ES2257753T3 - Pseudo-particulas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales. - Google Patents
Pseudo-particulas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNAS SEUDOPARTICULAS VIRICAS CARACTERIZADAS PORQUE ESTAN FORMADAS POR EL AUTOENSAMBLAJE DE AL MENOS UNA PROTEINA DE ESTRUCTURA VIRICA; PORQUE TIENEN UN TAMAÑO COMPRENDIDO ENTRE 20 Y 60 NM; PORQUE FORMAN UNA ESTRUCTURA APROXIMADAMENTE ICOSAEDRICA; Y PORQUE LA MENCIONADA PROTEINA ESTA MODIFICADA POR LA PRESENCIA DE AL MENOS UN EPITOPO QUE TIENE UNA SECUENCIA DE 8 A 25 AMINOACIDOS QUE PUEDEN ASOCIARSE CON AL MENOS UNA MOLECULA DE CLASE I O II DEL COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD, CON EXCLUSION DEL EPITOPO C3:T. LA MENCIONADA ASOCIACION ES RECONOCIDA POR LINFOCITOS TCD8 + CI TOTOXICOS Y TCD4 + . ESTAS SEUDOPARTICULAS PUEDEN UTILIZARSE COMO VACUNA ANTIVIRICA O COMO MEDICAMENTO.
Description
Pseudo-partículas virales
recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales.
La presente invención se refiere a
pseudo-partículas virales recombinantes de un virus
de la familia de Parvoviridae o de un virus emparentado, útiles en
particular para inducir respuestas linfocitarias TCD8^{+}
citotóxicas (CTL) in vivo a un nivel elevado.
La misma tiene asimismo por objeto la utilización
de dichas pseudo-partículas para la preparación de
vacunas o de medicamentos antitumorales.
La invención se refiere asimismo a unas
composiciones que comprenden dichas
pseudo-partículas en un vehículo y/o un diluyente
fisiológicamente aceptable.
Según Fernández et al. (Medécine/Sciences,
1995, 11, 975-983), la respuesta con mediación
celular, esencial en el caso de un tumor, puede dividirse en dos
partes:
- -
- por una parte la puesta en marcha de la respuesta que hace intervenir unos linfocitos TDC4+ y unas células presentadoras del antígeno (CPA), y
- -
- por otra parte la respuesta efectiva citotóxica en la que intervienen los linfocitos TCD8^{+}.
Los linfocitos TCD4^{+} activados proliferarán
y secretarán unas citoquinas, mientras que los linfocitos
TCD8^{+} activados proliferarán y se diferenciarán en linfocitos T
citotóxicos (CTL)
Estas dos familias de linfocitos, tienen por lo
tanto funciones muy diferentes y se activan mediante mecanismos
distintos. La estimulación de los linfocitos CD4^{+} necesita la
asociación de un péptido fruto de la degradación del antígeno a las
moléculas de clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(CMH), mientras que la estimulación de las células CD8^{+}
necesita la asociación de un péptido a unas moléculas de clase I del
CMH.
Se ha propuesto ya un cierto número de
estrategias profilácticas o terapéuticas para luchar contra las
enfermedades de orígenes diversos en el hombre y en el animal
ocasionadas por virus, bacterias, parásitos, o contra las
enfermedades cancerosas o tumorales.
Se conoce, por ejemplo, la inducción de
respuestas CTL in vivo por unos vectores "vivos". Sin
embargo, la inocuidad de estos vectores no está garantizada, en
particular en individuos inmunodeprimidos. Por otra parte, los
sistemas que implican la replicación de estos vectores "vivos"
no conservan su eficacia en individuos inmunes.
Martínez et al. dan a conocer en
Vaccine (vol. 10, pág. 684-690, 1992) la
utilización de cápsidas vacías de parvovirus de cerdo (PPV) en la
vacunación de los cerdos. La familia de las Parvoviridae
reagrupa virus muy destruidos en los mamíferos tales como cerdos,
bovinos, gatos, conejos, ratas y en el hombre. Sin embargo, los
parvovirus son relativamente específicos de los mamíferos huéspedes.
El parvovirus de cerdo (PPV), en particular, es responsable de
numerosas infecciones en la cría industrial de cerdos. El parvovirus
de cerdo (PPV) está constituido por una partícula isométrica no
recubierta de 20 nm de diámetro y de simetría icosaédrica, que
contiene una molécula de ADN de cadena sencilla. Está compuesto por
dos proteínas de cápsides, VP1 (83 kDa) y VP2 (64 kDa), y por una
tercera proteína, VP3 resultado de la proteólisis de VP2.
La proteína VP2 puede ser producida por células
de insectos con ayuda de un sistema de baculovirus recombinante y
las proteínas VP2 obtenidas son capaces de autoensamblarse para
formar unas pseudo-partículas virales que tienen el
mismo tamaño que el del virión nativo. La vacunación de cerdos
contra la PPV se realiza inmunizándolos con una mezcla de dichas
cápsides con asociación adyuvante Alhidrogel (a 50%) + Quil A 500
\mug (Superfos). Una enseñanza comparable a la de este artículo
se encuentra en las solicitudes EP-551 449 y
EP-554 414 que indican además que estos epítopos
correspondientes a otras proteínas virales pueden incorporarse a las
cápsides, sin precisar sin embargo la naturaleza de estos
epítopos.
La solicitud EP-647 655 se
refiere a unos péptidos sintéticos correspondientes a unos sitios
antígenos de VP2. No se trata entonces de la proteína completa.
