DE69635825T2

DE69635825T2 - Rekombinante virale pseudopartikel und deren verwendung als impfstoff oder als antitumorale wirkstoffe

Info

Publication number: DE69635825T2
Application number: DE69635825T
Authority: DE
Inventors: Ignacio Casal; Christine Sedlik; Javier Sarraseca; Claude Leclerc; Richard Lo Man; Paloma Rueda
Original assignee: Inmunologia y Genetica Aplicada SA; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Inmunologia y Genetica Aplicada SA; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1996-01-02
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: EP0871738B1; US6458362B1; WO1997024443A1; PT871738E; AU6933296A; ES2257753T3; DE69635825D1; DK0871738T3; IL167886A; ES2282998T3; ATE317901T1; CA2241280A1; NO983054D0; NZ316970A; EP0783038B1; JP2000502900A; BR9612422A; AU731706B2; NO324205B1; NO983054L

Description

Vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Pseudoviruspartikel eines Virus der Familie der Parvoviridae oder eines verwandten Virus, die insbesondere für die Induktion hochgradiger Antworten von zytotoxischen, CD8-positiven T-Lymphozyten (CTL) in vivo nützlich sind.
Sie bezieht sich auch auf die Benutzung dieser Pseudopartikel für die Herstellung von Impfstoffen oder Antitumormedikamenten.
Sie bezieht sich auch auf Zusammensetzungen, die die Pseudopartikel in einem physiologisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel umfassen.
Nach Fernandez et al. (Médecine/Sciences[Medizin/Naturwissenschaften], 1995, 11, 975-983) kann die Antwort als zelluläre Mediation, die im Fall eines Tumors wesentlich ist, in zwei Teile unterteilt werden:

– einerseits in die Ingangsetzung der Antwort, die CD4-positive T-Lymphozyten und das Antigen enthaltende Zellen (CPA) eingreifen lässt, und
– andererseits in die zytotoxische Effektorantwort, in die CD8-positive T-Lymphozyten eingreifen.

Die aktivierten CD4-positiven T-Lymphozyten werden proliferieren und Zytokine sekretieren, während die aktivierten CD8-positiven T-Lymphozyten proliferieren und sich in zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) differenzieren.
Diese beiden Familien von Lymphozyten haben also sehr verschiedene Funktionen und werden durch unterschiedliche Mechanismen aktiviert. Die Stimulation der CD4-positiven Lymphozyten erfordert die Assoziation eines aus dem Abbau des Antigens hervorgehenden Peptids an Moleküle der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (CMH), während diejenige der CD8-positiven Zellen die Assoziation eines Peptids an Moleküle der Klasse I des CMH erfordert.
Man hat bereits eine gewisse Anzahl von prophylaktischen oder therapeutischen Strategien vorgeschlagen, um durch Viren, Bakterien, Parasiten hervorgerufene Krankheiten diverser Herkunft bei Mensch und Tier oder kanzeröse oder tumorale Erkrankungen zu bekämpfen.
Man kennt zum Beispiel die Induktion von CTL-Antworten in vivo durch „lebende" Vektoren. Indessen ist die Unschädlichkeit dieser Vektoren nicht garantiert, insbesondere bei Individuen mit geschwächter Immunität. Andererseits haben die eine Replikation dieser „lebenden" Vektoren implizierenden Systeme bei immunen Individuen keine Wirksamkeit mehr.
Martinez et al. lehren in Vaccine [Impfstoff] (Band 10, S. 684-690, 1992) die Verwendung von leeren Kapsiden des Schweine-Parvovirus (PPV) zur Impfung von Schweinen. Zur Familie der Parvoviridae gehören Viren, die bei Säugetieren wie Schweinen, Rindern, Katzen, Kaninchen, Ratten und beim Menschen sehr verbreitet sind. Indessen sind die Parvoviren relativ spezifisch für Säugetierwirte. Das Schweine-Parvovirus (PPV) insbesondere ist verantwortlich für zahlreiche Infektionen in industriellen Schweinezuchtbetrieben. Das Schweine-Parvovirus (PPV) besteht aus einem nicht umhüllten, isometrischen Partikel von 20 nm Durchmesser mit ikosaedrischer Symmetrie, der ein Molekül einer einfachsträngigen DNA enthält. Er ist aus den beiden Kapsidproteinen VP1 (83 kDA) und VP2 (64 kDA) und einem dritten, aus der Proteolyse des VP2 resultierenden Protein VP3 zusammengesetzt.
Das Protein VP2 kann durch Insektenzellen mit Hilfe eines rekombinanten Baculovirussystems produziert werden und die erhaltenen Proteine VP2 sind fähig, sich selbst zu organisieren, um Pseudoviruspartikel zu bilden, die dieselbe Größe wie die des natürlichen Virions haben. Die Impfung von Schweinen gegen das PPV wird durchgeführt, indem sie mit einem Gemisch dieser Kapside unter Assoziation des Adjuvans Alhydrogel (zu 50%) + Quil A 500 μg (Superfos) immunisiert werden. Eine mit der Lehre dieses Artikels vergleichbare Lehre findet sich in den Patentanmeldungen EP-551.449 und EP-554.414, die außerdem angeben, dass anderen viralen Proteinen entsprechende Epitope in Kapside eingebaut werden können, aber sie bezeichnen nicht genau die Art dieser Epitope.
Was die Patentanmeldung EP-647.655 anbetrifft, so bezieht sie sich auf synthetische Peptide, die VP2-antigenen Stellen entsprechen. Es handelt sich also nicht um das ganze Protein.
Sedik et al. beschreiben in Journal of General Virology [Zeitschrift für allgemeine Virologie] (76: 2361-2368 (1995)) die Verwendung von hybriden Parti keln des PPV als Vektoren von zwei Epitopen des Poliovirus C3: B und C3: T, die jeweils durch CD4-positive B- und T-Lymphozyten erkannt werden. Die Partikel, die das CD4-positive T-Zell-Epitop C3 enthalten, erweisen sich als fähig, die proliferierenden Antworten nur von CD4-positiven T-Zellen und nicht von CD8-positiven T-Zellen zu stimulieren. Außer dieser Stimulationsspezifität bleiben die Antworten niedriggradig, unzureichend für eine wirksame Immunisierung. Jedenfalls erfordert die Induktion dieser Antworten zwingend die Verwendung eines Adjuvans (Aluminiumhydroxid oder das komplette Freund-Adjuvans).
