ES2304787T3

ES2304787T3 - Vesiculovirus recombinantes y sus usos.

Info

Publication number: ES2304787T3
Application number: ES96913292T
Authority: ES
Inventors: John K. Rose
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2016-05-01
Also published as: PT871482E; DE69637472D1; US7153510B1; ATE390145T1; EP0871482B1; AU5634596A; EP0871482A4; DE69637472T2; US20050238656A1; US6168943B1; AU714616B2; CA2220133C; DK0871482T3; EP0871482A1; CA2220133A1; WO1996034625A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE VESICULOVIRUS REPLICABLES RECOMBINANTES. LA INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO MEDIANTE EL CUAL, POR PRIMERA VEZ, SE LOGRA CON EXITO LA PRODUCCION Y LA RECUPERACION DE VESICULOVIRUS REPLICABLES, ASI COMO VESICULOVIRUS REPLICABLES RECOMBINANTES, A PARTIR DE ADN CLONADO, MEDIANTE UN PROCEDIMIENTO QUE IMPLICA LA EXPRESION DE ARN ANTIGENOMICO DE VESICULOVIRUS DE CADENA POSITIVA DE LONGITUD COMPLETA, EN CELULAS HUESPED. LOS VESICULOVIRUS RECOMBINANTES NO PROVOCAN PATOLOGIAS GRAVES EN HUMANOS, PUEDEN OBTENERSE CON ELEVADAS VALORACIONES Y PRESENTAN UN USO COMO VACUNAS. LOS VESICULOVIRUS RECOMBINANTES TAMBIEN PUEDE SER INACTIVADOS PARA SER UTILIZADOS COMO VACUNAS DE ORGANISMOS MUERTOS.

Description

Vesiculovirus recombinantes y sus usos.

1. Introducción

La presente invención se refiere a vesiculovirus recombinantes replicables y que pueden expresar ácido nucleico extraño contenido en su genoma. También se proporcionan formas inactivadas de los virus recombinantes. Los vesiculovirus son útiles en formulaciones de vacuna para prevenir o tratar diversas enfermedades y trastornos.

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2. Antecedentes de la invención 2.1. Rabdovirus

Los rabdovirus son virus envueltos con membrana que se distribuyen ampliamente en la naturaleza en la que infectan a vertebrados, invertebrados y plantas. Existen dos géneros distintos dentro de los rabdovirus, el género Lyssavirus y el género Vesiculovirus. Los rabdovirus tienen genomas de ARN sencillo, de cadena negativa de 11-12.000 nucleótidos (Rose y Schubert, 1987, Rhabdovirus genomes and their products, en The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Publishing Corp., NY, págs. 129-166). Las partículas de virus contienen un núcleo helicoidal de nucleocápsida compuesto por el ARN genómico y proteína. Generalmente, se encuentra que tres proteínas, denominadas N (nucleocápsida), P (denominada anteriormente NS, que indicaba originalmente no estructural) y L (grande ("large")) están asociadas con la nucleocápsida. Dentro de la envuelta de la membrana se encuentra una proteína de matriz (M) adicional, que interacciona quizá tanto con la membrana como con el núcleo de la nucleocápsida. Una única especie de glicoproteína (G) se extiende desde la membrana y forma las espículas sobre la superficie de la partícula de virus. Debido a que el genoma es de sentido negativo (es decir, complementario a la secuencia de ARN (sentido positivo) que funciona como ARNm para producir directamente la proteína codificada), los rabdovirus deben codificar y empaquetar una ARN polimerasa dependiente de ARN en el virión (Baltimore et al., 1970, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 572-576), compuesta por las proteínas P y L. Esta enzima transcribe el ARN genómico para preparar ARNm subgenómicos que codifican las 5-6 proteínas virales y también replica los ARN de sentido positivo y negativo de longitud completa. Los genes se transcriben secuencialmente, comenzando en el extremo 3' de los genomas. Se emplea también el mismo sistema genético básico por los paramixovirus y filovirus.

El rabdovirus prototipo, el virus de la estomatitis vesicular (VEV), crece hasta títulos muy altos en la mayoría de las células animales y puede prepararse en grandes cantidades. Como resultado, se ha usado ampliamente VEV como sistema modelo para estudiar la replicación y ensamblaje de virus de ARN envueltos. El estudio de VEV y virus de cadena negativa relacionados ha estado limitado por no poder realizar la manipulación genética directa de los virus usando tecnología de ADN recombinante. La dificultad en la generación de VEV a partir de ADN es que ni los ARN genómicos ni los ARN antigenómicos de longitud completa son infecciosos. La unidad infecciosa mínima es el ARN genómico unido fuertemente a 1.250 subunidades de la proteína (N) de la nucleocápsida (Thomas et al., 1985, J. Virol. 54: 598-607) y cantidades más pequeñas de las dos subunidades de la polimerasa codificadas viralmente, L y P. Para reconstituir virus infecciosos a partir del ARN viral, es necesario en primer lugar ensamblar el complejo proteína N-ARN que sirve como molde para la transcripción y replicación mediante la polimerasa de VEV. Aunque pueden empaquetarse segmentos de ARN de cadena negativa más pequeños del genoma del virus de la gripe dentro de nucleocápsidas in vitro y luego rescatarse en células infectadas con virus de la gripe (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3802-3805; Luytjes et al., 1989, Cell 59:1107-1113), no están aún disponibles sistemas para empaquetar los ARN genómicos de rabdovirus mucho más grandes.

Recientemente, se han descrito sistemas para la replicación y transcripción de minigenomas derivados de ADN o ARN defectuosos pequeños a partir de rabdovirus (Conzelmann y Schnell, 1994, J. Virol. 68:713-719; Pattnaik et al., 1992, Cell 69:1011-1120) y paramixovirus (Calain et al., 1992, Virology 191:62-71; Collins et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667; Collins et al., 1993, Virology 195:252-256; De y Banerjee, 1993, Virology 196:344-348; Dimock y Collins, 1993, J. Virol. 67:2772-2778; Park et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5537-5541). En estos sistemas, se ensamblan ARN en nucleocápsidas dentro de células que expresan la proteína N viral y proteínas de polimerasa. Aunque estos sistemas han sido muy útiles, no permiten la manipulación genética del genoma de longitud completa de virus infecciosos.

