DE69838073T2

DE69838073T2 - Rekombinante nodavirus-zusammensetzungen und verfahren

Info

Publication number: DE69838073T2
Application number: DE69838073T
Authority: DE
Inventors: Stephen G. San Diego HALL
Original assignee: Pentamer Pharmaceuticals Inc Anaheim; Scripps Research Institute; Pentamer Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Pentamer Pharmaceuticals Inc Anaheim; Scripps Research Institute; Pentamer Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-07
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2018-12-08
Also published as: AU755201B2; BR9813416A; ATE366743T1; ES2288769T3; US6171591B1; EP1037917B1; DE69838073D1; CA2313704A1; AU1714699A; JP2001525422A; IL136634A0; JP4503172B2; EP1037917A4; WO1999029723A1; CY1106842T1; PT1037917E; EP1037917A1; DK1037917T3; IL136634A; CA2313704C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf chimäre Nodavirus-verwandte Proteine, wie antigene Peptide, und deren Verwendungen. Diese Erfindung bezieht sich auch auf Virus-ähnliche Partikel, die chimäre Nodavirus-verwandte Proteine umfassen, und deren Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Immunsystem besitzt mehrere unterschiedliche Mechanismen, um mit Pathogenen in dem System fertig zu werden (Parker, D.C. 1993. Annu. Rev. Immunol. 11:331–360; Clinical Immunology: Principles and Practice. Band 1 und 2. Hrsg. (Fleisher et al. 1996. Mosby-Year Book, Inc. New York, NY). Der erste Schritt in der Immunantwort ist die Aktivierung einer speziellen Subklasse an T-Lymphozyten, genannt T-Helferzellen. Makrophagen präsentieren Fragmente fremder Proteine oder Antigene auf ihren Oberflächen. Die Erkennung dieser Antigene durch spezialisierte Rezepturen, die man auf T-Helferzellen findet, löst dann zwei Antworten aus: eine zellvermittelte Immunantwort und eine humorale Immunantwort.
Die zellvermittelte Antwort führt im Prinzip zur Stimulierung einer anderen Subklasse an T-Lymphozyten, genannt cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die infizierte Zellen erkennen und zerstören. HLA-Klasse-I-restringierte Moleküle binden an Peptide, die intrazellulär prozessiert worden sind, und befähigen CD8+ T-Zellen, intrazelluläre Viren zu beseitigen. CTLs sind die zweite immunologische Verteidigungslinie, da die humorale Antwort Antikörper erzeugt, die dazu in der Lage sein können, Viren zu neutralisieren und die Anzahl infizierter Zellen der ursprünglichen Infektion zu verringern. Die CD4+ T-Zellen (Th) weisen oft einen Helfer-Phänotyp auf, was anhand ihrer Fähigkeit, die humorale Antwort zu unterstützen, gemessen wird. Die Zellen ermöglichen die Effektorfunktion anderer Zellen und während Th-Zellen eine begrenzte antivirale Aktivität aufweisen, spielen sie eine Antikörper-produzierenden B-Zellen (Vitetta et al. 1989. Adv. Immunol. 45:1; Hodes, R.J.S. 587 In 1989. Fundamental immunology, Hrsg. Paul, W.E.).
Die humorale Antwort führt andererseits zur Aktivierung der zweiten bedeutenden Lymphozytenklasse, der B-Zellen, um zirkulierende Antikörper zu erzeugen. Antikörper erkennen und neutralisieren lösliche Antigene und markieren Zellen oder Viren, die Antigene tragen, für die Zerstörung durch phagozytierende Zellen. Die HLA-Klasse-II-Moleküle präsentieren die exogenen, antigenen Peptide, den Klasse-II-restringierten CD4+ B-Zellen. Antikörper dienen als wirksame Mittel, um die virale Infektiösität über mehrere Mechanismen zu verringern. Die Antikörperantwort gegenüber Oberflächenantigenen auf einem eindringenden Pathogen kann sehr stark sein, und der Antikörper kann in der Lage sein, den Viruspartikeltiter signifikant herabzusetzen. Außerdem können Antikörper die strukturelle Integrität des eindringenden Pathogens durch Interaktion mit Oberflächenantigenen verändern, was das Virus nicht-infektiös machen kann. Eine Neutralisierung des Pathogens kann auch durch Verhinderung einer Interaktion mit dem zellulären Rezeptor und/oder durch Verhinderung von Endozytose in das Cytoplasma erfolgen (Ruggeri, F.M. und Greenberg, H.B.J. Virol. 1991;2211–2219) Dimmock, N.J. In: Current Topics in microbiology and immunology. 1993. Springer-Verlag: New York).
Die Entwicklung wirksamer Impfstoffe war einer der entscheidendsten Fortschritte, der zu einem drastischen Abwärtstrend beim Auftreten viraler Krankheiten geführt hat. Die Impfung induziert in dem geimpften Subjekt einen "vorbereiteten" Zustand, so dass nach Antigenprovokation eine schnelle zweite Immunantwort erzeugt wird, die zu einer beschleunigten Eliminierung des Organismus und zum Schutz vor klinischer Erkrankung führt. Die Entwicklung von Impfstoffen erfordert die Beachtung der Sicherheit des Systems wie auch der Antigenizität und der Wirksamkeit der Prophylaxe.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass humorale und zellvermittelte Antworten auf Antigene ganz unterschiedlich sein können. Im Allgemeinen sind B-Zell-Epitope von Antigenen länger und sind als konformative Epitope bekannt. Konformative Epitope benötigen zur effizienten Erkennung durch Antikörper der korrekten dreidimensionalen Struktur (Elner et al. 1977. J. Immunol. 118:2053). Im Gegensatz dazu erkennen T-Zellen üblicherweise kleine lineare Epitope auf der Grundlage von Sequenzinformation. Da eine wirksame Resistenz gegen virale oder bakterielle Infektionen die Aktivitäten von sowohl humoraler als auch zellulärer Komponenten benötigt, ist es wichtig, die Antigenpräsentation gegenüber sowohl B- als auch T-Zellen zu optimieren.
Trotz jüngster Fortschritte bei Systemen zur Epitoppräsentation, besteht im Stand der Technik nach wie vor Bedarf nach einem System, das genetisch fähig ist, gleichzeitig B-Zell- und T-Zell-Epitope zu exprimieren wie auch diese Epitope dem Immunsystem im passenden Kontext zu präsentieren.
Es gibt Hinweise darauf, dass die gleichzeitige Expression von T- und B-Zell-Epitopen auf dem gleichen Trägersystem die Antigenantwort über einen kooperativen Mechanismus zwischen B- und T-Zellen verstärken kann. Zum Beispiel sind verstärkte B-Zell-Impfstoffe gegen Hepatitis B herstellbar, indem man Hepatitis-B-Virus-(HBV)-Hüllprotein-spezifische B-Zellen über ein Trägersystem stimuliert, das HBV imitiert (Chisari, F.V. 1995. S. 29–60 In.: Annu. Rev. Immunol). Wenn dieser Träger oder dieses Imitat Th-Zell-Epitope trägt, kann die nachfolgende Prozessierung dieser Th-Epitope die Proliferation von B-Zellen induzieren. Beispielsweise hängt die HBV-Clearance von einer starken und polyklonalen B-Zell- und T-Zell-Antwort auf die Hüll-, Nukleokapsid- und Polymerase-Antigene ab. Während die Antikörperantworten auf die HBV-Nukleocapsid- und Polymerase-Antigene nicht gut verstanden sind, ist es ganz klar, dass die Antikörperantwort auf das HBV-Hüll-Antigen eine T-Zell-Kooperation benötigt. Trotz der Notwendigkeit einer starken Immunantwort, die notwendig ist, um HBV zu beseitigen, ist die Klasse-II-restringierte Hüll-spezifische Antwort bei akuter und chronischer Hepatitis recht niedrig. Das Prozessieren von Th-Epitopen kann die Proliferation von B-Zellen und Anti-Hüll-Antikörpern induzieren. Ein wirksames Mittel der Verstärkung der Kooperation zwischen B- und Th-Zellen aufgrund der vermehrten Exposition gegen B- und Th-Zell-Epitope über ein Trägersystem würde wahrscheinlich zu einer Krankheitsremission bei den Patienten führen. Es gibt Hinweise darauf, dass verbesserte B-Zell-Impfstoffe gegen Hepatitis B dadurch erhältlich sind, dass HBV-Hüll-spezifische B-Zellen über ein Trägersystem stimuliert werden, das HBV imitiert, indem es den Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) HBV-Determinanten korrekt präsentiert.
Während es in akuten Fällen eine wesentliche Antwort auf Klasse-I-restringierte CTL gibt, wird die CTL-Antwort auf HBV bei chronisch infizierten Patienten, die nicht in der Lage waren, das Virus zu eliminieren, nicht leicht nachgewiesen. Die Fähigkeit, eine starke CTL-Expansion zusammen mit einer B- und Th-Zellkoopera tion zu induzieren, könnte eine gewichtige Bedeutung für die Behandlung von HBV-Infektion wie auch vieler anderer infektiöser Krankheiten und Krebs haben.
Es wurden in jüngster Zeit beachtliche Fortschritte bei Impfungsstrategien gemacht, jedoch besteht noch immer eine Notwendigkeit für eine Verbesserung bestehender Strategien. Rekombinante, pathogene Viren haben oft die stärksten humoralen und zellvermittelten Antworten induziert, aber die Probleme der Sicherheit und der möglichen Beeinträchtigung durch eine zuvor vorhandene Immunität gegenüber den Vektoren haben sie zu keinem attraktiven System für die fortgesetzte Verwendung gemacht. Peptidimpfstoffe haben sich als relativ sicher bei einer starken monofunktionellen Immunantwort erwiesen. Trotz dieser Vorteile neigen sie dazu, schwach immunogen zu sein, und haben eine begrenzte Fähigkeit, selektiv an unterschiedliche MHC-Determinanten zu binden, die sich in genetisch verschiedenen Populationen von Individuen finden. Während es möglich sein könnte, zahlreiche Peptide zur Formulierung in einem einzelnen Impfstoff zu erzeugen, stellt solch ein Unterfangen eine gewaltige Aufgabe dar. Genetische Immunisierung oder DNA-Impfstoffe sind viel versprechend, aber sie weisen nicht die Fähigkeit auf, APCs anzusprechen oder eine breite polyklonale Antwort zu erzeugen. Trotz dieser Fortschritte haben die derzeitigen Technologien kein System bereitgestellt, das zur gleichzeitigen Expression von B- und T-Zell-Epitopen befähigt war, die die B- und T-Zellen des Immunsystems wirksam aktivieren ("primen").
In diesen nicht einschränkenden Beispielen wurden genetisch manipulierte Nodavirus- oder speziell die chimären Flock-House-Virus (FHV)-Hüllproteinkonstrukte hergestellt, die genau definierte Liganden innerhalb der Insertionsregion wie auch eine Inkapsidierung therapeutischer Gene oder von Antisense enthalten.

Genübertragung oder Gentherapie kann als das Einbringen eines funktionellen Gens (zur Expression eines Proteins) oder eines Antisense-Moleküls (zum Blockieren der Translation eines Proteins) in somatische Zellen definiert werden. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,589,466 an Felgner et al. und US-Patent Nr. 5,676,954 an Brigham. Für Übersichtsartikel siehe Mitani, K. und Caskey, C.T. (1993) TIBTECH 11:162–166; Findeis, M.A. et al. (1993) TIBTECH 11:202–205; Friedmann, T. (1994) TIG: 10:210–214; Smith, C. (1994) TIG: 10:139–144; Karpati et al. (1996) TIBS 19:49–54; Calos, M.P. (1996) TIG: 12:463–466. Verschiedene Genübertragungstechnologien, die zum Behandeln einer Vielzahl von Krankheiten und erworbener und genetischer Funktionsstörungen verwendet werden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Vergleich von Genübertragungstechnologien

Vektor	Insertgröße	Integretion	Transduktionseffizienz	Vorteile	Nachteile
Retrovirus	8 kB	Ja	Hoch	Stabile Transfektion von sich teilenden Zellen	Infiziert nur sich rasch teilende Zellen. Kann onkogen sein.
