ES2257753T3 - Pseudo-particulas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales. - Google Patents

Pseudo-particulas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales.

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ES2257753T3 ES96930192T ES96930192T ES2257753T3 ES 2257753 T3 ES2257753 T3 ES 2257753T3 ES 96930192 T ES96930192 T ES 96930192T ES 96930192 T ES96930192 T ES 96930192T ES 2257753 T3 ES2257753 T3 ES 2257753T3
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Claude Leclerc
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNAS SEUDOPARTICULAS VIRICAS CARACTERIZADAS PORQUE ESTAN FORMADAS POR EL AUTOENSAMBLAJE DE AL MENOS UNA PROTEINA DE ESTRUCTURA VIRICA; PORQUE TIENEN UN TAMAÑO COMPRENDIDO ENTRE 20 Y 60 NM; PORQUE FORMAN UNA ESTRUCTURA APROXIMADAMENTE ICOSAEDRICA; Y PORQUE LA MENCIONADA PROTEINA ESTA MODIFICADA POR LA PRESENCIA DE AL MENOS UN EPITOPO QUE TIENE UNA SECUENCIA DE 8 A 25 AMINOACIDOS QUE PUEDEN ASOCIARSE CON AL MENOS UNA MOLECULA DE CLASE I O II DEL COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD, CON EXCLUSION DEL EPITOPO C3:T. LA MENCIONADA ASOCIACION ES RECONOCIDA POR LINFOCITOS TCD8 + CI TOTOXICOS Y TCD4 + . ESTAS SEUDOPARTICULAS PUEDEN UTILIZARSE COMO VACUNA ANTIVIRICA O COMO MEDICAMENTO.

Description

Pseudo-partículas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales.
La presente invención se refiere a pseudo-partículas virales recombinantes de un virus de la familia de Parvoviridae o de un virus emparentado, útiles en particular para inducir respuestas linfocitarias TCD8^{+} citotóxicas (CTL) in vivo a un nivel elevado.
La misma tiene asimismo por objeto la utilización de dichas pseudo-partículas para la preparación de vacunas o de medicamentos antitumorales.
La invención se refiere asimismo a unas composiciones que comprenden dichas pseudo-partículas en un vehículo y/o un diluyente fisiológicamente aceptable.
Según Fernández et al. (Medécine/Sciences, 1995, 11, 975-983), la respuesta con mediación celular, esencial en el caso de un tumor, puede dividirse en dos partes:
-
por una parte la puesta en marcha de la respuesta que hace intervenir unos linfocitos TDC4+ y unas células presentadoras del antígeno (CPA), y
-
por otra parte la respuesta efectiva citotóxica en la que intervienen los linfocitos TCD8^{+}.
Los linfocitos TCD4^{+} activados proliferarán y secretarán unas citoquinas, mientras que los linfocitos TCD8^{+} activados proliferarán y se diferenciarán en linfocitos T citotóxicos (CTL)
Estas dos familias de linfocitos, tienen por lo tanto funciones muy diferentes y se activan mediante mecanismos distintos. La estimulación de los linfocitos CD4^{+} necesita la asociación de un péptido fruto de la degradación del antígeno a las moléculas de clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH), mientras que la estimulación de las células CD8^{+} necesita la asociación de un péptido a unas moléculas de clase I del CMH.
Se ha propuesto ya un cierto número de estrategias profilácticas o terapéuticas para luchar contra las enfermedades de orígenes diversos en el hombre y en el animal ocasionadas por virus, bacterias, parásitos, o contra las enfermedades cancerosas o tumorales.
Se conoce, por ejemplo, la inducción de respuestas CTL in vivo por unos vectores "vivos". Sin embargo, la inocuidad de estos vectores no está garantizada, en particular en individuos inmunodeprimidos. Por otra parte, los sistemas que implican la replicación de estos vectores "vivos" no conservan su eficacia en individuos inmunes.
Martínez et al. dan a conocer en Vaccine (vol. 10, pág. 684-690, 1992) la utilización de cápsidas vacías de parvovirus de cerdo (PPV) en la vacunación de los cerdos. La familia de las Parvoviridae reagrupa virus muy destruidos en los mamíferos tales como cerdos, bovinos, gatos, conejos, ratas y en el hombre. Sin embargo, los parvovirus son relativamente específicos de los mamíferos huéspedes. El parvovirus de cerdo (PPV), en particular, es responsable de numerosas infecciones en la cría industrial de cerdos. El parvovirus de cerdo (PPV) está constituido por una partícula isométrica no recubierta de 20 nm de diámetro y de simetría icosaédrica, que contiene una molécula de ADN de cadena sencilla. Está compuesto por dos proteínas de cápsides, VP1 (83 kDa) y VP2 (64 kDa), y por una tercera proteína, VP3 resultado de la proteólisis de VP2.
La proteína VP2 puede ser producida por células de insectos con ayuda de un sistema de baculovirus recombinante y las proteínas VP2 obtenidas son capaces de autoensamblarse para formar unas pseudo-partículas virales que tienen el mismo tamaño que el del virión nativo. La vacunación de cerdos contra la PPV se realiza inmunizándolos con una mezcla de dichas cápsides con asociación adyuvante Alhidrogel (a 50%) + Quil A 500 \mug (Superfos). Una enseñanza comparable a la de este artículo se encuentra en las solicitudes EP-551 449 y EP-554 414 que indican además que estos epítopos correspondientes a otras proteínas virales pueden incorporarse a las cápsides, sin precisar sin embargo la naturaleza de estos epítopos.
La solicitud EP-647 655 se refiere a unos péptidos sintéticos correspondientes a unos sitios antígenos de VP2. No se trata entonces de la proteína completa.