Außerdem stoßen die Versuche der Modifizierung der Pseudopartikel zum Zweck des Einbaus heterologer Epitope auf Schwierigkeiten wie der Hemmung der Bildung von Pseudopartikeln. Selbst wenn diese Letzteren sich bilden, ist das heterologe Epitop nicht notwendigerweise immunogen, da das Epitop zum Beispiel an einer Stelle gelegen sein kann, an der es unfähig ist, seine natürliche Formgebung anzunehmen oder von den das Antigen aufweisenden Zellen produziert zu werden.
Im Übrigen ist wie bei den Impfstoffen mit „lebenden" Vektoren die Unschädlichkeit dieser hybriden, an Adjuvanzien assoziierten Partikel nicht völlig sichergestellt, denn eine Toxizität kann von gewissen Eigenschaften der Adjuvanzien herrühren, die für den Organismus unheilvolle Nebenwirkungen induzieren können.
Es ergibt sich also aus dem Stand der Technik, dass man kein zuverlässiges wirksames System kannte, das die Stimulation der zytotoxischen und helfenden Antwort der T-Lymphozyten ermöglicht ohne Gefahr für die Gesundheit des behandelten Individuums und ohne Verwendung von immunstimulierenden Adjuvanzien.
Außerdem erwiesen sich die hybriden, das Epitop C3 : T enthaltenden Partikel nicht als fähig, eine wirksame CD4-positive T-Zell-Antwort in Abwesenheit eines Adjuvans zu induzieren.
Der Anmelder hat gezeigt, dass es möglich ist, eine CD8-positive lymphozytäre Antwort spezifisch ohne Verwendung von Immunadjuvanzien zu induzieren, d. h. eine zytotoxische Antwort mit Hilfe von Pseudopartikeln, die Epitope besitzen, die sich an jeweils wenigstens ein Molekül der Klasse I des CMH assoziieren können.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Pseudoviruspartikel, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Selbstorganisation wenigstens des viralen Strukturproteins VP2 eines Virus der Familie der Parvoviridae oder eines verwandten Virus entstehen, dass sie eine Größe zwischen etwa 20 und 60 nm haben, dass sie eine ungefähr ikosoedrische Struktur bilden und dass das Protein VP2 an seinem N-Terminus durch die Anwesenheit wenigstens eines Epitops modifiziert ist, das eine Sequenz von 8 bis 25 Aminosäuren umfasst, die sich an wenigstens ein Molekül der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes assoziieren kann, wobei die Assoziation von zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt wird.
Die erfindungsgemäßen CD8-positiven T-Lymphozyten sind fähig, wenigstens ein Epitop zu erkennen, das eine Sequenz von 8 bis 9 Aminosäuren umfasst, die sich an wenigstens ein Molekül der Klasse I des CMH assoziieren kann.
Die erfindungsgemäßen CD4-positiven T-Lymphozyten sind fähig, eine Sequenz zwischen 8 und 25 Aminosäuren zu erkennen, die sich an wenigstens ein Molekül der Klasse II des CMH assoziieren kann.
Die erfindungsgemäßen Partikel können Proteine verschiedener Arten umfassen und hybride Partikel bilden. Sie können zum Beispiel aus den Proteinen VP2 und VP1 bestehen.
Die zwischen der dem Epitop entsprechenden Sequenz und den Molekülen der Klasse I gebildete Assoziation wird vom CD8-positiven T-Lymphozytenrezeptor erkannt und induziert eine Differenzierung und Proliferation dieser Lymphozyten.
Vorteilhaft ist diese Sequenz von so genannten flankierenden Regionen eingefasst, die ihren Abbau modulieren, d. h. ihre Produktion beim Abbau des Antigens oder ihre Fixierung an Moleküle der Klasse I des CMH erleichtern können.
Die flankierenden Regionen können Aminosäuren entsprechen, die das CD8-positive T-Zell-Epitop in seiner natürlichen Umgebung flankieren. Auf allgemeine Weise können sie aus mehreren Aminosäuren und insbesondere aus Alanin oder Lysin zusammengesetzt sein.
Die erfindungsgemäßen Pseudopartikel sind von erstrangigem Interesse, das sich aus der Sicherheit dieses Immunisierungsmodus ergibt, da der einge setzte Vektor nicht replikativ ist, aus einem einzigen Typ eines viralen Proteins besteht und selbst Individuen mit geschwächter Immunität verabreicht werden kann.
Ein zweiter Vorteil der erfindungsgemäßen Pseudopartikel liegt im Fehlen gekreuzter Reaktionen mit dem menschlichen Parvovirus und somit im Fehlen von Problemen in Verbindung mit einer Präimmunisierung der Individuen, die eventuell zu einer schwachen Immunogenität dieses Typs rekombinanter Impfstoffe führt.
Außerdem erfordern die erfindungsgemäßen Pseudopartikel nicht die Replikation des Vektors und können daher ihre Wirksamkeit bei immunen Individuen beibehalten.
Auch besitzen die erfindungsgemäßen Pseudopartikel eine ausgezeichnete Immunogenität – eine einzige Immunisierung genügt – und können daher ohne immunstimulierendes Adjuvans verwendet werden.
Vorteilhaft ist das Parvovirus das PPV, das CPV (Hunde-Parvovirus) oder ein anderes verwandtes Virus wie das FPLV (Katzen-Panleukopenie-Virus) und das MEV (Nerz-Enteritis-Virus).
Das Epitop kann durch jede Sequenz gebildet sein, die sich an ein Molekül des CMH der Klasse I fixiert und eine Zytotoxizität der T-Lymphozyten induzieren kann. Es kann insbesondere ein CD8-positives T-Zell-Epitop eines Virus wie des HIV-1 oder HIV-2 oder eines Grippevirus oder ein tumorales Epitop oder ein durch karzinomatöse Zellen exprimiertes Epitop sein.
Nach einem vorteilhaften Ausführungsmodus sind die erfindungsgemäßen Pseudopartikel dadurch gekennzeichnet, dass das ausgewählte Epitop das CD8-positive CTL-Epitop ist, das in der Region 118-132 des Kernproteins des lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) enthalten ist.
