK-Patentanmeldung Nr. 2 004 744 beschreibt einen Komplex, der sich zwischen einem Antigen und einem Protein des Major Histocompatibility Complex (MHC) bildet.
Aus der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0161188 ist es bekannt, bakterielle Polysaccharide kovalent an immunogene Proteine zu binden, um die Immunogenizität des Polysaccharids zu verbessern. Die Immunreaktion auf das Polysaccharid wird jedoch nicht in dem Ausmaß gesteigert, daß ein zusätzliches Adjuvans nicht erforderlich ist.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0243333 beschreibt die Herstellung eines Fusionsproteins, bei der ein Immunogen an ein relativ grobes Trägerprotein wie Protein A gebunden wird, welches die Reinigung erleichtert. Wie bei der vorherigen Veröffentlichung ist ein Adjuvans, in diesem Falle das von Freund, erforderlich, um eine befriedigende immunologische Reaktion hervorzurufen.

Beschreibung der Erfindung.

Die Erfindung betrifft eine Klasse von Molekülen, die bei der chemischen oder genetischen Verknüpfung mit einem Immunogen oder Hapten die Immunreaktion des Wirtes auf das Immunogen oder Hapten verstärken, und zwar unabhängig davon, ob der Komplex parenteral, enteral oder oral verabreicht wird. Zusätzlich führt ihr Einsatz nicht zu der Ausbildung grober Läsionen am Injektionsort.
Moleküle mit dieser Wirkung können so definiert werden, daß ihnen die allgemeine Eigenschaft zukommt, Membranproteine zu sein, und die hier beschriebenen Beispiele stammen von spezifischen Typen von Membranproteinen, insbesondere den äußeren Membranproteinen gramnegativer Bakterien. Spezifisch wiedergegebene Beispiele schliefen das TraT-Protein ein, ein äußeres Membranprotein bestimmter Stämme von E. coli, das für die Widerstandsfähigkeit dieser Stämme gegenüber dem Abtöten durch Serum verantwortlich ist. Andere Proteine dieser Klasse sind die äußeren Membranproteine OmpA und OmpF von E. coli. Wenn Mengen von TraT, OmpA oder OmpF (im folgenden als Träger bezeichnet) intramuskulär Mäusen ohne Adjuvans injiziert werden, wird eine Antikörperreaktion hervorgerufen, die vergleichbar ist mit derjenigen, wenn ein lösliches Protein wie BSA, Flagellin oder Schaf-IgG mit dem unvollständigen Adjuvans von Freund vermischt und anschließend injiziert wird. In der Tat ist die Antikörperreaktion, die durch die äußeren Membranproteine hervorgerufen wird, so hoch, daß sie durch Adjuvation mit dem unvollständigen Adjuvans von Freund nur geringfügig verstärkt wird.
Es wurde weiterhin gefunden, daß die orale Verabreichung von TraT oder OmpA zu der Stimulierung von signifikanten Titern von anti-TraT (1/4096) oder anti-OmpA (1/892)-Serumantikörpern führt.
In ähnlicher Weise wurde gefunden, daß die Zufuhr von mäßigen Mengen (10&sup9;-10¹&sup0;) von TraT in der äußeren Membran enthaltenden Salmonellen oder E. coli ebenfalls die Bildung von Anti-TraT- Antikörpern verstärkt.
Die kovalente Bindung eines Haptens (Dinitrophenol, DNP), eines Peptids (CSP) oder eines Proteins (Rinder-Serumalbumin, BSA) an OmpA oder TraT wirkt ebenfalls unter Verstärkung der Immunreaktion auf DNP, CSP oder BSA.
Gemäß einer ersten Ausführungsform ist die Erfindung auf einen Komplex gerichtet, der ein an ein Trägermolekül gekoppeltes Immunogen umfaßt, und der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Trägermolekül die Immunreaktion eines Wirtes auf das Immunogen verstärkt, wenn der Komplex an den Wirt verabreicht wird, unabhängig davon, ob der Komplex parenteral, enteral oder oral verabreicht wird, wobei das Immunogen entweder ein Antigen oder ein Hapten und das Trägermolekül die Gesamtheit oder einen Teil des TraT-Proteins, des äußeren Membranproteins OmpA oder des äußeren Membranproteins OmpF, gebildet von E. coli-Stämmen, enthält. Alternativ umfaßt das Trägermolekül die Gesamtheit oder einen Teil des TraT-Proteins oder des äußeren Membranproteins OmpA oder OmpF, gebildet von Salmonella-Stämmen.
Bevorzugte Immunogene der Erfindung schliefen CSP, das virale Capsidprotein VP7 von einem Rotavirus-Stamm und die Gesamtheit oder einen Teil des eukaryotischen Proteins Minactivin ein.
Der Immunogen/Träger-Komplex kann auf chemischen Wege erhalten werden, einschließlich dem der Konjugation, z. B. unter Verwendung entweder eines geeigneten Konjugations- oder Verknüpfungsmittels, und der Modifikation und/oder der Umsetzung auf dem Träger und/oder dem Immunogen vorhandener funktioneller Gruppen.
Somit ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Komplexes gerichtet, der ein wie oben beschrieben an ein Trägermolekül gekoppeltes Immunogen umfaßt, wobei das Verfahren einen der folgenden Schritte oder mehrere umfaßt:
a) Umsetzung des Immunogens mit dem Träger unter Bildung des Komplexes;
b) chemische Modifizierung des Immunogens zur Bereitstellung mindestens einer funktionellen Gruppe, die eine chemische Bindung ausbilden kann, und Umsetzung des modifizierten Immunogens und des Trägers unter Bildung des Komplexes;
c) chemische Modifizierung des Trägers zur Bereitstellung mindestens einer funktionellen Gruppe, die eine chemische Bindung ausbilden kann, und Umsetzung des Immunogens und des modifizierten Trägers zur Ausbildung des Komplexes;
d) chemische Modifizierung des Immunogens und des Trägers zur Bereitstellung funktioneller Gruppen, die eine chemische Bindung ausbilden können, und Umsetzung des modifizierten Immunogens und des modifizierten Trägers unter Ausbildung des Komplexes;
e) Umsetzung des Immunogens mit mindestens einem Verknüpfungsmittel und Umsetzung des Verknüpfungsimmunogens und des Trägermoleküls unter Ausbildung des Komplexes;
f) Umsetzung des Trägers mit mindestens einem Verknüpfungsmittel und Umsetzung des Immunogens und des Verknüpfungsträgers unter Ausbildung des Komplexes;
g) Umsetzung des Immunogens und des Trägers mit mindestens einem Verknüpfungsmittel und Umsetzung des Verknüpfungsimmunogens und des Verknüpfungsträgers unter Ausbildung des Komplexes.
Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung ist gekennzeichnet durch
i) chemische Modifizierung des Immunogens zur Bereitstellung mindestens einer funktionellen Gruppe, die eine chemische Bindung ausbilden kann, und
ii) Umsetzung des modifizierten Immunogens und des Trägers unter Ausbildung des Komplexes.
Das Verknüpfungsmittel kann eine Disulfidbindung enthalten oder mittels Säure, Base oder Periodat spaltbar sein. Beispiele für derartige Verknüpfungsmittel schliefen N-(4-Azidophenylthio)phthalimid, 4,4'-Dithiobisphenylazid, Dithiobis-(succinimidylpropionat), Dimethyl-3,3'dithiobispropionimidat.2HC1, 3,3'-Dithiobis-(sulfosuccinimidylpropionat), Ethyl-4-azidophenyl-1,4-dithiobutyrimidat. HC1, N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)-1,3'-dithiopropionat, Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3'- dithiopropionat, Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'dithiopropionate, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat, Sulfosuccinimidyl-(4-azidophenyldithio)-propionat und 2-Iminothiolan ein. Bevorzugte Vernetzungsmittel sind Disuccinimidyltartrat und bis-[2-(Succinimidyloxycarbonyloxy)-ethyl]-sulfon.
In geeigneter Weise kann das Verknüpfen des Trägers und des Immunogens erreicht werden, indem man den Träger an geeignete Gruppen des Immunogens koppelt.
Wenn der Immunogen/Träger-Komplex durch chemische Konjugation gebildet wird, z. B. durch Verwendung entweder eines geeigneten Konjugationsmittels oder eines Verknüpfungsmittels, schliefen bevorzugte Konjugations- oder Verknüpfungsmittel 1-Ethyl-3-(-3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid, Glutaraldehyd, m-Maleimido-benzoesäure-n-hydrohxysuccinimidester oder N, N&sub1;-Dicyclohexylcarbodiimid ein.
Die Verknüpfung zwischen dem Immunogen und dem Trägermolekül kann weiterhin durch die Herstellung eines Hybrideproteinmoleküls erreicht werden, wie es z. B. mittels rekombinanter DNA-Techniken durch Insertion in die (oder Zugabe zu der) für den Träger kodierenden DNA-Sequenz von für das Immunogen kodierender DNA gebildet wird.
