NO324205B1 - Rekombinante virale pseudopartikler, sammensetning, anvendelse og fremgangsmate for in vitro stimulering av T-cytotoksiske responser. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår rekombinante, virale pseudopartikler av et virus av familien Parvoviridae eller et beslektet virus. Nevnte virale pseudopartikler er særlig anvendelig for å indusere cytotoksiske TCD8<+> (CTL) responser in vivo på høyt nivå.

Oppfinnelsen angår likeledes preparater inneholdende pseudopartiklene i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av nevnte pseudopartikler eller nevnte preparat for fremstilling av medisinske produkter eller vaksiner, spesielt antivirale vaksiner eller antitumorale medikamenter.

Videre angår oppfinnelsen en invitro fremgangsmåte for stimulering av T-cytotoksiske responser av lymfocytter som stammer fra individer med virale eller tumorale infeksjoner.

I henhold til Fernandez et al. ("Médecine/Sciences", 1995, 11, 975-983) kan responsen på cellulær mediering, spesielt når det gjelder en tumor, deles i to deler: - på den ene side initiering av responsen som medfører involvering av TCD4<+->lymfocyttene og cellene som presenterer antigenet (CPA)og - på den annen side den cytotoksiske effektor respons hvor TCD8<+->lymfocyttene er involvert.

De aktiverte TCD4<+->lymfocytter prolifererer og skiller ut cytokiner, mens de aktiverte TCD8<+> lymfocytter prolifereres og differensieres til cytotoksiske T-lymfocytter (CTL).

Disse to familier av lymfocytter har meget forskjellige funksjoner og aktiveres ved distinkte mekanismer. Stimuleringen av CD4<+->lymfocyttene nødvendiggjør assosiasjon av et peptid, som stammer fra nedbrytningen av antigenet, med molekyler av klasse IT av "major" histokompatibilitetskomplekset (MHC), mens CD8<+> cellene nødvendiggjør assosiasjon av et peptid til molekyler av klasse I av MHC.

En rekke profylaktiske og terapeutiske strategier har allerede blitt foreslått for å bekjempe sykdommer av forskjellige opprinnelser hos mennesker og dyr som skyldes virus, bakterier, parasitter, eller mot cancerøse eller tumorale sykdommer.

For eksempel er induksjon av CTL-responser in vivo med "levende" vektorer allerede beskrevet. Imidlertid er disse vektorer ikke garantert trygge, særlig i immunokompromiterende individer. På den annen side bevarer systemene som er forbundet med replikasjon av de "levende" vektorer ikke deres effektivitet hos immune individer.

Martinez et al. angir i "Vaccine" (vol. 10, sidene 684-690, 1992) anvendelsen av tomme kapsider av svine-parvovirus (PPV) ved vaksinering av svin. Familien av Parvoviridae omfatter virus som i stor grad er spredt hos pattedyr som svin, fe, katter, kaniner, rotter og mennesker. Imidlertid er parvovirus relativt spesifikke for vertsdyrene. Svine-parvovirus (PPV) er særlig ansvarlig for tallrike infeksjoner ved industrielt oppdrett av svin. Svine-parvovirus (PPV) består av en isometrisk, ikke-omhyllet partikkel på 20 nm i diameter og med ikosaedrisk symmetri, inneholdende et enkeltstreng-DNA-molekyl. Det består av to kapsidproteiner, VP1 (83 kDa) og VP2 (64 kDa) samt et tredje protein, VP3, som stammer fra proteolyse av VP2.

Proteinet VP2 kan produseres av insektceller ved hjelp av et rekombinant baculovirussystem og de oppnådde VP2-proteiner er i stand til autosammenføyning for å danne virale pseudopartikler som har samme størrelse som det native virion. Vaksina-sjon av svin mot PPV realiseres ved å immunisere dem med en blanding av de nevnte kapsider med assosiasjonen hjelpe-alhydrogel (ved 50%) + Quil A 500 ug (Superfos). En sammenliknbar lærdom til hva som finnes i denne artikkel gjenfinnes i EP 551 449 og EP 554 414 som videre antyder at epitopene som tilsvarer andre virale proteiner kan innarbeides i kapsider, uten at arten av disse epitoper er nærmere presisert.

EP 647 655 angår syntetiske peptider som tilsvarer de antigene seter av VP2. Det dreier seg således ikke om hele proteinet.

Sedlik et al. beskriver i "Journal of General Virology" (76 : 2361-2368, (1995))

i anvendelsen av hybride partikler av PPV som vektorer for to epitoper av poliovirus,

C3:B og C3:T, som gjenkjennes av henholdsvis B-lymfocytter og CD4<+> T-lymfocytter. Partiklene inneholdende epitopen C3:TCD4<+> og har vist seg kun å stimulere de proliferative responser av CD4<+> T-celler, men ikke CD8<+> T-celler. Utover denne

stimuleringsspesifisitet forblir responsene på et relativt lavt nivå, utilstrekkelig for en ; effektiv immunisering. Uansett krever induksjonen av disse responser obligatorisk anvendelsen av et hjelpestoff (aluminiumhydroksid eller Freunds fullstendige adjuvant).

Videre vil forsøk på modifisering av pseudopartiklene med henblikk på innarbeiding av heterologe epitoper møte på vanskeligheter slik som inhibering av dannelsen av pseudopartikler. Selv om de sistnevnte faktisk dannes, er den heterologe epitop ikke nødvendigvis immunogen, og epitopen kan for eksempel være lokalisert på et sted der den er ute av stand til å innta den naturlige konformasjon eller bli produsert av celler som oppviser antigenet.