Sedik et al. describen, en el Journal of General Virology (76:2361-2368, (1995)), la utilización de partículas híbridas de PPV como vectores de dos epítopos del virus de la polio, C3:B y C3:T reconocidos respectivamente por linfocitos B y TCD4^{+}. Las partículas que contienen el epítopo C3:TCD4^{+} solamente son capaces de estimular las respuestas proliferativas de células T, CD4^{+} y no de células T CD8^{+}. Además de esta especificidad de estimulación, las respuestas son de un nivel poco elevado, insuficiente para una inmunización eficaz. En cualquier caso, la inducción de estas respuestas requiere obligatoriamente la utilización de un adyuvante (hidróxido de aluminio o adyuvante completo de Freund).
Además, los ensayos de modificación de las pseudo-partículas con vistas a incorporar unos epítopos heterólogos se encuentran con unas dificultades tales como la inhibición de la formación de las pseudo-partículas. Incluso cuando estas últimas se forman, el epítopo heterólogo no es necesariamente inmunógeno, pudiendo el epítopo situarse, por ejemplo, en un sitio en el que es incapaz de adoptar su conformación natural o ser producido por las células que presentan el antígeno.
Por otra parte, a semejanza de las vacunas con vectores "vivos" la inocuidad de estas partículas híbridas asociadas a los adyuvantes no está totalmente asegurada, pudiendo una toxicidad provenir de ciertas propiedades de los adyuvantes susceptibles de inducir efectos secundarios nefastos para el organismo.
Se desprende por tanto del estado de la técnica que no se conoce un sistema fiable, eficaz que permita estimular la respuesta linfocitaria T-citotóxico y T auxiliar, sin riesgo para la salud del individuo tratado y sin la utilización de adyuvantes inmunoestimuladores.
Además, las partículas híbridas que contienen el epítopo C3:T no son capaces de inducir una respuesta T CD4^{+} eficaz en ausencia del adyuvante.
El solicitante ha demostrado que es posible inducir específicamente sin utilizar inmunoadyuvantes, una respuesta linfocitaria CD8^{+}, es decir una respuesta citotóxica con ayuda de pseudo-partículas que llevan epítopos susceptibles de asociarse con al menos una molécula de clase I o de clase II del CMH, respectivamente.
La presente invención tiene por objeto unas pseudo-partículas virales recombinantes, caracterizadas porque están constituidas por el autoensamblado de al menos una proteína de estructura viral VP2 de un virus de la familia de las Parvoviridae, o de un virus emparentado, porque presentan un tamaño comprendido entre aproximadamente 20 y 60 nm, porque forman una estructura aproximadamente icosaédrica, y porque la proteína VP2 está modificada, en su extremo N-terminal, por la presencia de al menos un epítopo que comprende una secuencia de 8 a 25 aminoácidos susceptible de asociarse a al menos una molécula de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, siendo dicha asociación reconocida por unos linfocitos T citotóxicos.
Los linfocitos TCD8^{+} según la invención son capaces de reconocer al menos un epítopo que comprende una secuencia de 8 a 9 aminoácidos susceptibles de asociarse al menos a una molécula de clase I del CMH.
Los linfocitos TD4^{+} según la invención son capaces de reconocer una secuencia comprendida entre 8 y 25 aminoácidos susceptibles de asociarse al menos a una molécula de clase II del CMH.
Las partículas según la invención pueden comprender proteínas de diversas naturalezas, y formar partículas híbridas. Pueden estar constituidas por ejemplo por proteínas VP2 y VP1.
La asociación formada entre la secuencia correspondiente al epítopo y las moléculas de clase I es reconocida por el receptor de linfocitos T CD8^{+} e induce una diferenciación y una proliferación de estos linfocitos.
Ventajosamente, dicha secuencia está rodeada de regiones denominadas flanqueantes susceptibles de modular su degradación, es decir de facilitar su producción durante la degradación del antígeno, o de facilitar su fijación a las moléculas de clase I del CMH.
Las regiones flanqueantes pueden corresponder a los aminoácidos que flanquean el epítopo T, CD8^{+} en su ambiente natural. De manera general, pueden estar compuestas por diversos aminoácidos, y en particular por alanina o por lisina.
Las pseudo-partículas según la invención presentan un primer interés, que proviene de la seguridad de este modo de inmunización, siendo el vector utilizado no replicativo, constituido por un único tipo de proteína viral y pudiendo ser administrado incluso a individuos inmunodeprimidos.
Una segunda ventaja de las pseudo-partículas según la invención reside en la ausencia de reacciones cruzadas con el parvovirus humano y, por lo tanto, en ausencia de problemas ligados a una pre-inmunización de los individuos, que provoca eventualmente una inmunogenicidad débil de este tipo de vacunas recombinantes.
Además, las pseudo-partículas según la invención no necesitan la replicación del vector y por lo tanto, pueden conservar su eficacia en los individuos inmunes.
Asimismo, las pseudo-partículas según la invención poseen una excelente inmunogenicidad -una sola inmunización es suficiente- y por lo tanto, pueden utilizarse en ausencia de adyuvante inmunoestimulador.
Ventajosamente, el parvovirus es el PPV, el CPV (Canine Parvovirus) u otro virus emparentado tal como el FPLV (Feline Paroleukopenia virus) y el MEV (Mink Enteritis virus).
El epítopo puede estar constituido por cualquier secuencia que se fija a una molécula del CMH de clase I y susceptible de inducir una toxicidad T linfocitaria. En particular, puede tratarse de un epítopo TCD8^{+} de un virus, tal como el VIH-1 o el VIH-2, o el virus de la gripe, o un epítopo tumoral o expresado por unas células cancerosas.
Según un modo ventajoso de realización, las pseudo-partículas según la invención se caracterizan porque el epítopo seleccionado es el epítopo CTL CD8^{+} contenido en la región 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV).