Sedik et al. describen, en el Journal
of General Virology (76:2361-2368, (1995)), la
utilización de partículas híbridas de PPV como vectores de dos
epítopos del virus de la polio, C3:B y C3:T reconocidos
respectivamente por linfocitos B y TCD4^{+}. Las partículas que
contienen el epítopo C3:TCD4^{+} solamente son capaces de
estimular las respuestas proliferativas de células T, CD4^{+} y no
de células T CD8^{+}. Además de esta especificidad de
estimulación, las respuestas son de un nivel poco elevado,
insuficiente para una inmunización eficaz. En cualquier caso, la
inducción de estas respuestas requiere obligatoriamente la
utilización de un adyuvante (hidróxido de aluminio o adyuvante
completo de Freund).
Además, los ensayos de modificación de las
pseudo-partículas con vistas a incorporar unos
epítopos heterólogos se encuentran con unas dificultades tales como
la inhibición de la formación de las
pseudo-partículas. Incluso cuando estas últimas se
forman, el epítopo heterólogo no es necesariamente inmunógeno,
pudiendo el epítopo situarse, por ejemplo, en un sitio en el que es
incapaz de adoptar su conformación natural o ser producido por las
células que presentan el antígeno.
Por otra parte, a semejanza de las vacunas con
vectores "vivos" la inocuidad de estas partículas híbridas
asociadas a los adyuvantes no está totalmente asegurada, pudiendo
una toxicidad provenir de ciertas propiedades de los adyuvantes
susceptibles de inducir efectos secundarios nefastos para el
organismo.
Se desprende por tanto del estado de la técnica
que no se conoce un sistema fiable, eficaz que permita estimular la
respuesta linfocitaria T-citotóxico y T auxiliar,
sin riesgo para la salud del individuo tratado y sin la utilización
de adyuvantes inmunoestimuladores.
Además, las partículas híbridas que contienen el
epítopo C3:T no son capaces de inducir una respuesta T CD4^{+}
eficaz en ausencia del adyuvante.
El solicitante ha demostrado que es posible
inducir específicamente sin utilizar inmunoadyuvantes, una respuesta
linfocitaria CD8^{+}, es decir una respuesta citotóxica con ayuda
de pseudo-partículas que llevan epítopos
susceptibles de asociarse con al menos una molécula de clase I o de
clase II del CMH, respectivamente.
La presente invención tiene por objeto unas
pseudo-partículas virales recombinantes,
caracterizadas porque están constituidas por el autoensamblado de
al menos una proteína de estructura viral VP2 de un virus de la
familia de las Parvoviridae, o de un virus emparentado,
porque presentan un tamaño comprendido entre aproximadamente 20 y
60 nm, porque forman una estructura aproximadamente icosaédrica, y
porque la proteína VP2 está modificada, en su extremo
N-terminal, por la presencia de al menos un epítopo
que comprende una secuencia de 8 a 25 aminoácidos susceptible de
asociarse a al menos una molécula de clase I del complejo mayor de
histocompatibilidad, siendo dicha asociación reconocida por unos
linfocitos T citotóxicos.
Los linfocitos TCD8^{+} según la invención son
capaces de reconocer al menos un epítopo que comprende una
secuencia de 8 a 9 aminoácidos susceptibles de asociarse al menos a
una molécula de clase I del CMH.
Los linfocitos TD4^{+} según la invención son
capaces de reconocer una secuencia comprendida entre 8 y 25
aminoácidos susceptibles de asociarse al menos a una molécula de
clase II del CMH.
Las partículas según la invención pueden
comprender proteínas de diversas naturalezas, y formar partículas
híbridas. Pueden estar constituidas por ejemplo por proteínas VP2 y
VP1.
La asociación formada entre la secuencia
correspondiente al epítopo y las moléculas de clase I es reconocida
por el receptor de linfocitos T CD8^{+} e induce una
diferenciación y una proliferación de estos linfocitos.
Ventajosamente, dicha secuencia está rodeada de
regiones denominadas flanqueantes susceptibles de modular su
degradación, es decir de facilitar su producción durante la
degradación del antígeno, o de facilitar su fijación a las
moléculas de clase I del CMH.
Las regiones flanqueantes pueden corresponder a
los aminoácidos que flanquean el epítopo T, CD8^{+} en su
ambiente natural. De manera general, pueden estar compuestas por
diversos aminoácidos, y en particular por alanina o por lisina.
Las pseudo-partículas según la
invención presentan un primer interés, que proviene de la seguridad
de este modo de inmunización, siendo el vector utilizado no
replicativo, constituido por un único tipo de proteína viral y
pudiendo ser administrado incluso a individuos inmunodeprimidos.
Una segunda ventaja de las
pseudo-partículas según la invención reside en la
ausencia de reacciones cruzadas con el parvovirus humano y, por lo
tanto, en ausencia de problemas ligados a una
pre-inmunización de los individuos, que provoca
eventualmente una inmunogenicidad débil de este tipo de vacunas
recombinantes.
Además, las pseudo-partículas
según la invención no necesitan la replicación del vector y por lo
tanto, pueden conservar su eficacia en los individuos inmunes.
Asimismo, las pseudo-partículas
según la invención poseen una excelente inmunogenicidad -una sola
inmunización es suficiente- y por lo tanto, pueden utilizarse en
ausencia de adyuvante inmunoestimulador.
Ventajosamente, el parvovirus es el PPV, el CPV
(Canine Parvovirus) u otro virus emparentado tal como el FPLV
(Feline Paroleukopenia virus) y el MEV (Mink Enteritis virus).
El epítopo puede estar constituido por cualquier
secuencia que se fija a una molécula del CMH de clase I y
susceptible de inducir una toxicidad T linfocitaria. En particular,
puede tratarse de un epítopo TCD8^{+} de un virus, tal como el
VIH-1 o el VIH-2, o el virus de la
gripe, o un epítopo tumoral o expresado por unas células
cancerosas.
Según un modo ventajoso de realización, las
pseudo-partículas según la invención se caracterizan
porque el epítopo seleccionado es el epítopo CTL CD8^{+}
contenido en la región 118-132 de la nucleoproteína
del virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV).