I likhet med vaksiner med "levende" vektorer, er sikkerheten av disse hybride partikler kombinert med adjuvanten ikke helt sikret ettersom en toksisitet kan komme fra visse egenskaper hos adjuvanten som kan fremkalle sekundære virkninger som er skadelige for organismen.

Det ligger således i den kjente teknikk at man ikke kjenner pålitelige systemer som effektivt tillater å stimulere den cytotoksiske T-lymfocytt respons og T-hjelpecelle respons uten risiko for helsen hos individet som behandles og uten anvendelse av immunostimulatoriske adjuvanter.

Det har videre vist seg at hybridpartiklene, som inneholder epitopen C3:T, ikke er i stand til å indusere en effektiv T CD4<+->respons i fravær av adjuvant.

Foreliggende søkere har vist at det er mulig spesifikt og uten bruk av immunoadjuvanter å fremkalle en lymfocytær CD8<+->respons ved hjelp av pseudopartikler som bærer epitopen ansvarlige for å assosiere seg med minst et molekyl av klasse I MHC.

Et første aspekt ved oppfinnelsen angår således rekombinante virale pseudopartikler, kjennetegnet ved at de er dannet ved autosammenføyning av minst det virale strukturproteinet VP2 av et virus i familien Parvoviridae, eller et beslektet virus, ved at de har en størrelse mellom 20 og 60 nm, ved at de danner en approksimativ ikosaedrisk struktur, og ved at VP2 proteinet er modifisert, i dets N-terminale ende, ved tilstedeværelse av minst en epitop omfattende en sekvens på 8 til 25 aminosyrer i stand til å assosiere med minst et major-histokompatibilitetskompleks av klasse I, idet nevnte assosiasjon gjenkjennes av cytotoksiske T-lymfocytter.

TCD8<+->lymfocyttene ifølge oppfinnelsen er i stand til å gjenkjenne minst en epitop omfattende en sekvens på 8 til 9 aminosyrer i stand til å assosiere seg med minst et molekyl av klasse I av MHC.

TCD4<+->lymfocyttene ifølge oppfinnelsen er i stand til å gjenkjenne en sekvens omfattende mellom 8 og 25 aminosyrer i stand til å assosiere seg med minst et molekyl av klasse II av MHC.

Partiklene ifølge oppfinnelsen kan omfatte proteiner av forskjellige typer og danne hybridpartikler. De kan for eksempel bestå av proteinene VP2 og VP1.

Assosiasjonen som dannes mellom sekvensen tilsvarende epitopen og molekylene av klasse I gjenkjennes av reseptoren for lymfocyttene TCD8<+> og induserer en differensiering og en proliferering av disse lymfocytter.

Nevnte sekvens kan være avgrenset av regioner kalt flankører, i stand til å modulere dens nedbrytning, det vil si å lette produksjonen under nedbrytningen av antigenet, eller å lette dets fiksering til molekyler av klasse I MHC.

De flankerende områder kan tilsvare aminosyrer som flankerer epitopen T, CD8<+> i dens naturlige omgivelse. Rent generelt kan de bestå av flere aminosyrer og særlig alanin eller lysin.

Pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen oppviser en primær betydning som stammer fra sikkerheten for denne immuniseringsmåte, idet vektoren som benyttes er ikke-replikativ og består av en enkelt type viralt protein og kan administreres sågar til immunokompromiterende individer.

En annen fordel ved pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen ligger i fraværet av kryssende reaksjoner med human parvovirus og således i fravær av problemer forbundet med en forimmunisering av individene som eventuelt kan føre til en lav immunogenitet for denne type rekombinante vaksiner.

Videre nødvendiggjør pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen ikke replikering av vektoren og kan således bevare sin effektivitet ved anvendelse på immune individer.

Likeledes har pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen en utmerket immunogenisitet, en enkelt immunisering er tilstrekkelig, og kan således benyttes i fravær av immunostimulerende adjuvanter.

Fortrinnsvis er parvovirusen PPV, CPV (kanin-parvovirus) eller en annen beslektet virus som FPLV (Feline Panleukopenia-virus) og MEV (Mink Enteritis-virus).

Epitopen kan bestå av en hvilken som helst sekvens som fikseres til et molekyl av MHC av klasse I og i stand til å indusere en lymfocytær T-cytotoksisitet. Den kan særlig være en epitop TCD8<+> av et virus som HIV-1 eller HIV-2, eller influensavirusen, eller en tumoral virus eller eksprimert av cancerøse celler.

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse karakteriseres pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen ved at den valgte epitop er en epitop av lymfocyttisk koriomeningitt virus nukleoprotein.

I henhold til en fordelaktig utførelsesform karakteriseres pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen ved at den valgte epitop er epitopen CTL CD8<+> inneholdt i området 118-132 av nukleoproteinet av virusen av den lymfocytære koriomeningitt (LCMV).

Epitopen kan ikke desto mindre være en hvilken som helst annen epitop som er i stand til å indusere en CTL-respons, for eksempel en av de følgende epitoper: - epitopene av proteinene Env gpl20, Env gp41, Gag pl7, Gag p24, Gag pl5, Pol og Nef, Hiv-virus og epitoper av proteinene Gag, og nef av virus SIV og Gag av virus fflV-2 som definert av Venet og Walker i "AIDS", 1993, vol. 7, suppl. 1, 119-120. - epitoper av proteiner som uttrykkes av tumorer som utvikles hos menneskelige vesener, for eksempel proteiner som uttrykkes av genene MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1,2, HER-2/neu og antigenene fra melanocytisk differensiering som tyrosinase, Pmell7gpl00, Melan-AMART-1 og gp 75TRP1, definert av Van Den Eynde og Brichard ("Current Opinion in Immunology", 1995, 7, 674-681).