Sin embargo, el epítopo puede ser cualquier otro epítopo susceptible de inducir una respuesta CTL, tal como por ejemplo, uno de los epítopos siguientes:
-
los epítopos de las proteínas Env gp 120, Env gp41, Gag p17, Gag p24, Gag p15, Pol y Nef, de los virus VIH y los epítopos de las proteínas Gag, y nef del virus VIS y Gag del virus VIH-12, tal como los definidos por VENET y WALKER (AIDS 1993, Vol. 7, supl. 1, 119-120)
-
los epítopos de proteínas expresadas por unos tumores que se desarrollan en el ser humano, tales como las proteínas expresadas por los genes MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1,2, HER-2/neu, y por antígenos de diferenciación melanocítica, tales como la tirosinasa, Pmel17gp100, Melan-AMART-1, y gp 75TRP1, definidos por VAN DEN EYNDE y BRICHARD (Current Opinion in Immunolgy, 1995, 7, 674-681).
Para inducir una respuesta T CD4^{+} auxiliar o que resulta en la producción de linfoquinas, el epítopo puede ser el epítopo T CD4^{+} PréS:T situado en la región PréS2 (secuencia 120-132) del virus de la hepatitis B (HBV).
La pseudo-partícula puede comprender asimismo una combinación de epítopos, y en particular:
-
al menos un epítopo TDC4^{+} y por lo menos un epítopo TCD8^{+},
-
una combinación de multicopias de epítopos TDC4^{+} o TCD8^{+},
-
una combinación de cuatro copias de epítopos TCD8^{+}Mut del carcinoma de Lewis.
Por combinación de epítopos, se entiende una combinación que comprende al menos dos epítopos y preferentemente, entre dos y diez epítopos de proteínas idénticas como por ejemplo, una multicopia de epítopos Mut1 del carcinoma de Lewis o de proteínas diferentes. Así, una combinación de multicopias de epítopos TCD8^{+} puede comprender al menos dos epítopos y de manera preferida, entre dos y diez epítopos fruto de proteínas diferentes como por ejemplo, la asociación de un epítopo TCD8^{+} de la nucleoproteína de la coriomeningitis linfocitaria y de un epítopo TCD8^{+} Env.gp 41 del VIH.
Ventajosamente, dichas pseudo-proteínas virales recombinantes son susceptibles de ser obtenidas mediante por un procedimiento que comprende una etapa de expresión en el baculovirus, de la proteína quimérica constituida por la proteína VP2 del parvovirus y de dicho epítopo.
Las pseudo-partículas según la invención se obtienen, de manera aún más preferida, mediante autoensamblado de la proteína VP2 de parvovirus modificada por la presencia, en su extremo N-terminal, de al menos un epítopo de la nucleoproteína de LCMV o de al menos un epítopo de HBV o incluso de una combinación de multicopias de epítopos.
Se observará que cualquier otra molécula, y en particular cualquier otra proteína, que presenta propiedades similares a VP2, tal como el autoensamblado, y que pueden ser modificadas por un epítopo, pueden utilizarse en el marco de la presente invención como sustitución de VP2.
La presente invención tiene asimismo por objeto la utilización de las pseudo-partículas en cantidad inmunizante eficaz, para la inducción de respuestas CTL in vivo a un nivel elevado.
Por la expresión "cantidad inmunizante eficaz" se entiende una cantidad seleccionada en función de la vía de administración y del peso del individuo de las pseudo-partículas según la invención. Ventajosamente, la cantidad administrativa estará comprendida entre 10 y 500 \mug de pseudo-partículas por individuo.
La presente invención tiene además por objeto una composición que comprende las pseudo-partículas en un vehículo y/o un diluyente inmunológicamente aceptables. Como diluyente, se puede utilizar una solución acuosa tamponada aproximadamente a pH 7 (solución fisiológica).
Ventajosamente, la composición según la presente invención está exenta de adyuvante inmunoestimulante. Sin embargo, puede contener, si es necesario, dicho adyuvante que puede ser hidróxido de aluminio.
Las pseudo-partículas según la presente invención también pueden utilizarse en un procedimiento de estimulación in vitro de las respuestas T citotóxicas de linfocitos que provienen de sujetos que sufren de infecciones virales tumorales que comprenden la puesta en contacto de los linfocitos de los sujetos con las pseudo-partículas. En este caso, las células, son después del tratamiento, readministradas a los pacientes, por ejemplo, mediante inyección.
La presente invención tiene asimismo por objeto la utilización de las pseudo-partículas de conformidad a la invención en una preparación de una vacuna, de preferencia de dosis única, en particular antitumoral o antiviral. Puede administrarse por las vías habituales para las vacunas, a saber por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea o eventualmente por vía oral o cualquier otra vía que permita la activación de una respuesta CTL.
La invención se ilustra sin estar limitada de ningún modo por la descripción siguiente, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 representa el procedimiento de obtención del plásmido pPPV29.
La figura 2 que comprende tres gráficos 2(a), 2(b) y 2(c), ilustra la inmunización de ratones, en dos tomas, el día 0 y el día 21 con 10 y 50 \mug respectivamente de pseudo-partículas según la invención, sin adyuvante. El día 28, los esplenocitos son estimulados in vitro durante 5 días con los esplenocitos singénicos preincubados con el péptido sintético 118-132. La actividad linfocitaria T citotóxica se mide sobre las dianas P815 preincubadas con el medio o con el péptido sintético 118-132. Los resultados se expresan en % de lisis, estando la relación E:T indicada en abscisas, designando esta expresión E/T la relación de linfocitos efectores/células diana. La figura 2(a) se refiere a los resultados obtenidos con la partícula PPV-29LCMV, la figura 2(b) los resultados obtenidos con la partícula PPV-30LMCV y la figura 2(c) a título comparativo con las pseudo-partículas no modificadas.