Adenovirus	< 7,5 kB	Nein	Hoch	Transfiziert nahezu alle Zelltypen, sich teilende oder nicht teilende.	Transiente Expression löst Immunreaktion aus, häufiges humanes Virus.
Adeno-assoziiertes Virus (AAV)	< 4 kB	Ja (Chr. 19)	Hoch	Stabile Transfektion.	Kleine Insert-Größe, Integration kaum verstanden. Helfervirus wird benötigt.
Herpes-Simplex-Virus (HSV)	< 20 kB	Nein	Niedrig	Große Insert-Größe. Neuronenspezifisch.	Transiente Expression, Potential bei Menschen infektiöse HSV auszulösen.
Vaccinia	< 25 kB	Nein	Hoch	Infiziert effektiv eine Vielzahl von Zellen.	Begrenzt auf nicht gegen Pocken geimpfte oder immungeschwächte Personen.
Liposomen	> 20 kB	Nein	N/A	Große Insert-Größe.	Vorübergehende Expression ist von Nachteil kombiniert mit unterschiedlicher Übertragung.
Ballistische ("biollistische") Injektion	> 20 kB	Nein	N/A	Große Insert-Größe.	Benötigt exponiertes Gewebe.
PlasmidDNA-Injektion	> 20 kB	Nein	N/A	Große-Insert-Größe.	Mangelhafte Übertragung. Anhaltende Expression nur in Muskel.

Rekombinante Flock-House-Virus-(FHV)-Proteine, die virale Antigene präsentieren, wurden beschrieben (Tisminetzky, S.G. et al., FEBS Lett. 353:1–4 (1994); Scodeller, E.A. et al., Vaccine, 13:1233–1239 (1995); Buratti, E. et al., J. Immunol. Methods, 197:7–18 (1996); Schiappacassi, M. et al., J. Virol. Methods, 63:121–127 (1997); Buratti, E. et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4:117–12 (1997). Siehe auch Barolle, F.E. et al., veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 96/05293 (1996). Diese früheren Versuche leiden jedoch aufgrund der Deletion von Aminosäureresten in einer oder mehreren Regionen des Capsidproteins unter Schwierigkeiten bei der Bildung eines Virus-ähnlichen Partikels.
Was benötigt wird, sind rekombinante Nodavirus-verwandte Proteine, die heterologe Peptide von 100 Aminosäureresten Länge oder mehr enthalten können, aber dennoch zum Self-Assembly zu chimären Virus-ähnlichen Partikeln fähig sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein chimäres Protein bereit, welches ein Deletionsfreies Flock-House-Virus-Capsidprotein zusammen mit einem in dem Capsidprotein an einer Stelle zwischen Aminosäurerest 205 und Aminosäurerest 209 vom Aminoterminus des Capsidproteins vorhandenen heterologen Peptidsegments bereitstellt. Alle Aminosäurereste, die normalerweise in dem Nodavirus-Capsidprotein vorhanden sind, werden beibehalten. Die Aminosäuresequenz des heterologen Peptidsegments wird aus zellspezifischen Zielsequenzen wie B-Zell-Epitopen, T-Zell-Epitopen und aus Sequenzen, die auf andere Zell-Typen zielen, ausgewählt. Das heterologe Peptidsegment kann eine Größe von bis zu ungefähr 100 Aminosäureresten aufweisen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Nodavirus-System zum Überbringen einer biologisch aktiven Gruppe, wobei das System ein chimäres Capsidprotein umfasst. Die biologisch aktive Gruppe kann ein direktes Immunstimulanz, ein indirektes Immunstimulanz, ein Gen, das für ein direktes Immunstimulanz kodiert, oder ein Gen, das für ein indirektes Immunstimulanz kodiert, sein. Chimäre Proteine wie auch Nodavirus-Partikel, die mit einem antigenen Protein konjugiert sind, können auch als effektive Immunstimulanzien oder Immunmodulatoren dienen und sind nützlich für diagnostische wie auch immunisierende Zwecke.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde der oben beschriebene Bedarf an nicht-pathogenen Vektoren durch ein neues, auf Viral-ähnliche gestütztes System erfüllt, das therapeutische Zusammensetzungen einschließlich Impfstoffe wie auch diagnostische Ausführungsformen wie diagnostische Kits bereitstellt. Das Flock-House-Virus (FHV) ist solch ein Nodavirus, das verwendet werden kann, um Virus-ähnliche Partikel genetisch zu modifizieren, die auf ihrer Oberfläche antigene Peptide tragen. Die Grundlage für dieses System stützt sich auf die bemerkenswerte funktionelle Vielfältigkeit des FHV-Capsidproteins. Eine ausgedehnte, rechnergestützte chemische Analyse der hoch aufgelösten atomaren Struktur des FHV führte zur Identifizierung einer Region im Capsidprotein, die für die Insertion heterologer Peptidsegmente zugänglich ist, ohne den Zusammenbau der viralen Hülle oder des Capsids zu beeinträchtigen. Die Vorhersagen aus den strukturellen und rechnergestützten Untersuchungen wurden verwendet, um genetisch FHV-ähnliche, chimäre, Virus-ähnliche Partikel zu konstruieren, die genau definierte antigene Determinanten als inserierte heterologe Peptide enthalten. Diese inserierten heterologen Peptide enthalten B-Zell-Epitope, die auf der Oberfläche des Trägers in der korrekten Konformation präsentiert werden, um eine humorale Antwort zu erzeugen. Andere heterologe Peptidsegmente wie jene, die T-Zell-Epitope enthalten, wurden auf der Oberfläche solcher chimärer Virus-ähnlicher Partikel exprimiert, wodurch eine Struktur erzeugt wird, die eine proliferative und CTL-Antwort generiert. Heterologe Peptidsegmente, die zusammenhängende B-Zell-Epitope und T-Zell-Epitope umfassen, die unter Ausbildung chimärer Proteine inseriert sind, zeigten eine erhöhte Immunogenität.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Zeichnungen,
zeigt 1 die Tertiärstruktur der FHV-Hüllprotein-Untereinheit.
zeigt 2 die vorhergesagte Sekundärstruktur, die das Enkapsidierungssignal in RNA2 zahlreicher Nodaviren darstellt.
zeigt 3 das Pfropfen des FHV-Enkapsidierungssignals an das Ende eines Gens von therapeutischem Interesse, humanem Interferon-γ.
zeigt 4 die p2BS(+)-wt-Sequenz, die das RNA2-Insert unmittelbar flankiert, bestimmt durch Sequenzieren der Enden von p2BS(+)-wt, p2BS(+)-RNA2:VSV-G #1, p2BS(+)-RNA2:BRSV #1.
zeigt 5 die Sequenz des p2BS(+)-RNA2:VSV-G-Konstrukts.
zeigt 6 die Sequenzen des mutagenen RNA2:VSV-G-Primers und der Hybridisierungssonde.
zeigt 7 die Sequenz der p2BS(+)-RNA2:BRSV-Konstrukte.
zeigt 8 die Sequenz des mutagenen RNA2:BRSV-Primers.
zeigt 9 das Schema der Konstruktion der pVL1392-RNA2-, pVL1392-RNA2:VSV-G- und pVL1392-RNA2:BRSV-Baculovirus-Expressionsvektoren.
zeigt 10 die Sequenzen der Primer zum Subklonieren der RNA2-Konstrukte in pVL1392.
zeigt 11 die Sequenzen der p2BS(+)-RNA2:HBV-Konstrukte.
zeigt 12 das Schema der Konstruktion des funktionellen RNA2:CSP-Fusionskonstrukts.
zeigt 13 die Sequenzen von RNA2 und anderer Sequenzierprimer.
zeigt 14 eine elektronenmikroskopische Aufnahme chimärer FHV-Partikel mit einem VSV-Epitop, das in das Hüllprotein inseriert ist. Ein Epitop wurde vom Vesikuläre-Stomatitis-Virus (VSV) abgeleitet, um ein chimäres FHV:VSV-Partikel zu erzeugen. Das Epitop Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys (SEQ ID NO: 1) wurde in das FHV-Hüllprotein-Gen inseriert und in das Baculovirus-Expressionssystem eingebracht. Bild A zeigt chimäre, virusähnliche Partikel, die aus Baculovirus-infizierten S.-frugiperda-Zellen isoliert wurden und einer Elektronenmikroskopaufnahme unter Verwendung von Standard-Negativfärbungsbedingungen unterzogen wurden (Vergrößerung × 39000). Beachte die ikosaedrische Form der stabilen, chimären Virionen. Bild B zeigt chimäre FHV:VSV-Partikel, die aus Baculovirus-infizierten S.-frugiperda-Zellen isoliert und einer immunelektronenmikroskopischen Aufnahme unterzogen wurden (Vergrößerung × 39000). Die chimären FHV:VSV-Partikel sind mit dem monoklonalen Antikörper P5D4 (MAb P5D4) gegen das oben erwähnte VSV-Epitop von 11 Resten (SEQ ID NO: 1) belegt, das in das FHV-Hüllprotein inseriert worden war. MAb P5D4 ist vom Subtyp IgG₁κ, und man kann es an das VSV-Epitop binden sehen, was den chimären Partikeln eine dunkle, Halo-ähn liche Erscheinung gibt. Der Antikörper induziert auch eine schwache Aggregation aufgrund des Vorhandenseins von IgG.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung verwendet ein Mitglied der Nodaviridae-Virusfamilie, gemeinhin bekannt als Nodaviren, wie jene unten in Tabelle 2 aufgeführten, um chimäre Proteine zu erzeugen, die zum Self-Assembly zu chimären, virusähnlichen Partikeln befähigt sind. TABELLE 2: Nodaviren

Mitglied	Propagieren in Zellkultur	Protein-Expressionssysteme
Nodamura-Virus (NV)	BHK-21, Moskitozellen	Baculovirus- und E.-coli-Expressionssysteme
Flock-House-Virus (FHV) Black-Beetle-Virus (BBV) Boolarra-Virus (BoV) Gypsy-Moth-Virus (GMV) Manawatu-Virus (MwV)	Drosophila-Zellen, Black-Beetle-Zellen, Protoplasten	Baculovirus- und E.-coli-Expressionssysteme

Dieses Nodavirus ist das Flock-House-Virus (FHV).
Die Struktur des Flock-House-Virus-Hüllproteins, auch bekannt als das Capsidprotein, ist in 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz, von links nach rechts in der Richtung vom Amino- oder N-Terminus zum Carboxy- oder C-Terminus dieses Proteins ist wie folgt:
Die Nukleotidsequenz für die vorgenannte Aminosäuresequenz ist bekannt und ist beschrieben bei Dasgupta, R. et al., Nucleic Acids Res. 17(18):7525–7526 (1989).
Der Kern der Struktur wird von achtsträngigen anti-parallelen Beta-Barrels gebildet, wie man sie in vielen anderen viralen Capsidproteinen sieht. Die helikale Do mäne wird von 3 alpha-Helices gebildet, die durch die Polypeptidkette gebildet und in der Reihenfolge 'N'- und 'C'-terminal zu dem Beta-Barrel angeordnet sind. Die Helix ist das Gamma-Peptid, eines der Spaltprodukte. Eine Region zwischen Aminosäuren 205–209 vom "N"-Terminus bildet eine Schleife, die auf der äußeren Oberfläche des assemblierten Capsids exponiert wird. Die gebildete Schleife befindet sich zwischen den βE-βF-Strängen eines Beta-Barrels. Die Insertion selbst bildet ein Paar aus β-Strängen, βE'-β'', mit einer kurzen Schleife dazwischen wie man in 1 sehen kann.
Das innerhalb des Capsids enthaltene FHV-Genom enthält zwei Messenger-Sense-RNA-Moleküle, RNA 1 und RNA 2 (Schneemann, A. et al., 1993. In W. Doerfler und P. Bhm (Hrsg.), Viral Strategies, Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, S. 167–176). RNA 1 (3,1 kb) regelt die Synthese von Protein A (102 kDa), der mutmaßlichen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (Fisher, A.J. und J.E. Johnson. 1993. Nature (London) 361:176–179). RNA 2 (1,4 kb) kodiert für Protein-alpha (43 kDa), den Precursor des Hüllproteins (Gallagher, T.M. und R.R. Rueckert, 1988. J. Virol. 62:3399–3406). Zusätzlich zu den genomischen RNAs enthalten infizierte Zellen auch eine subgenomische RNA3 (0,4 kb), die vom 3'-Ende der RNA1 abgeleitet ist. Sie kodiert für Protein B (10 kDa), dessen Funktion es ist, die Replikation zu modulieren (Ball, L.A. (1994) PNAS 91:12443–12447; Ball, L.A. (1995) J. Virol. 69:720–727).