For også å kunne indusere TCD4<+->respons eller en resulterende respons ved produksjon av lymfokiner, kan epitopen være epitopen TCD4<+> PréS:T som befinner seg i området PréS2 (sekvens 120-132) av hepatitt-B-virusen (HBV).

Pseudopartikkelen kan også omfatte en kombinasjon av epitoper og særlig:

- minst en epitop TCD4<+> og minst en epitop TCD8<+>,

- en kombinasjon av multikopier av epitopene TCD4<+> eller TCD8<+>,

- en kombinasjon av fire kopier av epitopene TCD8<+> Mut av Lewis-karsinomet.

Ved kombinasjon av epitoper, menes her en kombinasjon omfattende minst to epitoper og på fordelaktig måte mellom to og ti epitoper av identiske proteiner som for eksempel en multikopi av Mutl-epitoper av Lewis-karsinomet eller forskjellige proteiner. Således kan en multikopikombinasjon av epitopene TCD8<+> omfatte minst to epitoper og fortrinnsvis mellom to og ti epitoper fra forskjellige proteiner som for eksempel assosiasjonen av en epitop TCD8<+> av nukleoproteinet av lymfocytære koriomeningitt og en epitop TCD8<+> Env. gp41 av HIV.

Fortrinnsvis er de rekombinante, virale pseudopartikler i stand til å kunne oppnås ved en fremgangsmåte omfattende et trinn med ekspresjon i baculovirus, idet det kimære protein består av proteinet VP2 av parvovirusen og nevnte epitop.

Pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen oppnås på ennu mere foretrukken måte ved auto-sammensetning av proteinet VP2 av parvovirusen, modifisert ved nærværet, ved den N-terminale ende, av minst en epitop av nukleoproteinet av LCMV eller minst en epitop av HB V eller også en kombinasjon av epitop-multikopier.

Man merker seg at et hvilken som helst annet molekyl og særlig et hvilket som helst annet protein som oppviser egenskaper tilsvarende VP2, som auto-sammensetning, og som kan modifisere med en epitop, kan anvendes innenfor rammen av oppfinnelsen og erstatte VP2.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelsen av pseudopartikler i effektiv, immuniserende mengde, for induksjon av CTL-responser og/eller hjelpe TCD4<+->responser in vivo i forhøyet grad.

Med uttrykket "effektiv, immuniserende mengde" menes en mengde som velges som funksjon av administreringsvei og individvekt for pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er den administrerte mengde mellom 10 og 500 ug pseudopartikler pr. individ.

Oppfinnelsen angår også et preparat omfattende pseudopartiklene i en bærer og/eller et fortynningsmiddel som kan aksepteres ut fra et immunologisk synspunkt. Som fortynningsmiddel kan man benytte en vandig oppløsning som er bufret til nær pH 7 (fysiologisk oppløsning).

På fordelaktig måte er preparatet ifølge oppfinnelsen fri for immunostimulerende adjuvant. Den kan imidlertid ikke desto mindre, hvis nødvendig, inneholde en slik adjuvant som kan være aluminiumhydroksyd.

Pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen kan også benyttes i en fremgangsmåte for in vitro-stimulering av cytotoksiske T-responser av lymfocytter som stammer fra subjekter med virale eller tumorale infeksjoner omfattende å bringe lymfocyttene av subjektene i kontakt med pseudopartiklene. I dette tilfellet blir cellene, etter behandling, readministrert til pasientene, for eksempel ved injeksjon.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelsen av pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av en vaksine, fortrinnsvis i enhetsdoser, særlig antitumoral eller antiviral vaksine. Den kan administreres ved hjelp av de vanlige veier for administrering av vaksiner, altså intramuskulært, intradermalt, subkutant eller også oralt eller på en hvilken som helst annen måte som tillater aktivering av en CTL- og/eller CD4<+->respons.

Figur 1 viser fremgangsmåten for oppnåelse av et plasmid pPPV29.

Figur 2 omfatter tre diagrammer 2(a), 2(b) og 2(c) som illustrerer immunisering av mus i to trinn, ved dO og d21 med respektivt 10 og 50 ug pseudopartikler ifølge oppfinnelsen, uten adjuvant. På d28 blir splenocyttene stimulert in vitro over en periode på 5 dager med syngeniske splenocytter som er preinkubert med det syntetiske peptid 118-132. Den cytotoksiske T-lymfocytære aktivitet måles på målene P815 som er preinkubert med medium eller med syntetisk peptid 118-132. Resultatene er uttrykk som % lysering, forholdet E:T er angitt langs abscissen idet dette uttrykk E:T angir forholdet effektorlymfocytter:målceller. Figur 2(a) angår de resultater som oppnås med partikkelen PPV-29LCMV, figur 2(b) de resultater som oppnås med partikkelen PPV-30LCMV og figur 2(c) er en sammenligning med ikke-modifiserte pseudopartikler. Figur 3 omfatter 7 diagrammer 3(a), 3(b), 3(c), 3(d), 3(e), 3(f) og 3(g) som viser immunisering av mus i to trinn på dO og d21, med forskjellige doser, respektivt 50 ug for figur 3(a), 10 ug for figur 3(b), 2 ug for figur 3(c), 0,4 ug for figur 3(d), 0,08 (xg for figur 3(e) av pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen, uten adjuvant.