Das Epitop kann jedoch jedes andere Epitop sein, das eine CTL-Antwort induzieren kann, wie zum Beispiel eines der folgenden Epitope:

– die Epitope der Proteine Env gp120, Env gp41, Gag p17, Gag p24, Gag p15, Pol und Nef der HI-Viren und die Epitope der Proteine Gag und Nef des VIS-Virus und Gag des HIV-2, wie sie von VENET und WALKER definiert wurden (AIDS 1993, Band 7, Ergänz. 1, 119-120);
– die Epitope von durch Tumore exprimierten Proteinen, die sich beim Menschen entwickeln, wie den von den Genen MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GA-GE-1,2, HER-2/neu exprimierten Proteinen, und von Antigenen melanozytischer Differenzierung wie der Tyrosinase, Pme117gp100, Melan-AMART-1 und gp 75TRP1, die von VAN DEN EYNDE und BRICHARD definiert wurden (Current Opinion in Immunology [Aktuelle Stellungnahme zur Immunologie], 1995, 7, 674-681).

Um auch eine CD4-positive T-Helfer-Zell-Antwort oder zur Produktion von Lymphokinen führende Antwort zu induzieren, kann das Epitop das CD4-positive T-Zell-Epitop PreS:T sein, das in der Region PreS2 (Sequenz 120-132) des Hepatitis-B-Virus (HBV) gelegen ist.
Der Pseudopartikel kann auch eine Kombination von Epitopen umfassen und insbesondere:

– wenigstens ein CD4-positives T-Zell-Epitop und wenigstens ein CD8-positives T-Zell-Epitop,
– eine Kombination von mehrfachen Kopien von CD4-positiven T-Zell-Epitopen oder CD8-positiven T-Zell-Epitopen,
– eine Kombination von vier Kopien von CD8-positiven T-Zell-Epitopen Mut des Lewis-Karzinoms.

Unter einer Kombination von Epitopen versteht man eine Kombination, die wenigstens zwei Epitope und auf bevorzugte Weise zwischen zwei und zehn Epitope identischer Proteine wie zum Beispiel eine mehrfache Kopie der Epitope MutI des Lewis-Karzinoms oder unterschiedlicher Proteine umfasst. So kann eine Kombination von mehrfachen Kopien von CD8-positiven T-Zell-Epitopen wenigstens zwei Epitope und auf bevorzugte Weise zwischen zwei und zehn Epitope umfassen, die aus unterschiedlichen Proteinen hervorgehen, wie zum Beispiel die Assoziation eines CD8-positiven T-Zell-Epitops des Kernproteins der lymphozytären Choriomeningitis und eines CD8-positiven T-Zell-Epitops Env. gp41 des HIV.
Auf vorteilhafte Weise können die rekombinanten Pseudoviruspartikel durch ein Verfahren erhalten werden, das einen Schritt der Expression des aus dem Protein VP2 des Parvovirus und diesem Epitop gebildeten Hybridproteins im Baculovirus umfasst.
Die erfindungsgemäßen Pseudopartikel werden auf noch bevorzugtere Weise erhalten durch Selbstorganisation des Proteins VP2 des Parvovirus, das durch die Anwesenheit an seinem N-Terminus wenigstens eines Epitops des Kernproteins des LCMV oder wenigstens eines Epitops des HBV oder auch einer Kombination von mehrfachen Kopien von Epitopen modifiziert ist.
Man wird feststellen, dass jedes andere Molekül und insbesondere jedes andere Protein, das dem VP2 ähnliche Eigenschaften aufweist, wie die Selbstorganisation und die Modifizierbarkeit durch ein Epitop, im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Ersatz des VP2 verwendet werden kann.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von Pseudopartikeln in wirksamer immunisierender Menge zur hochgradigen in vivo Induktion von CTL-Antworten.
Mit dem Ausdruck „wirksame immunisierende Menge" versteht man eine Menge an erfindungsgemäßen Pseudopartikeln, die je nach dem Verabreichungsweg und dem Gewicht des Individuums ausgewählt ist. Vorteilhaft liegt die verabreichte Menge zwischen 10 und 500 μg Pseudopartikeln pro Individuum.
Vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf eine Zusammensetzung, die Pseudopartikel in einem aus dem Gesichtspunkt der Immunologie annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel umfasst. Als Verdünnungsmittel kann man eine wässrige gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von etwa 7 (physiologische Lösung) verwenden.
Vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung frei von einem immunstimulierenden Adjuvans. Sie kann jedoch erforderlichenfalls ein solches Adjuvans enthalten, das Aluminiumhydroxid sein kann.
Die erfindungsgemäßen Pseudopartikel können auch in einem in vitro – Verfahren zur Stimulierung zytotoxischer T-Zellantworten von Lymphozyten verwendet werden, die von Patienten stammen, die eine virale oder tumorale Infektion erlitten haben, welches das In-Kontakt-Bringen der Lymphozyten der Patienten mit den Pseudopartikeln umfasst. In diesem Fall werden die Zellen nach der Behandlung den Patienten erneut verabreicht, z.B. durch Injektion.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Pseudopartikel bei der Herstellung eines vorzugsweise in einer einzigen Dosis zu verabreichenden, insbesondere antitumoralen oder antiviralen Impfstoffs. Er kann auf den für Impfstoffe üblichen Wegen verabreicht werden, nämlich auf intramuskulärem, intradermalem, subkutanem oder eventuell oralem Weg oder jedem anderen Weg, der die Aktivierung einer CTL-Antwort ermöglicht.
Die Erfindung wird, ohne dadurch in irgendeiner Weise eingeschränkt zu sein, durch folgende Beschreibung unter Verweis auf die beigefügten Zeichnungen dargestellt:
1 stellt ein Verfahren zur Gewinnung des Plasmids pPPV29 dar.
2, die aus drei Graphiken 2(a), 2(b) und 2(c) besteht, stellt die zweimalige Immunisierung von Mäusen am Tag 0 und am Tag 21 mit jeweils 10 μg und 50 μg der erfindungsgemäßen Pseudopartikel ohne Adjuvans dar. Am Tag 28 werden die Splenozyten in vitro während 5 Tagen mit syngenetischen, mit dem synthetischen Peptid 118-132 präinkubierten Splenozyten stimuliert. Die zytotoxische Aktivität der T-Lymphozyten wird auf den mit Medium oder mit dem synthetischen Peptid 118-132 präinkubierten Targets P815 gemessen. Die Resultate werden in Prozent der Lyse ausgedrückt, wobei das Verhältnis E:T auf der Abszisse eingetragen wird und dieser Ausdruck E/T das Lymphozytenverhältnis Effektoren/Targetzellen bezeichnet. Die 2(a) betrifft die mit dem Partikel PPV-29LCMV erhaltenen Resultate, die 2(b) die mit dem Partikel PPV-30LCMV erhaltenen Resultate und die 2(c) stellt zum Vergleich nicht modifizierte Pseudopartikel dar.