Somit ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung des genannten Komplexes eines Trägermoleküls mit einem Immunogen gerichtet, wobei das Verfahren die Herstellung eines Hybridproteinmoleküls umfaßt. In einem bevorzugten Verfahren wird das Hybridproteinmolekül mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt, und zwar durch Insertion in die (oder Zugabe zu der) für den Träger kodierenden DNA-Sequenz von für das Immunogen kodierender DNA.
Die Erfindung ist weiterhin auf eine hybride DNA-Sequenz gerichtet, die aus folgendem besteht:
Eine erste DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfaßt, welche als Kodierungssequenz für mindestens einen Teil eines integralen Membranproteins prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs wirkt, gekoppelt an eine DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz eines Immunogens kodiert, oder eine zweite DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA-Sequenz hybridisiert, unabhängig von ihrem Ursprung, der natürliche, synthetische oder halbsynthetische Quellen einschließt; eine mit einer Mutation in Verbindung stehende DNA-Sequenz einschließlich einfacher oder mehrfacher Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen bei der genannten ersten DNA-Sequenz, oder eine DNA-Sequenz, die Sequenzen von Codons umfaßt, die bei der Expression für ein Polypeptid kodieren, das ähnliche immunologische oder biologische Wirkungen zeigt wie ein Polypeptid, das bei der Expression der Codons einer jeden der obigen Hybrid-DNA-Sequenzen und Insertionen kodiert wird.
Bevorzugte Hybrid-DNA-Sequenzen der Erfindung kodieren für mindestens einen Teil von TraT, OmpF oder OmpA, gekoppelt an eine DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz eines Immunogens kodiert, so daß die erhaltenen TraT-(OmpF oder OmpA)-Hybridproteine nach außen transportiert und auf der Zelloberfläche des Wirtes exponiert werden.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein fusioniertes Gen gerichtet, das eine Hybrid-DNA-Sequenz der Erfindung, verknüpft mit einem transportfähigen Promoter, umfaßt. Ein bevorzugter Promoter der Erfindung ist der PL-Promoter des Bacteriophagen lambda.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine hybride DNA-Sequenz gemäß der Erfindung und eine Vektor-DNA umfaßt, wobei die Vektor-DNA eine Plasmid-, Bacteriophagen-, Virus- oder Cosmid-DNA ist.
Ein bevorzugtes rekombinantes DNA-Molekül der Erfindung schließt eine Expressionskontrollsequenz ein, die operativ mit der Hybrid-DNA-Sequenz verknüpft ist.
Besonders bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle gemäß der Erfindung schliefen pBTA371, pBTA439, pBTA449, pBTA450 und pBTA586 ein.
Innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das folgendes umfaßt:
Einführung einer Hybrid-DNA-Sequenz gemäß der Erfindung in ein Klonierungsvehikel.
Bevorzugt schließt das Verfahren weiterhin die Stufe des Einführens einer Expressionskontrollsequenz in das Klonierungsvehikel ein.
Die Erfindung ist weiterhin auf einen Wirt gerichtet, der mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung transformiert ist.
Geeignete Wirte schliefen E. coli und Salmonella sp. ein.
Ein bevorzugter Transformant ist ATCC 67331 (auch als CCTCC 87026 bezeichnet).
Weiterhin eingeschlossen in der Erfindung ist ein Verfahren zur Transformation eines Wirtes, das den folgenden Schritt umfaßt:
Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls der Erfindung in einen Wirt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf einen Komplex eines Trägers mit einem Immunogen, zugerichtet für die parenterale Injektion bei einem Wirt oder zugerichtet für die orale oder enterale Verabreichung, gerichtet, um eine humorale und mucosale Antikörperreaktion zu verursachen.
Eingeschlossen in den Umfang der Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung eines Komplexes eines Trägers mit einem Immunogen in einer für die parenterale, enterale oder orale Verabreichung an einen Wirt geeigneten Form, wobei das Verfahren die Herstellung des Komplexes umfaßt sowie dessen Zugabe zu einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.
Bevorzugt ist die Erfindung auf eine bakterielle Ganzzellvakzine gerichtet, die ein Hybridprotein gemäß der Erfindung umfaßt das auf der bakteriellen Zelloberfläche zur Darbietung an das Immunsystem exponiert ist. Die Ganzzellvakzine kann eine Lebend- oder Tot-Ganzzellvakzine zur oralen Verabreichung sein. Alternativ kann das Hybridprotein von der Zellmembran oder den Zellbestandteilen gereinigt werden und als Untere inheit-Vakzine parenteral, enteral oder oral verabreicht werden.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren für die Herstellung eines Mikroorganismus mit der genetischen Information für die Biosynthese eines Hybridproteins gerichtet, wobei das Hybridprotein mindestens ein Immunogen und einen Träger umfaßt, welcher seinerseits mindestens einen Teil eines IMP prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs umfaßt, so daß das erhaltene Hybridpeptid auf der Zelloberfläche des Wirtes exponiert wird, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, gemäß dem ein Mikroorganismus, der die erforderliche genetische Information trägt, kultiviert wird. Wenn der Mikroorganismus zur Herstellung einer Untereinheit-Vakzine verwendet wird, umfaßt das Verfahren weiterhin die Reinigung des Hybridpeptids von der Zellmembran oder zellulären Bestandteilen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: Modifikation der Immunreaktion durch Adjuvantien.
Kaninchen wurden i. m. mit TraT (Fig. 1a) und BSA (Fig. 1b) allein oder in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien injiziert. TraT und BSA wurden mit F.I.A. ( - ); Montanid 888 ( - ), Alhydrogel ( - ), Kochsalz (x-x), Fig. 1a + 1b, vermischt. Ein Vergleich der auf TraT (x-x), OmpA ( - ) und OmpF ( - ), injiziert in Kochsalz, erzeugten Antikörperreaktion in der Fig. 1c wiedergegeben.
Fig. 2: Stimulation der Antikörperreaktion auf DNP und BSA durch Kopplung an TraT und OmpA.
Dinitrophenylierte Zubereitungen von TraT (+-+), Omp A (X-X) und BSA ( - ) wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Stimulation von Antiträger- (Fig. 2a) und Antikörper-DNP-Antikörperreaktionen (Fig. 2b) nach einer i. m. Injektion verglichen. Die Antikörperreaktion auf TraT ( - ) und Omp A ( - ) bei alleiniger Injektion wurde ebenfalls bestimmt. In ähnlicher Weise wurde BSA in Kochsalz ( - ), vermischt mit FIA ( - ) oder kovalent konjugiert mit TraT ( - ) oder Omp A ( - ) injiziert und die anti-BSA-Reaktion bestimmt (Fig. 2c). Die anti-TraT- und anti-Omp A-Reaktionen auf die Konjugate sind in Fig. 2a gezeigt. Die Immunopotenzierungsaktivität von IMPS wurde untersucht, wenn BSA kovalent verknüpft an TraT ( - ) oder Omp A ( - ), bei Vermischung mit TraT ( - ) oder Omp A ( - ) oder bei der Injektion an einem getrennten Ort von TraT ( - ) oder Omp A ( - ) (Fig. 2d) injiziert wurde.
Fig. 3a zeigt die Konstruktion der Plasmide und von pBTA449, pBTA439 und pBTA371.
Fig. 3b zeigt einen SDS-PAGE und einen Western für die Expression von TraT und das TraT-VP7-Fusionsprotein.
Fig. 3c zeigt eine Autoradiographie von an der Zelloberfläche markierten, TraT exprimierenden E. coli (Spur 1), TraT-VP7 (Spur 3) und Vergleich (Spur 2). Zellen wurden mit ¹²5J und Lactoperoxidase markiert.
Fig. 4a zeigt die Konstruktion der Plasmide pBTA450 und pBTA586.
Fig. 4b zeigt das SDS-Polyacrylamidgel eines TraT-Minactivin-Hybridproteins (TraTMIN), exprimiert von pBTA586.
Abkürzungen (Fig. 3 und 4): Resistenz gegen: Ampicillin Apr, Chloramphenicol cmr; Quecksilberchlorid Hg&spplus;, Tetracyclin Tc; VP7 Strukturgen VP7; TraT-Strukturgen TraT, TraT-VP7-Genfusion TraT-VP7; lambda-Bacteriophage-PL-Promoterregion PL. Restrictionsendonucleasen Al AluI; A AvaI; D DraI; B BamHI; E EcoRI; N NdeI; Pv PvuII; RV EcoRV; Ss Ssp1.
Bevorzugte Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und beschränken in keinerlei Hinsicht ihren Umfang.