På dag 28 blir splenocyttene stimulert in vitro i 4 dager med syngeniske splenocytter, preinkubert med det syntetiske peptid 118-132. Den cytotoksiske, T-lymfocytære aktivitet måles på målene P815, preinkubert med medium eller med det syntetiske peptid 118-132. Kontrollmus mottar en injeksjon på dag 21. med 100 ug syntetisk peptid 118-126 med ufullstendig Freund-adjuvant (IFA)

(figur 3(g)) eller kontroll-pseudopartikler (figur 3(fj). Resultatene er uttrykt i prosent lysering på samme måte som i figur 2.

Figur 4 omfatter, på samme måte som figur 2, tre diagrammer 4(a), 4(b) og 4(c) som viser immuniseringen av mus med en enkelt injeksjon på 10 (ag eller 50 ug av pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen, uten adjuvant. På d!4 blir splenocyttene stimulert in vitro i 5 dager med syngeniske splenocytter som er preinkubert med det syntetiske peptid 118-132. Den cytotoksiske T-lymfocytære aktivitet måles på mål-P815 som er preinkubert med mediet eller med det syntetiske peptid 118-132. Resultatene er uttrykt i % lysering på samme måte som når det gjelder figur 2. Figur 5 omfatter to diagrammer 5(a) og 5(b) som viser beskyttelsen av BALB/c-mus, injisert intraperitonealt (i.p.) på dagene 0 og 21 med PBS, med tomme pseudopartikler (PPV) som uttrykker sekvensen 118-132 av nukleoproteinet av LCMV (PPV-LVMC), eller med virus av stammen Armstrong (LCMV-Arms), mot infeksjon med LCMV på henholdsvis dag 28 (5(a)) og dag 70 (5(b)). Musene infiseres intracerebralt med 10<1>'<7> PFU/mus. Musenes dødelighet forfølges daglig i 10 dager og resultatene er uttrykt som % overlevelse blant dyrene i hver gruppe. Figurene 6A til 6D viser stimuleringen av T-hybridomer med epitopen TCD4<+> PréS:T av HBV, 51 El2 (6A og 6C) eller 52A12 (6B og 6D), med celler av lymfom B (6A og 6B) eller bestrålte splenocytter (6C og 6D) i nærvær av peptidet PréS:T, av rekombinante pseudopartikler PPV-PréS:T eller av PPV(VP2) pseudopartikler. Figurene 7A og 7B viser den proliferative respons for de ganglionære celler som er stimulert in vitro med peptidet PréS:T (figur 7A) eller pseudopartiklene PPV (VP2) (figur 7B), hvilke celler stammer fra DBA/1-mus som er immunisert med 0,01 ug PPV-PréS:T eller 10 ug PPV (VP2), i fravær av adjuvant. Figurene 8A og 8B representerer proliferering av de ganglionære celler fra DBA/1-mus immunisert med PPV-PréS:T i PBS-medium eller i nærvær av Freunds

komplette adjuvant eller PPV (VP2), restimulert med peptidet PréS:T (figur 8A) eller PPV (VP2) (figur 8B).

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere under henvisning til de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1: Induksjon av den lymfocytære T-cytotoksisitet med pseudopartikler ifølge oppfinnelsen som bærer en epitop av nukleoproteinet av LCMV

Den heterologe CTL-epitop, CD8<+> inneholdt i området 118-132 av nukleoproteinet av LCMV innføres i PPV VP2 genet uten å endre den senere dannelse av pseudopartikler. Det oppnås to partikler, PPV-29 LCMV og PPV-30 LCMV, som kun skiller seg ved initieringskodonet. Disse kimære proteiner produseres av et system av baculovirus og renses ved presipitering med ammoniumsulfat fra lysatet av insektceller ifølge den metode som er beskrevet i "Journal of General Virology", 76, sidene 2361-2368 (1995).

Kapasiteten for disse rekombinante partikler til å indusere cytotoksiske, T-lymfocytære responser er analysert in vivo på BALB/c-mus.

Materiell og metoder

Innføring av epitopen LCMV CD8<+> i Xhol-setet av den N-terminale ende av VP2 Som vist i figur 1, oppnås vektoren pPPV29 ved fordøyelse og erstatning av fragment Xhol-Ncol av vektoren pPPV17R, stammende fra vektoren pPPV17 som beskrevet av Martinez et al. i 1992, "Vaccine", 10, 684-690, med to PCR-amplifiseringsprodukter, for å eliminere et område som er til stede i polykloningsetet av pPPV17R og initieringskodonet av VP2. Disse vektorer, pPPV17 og pPPV17R, skiller seg kun ved orienteringen av det klonede VP2 gen i forhold til polylinkeren. Alle PCR-amplifiseringer gjennomføres i et totalvolum på 100 (il med en enhet DNA-polymerase Vent (New England Biolabs), 10 ng pPPV17R som matriks, 100 um dNTPer og 800 ng av hver primer, amplifiseringene gjennomføres i løpet av 25 denatureirngssykler ved 93 °C i løpet av 1 minutt, der annelering av primeren gjennomføres ved 50 °C i løpet av 1 minutt og ekstensjonen ved 72 <H>C i 3 minutter. Produktene av denne PCR klones i pPPV17R, fordøyes med Xhol og Ncol og defosforylert. Ligeringsblandingenebenyttes for å transformere E. coli DH5-bakterier. På denne måte oppnås to plasmider: pPPV29 som inneholder et enkelt kloningssete Xhol ved siden av det opprinnelige ATG-kodon av VP2, og pPPV30 som inneholder et enkelt kloningssete Xhol, men uten initieringskodonet ATG.