Se publicó recientemente la recuperación de virus de la rabia a partir de un clon de ADNc completo (Schnell et al., 1994, EMBO J. 13:4195-4203). El ciclo infeccioso se inició expresando el ARN antigenómico (cadena positiva de longitud completa) en células que expresan las proteínas N, P y L virales. Aunque el virus de la rabia es un rabdovirus, es estructural y funcionalmente diferente de los vesiculovirus. El virus de la rabia es un Lyssavirus, no un vesiculovirus. Los Lyssavirus invaden el sistema nervioso central. Los vesiculovirus invaden las células epiteliales, predominantemente las de la lengua, para producir vesículas. El virus de la rabia provoca encefalitis en una variedad de animales y en seres humanos, mientras que VEV provoca una enfermedad epidémica pero autolimitativa en el ganado. En contraste marcado con células infectadas por VEV, el virus de la rabia produce poco o ningún efecto citopático en cultivos celulares infectados, se replica de manera menos eficaz que VEV en cultivo celular y provoca poca disminución de la síntesis celular de ADN, ARN o proteínas en cultivos celulares infectados (véase Baer et al., 1990, en Virology, 2ª ed., Fields et al. (eds.), Raven Press, Ltd., NY, págs. 883, 887). De hecho, no se observa hibridación cruzada entre los genomas del virus de la rabia y VEV, y puede discernirse generalmente homología de secuencia entre los dos genomas sólo con la ayuda de programas de homología ejecutables por ordenador.

Palese (Trends in microbiology vol. 3, nº 4, páginas 123-125, 4 de abril de 1995) notifica el rescate de VEV infeccioso a partir de un clon de ADN de longitud completa, sin embargo, el VEV recombinante estaba etiquetado genéticamente y no expresó péptidos o proteínas extrañas.

Se ha intentado, sin éxito, la recuperación de virus del sarampión infeccioso, otro virus de ARN de cadena negativa, a partir de ADNc clonado (véase Ballart et al., 1990, EMBO J. 9(2):379-384 y la retractación del mismo por Eschle et al., 1991, EMBO J. 10(11):3558).

2.2. Vacunas

El desarrollo de vacunas para la prevención de enfermedades virales, bacterianas o parásitas es el centro de un gran esfuerzo de investigación.

Las formas tradicionales de preparación de vacunas incluyen el uso de patógenos inactivados o atenuados. Una inactivación adecuada del microorganismo patógeno lo convierte en inofensivo como agente biológico pero no destruye su inmunogenicidad. La inyección de estas partículas "destruidas" en un huésped provocará entonces una respuesta inmunitaria que puede prevenir una infección futura con un microorganismo vivo. Sin embargo, un problema importante en el uso de vacunas inactivadas (que usan un patógeno inactivado) es no poder inactivar todas las partículas de microorganismo. Incluso cuando esto se consigue, dado que los patógenos destruidos no se multiplican en su huésped, o por otras razones desconocidas, la inmunidad lograda es a menudo incompleta, de vida corta y requiere múltiples inmunizaciones. Finalmente, el procedimiento de inactivación puede alterar los antígenos del microorganismo, convirtiéndolos en menos eficaces como inmunógenos.

Atenuación se refiere a la producción de cepas de microorganismos patógenos que han perdido esencialmente su capacidad de producir la enfermedad. Una forma de conseguir esto es someter al microorganismo a condiciones de crecimiento poco comunes y/o pases frecuentes en cultivo celular. Entonces se seleccionan mutantes que han perdido la virulencia pero que aún pueden provocar una respuesta inmunitaria. Los patógenos atenuados a menudo son buenos inmunógenos ya que se replican realmente en la célula huésped y provocan inmunidad de larga duración. Sin embargo, se encuentran varios problemas con el uso de vacunas activadas, siendo el más preocupante la atenuación insuficiente y el riesgo de reversión a la virulencia.

Una alternativa a los procedimientos anteriores es el uso de vacunas de subunidades. Esto implica la inmunización sólo con aquellos componentes que contengan el material inmunológico relevante.

A menudo, las vacunas se formulan e inoculan con diversos adyuvantes. Los adyuvantes ayudan a alcanzar un nivel más duradero y superior de inmunidad usando pequeñas cantidades de antígeno o dosis inferiores que si se administrase el inmunógeno solo. El mecanismo de la acción del adyuvante es complejo y no se entiende completamente. Sin embargo, puede implicar la estimulación de la producción de citocinas, fagocitosis y otras actividades del sistema reticuloendotelial así como una liberación y degradación retrasada del antígeno. Los ejemplos de adyuvantes incluyen adyuvante de Freund (completo o incompleto), adyuvante 65 (que contiene aceite de cacahuete, monooleato de manida y monoestearato de aluminio), el poliol plurónico L-121, avridina y geles minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc. El adyuvante de Freund ya no se usa en formulaciones de vacuna para seres humano porque contiene aceite mineral no metabolizable y es un carcinógeno potencial.

3. Sumario de la invención

La presente invención proporciona vesiculovirus replicables recombinantes. La técnica anterior ha intentado de manera no satisfactoria producir vesiculovirus replicables a partir de ADN clonado. En cambio, la invención proporciona un procedimiento que, por primera vez, ha permitido de manera satisfactoria la producción y recuperación de vesiculovirus replicables, así como vesiculovirus replicables recombinantes, a partir de ADN clonado.