Beispiel 1

Isolierung von TraT, OmpA und OmpF.

E. coli (Stamm BTA 1352, enthaltend das Plasmid pBTA439) wurden in einem Fermenter bei 30ºC in MEB-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden nach 2 Stunden einer Wärmeinduktion von TraT bei 42ºC geerntet. Die Bakterien wurden auf 2 l unter Verwendung einer 0,1 u Hohlfaserpatrone in einem Amicon-DCIOLA- Konzentrator konzentriert. Die Zellen wurden anschließend mit 10 l destilliertem Wasser gewaschen und auf 800 ml rekonzentriert. Die bakterielle Aufschlämmung wurde anschließend von dem Konzentrat entfernt und die äußeren Membranproteine (TraT, OmpA und OmpF) wurden aus den Zellen extrahiert, und zwar unter Zugabe von 200 ml IM Natriumacetat-Puffer, pH 2,5, gefolgt von 1 l 10% Cetrimide (Sigma) in 40% ETOH plus 1M CaCl&sub2;. Man lieb die Extraktion über Nacht bei Umgebungstemperatur (RT) fortschreiten, wonach die Bakterien durch Zentrifugieren (17000 xg, 20 min) entfernt wurden.
TraT und OmpF wurden aus dem Überstand durch Zugabe von Ethanol auf 50% und Zentrifugieren (40000 xg, 10 min) ausgefällt. OmpA wurde anschließend aus dem letzten Überstand durch Zugabe von Ethanol auf 80% ausgefällt.