Sin embargo, el epítopo puede ser cualquier otro
epítopo susceptible de inducir una respuesta CTL, tal como por
ejemplo, uno de los epítopos siguientes:
- -
- los epítopos de las proteínas Env gp 120, Env gp41, Gag p17, Gag p24, Gag p15, Pol y Nef, de los virus VIH y los epítopos de las proteínas Gag, y nef del virus VIS y Gag del virus VIH-12, tal como los definidos por VENET y WALKER (AIDS 1993, Vol. 7, supl. 1, 119-120)
- -
- los epítopos de proteínas expresadas por unos tumores que se desarrollan en el ser humano, tales como las proteínas expresadas por los genes MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1,2, HER-2/neu, y por antígenos de diferenciación melanocítica, tales como la tirosinasa, Pmel17gp100, Melan-AMART-1, y gp 75TRP1, definidos por VAN DEN EYNDE y BRICHARD (Current Opinion in Immunolgy, 1995, 7, 674-681).
Para inducir una respuesta T CD4^{+} auxiliar o
que resulta en la producción de linfoquinas, el epítopo puede ser
el epítopo T CD4^{+} PréS:T situado en la región PréS2 (secuencia
120-132) del virus de la hepatitis B (HBV).
La pseudo-partícula puede
comprender asimismo una combinación de epítopos, y en
particular:
- -
- al menos un epítopo TDC4^{+} y por lo menos un epítopo TCD8^{+},
- -
- una combinación de multicopias de epítopos TDC4^{+} o TCD8^{+},
- -
- una combinación de cuatro copias de epítopos TCD8^{+}Mut del carcinoma de Lewis.
Por combinación de epítopos, se entiende una
combinación que comprende al menos dos epítopos y preferentemente,
entre dos y diez epítopos de proteínas idénticas como por ejemplo,
una multicopia de epítopos Mut1 del carcinoma de Lewis o de
proteínas diferentes. Así, una combinación de multicopias de
epítopos TCD8^{+} puede comprender al menos dos epítopos y de
manera preferida, entre dos y diez epítopos fruto de proteínas
diferentes como por ejemplo, la asociación de un epítopo TCD8^{+}
de la nucleoproteína de la coriomeningitis linfocitaria y de un
epítopo TCD8^{+} Env.gp 41 del VIH.
Ventajosamente, dichas
pseudo-proteínas virales recombinantes son
susceptibles de ser obtenidas mediante por un procedimiento que
comprende una etapa de expresión en el baculovirus, de la proteína
quimérica constituida por la proteína VP2 del parvovirus y de dicho
epítopo.
Las pseudo-partículas según la
invención se obtienen, de manera aún más preferida, mediante
autoensamblado de la proteína VP2 de parvovirus modificada por la
presencia, en su extremo N-terminal, de al menos un
epítopo de la nucleoproteína de LCMV o de al menos un epítopo de
HBV o incluso de una combinación de multicopias de epítopos.
Se observará que cualquier otra molécula, y en
particular cualquier otra proteína, que presenta propiedades
similares a VP2, tal como el autoensamblado, y que pueden ser
modificadas por un epítopo, pueden utilizarse en el marco de la
presente invención como sustitución de VP2.
La presente invención tiene asimismo por objeto
la utilización de las pseudo-partículas en cantidad
inmunizante eficaz, para la inducción de respuestas CTL in
vivo a un nivel elevado.
Por la expresión "cantidad inmunizante
eficaz" se entiende una cantidad seleccionada en función de la
vía de administración y del peso del individuo de las
pseudo-partículas según la invención.
Ventajosamente, la cantidad administrativa estará comprendida entre
10 y 500 \mug de pseudo-partículas por
individuo.
La presente invención tiene además por objeto una
composición que comprende las pseudo-partículas en
un vehículo y/o un diluyente inmunológicamente aceptables. Como
diluyente, se puede utilizar una solución acuosa tamponada
aproximadamente a pH 7 (solución fisiológica).
Ventajosamente, la composición según la presente
invención está exenta de adyuvante inmunoestimulante. Sin embargo,
puede contener, si es necesario, dicho adyuvante que puede ser
hidróxido de aluminio.
Las pseudo-partículas según la
presente invención también pueden utilizarse en un procedimiento de
estimulación in vitro de las respuestas T citotóxicas de
linfocitos que provienen de sujetos que sufren de infecciones
virales tumorales que comprenden la puesta en contacto de los
linfocitos de los sujetos con las pseudo-partículas.
En este caso, las células, son después del tratamiento,
readministradas a los pacientes, por ejemplo, mediante
inyección.
La presente invención tiene asimismo por objeto
la utilización de las pseudo-partículas de
conformidad a la invención en una preparación de una vacuna, de
preferencia de dosis única, en particular antitumoral o antiviral.
Puede administrarse por las vías habituales para las vacunas, a
saber por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea o
eventualmente por vía oral o cualquier otra vía que permita la
activación de una respuesta CTL.
La invención se ilustra sin estar limitada de
ningún modo por la descripción siguiente, haciendo referencia a los
dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 representa el procedimiento de
obtención del plásmido pPPV29.
La figura 2 que comprende tres gráficos
2(a), 2(b) y 2(c), ilustra la inmunización de
ratones, en dos tomas, el día 0 y el día 21 con 10 y 50 \mug
respectivamente de pseudo-partículas según la
invención, sin adyuvante. El día 28, los esplenocitos son
estimulados in vitro durante 5 días con los esplenocitos
singénicos preincubados con el péptido sintético
118-132. La actividad linfocitaria T citotóxica se
mide sobre las dianas P815 preincubadas con el medio o con el
péptido sintético 118-132. Los resultados se
expresan en % de lisis, estando la relación E:T indicada en
abscisas, designando esta expresión E/T la relación de linfocitos
efectores/células diana. La figura 2(a) se refiere a los
resultados obtenidos con la partícula PPV-29LCMV, la
figura 2(b) los resultados obtenidos con la partícula
PPV-30LMCV y la figura 2(c) a título
comparativo con las pseudo-partículas no
modificadas.