Vektoren pPPV29 mod oppnås på følgende måte: genet VP2 oppnås ved fordøyelse av pPPV29 med Pstl og etterfølgende ligering inn i kloningssetet Pstl av plasmidet pMTL24 for å tilveiebringe setene BamHl for subkloning inn i overføringsvektorer for baculovirusen.

To oligonukleotider som koder for epitopen CD8<+> og initieringskodonet, og som inneholder to Xhol-seter, syntetiseres. De oppviser de følgende sekvenser:

Disse to komplementære oligonukleotider er tilveiebrakt fra MedProbe (Norge). De fosforyleres ved hjelp av polynukleotidkinase T4, anneleres ved 70 °C i 15 minutter og ligeres inn i setet Xhol av plasmidet pPPV29mod fordøyd med Xhol; som inneholder genet som koder for PPV-VP2.

Celler av stammen Escherichia coli DH5 transformeres med ligeringsblandingen og spres på LB-medium inneholdende 100 ug/ml ampicillin (Hanahan, 1983, "J. Mol. Biol.", 166, 557-580). Rekombinantene inneholdende innskuddet LCMV seleksjoneres og sekvenseres deretter ved dideoksymetoden for å bestemme orienteringen og integriteten for de innskutte sekvenser. Den rekombinante klon inneholdende sekvensen LCMV i adekvat orientering kalles pPPV29mod/LCMV.

Konstruksjon av overføringsvektorer til baculovirus og seleksjon av rekombinante baculovirus

Den kimære sekvens VP2 oppnås fra vektoren pPPV29mod/LCMV ved fordøyning med BamHI og subklones inn i det unike restriksjonssetet BamHI i baculovirusen PAcYMl overføringsvektoren.

De rekombinante kloner fremstilles som beskrevet ovenfor og analyseres ved mini-preparasjonsmetoden for plasmidisk DNA og ved restriksjonskartlegging. Innskudds-sekvensene for de positive kloner sekvenseres for å verifisere på ny integriteten av det innskutte epitop samt de flankerende sekvenser. Til slutt blir dette DNA som er renset med fenol presipitert med 2 volumer etanol. Den således oppnådde, rekombinante klon kalles pAcYMl/LCMV/ppv29 mod.

For å oppnå rekombinante baculovirus blir en blanding av 2 ug DNA av overførings-vektoren renset og 500 ng parental DNA AcRP231acz+ tilsettes til insektcellene Sf9 i nærvær av transfeksjonsreaktant DOTAP (Boehringer Mannheim) i henhold til leveran-dørens instruksjoner. Transfeksjonen følges inntil den cytopatiske virkning er total. Etter 9 dager blir kulturene gjenvunnet og den klarede supernatant benyttes for isolering av populasjoner av rekombinante baculovirus i henhold til metoder som allerede er kjent av fagmannen og beskrevet av Sedlik et al. ("J. Gen. Virol.", 1995, 76, 2361-2368). De rekombinante kloner seleksjoneres ved anvendelse av deres hvite fenotype (hvit populasjon: rekombinant; blå populasjon: vill-fenotype).

De rekombinante baculovirus renses inntil det ikke lenger kan detekteres noen blå populasjon. Virusforråd som oppviser en betydelig mengde av rekombinant baculovirus AcNPV.PPV-LCMV (> IO<8>) fremstilles.

En klon, kalt AcPP29-LMCV, ble deponert ved "European Collection of Animal Cell Cultures" (ECACC) den 20. desember 1995 under aksessnummeret V 95122022.

Analyse av de rekombinante proteiner

Sf9-cellene infiseres med de rekombinante baculovirus i en infeksjonsgrad på 1 pfu pr. celle (en populasjonsdannende enhet pr. celle) og celleekstraktene samles 72 timer etter infeksjon.

Buffer for dissosiasjon av proteinet settes til hvert celleekstrakt og blandingen oppvarmes til 100 °C i 5 minutter og separeres på SDS-9% PAGE.

Gelene farges ved hjelp av coomassie-blått eller overføres på nitrocellulosemembraner ved hjelp av et halvtørt utstyr, ved 22 volt i 30 minutter.

Membranene innkuberes med museserum som er rettet mot epitopen LCMV CD8<+>

(fortynning 1:200) i 2 timer ved omgivelsestemperatur.

Etter vasking blir de fikserte antistoffer detektert med protein A, konjugert med peroksi-dase (fortynning 1:2000) under anvendelse av 4-klomaftol som substrat inntil fargen ble dannet. Membranene skylles deretter med destillert vann for å stanse reaksjonen. Etter farging av SDS-gelene med coomassie-blått detekteres et synlig bånd ved 67 kD i ekstraktene av Sf9-celler som er infisert med rekombinante baculovirus. Den observerte størrelse tilsvarer den størrelse som ventes for det kimære protein VP2-LCMV. Identiteten til dette protein bekreftes ved immunooverføring. Muse-antiserumet viser spesifikt en meget klar, positiv reaksjon med proteinet på 67 kD fra disse infiserte celleekstrakter. Den intracellulære lokalisering av det rekombinante protein analyseres ved immunooverføring av forskjellige, cellulære fraksjoner. Dette tillater å vise at det kimære protein LCMV-VP2 er et oppløselig, cytoplasmisk protein.