Ionenaustausch-Chromatographie

Das 50%-Ethanolpellet, enthaltend OmpF und TraT, wurde in 20 mM Na-Acetatpuffer, pH 5,0, enthaltend 0,5% Zwittergent, resuspendiert und auf eine 5·50 cm Kolonne mit DEAE-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals), zuvor äquilibriert mit 20 mM Na-Acetatpuffer, pH 5,0, enthaltend 0,1% Zwittergent, geladen. TraT fand sich in dem Kolonnendurchfluß, und gebundenes OmpF wurde von der Kolonne unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-1,0 M NaCl in einem Äquilibierungspuffer eluiert. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und zwar unter Verwendung einer Modifikation der Methode von Laemmli (Laemmli, U. K. NATURE (LOND) 227 : 680, 1970; Salit et al., J. Exp. Med. 151 : 716, 1980), und isoliertes TraT oder OmpF enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und durch Ethanol-Ausfällung konzentriert.

Sephacryl S-300-Chromatographie

Das 80%-Ethanolpellet, enthaltend OmpA, wurde in 1% SDS in 20 mM Tris. HCl, pH 8,8, resuspendiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, durch SDS-PAGE analysiert und Fraktionen, die OmpA enthielten, wurden gepoolt und durch Ethanolausfällungen konzentriert.
Mittels der obigen Methoden gereinigte Proteine erwiesen sich als frei von LPS bei der Untersuchung mit SDS-PAGE sowie beim Anfärben mit Silber durch das Verfahren gemäß Tsai C.M. und Frasch, C.E. Anal. Biochem 119 : 115 (1982).

Dinitrophenylierung von Trägern

TraT, OmpA und OmpF wurden gemäß dem Verfahren von Little und Eisen, "Mehtods in Immunology and Immunochemistry" (E.D. Williams, CA und Chase, M.W.) 1, 5.128 Academic Press, N.Y. (1967) dinitrophenyliert. Kurz gesagt wurden die Träger (in 0,1M Carb/bicarb-Puffer, pH 9,5) mit einer 0,1M Lösung von DNFB (in Aceton) über Nacht bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Die Proteine wurden anschließend extensiv gegen den Kopplungspuffer dialysiert.

Kopplung mit Glutaraldehyd

Rinder-Serumalbumin (BSA) (von Sigma Chemical Co. St. Louis, Miss.) wurde an TraT, OmpA und OmpF gekoppelt, und zwar unter Verwendung des zweistufigen Glutaraldehyd-Verfahrens von Avrameus et al. (1978). Kurz gesagt wurde BSA mit 0,2% Glu taraldehyd 2 Stunden bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Das Protein wurde anschließend über Nacht dialysiert und zwar gegen Carb/bicarb-Puffer, pH 9,5, gefolgt von der Zugabe von Omp's bei einem Molverhältnis von 1 : 1 BSA:omp, und 24 Stunden bei Umgebungstemperatur umgesetzt. Schließlich wurde Ethanolamin (Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 0,1M zugesetzt (1 h, Umgebungstemperatur), gefolgt von einer Dialyse über Nacht bei 4C gegen 0,1M Carb/bicarb-Puffer, pH 9,5.

Antigenverabreichung

1. Kaninchen

Weißen Neuseeland-Kaninchen (2 bis 2,5 kg) wurde das Antigen intramuskulär in 0,5 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung injiziert.
Die Injektionen wurden an den Tagen 0 und 36 durchgeführt. Wöchentliche Blutentnahmen wurden von der longitudinalen Vene im Kaninchenohr erhalten, und Antikörpertiter wurden mittels eines Standard-ELISA bestimmt, und zwar unter Verwendung von TraT, OmpA, BSA oder DNP-Schaf-IgG als Beschichtungsantigene.

2. Mäuse

Weibliche C57BL/6J-Mäuse (18 - 22g) wurden von dem Animal Resources Centre, Perth, Westaustralien, erhalten. Sämtliche Mäuse wurden drei bis vier Stunden vor der oralen oder intramuskulären (i. m.) Verabreichung der Antigene nüchtern gehalten. Die Mäuse wurden mit Antigen bei geeigneten Konzentrationen in 0,5 ml 0.1M Carb/bicarbonat-Puffer, pH 9,5, unter Verwendung einer speziell vorbereiteten Fütterungskanüle verabreicht. Parallele Dosen von Antigen wurden i. m. in 0,1 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung in das linke Hinterbein injiziert. Gruppen von 5 Mäusen, die Antigen entweder oral oder i. m. erhielten, erhielten identische Dosierungen des Antigens am Tag 0 und am Tag 14. Eine Blutprobe (ca. 0,5 ml) wurde von dem retro-orbitalen Plexus am Tag 14 und am Tag 21 entnommen. Die Mäuse wurden anschließend mittels zervikaler Dislokation getötet und an dem Dünndarm wurde in der folgenden Weise eine Darmspülung durchgeführt. Der Dünndarm wurde sorgfältig entfernt und eine kleine Menge von Waschpuffer (1,0 l, 30 mM Tris.HCl, pH 8,8, 0,9% NaCl, 50 mM EDTA plus 1,0% Tween 20) wurde in das Lumen des Darms über eine Zufuhrkanüle mit stumpfem Ende eingeführt. Nach vorsichtigem Kneten des Darms wurde der Inhalt zwischen Zeigefinger und Daumen ausgedrückt. Die so erhaltenen Darmspülungen wurden augenblicklich zur Entfernung von Verunreinigungen zentrifugiert und bei -20ºC bis zur Prüfung gelagert. Blutproben lieb man bei 4ºC gerinnen, bevor das Serum entfernt wurde und die Lagerung bei -20ºC erfolgte.