La figura 3 que comprende 7 gráficas 3(a),
3(b), 3(c), 3(d), 3(e), 3(f) y
3(g), ilustra la inmunización de ratones, en dos tomas, el
día 0 y el día 21, con diferentes dosis respectivamente de 50 \mug
para la figura 3(a), 10 \mug para la figura 3(b), 2
\mug para la figura 3(c), 0,4 \mug para la figura
3(d), 0,08 \mug para la figura 3(e), de
pseudo-partículas según la invención, sin adyuvante.
El día 28, los esplenocitos son estimulados in vitro durante
5 días con los esplenocitos singénicos pre-incubados
con el péptido sintético 118-132. La actividad
linfocitaria T citotóxica se mide sobre dianas P815
pre-incubadas con el medio o con el péptido
sintético 118-132 Los ratones testigo recibieron una
inyección el día 21 de 100 \mug de péptido sintético
118-126 de adyuvante incompleto de Freund (IFA)
(figura 3g) o de pseudo-partículas testigo (figura
3f). Los resultados se expresan en T de lisis, de la misma manera
que en la figura 2.
La figura 4 que comprende, de una manera similar
a la figura 2, tres gráficos 4(a), 4(b) y 4(c),
ilustra la inmunización de ratones mediante una única inyección de
10 \mug o de 50 \mug de pseudo-partículas según
la invención, sin adyuvante. Al día 24, los esplenocitos son
estimulados in vitro durante 5 días con esplenocitos
singénicos pre-incubados con el péptido sintético
118-132. La actividad linfocitaria T citotóxica se
mide sobre unas dianas P815 pre-incubados con el
medio o con el péptido sintético 118-132. Los
resultados se expresan en % de lisis, de la misma manera que en la
Figura 2.
La figura 5 que comprende dos gráficas
5(a) y 5(b), ilustra la protección de ratones BALB/c,
inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) los días 0 y 21 con PBS,
o con las pseudo-partículas huecas (PPV) o que
expresan la secuencia 118-132 de la nucleoproteína
del LCMV (PPC-LCMV), o con el virus cepa Armstrong
(LCMV-Arms), contra la infección mediante LCMV
respectivamente los días 28 (5a) y 70 (5b). Los ratones fueron
infectados por vía intracerebral con 10^{1.7}PFU/ratón. La
mortalidad de los ratones es seguida diariamente durante 10 días y
los resultados se expresan en % de supervivencia entre los animales
de cada lote.
Las figuras 6A a 6D ilustran la estimulación de
hibridomas T específicos del epítopo T CD4^{+} PréS:T de HBV, 51
E12 (6A y 6D) o 52A12 (6B y 6D) por unas células de linfoma B (6A y
6B) o unos esplenocitos irradiados (6C y 6D) puestos en presencia
de péptido PréS:T, de pseudo-partículas
recombinantes PPV-PréS:T o de
pseudo-partículas PPV (VP2).
Las figuras 7A y 7B ilustran la respuesta
proliferativa de las células ganglionarias estimuladas in
vitro con el péptido PréS:T (figura 7A) o las
pseudo-partículas PPV (VP2) (figura 7B), procediendo
dichas células de los ratones DBA/1 inmunizados por 0,01 \mug de
PPV-PréS:T o 10 \mug de PPV (VP2), en ausencia de
adyuvante.
Las figura 8A y 8B representan la proliferación
de células ganglionarias, procedentes de ratones DBA/1 inmunizados
mediante PPV-PréS:T en medio PBS o en presencia de
adyuvante completo de Freund o PPV (VP2), reestimulados mediante el
péptido PréS:T (figura 8A) o PPV (VP2) (figura 8B).
El epítopo CTL heterólogo, CD8^{+} contenido en
la región 118-132 de la nucleoproteína de LCMV fue
inducido en el gen de VP2 del PPV sin alterar la formación ulterior
de las pseudo-partículas. Se obtuvieron dos
partículas, PPV-29 LCMV y PPV-30
LCMV, que se diferencian únicamente por un codón de iniciación.
Estas proteínas quimeras fueron producidas por un sistema de
baculovirus y purificadas mediante precipitación de sulfato de
amonio a partir del lisado de células de insectos según el
procedimiento descrito en el Journal of General Virology 76: pág.
2361-2368 (1995).
La capacidad de estas partículas recombinantes
para inducir respuestas linfocitarias T citotóxicas fue analizada
in vivo en el ratón BALB/c.
Como se ilustra en la figura 1, el vector pPPV29
se obtiene mediante digestión y sustitución del fragmento
Xhol-Ncol del vector pPPV17R procedente del vector
pPPV17 descrito por Martinez et al. (1992, Vaccine,
10, 684-690) mediante dos productos de
amplificación PCR, con el fin de eliminar una región presente en el
sitio de policlonación de pPPV17R y el codón de iniciación de VP2.
Los vectores pPPV17 y pPPV17R se diferencian únicamente por la
orientación del gen clonado VP2 con relación al polienlazador. Todas
las amplificaciones PCR se efectuaron en un volumen total de 100 ml
con una unidad de ADN polimerasa Vent (New England Biolabs), 10 ng
de pPPV17R como matriz, 100 \mum de dNTPs y 800 ng de cada
iniciador. Las amplificaciones se llevaron a cabo durante 25 ciclos
de desnaturalización a 93ºC durante un minuto, siendo el anillado
del iniciador efectuado a 50ºC durante un minuto y la extensión a
72ºC durante tres minutos. Los productos de la PCR se clonaron en
el pPPV17R digerido por Xho-I y Ncol y
desfosforilado. Las mezclas de enlace se utilizaron para transformar
las bacterias E. Coli DH5. De esta manera, se obtuvieron dos
plásmidos: pPPV29 que contiene un sitio único de clonación
Xho-I adyacente al codón ATG original de VP2, y
pPPV30 que contiene un sitio único de clonación
Xho-I, pero sin el codón de iniciación ATG.
