DE69007311T2

DE69007311T2 - Konjugate.

Info

Publication number: DE69007311T2
Application number: DE69007311T
Authority: DE
Inventors: Berwyn Ewart Clarke; Michael James Francis; David John Rowlands
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1990-02-14
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2010-02-15
Also published as: CA2009896A1; JP2858848B2; DK0385610T3; ZA901086B; JPH0327400A; AU634518B2; AU4975590A; DE69007311D1; IE64983B1; EP0385610B1; NZ232505A; IE900502L; ES2062330T3; GB8903313D0; EP0385610A1

Description

Die Erfindung betrifft Konjugate, die Polypeptide mit einer an einen Träger gebundenen antigenen Determinante umfassen, sowie deren Herstellung und deren Verwendung bei der Erzeugung von Antikörpern.
Die Ziele, die mit einem guten Impfstoff erreicht werden sollen, bestehen in der Gewährleistung eines raschen Einsetzens einer Immunität von langer Dauer und in der Gewährleistung eines immunologischen Gedächtnisses für eine anschließende Inokulation oder eine Begegnung mit dem infektiösen Agens. Das Impfstoffpräparat muß ferner leicht verabreichbar und stabil sein, minimale Nebenwirkungen besitzen und beim Empfänger einen breiten Schutz hervorrufen. Diese Ziele werden durch zahlreiche vorhandene Handelsprodukte weitgehend erreicht. Jedoch sind herkömmliche Impfstoffe auf der Basis von inaktivierten infektiösen Agentien mit Schwierigkeiten behaftet. Dazu gehören die undefinierte Natur des immunisierenden Antigens, die Frage, ob das Produkt wirklich unschädlich ist, die mit der Handhabung von großen Mengen an infektiösem Material verbundenen Gefahren und die Stabilität und Beschränkungen der Darreichungsform, die sich im allgemeinen aus Stabilitätsproblemen ergeben.
Bei einem Versuch zur Herstellung von stabileren und besser definierten Impfstoffen wurde von Wissenschaftlern die Immunantwort auf viele infektiöse Agentien näher untersucht, um die kritischen Epitope, die bei der Gewährleistung der schützenden Immunität beteiligt sind, zu identifizieren.
Aufgrund dieses Wissens ist es nunmehr möglich, derartige Epitope nachzuahmen, indem man kurze Peptide herstellt und diese als Basis für einen Impfstoff verwendet. Derartige Impfstcffe auf Peptidbasis weisen zahlreiche Vorteile auf. Sie sind chemisch definiert und unbegrenzt stabil und bei ihrer Herstellung ist kein infektiöses Material beteiligt. Ferner können sie so konstruiert werden, daß sie die geeignete Immunantwort stimulieren und die Möglichkeit bieten, neuartige Abgabesyseme einzusetzen und auf das Antigen abzuzielen. Ferner sollte vom Standpunkt dem Herstellers aus die Notwendigkeit einer großtechnischen Herstellungsanlage und einer komplizierten Nachbearbeitung des Produkts nach Möglichkeit entfallen.
Trotz dieser klaren Vorteile hat sich eine Reihe von Kritikpunkten gegen Impfstoffe auf Peptidbasis ergeben. Dazu gehören das Erfordernis nach undefinierten Trägerproteinen und die Annahme, daß die Immunogenität eines Peptid-Antigens nie an die des nativen Organismus herankommt. Es wurde allgemein angenommen, daß sich zahlreiche synthetische Peptide aufgrund ihrer relativ geringen Molekülgröße wie Haptene verhalten und die Kupplung an einen großen "fremden" Proteinträger benötigen, um ihre Immunogenität zu verstärken. Eine Immunisierung mit derartigen Konjugaten führte häufig zur Bildung von Antipeptid-Antikörpern, die bei der Erkennung des nativen Proteins oder infektiösen Agens aufgrund der Methode der Peptid/Träger-Verknüpfung vollkommen versagten. Weitere Schwierigkeiten, die bei Impfungen von besonderer Bedeutung sind und auftreten konnten, waren die Hypersensibilität gegen das "fremde" Trägerprotein und die schlechte Charge-zu-Charge-Reproduzierbarkeit der Konjugate.
In jüngerer Zeit hat man sich für die Verwendung von Hepatitis B-Kernantigen (HBcAg) als Trägerprotein interessiert. Clarke et al., Nature, Bd. 330 (1987), S. 381- 384 beschreiben ein Pusionsprotein, das aus der Hauptantigenstelle des VP1-Capsid-Proteins des Maul-und- Klauenseuchen-Virus (FMDV) besteht, das mit dem Aminoende von HBcAg fusioniert ist. Das Fusionsprotein ordnete sich selbständig zu regelmäßigen 27 nm kernähnlichen Teilchen. Diese Teilchen waren in Bezug auf FMDV fast ebenso stark immunogen wie das native Virus selbst.
EP-A-0271302 beansprucht immunogene Polypeptid-Konjtigate mit einem Gehalt an HBcAg, das operativ über einen seitenständigen Aminosäurerest mit einem Polypeptid-Immunogen verknüpft ist. Dort werden auch immunogene Fusionsproteine mit einem Gehalt an HBcAg-Protein, das operativ. über eine Peptidbindung mit einem pathogenverwandten Immunogen verknüpft ist, beansprucht. Ferner werden spezielle, T-Zellen stimulierende Polypeptide beansprucht.
Wir untersuchten die chemische Kupplung von Polypeptiden an HBcAg-Teilchen. Dabei konnten jedoch im keinem Fall zufriedensellende Ergebnisse erreicht werden. Insbesondere wurde folgendes durchgeführt:
1. Wir versuchten, das Hepatitis B-Cberflächenantigen (HBsAg) an HBcAg über Seitenketten-Aminogruppen des HBcAg durch Derivatisierung der HBcAg-Teilchen mit Succinimidyl-4-(Nmaleinimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) zu kuppeln. Es erfolgte keine oder nur eine geringe Derivatisierung der HBcAg-Teilchen.