3, welche 7 Graphiken 3(a), 3(b), 3(c), 3(d), 3(e), 3(f) und 3(g) umfasst, stellt die zweimalige Immunisierung von Mäusen am Tag 0 und am Tag 21 mit unterschiedlichen Dosen von jeweils 50 μg in der 3(a), 10 μg in der 3(b), 2 μg in der 3(c), 0,4 μg in der 3(d), 0,08 μg in der 3(e) der erfindungsgemäßen Pseudopartikel ohne Adjuvans dar. Am Tag 28 werden die Splenozyten in vitro während 5 Tagen mit syngenetischen, mit dem synthetischen Peptid 118-132 präinkubierten Splenozyten stimuliert. Die zytotoxische Aktivität der T-Lymphozyten wird auf den mit Medium oder dem synthetischen Peptid 118-132 präinkubierten Targets P815 gemessen. Die Vergleichsmäuse haben eine Injektion am Tag 21 von 100 μg des synthetischen Peptids 118-126 mit inkomplettem Freund-Adjuvans (IFA) (3g) oder Vergleichspseudoparfikel (3f) erhalten. Die Resultate sind in Prozent der Lyse auf die gleiche Weise wie in 2 ausgedrückt.
4, die auf ähnliche Weise wie 2 drei Graphiken umfasst, 4(a), 4(b) und 4(c), stellt die Immunisierung von Mäusen durch eine einzige Injektion von 10 μg oder von 50 μg der erfindungsgemäßen Pseudopartikel ohne Adjuvans dar. Am Tag 14 werden die Splenozyten in vitro während 5 Tagen mit syngenetischen, mit dem synthetischen Peptid 118-132 präinkubierten Splenozyten stimuliert. Die zytotoxische Aktivität der T-Lymphozyten wird auf den mit Medium oder dem synthetischen Peptid 118-132 präinkubierten Targets P815 gemessen. Die Resultate sind in Prozent der Lyse auf die gleiche Weise wie in 2 ausgedrückt.
5, welche 2 Graphiken 5(a) und 5(b) umfasst, stellt den Schutz von BALB/c-Mäusen dar, denen auf intraperitonealem Weg (i.p.) an den Tagen 0 und 21 entweder PBS oder leere Pseudopartikel (PPV) oder die Sequenz 118-132 des Kernproteins des LCMV (PPV-LCMV) exprimierende Pseudopartikel oder das Virus des Armstrong-Stammes (LCMV-Arms) injiziert worden sind gegen die Infektion durch LCMV jeweils an den Tagen 28 (5a) und 70 (5b). Die Mäuse waren auf intrazerebralem Weg mit 10^1,7 PFU/Maus infiziert worden. Die Sterblichkeit der Mäuse wird täglich während 10 Tagen verfolgt und die Resultate sind in Prozent der Überlebensrate unter den Tieren eines jeden Loses ausgedrückt.
Die 6A bis 6D stellen die Stimulation der für das CD4-positive T-Zell-Epitop PreS:T des HBV spezifischen T-Hybridomen 51 E12 (6A und 6C) oder 52A12 (6B und 6D) durch Zellen des Lymphoms B (6A und 6B) oder bestrahlte Splenozyten (6C und 6D) dar, welche mit dem Peptid PreS:T, rekombinanten Pseudopartikeln PPV-PreS:T oder Pseudopartikeln PPV (VP2) zusammen gebracht wurden.
Die 7A und 7B stellen die proliferierende Antwort von Ganglienzellen dar, die in vitro mit dem Peptid PreS:T (7A) oder Pseudopartikeln PPV (VP2) (7B) stimuliert worden sind, wobei diese Zellen von mit 0,01 μg PPV-PreS:T oder 10 μg PPV (VP2) ohne Adjuvans immunisierten DBA/1-Mäusen stammen.
Die 8A und 8B stellen die Proliferation von Ganglienzellen dar, die von DBA/1-Mäusen stammen, welche durch PPV-PreS:T im PBS-Medium oder in Anwesenheit des kompletten Freund-Adjuvans oder von PPV (VP2) immunisiert und durch das Peptid PreS:T (8A) oder PPV (VP2) (8B) erneut stimuliert worden sind.
BEISPIEL 1: INDUKTION DER ZYTOTOXIZITÄT DER T-LYMPHOMEN DURCH ER-FINDUNGSGEMÄßE PSEUDOPARTIKEL. DIE EIN EPITOP DES KERNPROTEINS DES LCMV ENTHALTEN.
Das CD8-positive, heterologe CTL-Epitop, das in der Region 118-132 des Kernproteins des LCMV enthalten ist, wurde in das Gen des VP2 des PPV eingeführt, ohne die spätere Bildung von Pseudopartikeln zu verändern. Zwei Partikel wurden erhalten, PPV-29 LCMV und PPV-30 LCMV, die sich nur durch ein Initiationscodon unterscheiden. Diese Hybridproteine waren durch ein Baculovirussystem erzeugt und durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat aus einem Lysat von Insektenzellen nach der im Journal of General Virology [Zeitschrift für allgemeine Virologie] 76: Seite 2361-2368 (1995) beschriebenen Methode gereinigt worden.
Die Fähigkeit dieser rekombinanten Partikel, zytotoxische T-Lymphozytenantworten zu induzieren, wurde in vivo bei der BALB/c-Maus analysiert.
Material und Methoden
* Insertion des CD8-positiven Ekitops LCMV in die Stelle XhoI des N-Terminus des VP2.
Wie in 1 dargestellt, wird der Vektor pPPV29 erhalten durch Digerieren und Ersatz des Fragments XhoI-Ncol des aus dem von Martinez et al. (1992, Vaccine [Impfstoff], 10, 684-690) beschriebenen Vektor pPPV17 hervorgehenden Vektors pPPV17R durch zwei PCR-Amplifikationsprodukte, um eine an der Stelle der Polyklonierung des pPPV17R vorhandene Region und das Initiationscodon des VP2 zu entfernen. Die Vektoren pPPV17 und pPPV17R unterscheiden sich nur durch die Orientierung des klonierten Gens VP2 im Verhältnis zum Polylinker. Alle PCR-Amplifikationen wurden in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einer Einheit der DNA-Polymerase Vent (New England Biolabs), 10 ng des pPPV17R als Matrize, 100 μm dNTPs und 800 ng von jedem Primer durchge führt. Die Amplifikationen wurden während 25 Denaturationszyklen bei 93°C während einer Minute durchgeführt, wobei die Annelierung des Primers bei 50°C während einer Minute und die Extension bei 72°C während 3 Minuten durchgeführt wurden. Die Produkte der PCR wurden im pPPV17R kloniert, der durch Xho-I und Ncol digeriert und dephosphoryliert wurde. Die Mischungen der Ligation wurden verwendet, um die E. coli DH5- Bakterien zu transformieren. Auf diese Weise wurden zwei Plasmide erhalten: pPPV29, das eine einzige Klonierungsstelle Xho-I neben dem vom VP2 stammenden ATG-Codon enthält, und pPPV30, das eine einzige Klonierungsstelle Xho-I enthält, aber ohne das Initiationscodon ATG.