Se obtuvo entonces el vector pPPV29 mod: el gen
VP2 se obtuvo mediante digestión del pPPV29 por PstI ligado a
continuación en el sitio de clonación PstI del plásmido pMTL24 con
el fin de proporcionar los sitios BamHI para la subclonación en los
vectores de transferencia del baculovirus.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos que
codifican para el epítopo CD8^{+} y el codón de iniciación, y que
comprenden dos sitios Xhol. Presentan las secuencias SEC ID nº 1 y
nº 2 siguientes:
SEC ID nº 1:
5'TCGAGATGCGACCACAAGCTTCAGGAGTATACATGGGAAACCTAACAGCACAAC3'
SEC ID nº2
5'TCGAGTTGTGTGCTGTTAGGTTTCCCATGTATACTCCTGAAGCTTGTGGTCGCATC3
Estos dos oligonucleótidos complementarios se
proporcionaron mediante MedProbe (Norvege). Se fosforilaron con
ayuda del polinucleótido quinasa T4, anillados a 70ºC durante 15
minutos y ligados en el sitio Xhol del plásmido pPPV29mod digerido
por Xhol, que contiene el gen que codifica para la
PPV-VP2.
Unas células de Escherichia coli DH5 se
transformaron con la mezcla de ligadura y se extendieron sobre el
medio LB que contiene 100 \mug(ml de amplicilina (Hanahan,
1983, J. Mol. Biol., 166, 557-580). Se
seleccionaron los recombinantes que contienen la inserción LCMV, y
se secuenciaron a continuación mediante el procedimiento con
dideoxi con el fin de determinar su orientación y la integridad de
las secuencias insertadas. El clon recombinante que contiene la
secuencia LCMV en la orientación adecuada ha sido denomiinado
pPPV29mod/LCMV.
La secuencia VP2 quimérica se obtuvo a partir del
vector pPPV29mod/LCMV mediante digestión por BamHI y subclonada en
el único sitio de restricción BamHI del vector de transferencia del
baculovirus PacYM1.
Se prepararon los clones recombinantes como se ha
descrito anteriormente y se analizaron mediante el procedimiento de
minipreparación de ADN plasmídico y mediante cartografía de
restricción. Las secuencias de inserción de los clones positivos se
secuenciaron con el fin de verificar de nuevo la integridad del
epítopo insertado así como las secuencias flanqueantes. Por último,
el ADN purificado por el fenol se precipitó por dos volúmenes de
etanol. El clon recombinante así obtenido se denominó
pAcYM1/LCMV/ppv29mod.
Con el fin de obtener los baculovirus
recombinantes, se añadió una mezcla de 2 \mug de ADN de vector de
transferencia purificado y de 500 ng de ADN parental AcRP32Iacz+ a
las células de insectos Sf9 en presencia de reactivo de
transfección DOTAP (Boering Mannheim), según las instrucciones de
esta Sociedad. La transfección se prosiguió hasta el efecto
citopático fue total. Después de 9 días, los cultivos se recuperaron
y se utilizó el sobrenadante clarificado para el aislamiento de
placas de baculovirus recombinantes según los procedimientos ya
conocidos por el experto en la materia y descritos por Sedlik et
al. (J. Gen. Virol. 1995, 76, 2361-2369). Los
clones recombinantes se seleccionaron utilizando su fenotipo diana
(placa blanca: recombinante, placa azul: fenotipo salvaje).
Los baculovirus recombinantes se purificaron
hasta que no pudiera detectarse ninguna placa azul. Se prepararon
unas reservas de virus que presentan un título importante de
baculovirus recombinante AcNPV.PPV-LCMV
(>10º^{8}).
Un clon, denominado AcPP29-LMCV
se depositó el 20 de diciembre de 1995 bajo el nº V 95122022 ante la
European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC).
Las células Sf9 se infectaron con los baculovirus
recombinantes a razón de una tasa de infección de 1 pfu por célula
(una unidad que forma placa por célula) y los extractos de las
células se recogieron 72 horas después de la infección.
Se agregó tampón de disociación de proteína a
cada extracto celular, y las mezclas se calentaron a 100ºC durante
5 minutos, y se separaron a continuación sobre SDS PAGE al 9%.
Los geles se colorearon con ayuda de azul de
Coomassie o se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa con
ayuda de un equipo semiseco, a 22 voltios durante 30 minutos.
Las membranas se incubaron con suero de ratón
digerido contra el epítopo LCMV CD8^{+} (dilución 1/200) durante
dos horas a temperatura ambiente.
Después del lavado, los anticuerpos fijados se
detectaron mediante la proteína A conjugada con peroxidasa
(dilución 1/2000) utilizando 4-cloronaftol como
substrato hasta el desarrollo del color. Las membranas se
enjuagaron a continuación con agua destilada con el fin de detener
la reacción. Después de la coloración de los geles SDS mediante
azul de Coomassie, se detectó una banda visible de 67 kD en los
extractos de células Sf9 infectadas con los baculovirus
recombinantes. El tamaño observado corresponde al tamaño esperado
para la proteína quimérica VP2-LCMV. La identidad
de esta proteína se confirmó mediante inmunotransferencia. El
antisuero de ratón específico muestra una reacción positiva muy
clara con la proteína de 67 kD de los extractos celulares
infectados. La localización intracelular de la proteína recombinante
fue analizada mediante inmunotransferencia de diferentes fracciones
celulares. Esto ha permitido demostrar que la proteína quimérica
LCMV-VP2 es una proteína citoplásmica soluble.