Rensing av partiklene

Sf9-cellene infiseres ved hjelp av rekombinant baculovirus i en infeksjonsgrad på 1 pfu pr. celle. Cellene samles 72 timer etter infeksjon, vaskes med PBS og lyseres ved osmotisk sjokk ved 4°C i en 25 mM bikarbonatoppløsning. Celleavfallstoffene fjernes ved sentrifugering ved lav hastighet. Partiklene inneholdt i ekstraktene renses så ved presipitering i en mettet 20 % ammoniumsulfatoppløsning. Presipitatet sentrifugeres ved 15000 o/min. i 15 minutter, suspenderes igjen i PBS og dialyseres over natten mot den samme buffer. Identiteten og egenskapene for disse partikler bekreftes ved SDS-PAGE, immunooverføring og elektronmikroskopi.

De rensede partikler benyttes for immunisering og induksjon av lymfocytær cytotoksisitet (CTL).

Immunisering av mus

Musene mottar intraperitonealt en injeksjon av et preparat inneholdende de rekombinante, virale pseudopartikler ifølge oppfinnelsen (PPV-LCMV) eller tomme (PPV), i fravær av adjuvant. Positive kontroller er mus som på dag 27 injiseres subkutant med det syntetiske peptid 118-126 (levert av firma Neosystem, Strasbourg, Frankrike) i Freunds ufullstendige adjuvant (EFA). Negative kontroller mottar pseudopartikler som ikke uttrykker epitopen LCMV.

Induksjon av cytotoksiske celler

7 til 14 dager etter den siste immunisering blir milten tatt ut av de immuniserte mus.

25 x IO<6> immunceller bringes i kultur i nærvær av 25 x IO6bestrålte splenocytter fra syngeniske, native mus, i kolber inneholdende næringsmedium (RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum, glutamin og antibiotikum) i 5 dager ved 37 °C og 5 % CO2.

De stimulerende celler sensibiliseres in vitro med det syntetiske peptid 118-126 ved 0,05 uM eller med det syntetiske peptid 118-132 (likeledes levert av firma Neosystem, Strasbourg, Frankrike) ved 0,5 uM.

Cytotoksisitetstest

Den cytotoksiske aktivitet lymfocyttene utøver måles etter 5 dager. Målcellene P815 preinkuberes enten med næringsmedium (negativ kontroll) eller med det syntetiske, antigeniske peptid og merkes samtidig med <51>Cr i 1 time ved 37°C. Deretter blir effektorlymfocyttene innkubert med de merkede celler i forskjellige forhold mellom effektor og målceller (E:T) på et næringsmedium i 96 brønners plater med rund bunn i 4 til 5 timer ved 37 °C. Målcellene innkuberes i medium under de samme betingelser for å måle den spontane frisetting av <51>Cr, og med IN saltsyre for å måle den maksimale frisetting av 51 Cr. Den cytotoksiske lymfocyttaktivitet bestemmes ved telling av radioaktiviteten som er til stede i kultursupernatantene, som svarer til de lyserede målcellers frigivelse av 51Cr.

Beregningen gjennomføres med målceller som er innkubert i næringsmedium (P815) og med målceller som er innkubert med det syntetiske peptid (P815 + pl 18-132), som vist ved kurvene i figurene 2 til 4.

Resultater

Som man har kunnet fastslå etter en undersøkelse av figurene 2 til 5, har en enkel injeksjon på 10 ug av de rekombinante pseudopartikler som oppviser epitopen T, CD8<+ >av LCMV, tillatt praktisk talt å oppnå 100% lysering, det vil si like mye som det positive kontroll syntetisk peptid Pl 18-126 + F1A, noe som bekrefter at pseudopartiklene ifølge oppfinnelsen tillater å indusere CTL-responser in vivo ved et forhøyet nivå uten tilføyelse av adjuvant.

Denne induksjon er spesifikk for epitopen fordi ingen cytotoksisk T-respons oppnås når

musene immuniseres med ekvivalente doser av pseudopartikler som ikke uttrykker epitopen LCMV. De således induserte cytotoksiske T-celler lyserer spesifikt P815

målcellene som er omsluttet av peptidet som tilsvarer den innskutte epitop.

Figur 5 viser at musene i hvilke pseudopartiklene er injisert, er beskyttet mot virale infeksjoner i 28 dager og at 4/5 av musene er beskyttet ved 70 dager.

EKSEMPEL 2: Induksjon av T-respons, CD4<+>, spesifikk for en epitop av hepatitt-B-virus med pseudopartikler av parvovirus

1) Materiell og metoder

Innføring av epitopen PréS:T av HBV ved den N-terminale ende av PPV-VP2 proteinet

Det syntetiseres to oligonukleotider som koder for epitopen Prés:T av HBV med følgende sekvenser:

Disse to oligonukleotider er komplementære og inneholder to sekvenser som flankerer Xhol-setet ved endene for å tillate en direkte kloning inn i vektoren pPPV30. Oligonukleotidene er levert av ISOGEN (Nederland). De er fosforylert ved hjelp av polynukleotidkinase T4, annelert ved 70 °C i 15 minutter og deretter ligert i nærvær av pPPV30 som er fordøyd med Xhol og behandlet med fosfatase ved 14 °C over natten. Blandingen benyttes for å transformere Escherichia coli-celler av stammen DH5.

Koloniene analyseres ved hjelp av restriksjonsenzymer EcoRI og Hindffl for å verifisere nærværet av innskutte sekvenser. Rekombinantene inneholdende sekvensen av epitopen sekvenseres for å bekrefte at ingen endring eller mutasjon har skjedd under disse mani-puleringer.