Dann wurde der Vektor pPPV29 mod erhalten: Das Gen VP2 wurde durch Digerieren des pPPV29 durch PstI erhalten, dann ligiert an der Klonierungsstelle PstI des Plasmids pMTL24, um die Stellen BamHI für die Subklonierung in den Transfervektoren der Baculoviren zu liefern.
Zwei Oligonucleotide, die für das CD8-positive Epitop und das Initiationscodon kodieren und zwei Stellen XhoI umfassen, wurden synthetisiert. Sie weisen die folgenden Sequenzen auf: SEQ ID Nr. 1 und Nr. 2:
SEQ ID Nr. 1
5'TCGAGATGCGACCACAAGCTTCAGGAGTATACATGGGAAACCTAACAGCAC
AAC3'
SEQ ID Nr. 2
5'TCGAGTTGTGCTGTTAGGTTTCCCATGTATACTCCTGAAGCTTGTGGTCGCATC3
Diese beiden komplementären Oligonucleotide wurden von MedProbe (Norwegen) geliefert. Sie wurden phosphoryliert mit Hilfe der Polynucleotidkinase T4, anneliert bei 70°C während 15 Minuten und ligiert auf der Stelle XhoI des durch XhoI digerierten Plasmids pPPV29mod, das das für das PPV-VP2 kodierende Gen enthält.
Zellen der Escherichia coli DH5 wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf LB-Medium ausgebreitet, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt (Hanahan 1983, J. Mol. Biol. [Zeitschrift für Molekularbiologie], 166, 557 bis 580). Die Rekombinanten, welche das eingefügte LCMV enthielten, wurden ausgewählt, dann sequenziert durch das Didesoxy-Verfahren, um die Orientierung und Integrität der eingefügten Sequenzen zu bestimmen. Der rekombinante Klon, der die LCMV-Sequenz in der adäquaten Orientierung enthielt, wurde pPPV29mod/LCMV genannt.
* Konstruktion von Transfervektoren in den Baculoviren und Auswahl der rekombinanten Baculoviren.
Die Hybridsequenz VP2 wurde vom Vektor pPPV29mod/LCMV ausgehend durch Digerieren durch BamHI erhalten und subkloniert an der einzigen BamHI-Restriktionsstelle des Transfervektors des Baculovirus PAcYM1.
Rekombinante Klone wurden wie oben beschrieben zubereitet und durch die Methode der minimalen Zubereitung der Plasmid-DNA und durch Restriktionskartographie analysiert. Die Insertionssequenzen der positiven Klone wurden sequenzierf, um erneut die Integrität des eingebauten Epitops sowie der flankierenden Sequenzen zu überprüfen. Schließlich wurde die mit Phenol gereinigte DNA durch zwei Volumina Ethanol ausgefällt. Der so erhaltene rekombinante Klon wurde pAcYM1/LCMV/ppv29mod genannt.
Um rekombinante Baculoviren zu erhalten, wurde ein Gemisch von 2 μg DNA des gereinigten Transfervektors und von 500 ng parentaler DNA AcRP23lacz+ zu Sf9-Insektenzellen in Anwesenheit des Transfektionsreagens DO-TAP (Boehringer Mannheim) nach den Anweisungen dieses Unternehmens hinzugefügt. Die Transfektion wurde fortgesetzt, bis der zytopathische Effekt vollständig war. Nach 9 Tagen wurden die Kulturen wieder vorgenommen und das geklärte Obenschwimmende zur Isolierung der Plaques der rekombinanten Baculoviren nach dem Fachmann bereits bekannten und von Sedlik et al. (J. Gen. Virol. [Zeitschrift für allgemeine Virologie] 1995, 76, 2361 bis 2368) beschriebenen Methoden benutzt. Die rekombinanten Klone wurden an Hand ihres weißen Phänotyps (weiße Kolonie: rekombinant, blaue Kolonie: wilder Phänotyp) ausgewählt.
Die rekombinanten Baculoviren wurden gereinigt, bis keine blaue Kolonie mehr entdeckt werden konnte. Virenbestände, die einen erheblichen Titer an rekombinanten Baculoviren AcNPV. PPV-LCMV (> 108) enthielten, wurden zubereitet.
Ein Klon, der AcPP29-LCMV genannt wird, wurde am 20. Dezember 1995 unter der Nr. V 95122022 bei der Europäischen Sammlung Tierischer Zellkulturen (ECACC) hinterlegt.
* Analyse rekombinanter Proteine.
Die Sf9-Zellen wurden mit rekombinanten Baculoviren mit einem Injektionsgrad von 1 PFU pro Zelle (wobei eine Einheit eine Kolonie pro Zelle bildet) infiziert und die Zellextrakte 72 Stunden nach der Infektion gesammelt.
Ein Proteinspaltungspuffer wurde einem jeden Zellextrakt hinzugefügt und die Gemische auf 100°C während 5 Minuten erhitzt und dann auf SDS-9% PAGE getrennt.
Die Gels wurden mit Hilfe von Coomassie-Blau gefärbt oder auf Nitrozellulosemembranen mit Hilfe einer halbtrockenen Ausrüstung bei 22 Volt während 30 Minuten transferiert.
Die Membranen wurden mit Mäuse-Serum inkubiert, das gegen das CD8-positive LCMV-Epitop (Verdünnung 1/200) während zwei Stunden bei Raumtemperatur gerichtet war.