2. Der Versuch von 1. wurde wiederholt, wobei aber m- Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) anstelle von SMCC verwendet wurde. Auch hier kam es zu keiner oder nur zu einer geringen Derivatisierung der HBcAg-Teilchen.
3. Eine Kupplung von HBsAg an HBcAg-Teilchen wurde mit Glutaraldehyd versucht. Eine Kupplung erfolgte bei einer hohen Konzentration an Glutaraldehyd. Jedoch bewirkte der Glutaraldehyd eine erhebliche Schädigung des HBsAg. Es ergab sich eine erheblich verringerte Reaktion auf HBsAg, wenn die erhaltenen Komplexe an Mäuse verabreicht wurden.
4. Wir versuchten ein Cys-haitiges FMDV-VP1 141-160-Peptid an Seitenketten-Aminogruppen des HBcAg unter Verwendung von Bis(maleinimid)-methylester (BMME) zu kuppeln. Die HBcAg- Teilchen wurden reduziert, mit BMME derivatisiert und mit dem Peptid umgesetzt. Obgleich eine Kupplung erfolgte, wurden durch das erhaltene Material nur geringe Antikörper- Reaktionen auf FMDV induziert.
Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, exprimierten wir ein Fusionsprotein aus einer kurzkettigen Lys-haltigen Sequenz, die mit dem Aminoende von HBcAg fusioniert war. Sodann kuppelten wir Peptide über die Seitenkette-Aminogruppe des Lys-Restes an dieses modifizierte HBcAg-Protein. Die Kupplung verlief erfolgreich. Die erhaltenen Konjugate führten sowohl zur Bildung von Antipeptid als auch von neutralisierendem Antikörper. Das Verfahren ist einfach, wirksam und ermöglicht die Kupplung des Peptids in einem definierten Vorgang.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Teilchen bereit, die aus HBcAg zusammengesetzt sind, das mit einer N- endständigen Erweiterung mit einem einverleibten Lys-Rest innerhalb der ersten 15 N-endständigen Aminosäurereste der Erweiterung versehen ist und an das über die Seitenketten- Aminogruppe des Lys-Restes ein Polypeptid gekuppelt ist, das ein antigenes Epitop aufweist.
Jedes beliebige Polypeptid kann an die modifizierten HBcAg- Teilchen gekuppelt werden. Jedoch muß am Polypeptid eine Gruppe, z.B. -NH&sub2; oder -SH, vorhanden sein, die mit der Seitenketten-Aminogruppe des Lys-Restes in der N-endständigen Erweiterung von HBcAg gekuppelt werden kann. Das PoLypeptid weist typischerweise ein fremdes Epitop auf, d.h. ein Epitop, bei dem es sich nicht um ein Epitop von HBcAg handelt.
Das Polypeptid kann ein antigenes Epitop umfassen, das zur Erzeugung eines neutralisierenden Antikörpers befähigt ist, beispielsweise ein Epitop eines infektiösen Agens, z.B. eines Virus, Bakteriums oder Protozoons. Es kann sich um ein Epitop eines nicht-infektiösen Agens, z.B. um ein Wachstumhormon-Fragment, handeln. Das Polypeptid kann Wiederholungen eines Epitops enthalten, beispielsweise bis zu acht oder bis zu vier Kopien eines Epitops. Zwei Kopien eines Epitops können also im Polypeptid vorhanden sein. Ein Polypeptid kann zwei oder mehr unterschiedliche Epitope enthalten, beispielsweise drei oder vier.
Als Beispiele für Viren, deren Epitope vorhanden sein können, lassen sich folgende Viren erwähnen: Hepatitis A-Virus, Hepatitis B-Virus, Grippevirus, Maul-und-Klauenseuche-Virus, Poliovirus, Herpes simplex-Virus, Tollwutvirus, Humanimmunschwäche-Virus Typ 1 (HIV-1), HIV-2, Affen- Immunschwäche-Virus (SIV), humanes Rhinovirus (HRV), Dengue-Virus und Gelbf ibervirus. Bei dem mit dem modifizierten HBcAg gekuppelten Polypeptid kann es sich somit um HBsAg oder ein Polypeptid, das die überwiegende FMDV-VP1-Antigenstelle umfaßt, handeln. Ein Protozoon, dessen Epitope bereitgestellt werden können, ist der Malaria-Parasit Plasmodium falciparum.
Ein verwendbares Peptid, dem die Haupt-FMDV-VP1-Antigenstelle einverleibt ist, umfaßt eine Sequenz, die mit einem Rest von 137 bis 142 von VP1 von FMDV beginnt und mit einem -Rest von 160 bis 162 endet, beispielsweise von beliebigen FMDV- Serotypen. Typische Sequenzen sind VPI-Reste 140 bis 162, 140 bis 160, 137 bis 162, 137 bis 160 oder 141 bis 160. Ein Polypeptid mit einem Gehalt an Tandem-Wiederholungen einer derartigen Sequenz oder gemischten Serotyp-Tandem- Wiederholungen einer derartigen Sequenz können an die modifizierten HBcAg-Teilchen gekuppelt werden.
Geeignete Peptide mit einem Gehalt an derartigen Tandem-Wiederholungen der Haupt-FMDV-VP1-Antigenstelle sind Peptide mit einem Gehalt an aufeinanderfolgenden Sequenzen, wobei jede Sequenz aus nicht mehr als 30 Aminosäureresten zusammengesetzt ist und die gleiche immunogene Sequenz umfaßt. Bei dieser immunogenen Sequenz handelt es sich um:
(i) eine Sequenz, die an einem Rest von 137 bis 145 von VP1 von FMDV-Subtyp O&sub1; beginnt oder an einem Rest von 150 bis 162 davon endet oder
(ii) eine Sequenz entsprechend den Aminosäureresten eines anderen Subtyps vom Serotyp O oder eines Subtyps eines unterschiedlichen FMDV-Serotyps.