Las células Sf9 se infectaron con ayuda de
baculovirus recombinante a una tasa de infección de 1 pfu por
célula. Las células se recogieron 72 horas después de la infección,
se lavaron con PBS y se lisaron mediante choque osmótico a 4ºC en
una solución de bicarbonato 25 nM. Los restos celulares de
eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad.
Las partículas contenidas en los extractos se
purificaron entonces mediante precipitación por una solución
saturada con 20% de sulfato de amonio. El precipitado se centrifugó
a 1.500 rpm durante 15 minutos, se resuspendió en PBS y se dializó
durante una noche con este mismo tampón. La identidad y las
propiedades de las partículas se confirmaron mediante
SDS-PAGE, inmunotransferencia y mediante microscopía
electrónica.
Estas partículas purificadas se utilizaron para
la inmunización e inducción de la citotoxicidad linfocitaria
(CTL).
Los ratones reciben por vía intraperitoneal una
inyección de una composición que contiene las
pseudo-partículas virales recombinantes según la
invención (PPV-LCMV), o huecas (PPV), en ausencia de
adyuvante. Los testigos positivos son ratones inyectados, en el día
21, por vía subcutánea con el péptido sintético
118-126 (proporcionando por la sociedad Neosystem,
Estrasburgo, Francia) de adyuvante incompleto de Freund (IFA). Los
testigos negativos reciben unas pseudo-partículas
que no expresan el epítopo LCMV.
Se extraen los bazos
pseudo-partículas de los ratones inmunizados 7 a 14
días después de la última inmunización. 25x10^{6} células inmunes
se ponen en cultivo, en presencia de 25x10^{6} esplenocitos
irradiados procedentes de los ratones singénicos naives, en frascos
que contienen el medio de cultivo nutritivo (RPMI 1640, 10% de
suero bovino fetal, glutamina y antibiótico) durante 5 días a 37ºC,
CO_{2} al 5%
Las células estimuladoras son sensibilizadas
in vitro con el péptido sintético 118-126 a
0,5 \muM o con el péptido sintético 118-132
(suministrado asimismo por la sociedad Neosystem, Estrasburgo,
Francia) a 0,5 \muM.
La actividad citotóxica de los linfocitos
efectores se midió después de 5 días. Las células diana P815 se
preincubaron o bien con el medio nutritivo (testigo negativo), o
bien con el péptido antigénico sintético y se marcaron
simultáneamente por el ^{51}Cr durante 1h, a 37ºC. A continuación,
los linfocitos efectores se incuban con las células marcadas, a
diferentes relaciones de efector/diana (relación E/T) en medio
nutritivo en placas de 96 pocillos de fondo redondo, durante 4 a 5
horas, a 37ºC. Las dianas se incubaron en las mismas condiciones
con el medio para medir la liberación espontánea de ^{51}Cr y con
el ácido clorhídrico 1N para medir la liberación máxima del
^{51}Cr. La actividad de los linfocitos citotóxicos se determina
mediante recuento de la radioactividad presente en los
sobrenadantes de cultivo, correspondiente a la liberación de
^{51}Cr por las células diana lisadas.
% de lisis
específica = \frac{cpm \ experimental - cpm \ espontáneo}{cpm \
máximo - cpm \
espontáneo}
Este cálculo se realiza con las células diana
incubadas en el medio nutritivo (P815) y con las células diana
incubadas con el péptido sintético (P815 +
0118-132), como se ha representado mediante las
curvas de las figuras 2 y 4.
Como se puede constatar a partir del examen de
las figuras 2 a 5, una única inyección de 10 \mug de
pseudo-partículas recombinantes que presentan el
epítopo T, CD8^{+} de LCMV ha permitido alcanzar prácticamente
100% de lisis, es decir, tanto como el testigo positivo péptido
sintético p118-126 + FIA, lo que confirma que las
pseudo-partículas según la invención permiten la
inducción de respuestas CTL in vivo a un nivel elevado sin
añadir el adyuvante.
Esta inducción es específica del epítopo
insertado ya que ninguna respuesta T citotóxica se obtiene cuando
los ratones son inmunizados mediante dosis equivalentes de
pseudo-partículas que no expresan el epítopo LCMV.
Las células T citotóxicas así inducidas lisan específicamente las
células diana P185 recubiertas por el péptido correspondiente al
epítopo insertado.
La figura 5 muestra por su parte que los ratones
a los que se les inyectaron las pseudo-partículas
están protegidos contra la infección viral a 28 días, y que 4/5
ratones están protegidos a 70 días.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos, que
codifican para el epítopo PréS:T del HBV, que tiene las siguientes
secuencias:
SEC. ID nº 3
5'TCGAGATGCAATGGAATTCTACCACCTTCCACCAAACCCTGCAAC3'
SEC. ID nº 4
5'TCGAGTTGCAGGGTTTGGTGGAAGGTGGTAGAATTCCATTGCATC3'
Estos dos oligonucleótidos son complementarios y
contienen dos secuencias flanqueantes del sitio Xhol en los
extremos con el fin de permitir una clonación directa en el vector
pPPV30. Los oligonucleótidos se proporcionan por ISOGEN (Países
Bajos). Se fosforilaron con ayuda del polinucleótido quinasa T4, se
anillaron a 70ºC durante 15 minutos y se ligaron a continuación en
presencia de pPPV30 digerido por Xhol y tratado mediante fosfatasa
a 14ºC durante una noche. La mezcla se utilizó para transformar las
células de Escherichia coli (cepa DH5).
Las colonias se analizaron con ayuda de las
enzimas de restricción EcoRi y HindIII con el fin de verificar la
presencia de las secuencias insertadas. Los recombinantes que
contienen la secuencia del epítopo se secuenciaron con el fin de
confirmar que no se produjo ningún cambio ni ninguna mutación
durante estas manipulaciones.