Nach der Spülung wurden die fixierten Antikörper durch das mit der Peroxidase konjugierte Protein A erfasst (Verdünnung 1/2000) unter Verwendung von 4-Chlornaphthol als Substrat bis zur Entwicklung der Farbe. Die Membranen wurden sodann mit destilliertem blosser gespült, um die Reaktion zu stoppen. Nach Färbung der SDS-Gels mit Coomassie-Blau wurde ein sichtbares Band mit 67 kD in den Sf9-Zellextrakten entdeckt, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert waren. Die beobachtete Größe entspricht der für das Hybridprotein P2-LCMV erwarteten Größe. Die Identität dieses Proteins wird bestätigt durch Immuntransfer. Das spezifische Mäuse-Antiserum zeigt eine sehr klare positive Reaktion mit dem 67 kD Protein der infizierten Zellextrakte. Die intrazelluläre Lokalisierung des rekombinanten Proteins wurde durch Immuntransfer verschiedener Zellfraktionen analysiert. Dies ermöglichte es zu zeigen, dass das Hybridprotein LCMV-VP2 ein lösliches zytoplasmisches Protein ist.
* Reinigung der Partikel
Sf9-Zellen wurden mit Hilfe rekombinanter Baculoviren mit einem Infektionsgrad von 1 PFU pro Zelle infiziert. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Infektion gesammelt, mit PBS gewaschen und durch osmotischen Schock bei 4°C in 25 mM einer Lösung von Bicarbonat lysiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation niedriger Geschwindigkeit entfernt. Die in den Extrakten enthaltenen Partikel wurden dann durch Ausfällung durch eine zu 20% gesättigte Amoniumsulfatlösung gereinigt. Das Präzipitat wurde bei 15000 rpm während 15 Minuten zentrifugiert, erneut in PBS suspendiert und während einer Nacht gegen diesen gleichen Puffer dialysiert. Identität und Eigenschaften dieser Partikel wurden durch SDS-PAGE, Immuntransfer und Elektronenmikroskopie bestätigt.
Diese gereinigten Partikeln wurden zur Immunisierung und Induktion der Zytotoxizität der Lymphozyten (CTL) verwendet.
* Immunisierung von Mäusen
Die Mäuse erhalten auf intraperitonealem Weg eine Injektion einer Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen rekombinanten (PPV-LCMV) oder leere (PPV) Pseudoviruspartikel ohne Adjuvans enthält. Die positiven Proben sind Mäuse, die am Tag 21 auf subkutanem Weg mit dem synthetischen Peptid 118-126 (von der Firma Neosystem, Strassburg, Frankreich, bezogen) mit dem inkompletten Freund-Adjuvans (IFA) injiziert wurden. Die negativen Proben erhalten Pseudopartikel, welche das Epitop LCMV nicht exprimieren.
* Induktion zytotoxischer Zellen
7 bis 14 Tage nach der letzten Immunisierung wird den immunisierten Mäusen die Milz entnommen. 25 x 10⁶ immune Zellen werden in Anwesenheit von 25 x 10⁶ bestrahlten Splenozyten, die von syngenetischen Jungmäusen stammen, in Glasfläschchen, die das Nährmedium (RPMI 1640, 10% fötales Kalbserum, Glutamin und Antibiotikum) enthalten, während 5 Tagen bei 37°C mit 5% CO₂ kultiviert.
Die stimulierenden Zellen werden in vitro mit 0,05 μM des synthetischen Peptids 118-126 oder mit 0,5 μM des synthetischen Peptids 118-132 (ebenfalls von der Firma Neosystem, Strassburg, Frankreich, bezogen) sensibilisiert.
* Zytotoxizitätstest
Die zytotoxische Aktivität der Effektorlymphozyten wurde nach 5 Tagen gemessen. Die Targetzellen P815 werden präinkubiert, entweder mit Nährmedium (negative Proben) oder mit dem synthetischen antigenetischen Peptid und gleichzeitig mit ⁵¹Cr während einer Stunde bei 37°C markiert. Dann werden die Effektorlymphozyten mit den markierten Zellen in unterschiedlichen Effektor/Target-Verhältnissen (E/T-Verhältnis) im Nährmedium in Platten mit 96 rundbödigen Kolben während 4 bis 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Targets werden unter denselben Bedingungen mit Medium, um die spontane Freisetzung des ⁵¹Cr zu messen, und mit Salzsäure 1 N inkubiert, um die maximale Freisetzung des ⁵¹Cr zu messen. Die Aktivität der zytotoxischen Lymphozyten wird bestimmt durch Zählung der Radioaktivität, die im Obenschwimmenden der Kultur vorhanden ist und dem Aussalzen des 5'Cr durch die lysierten Targetzellen entspricht
Die Berechnung wird durchgeführt mit im Nährmedium (P815) inkubieren Targetzellen und mit Targetzellen, die mit dem synthetischen Peptid (P815 + p118-132) inkubiert wurden, wie dies durch die Kurven der 2 bis 4 dargestellt ist.
Resultate
Wie man nach der Prüfung der 2 bis 5 feststellen kann, hat eine einzige Injektion von 10 μg rekombinanter Pseudopartikel, die CD8-positive T-Zell-Epitop des LCMV aufwiesen, es ermöglicht, praktisch 100 Lyse zu eneichen, d.h. ebensoviel wie die positive Probe des synthetischen Peptids p118-126 + FIA, was bestätigt, dass die erfindungsgemäßen Pseudopartikel die Induktion von CTL-Antworten in vivo in einem hohen Grad ohne Hinzugabe eines Adjuvans ermöglichen.
Diese Induktion ist für das eingebaute Epitop spezifisch, denn man erhält keine zytotoxische T-Zell-Antwort, wenn die Mäuse mit äquivalenten Dosen von Pseudopartikeln, die das Epitop LCMV nicht exprimieren, immunisiert sind. Die so induzierten zytotoxischen T-Zellen lysieren spezifisch die Targetzellen P815, die mit dem dem eingebauten Epitop entsprechenden Peptid bedeckt sind.
5 zeigt, dass die Mäuse, denen Pseudopartikel injiziert wurden, gegen die virale Infektion nach 28 Tagen und 4 von 5 Mäusen nach 70 Tagen geschützt sind.
BEISPIEL 2:
Induktion CD4-positiver T-Zell-Antworten, die für ein Epitop des Hepatitis-B-Virus spezifisch sind durch Pseudopartikel des Parvovirus
1) Materialien und Verfahren
Einbau des Epitops PreS:T des HBV am N-Terminus des Proteins VP2 des PPV.