Bei den Peptiden kann es sich daher um Tandem-Wiederholungen einer immunogenen Sequenz handeln. Eine andere Möglichkeit besteht darin, ein Peptid, das aus aufeinanderfolgenden Sequenzen zusammengesetzt ist, bereitzustellen, bei dem eine oder mehrere der Sequenzen zusätzliche Aminosäurereste umfassen, die nicht tatsächlich Bestandteil der wiederholten immunogenen Sequenz sind. Derartige zusätzliche Aminosäurereste können zur Verknüpfung der einzelnen immunogenen Sequenzen vorhanden sein. Eine derartige verknüpfende Sequenz kann aus bis zu sechs Aminosäureresten, beispielsweise aus 1 bis 3 Aminosäureresten, zusammengesetzt sein. Ohne derartige verknüpfende Reste sind die einzelnen immunogenen Sequenzen direkt mit der nächsten Sequenz verbunden.
Die Peptide können eine beliebige Anzahl an Wiederholungen der immunogenen Sequenz umfassen. Beispielsweise können zwei bis acht und insbesondere zwei bis vier Wiederholungen vorhanden sein. Die Peptide können gegebenenfalls am C-Ende und/oder N-Ende mit einem nicht-natürlichen Cysteinrest enden.
Die Sequenz, die die immunogene FMDV-Sequenz umfaßt besteht aus nicht mehr als 30 Aminosäureresten. Die Länge der Sequenz hängt von der Länge der immunogenen Sequenz ab, obgLeich auch zusätzliche verknüpfende Aminosäurereste und gegebenenfalls ein C-endständiges und/oder N-endständiges nicht-na-ürliches Cystein vorhanden sein können. Vorzugsweise weisen die einzelnen aufeinanderfolgenden Sequenzen eine Länge von nicht mehr als 26 Resten auf.
Die Peptide weisen Wiederholungen der Haupt-FMDV-VP1- Immunogenstelle auf. Das Haupt-FMDV-Epitop ist typischerweise mindestens durch die Aminosäurereste 142 bis 160 des VP1- Capsid-Proteins definiert. Dies gilt insbesondere für den Serotyp 0&sub1;. Eine immunogene Sequenz, die somit wiederholt werden kann, ist die Sequenz, die definiert ist durch die VPI-Aminosäurereste 142 bis 160 vom FMDV-Serotyp 0&sub1;, gegebenenfalls unter Erweiterung nach unten bis zur Aminosäure 137 am N-Ende und/oder nach oben bis zur Aminosäure 162 am C-Ende, oder durch die entsprechenden Aminosäuren eines anderen Serotyps. Typische Sequenzen sind die VP1-Reste 140 bis 162, 140 bis 160, 137 bis 162 oder 137 bis 160 von Serotyp O oder A, beispielsweise für die Subtypen O&sub1; und A&sub1;&sub2;. Diese typischen Sequenzen können beispielsweise zweimal wiederholt werden. Geeignete Peptide sind unter Anwendung des Einbuchstabencodes:
Kleinere immunogene Sequenzen des FMDV-Epitops können jedoch vorhanden sein. Beispielsweise kann auf diese Weise die durch die VP1-Reste 145 bis 150 von Serotyp O&sub1; definierte Sequenz vorhanden sein. Infolgedessen kann die FMDV-Sequenz, die wiederholt werden kann, breiter definiert werden durch die VPI-Reste 145 bis 150 von Serotyp O&sub1;, gegebenenfalls unter Erweiterung nach unten zur Aminosäure 137 am N-Ende und/oder nach oben bis zur Aminosäure 162 am C-Ende, oder durch entsprechende Aminosäuren eines anderen Serotyps. Geeignete kleinere Peptide sind:
Geeignete Peptide mit einem Gehalt an gemischten Serotyp-Tandem-Wiederholungen der Haupt-FMDV-VP1-Antigenstelle werden durch die Formel (I) wiedergegeben:
C'-X-Y-Z-C"
in der X (i) eine Sequenz bedeutet, die an einem Rest von 137 bis 142 beginnt und an einem Rest von 160 bis 162 von VPI des FMDV-Subtyps O&sub1; endet oder (ii) eine Sequenz von entsprechenden Aminosäureresten eines anderen Subtyps vom Serotyp O oder eines Subtyps eines unterschiedlichen FMDVSerotyps bedeutet;
Y eine direkte Bindung oder eine bindende Sequenz bis zu 6 Aminosäureresten bedeutet;
Z eine Sequenz entsprechend der Definition von X bedeutet, jedoch von einem im Vergleich zu der durch X bezeichneten Sequenz un-erschiedlichen Serotyp stammt; und
C' und C" jeweils unabhängig voneinander einen gegebenenfalls vorhandenen Cysteinrest bedeuten.
Die einzelnen immunogenen Sequenzen X und Z sind definiert durch die VP1-Aminosäurereste 142 bis 160 vom FMDV-Serotyp O , gegebenenfalls unter Erweiterung nach unten bis zur Aminosäure 137 am N-Ende und/oder nach oben bis zu Aminosäuren 162 am C-Ende, oder durch entsprechende Aminosäuren eines anderen Subtyps vom Serotyp O oder eines Subtyps eines unterschiedlichen FMDV-Serotyps. Typische Sequenzen sind die VP1-Reste 140 bis 162, 140 bis 160, 137 bis 162 oder 137 bis 160.
Die immunogenen Sequenzen x und Z stammen von versciiiedenen Serotypen. Es gibt sieben FMDV-Serotypen: O, A, C, Asia 1, SAT 1, SAT 2 und SAT 3. Ein geeignetes Peptid umfaßt O&sub1;- und A&sub1;&sub2;-Sequenzen in beiden Reihenfolgen. Die immunogenen Sequenzen können direkt oder über bis zu sechs Aminosäurereste, beispielsweise 1 bis 3 Aminosäurereste, verknüpft sein. Vorzugsweise ist ein C-endständiger nichtnatürlicher Cysteinrest vorhanden. Bevorzugte Peptide sind gemäß dem Einbuchstabencode:
Ein bevorzugtes Polypeptid zum Kuppeln der modifizierten HBcAg-Teilchen umfaßt das HRV-NIm-II-Epitop gemäß EP-A- 0287395. Dieses Epitop ist durch die Aminosäurereste 156 bis 164 von VP2 von HRV2 oder äquivalente Aminosäurereste eines anderen HRV definiert. Diese Aminosäurereste können durch andere Aminosäuren ersetzt werden, die die antigene Beschaffenheit der Sequenz nicht beeinträchtigen. Für HRV2 lautet die NIm-II Sequenz VKAETRLNP.