Los vesiculovirus de la invención se producen proporcionando en una célula huésped apropiada: (a) ADN que puede transcribirse para dar (codificar) ARN (+) antigenómico de vesiculovirus (complementario al genoma del vesiculovirus), (b) una fuente recombinante de proteína N de vesiculovirus, (c) una fuente recombinante de proteína P de vesiculovirus y (d) una fuente recombinante de proteína L de vesiculovirus; en condiciones tales que el ADN se transcribe para producir el ARN antigenómico, y se produce un vesiculovirus que contiene ARN genómico complementario al ARN antigenómico producido a partir del ADN.

La invención proporciona un vesiculovirus recombinante infeccioso que puede replicarse en un animal dentro del que se introduce el vesiculovirus recombinante, en el que el genoma del vesiculovirus comprende ARN extraño que no es una parte de manera natural del genoma del vesiculovirus. El vesiculovirus recombinante se forma produciendo vesiculovirus según el procedimiento de la invención, en el que regiones del ADN que codifican ARN (+) antigenómico de vesiculovirus que no son esenciales para la replicación viral se han insertado dentro o sustituido por ADN
extraño.

El ARN extraño contenido dentro del genoma del vesiculovirus recombinante (codificado originalmente por el ADN extraño), tras la expresión en una célula huésped apropiada, produce una proteína o péptido que es antigénico o inmunogénico.

Los vesiculovirus recombinantes de la invención se usan como vacunas. En una realización, en la que el ARN extraño dirige la producción de un antígeno que induce una respuesta inmunitaria contra un patógeno, las vacunas de la invención se usan en el tratamiento o prevención de infecciones por un patógeno de este tipo (particularmente un microorganismo patógeno) y sus manifestaciones clínicas, es decir, una enfermedad infecciosa. En una realización preferida, un antígeno de este tipo presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de una glicoproteína de la envuelta de un virus diferente de vesiculovirus y el antígeno se incorpora en la envuelta del vesiculovirus. Los vesiculovirus recombinantes también se usan en el diagnóstico y monitorización de la progresión de trastornos infecciosos, incluyendo la respuesta frente a vacunación y/o terapia.

En otra realización, en la que el ARN extraño dirige la producción de un antígeno que induce una respuesta inmunitaria contra un tumor, los virus recombinantes de la invención se usan en la inmunoprofilaxis, inmunoterapia y diagnóstico del cáncer, y en la monitorización de la progresión o regresión del tumor.

Los vesiculovirus recombinantes pueden usarse como vacunas activadas o pueden inactivarse para su uso como vacunas inactivadas. Los virus recombinantes también pueden usarse para producir grandes cantidades de antígeno fácilmente purificado, por ejemplo, para su uso en vacunas de subunidades.

La invención también proporciona formulaciones de vacuna, kits y células huésped recombinantes.

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4. Descripción de las figuras

Figura 1. Secuencia de nucleótidos del plásmido pVSVFL(+), que muestra la secuencia de ADN completa que se transcribe para producir ARN (+) antigenómico de VEV y las secuencias pronosticadas de las proteínas de VEV codificadas. [Proteína N: SEC ID NO: 2; proteína P: SEC ID NO: 3; proteína M: SEC ID NO: 4; proteína G: SEC ID NO: 5; proteína L: SEC ID NO: 6]. Pueden observarse las regiones no codificante e intergénica. La línea superior de la secuencia (SEC ID NO: 1) es la cadena positiva antigenómica de VEV; línea inferior = SEC ID NO: 7. Se indican los sitios de restricción. También se indican los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína G. Se muestran las secuencias del primer promotor de la ARN polimerasa de T7 (SEC ID NO: 8), del segundo promotor de la ARN polimerasa de T7 (SEC ID NO: 9); la secuencia líder (SEC ID NO: 10), la señal de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa de T7 (SEC ID NO: 11) y la secuencia que se transcribe para producir la ribozima de VHD (SEC ID NO: 12).

Figura 2. Secuencia de nucleótidos de una parte del plásmido pVSVSS1, que muestra el inserto de ADN sintético que contiene la región de poliligador insertada entre las regiones que codifican G y L (3' de G y 5' de L) que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción únicos, concretamente, XmaI, NotI y SmaI. Línea superior de la secuencia: SEC ID NO: 13; línea inferior de la secuencia: SEC ID NO: 14.

Figura 3. Uniones génicas de VEV. Se muestran las secuencias de nucleótidos en el extremo 3' del ARN líder y los extremos 5' y 3' de cada ARNm junto con las correspondientes secuencias genómicas (ARNv) (SEC ID NO: 15-31). Se indican los dinucleótidos intergénicos en negrita. De Rose y Schubert, 1987, en The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, NY, págs. 129-166, en la pág. 136.

Figura 4. Construcción de ADN de plásmido. A. El diagrama ilustra la secuencia genómica de VEV clonada y los cuatro fragmentos de ADN (numerados 1-4) que se usaron para generar el plásmido pVSVFL(+). Las flechas horizontales representan cebadores de PCR usados para generar los fragmentos 1 y 3. B. Diagrama del plásmido pVSVFL(+) que da origen a VEV infeccioso. Se muestran las ubicaciones de los genes de VEV que codifican las cinco proteínas N, P, M, G y L. La región punteada desde Sac I hasta Xho I representa la secuencia del vector pBSSK^{+} y los segmentos sombreados representan las regiones del genoma de VEV generadas mediante PCR. La transcripción a partir del promotor de T7 genera el ARN de VEV de cadena (+) completo.

Figura 5. Proteínas presentes en VEV de tipo natural y recombinantes. Se separaron mediante SDS-PAGE (acrilamida al 10%) proteínas a partir del 1% del virus recuperado de aproximadamente 5 x 10^{6} células BHK infectadas y se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie. Se indican las posiciones de las cinco proteínas de VEV.