Zwei Oligonucleotide wurden synthetisiert, die für das Epitop PreS:T des HBV kodieren und folgende Sequenzen aufweisen:
Seq ID Nr. 3:
5'TCGAGATGCAATGGAATTCTACCACCTTCCACCAAACCCTGCAAC3'
SEQ ID Nr. 4:
5'TCGAGTTGCAGGGTTTGGTGGAAGGTGGTAGAATTCCATTGCATC 3'
Diese beiden Oligonucleotide sind komplementär und enthalten zwei flankierende Sequenzen der Stelle XhoI an den Extremitäten, um eine direkte Klonierung im Vektor pPPV30 zu ermöglichen. Die Oligonucleotide wurden von ISOGEN (Niederlande) geliefert. Sie wurden phosphoryliert mit Hilfe der Polynucleotidkinase T4, anneliert bei 70°C während 15 Minuten, dann ligiert in Anwesenheit von durch XhoI digeriertem und durch Phosphatase bei 14°C während einer Nacht behandeltem pPPV30. Das Gemisch wurde verwendet, um Zellen der Escherichia coli (Stamm DNS) zu transformieren.
Die Kolonien wurden mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII analysiert, um die Anwesenheit der eingefügten Sequenzen zu prüfen. Die die Sequenz des Epitops enthaltenden Rekombinanten waren Sequenzen, die bestätigten, dass während dieser Manipulationen keine Veränderung oder Mutation stattgefunden hat.
* Konstruktion eines Transfervektors aus den Konstruktionen PreS:T-PPV in den Baculoviren und Gewinnung rekombinanter Baculoviren.
Die rekombinanten Plasmide, die das Epitop PreS:T in korrekter Orientierung enthalten, wurden mit Hilfe von BamHI digeriert, und das modifizierte VP2 wurde im Transfervektor pAcYM1 (Matsuura et al., 1987, J. Gen. Virol. [Zeitschrift für allgemeine Virologie] 68, 1233-1250) subkloniert. Die rekombinanten Klone wurden wie oben beschrieben analysiert und die Sequenzen der Insertionen durch Sequenzierung bestätigt. Der rekombinante Klon wird pAcYMI/PreS:TpPPV30 genannt.
Die rekombinanten Baculoviren wurden durch Transfektion der SF9-Insektenzellen gewonnen, wie in Beispiel 1 beschrieben, und es wurden Viren bestände, welche erhebliche Titer aufwiesen, hergestellt (>10⁸ PFU/ml). Der rekombinante Virus wurde AcPPV30-PreS:T genannt.
Er wurde bei der Europäischen Sammlung Tierischer Zellkulturen (ECACC) unter der Nr. V96081412 am 15. August 1996 hinterlegt.
* Analyse und Reinigung der rekombinanten Proteine
Sf9-Zellen wurden infiziert (SMITH et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165) mit einem Infektionsgrad von 1 PFU pro Zelle mit dem rekombinanten Baculovirus AcPPV30-PreS:T. Die infizierten Zellen wurden 72 Stunden nach der Infektion gesammelt und durch Elektrophorese auf Polyakrylamidgels zu 9% in Anwesenheit von SDS, dann durch Immuntransfer analysiert. Die Resultate zeigen das Vorhandensein des modifizierten rekombinanten Proteins VP2.
Um die Hybridteilchen VP2 zu reinigen, wurden die infizierten Zellen mit Hilfe von 25 mM Natriumbicarbonat lysiert, die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und das die Partikel enthaltende Obenschwimmende wurde mit Hilfe von Ammoniumsulfat zu 20% während 20 Minuten bei 4°C ausgefällt. Der Rest, der erheblich mit VP2-Partikeln angereichert war, wurde durch Zentrifugation gesammelt und erneut gegen PBS während einer Nacht dialysiert. Die gereinigten Partikeln wurden bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
* Stimulation von für das Peptid PreS:T des HBV spezifischen T-Hybridomen durch dieses Peptid exprimierende Pseudopartikel.
10⁵ Zellen des Lymphoms B, M 12C10(H-2^d/a) (6A und B) oder 5,10⁵ bestrahlte Splenozyten von DBA/1-(H-2^q)-Mäusen (6C und D) wurden bei 37°C in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des der Sequenz 120-132 entsprechenden Peptids PreS:T, von rekombinanten Pseudopartikeln PPV-PreS:T oder Pseudopartikeln PPV (VP2) inkubiert, dann verwendet, um 10⁵ 7-Hybridome, 51 E12 (6A und 6C) oder 52A12(6B und 6D), die für das Peptid PreS:T spezifisch und durch die Moleküle I-A^q eingeschränkt waren, zu stimulieren. Nach 24 Stunden wurde das Obenschwimmende der Kultur entnommen und ihm der vom IL-2 abhängige CTLL-Stamm zugemessen. 3 Tage später wird die Proliferation der CTLL-Zellen durch Beimengen von tritiiertem Thymidin gemessen.
* Induktion in Abwesenheit eines Adjuvans von für das Peatid PreS:T des HBV spezifischen, proliferierenden Antworten nach Immunisierung von Mäusen mit dieses Peptid exprimierenden Pseudoviruspartikeln des Parvovirus.
DBA/1- Mäuse (H-2^q) wurden auf subkutanem Weg mit 10 μg, 1 μg, 0,1 μg oder 0,01 μg rekombinanter Pseudoviruspartikel PPV-PreS:T oder 10 μg Pseudoviruspartikel PPV (VP2) immunisiert. Zehn Tage später wurden die Zellen der drainierenden Ganglien in vitro mit unterschiedlichen Konzentrationen des Peptids PreS:T (76A) oder mit 0,5 μg/ml des PPV (VP2) (7B) erneut stimuliert. 4 Tage später wird die Proliferation der Ganglienzellen durch Beimengen von tritiiertem Thymidin gemessen.
* Fähigkeit der rekombinanten Pseudoviruspartikel PPV-PreS:T, eine für das Peatid PreS:T spezifische poliferierende Antwort in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Adjuvans zu induzieren.
DBA/1-Mäuse (H-2Q) wurden auf subkutanem Weg mit 10 μg rekombinanter Pseudoviruspartikel PPV-PreS:T in Salzlösung (PBS) oder in Emulsion mit einem kompletten Freund-Adjuvans (ACF) oder mit 10 μg Pseudoviruspartikel PPV (VP2) in ACF immunisiert. Zehn Tage später wurden die Zellen der drainierenden Ganglien in vitro mit unterschiedlichen Konzentrationen des Peptids PreS:T (8A) oder von PPV (VP2) (Abbidding 8B) erneut stimuliert. Vier Tage später wird die Proliferation der Ganglienzellen durch Beimengen von tritiiertem Thymidin gemessen.
2) Resultate
Das CD4-positive T-Zell-Epitop PreS:T, das in der Region PreS2 (der Sequenz 120-132 entsprechend) des Virus HBV gelegen ist, wurde in das Protein VP2 des Parvovirus eingeführt. Die Kontrollpseudopartikel PPV (VP2) oder rekombinanten Pseudopartikel PPV-PreS:T wurden gereinigt.