Äquivalente Aminosäurereste von anderen HVRs sind die VP2- Aminosäurereste entsprechend den VP2-Aminosäureresten 156 bis 164 von HRV2. Mit anderen Worten, es kann sich um die Gegenstück-VP2-Reste eines anderen HRV-Serotyps handeln.
Diese können leicht bestimmt werden, indem man die VP2- Sequenz eines anderen HRV mit der VP2-Sequenz von HRV2 aufreiht. Dies stellt aufgrund der Homologie zwischen VP2- Sequenzen von unterschiedlichen Typen von HRV ein direktes Verfahren dar.
Bei den PoLypeptiden kann es sich um relativ kurze Peptide mit einer Länge bis zu 50 Aminosäureresten, beispielsweise bis zu 40 oder bis zu 30 Aminosäureresten, handeln. Alternativ können sie länger sein und beispielsweise. bis zu 100 oder 200 Aminosäurereste aufweisen. Es kann sich um Proteine handeln. Sie können durch chemische Synthese oder durch rekombinante DNA-Techniken erhalten worden sein.
Die Teilchen, mit denen die Polypeptide gekuppelt werden, bestehen im wesentlichen aus HBcAg, das mit einer N- endständigen Erweiterung, der ein Lys-Rest einverleibt ist, versehen ist. HBcAg ordnet sich selbstständig zu Teilchen von 27 nm Durchmesser. Das modifizierte HBcAg ordnet sich ebenfalls selbst ständig unter Bildung von kernähnlichen Teilchen. In der N-endständigen Erweiterung können mehr als ein Lys-Rest vorhanden sein. Es können bis zu 6 Lys-Reste und beispielsweise bis zu 4 Lys-Reste vorgesehen sein.
Die N-endständige Erweiterung kann eine beliebige geeignete Länge aufweisen, vorausgesetzt, daß das HBcAg mit der Erweiterung einer selbständigen Anordnung zu kernähnlichen Teilchen zugänglich ist und einen Lys-Rest in der Erweiterung aufweist, der für die Kupplung verfügbar ist. Die Erweiterung kann eine Länge von bis zu 250 Aminosäureresten und beispielsweise bis zu 200 oder bis zu 100 Aminosäureresten aufweisen. Eine kurze Erweiterung kann eine Länge bis zu 60 und beispielsweise bis zu 40, 20, 10 oder 5 Aminosäureresten aufweisen.
Eine geeignete Erweiterung umfaßt Reste von 95 bis 102, beispielsweise von 95 bis 104, des VPI-Capsid-Proteins eines Stamms von Poliovirustyp 1 (PV1), wie des Sabin- oder Mahoney-Stamms:
Sabin PV1 VP1 95-102 : SASTKNKD
Sabin PV1 VP1 95-104 : SASTKNKDKL
Mahoney PV1 VP1 95-102 : PASTTNKD
Mahoney PV1 VP1 95-104 : PASTTNKDKL
Die Sequenzen sind gemäß dem Einbuchstabencode (Eur. J. Biochem., 3d. 138 (1984), S. 9-37) wiedergegeben, wobei K Lys bedeutet. Diese Sequenzen umspannen die vorgeschlagene Haupt-Antigenstelle an PV1-VP1. Eine weitere geeignete Erweiterung umfaßt die Reste 156 bis 164, beispielsweise 156 bis 170, des VP2-Capsid-Proteins von HRV2 oder äquivalente Aminosäurereste eines anderen HRV. Für HRV2 handelt es sich bei diesen Resten um:
156-164: VKAETRLNP
156-170: VKAETRLNPDLQPTE
Die von PV1 oder HRV abgeleiteten Sequenzen können an einem oder beiden Enden mit Linkersequenzen versehen sein, die beispielsweise bis zu 5 oder bis zu 3 Aminosäurereste aufweisen. Für jede N-endständige Erweiterung von HBcAg liegt mindestens ein Lys-Rest innerhalb der ersten 14 N- endständigen Reste vor, beispielsweise 1 Lys-Rest innerhalb der ersten 5 oder ersten 12 Reste oder 2-Lys-Reste innerhalb der ersten 14 N-endständigen Reste. Für ein gewähltes Polypeptid, das für eine Kupplung erwünscht ist, kann es zweckmäßig sein, ein HBcAg mit einer N-endständigen Erweiterung zu wählen, die einen Lys-Rest in der Nähe zum N- Ende der Erweiterung aufweist. Ferner kann es wünscnenswert sein, daß die N-endständige Erweiterung hydrophil ist.
Ein modifiziertes HBcAg, das mit einer N-endständigen Erweiterung versehen ist, die eine dieser Sequenzen oder eine andere Sequenz mit einem Lys-Rest umfaßt, kann durch gentechnische Maßnahmen, beispielsweise gemäß JP-A-L96299/88, erhalten werden. Insbesondere läßt sich ein derartiges modifiziertes HBcAg erhalten, indem man ein Gen, dar für das modifizierte HBcAg in einem geeigneten Expressionsvektor codiert, bereitstellt und das modifizierte HBcAg in einem mit dem Vektor transformierten Wirt exprimiert.
Ein für das modifizierte HBcAg codierendes Gen kann hergestellt werden, indem man eine DNA-Sequenz, die für die gewünschte N-endständige Erweiterung codiert, synthetisiert und sie gegebenenfalls mit geeigneten Linkern mit dem 5'-Ende der für HBcAg codierenden DNA-Sequenz ligiert. Die erhaltene DNA-Sequenz kann auf diese Weise in einem Expressionsvektor unter der Kontrolle geeigneter transskriptionaler und translationaler regulatorischer Sequenzen bereitgestellt werden. Das modifizierte HBcAg wird in einem geeigneten prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt, beispielsweise einem Stamm von E. coli, Salmonella oder Hefe, exprimiert und in Form von Teilchen gewonnen.