La figura 3 que comprende 7 gráficas 3(a), 3(b), 3(c), 3(d), 3(e), 3(f) y 3(g), ilustra la inmunización de ratones, en dos tomas, el día 0 y el día 21, con diferentes dosis respectivamente de 50 \mug para la figura 3(a), 10 \mug para la figura 3(b), 2 \mug para la figura 3(c), 0,4 \mug para la figura 3(d), 0,08 \mug para la figura 3(e), de pseudo-partículas según la invención, sin adyuvante. El día 28, los esplenocitos son estimulados in vitro durante 5 días con los esplenocitos singénicos pre-incubados con el péptido sintético 118-132. La actividad linfocitaria T citotóxica se mide sobre dianas P815 pre-incubadas con el medio o con el péptido sintético 118-132 Los ratones testigo recibieron una inyección el día 21 de 100 \mug de péptido sintético 118-126 de adyuvante incompleto de Freund (IFA) (figura 3g) o de pseudo-partículas testigo (figura 3f). Los resultados se expresan en T de lisis, de la misma manera que en la figura 2.
La figura 4 que comprende, de una manera similar a la figura 2, tres gráficos 4(a), 4(b) y 4(c), ilustra la inmunización de ratones mediante una única inyección de 10 \mug o de 50 \mug de pseudo-partículas según la invención, sin adyuvante. Al día 24, los esplenocitos son estimulados in vitro durante 5 días con esplenocitos singénicos pre-incubados con el péptido sintético 118-132. La actividad linfocitaria T citotóxica se mide sobre unas dianas P815 pre-incubados con el medio o con el péptido sintético 118-132. Los resultados se expresan en % de lisis, de la misma manera que en la Figura 2.
La figura 5 que comprende dos gráficas 5(a) y 5(b), ilustra la protección de ratones BALB/c, inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) los días 0 y 21 con PBS, o con las pseudo-partículas huecas (PPV) o que expresan la secuencia 118-132 de la nucleoproteína del LCMV (PPC-LCMV), o con el virus cepa Armstrong (LCMV-Arms), contra la infección mediante LCMV respectivamente los días 28 (5a) y 70 (5b). Los ratones fueron infectados por vía intracerebral con 10^{1.7}PFU/ratón. La mortalidad de los ratones es seguida diariamente durante 10 días y los resultados se expresan en % de supervivencia entre los animales de cada lote.
Las figuras 6A a 6D ilustran la estimulación de hibridomas T específicos del epítopo T CD4^{+} PréS:T de HBV, 51 E12 (6A y 6D) o 52A12 (6B y 6D) por unas células de linfoma B (6A y 6B) o unos esplenocitos irradiados (6C y 6D) puestos en presencia de péptido PréS:T, de pseudo-partículas recombinantes PPV-PréS:T o de pseudo-partículas PPV (VP2).
Las figuras 7A y 7B ilustran la respuesta proliferativa de las células ganglionarias estimuladas in vitro con el péptido PréS:T (figura 7A) o las pseudo-partículas PPV (VP2) (figura 7B), procediendo dichas células de los ratones DBA/1 inmunizados por 0,01 \mug de PPV-PréS:T o 10 \mug de PPV (VP2), en ausencia de adyuvante.
Las figura 8A y 8B representan la proliferación de células ganglionarias, procedentes de ratones DBA/1 inmunizados mediante PPV-PréS:T en medio PBS o en presencia de adyuvante completo de Freund o PPV (VP2), reestimulados mediante el péptido PréS:T (figura 8A) o PPV (VP2) (figura 8B).
Ejemplo 1 Inducción de la citotoxicidad T linfocitaria por unas pseudo-partículas según la invención que contienen un epítopo de la nucleoproteína de LCMV
El epítopo CTL heterólogo, CD8^{+} contenido en la región 118-132 de la nucleoproteína de LCMV fue inducido en el gen de VP2 del PPV sin alterar la formación ulterior de las pseudo-partículas. Se obtuvieron dos partículas, PPV-29 LCMV y PPV-30 LCMV, que se diferencian únicamente por un codón de iniciación. Estas proteínas quimeras fueron producidas por un sistema de baculovirus y purificadas mediante precipitación de sulfato de amonio a partir del lisado de células de insectos según el procedimiento descrito en el Journal of General Virology 76: pág. 2361-2368 (1995).
La capacidad de estas partículas recombinantes para inducir respuestas linfocitarias T citotóxicas fue analizada in vivo en el ratón BALB/c.
Materiales y Métodos * Inserción del epítopo LCMV DC8^{+} en el sitio Xhol del extremo N-terminal de VP2
Como se ilustra en la figura 1, el vector pPPV29 se obtiene mediante digestión y sustitución del fragmento Xhol-Ncol del vector pPPV17R procedente del vector pPPV17 descrito por Martinez et al. (1992, Vaccine, 10, 684-690) mediante dos productos de amplificación PCR, con el fin de eliminar una región presente en el sitio de policlonación de pPPV17R y el codón de iniciación de VP2. Los vectores pPPV17 y pPPV17R se diferencian únicamente por la orientación del gen clonado VP2 con relación al polienlazador. Todas las amplificaciones PCR se efectuaron en un volumen total de 100 ml con una unidad de ADN polimerasa Vent (New England Biolabs), 10 ng de pPPV17R como matriz, 100 \mum de dNTPs y 800 ng de cada iniciador. Las amplificaciones se llevaron a cabo durante 25 ciclos de desnaturalización a 93ºC durante un minuto, siendo el anillado del iniciador efectuado a 50ºC durante un minuto y la extensión a 72ºC durante tres minutos. Los productos de la PCR se clonaron en el pPPV17R digerido por Xho-I y Ncol y desfosforilado. Las mezclas de enlace se utilizaron para transformar las bacterias E. Coli DH5. De esta manera, se obtuvieron dos plásmidos: pPPV29 que contiene un sitio único de clonación Xho-I adyacente al codón ATG original de VP2, y pPPV30 que contiene un sitio único de clonación Xho-I, pero sin el codón de iniciación ATG.