Enzymbezogener Immunosorptionsassay (ELISA)

Der ELISA für die Bestimmung von Antikörpertitern wurde wie von Russell-Jones et al., J. Exp. Med. 160 : 1467 (1984) beschrieben durchgeführt. Die Titer wurden als der Reziprokwert der Antiserumverdünnung ausgedrückt; dies ergab eine ELISA-Ablesung von 0,5 nach 45 min bei 37ºC.

Beispiel 2

Wirkung des Adjuvans auf die Antikörperreaktion gegenüber integralen Membranproteinen.
Das Potential von IMP's zur Wirkung als selbstadjuvierende Moleküle bei der i. m. -Injektion wurde untersucht. Der Antikörpertiter, gebildet wenn TraT, Fig. (1a, x-x) oder BSA, Fig. (1b x-x) allein injiziert wurden, wurde mit demjenigen verglichen, der erhalten wurde, wenn TraT (Fig. 1a) oder BSA (Fig. 1b) mit einer Anzahl von Adjuvantien vermischt wurden.
Die intramuskuläre Verabreichung von TraT in Kochsalz führte rasch zu hohen Titern von Serumantikörpern auf das immunisierende Mittel (Fig. 1a). Tatsächlich konnten die mit TraT in Kochsalz erzeugten Titer lediglich um einen Faktor von 4 - 8 durch Injektion dieses Antigens in Adjuvantien wie Montanid oder FIA gesteigert werden (Fig. 1a). Dies steht im direkten Widerspruch zu der von dem löslichen Antigen BSA erzeugten Reaktion. In diesem Falle wurde eine schlechte Antikörperreaktion auf die in Kochsalz verabreichten Antigene erzeugt, die jedoch merklich um das 60-100fache durch Injektionen des Antigens in FIA oder Montanid gesteigert wurde.
Ähnliche Injektionen von OmpA und OmpF in Kochsalz allein führten ebenfalls zu hohen Serum-Ab-Titern. In der Tat wurden überraschend ähnliche Antikörpertiter durch Injektion von 100 ug TraT, OmpA oder OmpF (Fig. 1c) erzeugt.

Beispiel 3

Untersuchung der adjuvierenden Fähigkeit von Immunogen- IMP-Komplexen
TraT und OmpA wurden bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, anti-Hapten (DNP)- und anti-Protein (BSA)-Reaktionen zu verstärken. Die zwei IMP's wurden mit DNP unter Verwendung von Dinitrofluorbenzol (vgl. Beispiel 1) substituiert oder wurden Glutaraldehyd-vernetzt an BSA (vgl. Beispiel 1) und anschließend i. m. injiziert.
Die Kopplung von DNP oder BSA an entweder TraT oder OmpA hatte geringen Einfluß auf die Erzeugung einer anti-IMP-Reaktion (Fig. 2a, cf. 1c). Die Dinitrophenylierung der IMP's steigerte jedoch die anti-DNP-Reaktion um das etwa 4-16fache gegenüber der DNP-BSA beobachtete Reaktion, wenn diese in Kochsalz injiziert wurden (Fig. 2b). In ähnlicher Weise wurde die anti-BSA-Reaktion im großen Umfang verstärkt, wenn BSA in FIA (Fig. 2c) verabreicht wurde. Der immunopotenzialisierende Effekt von TraT oder OmpA auf die anti-BSA-Reaktion war am größten, wenn BSA kovalent an die IMP's gekoppelt wurde. In der Tat erniedrigte die Injektion von BSA an einem getrennten Ort von dem IMP die Sekundärreaktion auf BSA (cf. 2d und 2c).

Beispiel 4

Wirkung der Dosierung auf die Immunreaktion auf TraT.
Die Wirkung einer gesteigerten Dosierung von TraT, verabreicht entweder i. m. oder per os, wurde an Mäusen untersucht.
Gruppen von 5 Mäusen wurde durch intramuskuläre Injektion oder durch orale Zufuhr mit steigenden Dosierungen von TraT immunosiert. Die Mäuse erhielten Dosierungen am Tag 0 und Tag 14. Am Tag 21 wurde den Mäusen Blut entnommen, sie wurden getötet und es wurden Darmspülungen hergestellt. Die Antikörpertiter wurden durch ELISA erhoben.
Wie der Tabelle 1 entnommen werden kann, führten gesteigerte Dosierungen von oral oder parenteral verabreichtem TraT zu einer dosisabhängigen Zunahme einer Serum-anti-TraT-Ab-Reaktion.
Die parenterale Verabreichung war jedoch wesentlich wirksamer als die orale Verabreichung. Tabelle 1 Verabreichungsweg Antigendosis i. m. Serum IgG per os Darm

Beispiel 5

Untersuchung der Haptendichte auf die Fähigkeit der Imp's zur Wirkung als Träger für eine anti-DNP-Reaktion.
TraT, OmpA und OmpF wurden mit verschiedenen Verhältnissen von DNP:Imp wie in Beispiel 1 beschrieben substituiert. Gruppen von 5 Mäusen wurden i. m. mit 50 ug-Dosen des DNP:Träger- Komplexes an den Tagen 0 und 14 injiziert. Am Tag 21 wurde den Mäusen Blut entnommen, und die Ab-Titer wurden durch ELISA bestimmt.
Die Vergrößerung des Substitutionsverhältnisses von DNP zum Träger von 0,5 : 1 auf 4 : 1 steigerte erheblich die anti-Hapten- Reaktion. Substitutionen von mehr als 10 : 1 schienen die anti-Hapten-Reaktion zu verringern. Tabelle 2 Antigen Substitution Weg Antikörperreaktion (Serum-IgG)