Ein Expressionsvektor, beispielsweise ein Plasmid, der zur Expression von HBcAg befähigt ist, kann verwendet werden, wenn eine geeignete Restriktionsstelle am 5'-Ende der für HBcAg codierenden DNA-Sequenz vorliegt. Eine für die gewünschte N-endständige Erweiterung für HBcAg codierende DNA-Sequenz wird an dieser Stelle inseriert. Ein Fusionsprotein, bei dem die N-endständige Erweiterung mit dem Aminoende von HBcAg verknüpft ist, wird exprimiert. Ein geeigneter Expressionsvektor ist das Plasmid pBc404. E. coli (JM 101), das dieses Plasmid beinhaltet, wurde beim National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB, am 9. Februar 1989 unter der Hinterlegungsnummer NCIB 40111 hinterlegt. Dieses Plasmid codiert für ein Ampicillinase-Gen als Selektionsmarker und besitzt einen starken bakteriellen Promotor, tac, der sich stromaufwärts vom HBcAg-Gen befindet. Die Anwesenheit von Restriktionsstellen EcoRI und BamHI erlaubt die Insertion eines synthetischen Oligonucleotids, das für eine beliebige gewünschte N-endständige Erweiterung für HBcAg codiert.
Konjugate werden erfindungsgemäß hergestellt, indem man das Polypeptid, das eine antigene Determinante für das modifizierte HBcAg aufweist, über die Seitenketten-Aminogruppe des Lys-Restes, der innerhalb der letzten 14 N- endständigen Aminosäurereste des modifizierten HBcAg vorhanden ist, kuppelt. Dies wird typischerweise erreicht, indem man das modifizierte HBcAg mit einem bifunktionellen Reagenz umsetzt, das zur Verknüpfung an einer Aminogruppe und an einer Sulfydrylgruppe befähigt ist. Das auf diese Weise derivatisierte, modifizierte HBcAg wird mit dem Polypeptid umgesetzt, das, sofern es keine freie Sulfydrylgruppe besitzt, so modifiziert worden ist, daß eine derartige Gruppe vorliegt.
Geeignete bifunktionelle Reagenzien sind SMCC, MBS und N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP). Die bifunktionellen Reagenzien umfassen im allgemeinen eine Gruppe, die zur Bildung einer Peptidverknüpfung befähigt ist, und eine Gruppe, die zur Bildung einer Disulfid-oder Thioetherverknüpfung befähigt ist. Eine Sulfydrylgruppe kann an dem Polypeptid, für das eine Kupplung mit dem modifizierten HBcAg erwünscht ist, durch Bereitstellung eines N-endständigen und/oder C-endständigen Cys-Restes oder durch Umsetzung von Aminofunktionen mit 2-Aminothiolan oder dem N- Hydroxysuccinimidester von 3-(3-Dithiopyridyl)-propionat oder S-Acetylthioglycolsäure erhalten werden. Nach Umsetzung mit S-Acetylthioglycolsäure-N-hydroxysuccinimidester (SATA) ergibt eine Desacetylierung des SATA beispielsweise mit Hydroxylamin freie -SH-Gruppen.
In der Praxis werden die modifizierten HBcAg-Teilchen im allgemeinen in einem Puffer, z.B. einem Phosphatpuf i:.er mit einem pH-Wert von etwa 7, bereitgestellt. Ein molarer Überschuß des bifunktionellen Agens in einem inerten Lösungsmittel, z.B. einem aprotischen organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, wird zugesetzt Die Derivatisierung der HBcAg-Teilchen erfolgt. Ein Überschuß des bifunktionellen Agens wird beispielsweise durch Filtration entfernt. Ein Überschuß des mit den HBcAg-Teilchen zu kuppelnden Polypeptids wird sodann zugesetzt. Die Kupplung erfolgt, und die erhaltenen Konjugate, die aus dem Polypeptid, das mit den modifizierten HBcAg-Teilchen verknüpft ist, bestehen, werden beispielsweise durch Filtration gewonnen.
Die modifizierten HBcAg-Kernteilchen können vor der Verwendung der Carboxymethylierung unterworfen werden. Der Zweck dieser Maßnahme besteht in der Blockierung der Sulfydrylgruppen an den Kernteilchen vor der Derivatbildung und somit darin, zu verhindern, daß die Kernproteine einer Vernetzung unterliegen, wenn ein bifunktionelles Reagenz zur Kupplung der N-endständigen Seitenketten-Aminogruppe der Kernteilchen an eine -SH-Gruppe eines Polypeptids verwendet wird. Eine Carboxymethylierung kann erreicht werden, indem man die Kernteilchen mit Iodacetamid umsetzt. Überschüssiges Reagenz kann durch Gelfiltration oder Dialyse abgetrennt werden.
Die Konjugate eignen sich zur Bildung von Antikörpern gegen die antigene Determinante, die durch das mit den HBcAg- Teilchen verknüpfte Polypeptid präsentiert wird. Die Konjugate können somit als Impfstoffe für Menschen oder Tiere verwendet werden. Eine Impfung wird erreicht, indem man einem Menschen oder einem Tier eine wirksame Menge des Konjugats verabreich-. Man kann sich eines oralen oder parenteralen Verabreichungswegs bedienen, z.B. durch subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung. Typischerweise wird das Konjugat in einer Menge von 1 bis 1000 ug pro Dosis und vorzugsweise von 10 bis 100 ug entweder oral oder parenteral verabreicht.
Für die Verabreichung wird ein Konjugat typischerweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel zubereitet. Herkömmliche Zubereitungen, Träger, Adjuvantien und Verdünnungsmittel können eingesetzt werden. Diese Bestandteile werden selbstverständlich durch den Verabreichungsweg festgelegt. Beispiele für geeignete Trägerstoffe und Verdünnungsmittel sind inkomplettes FreundÄdjuvans (IFA), Aluminiumhydroxid, Saponin, DEAE-Dextran, Muramyldipeptid, Mineralöle, neutrale Öle, wie Miglycol, pflanzliche Öle, wie Erdnußöl, "Iscoms", Liposomen, Pluronic (Warenbezeichnung)-Polyole oder das Ribi-Adjuvans-System (GB- A-2189141).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In der beigefügten Figur ist das Plasmid pBc404 gezeigt. B, E und P bedeuten Restriktionsstellen für BamHI, EcoRI bzw. PstI; tac bezeichnet den tac-Promotor; ori bezeichnet die Replikationsursprungsstelle; bla bedeutet β-Lactamase und SD bedeutet Shine-Dalgarno-Sequenz.