Se obtuvo entonces el vector pPPV29 mod: el gen VP2 se obtuvo mediante digestión del pPPV29 por PstI ligado a continuación en el sitio de clonación PstI del plásmido pMTL24 con el fin de proporcionar los sitios BamHI para la subclonación en los vectores de transferencia del baculovirus.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos que codifican para el epítopo CD8^{+} y el codón de iniciación, y que comprenden dos sitios Xhol. Presentan las secuencias SEC ID nº 1 y nº 2 siguientes:
SEC ID nº 1:
5'TCGAGATGCGACCACAAGCTTCAGGAGTATACATGGGAAACCTAACAGCACAAC3'
SEC ID nº2
5'TCGAGTTGTGTGCTGTTAGGTTTCCCATGTATACTCCTGAAGCTTGTGGTCGCATC3
Estos dos oligonucleótidos complementarios se proporcionaron mediante MedProbe (Norvege). Se fosforilaron con ayuda del polinucleótido quinasa T4, anillados a 70ºC durante 15 minutos y ligados en el sitio Xhol del plásmido pPPV29mod digerido por Xhol, que contiene el gen que codifica para la PPV-VP2.
Unas células de Escherichia coli DH5 se transformaron con la mezcla de ligadura y se extendieron sobre el medio LB que contiene 100 \mug(ml de amplicilina (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166, 557-580). Se seleccionaron los recombinantes que contienen la inserción LCMV, y se secuenciaron a continuación mediante el procedimiento con dideoxi con el fin de determinar su orientación y la integridad de las secuencias insertadas. El clon recombinante que contiene la secuencia LCMV en la orientación adecuada ha sido denomiinado pPPV29mod/LCMV.
* Construcción de vectores de transferencia en los baculovirus y selección de los baculovirus recombinantes
La secuencia VP2 quimérica se obtuvo a partir del vector pPPV29mod/LCMV mediante digestión por BamHI y subclonada en el único sitio de restricción BamHI del vector de transferencia del baculovirus PacYM1.
Se prepararon los clones recombinantes como se ha descrito anteriormente y se analizaron mediante el procedimiento de minipreparación de ADN plasmídico y mediante cartografía de restricción. Las secuencias de inserción de los clones positivos se secuenciaron con el fin de verificar de nuevo la integridad del epítopo insertado así como las secuencias flanqueantes. Por último, el ADN purificado por el fenol se precipitó por dos volúmenes de etanol. El clon recombinante así obtenido se denominó pAcYM1/LCMV/ppv29mod.
Con el fin de obtener los baculovirus recombinantes, se añadió una mezcla de 2 \mug de ADN de vector de transferencia purificado y de 500 ng de ADN parental AcRP32Iacz+ a las células de insectos Sf9 en presencia de reactivo de transfección DOTAP (Boering Mannheim), según las instrucciones de esta Sociedad. La transfección se prosiguió hasta el efecto citopático fue total. Después de 9 días, los cultivos se recuperaron y se utilizó el sobrenadante clarificado para el aislamiento de placas de baculovirus recombinantes según los procedimientos ya conocidos por el experto en la materia y descritos por Sedlik et al. (J. Gen. Virol. 1995, 76, 2361-2369). Los clones recombinantes se seleccionaron utilizando su fenotipo diana (placa blanca: recombinante, placa azul: fenotipo salvaje).
Los baculovirus recombinantes se purificaron hasta que no pudiera detectarse ninguna placa azul. Se prepararon unas reservas de virus que presentan un título importante de baculovirus recombinante AcNPV.PPV-LCMV (>10º^{8}).
Un clon, denominado AcPP29-LMCV se depositó el 20 de diciembre de 1995 bajo el nº V 95122022 ante la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC).
* Análisis de las proteínas recombinantes
Las células Sf9 se infectaron con los baculovirus recombinantes a razón de una tasa de infección de 1 pfu por célula (una unidad que forma placa por célula) y los extractos de las células se recogieron 72 horas después de la infección.
Se agregó tampón de disociación de proteína a cada extracto celular, y las mezclas se calentaron a 100ºC durante 5 minutos, y se separaron a continuación sobre SDS PAGE al 9%.
Los geles se colorearon con ayuda de azul de Coomassie o se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa con ayuda de un equipo semiseco, a 22 voltios durante 30 minutos.
Las membranas se incubaron con suero de ratón digerido contra el epítopo LCMV CD8^{+} (dilución 1/200) durante dos horas a temperatura ambiente.
Después del lavado, los anticuerpos fijados se detectaron mediante la proteína A conjugada con peroxidasa (dilución 1/2000) utilizando 4-cloronaftol como substrato hasta el desarrollo del color. Las membranas se enjuagaron a continuación con agua destilada con el fin de detener la reacción. Después de la coloración de los geles SDS mediante azul de Coomassie, se detectó una banda visible de 67 kD en los extractos de células Sf9 infectadas con los baculovirus recombinantes. El tamaño observado corresponde al tamaño esperado para la proteína quimérica VP2-LCMV. La identidad de esta proteína se confirmó mediante inmunotransferencia. El antisuero de ratón específico muestra una reacción positiva muy clara con la proteína de 67 kD de los extractos celulares infectados. La localización intracelular de la proteína recombinante fue analizada mediante inmunotransferencia de diferentes fracciones celulares. Esto ha permitido demostrar que la proteína quimérica LCMV-VP2 es una proteína citoplásmica soluble.
* Purificación de las partículas
Las células Sf9 se infectaron con ayuda de baculovirus recombinante a una tasa de infección de 1 pfu por célula. Las células se recogieron 72 horas después de la infección, se lavaron con PBS y se lisaron mediante choque osmótico a 4ºC en una solución de bicarbonato 25 nM. Los restos celulares de eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad.
Las partículas contenidas en los extractos se purificaron entonces mediante precipitación por una solución saturada con 20% de sulfato de amonio. El precipitado se centrifugó a 1.500 rpm durante 15 minutos, se resuspendió en PBS y se dializó durante una noche con este mismo tampón. La identidad y las propiedades de las partículas se confirmaron mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia y mediante microscopía electrónica.
Estas partículas purificadas se utilizaron para la inmunización e inducción de la citotoxicidad linfocitaria (CTL).