Beispiel 6

Erzeugen einer anti-CSP-Reaktion durch Kopplung an TraT.
Ein synthetisches Peptid, abgeleitet von dem Circumsporozoit- Protein (CSP)-Antigen von P. falciparum, mit der folgenden Sequenz: NH&sub2; Cys (Asn Pro Asn Ala)&sub4; wurde synthetisiert und zur Konjugation an TraT verwendet, um den adjuvierenden Effekt von TraT auf das Peptidantigen zu untersuchen.
Das CSP-Antigen wurde an TraT gekoppelt, und zwar unter Verwendung von entweder Glutaraldehyd oder Maleimidobenzoesäure-n-hydroxysuccinimidester (MBS). Auf diesem Wege hergestellte Konjugate wurden a) Kaninchen am Tag 0, Tag 28 injiziert, denen dann anschließend am Tag 38 Blut entnommen wurde, oder b) Gruppen von 5 Mäusen am Tag 0 und 14. Den Mäusen wurde am Tag 21 Blut entnommen. Die Antikörpertiter wurden wie weiter oben beschrieben bestimmt.
Die Immunisierung von Kaninchen der Mäusen mit dem CSP-Antigen, gekoppelt an TraT unter Verwendung von entweder Glutaraldehyd oder MBS, führt zu der Stimulierung einer anti-CSP-Reaktion, die vergleichbar war mit derjenigen, die beobachtet wurde, wenn das Antigen an BSA gekoppelt und in Montanid injiziert wurde. Tabelle 3 Antigen (Serum) Kopplungsmethode Tier Dosis Antikörperreaktion anti-TraT anti-CSP CSP-Trat Glutaraldehyd Kaninch. CSP-Montanid CSP-BSA+Montanid Maus

Beispiel 7

Genetische Konstruktion eines TraT-Immunogen-Proteinkomplexes.
Das für das TraT-Protein kodierende Gen befindet sich auf dem R-Plasmid R100 (oder R6-5), und die Nucleotidsequenz dieses Gens wurde bestimmt (Ogata et al., J. Bacteriol 151 : 819-827). TraT ist ein oligomeres Lipoprotein, das in der äußeren Membran vorkommt, das gleichzeitig auf der Zelloberfläche exponiert und mit Peptidoglykan, einer internen Struktur, assoziiert ist. Unter Verwendung dieser Tatsachen wurde ein Plasmidvector konstruiert (Fig. 3a), und zwar durch anfängliches Klonieren eines 6,0 kb EcoRI-Fragmentes des R100-Plasmids, das TraT enthält, in das Vielkopien-Plasmid pBR329. Die weitere Deletion eines unerwünschten 3 kb BamHI-Fragmentes und die Inaktivierung durch Insertion eines kleinen, stumpfendigen HaeIII-Fragmentes von M13mp8 an einen EcoRV-Ort ergab pBTA449. Dieses Vectorplasmid enthält den natürlichen TraT-Promoter, der die Synthese von TraT dirigiert. Die Expression von TraT (oder der anschließend konstruierten TraT-Hybridproteine) kann durch den Ersatz des schwachen, natürlichen TraT-Promoters durch den starken PL-Promoter des Bacteriophagen Lambda (z. B. im Plasmid pBTA439, Fig. 3a, oder pBTA586, Fig. 4a), geboosted werden. Das TraT-Gen enthält einen EcoRV-Ort (einzigartig für pBTA449), wo Fremd-DNA-sequenzen so insertiert werden können, daß Fusionen zwischen TraT und dem kodierten Fremdprotein korrekt an die Zelloberfläche transportiert werden und zu einer Exposition des Fremdproteinsegmentes an der Zelloberfläche führten.
In einem Beispiel wurde das Gen für ein virales Capsidprotein (VP7) zur Bildung von TraT-VP7-Hybridproteinen verwendet. VP7 ist ein strukturelles Protein eines Rotavirus, und gegen das gereinigtes VP7-Protein gebildete Antikörper neutralisieren wirksam die virale Infektivität in einer Zellkultur (Dyall- Smith et al., 1985, in Infectious Diarrhoea in the young, Hrsg. S.Tzipori). Somit ist das VP7-Protein in einer geeignet exprimierten Form der erste Kandidat für den Einbau in eine Rotavirusvakzine.
Eine AluI-PvuII-Restriktionsfragment des Rotavirus NCDV VP7-Gens wurde in den EcoRV-Ort des Plasmids pBTA449 kloniert und anschließend mit dem PL-Promoter (pBTA371, Fig. 3a) überexprimiert. Für die Expression wurde das Plasmid pBTA371 verwendet, um den E. coli K-12-Stamm N4830 (Joyce et al., PNAS 80, 1830-1834, 1983) zu transformieren, der den thermolabilen cI-Repressor von Lambda enthält. Mit pBTA371 transformierte Zellen wurden über Nacht in einem MEB-Medium (Mott et al., PNAS 82, 88-92, 1985) mit 100 ug/ml Ampicillin bei 30ºC gezüchtet. Die Zellen wurden in MEB-Medium verdünnt und bei 30ºC bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 gezüchtet, wonach vorgewärmtes (650) MEB-Medium in gleichem Volumen zugesetzt wurde, um die Temperatur auf 42ºC zu äquilibrieren. Nach vierstündigem Züchten bei 42ºC wurden die Zellen gesammelt und bezüglich der Induktion des Tra-VP7-Hybridproteins untersucht. In E.coli N4830 wurde eine Expression auf hohem Niveau des TraT-VP7-Proteinkomplexes (10-15% Gesamtzellprotein oder mehr als 500.000 Kopien pro Zelle) beobachtet. Ein erheblicher Anteil dieses Komplexes war in der äußeren Membranfraktion vorhanden (Fig. 3b, 3c).
In einem weiteren Beispiel folgt ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das ein Hybrid eines Teils der Kodierungssequenz des TraT-Proteins oder der Gesamtheit oder eines Teils einer Kodierungssequenz eines eukaryotischen Proteins, Minactivin, ist.
Wie in Fig. 4a gezeigt, wurde das Plasmid pBTA440 mit SspI und DraI verdaut, und es wurde ein 1110bp-Fragment aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde an den Vektor pBTA449, verdaut mit EcoRV, ligiert, wobei pBTA450 entstand. pBTA450 wurde anschließend mit Aval verdaut, und ein gereinigtes 2800 bp-Fragment wurde an das Plasmid pLK57, verdaut mit Aval, ligiert, wobei das Plasmid pBTA586 erzeugt wurde. Dies stellt einen Teil der Minactivin-Kodierungssequenz unter die Kontrolle des lambda-PLPromoters und fusioniert die Kodierungssequenz mit den ersten achtzig Aminosäuren des TraT-Gens, bei dem die ersten zwanzig eine Signalsequenz bilden, die in dem in der äußeren Membran von E.coli erscheinenden Hybrid auftritt. Diese Signalsequenz wird während des Transports an die äußere Membran abgespalten, in der sich das TraT-Protein normalerweise befindet.
Wenn das Plasmid pBTA586 in einen geeigneten Wirt, z. B. N4830, transformiert und mit einem Temperaturshift wie oben beschrieben induziert wird, erscheint das TraT-Minactivin-Hybridprotein in der äußeren Membranfraktion, wie sich aus Fig. 4b ergibt.