Figura 6. Identificación de una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción en el VEV recombinante. Se amplificó un segmento de 620 nucleótidos aislado de ARN genómico a partir de VEV de tipo natural y recombinante mediante transcripción inversa y PCR usando los cebadores 5'-CATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCC (SEC ID NO: 32) y 5'-CATGAATGTTAACATCTCAAGA (SEC ID NO: 33). Se indican controles en los que se omitió la transcriptasa inversa de la reacción. Se digirieron muestras de ADN con Nhe I o bien se dejaron sin digerir antes de la electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6% tal como se indicó. Se detectó el ADN mediante tinción con bromuro de etidio. Se indican a la izquierda los tamaños de los marcadores de ADN.

Figura 7. Autorradiograma que muestra la secuencia de ARN genómico de VEV recombinante. Se secuenció ARN preparado a partir de VEV recombinante mediante el procedimiento de didesoxi usando transcriptasa inversa. La secuencia escrita corresponde a los nucleótidos 1563-1593 en el ARNm de G (Rose y Gallione, 1981, J. Virol. 39:519-528). La secuencia subrayada representa los cuatro nucleótidos que se cambiaron para generar el sitio Nhe I.

Figura 8. Análisis de proteínas de VEV recombinante que expresa la glicoproteína del serotipo New Jersey. Se separaron mediante SDS-PAGE (acrilamida al 10%) proteínas a partir del 1% del virus sedimentado del medio de aproximadamente 5 x 10^{6} células BHK infectadas durante 24 horas con VEV_{1} de tipo natural (carril 1), VEV_{1/NJG} recombinante (carril 2) o VEV_{NJ} de tipo natural (carril 3). Se visualizaron las proteínas mediante tinción con azul brillante de Coomassie. Se indican las posiciones de las proteínas virales.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona vesiculovirus replicables recombinantes que tienen una inserción de una secuencia de ARN extraño que codifica un péptido o una proteína que inducirá una respuesta inmunitaria cuando se expresa en un huésped adecuado. La expresión del ARN de vesiculovirus de cadena positiva de longitud completa en células huésped ha permitido de manera satisfactoria la generación de vesiculovirus recombinantes a partir de ADN, proporcionando virus recombinantes que no provocan patología grave en seres humanos y que pueden obtenerse en altos títulos, que se usan como vacunas.

Los vesiculovirus de la invención se producen proporcionando en una célula huésped apropiada: (a) ADN que puede transcribirse para dar (codificar) ARN (+) antigenómico de vesiculovirus (complementario al genoma del vesiculovirus) y que tiene una inserción de una secuencia de ARN extraño que codifica un péptido o una proteína que inducirá una respuesta inmunitaria cuando se expresa en un huésped adecuado y (b) una fuente recombinante de proteína N de vesiculovirus, (c) una fuente recombinante de proteína P de vesiculovirus y (d) una fuente recombinante de proteína L de vesiculovirus; en condiciones tales que el ADN se transcribe para producir el ARN antigenómico, y se produce un vesiculovirus que contiene ARN genómico complementario al ARN antigenómico producido a partir del ADN.

Dado que los virus son replicables (es decir, no defectuosos en la replicación), codifican toda la maquinaria de vesiculovirus necesaria para la replicación en una célula tras la infección por el virus.

En una realización preferida, el vesiculovirus recombinante es un virus de la estomatitis vesicular recombinante (VEV).

El ARN extraño contenido dentro del genoma del vesiculovirus recombinante (codificado originalmente por el ADN extraño), tras la expresión en una célula huésped apropiada, produce una proteína o un péptido que es antigénico o inmunogénico. Una proteína o un péptido antigénico o inmunogénico de este tipo cuya expresión se dirige mediante el ARN extraño (presente en sentido negativo) dentro del genoma del vesiculovirus (mediante expresión a partir del mensaje antigenómico (+)) se denominará a continuación en el presente documento "antígeno". Los antígenos apropiados incluyen pero no se limitan a antígenos conocidos de microorganismos patógenos o de tumores, así como fragmentos o derivados de tales antígenos que presentan la antigenicidad o inmunogenicidad de tales antígenos. Una proteína presenta la antigenicidad de un antígeno cuando la proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo al antígeno. Una proteína presenta la inmunogenicidad de un antígeno cuando provoca una respuesta inmunitaria frente al antígeno (por ejemplo, cuando la inmunización con la proteína provoca la producción de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno o provoca una respuesta inmunitaria mediada por células dirigida contra el antígeno).

Los vesiculovirus recombinantes de la invención se usan como vacunas. Cuando el ARN extraño dirige la producción de un antígeno (codificado originalmente por el ADN extraño usado para producir el vesiculovirus recombinante o su predecesor) que induce una respuesta inmunitaria contra un patógeno, las vacunas de la invención se usan en el tratamiento o prevención de infecciones por un patógeno de este tipo (particularmente un microorganismo patógeno) y sus manifestaciones clínicas, es decir, una enfermedad infecciosa. Por tanto, la invención proporciona procedimientos de prevención o tratamiento de la infección y enfermedad infecciosa que comprende administrar a un sujeto en el que se desea tal tratamiento o prevención uno o más de los vesiculovirus recombinantes de la invención. Los vesiculovirus recombinantes también se usan en diagnóstico y monitorización de la progresión de trastornos infecciosos, incluyendo respuestas a la vacunación y/o terapia.

En otra realización, en la que el antígeno induce una respuesta inmunitaria contra un tumor, los virus recombinantes de la invención tienen usos en la inmunoprofilaxis, inmunoterapia y diagnóstico del cáncer y en la monitorización de la progresión o regresión del tumor.

En una realización específica, el ADN extraño usado inicialmente para la producción de los vesiculovirus recombinantes también puede comprender una secuencia que codifica un marcador detectable, por ejemplo \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, \beta-geo (Friedrich & Soriano, 1991, Genes Dev. 5:1513-1523).

En otra realización específica, el ADN extraño también puede comprender una secuencia que codifica una citocina que puede estimular una respuesta inmunitaria. Tales citocinas incluyen pero no se limitan a interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interferones y factores estimulantes de colonias de granulocitos y macrófagos.