Los plásmidos recombinantes que contienen el
epítopo PréS:T en una orientación correcta se digirieron con ayuda
de BamHI y VP2 modificada se subclonó en el vector de transferencia
pAcYM1 (Matsuura et al., 1987, J. Gen. Virol. 68,
1233-1250). Los clones recombinantes se analizaron
como se ha descrito anteriormente y las secuencias de las
inserciones se confirmaron mediante secuenciado. El clon
recombinante se denomina pAcYM1/PréS:T-pPPV30.
Los baculovirus recombinantes se obtuvieron
mediante transfección de células de insectos SF9, como se describe
en el ejemplo 1 y se separaron unas reservas de virus que presentan
títulos importantes (>10^{8} pfu/ml). El virus recombinante se
denominó AcPPV30-PréS:T.
Se depositó ante la European Collection of Animal
Cell Cultures (ECACC), con el nº V96081412 el 15 de agosto de
1996.
Se infectaron células Sf9 (Smith et al.,
1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165) con una
tasa de infección de 1pfu/célula con el baculovirus recombinante
AcPPV30-PréS:T. Se recogieron células infectadas 72
horas después de la infección y se analizaron mediante
electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 9% en presencia de
SDS y mediante inmunotransferencia. Los resultados demuestran la
presencia de proteína VP2 recombinante modificada.
Con el fin de purificar las partículas VP2
quiméricas, las células infectadas se lisaron con ayuda de
bicarbonato se sodio 25 mM, los restos se eliminaron mediante
centrifugación y el sobrenadante que contienen las partículas se
precipitó con ayuda de sulfato de amonio al 20% durante 20 minutos a
4ºC. El residuo, que se enriqueció de manera importante de
partículas VP2, se recogió mediante centrifugación y se dializó de
nuevo contra PBS durante una noche. Las partículas purificadas se
almacenaron a 4ºC hasta su utilización.
10^{5} células de linfoma B,
M12C10(H-2^{d/q}) (Figura 6A y B) o
5.10^{5} esplenocitos irradiados de ratones
DBA/1(H-2^{q}) (figuras 6C y D) se
incubaron a 37ºC, en presencia de diferentes concentraciones de
péptido PréS:T que corresponde a la secuencia
120-132, de pseudo-partículas
recombinantes PPV-PréS:T, o de
pseudo-partículas PPV (VP2), y se utilizaron a
continuación para estimular 10^{5} hibridomas T, 51E12 (6A y 6C)
o 52A12 (6B y 6D), específicas del péptido PréS:T y limitadas por
las moléculas I-A^{q}; después de 24 horas, se
extrajeron los sobrenadantes de cultivo, y se dosificaron con la
línea CTLL, dependiente de IL-2. Tres días más
tarde, la proliferación de las células CTLL se midió mediante
incorporación de timidina tritiada.
Se inmunizaron ratones DBA/1
(H-2^{q}) por vía subcutánea con 10 \mug, 1
\mug, 0,1 \mug o 0,01 \mug de
pseudo-partículas virales PPV (VP2). Diez días más
tarde, las células de los ganglios drenantes se estimularon
nuevamente in vitro con diferentes concentraciones de
péptido PréS:T (Figura 7A) o con 0,5 \mug/ml de PPV (VP2) (Figura
7B). Cuatro días más tarde, la proliferación de las células
ganglionarias se mide mediante incorporación de timidina
tritiada.
Ratones DBA/1 (H-2^{q}) se
inmunizaron por vía subcutánea con 10 \mug de
pseudo-partículas virales recombinantes
PPV-PréS:T en solución salina (PBS) o en emulsión
con el adyuvante completo de Freund (ACF), o con 10 \mug de
pseudo-partículas virales PPV (VP2) en
ACF. Diez días más tarde, las células de los ganglios drenantes se
estimularon nuevamente in vitro con diferentes
concentraciones de péptido PréS:T (figura 8A) o de PPV (VP2)
(figura 8B). Cuatro días más tarde, la proliferación de las células
ganglionarias se midió mediante incorporación de timidina
tritiada.
Se introdujo el epítopo T, CD4^{+} PréS:T
situado en la región PréS2 (correspondiente a las secuencia
120-132) del virus HBV en la proteína VP2 del
parvovirus. Se purificaron las pseudo-partículas
controladas PPV (VP2) o recombinantes
PPV-PréS:T.
En un primer momento, la antigenicidad de estas
partículas se analizó in vitro contra hibridomas T
específicos del epítopo PréS:T. Como se aprecia en la figura 6, las
pseudo-partículas virales que contienen el epítopo
PréS:T estimulan en gran medida la producción de
IL-2 mediante estos hibridomas T específicos, y esto
de manera específica con relación a las
pseudo-partículas de controles. Si se compara en
molaridad la eficacia de PPV-PréS:T con relación al
péptido p120-132, se constata que las
pseudo-partículas son de 100 a 1000 veces más
antigénicas que el péptido.
La inmunogenicidad de estas partículas se ensayó
a continuación in vivo, o bien solas o bien a diversas dosis
(0,01 a 10 \mug) (figura 7), o bien 10 \mug en presencia o no de
adyuvante completo de Freund (figura 8). Estos experimentos
demostraron la gran inmunogenicidad de las
pseudo-partículas PPV-PréS:T que, en
ausencia de cualquier adyuvante y a dosis débiles (1 sola inyección
de 1 \mug), inducen respuestas proliferativas muy elevadas contra
el epítopo insertado (figura 7). Estas respuestas son tan fuertes
cuando las pseudo-partículas se inyectan solas como
cuando se administran en presencia de adyuvante de Freund (figura
8).