Eine bestimmte Region der FHV-RNA2 (Basen 186–217) weist eine vorhergesagte Stamm-Schleifen-Struktur auf (2), die als das Verpackungssignal für die in vivo-Enkapsidierung der RNA 2 dient (Zhong, W., Dasgupta, R. und Rueckert, R. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11146–11150). Ähnliche Regionen der anderen nodaviralen RNA2-Sequenzen sind auch in 2 gezeigt und dienen einer identischen Funktion. Man nimmt an, dass der initiale Schritt die Bildung eines Nukleationskomplexes bedingt, in welchem eine Hüllprotein-Substruktur mit diesem Enkapsidierungssignal auf der viralen RNA interagiert. Der Initiationskomplex kann sich dann durch Hinzufügung von Hüllprotein-Untereinheiten, die durch Bindung an die virale RNA in die wachsende Hülle geleitet werden, zu einem sphärischen Partikel vermehren.
Flock-House-Virus (FHV) kann in Drosophila-Zellkultur zu hohen Titern angezogen werden, wobei die Synthese von Protein A und B bei ungefähr 5 Stunden bzw. 8 Stunden ihren Spitzenwert erreicht (Schneemann, A. et al., 1993. In W. Doerfler und P. Bhm (Hrsg.), Viral Strategies, Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, S. 167–176).
Im Gegensatz dazu bleibt die Synthese von Protein-alpha während der ersten 12 Stunden niedrig, aber steigt danach mit einem Spitzenwert der Produktion bei ungefähr 15 Stunden rasch an. Die neu synthetisierten Alpha-Ketten werden innerhalb von Minuten zu labilen Precursor-Partikeln, genannt Provirionen, assembliert. Provirionen enthalten 180 Alpha-Untereinheiten, in ikosaedrischer Symmetrie angeordnet, wie auch eine Kopie jedes der genomischen RNA-Moleküle. Der Assembly-Vorgang löst eine autoproteolytische Reaktion in der 407 Aminosäuren langen Alpha-Kette aus, was zur Spaltung zwischen Asparagin 363 und Alanin 364 führt (Hosur, M.V. et al., 1987. Proteins: Struc. Funct. Genet. 2:167–176; Fisher, A.J. und J.E. Johnson. 1993. Nature (London) 361:176–179).
Die neu geformten Polypeptide beta (38 kDa, 363 Aminosäuren) und gamma (5 kDa, 44 Aminosäuren), bleiben mit dem reifen Virion assoziiert.
Nach der Injektion von Wildtyp-FHV tritt eine Antikörperbildung ohne Symptome oder Krankheitserscheinungen bei Schweinen, erwachsenen Mäusen, Kaninchen, Meerschweinchen, syrischen Hamstern und Hühnern auf. Außerdem gibt es keine Cytopathologie in Säugetierzellkulturlinien, einschließlich Nierenzellen von Primaten und humanen Amnionzellen (Hendry, D.A. 1991. In Viruses of Invertebrates (Hrsg. E. Kurstak) Marcel Dekker, Inc.: New York).
Die Struktur von FHV wurde mit atomarer Auflösung gelöst und zeigt, dass das virale Capsid aus 60 dreieckigen Einheiten zusammengesetzt ist, die aus drei identischen Polypeptiden bestehen, die in ikosaedrischer Symmetrie verbunden sind (Hosur, M.V. et al., 1987. Struc. Funct. Genet. 2:167–176). Alle drei Untereinheiten, bezeichnet als A, B und C, enthalten ein zentrales Beta-Barrel-Motiv ähnlich zu dem, das bei vielen anderen Virusstrukturen beobachtet wird (Rossmann, M.G. und J.E. Johnson. 1989. Ann. Rev. Biochem. 58:533–573). Die äußere Oberfläche besteht aus komplizierten Schleifen zwischen den Beta-Strängen, und die innere Oberfläche wird von helikalen Domänen aus den Amino- und Carboxy-terminalen Enden des Proteins gebildet. Die helikale Domäne, die durch das Amino-terminale Ende des Proteins gebildet wird, ist nur bei den C-Untereinheiten sichtbar, bei denen die Aminosäurereste 20–30 einen geordneten Peptid-"Arm" darstellen. Bei den A- und B-Untereinheiten ist das Amino-terminale Ende ungeordnet und in der Elektronendichtekarte nicht sichtbar. Diese Variation führt zu einem signifikanten Unterschied in den Untereinheitenkontakten über die ikosaedrischen zweifachen und quasi-zweifachen Achsen. Während die Interaktion zwischen den Proteinunterein heiten über die quasi-zweifachen Achsen (A/A₂ und C/B₅) abgewinkelt sind, sind die Interaktionen über die zweifachen Achsen (C/B₂ und C₂/B) eben. Dies liegt daran, dass der Peptidarm in den C-Untereinheiten in das Scharnier zwischen den Untereinheiten hineinfaltet, was sie daran hindert, den Diederwinkel auszubilden, den man an den quasi-zweifachen Achsen beobachtet. Außerdem wird die ebene Verbindung an den zweifachen Achsen durch ein Segment genomischer RNA stabilisiert, die einen Teil zwischen den C/C₂-Verbindungen, aber nicht zwischen den A/B₅-Verbindungen ausbildet.
Die Alpha-Protein-Spaltstelle ist tief innerhalb des Virions in der Nähe des RNA-Kerns lokalisiert, was ihre Unzugänglichkeit für Proteinase-Inhibitoren und Virus-präzipitierende Antikörper erklärt. Das Spaltprodukt gamma (carboxyterminale Reste 364–407) ist im Inneren des Partikels lokalisiert und bildet eine amphipathische Helix. An den zweifachen Symmetrieachsen interagieren die Gamma-Helices mit der geordneten Duplex-RNA, während sie an den fünffachen Achsen ein pentameres, helikales Bündel bilden, das durch Interaktionen zwischen den hydrophilen Oberflächen der Helices stabilisiert wird (Cheng, H.R. et al. 1994. Structure 2:271–282).
Identifikation der Insertionsstelle für fremde Sequenzen in das FHV-Genom
Eine rechnergestützte, chemische Analyse der hochaufgelösten, atomaren Struktur von FHV und eine molekulargenetische Analyse des Genoms führte zur Identifikation der Regionen in den Hüllproteinuntereinheiten, die für eine Insertionsmutagenese von bis zu ungefähr 100 Aminosäuren zugänglich sind, ohne das virale Assembly zu beeinträchtigen. Diese Region des Hüllproteins umfasst Aminosäuren 205–209 und ist eine Schleife, die auf der Virusoberfläche gut exponiert ist (1). Entsprechende Schleifen können auf der Oberfläche jedes der anderen Nodavirus-Familienmitglieder gefunden werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist eine bestimmte Position innerhalb des FHV-Hüllproteingens zugänglich für die Insertion fremder Sequenzen von bis zu ungefähr 300 Basenpaaren (bis zu ungefähr 100 Aminosäurereste), die den viralen Assemblierungsvorgang nicht unterbrechen. Diese Position liegt zwischen benachbarten Beta-Barrels der Proteinkernstruktur wie oben beschrieben.
Diese Erfindung stellt Verfahren zum Erzeugen der chimären, FHV-ähnlichen Proteine wie auch diagnostische und therapeutische Verwendungen der Proteine bereit.
FHV-ähnliche, multivalente chimäre Proteine zusammen mit dem inserierten, heterologen Peptidsegment stellen mehr als ein zellspezifisches Signal bereit. Zum Beispiel umfasst das F-Protein aus bovinem respiratorischem Syncytialvirus (BRSV) sowohl ein B-Zell-Epitop als auch ein T-Zell-Epitop (Tabelle 3). Solche multivalenten, chimären Proteine können in hohen Titern erzeugt werden, vorzugsweise wenn sie in das Baculovirus-Expressionssystem eingebracht werden.
Multivalente, chimäre Virus-ähnliche Partikel wiederum können durch die Expression und das Assembly eines multivalenten, chimären Proteins im Baculovirus-Expressionssystem erzeugt werden. Alternativ können multivalente, chimäre Virus-ähnliche Partikel, die wenigstens zwei chimäre Proteine umfassen, in einem Baculovirus co-exprimiert und assembliert werden. Jedes der co-exprimierten, chimären Proteine enthält ein inseriertes, heterologes Peptidsegment, das wenigstens ein zellspezifisches Signal bereitstellt.
Die maximale Größe einer Peptid-kodierenden Sequenz beträgt ungefähr 300 Basenpaare, was zur Insertion eines fremden oder heterologen Peptidsegments von ungefähr 100 Aminosäuren führt. Die Sequenzzusammensetzung dieser Region des chimären Hüllproteingens ist:
5' CGAACTGGTGGCTGG...(n)_~300...ATCTGTTGCAACCGG 3'
wobei die 15 Basen an den 5'- und 3'-Enden des Oligonukleotids komplementär zu Basen 629–643 und 644–658 der RNA-2-Botenstrangsequenz sind und (n)_~300 eine Abfolge von ungefähr 300 Nukleotiden darstellt, die für die zu exprimierende Peptidsegmentsequenz kodieren.
Da 180 Kopien des Hüllproteins in jedem einzelnen Partikel vorhanden sind, beträgt die maximale theoretische Anzahl "N" unterschiedlicher Epitope, die auf der Oberfläche eines Partikels präsentiert werden können, N ≤ 180. In der Praxis kann es jedoch technisch vorteilhaft sein, die Anzahl unterschiedlicher Epitope, die auf der Oberfläche eines beliebigen Partikels vorhanden sind, auf N ≤ 30 zu begrenzen (d.h. auf nicht mehr als sechs verschiedene Epitope auf einem beliebigen Partikel), um eine Verringerung der molekularen Masse eines beliebigen definierten Epitops auf einen Wert unterhalb eines beliebigen minimalen Schwellenwerts zu verhindern, der notwendig ist, um eine ausreichende Immunantwort zu induzieren.
Es scheint keine anderen Restriktionen für die Insertion als die Größe zu geben, obwohl posttranslationale Modifikationen in dem System die Antigenität beeinflussen können. Während das Hüllprotein keine Glykosylierungssignale oder Disulfidbindungen aufweist, modifizieren Insektenzelllinien, in denen das Virus propagiert werden kann, wie jene, in denen Baculovirus exprimiert wird, Proteine translational auf eine sehr ähnliche Weise wie die bei Säugetieren beobachtete. In den unten gezeigten, nicht-einschränkenden Beispielen wurden Epitope ausgewählt, die keine Glykosylierungsstellen oder Cysteine aufweisen, bei denen die Bildung von Disulfidbindungen erwartet werden kann. Nichtsdestoweniger ist dieses System auch bei Epitopen wirksam, die solche posttranslationalen Veränderungen, die für korrekte Antigenität notwendig sind, benötigen. Außerdem können bakterielle Expressionssysteme verwendet werden, um die Chimären zu erzeugen, bei denen Epitope inseriert worden sind, die keine posttranslationalen Änderungen benötigen, da bakterielle Systeme zu posttranslationalen Modifikationen von Proteinen nicht fähig sind.
Die molekulare Konstruktion der chimären Hüllproteingene kann durch Oligonukleotid-vermittelte Einzelstrangplasmid-DNA-Mutagenese (Kunkel, T.A. 1985. PNAS 82:488–492; Kunkel, T.A., Roberts, J.D., und Zakour, R.A., 1987. Meth. Enzymol. 154:367–382) erzielt werden. Dieses Schema bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die spezifisch verändert werden kann, indem man innerhalb eines Oligonukleotids die erwünschte Sequenzänderung synthetisiert und dann dieses in einen biologisch aktiven zirkulären DNA-Strang konvertiert, indem man das Oligonukleotid als Primer für die in vitro-Synthese auf einer einzelsträngigen, zirkulären DNA-Matrize verwendet.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Einschränkungen der Oligonukleotid-vermittelten Einzel-Schritt-Einzelstrang-Plasmid-DNA-Mutagenese deutlich werden, wenn man versucht Primer zu erzeugen, die viel länger als ungefähr 100 Basen sind, können wie oben gesagt, andere molekulare Verfahren vom Fachmann auf dem Gebiet der molekularen Genetik verwendet werden, um Insertionen zu erzeugen, die größer als ungefähr 100 Basen sind.