En un aspecto preferido, tras la infección con un vesiculovirus recombinante de la invención, el antígeno se expresa como una proteína no de fusión. En una realización menos preferida, el antígeno se expresa como una proteína de fusión, por ejemplo con la proteína G viral. "Proteína de fusión", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una primera proteína unida covalentemente mediante un enlace peptídico en su extremo carboxilo terminal con el extremo amino terminal de una secuencia de aminoácidos de una segunda proteína diferente.

En una realización, una formulación de vacuna de la invención contiene un único tipo de vesiculovirus recombinante de la invención. En otra realización, una formulación de vacuna comprende una mezcla de dos o más virus recombinantes de la invención.

Las formulaciones de vacuna de la invención proporcionan uno o más de los siguientes beneficios: estabilidad durante largos periodos sin refrigeración; facilidad de producción; bajo coste y alto título de producción; capacidad de administrarse por empleados locales sin preparación médica avanzada; e implicación de la administración de un microorganismo que se sabe que no provoca enfermedad grave en seres humanos.

La presente invención también proporciona una célula huésped infectada con un vesiculovirus recombinante que puede replicarse. En una realización, la célula huésped es una célula de mamífero. Preferiblemente, la célula de mamífero es una célula de riñón de hámster.

5.1. ADN que puede transcribirse para producir ARN (+) antigenómico de vesiculovirus

Se conocen en la técnica muchos vesiculovirus y pueden hacerse recombinantes según los procedimientos de la invención. Se enumeran ejemplos de tales vesiculovirus en la tabla I.

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Cualquier ADN que pueda transcribirse para producir ARN (+) antigenómico de vesiculovirus (complementario al genoma de VEV) puede usarse para la construcción de un ADN recombinante que contiene ADN extraño que codifica un antígeno, para su uso en la producción de los vesiculovirus recombinantes de la invención. Está disponible en la técnica y/o puede obtenerse mediante procedimientos convencionales ADN que puede transcribirse para producir ARN (+) antigenómico de vesiculovirus (tal como ADN que se denomina en el presente documento ``ADN (-) de vesiculovirus). En particular, el plásmido pVSVFL(+), que contiene ADN (-) de VEV que se prefiere para su uso en la presente invención, se ha depositado en la ATCC y se le ha asignado el número de acceso 97134. En un aspecto preferido, se usa ADN que puede transcribirse para producir ARN (+) de VEV, (es decir, ADN (-) de VEV). Puede usarse ADN (-) de VEV para cualquier serotipo o cepa conocida en la técnica, por ejemplo, los serotipos New Jersey o VEV. Se conoce la secuencia de proteína deducida y la secuencia de nucleótidos completa del genoma de VEV y está disponible como Genbank VSVCG, número de acceso J02428; NCBI SEC ID 335873; y está publicada en Rose y Schubert, 1987, en The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, NY, págs. 129-166. Se han publicado secuencias parciales de otros genomas de vesiculovirus y están disponibles en la técnica. La secuencia completa del ADN (-) de VEV que se usa en una realización preferida está contenida en el plásmido pVSVFL(+) y se muestra en la figura 1; también se muestran las secuencias pronosticadas de las proteínas de VEV (esta secuencia contiene varias correcciones de secuencia en relación con la obtenible de GenBank). El ADN (-) de vesiculovirus, si no está todavía disponible, puede prepararse mediante procedimientos convencionales, tal como sigue: si no está todavía disponible ADNc de vesiculovirus, puede purificarse ARN genómico de vesiculovirus a partir de preparaciones de virus, y usarse transcripción inversa con reacción en cadena de la polimerasa a larga distancia para generar el ADN (-) de vesiculovirus. Como alternativa, tras la purificación del ARN genómico, puede sintetizarse in vitro ARNm de VEV y prepararse ADNc mediante procedimientos convencionales, seguido por inserción en vectores de clonación (véase, por ejemplo, Rose y Gallione, 1981, J. Virol. 39(2):519-528). Pueden unirse clones de ADNc individuales de ARN de vesiculovirus mediante el uso de fragmentos de ADN pequeños que cubren las uniones génicas, generados mediante el uso de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) (Mullis y Faloona, 1987, Meth. Enzymol. 155:335-350) a partir de ARN genómico de VEV (véase la sección 6, a continuación). Están disponibles vesiculovirus en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse VEV de la Colección Americana de Cultivos Tipo.

En una realización preferida, se introducen uno o más, preferiblemente un único sitio de restricción (por ejemplo, en un poliligador) dentro del ADN (-) de vesiculovirus, en regiones intergénicas, o en 5' con respecto a la secuencia complementaria al extremo 3' del genoma del vesiculovirus, o en 3' con respecto a la secuencia complementaria al extremo 5' del genoma del vesiculovirus, para facilitar la inversión del ADN extraño.

En un procedimiento preferido de la invención, se construye el ADN (-) de vesiculovirus de manera que tenga un promotor operativamente unido al mismo. El promotor debe poder iniciar la transcripción del ADN (-) en una célula animal o de insecto en la que se desea producir el vesiculovirus recombinante. Los promotores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de la timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); promotores de choque térmico (por ejemplo, hsp70 para su uso en células S2 de Drosophila); el promotor de la ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de la PGK (fosfoglicerol cinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional animales, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); región de control del gen de la insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control de genes de inmunoglobulinas que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel. 1:268-276), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de la alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel. 1: 161-171), región de control del gen de la beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712) y región de control del gen de la cadena 2 ligera de la miosina que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286). Preferiblemente, el promotor es un promotor de la ARN polimerasa, preferiblemente un promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago, viral o de insectos, incluyendo pero sin limitarse a los promotores de la ARN polimerasa de T7, la ARN polimerasa de SP6 y la ARN polimerasa de T3. Si se usa un promotor de la ARN polimerasa en el que la ARN polimerasa no se produce de manera endógena por la célula huésped en la que se desea producir el vesiculovirus recombinante, también debe proporcionarse una fuente recombinante de la ARN polimerasa en la célula huésped.