Konstruksjon av en overføringsvektor for konstruksjonene PréS:T-PPV i baculo-virusene og oppnåelse av rekombinante baculovirus

De rekombinante plasmider inneholdende epitop PréS:T i en riktig orientering fordøyes ved hjelp av BamHI og modifisert VP2 subklones inn i overføringsvektoren pAcYMl (Matsuura et al. 1987, "J. Gen. Virol." 68, 1233-1250). De rekombinante kloner analyseres som beskrevet ovenfor og innskytningssekvensene bekreftes ved sekvensering. Den rekombinante klon kalles pAcYml/PréS:T-pPPV30.

De rekombinante baculovirus oppnås ved transfeksjon av SF9 insektceller som beskrevet i eksempel 1 og virusforrådet som oppviser betydelige titere prepareres (>10g pfu/ml). Den rekombinante virus kalles AcPPV30-PréS:T.

Den er deponert ved "European Collection of Animal Cell Cultures" (ECACC) under aksessnummeret V96081412 den 15. august 1996.

Analyse og rensing av rekombinante proteiner

Sf9-celler infiseres (Smith et al., 1983, "Mol. Cell. Biol.", 3, 2156-2165) i en infeksjonsgrad av 1 pfu/celle med den rekombinante baculovirus AcPPV30-PréS:T. De infiserte celler samles 72 timer etter infeksjon og analyseres ved elektroforese på 9% polyakrylamidgel i nærvær av SDS og så ved immunooverføring. Resultatene viser nærværet av modifisert, rekombinant protein VP2.

For å rense de kimære VP2-partikler, ble de infiserte celler lysert ved hjelp av 25 mM natriumbikarbonat, cellerestene fjernes ved sentrifugering og supernatanten inneholdende partiklene presipiteres ved hjelp av 20 % ammoniumsulfat iløpet 20 minutter ved 4°C. Bunnfallet som betydelig er anriket på VP2-partikler samles ved sentrifugering og dialyseres nok en gang mot PBS over natten. De rensede partikler oppbevares ved 4 °C til bruk.

Stimulering av spesifikke T-hybridomer for peptidet PréS:T av HBV med pseudopartikler som utrykker dette peptid

IO<5> lymfome B-celler, M12C10(H-2<d/q>) (figur 6A og B) eller 5 x 105 bestrålte splenocytter fra DBA/1 (H-2d/q) -mus (figur 6C og D) inrikuberes ved 37 °C i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av peptidet PréS:T tilsvarende sekvensen 120-132, i nærvær av rekombinante PPV-PréS:T pseudopartikler eller PPV (VP2) pseudopartikler, og disse celler ble så benyttet for å stimulere 105 T-hybndomer, 51 El 2 (6A eller 6C) eller 52A12 (6B og 6D), spesifikke for peptidet PréS:T og avgrenset av molekylene 1-Aq; etter 24 timer blir kultursupernatantene fjernet og så titrert med den IL-2 avhengige CTLL linje. Tre dager senere måles prolifereringen av CTLL-cellene ved innkorporering av tritiert thymidin.

Induksjon, i fravær av adjuvant, av den proliferative respons spesifikk for peptidet PréS:T av HBV etter immunisering av mus med virale pseudopartikler av parvovirus som utrykker peptidet

DBA/1 (H-2<q>)-mus immuniseres subkutant med 10 ug, 1 ug, 0,1 ug eller 0,01 ug rekombinante virale PPV-PréS:T pseudopartikler eller 10 ug virale PPV (VP2) pseudopartikler. 10 dager senere blir ganglioner ("ganglions drainants") restimulert in vitro med forskjellige konsentrasjoner av PréS:T peptidet (figur 76A) eller med 0,5 ug/ml PPV (VP2) (figur 7B). 4 dager senere måles prolifereringen av de ganglionære celler ved innkorporering av tritiert thymidin.

Kapasitet hos de rekombinante, virale PPV-PréS:T pseudopartikler til å indusere den proliferative respons spesifikk for PréS:T peptidet i nærvær eller fravær av adjuvant

DBA/1 (H-2<q>)-mus immuniseres subkutant med 10 (ag rekombinante, virale PPV-PréS:T pseudopartikler i saltoppløsning (PBS) eller i emulsjon med Freunds komplette adjuvant (FCA), eller med 10 ug virale PPV (VP2) pseudopartikler i CFA. 10 dager senere blir ganglionceller ("ganglions drainants") restimulert in vitro med forskjellige konsentrasjoner av PréS:T peptidet (figur 8A) eller PPV (VP2) (figur 8B). 4 dager senere måles prolifereringen av de ganglionære celler ved innkorporering av tritiert thymidin.

2) Resultater

Epitopen T, CD4<+> PréS:T som befinner seg i området PréS2 (tilsvarende sekvensen 120-132) av HBV-virusen ble innført i VP2 proteinet av parvovirusen. Kontroll PPV (VP2) pseudopartikler eller rekombinante PPV- PréS:T pseudopartikler renses.

I et første trinn analyseres antigenisiteten for partiklene in vitro vis å vis T-hybridomer som er spesifikke for PréS:T epitopen. Slik det fremgår av figur 6 stimulerer virale pseudopartikler inneholdende PréS:T epitopen meget sterkt produksjonen av IL-2 som fremkalles av disse spesifikke T-hybridomer og dette på spesifikk måte i forhold til kontroll pseudopartiklene. Hvis man sammenligner effektiviteten av PPV-PréS:T med peptidet pl 20-132 på molar basis, fastslår man at pseudopartiklene er 100 til 1000 ganger mer antigeniske enn peptidet.