Beispiel 8

Orale Zufuhr von TraT in der äußeren Membran exprimierenden Stämmen.
Weibliche C57B1/65-Mäuse (20-25 g) wurden mit 10)-10¹&sup0;-Bakterien (E.coli oder ein galE&supmin;-Mutant von S. typhimurium) gefüttert, die TraT in ihren äußeren Membranen exprimieren. Kontrolltiere erhielten die gleichen Stämme ohne das TraT-Protein. Nach einer Woche wurde den Mäusen Blut entnommen, und die anti-TraT-Titer wurden wie oben erwähnt bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 als reziproke Antikörpertiter wiedergegeben und zeigen einen Durchschnitt von 10 Mäusen. Tabelle 4 Antikörperreaktion auf oral verabreichte Ganzbakterien-anti-TraT Stamm Anti-TraT TraT Serum Darm Anti OmpA E.coli Salmonella

Gewerbliche Verwertbarkeit

Die vorliegende Erfindung ist nützlich bei der Herstellung von Impfstoffen zur Verwendung bei Menschen, Haustieren und Fleischtieren, und allgemein für die Potenzierung der Reaktion auf ein Antigen bei oraler, enteraler oder parenteraler Verabreichung.

Claims

1. Komplex, enthaltend ein an ein Trägermolekül gekoppeltes Immunogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermolekül die Immunreaktion eines Wirtes auf das Immunogen verstärkt, wenn der Komplex dem Wirt verabreicht wird, unabhängig davon, ob der Komplex parenteral, enteral oder oral verabreicht wird, und die Verstärkung nicht wesentlich durch die Zugabe eines Adjuvans zu dem Komplex gesteigert wird, wenn der Komplex dem Wirt verabreicht wird, wobei das Immunogen entweder ein Antigen oder ein Hapten umfaßt und das Trägermolekül das TraT-Protein, das äußere Membranprotein OmpA oder das äußere Membranprotein OmpF, gebildet von E.coli-Stämmen, vollständig oder teilweise enthält.

2. Komplex, enthaltend ein an ein Trägermolekül gekoppeltes Immunogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermolekül die Immunreaktion eines Wirtes auf das Immunogen verstärkt, wenn der Komplex dem Wirt verabreicht wird, unabhängig davon, ob der Komplex parenteral, enteral oder oral verabreicht wird, und die Verstärkung nicht wesentlich durch die Zugabe eines Adjuvans zu dem Komplex gesteigert wird, wenn der Komplex dem Wirt verabreicht wird, wobei das Immunogen entweder ein Antigen oder ein Hapten umfaßt und das Trägermolekül das TraT-Protein, das äußere Membranprotein OmpA oder das äußere Membranprotein OmpF, gebildet von Salmonella-Stämmen, vollständig oder teilweise enthält.

3. Komplex nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem das Trägermolekül das Protein TraT ist.

4. Komplex gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Immunogen CSP, das virale Capsidprotein VP7 aus einem Rotavirus oder das gesamte Minactivin oder einen Teil desselben enthält.

5. Komplex nach Anspruch 4, bei dem das Immunogen CSP ist.

6. Komplex gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Kupplung des Trägers an das Immunogen durch chemische Mittel erfolgt.

7. Komplex nach Anspruch 6, bei dem das Ankoppeln durch chemische Konjugation erfolgt, welche die Verwendung eines Konjugations- oder Verknüpfungsmittels umfaßt.

8. Komplex nach Anspruch 7, bei dem das Konjugations- oder Verknüpfungsmittel 1-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid, Glutaraldehyd, m-Maleimido-benzoesäure-nhydroxysuccinimidester oder N,N&sub1;-Dicyclohexylcarbodiimid ist.

9. Komplex nach Anspruch 7, bei dem das Verknüpfungsmittel eine Disulfidbrücke enthält oder mittels Säuren, Basen oder Perjodat spaltbar ist.

10. Komplex nach Anspruch 9, bei dem das Verknüpfungsmittel aus N-(4-Azidophenylthio)phthalimid, 4,4'-Dithiobisphenylazid, Dithiobis-(succinimidylpropionat), Dimethyl-3,3'dithiobis-propionimidat. 2HC1, 3,3'-Dithiobis-(sulfosuccinimidyl-propionat), Ethyl-4-azidophenyl-1,4-dithiobutyrimidat. HC1, N-Succinimidyl-(4-azidophenyl)- 1,3'-dithiopropionat, Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-onitrobenzamido)-ethyl-1,3'-dithiopropionat, Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)-ethyl-1,3'dithiopropionate, N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Sulfosuccinimidyl-(4-azidophenyldithio)-propionat 2-Iminothiolandisuccinimidyl-tartrat und bis-[2- Succinimidyloxycarbonyloxy)-ethyl]-sulfon, ausgewählt ist.