PCR-basierte Verfahren können verwendet werden, die drei Primer benötigen: Zwei flankierende Primer, die sich an Regionen stromaufwärts und stromabwärts zur Mutationsstelle anlagern, und einen mutagenen Primer. Die Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primer werden konstant gehalten, während sich der mutagene Pri mer bei jeder Mutagenese ändert. Abwandlungen erlauben Substitutions-, Deletions- und Insertionsmutagenese. Das Megaprimerverfahren der positionsgerichteten Mutagenese ("site directed mutagenesis") wurde mit Megaprimern von einer Länge größer als 800 bp erfolgreich durchgeführt (Sarkar, G. und S.S. Sommer. 1990. BioTechniques 8:404–407; Picard, V.E. et al. 1994. Nucleic Acids Res. 22:2587–2591). Um Mutationen in dieser Region des cDNA-Klons des FHV-Hüllproteins zu platzieren, benötigt man einen Megaprimer, der maximal ungefähr 700 Basenpaare enthält.
Zur Insertionsmutagenese von Genen kann ein PCR-basiertes Verfahren verwendet werden, das vier Primer benötigt: zwei flankierende Primer an den 5'- und 3'-Enden des Gens mit geeigneten, hineinkonstruierten Restriktionsstellen zum Primen, die sich an Regionen stromaufwärts und stromabwärts zur Mutationsstelle anlagern, und zwei mutagene Primer. Die Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primer werden konstant gelassen, während sich die mutagenen Primer bei jeder Mutagenese ändern. Ungefähr 15 bis 20 Basen jedes mutagenen Primers ist komplementär zur Wildtyp-Sequenz, und der Rest stellt die Insertionssequenz dar.
Bei diesem speziellen Schema wird der zur FHV-Wildtyp-Sequenz komplementäre 5'-PCR-Primer in eine Reaktion mit einem 3'-Primer gegeben, der 15–20 zur FHV-Wildtyp-Sequenz komplementäre Basen aufweist, die in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Molekularbiologie direkt proximal zur Insertionssequenz liegen. In einer zweiten Reaktion wird ein 3'-PCR-Primer verwendet, der komplementär zu der Wildtyp-Sequenz ist, die direkt distal zum Komplement der Insertionssequenz in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Molekularbiologie liegt. Diese zwei separaten PCR-Vervielfältigungen werden durchgeführt, und die resultierenden PCR-Produkte werden gereinigt und einer dritten PCR-Runde unterzogen. In dieser dritten PCR-Runde werden beide PCR-Produkte mit den 5'- und 3'-flankierenden Primern kombiniert, die komplementär zur Wildtyp-Sequenz sind. Bei dieser dritten PCR-Runde werden keine mutagenen Primer verwendet. In den anfänglichen Zyklen dieser letzten PCR lagern sich die Insertionssequenz und ihr Komplement aneinander und erzeugen eine chimäre Volllängenmatrize, die in den nachfolgenden PCR-Runden vervielfältigt wird. Die folgenden Bedingungen sind für alle Reaktionen typisch:

Zyklus 1: Denaturieren bei 94°C für drei Minuten.
Zyklen 2–30: Denaturieren bei 94°C für eine Minute und 30 Sekunden.
Anlagerung bei 53°C für eine Minute.
Verlängerung bei 72°C für zwei Minuten.
Zyklus 31: Verlängerung bei 72°C für sieben Minuten.
Zyklus 32: Halten bei 4°C, bis die Proben gereinigt und untersucht werden.

Um sicherzustellen, dass die Sequenzänderungen, die während der PCR erzeugt werden, auf jene beschränkt sind, die durch die mutagenen Primer eingeführt werden, wird eine thermostabile DNA-Polymerase, die Korrekturlese-Fähigkeiten ("proof-reading") aufweist, z.B. Pfu-Polymerase, verwendet (Marini, F. III. et al. 1993. Nucleic Acids Res. 21:2277–2278). Solche Polymerasen haben den zusätzlichen Vorteil, dass ihnen die terminale Transferaseaktivität fehlt, die üblicherweise zu einer Hinzufügung von nicht durch die Matrize kodierten Basen am 3'-Ende der vervielfältigten DNA-Produkte führt. Die Anzahl der PCR-Zyklen wird auf ein Minimum beschränkt, um die Möglichkeit des Einführens unerwünschter Sequenzänderungen weiter herabzusetzen. Das endgültige PCR-Produkt wird dann gereinigt, subkloniert und auf das Vorhandensein der erwünschten Mutation getestet.
Andere Verfahren der PCR-basierten Insertionsmutagenese können von den Fachleuten auf dem Gebiet der molekularen Genetik verwendet werden, um die Chimären zu erzeugen.
Das bevorzugte Expressionssystem: Das Baculovirus-Expressionssystem
FHV-ähnliche Partikel werden erzeugt, indem man die chimären FHV-Hüllprotein-Gene in dem Baculovirus-Expressionssystem exprimiert (Vlak, J.M. und Keus, R.J.A. 1990. In Viral Vaccines. Wiley-Liss, Inc., New York. S. 91–128; O'Reilly, D.R., Miller, L.K. und Luckow, V.A., 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. W.H. Freeman und Co., New York). Dies gestattet die großtechnische Produktion chimärer Partikel, die biochemisch gereinigt und zum in vitro- und in vivo-Testen auf ihre Tauglichkeit als Impfstoffe präpariert werden Typische Präparationen ergeben 1–2 mg Partikel pro 6 × 10⁹ infizierter Sf9-Zellen. Ausbeuten von T.-ni.-Zellen können 50 mg pro 10⁹ infizierter Zellen übersteigen.
cDNAs der FHV-RNA 2, die das chimäre Hüllprotein alpha kodieren, werden unter die Kontrolle des Polyhedron-Promotors gesetzt und in das Baculovirus-Genom durch homologe Rekombination eingefügt. Die mRNAs des in dem heterologen System exprimierten Hüllproteins sind bedeutend länger als die 1400 Basen, die die authentische FHV-RNA 2 umfassen. Dies liegt daran, dass der Sequenz von RNA 2 eukaryontische Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale fehlen, die durch die flankierenden Polyhedron-Sequenzen bereitgestellt werden. Die endgültigen Wildtyp-Transkripte sind ungefähr 2100 Basen lang, einschließlich eines poly(A)-Schwanzes, der in authentischer FHV-RNA 2 nicht vorhanden ist. Dieses System wurde ausgiebig getestet, um zu bestimmen, ob ein in der Abwesenheit von RNA 1 und in der Gegenwart einer wesentlich größeren RNA 2 exprimiertes Hüllprotein dazu fähig wäre, zu Partikeln zu assemblieren, die für kristallographische Analysen geeignet sind. Wie erwartet assemblieren die Capsidproteine spontan in Virus-ähnliche Partikel, die sogar die mRNA des Hüllproteins verpacken. Diese Untersuchungen zeigen auch, dass RNA 1, die für die Replikation des FHV-Genoms benötigt wird, für das Virionen-Assembly verzichtbar ist.
Daher ist es bei Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems zur Produktion von FHV-Chimären nicht notwendig, RNA1 zu verwenden. In diesem Fall wurde ein chimäres RNA-2:VSV-Hüllprotein konstruiert und in das Baculovirus-Expressionssystem gesteckt. Deshalb verpacken die Partikel lediglich chimäre RNA2:VSV-RNA.
Aus Klarheitsgründen werden die Begriffe FNV:VSV oder FHV:BRSV BRSV verwendet werden, um die chimären RNA2:VSV- oder RNA2:BRSV-Konstrukte darzustellen.
Wie hierin erörtert, besteht ein optimales Verfahren zur Erzeugung chimärer Hüllproteingene und der resultierenden Partikel darin, das Baculovirus-Expressionssystem zu verwenden. Dies umgeht die Notwendigkeit, die FHV-Replikase bereitzustellen, da die Replikationsmaschinerie durch das Baculovirus-System bereitgestellt wird.
Andere Verfahren können verwendet werden, um chimäre FHV-ähnliche Partikel zu erzeugen. Zum Beispiel können die chimären Proteine durch die Erzeugung heterologer Capsidprotein-RNA gefolgt von der Inokulation von Pflanzensystemen oder durch Transfizieren vieler anderer Zelllinien mit der RNA hergestellt werden. Diese alternativen Systeme sind von der Fähigkeit des FHV abhängig, replizieren zu können, die zu einem gewissen Grad in diesen alternativen Systemen behindert sein kann, da die Insertionsstelle in der Nähe der mutmaßlichen Rezeptorbindungsstelle liegen kann, die bis heute nicht endgültig bestimmt worden ist.
Alternativ können spezialisierte Plasmide, die Kopien der chimären FHV-Capsidprotein-cDNA enthalten, auf eine ähnliche Weise wie hierin erörtert konstruiert und verwendet werden, um Transkripte herzustellen, die ihre eigene Replikation steuern. Durch Einbau eines Phagen-Polymerase-Promotors in dem Stromaufwärts-Primer können die PCR-erzeugten DNAs direkt als Matrizen zur in vitro-Transkription von RNA ohne vorheriges Subklonieren verwendet werden. Dieses Verfahren erzeugt hohe Titer chimärer Nodavirus-Proteine, vorausgesetzt, dass das Replikasetranskript ein normales Aktivitätsniveau aufweist und die Partikel in der speziellen Wirtszelle über Bindung an zelluläre Rezeptoren replizieren können.

In diesen nicht-einschränkenden Beispielen wurden genetisch modifizierte, chimäre FHV-Hüllproteinkonstrukte so hergestellt, dass sie genau definierte Epitope aus den unten in Tabelle 3 aufgeführten Viren enthielten. TABELLE 3: Chimäre Hüllproteinkonstrukte

Virale Epitope	Referenz
Vesikuläre-Stomatitis-Virus (VSV) G-Glykoprotein Viraler Stamm: ts-045 VSV Indiana Serotyp B-Zell-Epitop Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asp Arg Leu Gly Lys (SEQ ID NO: 1)	Kreis, T.E. (1986) EMBO J. 5:931–941 Kolodziej, P.A. & Young, R.A., (1991) Methods Enzymol. 194:508–519
Bovines respiratorisches Syncytial-Virus (BRSV) F-Protein Viraler Stamm: RB94 Zusammenhängende B- und T-Zell-Epitope Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln (SEQ ID NO: 2)	Walravens et al., (1990) J. Gen Virol. 71:3009–3014 Bourgeois et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:1051–1058
Humanes respiratorisches Syncytial-Virus (RSV) F-Protein Viraler Stamm: RSS-2 (Subtyp B) Zusammenhängende B- und T-Zell-Epitope Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln (SEQ ID NO: 3)	Walravens et al., (1990) J. Gen Virol. 71:3009–3014 Bourgeois et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:1051–1058
Humanes respiratorisches Syncytial-Virus (RSV) F-Protein Viraler Stamm: 18537 (Subtyp B) Zusammenhängende B- und T-Zell-Epitope Asp Lys Arg Leu Leu Pro Ile Val Asn Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln (SEQ ID NO: 4)	Walravens et al., (1990) J. Gen Virol. 71:3009–3014 Bourgeois et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:1051–1058

Humanes respiratorisches Syncytial-Virus (RSV) Bovines respiratorisches Syncytial-Virus (BRSV) F-Protein Virale Stämme: RSS-2 (Subtyp A) (RSV) 18537 (Subtyp B) (RSV) RSS-2 (Subtyp A) (BRSV) T-Zell-Epitop Phe Pro Ser Asp Glu Phe [100% Sequenzkonservierung] (SEQ ID NO: 5)	Walravens et al., (1990) J. Gen Virol. 71:3009–3014 Bourgeois et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:1051–1058
Hepatitis B-Virus (HBV) präS2-Reste 132–145 B-Zell-Epitop Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly (SEQ ID NO: 6) * doppelte Chimäre erzeugt mit dem Epitop unten	Neurath, A.R., et al. 1986. Vaccine 4:35. Itoh, Y., et al. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:9174.