* Inmunización de los ratones
Los ratones reciben por vía intraperitoneal una inyección de una composición que contiene las pseudo-partículas virales recombinantes según la invención (PPV-LCMV), o huecas (PPV), en ausencia de adyuvante. Los testigos positivos son ratones inyectados, en el día 21, por vía subcutánea con el péptido sintético 118-126 (proporcionando por la sociedad Neosystem, Estrasburgo, Francia) de adyuvante incompleto de Freund (IFA). Los testigos negativos reciben unas pseudo-partículas que no expresan el epítopo LCMV.
* Inducción de células citotóxicas
Se extraen los bazos pseudo-partículas de los ratones inmunizados 7 a 14 días después de la última inmunización. 25x10^{6} células inmunes se ponen en cultivo, en presencia de 25x10^{6} esplenocitos irradiados procedentes de los ratones singénicos naives, en frascos que contienen el medio de cultivo nutritivo (RPMI 1640, 10% de suero bovino fetal, glutamina y antibiótico) durante 5 días a 37ºC, CO_{2} al 5%
Las células estimuladoras son sensibilizadas in vitro con el péptido sintético 118-126 a 0,5 \muM o con el péptido sintético 118-132 (suministrado asimismo por la sociedad Neosystem, Estrasburgo, Francia) a 0,5 \muM.
* Test de citotoxicidad
La actividad citotóxica de los linfocitos efectores se midió después de 5 días. Las células diana P815 se preincubaron o bien con el medio nutritivo (testigo negativo), o bien con el péptido antigénico sintético y se marcaron simultáneamente por el ^{51}Cr durante 1h, a 37ºC. A continuación, los linfocitos efectores se incuban con las células marcadas, a diferentes relaciones de efector/diana (relación E/T) en medio nutritivo en placas de 96 pocillos de fondo redondo, durante 4 a 5 horas, a 37ºC. Las dianas se incubaron en las mismas condiciones con el medio para medir la liberación espontánea de ^{51}Cr y con el ácido clorhídrico 1N para medir la liberación máxima del ^{51}Cr. La actividad de los linfocitos citotóxicos se determina mediante recuento de la radioactividad presente en los sobrenadantes de cultivo, correspondiente a la liberación de ^{51}Cr por las células diana lisadas.
% de lisis específica = \frac{cpm \ experimental - cpm \ espontáneo}{cpm \ máximo - cpm \ espontáneo}
Este cálculo se realiza con las células diana incubadas en el medio nutritivo (P815) y con las células diana incubadas con el péptido sintético (P815 + 0118-132), como se ha representado mediante las curvas de las figuras 2 y 4.
Resultados
Como se puede constatar a partir del examen de las figuras 2 a 5, una única inyección de 10 \mug de pseudo-partículas recombinantes que presentan el epítopo T, CD8^{+} de LCMV ha permitido alcanzar prácticamente 100% de lisis, es decir, tanto como el testigo positivo péptido sintético p118-126 + FIA, lo que confirma que las pseudo-partículas según la invención permiten la inducción de respuestas CTL in vivo a un nivel elevado sin añadir el adyuvante.
Esta inducción es específica del epítopo insertado ya que ninguna respuesta T citotóxica se obtiene cuando los ratones son inmunizados mediante dosis equivalentes de pseudo-partículas que no expresan el epítopo LCMV. Las células T citotóxicas así inducidas lisan específicamente las células diana P185 recubiertas por el péptido correspondiente al epítopo insertado.
La figura 5 muestra por su parte que los ratones a los que se les inyectaron las pseudo-partículas están protegidos contra la infección viral a 28 días, y que 4/5 ratones están protegidos a 70 días.
Ejemplo 2 Inducción de respuestas T, CD4^{+}, específicas de un epítopo del virus de la hepatitis B mediante las pseudo-partículas de parvovirus 1) Materiales y Métodos Inserción del epítopo PréS:T de HBV en el extremo N-terminal de la proteína VP2 del PPV
Se sintetizaron dos oligonucleótidos, que codifican para el epítopo PréS:T del HBV, que tiene las siguientes secuencias:
SEC. ID nº 3
5'TCGAGATGCAATGGAATTCTACCACCTTCCACCAAACCCTGCAAC3'
SEC. ID nº 4
5'TCGAGTTGCAGGGTTTGGTGGAAGGTGGTAGAATTCCATTGCATC3'
Estos dos oligonucleótidos son complementarios y contienen dos secuencias flanqueantes del sitio Xhol en los extremos con el fin de permitir una clonación directa en el vector pPPV30. Los oligonucleótidos se proporcionan por ISOGEN (Países Bajos). Se fosforilaron con ayuda del polinucleótido quinasa T4, se anillaron a 70ºC durante 15 minutos y se ligaron a continuación en presencia de pPPV30 digerido por Xhol y tratado mediante fosfatasa a 14ºC durante una noche. La mezcla se utilizó para transformar las células de Escherichia coli (cepa DH5).
Las colonias se analizaron con ayuda de las enzimas de restricción EcoRi y HindIII con el fin de verificar la presencia de las secuencias insertadas. Los recombinantes que contienen la secuencia del epítopo se secuenciaron con el fin de confirmar que no se produjo ningún cambio ni ninguna mutación durante estas manipulaciones.
* Construcción de un vector de transferencia de las construcciones PréS:T:PPV en los baculovirus y obtención de baculovirus recombinantes
Los plásmidos recombinantes que contienen el epítopo PréS:T en una orientación correcta se digirieron con ayuda de BamHI y VP2 modificada se subclonó en el vector de transferencia pAcYM1 (Matsuura et al., 1987, J. Gen. Virol. 68, 1233-1250). Los clones recombinantes se analizaron como se ha descrito anteriormente y las secuencias de las inserciones se confirmaron mediante secuenciado. El clon recombinante se denomina pAcYM1/PréS:T-pPPV30.
Los baculovirus recombinantes se obtuvieron mediante transfección de células de insectos SF9, como se describe en el ejemplo 1 y se separaron unas reservas de virus que presentan títulos importantes (>10^{8} pfu/ml). El virus recombinante se denominó AcPPV30-PréS:T.