Zunächst wurde die Antigenität dieser Partikel in vitro gegenüber für das Epitop PreS:T spezifischen T-Hybridomen analysiert. Wie es in 6 sichtbar ist, stimulieren die Pseudoviruspartikel, welche das Epitop PreS:T enthalten, sehr stark die Produktion von IL-2 durch diese spezifischen T-Hybridome, und zwar auf spezifische Weise im Vergleich zu den Kontrollpseudopartikeln. Vergleicht man in molarer Größe die Wirksamkeit der PPV-PreS:T im Vergleich zum Peptid p120-132, stellt man fest, dass die Pseudopartikel 100- bis 1 000-mal mehr antigen sind als das Peptid.
Die Immunogenität dieser Partikel wurde sodann in vivo getestet, entweder allein in verschiedenen Dosen (mit 0,01 bis 10 μg) (7) oder mit 10 μg in Anwesenheit oder Abwesenheit des kompletten Freund-Adjuvans (8). Diese Erfahrungen haben die sehr starke Immunogenität der Pseudopartikel PPV-PreS:T bewiesen, die in Abwesenheit jeglichen Adjuvans und in schwachen Dosen (eine einzige Injektion von 1 μg) sehr hochgradige proliferierende Antworten gegen das inserierte Epitop induzieren (7). Diese Antworten sind ebenso stark, wenn die Pseudopartikel allein injiziert werden, wie wenn sie in Anwesenheit eines Freund-Adjuvans verabreicht werden (8).
BEISPIEL 3
Konstruktion von Pseudopartikeln, welche mehrere Epitope besitzen.
Zwei Oligonucleotide, welche die ergänzenden Sequenzen SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 aufweisen, wurden hergestellt:
SEQ ID Nr. 5 (MutI +):
5'TCGAGATGTTCGAACAAAACACCGCTCAACCCC 3'
SEQ ID Nr. 6 (MutI):
5'TCGAGGGGTTGAGCGGTGTTTTGTTCGAACATC 3'.
Die Extremitäten 5' eines jeden dieser Oligonucleotide können sich zusammen verbinden, um mehrere Kopien des Epitops zu erzeugen. Die Oligonucleotide wurden phosphoryliert, dann vermischt und auf 70°C während 15 Minuten erhitzt vor der Ligation im Plasmid pPPV29mod, das durch alkaline Phosphatase aus dem Kalbdarm behandelt und durch XhoI digeriert wurde.
Die Ligationsmischungen wurden verwendet, um E. coli DHSa-Bakterien zu transformieren. Die rekombinanten Klone wurden durch Analyse mit Hilfe von Restriktionsenzymen gekennzeichnet. Das Beimengen einer oder mehrerer Kopien oder die fehlende Beimengung des Epitops MutI wurde durch die Bestimmung der Größe des BamHI/HindIII-Fragments nachgewiesen. Die Integrität der Sequenzen des Epitops und ihre Orientierungen wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die modifizierten Gene VP2, welche die Insertionen der Epitope MutI enthielten, wurden durch BamHI digeriert und im Transfervektor der Baculoviren pAcYM1 subkloniert.
Rekombinante Baculoviren wurden aus Cotransfektionen von 500 μg durch Bsu361 linearisierter, viraler DNA AcRP23-LacZ und von 2 μg einzelner Transfervektoren unter Benutzung der Lipofectin-Technik, die bei Felgner et al. (1987, Proceedings of the National Academy Sciences [Verfahren der Nationalen Akadamiewissenschaften] USA 84, 7413-7417) beschrieben ist, gewonnen.
Die rekombinanten Viren wurden auf der Basis ihrer IacZ-negativen Phänotypen ausgewählt und vor der Herstellung von Virenbeständen, die einen bedeutenden Titer für jeden der rekombinanten Viren aufweisen, pro Platte gereinigt.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Rekombinante Pseudoviruspartikel, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Selbstorganisation wenigstens des viralen Strukturproteins VP2 eines Virus der Familie der Parvoviridae oder eines verwandten Virus entstehen, dass sie eine Größe zwischen etwa 20 und 60 nm haben, dass sie eine ungefähr icosaedrische Struktur bilden und dass das Protein VP2 an seinem N-Terminus durch die Anwesenheit wenigstens eines Epitops modifiziert ist, das eine Sequenz von 8 bis 25 Aminosäuren umfasst, die sich an wenigstens ein Molekül der Klasse I des Haupthistokompatibilitäts-komplexes assoziieren kann, wobei die Assoziation von cytotoxischen T-Lymphocyten erkannt wird.
Pseudopartikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop eine Sequenz von 8 oder 9 Aminosäuren umfasst, die sich an wenigstens ein Molekül der Klasse I assoziieren kann.
Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Parvovirus um PPV, CPV oder ein anderes, verwandtes Virus, wie FPLV und MEV, handelt.
Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop ein Epitop des Kemproteins des lymphozytären Choriomeningitis-Virus ist.
Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop das CD8-positive CTL-Epitop ist, das im Bereich 118-132 des Kernproteins des lymphozytären Choriomeningitis-Virus enthalten ist.
Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens ein CD4-positives T-Zell-Epitop und wenigstens ein CD8-positives T-Zell-Epitop umfassen.
Pseudopartikel gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kombination von mehrfachen Kopien von CD8-positiven T-Zell-Epitopen umfassen.
Pseudopartikel gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Kombination von vier Kopien der CD8-positiven T-Zell-Epitope MutI des Lewis-Karzinoms umfassen.
Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Verfahren erhalten werden können, das einen Schritt der Expression des aus dem Protein VP2 von Parvovirus und dem Epitop gebildeten Hybridproteins in Baculovirus umfasst.
Zusammensetzung, die Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem physiologisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie kein immunstimulierendes Adjuvans umfasst.
Verwendung der Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 und 11 zur Herstellung von Medikamenten oder Impfstoffen zur Induktion von CTL-Antworten oder von Cytokinen in vivo.
Verwendung der Pseudopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 und 11 bei der Herstellung von Impfstoffen, insbesondere antiviralen Impfstoffen, oder von Antitumormedikamenten.
Verfahren zur in-vitro-Stimulation der cytotoxischen T-Antworten von Lymphocyten, die von Patienten stammen, die eine virale oder tumorale Infektion erlitten haben, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Lymphocyten der Patienten mit den Pseudopartikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.