Hepatitis-B-Virus (HBV) HBsAg-Reste 178–204 überlappende Th- und CTL-Epitope Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe (SEQ ID NO: 7)	Franco, A., Guidotti, L.G., Hobbs, M.V., Pasquetto, V., und Chisari, F.V. 1997. J. Immunol. im Druck. Greenstein, J.L., et al. 1992. J. Immunol. 148:3970.

Das Nodavirus-System der vorliegenden Erfindung wurde auch als Genübertragungsträgermittel entwickelt, das zur Zielzell-spezifischen Übertragung therapeutischer mRNA-Moleküle fähig ist. Kurz gesagt werden Liganden in die gleiche Region des Hüllproteingens wie zuvor erwähnt eingefügt und zwar unter Verwendung der gleichen Kriterien und Parameter, die chimäre Partikel mit Zielzellspezifität erzeugen.
Ein Pfropfen dieses Verpackungssignals auf Gene von therapeutischem Interesse bewirkt, dass Hybrid-RNA-Moleküle bevorzugt in das Innere jedes chimären Partikels verpackt werden. Da duale oder dreifache Baculovirus-Expressionsvektoren verwendet werden, die eine cDNA mit einem in das Hüllproteingen hineinkonstruierten Liganden und eine andere Hybrid-cDNA enthalten, welche ein auf ein Verpackungssignal gepfropftes therapeutisches Gen enthält, enthält jeder aus der Baculovirus-Expression resultierende Partikel einen Liganden auf der Oberfläche und das interessierende therapeutische Gen im Inneren. Das Verpackungssignal wird stromabwärts zum 3'-Ende der Gensequenz platziert, da es nur dazu dient, das Gen über RNA-Protein-Wechselwirkungen zwischen dem Verpackungssignal und bestimmten auf der Innenseite des Partikels exponierten Hüllproteinresten an die Innenseite des Partikels anzubinden.
Die Ausführungsformen der Genübertragungsausführungsformen beziehen sich auf die Fähigkeit, ein Virus-ähnliches Partikel mit Liganden auf der Oberfläche und der mRNA eines Gens von therapeutischem Interesse im Inneren zu erzeugen, das vorzugsweise auf der Grundlage seiner Assoziierung mit dem Enkapsidierungssignal enkapsidiert wurde.
Solch ein System wird durch ein Partikel charakterisiert, das aus einem Liganden auf der Oberfläche besteht und eine Kopie der RNA-2-mRNA wie auch ein Polynukleotid enthält, das das RNA-2-Enkapsidierungssignal benachbart zum ausgewählten heterologen Gen enthält.
Die normalen Randbedingungen der Verpackung bei einem solchen Partikel beschränkt das eingeschlossene Polynukleotid auf eine Größe von ungefähr 4500 Basen. Das Wildtyp-Partikel enthält üblicherweise eine Kopie der Wildtyp-RNA-2-Hüllprotein-mRNA, die aus 1400 Basen besteht, und eine Kopie der RNA-1-Polymerase-mRNA, die aus ungefähr 3100 Basen besteht. Da die RNA1 in Zellkultursystemen weggelassen werden kann, kann das Partikel vorzugsweise alles mit einem intakten Enkapsidierungssignal der RNA2 verpacken. Wenn ein chimäres RNA-2-Hüllproteingen, das die normale Sequenz über die Enkapsidierungssignalregion hinweg wie auch die eingefügte Sequenz für den Liganden enthält, zusammen mit einem zweiten Konstrukt, das aus dem RNA-2-Enkapsidierungssignal besteht, das nur auf ein Gen von therapeutischem Interesse gepfropft ist, in Insektenzellen co-transfiziert wird, wird das resultierende Partikel eine Kopie von jeweils der chimären RNA-2-mRNA (ungefähr 1400 Basen) und dem RNA-2-Enkapsidierungssignal:therapeutischem-Gen enthalten. Folglich kann die maximale Größe des therapeutischen Gens ungefähr 3100 Basen betragen, da das Verpackungssignal lediglich ungefähr 30 Basen ausmacht.
Da die RNA-2-Hüllprotein-mRNA nicht verpackt werden muss, weil eine Replikation nicht notwendig ist, wenn konservative Basenaustausche in die Enkapsidierungsregion der RNA-2-cDNA eingeführt werden, die den Liganden enthält, wird sich alternativ das Partikel assemblieren, aber es wird lediglich die RNA-2-Enkapsidierungssignal:therapeutisches-Gen-mRNA und nicht die RNA-2-chimäres Hüllprotein-mRNA verpacken, da die Stamm-Schleifen-Struktur im letzteren Fall nicht zerstört worden ist. Auf diese Weise kann man im Wesentlichen jedes Partikel mit ungefähr 4500 Basen (4,5 kb) Boten-Sense-RNA füllen, die therapeutische Genprodukte darstellen. Diese sind nach Internalisierung und Entfernen der Hülle ("uncoating") des Partikels unmittelbar für die Translation durch zelluläre Ribosomen zugänglich. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass das 5'-Ende des Transkripts als erstes freigesetzt wird, um eine schnelle Translation durch Ribosomen zu ermöglichen.
Die Fähigkeit, Gene von therapeutischem Interesse zu enkapsidieren, gilt auch für das Enkapsidieren von mRNA, die B- oder T-Zell-Epitope kodiert. Insbesondere führt die Fähigkeit, mRNA zu translatieren, die für T-Zell-Epitope kodiert, die T-Zell-Peptide in die Zelle ein, wo sie über den klassischen endogenen Weg prozessiert und in einer Klasse-I-restringierten Weise präsentiert werden können.
Das Genübertragungssystem kann auch verwendet werden, um die Antisensetechnologie aufzunehmen, weil man leicht einen RNA-2-Enkapsidierungssignal:-Antisense-Strang erzeugen und bis zu 4500 Basen an Antisense-Strängen in das Innere jedes Partikels verpacken kann, die gemäß Antisense-Prinzipien funktionieren, sobald sie in das Cytosol freigesetzt werden. Ribozym-Technologie kann auch verwendet werden, um katalytische Ribozymzentren in Antisense-RNAs einzubauen, was die Möglichkeit schafft, Ziel-RNA-Substrate positionsspezifisch zu spalten (Rossi, J.J. 1995. TIBTECH 13: 301–306).
Beispiel 1
Chimäre Nodavirus-Capsidproteine wurden erzeugt, die das B-Zell-Epitop Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys (Tabelle 3, oben, SEQ ID NO: 1) des G-Glycoproteins des Vesikuläre-Stomatitis-Virus (VSV) umfassten. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Antikörper gegen dieses Epitop den Transport von VSV-G stören (Kreis, T.E. 1986. EMBO J. 5:931–941). Dieses Epitop wurde in das FHV-Hüllprotein-Gen hineinkonstruiert und chimäre Partikel wurden nachfolgend verwendet, um in vivo eine antigene Antwort zu zeigen.
Die molekulare Konstruktion dieser chimären Hüllproteingene wurde durch Oligonukleotid-vermittelte Einzelstrang-Plasmid-DNA-Mutagenese erzielt (Kunkel, T.A. 1985. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. PNAS 82:488–492; Kunkel, T.A., Roberts, J.D., und Zakour, R.A. 1987. Rapid and Efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Meth. Enzymol. 154:367–382). Dieses Schema schließt eine DNA-Sequenz ein, die spezifisch verändert werden kann, indem man die erwünschte Sequenzänderung innerhalb eines Oligonukleotids synthetisiert und dann dieses in einen biologisch aktiven zirkulären DNA-Strang dadurch konvertiert, dass man das Oligonukleotid dazu verwendet, eine in vitro-Synthese auf einer einzelsträngigen, zirkulären DNA-Matrize zu primen.
Eine Uridin-haltige ssDNA-Matrize wird erzeugt, indem man M13-Phage in Gegenwart von Uridin anzüchtet. Ein mutagener Primer wird dann an die Matrizen-DNA angelagert, gefolgt von Verlängerung des Primers mit T7-DNA-Polymerase und Ligation, um das Produkt zu zirkularisieren. Dadurch wird ein DNA-Duplex erzeugt, bei dem ein Strang die Originalmatrize ist und Uridin enthält, während der zweite Strang eine Mutante ist und kein Uridin enthält. Eine Transfektion dieser DNA in DH5αF'-Zellen führt zur bevorzugten Verdoppelung der nicht-Uridin-haltigen Mutantenstränge. Wenn transformierte Zellen auf einem Rasen aus untransformierten Zellen ausplattiert werden, enthalten ungefähr 70% der Plaques, die sich entwickeln, die mutierten Sequenzen.
Der für die Transformation und das Phagenwachstum verwendete Bakterienstamm war E. coli DH5αF' [F' f80dlacZDM 15 D(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 hsdR17 (r_k ⁺, m_k ⁺) supE44 1- thi-1 gyrA96 relA1] von Life Technologies (Gaithersburg, MD). E. coli B313/P3 [Hfr PO45 lysA dut ung thi-1 recA spoT1 {P3: Kan^R Amp^R (am) Tet^R (am)] von Invitrogen Corporation (San Diego, CA) wurde für das Wachstum Uridin-haltiger M13-Matrizen-DNA verwendet. Die Mutagenese wurde an Sequenzen durchgeführt, die in M13mp18-Phagen-DNA kloniert waren, die von Life Technologies (Gaithersburg, MD) erhalten wurde.
Das Plasmid p2BS(+)-wt diente als Ausgangsmaterial für Experimente zur ortsspezifischen Mutagenese. Dieses Plasmid war ein modifiziertes pBluescript(+) (Stratagene; San Diego, CA), in den eine 1400 Basenpaarsequenz kloniert wurde, die die gesamte kodierende Region des RNA-2-Gens enthielt. Die für RNA 2 kodierende Sequenz wurde in M13mp18 kloniert, indem zunächst ein Teil davon in pBluescript-KS(+) subkloniert wurde. Die RNA-2-Sequenz enthält eine singuläre AccI-Stelle bei Nukleotid 124 und eine XbaI-Stelle an ihrem 3'-Ende (Nukleotid 1400), die zuvor hineinkonstruiert wurde. Dieses 1276-bp-Fragment wurde in die AccI- und XbaI-Stellen von pBluescript-KS(+) kloniert, was zu einem Plasmid mit einer KpnI-Stelle neben der AccI-Stelle am 5'-Ende der eingefügten Sequenz führt. Die Sequenz wurde dann mit KpnI und XbaI ausgeschnitten und in die korrespondierenden Stellen in die replikative Form (RF) der M13mp18-DNA subkloniert. In den resultierenden M13mp18:RNA2-AccI/XbaI-Klonen enthält der (+)-Strang der Phagen-DNA die Botenstrang-(mRNA)-Sequenz des RNA-2-Gens.
Ein M13mp18:RNA2-AccI/XbaI-Phagenstamm wurde dadurch erzeugt, dass ein Phagenplaque gepickt und in 1 ml LB-Kulturmedium überführt wurde. Um Uridin-haltige M13mp18:RNA2-AccI/XbaI-ssDNA herzustellen, wurden 5 ml Kultur von BW313/P3-Zellen in der mittellogarithmischen Wachstumsphase zusammen mit 100 μl M13mp18:RNA2-AccI/XbaI-Phagenstamm zu 100 ml LB-Kulturmedium hinzugegeben. Die Kultur wurde über Nacht bei 37°C unter starkem Schütteln inkubiert. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 5000 × g pelletiert, und der Phage wurde aus dem Überstand durch Hinzufügen eines Viertelvolumens 15%igen Polyethylenglykols (PEG 8000), 2,5 M NaCl, durch Kühlen auf Eis für eine Stunde und durch Zentrifugation bei 5000 × g für 15 Minuten präzipitiert. Der präzipitierte Phage wurde in 5 ml 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert, für eine Stunde auf Eis gestellt und dann für 30 Minuten bei 5000 × g erneut zentrifugiert, um Fremdkörper zu entfernen. Der Überstand wurde zweimal mit gleichen Volumina Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in Wasser auf 100 μg/ml resuspendiert.