Beispiel 1:

Herstellung von HBCAg, das am N-Ende mit einer kurzen Erweiterung mit einem Gehalt an den pV1 Mahoney-VP1-Resten 95 bis 104 (PV-Kern) versehen ist

Ein Expressionsplasmid für den PV-Kern wurde auf der Basis des in der Figur gezeigten Ausgangsplasmids pBc404 herges-ellt. Synthetische Oligonucleotide, die die Aminosäuren 95 bis 104 von VP1 von PV1-Mahoney repräsentieren, wurden unter Verwendung von T4-Ligase durch übliche Verfahrensweisen der Ligation in pBc404 unterworfen. Die synthetischen Oligonucleotide, die Art ihrer Anelierung und die Codierungssequenz der N-endständigen Erweiterung sind nachstehend angegeben: LINKER POLIOVIRUS
Bakterien (E. coli JM 101), die das rekombinante Plasmid enthalten, wurden für die Expression unter Verwendung von 60 ug/ml Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 6 S-unden induziert. Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, mit Lysozym lysiert und einer Behandlung mit einem nichtionogenen Detergens unterworfen. Bakterienbruchstücke wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 10000 U/min entfernt. Proben des Überstands wurden bei 20ºC 75 Minuten an einem 15- 45 % linearen Saccharosegradienten bei 50000 U/min fraktioniert. Teilchen wurden aufgrund der optischen Dichte bei 260 nm festgestellt. Die Teilchen wurden durch 1-stündige Zentrifugation bei 40000 U/min eingeengt oder direkt nach Dialyse der Saccharose zur Derivatisierung verwendet.

Beispiel 2:

Kupplung des aus FMDV-VPI-Resten 141-160 zusammengesetzten Peptids, das ferner einen C-endständigen Cys-Rest aufweist (FMDV 141-160 Cys) an PV-Kerne

PV-Kerne, die in zwei aufeinanderfolgenden Saccharosegradienten gereinigt worden waren, wurden in einer Konzentration von 5 mg/ml in 10 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 über eine Sephadex (Warenbezeichnung) G100- Säule gegeben. Die PV-Kerne in 10 millimolarem Phosphatpuf fer mit einer Konzentration von 2 mg/ml wurden sodann der Derivatbildung unterzogen, indem man 1/20 Volumen an SMCC, das in trockenem Dimethylformamid so gelöst war, daß die Endkonzentration an SMCC in der PV-Kernprobe einem 50-fachen molaren Überschuß in Bezug zum PV-Kernprotein entsprach, zusetzte.
Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das SMCC durch Filtration durch Sephadex G100 in 10 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 entfernt. Frisch gelöstes FMDV 141-160 Cys wurde in 1/10 Volumen zugegeben, wodurch man einen 10-fachen molaren Überschuß des Peptids in Bezug auf die derivatisierten PV-Kerne erhielt. Nach 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde ungekuppeltes Peptid von den derivatisierten PV-Kernen durch Filtration durch Sephadex G200 abgetrennt. Die PV-Kerne mit dem anhaftenden Peptid wurden gewonnen.

Beispiel 3:

Kupplung von HRV2-Peptid an PV-Kerne

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 wurde das HRV2-Peptid, das das NIm-II-Epitop umfaßt und folgende Sequenz:
VKAETRLNPDLQPTC
aufweist, an PV-Kerne gekuppelt. Die PV-Kerne mit dem anhaftenden Peptid wurden gewonnen.

Beispiel 4:

Carboxymethylierung von PV-Kernen

PV-Kerne wurden nach Dialyse von Saccharose und Einengen durch Zentrifugieren in einer Menge von 200 ug/ml mit 10 millimolarem Iodacetamid in 0,5 m Tris, pH-Wert 8,0 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Überschüssiges Reagenz wurde von den auf diese Weise carboxymethylierten PV- Kernen durch Gelfiltration abgetrennt.

Beispiel 5:

Kuppeln von Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) an carboxmethylierte PV-Kerne

Die carboxymethylierten PV-Kerne von Beispiel 4 wurden mit einer äquimolaren Menge an SMCC in Dimethylformamid (DMF) derivatisiert. Die Menge an SMCC betrug 1/20 des Volumens an DMF. In Hefe exprimierte HBsAg-Teilchen wurden mit 200 ug/ml S-Acetylthioglycolsäure-N-Hydroxysuccinimidester (SATA) ebenfalls in äquimolaren Verhältnissen in DMF derivatisiert. Die Menge an SATA betrug ebenfalls 1/20 des Volumen- an DMF. Nach Desacetylierung des SATA mit Hydroxylamin unter Bildung von freien -5H-Gruppen wurden gleiche Volumina der beiden derivatisierten Teilchen, jeweils 200 ug/ml, vermischt. Die PV-Kerne mit anhaftendem HBsAg wurden gewonnen.

Beispiel 6:

Kuppeln von FMDV-Peptid und HRV2-Peptid an carboxymethylierte PV-Kerne

Das FMDV 141-160 Cys-Peptid wurde an carboxymethylierte PV- Kerne gemäß Beispiel 5 gekuppelt. In einem getrennten Versuch wurde das in Beispiel 3 beschriebene HRV2-Peptid auf die gleiche Weise an carboxymethylierte PV-Kerne gekuppelt. In beiden Fällen wurde jedoch die Derivatisierung in 50 millimolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,8 durchgeführt, wonach sich möglichst rasch nach der Derivatisierung zur Stabilisierung der Maleinimidgruppe die Übertragung auf 50 millimolaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 anschloß.