El ADN (-) de vesiculovirus puede unirse operativamente a un promotor antes o tras la inserción de ARN extraño que codifica un antígeno. Preferiblemente, se sitúa un terminador transcripcional en sentido 3' con respecto al ADN (-) del vesiculovirus.

En otra realización preferida, se sitúa una secuencia de ADN que puede transcribirse para producir una secuencia de ribozima en el extremo 3' inmediato del ADN (-) de vesiculovirus, antes de la señal de terminación transcripcional, de modo que tras la transcripción se produce una secuencia de ribozima autorrompible en el extremo 3' del ARN antigenómico, secuencia de ribozima que romperá de manera autocatalítica (tras un U) este transcrito de fusión para liberar el extremo 3' exacto del ARN (+) antigenómico de vesiculovirus. Puede usarse cualquier secuencia de ribozima conocida en la técnica, siempre que se reconozca y se rompa la secuencia correcta. (Se observa que la ribozima de cabeza de martillo no es probablemente adecuada para su uso). En un aspecto preferido, se usa la ribozima del virus de la hepatitis delta (VHD) (Perrotta y Been, 1991, Nature 350:434-436; Pattnaik et al., 1992, Cell 69: 1011-1020).

Un ADN (-) de VEV preferido para su uso, para la inserción de ADN extraño, es el mostrado en la figura 1 y contenido en el plásmido pVSVFL(+), en el que está presente un promotor de la ARN polimerasa de T7 en 5' con respecto a la secuencia complementaria al extremo 3' del genoma de VEV. Por tanto, el plásmido pVSVFL(+) comprende (en el orden 5' a 3') los siguientes componentes operativamente unidos: el promotor de la ARN polimerasa de T7, ADN (-) de VEV, una secuencia de ADN que se transcribe para producir una secuencia de ribozima de VHD (inmediatamente en sentido 3' con respecto al ADN (-) de VEV) y un sitio de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa de T7. Un plásmido que puede usarse también es el plásmido pVSVSS1, del que se muestra una parte de la secuencia en la figura 2, en la que se ha insertado un poliligador de ADN sintético, que facilita la inserción de ADN extraño, en pVSVFL(+) entre las regiones que codifican G y L. Se sintetizó el poliligador en un sintetizador de ADN de manera que tiene extremos compatibles para la ligación en un sitio NheI y contiene los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción únicos XmaI, SmaI, y NotI, que facilitan la inserción de ADN extraño generado mediante rotura con una de estas enzima o ligado a un poliligador que contiene un sitio de reconocimiento para una de estas enzimas (que se somete luego a rotura antes de la inserción).

El ADN extraño que codifica un antígeno se inserta en cualquier región, o sustituye a cualquier región del ADN (-) de vesiculovirus que no es esencial para la replicación del vesiculovirus. Por tanto, en una realización preferida, se inserta el ADN extraño en una región intergénica, o una parte del ADN (-) de vesiculovirus que se transcribe para formar la región no codificante de un ARNm viral. En una realización preferida, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN del plásmido pVSVFL(+) tal como se representa en la figura 1 de los números de nucleótido 623-12088 (una parte de SEC ID NO: 1), en la que a una región no esencial para la replicación del vesiculovirus se le ha insertado dentro o sustituido por ADN extraño.

Los vesiculovirus tienen una estructura intergénica definida. Se encuentran homologías frecuentes alrededor de los dinucleótidos intergénicos (figura 3). Estas regiones tienen la estructura común (3') AUACUUUUUUUNAUUGUCN
NUAG(5') (SEC ID NO: 34), en la que N indica cualquier nucleótido (por tanto, están presentes tres posiciones variables) y el dinucleótido intergénico está subrayado. Estos espaciadores de dinucleótido son GA, excepto en la unión NS-M, en la que el dinucleótido es CA. Los primeros 11 nucleótidos de la secuencia común son complementarios a la secuencia (5') ... UAUGAAAAAAA ... (3') (SEC ID NO: 35) que se produce en la unión ARNm-poliadenilato[poli(A)] en cada ARN incluyendo L. El copiado reiterativo de los residuos de U por la polimerasa de VEV genera presumiblemente la cola de poli(A) en cada ARNm (McGeoch, 1979, Cell 17:3199; Rose, 1980, Cell 19:415; Schubert et al., 1980, J. Virol. 34:550). La secuencia complementaria al extremo 5' del ARNm sigue al dinucleótido intergénico. El ARNm de L también termina con la secuencia UAUG-poli(A) codificada por la secuencia (3')AUACUUUUUUU (SEC ID NO: 36) y presumiblemente se poliadenila también mediante un mecanismo de "deslizamiento" de la polimerasa (Schubert et al., 1980, J. Virol. 34:550; Schubert y Lazarini, 1981, J. Virol. 38:256).

Por tanto, las regiones intergénicas en el ADN (-) de vesiculovirus consisten en tres partes, que desencadenan la terminación y reiniciación transcripcional presentes tanto en 5' como en 3' en cada gen (presentadas como la secuencia 5' a 3' de la cadena con sentido positivo del ADN (-) de vesiculovirus: (a) TATGAAAAAAA (SEC ID NO: 37), seguida por (b) el dinucleótido GT o CT, seguido por (c) AACAG. Por tanto, en un aspecto preferido, el ADN extraño que codifica un antígeno puede expresarse fácilmente como una proteína no de fusión a partir de regiones intergénicas, simplemente garantizando que esta región intergénica de tres partes se reconstituye, es decir, que esta región intergénica aparece en 5' y en 3' en el ADN extraño y también en 5' y en 3' en los genes adyacentes. Por ejemplo, en una realización preferida, se inserta ADN que consiste en (a) esta región intergénica de tres partes, fusionada con (b) ADN extraño que codifica un antígeno deseado (que incluye preferiblemente los codones de inicio y de parada nativos del gen del antígeno para la iniciación), dentro de una parte del ADN (-) de vesiculovirus que se transcribe para formar la región no codificante 3' de cualquier ARNm de vesiculovirus. En un aspecto particularmente preferido, se inserta el ADN extraño en la región no codificante entre G y L.