Für die Insertion der unterschiedlichen Peptid-kodierenden Sequenzen zwischen den Basen, die Aminosäuren 207 und 208 der primären RNA-2-Aminosäuresequenz des Capsidproteins kodieren, wurden mutagene Oligonukleotidprimer entworfen. Die mutagenen Primer enthielten 15 Basen, die komplementär zur RNA2-Botenstrangsequenz auf jeder Seite der Insertionsstelle waren, mit einer dazwischen liegenden, zentralen Sequenz, die das zu exprimierende Peptid kodiert. Bis heute betrug die Peptid-kodierende Sequenz bis zu 78 Basenpaare, was mutagene Oligonukleotidprimer mit einer Gesamtlänge von bis zu 108 Basenpaaren ergibt und Peptidinsertionen von bis zu 26 Aminosäuren ergibt. Die Sequenzzusammensetzung der Primer lautete:
5'- CGAACTGGTGGCTGG...(N)₇₈...ATCTGTTGCAACCGG 3'
wobei die 15 Basen an den 5'- und 3'-Enden des Oligonukleotids komplementär zu den Basen 629 bis 643 und 644 bis 658 der RNA2-Botenstrangsequenz in p2BS(+)-wt sind und (n)₇₈ die Anzahl der Nukleotide ist, die die zu exprimierende Peptidsequenz kodieren.
Ein molares Verhältnis des mutagenen Oligonukleotids zur ssDNA-Matrize von 10:1 wurde bei allen Experimenten verwendet. Typische Reaktionen verwendeten 1 μg an M13mp18:RNA2-AccI/XbaI-ssDNA und benötigten deshalb 100–200 ng Primer je nach Primerlänge. Eine für eine Reaktion ausreichende Primerlänge wurde durch Inkubation mit 10 U T4-Polynukleotidkinase in 70 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 2 mM ATP, pH 7,6 bei 37°C für 60 Minuten in einem Volumen von 20 μl phosphoryliert. Die Kinasereaktionen wurden durch Zugabe von EDTA auf 15 mM beendet, gefolgt von Inkubation bei 70°C für 3 Minuten.
Um die phosphorylierten Primer an die Matrizen-DNA anzulagern, wurden 1,25 μl 10 × SSC (10 × SSC ist 1,5 M NaCl, 0,15 M Na₃Citrat·H₂O, pH 7,0) zusammen mit 1 μg M13mp18:RNA2-AccI/XbaI-ssDNA zu der Kinasereaktionsmischung hinzugegeben, und das Volumen wurde auf 40 μl eingestellt. Die Mischung wurde in einem 500 ml-Wasserbad bei 95°C untergetaucht, und die Primer wurden angelagert, indem man das Bad langsam auf Zimmertemperatur abkühlen ließ.
Die angelagerten mutagenen Primer wurden mit T7-DNA-Polymerase verlängert und mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert. Die Synthese und die Ligation wurden gleichzeitig in einem 100-μl-Volumen durchgeführt, das die gesamte Primer-Matrizen-Anlagerungsmischung enthielt: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM ATP, 1 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 0,1 mg Rinderserumalbumin, 10 U T7-DNA-Polymerase und 3 U T4-DNA-Ligase. Die Inkubation bei 37°C dauerte 2 Stunden, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von EDTA auf 15 mM beendet.
Ein 20 μl-Aliquot jeder Reaktion wurde mittels Gelelektrophorese in einem 1,0% Agarosegel analysiert. Erfolgreiche Reaktionen führten zu der Umwandlung von im Wesentlichen der gesamten ssDNA-Matrizen-DNA zur replikativen Form der doppelsträngigen DNA von hohem Molekulargewicht.
Das aus der Primerverlängerungsreaktion verbliebene Produkt wurde mit Ethanol gefällt, getrocknet und in 10 μl Wasser resuspendiert. Kompetente DH5αF'-Zellen wurden gemäß dem Herstellerprotokoll mit 1 μl der resuspendierten Reaktionsproduktmischung transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf einem Rasen aus DH5αF'-Zellen gemäß den Herstellerempfehlungen ausplattiert, und die Platten wurden bei 37°C inkubiert. Phagenplaques wurden innerhalb von 12 Stunden sichtbar.
Mutagenisierte Klone wurden identifiziert und mittels DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Einzelne Phagenplaques wurden isoliert, und ssDNA wurde wie oben beschrieben präpariert. Die DNA wurde unter Verwendung von T7 Sequenase v2.0 (Amersham Life Science; Cleveland, OH) gemäß dem Herstellerprotokoll sequenziert. Die biologische Selektion gegen Uridin-haltige Matrizen-DNA ist sehr stark, und die Effizienz der Mutantengewinnung betrug typischerweise über 70%.
Mutagenisierte Sequenzen aus ausgewählten Klonen wurden für die Subklonierung aus der replikativen Form (RF) doppelsträngiger DNA gewonnen. Mit Phagen infizierte DH5αF'-Zellen wurden wie oben für die Isolierung von ssDNA beschrieben angezogen, und das Zell-Pellet wurde gemäß Standardprotokollen für die Isolierung und die Plasmidbanden-Generierung durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation für die RF-Isolation verarbeitet.
Die RF-DNA wurde mit AccI und XbaI verdaut, und das entstehende RNA2-Fragment, das jetzt eine inserierte Sequenz trägt, wurde zurück in die Original-AccI/XbaI-Stellen in p2BS(+)-wt subkloniert. Alle molekularen Konstrukte wurden einer vollständigen DNA-Sequenzierung und -Analyse vor der Expression unterzogen.
Die FHV-chimären Hüllproteingene wurden dann in dem hocheffizienten Baculovirus-Expressionssystem unter Verwendung von Standardexpressions- und Überprüfungsverfahren exprimiert (Vlak, J.M. und Keus, R.J.A. 1990. In Viral Vaccines. Wiley-Liss, Inc., New York, S. 91–128; O'Reilly, D.R., Miller, L.K. und Luckow, V.A. 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. W.H. Freeman und Co., New York). Das Baculovirus-Expressionssystem hat sich als ein besonders effizientes System zum Erzeugen rekombinanter Proteine erwiesen. Rekombinante Proteine werden üblicherweise in Niveaus hergestellt, die von 0,1% bis 50% des gesamten Insektenproteins reichen. Außerdem ist das Baculovirus-Expressionssystem in Insektenzellen typischerweise dazu in der Lage, die meisten der prozessierenden Ereignisse durchzuführen, die zur Bildung biologisch aktiver, fremder Proteine notwendig sind.
cDNAs von FHV RNA 2, die entweder Wildtyp oder chimäres Hüllprotein-alpha kodieren, wurden unter die Kontrolle des Baculovirus-Polyhedron-Promotors gestellt und durch homologe Rekombination in das Baculovirusgenom eingefügt. Die mRNAs des in dem heterologen System exprimierten Hüllproteins sind länger als die 1400 Basen, die die authentische FHV RNA 2 umfassen. Dies liegt daran, dass der Sequenz der RNA 2 eukaryontische Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale fehlen, die durch die flankierenden Polyhedronsequenzen bereitgestellt werden. Die endgültigen Wildtyp-Transkripte sind ungefähr 2100 Basen lang, einschließlich eines poly(A)-Schwanzes, der in authentischer FHV RNA 2 nicht vorhanden ist. Dieses System erzeugt in der Abwesenheit von RNA 1 und in der Gegenwart einer signifikant größeren RNA 2 hohe Ausbeuten an Partikeln (Schneemann, A. et al. 1993. J. Virol. 67:2756–2763).
Rekombinante Baculoviren, die die cDNAs des chimären FHV-Hüllproteins enthalten, wurden durch Co-Transfektion der RNA-2-cDNA mit linearisiertem Wildtyp-Autographa-californica-mononukleärem Polyhedrosis-Virus (AcMNPV) in ein Monolayer aus 2 × 10⁶ S.-frugiperda-Zellen erzeugt. Die Zellen wurden mit 1 ml TMN-FH-Medium bedeckt (Pharmingen, San Diego, CA). Die RNA-2-cDNA und die baculovirale DNA wurden in 30 μg Lipofectin gemischt und auf ein Gesamtvolumen von 100 μl gebracht. Diese Transfektionsmischung wurde tropfenweise zu 1 ml Medium hinzugegeben, das die Zellen bedeckte. Nach 4 Stunden Inkubation bei 27°C wurde das Medium entfernt und durch frisches TMN-FH-Medium ersetzt. Einzelne rekombinante Viren wurden durch mehrere Runden Plaquereinigung isoliert. Die isolierten Rekombinanten wurden bis zu einem Titer vervielfältigt, der 10⁸ pfu/ml überstieg.
Die chimären FHV-Partikel, die die interessierenden Epitope enthielten, wurden aus rekombinanten, mit Baculovirus infizierten Zellen 4–7 Tage nach Infektion gereinigt. Die Zellen wurden in Gegenwart von 0,5% NP-40 und 0,1% 2-Mercaptoethanol (2-ME) lysiert. Nach Inkubation für 15 Minuten auf Eis wurden die Zelltrümmer bei 10.000 UpM in einer Beckman GS-15R-Zentrifuge sedimentiert. Der Überstand wurde mit RNase A in einer Endkonzentration von 10 μg/ml bei 27°C für 30 Minuten behandelt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 g, um jedwedes partikuläre Material zu entfernen. Der resultierende Überstand, der die Partikel enthielt, wurde auf ein 30%iges (w/w) Saccharosekissen geschichtet, das 50 mM Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure) (pH 7,0), 0,1% 2-ME und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt. Die Partikel wurden in einem Beckman JS 24.15-Rotor bei 100.000 g für 2,5 Stunden bei 7°C durch das Saccharosekissen sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Sediment, das die Viruspartikel enthielt, wurde in 50 mM Hepes und 0,1% 2-ME resuspendiert. Die Suspension wurde auf 15 ml eines linearen 10–40%igen (w/w) Saccharosegradienten geschichtet und in einem JS 24.15-Rotor bei 100.000 g bei 7°C für 1,5 Stunden sedimentiert. Für analytische Präparationen wurde der Gradient auf einem ISCO-Gradientenfraktionator bei 0,75 ml/Minute und 0,5 Minuten pro Fraktion fraktioniert. Fraktionen, die entsprechend der gemessenen optischen Dichte Viruspartikel enthielten, wurden bei 4°C gelagert oder bei –20°C eingefroren. Für größere Präparationen war keine Fraktionierung notwendig. Stattdessen konnte nach der Zentrifugation eine virale Bande im oberen Drittel des Gradienten beobachtet werden. Eine mit einer Spritze verbundene 18-Gauge-Nadel wurde dann verwendet, um das Röhrchen zu punktieren und die Virusfraktion zu entnehmen.
Für sehr große Ausbeuten in SF9- oder T.-ni.-Zellen wurden die chimären FHV-Partikel, die die Epitope von Interesse enthielten, aus rekombinanten, mit Baculovirus infizierten Zellen 7 Tage nach Infektion gereinigt. Die Zellen wurden in Gegenwart von 0,5% NP-40 und 0,1% 2-ME lysiert. Nach Inkubation für 15 Minuten auf Eis wurden die Zelltrümmer in einer Beckman GS-15R-Zentrifuge bei 10.000 UpM pelletiert. Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000) wurde zu dem resultierenden Überstand in einer Endkonzentration von 8% und NaCl in einer Endkonzentration von 0,2 M hinzugegeben. Die Suspension wurde für eine Stunde auf Eis gemischt, wobei sich während dieser Zeit das PEG 8000 auflöste. Die trübe Suspension wurde für 10 Minuten bei 14.000 g zentrifugiert, und das Sediment wurde in 20 ml Hepes-Puffer (pH 7,0) resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 14.000 g entfernt. Der Überstand wurde entnommen und aufbewahrt. Das PEG-Sediment wurde zwei weitere Male mit 20-ml-Aliquots Hepes-Puffer resuspendiert, gefolgt von Zentrifugation. Die Überstände wurden vereinigt und auf einen linearen 10–40%igen (w/w) Saccharosegradienten geschichtet und wie oben erläutert gereinigt.