Immunogenisiteten av partiklene testes deretter in vivo, enten alene i forskjellige doser (0,01 til 10 ug) (figur 7) eller i en mengde på 10 (ag i nærvær eller ikke nærvær av Freunds komplette adjuvant (figur 8). Disse forsøkene viser den meget sterke immunogenisiteten av PPV-PréS:T pseudopartiklene, som i fråvær av enhver adjuvant og i små doser (en enkelt injeksjon på 1 ug), induserer meget høye proliferative responser mot den innskutte epitop (figur 7). Disse responser er like sterke når pseudopartiklene injiseres alene som når de administreres i nærvær av Freunds adjuvant (figur 8).

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av pseudopartikler som bærer flere epitoper

Det fremstilles to oligonukleotider som oppviser de komplementære sekvenser SEQ ID Nr. 5 og SEQ ID Nr. 6:

5' ende av hver av disse oligonukleotider kan binde seg sammen for å generere flere kopier av epitopen. Oligonukleotidene fosforyleres, blandes og oppvarmes til 70 °C i 15 minutter før ligering inn i plasmidet pPPV29mod, som var behandlet med kalveintestinal alkalisk fosfatase og fordøyd med Xhol.

Ligeringsblandingene benyttes for å transformere bakteriene E. coli DH5a. De rekombinante kloner karakteriseres ved analyse ved hjelp av restriksjonsenzymer. Innarbeiding av en eller flere kopier eller fravær av innarbeiding av epitopen Mutl påvises ved bestemmelsen av størrelsen av fragmentet BamHI/HindJTI. Integriteten av sekvensene av epitopen og deres orientering bekreftes ved sekvensering. De modifiserte VP2 gener inneholdende innskuddene av epitopene Mutl fordøyes med BamHI og subklones i overføringsvektoren av baculovirus pAcYMl.

De rekombinante baculovirus oppnås fra kotransfekteringer av 500 ng viral DNA av AcRP23-lacZ linearisert med Bsu361 og av 2 ug individuelle overføringsvektorer under anvendelse av lipofectinteknikken som beskrevet av Felgner et al. (1987, "Proceedings of the National Academy Sciences", USA 84, 7413-7417).

De rekombinante virus seleksjoneres på basis av deres lacZ-negative fenotyper og renses på plater før preparering av virale forråd som oppviser en betydelig titer for hver av de rekombinante virus.

Claims (14)

1. Rekombinante virale pseudopartikler, karakterisert ved at de er dannet ved autosammenføyning av minst det virale strukturproteinet VP2 av et virus i familien Parvoviridae, eller et beslektet virus, ved at de har en størrelse mellom 20 og 60 nm, ved at de danner en approksimativ ikosaedrisk struktur, og ved at VP2 proteinet er modifisert, i dets N-terminale ende, ved tilstedeværelse av minst en epitop omfattende en sekvens på 8 til 25 aminosyrer i stand til å assosiere med minst et major-histokompatibilitetskompleks av klasse I, idet nevnte assosiasjon gjenkjennes av cytotoksiske T-lymfocytter.

2. Pseudopartikler ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte epitop omfatter en sekvens på 8 eller 9 aminosyrer som er i stand til å assosiere med minst et molekyl av klasse I.

3. Pseudopartikler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 2, karakterisert ved at nevnte parvovirus er PPV, CPV eller andre beslektede virus slik som FPLV og MEV.

4. Pseudopartikler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at nevnte epitop er en epitop av lymfocyttisk koriomeningitt virus nukleoprotein.

5. Pseudopartikler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at nevnte epitop er CD8<+> CTL epitopen inneholdt i området 118-132 av lymfocyttisk koriomeningitt virus nukleoprotein.

6. Pseudopartikler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at de omfatter minst en CD4<+> T epitop og minst en CD8<+> T epitop.

7. Pseudopartikler ifølge krav 1 til 5, karakterisert ved at de omfatter en kombinasjon av multikopier av CD8<+> T epitoper.

8. Pseudopartikler ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at de omfatter en kombinasjon av fire kopier av Lewis-karsinoma Mut 1 CD8<+> T epitoper.

9. Pseudopartikler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at de kan oppnås ved en fremgangsmåte omfattende et trinn med ekspresjon, i baculoviruset, av hybridproteinet dannet av parvovirus VP2 proteinet og av nevnte epitop.

10. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter pseudopartikler i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 9 i en fysiologisk akseptabel bærer og/eller i et fortynningsmiddel.

11. Sammensetning ifølge krav 10, karakterisert ved at den ikke omfatter noen immunstimulerende adjuvant.

12. Anvendelse av pseudopartiklene ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, eller en sammensetning ifølge krav 10 eller 11, for fremstilling av medisinske produkter eller vaksiner for induksjon av CTL-responser eller cytokiner in vivo.

13. Anvendelse av pseudopartiklene ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, eller en sammensetning ifølge krav 10 eller 11, for fremstilling av vaksiner, spesielt antivirale vaksiner, eller antitumorale medikamenter.

14. Fremgangsmåte for in vitro stimulering av T-cytotoksiske responser i lymfocytter som stammer fra individer med virale eller tumorale infeksjoner, karakterisert ved at den omfatter å bringe lymfocyttene fra individene i kontakt med pseudopartikler ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9.