Se depositó ante la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), con el nº V96081412 el 15 de agosto de 1996.
* Análisis y purificación de proteínas recombinantes
Se infectaron células Sf9 (Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165) con una tasa de infección de 1pfu/célula con el baculovirus recombinante AcPPV30-PréS:T. Se recogieron células infectadas 72 horas después de la infección y se analizaron mediante electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 9% en presencia de SDS y mediante inmunotransferencia. Los resultados demuestran la presencia de proteína VP2 recombinante modificada.
Con el fin de purificar las partículas VP2 quiméricas, las células infectadas se lisaron con ayuda de bicarbonato se sodio 25 mM, los restos se eliminaron mediante centrifugación y el sobrenadante que contienen las partículas se precipitó con ayuda de sulfato de amonio al 20% durante 20 minutos a 4ºC. El residuo, que se enriqueció de manera importante de partículas VP2, se recogió mediante centrifugación y se dializó de nuevo contra PBS durante una noche. Las partículas purificadas se almacenaron a 4ºC hasta su utilización.
* Estímulación de hibridomas T específicos del péptido PréS:T de HBV mediante las pseudo-partículas que expresan este péptido
10^{5} células de linfoma B, M12C10(H-2^{d/q}) (Figura 6A y B) o 5.10^{5} esplenocitos irradiados de ratones DBA/1(H-2^{q}) (figuras 6C y D) se incubaron a 37ºC, en presencia de diferentes concentraciones de péptido PréS:T que corresponde a la secuencia 120-132, de pseudo-partículas recombinantes PPV-PréS:T, o de pseudo-partículas PPV (VP2), y se utilizaron a continuación para estimular 10^{5} hibridomas T, 51E12 (6A y 6C) o 52A12 (6B y 6D), específicas del péptido PréS:T y limitadas por las moléculas I-A^{q}; después de 24 horas, se extrajeron los sobrenadantes de cultivo, y se dosificaron con la línea CTLL, dependiente de IL-2. Tres días más tarde, la proliferación de las células CTLL se midió mediante incorporación de timidina tritiada.
* Inducción en ausencia de adyuvante de respuestas proliferativas específicas del péptido PréS:T de HBV después de la inmunización de ratones con las pseudo-partículas virales de parvovirus que expresan este péptido
Se inmunizaron ratones DBA/1 (H-2^{q}) por vía subcutánea con 10 \mug, 1 \mug, 0,1 \mug o 0,01 \mug de pseudo-partículas virales PPV (VP2). Diez días más tarde, las células de los ganglios drenantes se estimularon nuevamente in vitro con diferentes concentraciones de péptido PréS:T (Figura 7A) o con 0,5 \mug/ml de PPV (VP2) (Figura 7B). Cuatro días más tarde, la proliferación de las células ganglionarias se mide mediante incorporación de timidina tritiada.
* Capacidad de las pseudo-partículas virales recombinantes PPV-PréS:T para inducir una respuesta proliferativa específica del péptido PréS:T en presencia o ausencia de adyuvante
Ratones DBA/1 (H-2^{q}) se inmunizaron por vía subcutánea con 10 \mug de pseudo-partículas virales recombinantes PPV-PréS:T en solución salina (PBS) o en emulsión con el adyuvante completo de Freund (ACF), o con 10 \mug de pseudo-partículas virales PPV (VP2) en ACF. Diez días más tarde, las células de los ganglios drenantes se estimularon nuevamente in vitro con diferentes concentraciones de péptido PréS:T (figura 8A) o de PPV (VP2) (figura 8B). Cuatro días más tarde, la proliferación de las células ganglionarias se midió mediante incorporación de timidina tritiada.
2) Resultados
Se introdujo el epítopo T, CD4^{+} PréS:T situado en la región PréS2 (correspondiente a las secuencia 120-132) del virus HBV en la proteína VP2 del parvovirus. Se purificaron las pseudo-partículas controladas PPV (VP2) o recombinantes PPV-PréS:T.
En un primer momento, la antigenicidad de estas partículas se analizó in vitro contra hibridomas T específicos del epítopo PréS:T. Como se aprecia en la figura 6, las pseudo-partículas virales que contienen el epítopo PréS:T estimulan en gran medida la producción de IL-2 mediante estos hibridomas T específicos, y esto de manera específica con relación a las pseudo-partículas de controles. Si se compara en molaridad la eficacia de PPV-PréS:T con relación al péptido p120-132, se constata que las pseudo-partículas son de 100 a 1000 veces más antigénicas que el péptido.
La inmunogenicidad de estas partículas se ensayó a continuación in vivo, o bien solas o bien a diversas dosis (0,01 a 10 \mug) (figura 7), o bien 10 \mug en presencia o no de adyuvante completo de Freund (figura 8). Estos experimentos demostraron la gran inmunogenicidad de las pseudo-partículas PPV-PréS:T que, en ausencia de cualquier adyuvante y a dosis débiles (1 sola inyección de 1 \mug), inducen respuestas proliferativas muy elevadas contra el epítopo insertado (figura 7). Estas respuestas son tan fuertes cuando las pseudo-partículas se inyectan solas como cuando se administran en presencia de adyuvante de Freund (figura 8).
Ejemplo 3 Construcción de pseudo-partículas que comprenden diversos epítopos
Se fabricaron dos oligonucleótidos que presentan las secuencias complementarias SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6:
SEC ID nº 5 (Mut1 +)
5'TCGAGATGTTCGAACAAAACACCGCTCAACCCC3'
SEC ID nº 6 (Mut 1)
5'TCGAGGGGTTGAGCGGTGTTTTGTTCGAACATC3'
Los extremos 5' de cada uno de estos oligonucleótidos pueden ligarse juntos con el fin de generar diversas copias del epítopo. Los oligonucleótidos se fosforilaron, se mezclaron y calentaron a continuación a 70ºC durante 15 minutos antes de ligarse en el plásmido pPPV29mod tratado mediante fosfatasa alcalina intestinal bovina, y se digirió mediante Xhol.