Ein optionaler zusätzlicher Reinigungsschritt kann verwendet werden, bei dem die aus dem Saccharosegradienten isolierten Partikel 4-fach mit 50 mM Hepes (pH 7,0 und 0,1% 2-ME verdünnt und durch 15 ml eines 20–45%igen (w/w) CsCl-Gradienten in Hepes (pH 7,0) und 0,1% 2-ME in einem JS 24.15 oder einem vergleichbaren Rotor bei 100.000 g für 16 Stunden bei 7°C pelletiert werden.
Die isolierten Partikel werden ausgiebig gegen Hepes-Puffer (pH 7,0) dialysiert, um die Saccharose oder CsCl zu entfernen. Die Chargen zum Testen an Tieren wurden filtersterilisiert und bei –20°C gelagert.
Die Analyse der chimären Nodavirus-Partikel wurde mit zwei grundlegenden Verfahren durchgeführt. Ein Verfahren benutzt einen Western Blot, der immunchemische Reagenzien verwendet, um bestimmte Proteine von Interesse nachzuweisen. 180 Kopien der neu synthetisierten Hüllproteinmoleküle werden innerhalb von Minuten in labile Precursor-Partikel assembliert, die man Provirionen nennt. Der Assembly-Vorgang löst eine spontane chemische Reaktion aus, die das unreife Hüllprotein in zwei kleinere spaltet, die beide Teil des reifen Virions (des Viruspartikels) bleiben. Das Vorhandensein einer 43-kDa-Bande (ungespalten), einer 38-kDa-Bande (beta) und einer 5 kDa-Bande (gamma) zeigen an, dass die Partikel assembliert sind. Nach wenigen Tagen ist das meiste des ungespaltenen Produkts verschwunden, und zu diesem Zeitpunkt sind nur Hauptbanden von 38 kDa und 5 kDa nachweisbar. Ein nennenswerter Teil früherer Arbeiten hat gezeigt, dass dieser Spaltvorgang nur bei Partikeln auftritt, die assembliert sind (Gallagher, T.M. und R.R. Rueckert. 1988. J. Virol. 62:3399–3406; Schneemann, A. et al. 1992. J. Virol. 66:6728–6734).
Die im Baculovirussystem erzeugten FHV:VSV-Chimären wurden durch Western-Analyse analysiert. Proteine aus Sf-Zellen, die mit rekombinantem Baculovirus infiziert waren, der RNA2:VSV enthielt, wurden isoliert und mittels Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Immunblots mit Antikörpern analysiert, die gegen das Capsidprotein und die erwünschten Peptide gerichtet waren. Die gegen normale FHV-Sequenzen gerichteten Antikörper weisen diese Banden nach, und Antikörper, die gegen die inserierten Sequenzen gerichtet sind, weisen die entsprechenden inserierten Epitope innerhalb des Kontexts des Hüllproteins nach. Diese immunchemischen Experimente zeigen, dass die Spaltprodukte alle vorhanden sind, die aufgrund der inserierten Sequenz geringfügig größer als normal sind, und bestätigen, dass die chimären Partikel assembliert sind.
Bei einer anderen Weise der Bestätigung wurden die chimären Virus-ähnlichen Partikel unter Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie untersucht, um ihre allgemeine Geometrie und Größe zu bestimmen (Harris, J.R. 1991. Electron microscopy in biology. A practical approach. The practical approach series. Oxford University Press, New York).
Zur Negativfärbungsanalyse wurde ein Tropfen einer Suspension des chimären Viruspartikels auf ein glimmentladenes, mit Formvar-Kohle beschichtetes, 300–400 mesh Kupfernetz aufgetragen. In 1–2 Minuten wurde der Überschuss an Flüssigkeit teilweise geblottet, gefolgt von dreimaligem Waschen in Puffertropfen. Das Netz wurde dann zweimal benetzt und mit einem dritten Tropfen wässriger, 1%iger Uranylacetat-Lösung (Ted Pella Inc.), die durch einen 0,2 mm Millipore-Filter filtriert worden war, für eine Minute inkubiert. Die überschüssige Flüssigkeit wurde teilweise geblottet, und das Netz wurde luftgetrocknet. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden bei 100 kV auf einem Phillips CM100-Elektronenmikroskop aufgenommen.
Für die Immunelektronenmikroskopie wurden chimäre virale Partikel mit dem primären Antikörper inkubiert. 0,2 mg des chimären Virus in 50 mM Hepes, pH 7,0 (0,4 mg/ml Virus) wurden mit 0,012 mg Anti-VSV-G-MAb (gelöst in dem gleichen Puffer) über Nacht bei 4°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Für die Immunogoldmarkierung wurde ein Tropfen der Antikörper-Virus-Mischung (10 ml) für ungefähr eine Minute auf ein mit Formvar-Kohle beschichtetes, 300–400 mesh Kupfernetz gelegt. Der Überschuss wurde teilweise geblottet, und die Netze wurden 5mal in 50 mM HEPES, pH 7,0 gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Dann wurden die Netze für 30 Minuten bei Raumtemperatur und konstanter Feuchtigkeit in Tropfen von 6-nm-kolloidales-AU-Esel-Anti-Maus-IgG (1:10-Verdünnung mit dem Puffer) inkubiert, gefolgt von 5-maligem Waschen in Puffer. Anschließend wurden die Proben für eine Minute mit 1%igem Uranylacetat inkubiert, vollständig geblottet und luftgetrocknet.
Beispiel 2
Chimäre Capsidproteine wurden erzeugt, die das Epitop aus dem F-Protein des bovinen respiratorischen Syncytial-Virus (BRSV) wie in Tabelle 3 gezeigt enthielten. Genauer gesagt wurde eine BRSV-F-Proteinsequenz Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser Asn Ile Ala Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln (SEQ ID NO: 2) wie oben im Detail in Beispiel 1 beschrieben in das FHV-Hüllproteingen hineinkonstruiert.
Das BRSV-F-Glycoprotein ist als ein wichtiges Antigen in der Immunantwort nach der Infektion bekannt. Diese Sequenz erwies sich als ein B-Zell-Epitop und enthält auch Sequenzen, die für eine proliferative T-Zell-Antwort notwendig sind (Corvaisier, C. et al. 1993. Res. Virol. 144:141–150). Nach der Expression und nachfolgender Reinigung wurden die Partikel in vivo als ein Impfstoff verwendet, um ihre Antigenität zu demonstrieren.
Die in dem Baculovirussystem erzeugen FHV:BRSV-Chimären wurden mittels Western-Analyse analysiert. Proteine aus Sf-Zellen, die mit rekombinantem Baculovirus infiziert waren, der RNA2:BRSV enthielt, wurden isoliert und mittels Standard-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und auf Immunblots mit Antikörpern analysiert, die gegen das Capsidprotein und die erwünschten Peptide gerichtet waren. Die gegen normale FHV-Sequenzen gerichteten Antikörper wiesen diese Banden nach, und Antikörper, die gegen die inserierten Sequenzen gerichtet waren, wiesen die entsprechenden inserierten Epitope innerhalb des Kontexts des Hüllproteins nach. Diese immunchemischen Experimente zeigen, dass die Spaltprodukte, die aufgrund der eingefügten Sequenz geringfügig größer als normal sind, alle vorhanden sind, und bestätigt, dass die chimären Partikel assembliert sind.
Beispiel 3
Die Clearance von HBV hängt von einer starken und polyklonalen B-Zell- und T-Zell-Antwort auf die Hüll-, Nukleocapsid- und Polymerase-Antigene des Virus ab. Die CTL-Antwort auf HBV wird bei chronisch infizierten Patienten, die nicht fähig waren, das Virus zu eliminieren, nicht leicht nachgewiesen. Während angenommen wurde, dass die virale Clearance die Zerstörung infizierter Hepatozyten verlangt, was die assoziierte Lebererkrankung verursachen kann, deuten neuere Indizien darauf hin, dass dies nicht der Fall sein muss. Jüngere Studien deuten darauf hin, dass HBV-spezifische CTLs das Virus aus den Lebern transgener Mäuse eliminieren können, welche hohe Niveaus der HBV-Replikation aufweisen, die mit den in infizierter humaner Leber gefundenen Niveaus vergleichbar sind. Diese Studien ermöglichten die intrazelluläre Inaktivierung von HBV, indem Mäuse mit lymphozytischem Choriomeningitis-Virus (LCMV) infiziert wurden, das eine Sekundärinfektion verursacht. Diese Clearance tritt ohne ein Verletzen der zuvor infizierten Hepatozyten auf, die zu einem gesunden HBV-negativen Status zurückkehren. Diese heilende Wirkung wird durch Interferon gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) vermittelt, die bei Aktivierung von CTL sezerniert werden.
Die Cytokine aktivieren die Hepatozyten, um wenigstens zwei heilende antivirale Funktionen auszuüben, die intrazellulär alle Spuren replizierenden Virus eliminieren. Erstens disassemblieren sie die im Cytoplasma vorhandenen HBV-Nukleocapsidpartikel, was das virale Genom den zellulären Nukleasen aussetzt. Zweitens bauen sie die virale DNA ab, wodurch die Produktion neuer Transkriptionsmatrizen und das Assembly neuer viraler Partikel ausgeschlossen wird. Diese Ereignisse treten in vollkommen lebensfähigen Hepatozyten auf, die cytologisch vollständig normal sind.
Die oben erörterten Studien demonstrieren, dass CTL chronische Hepatitis-B-Virusinfektion heilen kann, ohne die infizierten Zellen abzutöten. Dies zeigt, dass eine virale Clearance hauptsächlich eine Überlebensfunktion der infizierten Zellen und weniger eine zerstörerische Funktion der Immunantwort ist.
In diesem Beispiel wurde ein chimäres FHV-Partikel, das einen Hepatozyten-spezifischen Liganden trägt und humanes Interferon gamma enthält, das unter Verwendung des Enkapsidierungssignals verpackt wurde (2 und 12), effektiv auf Leberzellen gelenkt, so dass es als ein Gentransportsystem fungieren kann.
Dieser Leber-spezifische Ligand basiert auf der Sequenz von CSP: VIII (SEQ ID NO: 8) aus Plasmodium falciparum, das effektiv die Bindung des Circumsporozoitenproteins aus Plasmodiumfalciparum an Hepatozytenmembranen blockiert (Cerami et al. 1992. Cell, Vol. 70, 1021–1033). In einem Versuch ein RNA2:CSP-Fusionsprotein zu erzeugen, das Hepatozytenmembranen spezifisch bindet, wurde eine Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese verwendet, um eine geringfügig größere für CSP-kodierende Sequenz, IX (23 Aminosäuren, SEQ ID NO: 9), zwischen den Aminosäureresten 207 und 208 von FHV RNA2 (12) einzufügen. Sobald diese assemblierten, chimären Partikel in Leberzellen eingeführt werden, binden die Leberzell-spezifischen Moleküle oder Liganden auf der Partikeloberfläche direkt an andere Moleküle in der Leberzelle. Da derselbe Partikel im Inneren die Botschaft für IFN-γ trägt, bewirkt sein Eintritt in Leberzellen die lokalisierte Produktion von Interferon. Dieses lokalisierte Interferon gamma in den Leberzellen agiert auf eine autokrine und parakrine Weise, um die in vivo-Herstellung weiteren Cytokins innerhalb jener Zellen zu aktivieren, was das Virus eliminieren kann, ohne die Zellen abzutöten.
Beispiel 4
Das vorliegende System kann leicht auf andere Peptidliganden mit weniger als ungefähr 100 Aminosäureresten in Länge und auf viele Gene mit weniger als ungefähr 4500 Basen in Größe angepasst werden. Cytokine und T-Zell-Epitope stellen eine kleine Anzahl dieser Kandidatengene oder Genfragmente dar. Ein Motorneuronen zielsystem, das eine Vielzahl an medizinischen Anwendungen hat, kann auch konstruiert werden. Auf eine ähnliche Weise wie zuvor erörtert, wird ein Ligand auf der Oberfläche des Partikels exprimiert, der Motorneuronennervenendigungen spezifisch bindet, und das Genübertragungssystem möglich macht. Es gibt mehrere aktivitätsabhängige Nervenendigungsstämme, deren Aktivität auf dem Umstand basiert, dass nach der Neurotransmittervesikelfusion die Vesikel rasch wieder aufgenommen werden und sie bei dem Vorgang etwas von der Flüssigkeit im synaptischen Spalt aufnehmen (Mundigl O. 1995. Eur J Cell Biol 66:246–256). Ein Ziel für die Virusbindung, das innerhalb des synaptischen Vesikels liegt, ist effizient. Das Partikel ist ungefähr 300 Å im Durchmesser und passt in endozytotische Vesikel.