En una realización alternativa, el ADN extraño puede insertarse dentro del gen de G, de manera que codifica una proteína de fusión con G, para la presentación en superficie resultante del antígeno sobre la partícula de vesiculovirus. Debe emprenderse la selección para garantizar que la inserción de ADN extraño no deteriore la función de la proteína G.

En una realización preferida, un antígeno expresado por un vesiculovirus recombinante es toda o parte de una glicoproteína de la envuelta de un virus diferente de vesiculovirus. Un antígeno de este tipo puede sustituir a la proteína G de vesiculovirus endógena en el vesiculovirus, o puede expresarse como una fusión con la proteína G endógena, o puede expresarse además de la proteína G endógena o bien como una proteína de fusión o bien como una proteína no de fusión. En una realización específica, un antígeno de este tipo forma una parte de la envuelta del vesiculovirus y por tanto se presenta en la superficie de la partícula de vesiculovirus. A modo de ejemplo, el antígeno puede ser gp160 o un fragmento de la misma del virus de la inmunodeficiencia humana, que se rompe para producir gp120 y gp41 (véase Owens y Rose, 1993, J. Virol. 67(1):360-365). En una realización específica, el gen de G de VEV en el ADN (-) de VEV del plásmido pVSVFL(+) puede quitarse y sustituirse, mediante rotura en los sitios NheI y MluI que flanquean al gen de G e inserción de la secuencia deseada. En otra realización específica, el antígeno es una glicoproteína de la envuelta extraña o una parte de la misma que se expresa como una proteína de fusión que comprende el dominio citoplasmático (y, opcionalmente, también la región transmembrana) de la proteína G de vesiculovirus nativa (véase Owens y Rose, 1993, J. Virol. 67(1): 360-365). Tal proteína de fusión puede sustituirse o expresarse además de la proteína G de vesiculovirus endógena. Tal como se muestra a modo de ejemplo en la sección 6 a continuación, puede sustituirse la secuencia que codifica una G nativa completa por una secuencia codificante de una G diferente para producir vesiculovirus replicables recombinantes que expresan una glicoproteína no nativa. Aunque pueden usarse vesiculovirus recombinantes que expresan y presentan epítopo(s) de las glicoproteínas de la envuelta de otros virus como vacunas activadas, tales vesiculovirus también son particularmente útiles como vacunas inactivadas, así como en la producción de vacunas de subunidades que contienen la proteína producida por el vesiculovirus que comprende tal/es epítopo(s).

En una realización específica, un vesiculovirus recombinante de la invención expresa en un huésped al que se administra uno o más antígenos. En una realización, se expresa una multiplicidad de antígenos, que presentan cada uno diferente antigenicidad o inmunogenicidad.

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5.2. Secuencias de ADN que codifican antígenos

La invención proporciona vesiculovirus recombinantes que pueden replicarse que tienen una secuencia de ARN extraño insertada dentro o que sustituye a un sitio del genoma no esencial para la replicación, en la que la secuencia de ARN extraño (que es de sentido negativo) dirige la producción de un antígeno que puede expresarse en un huésped infectado por el virus recombinante. Este genoma recombinante se produce originalmente mediante inserción de ADN extraño que codifica el antígeno en el ADN (-) de vesiculovirus. Cualquier secuencia de ADN que codifica un antígeno inmunogénico (que puede provocar una respuesta inmunitaria), que produce inmunidad profiláctica o terapéutica contra una enfermedad o trastornos, cuando se expresa como una proteína de fusión o, preferiblemente, como una proteína no de fusión en un vesiculovirus recombinante de la invención, solo o en combinación con otros antígenos expresados por el mismo o un vesiculovirus recombinante diferente, puede aislarse para su uso en las formulaciones de la presente invención.

En una realización preferida, la expresión de un antígeno mediante un vesiculovirus recombinante induce una respuesta inmunitaria contra un microorganismo patógeno. Por ejemplo, un antígeno puede presentar la inmunogenicidad o antigenicidad de un antígeno encontrado en bacterias, parásitos, virus u hongos que son agentes causantes de enfermedades y trastornos. En una realización preferida, se usan antígenos que presentan la antigenicidad o inmunogenicidad de antígenos de virus animales de importancia veterinaria (por ejemplo, que provocan enfermedades o trastornos en animales no humanos tales como animales domésticos o de granja, por ejemplo, vacas, pollos, caballos, perros, gatos, etc.). En otra realización, se usan antígenos que presentan la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno de un patógeno humano.

Para determinar la inmunogenicidad o antigenicidad detectando la unión a anticuerpo, pueden usarse diversos inmunoensayos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos tipo "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal, enzimáticos o de radioisótopos, por ejemplo), inmunotransferencias de tipo Western, reacciones de inmunoprecipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación al complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, se detecta la unión a anticuerpo detectando un marcador sobre el anticuerpo primario. En otra realización, se detecta el anticuerpo primario detectando la unión de un anticuerpo o reactivo secundario al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen en la técnica muchos medios para detectar la unión en un radioinmunoensayo y se prevé su uso. En una realización para detectar la inmunogenicidad, pueden someterse a ensayo las respuestas mediadas por células T mediante procedimientos convencionales, por ejemplo ensayos de citotoxicidad in vitro o ensayos de hipersensibilidad de tipo retrasada in vivo.