Las mezclas de ligaduras se utilizaron para transformar bacterias E. Coli DH5\alpha. Los clonesrecombinantes se caracterizaron mediante análisis con ayuda de enzimas de restricción. La incorporación de una o diversas copias, o la ausencia de incorporación del epítopo Mut1 se puso en evidencia mediante la determinación del tamaño del fragmento BamHI/HindIII. La integridad de las secuencias del epítopo y sus orientaciones se confirmaron mediante secuenciación. Los genes VP2 modificados que contienen las inserciones de los epítopos Mut1 se digirieron mediante BamHI y se subclonaron en el vector de transferencia de los baculovirus pAcYM1.
Se obtuvieron baculovirus recombinantes a partir de cotransfecciones de 500 ng de ADN viral AcRP13-lacZ linealizadas mediante Bsu36I y de 2 \mug de vectores individuales utilizando la técnica de la lipofectina descrita por Felgner et al. (1987, Proceedings of the National Academy Sciences, USA, 84, 7413-7417).
Los virus recombinantes se seleccionaron en base a sus fenotipos lacZ-negativos y se purificaron por placa antes de la preparación de reservas virales que presentan un título importante para cada uno de los virus recombinantes.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: INSTITUT PASTEUR
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 25-28, rue du Docteur Roux
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: PARIS
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 75724 PARIS
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 45 68 80 93
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: 250 609
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: IMMUNOLOGIA Y GENETICA APLICADA, S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Hermanos Garcia Noblejas, 41 20
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: MADRID
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESPAÑA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: E-28037
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Pseudo-partículas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGAGATGCG ACCACAAGCT TCAGGAGTAT ACATGGGAAA CCTAACAGCA CAAC 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGAGTTGTG CTGTTAGGTT TCCCATGTAT ACTCCTGAAG CTTGTGGTCG CATC 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGAGATGCA ATGGAATTCT ACCACCTTCC ACCAAACCCT GCAAC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGAGTTGCA GGGTTTGGTG GAAGGTGGTA GAATTCCATT GCATC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGAGATGTT CGAACAAAAC ACCGCTCAAC CCC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:6
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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TCGAGGGGTT GAGCGGTGTT TTGTTCGAAC ATC 
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Claims (14)

1. Pseudo-partículas virales recombinantes, caracterizadas porque están constituidas por el autoensamblado de al menos una proteína de estructura viral VP2 de un virus de la familia de las Parvoviridae, o de un virus emparentado, porque presentan un tamaño comprendido entre aproximadamente 20 y 60 nm, porque forman una estructura aproximadamente icosaédrica, y porque la proteína VP2 está modificada, en su extremo N-terminal, por la presencia de al menos un epítopo que comprende una secuencia de 8 a 25 aminoácidos susceptible de asociarse a al menos una molécula de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, siendo dicha asociación reconocida por unos linfocitos T citotóxicos.
2. Pseudo-partículas según la reivindicación 1, caracterizadas porque dicho epítopo comprende una secuencia de 8 ó 9 aminoácidos susceptible de asociarse a al menos una molécula de clase I.
3. Pseudo-partículas según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque dicho parvovirus es el PPV, el CPV u otro virus emparentado tal como el FPLV y el MEV.
4. Pseudo-partículas según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque dicho epítopo es un epítopo de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocitaria.
5. Pseudo-partículas según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque el epítopo es el epítopo CTL CD8^{+} contenido en la región 118-132 de la nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocitaria.
6. Pseudo-partículas según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque comprenden al menos un epítopo TCD4^{+} y al menos un epítopo TCD8^{+}.
7. Pseudo-partículas según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque comprenden una combinación de multicopias de epítopos TCD8^{+}.
8. Pseudo-partículas según la reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque comprenden una combinación de cuatro copias de epítopos TCD8^{+} Mut 1 del carcinoma de Lewis.
9. Pseudo-partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadas porque son susceptibles de ser obtenidas mediante un procedimiento que comprende una etapa de expresión en el baculovirus de la proteína híbrida formada por la proteína VP2 de parvovirus y de dicho epítopo.
10. Composición que comprende unas pseudo-partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en un vehículo y/o un diluyente fisiológicamente aceptable.
11. Composición según la reivindicación 10, caracterizada porque no comprende adyuvante inmunoestimulador.
12. Utilización de las pseudo-partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o de una composición según una de las reivindicaciones 10 u 11 en la fabricación de medicamentos o de vacunas para inducción de respuestas CTL o de citoquinas in vivo.
13. Utilización de las pseudo-partículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o de una composición según una de las reivindicaciones 10 u 11 en la fabricación de vacunas, en particular de vacunas antivirales o de medicamentos antitumorales.
14. Procedimiento de estimulación in vitro de las respuestas T citotóxicas de linfocitos procedentes de sujetos con infecciones virales o tumorales, que comprende la puesta en contacto de los linfocitos de los sujetos con las pseudo-partículas según una de las reivindicaciones 1 a 9.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60124523T2 (de) * 2001-07-10 2007-09-06 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Zusammensetzung einer Parvovirus VP1-Proteinvariante und eines arvovirus NS1-Proteins zur Induktion von Zytolyse
EP1614096A1 (en) * 2003-04-07 2006-01-11 Koninklijke Philips Electronics N.V. Display device
ES2307346B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
ES2307345B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
ES2310062B1 (es) 2005-07-15 2009-11-13 Bionostra, S.L. Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones.
AU2008297093B9 (en) 2007-09-14 2014-11-20 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polynucleotides allowing the expression and secretion of recombinant pseudo-virus containing foreign epitopes, their production, and use
EP2268801A4 (en) * 2008-03-14 2011-12-28 Us Gov Health & Human Serv COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO A HUMAN BOCAVIRUS

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8902301A (nl) * 1989-09-14 1991-04-02 Rijksuniversiteit Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins.

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