Ein auf synaptische Vesikel gerichteter Ansatz schließt die Fc-Antikörperbindungsregion von Protein A, die auf der Oberfläche des Partikels exprimiert werden kann, und dann dessen Targeting gegen jedes beliebige notwendige Antigen ein, einfach indem man das Partikel vor der Verabreichung an das Tier an spezifische Antikörper bindet. Durch Verwendung Struktur-basierten Designs und von Phage-Display-Verfahren wurden 33 Reste von Protein A gefunden, die die Fc-Region binden (Braisted A.C. und Wells J.A. 1996. Proc Natl Acad Sci USA 93:5688–569). Dies beseitigt die Notwendigkeit jedes Mal Rezeptoren zu identifizieren und ein neues chimäres Virus zu erzeugen. Der gleiche chimäre Kernpartikel mit der Fc-Antikörperregion von Protein A kann in vielen Anwendungen verwendet werden, indem man es an verschiedene Antikörper konjugiert.
Beispiel 5
Kleine Moleküle wie Peptide oder Haptene sind nicht völlig immunogen, auch wenn sie mit Immunantwortkomponenten interagieren können. Diese kleinen Moleküle können immunogen gemacht werden, indem sie an Trägerproteine gekoppelt werden, die dazu in der Lage sind, die Haptene auf eine immunogene Weise zu präsentieren. Einige häufig verwendete Träger, die kovalent an Haptene koppeln, umfassen Hämocyanin aus der Schlüssellochschnecke (KLH) mit einem Molekulargewicht von 4,5 × 10⁵ bis 1,3 × 10⁷ Dalton, Rinderserumalbumin (BSA) mit einem Molekulargewicht von 67000 Dalton und Ovalbumin (OVA) mit einem Molekulargewicht von 45000 Dalton.
Die Nodaviren und insbesondere das FHV-Partikel mit einer molekularen Masse von ungefähr 7,7 × 10⁶ Dalton sind dazu in der Lage, als hocheffiziente Träger antigener Peptide auf ihrer Oberfläche zu fungieren, wobei diese Peptide durch Konjugationschemie kovalent befestigt sind. Sobald das Partikel in einzelne Untereinheiten dissoziiert, werden die antigenen Peptide zunehmend exponiert und immunogen.
Die in diesem System verwendete Konjugationschemie beruht auf dem Umstand, dass es ungefähr 10 Aminseitenketten und 7 Säureseitenketten pro Untereinheit gibt, die exponiert sind. Dies bedeutet, dass es ungefähr 1800 Aminseitenketten und 1260 Säureseitenketten pro Partikel gibt. Diese Zahlen gelten für das Wildtyp-Partikel, das selbst dazu in der Lage ist, zahlreiche Peptide an jedes Partikel zu konjugieren. Chimäre Partikel mit zusätzlichen Aminseitenketten und Säureseitenketten, die in die Insertionsschleife konstruiert sind, dienen dazu, die Anzahl der für die Konjugation zugänglichen Stellen zu erhöhen. Es gibt auf dem Wildtyp-Partikel keine exponierten Sulfhydrylgruppen, was die Möglichkeit bietet, ein effizientes Konjugationsschema aufzustellen. Die meisten der Reste in der Insertionsschleife wären auf der Oberfläche des Partikels zugänglich.
In diesem spezifischen Beispiel wurden sulfonierte Crosslinker verwendet, um Peptide an die Oberfläche des Partikels zu konjugieren. Genauer gesagt wurde in diesem Beispiel der Crosslinker Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat verwendet. Dieser Crosslinker weist einen NHS-Ester und eine mit einem Spacer-Arm verbundene Maleimid-Gruppe auf. NHS-Ester reagieren mit primären Aminen und Maleimide reagieren mit Sulfhydrylen. Die NHS-Reaktion wird zuerst durchgeführt, indem ein 50-molarer Überschuss des Crosslinkers zu den FHV-Partikeln inkubiert wird und man die Reaktion für 30 Minuten bei Raumtemperatur voranschreiten lässt. Ein zweites Aliquot an Crosslinker wurde hinzugegeben, um den Crosslinker auf einen 100-molaren Endüberschuss zu bringen, und man ließ die Reaktion für 30 weitere Minuten bei Raumtemperatur voranschreiten. Überschüssiger Crosslinker wurde dadurch entfernt, dass die NHS-Ester-Reaktion durch Zugabe von Tris-HCl, pH 7,0, in einer Endkonzentration von 0,1 M abgefangen wurde, gefolgt von der Zugabe von Peptiden mit den Sulfhydrylgruppen. Das Vernetzen ist effektiv, weil NHS-Ester mit primären Aminen bei pH 7–9 reagieren und Maleimide mit SH-Gruppen bei pH 6,5–7,5 reagieren. Die freien Amine in dem Tris-HCl reagieren mit den verbliebenen zugänglichen NHS-Estern. Da Maleimide nur bei einem hohen pH mit NHS-Estern reagieren, stellt weiterhin die Reaktivität dieser zwei Gruppen miteinander kein Problem dar.
Ein Teil des BRSV-Peptids, das zuvor verwendet wurde (SEQ ID NO: 22) und das die Aminosäurereste Cys Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser (SEQ ID NO: 45) hatte, wurde als ein Hapten verwendet. Ein Cys-Rest am Aminoterminus dieses Teils wurde während der Synthese hinzugefügt, um eine Konjugation mit KLH zu ermöglichen. In einer separaten Konjugation wurde der gleiche BRSV-Peptidteil verwendet, aber ohne das zusätzliche Cys am Aminoterminus, d.h. Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser (SEQ ID NO: 46). Diese Peptide wurden an Wildtyp-Partikel wie auch an FHV:VSV-Chimären unter Verwendung des oben skizzierten Schemas konjugiert. Die Partikel wurden dann denaturiert und mittels Western Blot analysiert, und das Vorhandensein multipler Peptide innerhalb des Kontexts eines Hüllproteinmonomers wurde bestätigt. Die konjugierten Partikel wurden nachfolgend als Immunogene verwendet, und man fand, dass sie eine starke Immunantwort gegen die BRSV-Peptide induzieren, die an die Partikel konjugiert worden waren.
Dies zeigt, dass das Partikel sogar bei Abwesenheit einer Insertion in dem Capsidproteingen als ein wirksames Immunstimulanz und ein wirksamer Immunmodulator dienen kann. Weiterhin werden die immunstimulatorischen und immunmodulatorischen Wirkungen durch das Vorhandensein inserierter Sequenzen in dem Capsidproteingen wie auch durch die Enkapsidierung anderer bekannter Immunstimulanzien wie Cytokine innerhalb des Partikels vor dem Konjugieren von Haptenen an die Oberfläche verstärkt.
Beispiel 6
Andere therapeutische Konstrukte sind möglich, wie z.B. Konstrukte zum Antimalaria-Targeting. Für die Antimalariatherapie entwirft man unter Verwendung des vorliegenden Systems ein Gentherapieprotokoll, das auf Malaria-Sporozoitenzellen anstelle von humanen Zellen zielt. Die Expression der CSP-Erkennungsrezeptorstelle auf dem FHV-Virushüllprotein bindet und blockiert den Parasiten, während er sich noch in der Blutbahn befindet und verhindert dadurch eine Infektion, oder sie transportiert eine toxigene Substanz zum Parasiten, wodurch er zerstört wird.
Die vorstehende schriftliche Beschreibung stellt eine vollständige, klare, präzise und genaue Offenbarung der Erfindung dar, die den Fachmann in die Lage versetzt, dieselbe herzustellen und zu verwenden. Diese Offenbarung sollte nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie irgendeine direkte oder implizite Beschränkung auf den Umfang der Erfindung legt, die unten genau dargelegt ist und eindeutig beansprucht wird.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimäres Protein, welches ein Flock House Virus Kapsidprotein umfasst, welches frei von Deletionen ist und ein heterologes Peptidsegment innerhalb der Region zwischen Aminosäurerest 205 und Aminosäurerest 209 des Aminoterminus des besagten Kapsidproteins beinhaltet.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment zu der Gruppe gehört, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 besteht.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 4 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 6 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Proteinsegment durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Peptid mindestens eine zellspezifische Zielsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem B-Zellepitop, einem T-Zellepitop, einem CTL-Epitop und einer Hepatozytenzielsequenz umfasst.
Chimäres Protein nach Anspruch 1, wobei das heterologe Peptid sowohl ein B-Zellepitop als auch ein T-Zellepitop beinhaltet.
Impfstoffzusammensetzung, die das chimäre Protein des Anspruchs 1 umfasst.
Diagnostisches Kit, welches das chimäre Protein des Anspruchs 1 umfasst.
Expressionsvektor, der für das chimäre Protein des Anspruchs 1 kodiert.
Chimäres Virus-ähnliches Partikel, das ein Kapsid umfasst, welches mindestens ein chimäres Protein nach Anspruch 1 beinhaltet.
Impfstoffzusammensetzung, welche das chimäre Virus-ähnliche Partikel des Anspruchs 17 umfasst.
Multivalentes chimäres Virus-ähnliches Partikel, welches ein Kapsid umfasst, das mindestens zwei chimäre Proteine nach Anspruch 1 beinhaltet, wobei besagte chimäre Proteine verschiedene heterologe Peptide aufweisen.
Eukaryontisches Zellexpressionssystem, welches das chimäre Protein des Anspruchs 1 herstellt.
Verwendung einer wirksamen Menge des chimären Proteins wie in Anspruch 1 definiert, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, um eine Immunantwort in einem Tier hervorzurufen.
Verwendung einer wirksamen Menge eines chimären Proteins, wie in Anspruch 2 definiert, für die Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, um eine Immunantwort in einem Tier hervorzurufen.
Chimäres Nodavirus-ähnliches Partikel, welches ein chimäres Kapsidprotein, wie in Anspruch 1 definiert, sowie einen biologisch aktiven Bestandteil umfasst.
Chimäres Nodavirus-ähnliches Partikel nach Anspruch 23, wobei der biologisch aktive Bestandteil ein Immunostimulanz darstellt.
Nukleotidsequenz, welche für ein chimäres Protein, wie es in Anspruch 1 definiert ist, kodiert.
Nodavirus-Kapsidprotein-Gen, welches eine Nukleotidsequenz beinhaltet, die das chimäre Protein des Anspruchs 1 kodiert.
Baculovirus-Expressionssystem, welches ein Nodavirus-Kapsidprotein-Gen beinhaltet, welches für das chimäre Protein nach Anspruch 1 kodiert.
Chimäres Protein gemäß Anspruch 1, welches mit einem antigenen Peptid verbunden ist.
Chimäres Protein nach Anspruch 28, wobei das antigene Peptid ein Teil des BRSV F-Proteins beinhaltet.
Chimäres Protein nach Anspruch 28, wobei das antigene Peptid durch die Aminosäurereste Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser dargestellt wird.
Chimäres Protein nach Anspruch 28, wobei das antigene Peptid durch die Aminosäurereste Cys Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser dargestellt wird.
Chimäres Nodavirus-ähnliches Partikel, welches ein chimäres Kapsidprotein, wie in Anspruch 1 definiert, umfasst, welches mit einem antigenen Peptid verbunden ist.
Chimäres Nodavirus-ähnliches Partikel gemäß Anspruch 32, wobei das antigene Peptid ein Teil des BRSV F-Proteins umfasst.
Chimäre Nodavirus-ähnliche Partikel gemäß Anspruch 32, wobei das antigene Peptid durch die Aminosäurereste Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser dargestellt wird.
Chimäre Nodavirus-ähnliche Partikel gemäß Anspruch 32, wobei das antigene Peptid durch die Aminosäurereste Cys Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Val Asn Asn His Asp Cys Gln Ile Ser dargestellt wird.