Beispiel 7:

Testergebnisse unter Analyse der Kupplung von FMDV-Peptid und HRV2-Peptid an PV-Kerne

Tests wurden durchgeführt, um die PV-Kerne mit anhaftendem FMDV-Peptid, die in den Beispielen 2 und 6 erhalten worden waren1 und mit anhaftendem HRV2-Peptid, die in den Beispielen 3 und 6 erhalten worden waren, auf folgende Weise zu analysieren:
(a) Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Dieses Verf ahren ergab daß das gesamte Kernprotein aufgrund der Addition des Peptids zu einem höheren Molekulargewicht verschoben worden war.
(b) Western-Blot. Im Anschluß an die Gelelektrophorese wurden Proteine auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikern- oder Antipeptid-Antiseren umgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, daß die Proteinformen mit höherem Molekulargewicht, die nach dem Kuppeln auftraten, mit beiden Antiseren in der erwarteten Weise reagierten.

(c) Elisa.

(i) Tests wurden mit einem Sandwich-Verfahren durchgeführt, bei dem Antikern-Antiserum, das an die Elisa-Platte gebunden war, zum Fixieren der derivatisierten Teilchen verwendet wurde. Die Tests wurden nach Umsetzung mit Antipeptid-Antiserum entwickelt. Es zeigte sich, daß die derivatisierten Teilchen sowohl Kern- als auch Peptid-Antigenizität aufwiesen.
(ii) Eine Elisa-Titration von anti-HRV2-Peptid-Antiserum gegen Fusionskernteilchen, bei denen die HRV2-Peptidsequenz mit dem N-Ende des Kernproteins fusioniert war und gegen PV- Kerne, bei denen das HRV2-Peptid gekuppelt war, führten zu ähnlichen Ergebnissen. Da im Test gleiche Mengen der beiden Teilchen verwendet wurden, war die antigene Aktivität der N- endständigen Fusionsteilchen und der chemisch gekuppelten Teilchen im wesentlichen die gleiche. Bei anti-HRV2- Peptidantiserum handelte es sich um ein Antiserum gegen das anhaftende HRV2-Peptid der Beispiele 3 und 6.
(d) Saccharose-Dichte-Gradienten. Diese Analyse ergab, daß die Kupplung des FMDV-Peptids an Kerne zu einer Teilchen-Aggregation führte. Sie ergaben eine Pelletbildung am Boden des Röhrchens. Mit HRV-Peptid gekuppelte PV-Kerne sedimentierten in die gleiche Position wie unbehandelte Kerne und wiesen beim Elisa-Test sowohl Kern- als auch Peptid- Immunogenizität auf.
(e) Elektronenmikroskopie. Mit HRV2-Peptid gekuppelte PV- Kerne wurde untersucht. Es handelte sich um Teilchen von regelmäßigem Aussehen. Die elektronenmikroskopische Betrachtung von Immunkomplexen, die zwischen mit HRV2-Peptid gekuppelten PV-Kernen und anti-HRV2-Peptid-Antiserum gebildet worden waren, ergab, daß die Kernteilchen durch Antikörper verknüpft waren.

(f) Immunogenizität.

(i) An Kerne gekuppeltes FMDV-Peptid ergab eine neutralisierende Aktivität mit < 20 ug gekuppeltem Material (< 2 ug Peptid).
(ii) Die immunogene Aktivität der N-endständigen Fusionskernteilchen mit HRV2-Peptid und der chemisch gekuppelten Teilchen wurde an Meerschweinchen unter Einsatz von jeweils 20 ug-Dosen der Antigene verglichen. Die Antiseren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach < der Injektion mittels Elisa auf das HRV2-Peptid getestet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Tag chemisch gekuppelter Kern Fusionskern Auffrischung
Die Antigene wurden intramuskulär in inkomplettem Freund-Adjuvans injiziert.

Beispiel 8:

Herstellung von FMDV-Tandem-Wiederholungspeptiden

Die nachstehend angegebenen Peptide wurden nach dem Festphasenverfahren hergestellt. Insbesondere erfolgte die Synthese unter Anwendung einer angepaßten Merrifield-Technik (Merrifield, JACS , Bd. 85 (1963), S. 2149-2154), die von Houghten (Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 5131-5135) beschrieben worden ist. Die einzelnen Peptide weisen an ihrem C-Ende einen zusätzlichen, nichtnatürlichen Cysteinrest auf, ausgenommen das Peptid 199, das einen C-endständigen, nicht-natürlichen Glycinrest aufweist.
Die einzelnen Peptide wurden an einem p-Methylbenzhydrylamindivinylbenzol-Harz synthetisiert. Bei der α-Aminoschutzgruppe an den einzelnen Aminosäuren handelte es sich um tert.- Butoxycarbonyl (Boc.). Die einzelnen Kupplungszyklen liefen folgendermaßen ab:
1. Waschen des Harzes mit Dichlormethan - 10 Minuten
2. Waschen mit 5 % Diisopropylethylamin in Dichlormethan - 2 Minuten x 3.
3. Waschen mit Dichlormethan - 1 Minute x 2
4. Kuppeln der tert.-Butoxycarbonylaminosäure in Dichlormethan mit 0,3m Diisopropylcarbodiimid - 60 Minuten
5. Wie Stufe 3
6. Schutzgruppenentfernung mit 50 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan - 20 Minuten
7. Waschen mit Dichlormethan - 1l Minute x 6
8. Rückkehr zu Stufe 2.
Nachdem die Kupplungszyklen beendet waren, wurde dar Peptid vom Harz durch 1-stündige Behandlung mit Fluorwasserstoff mit 10 % Anisol-Fänger abgespalten. Das Peptid wurde auf diese Weise mit einer carboxyl-endständigen Amidgruppe erhalten. Es wurde mit Ether gewaschen, getrocknet, in 15 % Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Virus Peptid Bezeichnung Nummer

Beispiel 9:

Herstellung von FMDV-gemischten Serotyp-Tandem- Wiederholungspeptiden

Die nachstehend aufgeführten Peptide wurden gemäß dem in Beispiel 8 beschriebenen Festphasenverfahren synthetisiert. Virus Peptid Bezeichnung Nummer