11. Komplex nach Anspruch 10, bei dem das Verknüpfungsmittel 2-Iminothiolandisuccinimidyl-tartrat oder bis-[2- (Succinimidyloxycarbonyloxy)-ethyl]sulfon ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die Verknüpfung des Trägermoleküls mit dem Immunogen durch chemische Mittel umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das einen der folgenden Schritte oder mehrere umfaßt:

a) Umsetzung des Immunogens mit dem Träger unter Bildung des Komplexes;

b) chemische Modifizierung des Immunogens zur Bereitstellung mindestens einer funktionellen Gruppe, die eine chemische Bindung ausbilden kann, und Umsetzung des modifizierten Immunogens und des Trägers unter Bildung des Komplexes;

c) chemische Modifizierung des Trägers zur Bereitstellung mindestens einer funktionellen Gruppe, die eine chemische Bindung ausbilden kann, und Umsetzung des Immunogens und des modifizierten Trägers zur Ausbildung des Komplexes;

d) chemische Modifizierung des Immunogens und des Trägers zur Bereitstellung funktioneller Gruppen, die eine chemische Bindung ausbilden können, und Umsetzung des modifizierten Immunogens und des modifizierten Trägers unter Ausbildung des Komplexes;

e) Umsetzung des Immunogens mit mindestens einem Verknüpfungsmittel und Umsetzung des Verknüpfungsimmunogens und des Trägermoleküls unter Ausbildung des Komplexes;

f) Umsetzung des Trägers mit mindestens einem Verknüpfungsmittel und Umsetzung des Immunogens und des Verknüpfungsträgers unter Ausbildung des Komplexes;

g) Umsetzung des Immunogens und des Trägers mit mindestens einem Verknüpfungsmittel und Umsetzung des Verknüpfungsimmunogens und des Verknüpfungsträgers unter Ausbildung des Komplexes.

14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch

i) chemische Modifizierung des Immunogens zur Bereitstellung mindestens einer funktionellen Gruppe, die eine chemische Bindung ausbilden kann, und

ii) Umsetzung des modifizierten Immunogens und des Trägers unter Ausbildung des Komplexes.

15. Komplex gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Verknüpfung durch genetische Bindung erfolgt.

16. Komplex nach Anspruch 15, enthaltend ein Fusionsproteinmolekül.

17. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch die Herstellung eines Fusionsproteinmoleküls mittels rekombinanter DNA-Methoden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Komplex hergestellt wird, dem eine für das Immunogen codierende DNA in das für den Träger codierende DNA-Molekül insertiert oder diesem zugesetzt wird.

19. Hybrid-DNA-Molekül mit einem ersten DNA-Molekül, welches ein für einen Komplex gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 4 codierendes DNA-Molekül umfaßt, oder mit einem zweiten DNA-Molekül, welches ein für einen Komplex mit der immunologischen Aktivität eines Komplexes gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 4 kodierendes DNA-Molekül umfaßt.

20. Hybrid-DNA-Molekül nach Anspruch 19, das für mindestens Teile von TraT, OmpF oder OmpA, verknüpft mit einem Immunogen, kodiert.

21. Hybrid-DNA-Molekül gemäß Anspruch 20, das für mindestens Teile des TraT, verknüpft mit einem Immunogen, kodiert.

22. Hybrid-DNA-Molekül nach Anspruch 20 oder 21, das für ein TraT-, OmpF- oder OmpA-Fusionsprotein kodiert, welches an die Oberfläche einer Wirtszelle exportiert und dort exponiert werden kann.

23. Fusioniertes Gen mit einem Hybrid-DNA-Molekül gemäß einem jeden der Ansprüche 19 bis 22, fusioniert mit einem transportfähigen Promoter.

24. Fusioniertes Gen gemäß Anspruch 23, bei dem der Promoter der PL-Promoter des Bakteriophagen Lambda ist.

25. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein Hybrid-DNA-Molekül oder fusioniertes Gen gemäß einem jeden der Ansprüche 20 bis 24 und Vektor DNA.

26. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 25, bei dem die Vektor-DNA von Plasmiden, Bakteriophagen, Viren oder Cosmiden stammt.

27. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 26 mit einer Sequenz zur Expressionskontrolle, die operativ mit dem Hybrid-DNA-Molekül verknüpft ist.

28. Rekombinantes DNA-Molekül pBTA439, enthalten in E.coli K12 C600 lambda-Lysogen, hinterlegt bei der American Type Culture Collection unter der Zugriffsnummer ATCC 67331.

29. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß einem jeden der Ansprüche 25 bis 28, gekennzeichnet durch die Einführung eines Hybrid-DNA-Moleküls oder fusionierten Gens gemäß einem jeden der Ansprüche 19 bis 24 in Vektor-DNA.

30. Verfahren nach Anspruch 29, das weiterhin die Einführung einer Sequenz für die Expressionskontrolle in die Vektor- DNA umfaßt.

31. Transformierter Wirt mit einer Wirtszelle, die mit mindestens einem DNA-Molekül gemäß einem jeden der Ansprüche 25 bis 28 transformiert ist.

32. Transformierter Wirt gemäß Anspruch 31, wobei der Wirt E.coli oder eine Salmonella-Art ist.

34. Verfahren für die Transformation eines Wirts, gekennzeichnet durch die Einführung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß einem jeden der Ansprüche 25 bis 28 in einen Wirt.

35. Ganzzellige bakterielle Vakzine mit einem Fusionsprotein nach Anspruch 16, exponiert auf der bakteriellen Zelloberfläche zur Präsentation für das Immunsystem.

36. Ganzzellige Vakzine gemäß Anspruch 35 in Form einer ganzzelligen oralen Lebend- oder Totvakzine.

37. Vakzine mit einem Fusionsprotein gemäß Anspruch 16, gereinigt von der Zellmembran oder zellulären Bestandteilen.

38. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus mit der genetischen Information für die Biosynthese eines Fusionsproteins gemäß Anspruch 16, so daß das erhaltene Fusionsprotein auf der Oberfläche der Wirtszelle exponiert wird, gekennzeichnet durch die Züchtung eines die notwendige genetische Information tragenden Mikroorganismus.

39. Verfahren zur Herstellung einer Untereinheit-Vakzine, gekennzeichnet durch die Reinigung eines Fusionsproteins nach Anspruch 16 von der Zellmembran oder zellulären Bestandteilen eines mittels eines Verfahrens nach Anspruch 38 hergestellten Mikroorganismus.

40. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 11 in einer für die parenterale, orale oder enterale Verabreichung an einen Wirt angepaßten Form, gekennzeichnet durch die Herstellung des Komplexes und Zugabe desselben zu einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.

41. Komplex gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 11 für die parenterale, enterale oder orale Verabreichung an einen Wirt.