Se fabricaron dos oligonucleótidos que presentan
las secuencias complementarias SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6:
SEC ID nº 5 (Mut1 +)
5'TCGAGATGTTCGAACAAAACACCGCTCAACCCC3'
SEC ID nº 6 (Mut 1)
5'TCGAGGGGTTGAGCGGTGTTTTGTTCGAACATC3'
Los extremos 5' de cada uno de estos
oligonucleótidos pueden ligarse juntos con el fin de generar
diversas copias del epítopo. Los oligonucleótidos se fosforilaron,
se mezclaron y calentaron a continuación a 70ºC durante 15 minutos
antes de ligarse en el plásmido pPPV29mod tratado mediante fosfatasa
alcalina intestinal bovina, y se digirió mediante Xhol.
Las mezclas de ligaduras se utilizaron para
transformar bacterias E. Coli DH5\alpha. Los
clonesrecombinantes se caracterizaron mediante análisis con ayuda
de enzimas de restricción. La incorporación de una o diversas
copias, o la ausencia de incorporación del epítopo Mut1 se puso en
evidencia mediante la determinación del tamaño del fragmento
BamHI/HindIII. La integridad de las secuencias del epítopo y sus
orientaciones se confirmaron mediante secuenciación. Los genes VP2
modificados que contienen las inserciones de los epítopos Mut1 se
digirieron mediante BamHI y se subclonaron en el vector de
transferencia de los baculovirus pAcYM1.
Se obtuvieron baculovirus recombinantes a partir
de cotransfecciones de 500 ng de ADN viral
AcRP13-lacZ linealizadas mediante Bsu36I y de 2
\mug de vectores individuales utilizando la técnica de la
lipofectina descrita por Felgner et al. (1987,
Proceedings of the National Academy Sciences, USA, 84,
7413-7417).
Los virus recombinantes se seleccionaron en base
a sus fenotipos lacZ-negativos y se purificaron por
placa antes de la preparación de reservas virales que presentan un
título importante para cada uno de los virus recombinantes.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT PASTEUR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 25-28, rue du Docteur Roux
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 75724 PARIS
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 45 68 80 93
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 250 609
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: IMMUNOLOGIA Y GENETICA APLICADA, S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Hermanos Garcia Noblejas, 41 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MADRID
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESPAÑA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: E-28037
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Pseudo-partículas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGATGCG ACCACAAGCT TCAGGAGTAT ACATGGGAAA CCTAACAGCA CAAC
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGTTGTG CTGTTAGGTT TCCCATGTAT ACTCCTGAAG CTTGTGGTCG CATC
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGATGCA ATGGAATTCT ACCACCTTCC ACCAAACCCT GCAAC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGTTGCA GGGTTTGGTG GAAGGTGGTA GAATTCCATT GCATC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGATGTT CGAACAAAAC ACCGCTCAAC CCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGGGGTT GAGCGGTGTT TTGTTCGAAC ATC
\hfill33
Claims (14)
1. Pseudo-partículas virales
recombinantes, caracterizadas porque están constituidas por
el autoensamblado de al menos una proteína de estructura viral VP2
de un virus de la familia de las Parvoviridae, o de un virus
emparentado, porque presentan un tamaño comprendido entre
aproximadamente 20 y 60 nm, porque forman una estructura
aproximadamente icosaédrica, y porque la proteína VP2 está
modificada, en su extremo N-terminal, por la
presencia de al menos un epítopo que comprende una secuencia de 8 a
25 aminoácidos susceptible de asociarse a al menos una molécula de
clase I del complejo mayor de histocompatibilidad, siendo dicha
asociación reconocida por unos linfocitos T citotóxicos.
2. Pseudo-partículas según la
reivindicación 1, caracterizadas porque dicho epítopo
comprende una secuencia de 8 ó 9 aminoácidos susceptible de
asociarse a al menos una molécula de clase I.
3. Pseudo-partículas según una
de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque dicho
parvovirus es el PPV, el CPV u otro virus emparentado tal como el
FPLV y el MEV.
4. Pseudo-partículas según una
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque dicho
epítopo es un epítopo de la nucleoproteína del virus de la
coriomeningitis linfocitaria.
5. Pseudo-partículas según una
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque el
epítopo es el epítopo CTL CD8^{+} contenido en la región
118-132 de la nucleoproteína del virus de la
coriomeningitis linfocitaria.
6. Pseudo-partículas según una
de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque
comprenden al menos un epítopo TCD4^{+} y al menos un epítopo
TCD8^{+}.
7. Pseudo-partículas según las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque comprenden una
combinación de multicopias de epítopos TCD8^{+}.
8. Pseudo-partículas según la
reivindicaciones 1 a 6, caracterizadas porque comprenden una
combinación de cuatro copias de epítopos TCD8^{+} Mut 1 del
carcinoma de Lewis.
9. Pseudo-partículas según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadas
porque son susceptibles de ser obtenidas mediante un procedimiento
que comprende una etapa de expresión en el baculovirus de la
proteína híbrida formada por la proteína VP2 de parvovirus y de
dicho epítopo.
10. Composición que comprende unas
pseudo-partículas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en un vehículo y/o un diluyente
fisiológicamente aceptable.
11. Composición según la reivindicación 10,
caracterizada porque no comprende adyuvante
inmunoestimulador.
12. Utilización de las
pseudo-partículas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, o de una composición según una de las
reivindicaciones 10 u 11 en la fabricación de medicamentos o de
vacunas para inducción de respuestas CTL o de citoquinas in
vivo.
13. Utilización de las
pseudo-partículas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, o de una composición según una de las
reivindicaciones 10 u 11 en la fabricación de vacunas, en particular
de vacunas antivirales o de medicamentos antitumorales.
14. Procedimiento de estimulación in
vitro de las respuestas T citotóxicas de linfocitos procedentes
de sujetos con infecciones virales o tumorales, que comprende la
puesta en contacto de los linfocitos de los sujetos con las
pseudo-partículas según una de las reivindicaciones
1 a 9.
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