Beispiel 10:

Herstellung von HBCAg, das am N-Ende mit einer Erweiterung mit einem Gehalt an den HRV2-VP2-Resten 156-170 vergehen ist (HRV2-Kern)

Zum Aufbau von chimären Fusionsteilchen, die für eiii spezifisches N-endständiges HRV2 VP2-Epitop codieren und die VP2-Reste 156-170 aufweisen, wurden synthetische Oligonucleotide mit kohäsiven Enden für EcoRI (5') bzw. BamHI (3') unter Verwendung eines Applied Biosystems 381A DNA- Syntheseautomaten hergestellt. Diese Oligonucleotide wurden in mit EcoRI-BamHI-verdautes pBc404 ligiert, das nach üblichen Verfahren (Francis und Clarke, Meth. Enzymology, Bd. 178 (1989) S. 659-676) aus 1 % niedrigschmelzender Agarose gereinigt worden war. Diese DNA wurde sodann in E. coli-Stamm JM101 transformiert. Rekombinante Plasmide wurden der Restriktionskartierung von DNA-Präparaten im Kleinmaßstab unterworfen. Die synthetischen Oligonucleotide, die Art ihrer Anelierung und die Codierungssequenz der N-endständigen- Erweiterung sind nachstehend angegeben. LINKER Kern
Bakterien mit einem Gehalt an rekombinanten Plasmiden wurden über Nacht in L-Amp-Medium bis zu einer hohen Zelldichte gezüchtet und am nächsten Tag mit frischer L-Brühe (1:10) verdünnt. Die Expression wurde routinemäßig durch sofortige Zugabe von IPTG (60 ug/ml Endkonzentration) induziert. Man ließ die Bakterien weitere 6 bis 8 Stunden bei 37ºC replizieren. Sodann wurden die Bakterien geerntet und chimäre Kernteilchen mit N-endständigen Peptid-Epitopen wurden wie früher gereinigt und charakterisiert (Clarke et al. Nature, Bd. 330 (1987), S. 381-383; Francis und Clarke, 1989).

Beispiel 11:

Kuppeln von HBsAg an HRV2-Kerne

Die HRV2-Kerne von Beispiel 10 wurden mit einer äquimolaren Menge an SMCC in DMF der Derivatisierung unterworfen. Die Menge an SMCC betrug 1/20 des Volumens an DMF. Hefeexprimiertes HBsAg wurde bei 200 ug/ml mit SATA in äquimolaren Verhältnissen an DMF derivatisiert. Die Menge an SATA betrug 1/20 des DMF-Volumens. Nach Desacetylierung des SATA mit Hydroxylamin unter Bildung von freien -SH-Gruppen wurden gleiche Volumina der beiden derivatisierten Feilchen, jeweils 200 ug/ml, vermischt. Die HRV2-Kerne mit anhaftendem HBsAg wurden gewonnen.

Claims

1. Hepatitis B-Kernantigen (HBcAg)-Teilchen, die e;Ln Polypeptid tragen, das ein antigenes Epitop aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die HBcAg-Teilchen zusammengesetzt sind aus HBcAg, das mit einer N- endständigen Erweiterung mit einem Lys-Rest innerhalb der ersten 14 N-endständigen Aminosäurereste der Erweiterung versehen ist, wobei das Polypeptid an die Teilchen über die Seitenketten-Aminogruppe des Lys- Restes gekuppelt ist.

2. Teilchen nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein antigenes Epitop aufweist, das zur Bildung von neutraiisierenden Antikörpern befähigt ist.

3. Teilchen nach Anspruch 2, wobei es sich beim Epitop um ein Epitop eines Virus, Bakteriums oder Protozoons handelt.

4. Teilchen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid eine Länge von bis zu 50 Aminosäureresten aufweist.

5. Teilchen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die N-endständige Erweiterung eine Länge von bis zu 60 Aminosäureresten aufweist.

6. Teilchen nach Anspruch 5, wobei die N-endständige Erweiterung eine Länge von bis zu 40 Aminosäureresten aufweist.

7. Teilchen nach Anspruch 6, wobei die N-endständige Erweiterung eine Länge von bis zu 20 Aminosäureresten auweist.

8. Teilchen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die N-endständige Erweiterung die Reste 95-102 des VP1- Capsid-Proteins eines Typ 1-Poliovirus oder die Reste 156-164 des VP2-Capsid-Proteins von humanem Rhinovirus (HRV) Typ 2 oder äquivalente Aminosäurereste eines anderen HRV umfaßt.

9. Teilchen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei 1 Lys-Rest innerhalb der ersten 12 N-endständigen Aminosäurereste der Erweiterung vorhanden ist.

10. Teilchen nach Anspruch 9, wobei ein Lys-Rest innerhalb der ersten 5 N-endständigen Aminosäurereste der Erweiterung vorhanden ist.

11. Teilchen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei 2 Lys-Reste innerhalb der ersten 14 N-endständigen Aminosäurereste der Erweiterung vorhanden sind.

12. Teilchen nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das HBcAg, das mit der N-endständigen Erweiterung versehen ist, carboxymethyliert ist.

13. Verfahren zur Herstellung von HBcAg-Teilchen, de ein Polypeptid tragen, das ein antigenes Epitop aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid an HBcAg- Teilchen, die aus HBcAG, das eine N-endständige Erweiterung mit einem freiliegenden Lys-Rest innerhalb der ersten 14 N-endständigen Aminosäurereste der Erweiterung aufweist, zusammengesetzt sind, über die Seitenkette-Aminogruppe des Lys-Restes gekuppelt ist.

14. Verf ahren nach Anspruch 13, wobei das HBcAg der N- endständigen Erweiterung vor der Kupplung des Poypeptids carboxymethyliert wird.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel und als Wirkstoff HBcAg-Teilchen, die der Definition in einem der Ansprüche 1-12 entsprechen oder die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 hergestellt worden sind, die ein Polypeptid mit einem antigenen Epitop tragen.