Los parásitos y bacterias que expresan epítopos (determinantes antigénicos) que pueden expresarse mediante vesiculovirus recombinantes (en los que el ARN extraño dirige la producción de un antígeno del parásito o bacterias o un derivado del mismo que contiene un epítopo del mismo) incluyen pero no se limitan a los enumerados en la tabla II.

2

En otra realización, el antígeno comprende un epítopo de un antígeno de un nematodo, para proteger contra trastornos provocados por tales gusanos.

En otra realización específica, cualquier secuencia de ADN que codifica un epítopo de Plasmodium, que cuando se expresa por un vesiculovirus recombinante es inmunogénico en un huésped vertebrado, puede aislarse para su inserción en el ADN (-) de vesiculovirus según la presente invención. Las especies de Plasmodium que pueden servir como fuentes de ADN incluyen pero no se limitan a los parásitos de malaria humana P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax y los parásitos de malaria animal P. berghei, P. yoelii, P. knowlesi, y P. cynomolgi. En una realización particular, el epítopo que va a expresarse es un epítopo de la proteína circumsporozoito (CS) de una especie de Plasmodium (Miller et al., 1986, Science 234:1349).

Aún en otra realización, el antígeno comprende un péptido de la subunidad \beta de la toxina del cólera (Jacob et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7611).

Los virus que expresan epítopos (determinantes antigénicos) que pueden expresarse mediante vesiculovirus recombinantes (en los que el ARN extraño dirige la producción de un antígeno del virus o un derivado del mismo que comprende un epítopo del mismo) incluyen pero no se limitan a los enumerados en la tabla III, que enumera tales virus por la familia para fines de comodidad y no de limitación (véase 1990, Fields Virology, 2ª ed., Fields y Knipe (eds.), Raven Press, NY).

3

300

301

En realizaciones específicas, el antígeno codificado por las secuencias extrañas que se expresa tras la infección de un huésped por el vesiculovirus recombinante presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de una hemaglutinina del virus de la gripe (número de acceso de GenBank JO2132; Air, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7639-7643; Newton et al., 1983, Virology 128:495-501); la glicoproteína G del virus respiratorio sincitial humano (número de acceso de GenBank Z33429; Garcia et al., 1994, J. Virol.; Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7683); la proteína del núcleo, la proteína de la matriz u otra proteína del virus del Dengue (número de acceso de GenBank M19197; Hahn et al., 1988, Virology 162:167-180), la hemaglutinina del virus del sarampión (número de acceso de GenBank M81899; Rota et al., 1992, Virology 188:135-142); y glicoproteína gB del virus del herpes simple tipo 2 (número de acceso de GenBank M14923; Bzik et al., 1986, Virology 155:322-333).

En otra realización, pueden expresarse uno o más epítopos de la proteína de fusión del virus respiratorio sincitial (VRS) como un antígeno.

Otros antígenos que pueden expresarse mediante un vesiculovirus recombinante incluyen pero no se limitan a los que presentan la antigenicidad o inmunogenicidad de los siguientes antígenos: VP1 de poliovirus (Emini et al., 1983, Nature 304: 699); glicoproteínas de la envuelta de VIH I (Putney et al., 1986, Science 234:1392-1395); antígeno de superficie de la hepatitis B (Itoh et al., 1986, Nature 308:19; Neurath et al., 1986, Vaccine 4:34); toxina de la difteria (Audibert et al., 1981, Nature 289:543); epítopo 24M de estreptococos (Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193) y pilina gonocócica (Rothbard y Schoolnik, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:247).

En otras realizaciones, el antígeno expresado por el vesiculovirus recombinante presenta la antigenicidad o inmunogenicidad del virus g50 de la pseudorrabia (gpD), virus II de la pseudorrabia (gpB), virus gIll de la pseudorrabia (gpC), glicoproteína H del virus de la pseudorrabia, glicoproteína E del virus de la pseudorrabia, glicoproteína 195 de gastroenteritis transmisible, proteína de la matriz de gastroenteritis transmisible, glicoproteína 38 del rotavirus porcino, proteína de la cápsida del parvovirus porcino, antígeno protector contra Serpulina hydodysenteriae, glicoproteína 55 de la diarrea viral bovina, hemaglutinina-neuraminidasa de la enfermedad de Newcastle, hemaglutinina de la gripe porcina o neuraminidasa de la gripe porcina.

En diversas realizaciones, el antígeno expresado por el vesiculovirus recombinante presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno derivado de Serpulina hyodysenteriae, virus de la enfermedad de pie y boca, virus del cólera del cerdo, virus de la gripe porcina, virus de la fiebre porcina africana, Mycoplasma hyopneumoniae, virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa (por ejemplo, glicoproteína E o glicoproteína G del virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa) o virus de la laringotraqueitis infecciosa (por ejemplo, glicoproteína G o glicoproteína I del virus de la laringotraqueitis infecciosa).

En otra realización, el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de una glicoproteína del virus de La Crosse (Gonzales-Scarano et al., 1982, Virology 120:42), virus de la diarrea de terneros neonatal (Matsuno y Inouye, 1983, Infección y Immunity 39:155), virus de la encefalitis equina venezolana (Mathews y Roehrig, 1982, J. Immunol. 129:2763), virus Punta Toro (Dalrymple et al., 1981, en Replication of Negative Strand Virus, Bishop y Compans (eds.), Elsevier, NY, p. 167), virus de la leucemia murina (Steeves et al., 1974, J. Virol. 14:187) o virus de tumor mamario de ratón (Massey y Schochetman, 1981, Virology 115:20).

En otra realización, el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno de un patógeno humano, incluyendo pero sin limitarse a herpesvirus humano, virus 1 de herpes simple, virus 2 de herpes simple, citomegalovirus humano, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela-zóster, herpesvirus humano 6, herpesvirus humano 7, virus de la gripe humana, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la rabia, virus del sarampión, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, Plasmodium falciparum y Bordetella pertussis.

En una realización específica de la invención, un vesiculovirus recombinante expresa la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y/o el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B o un fragmento o derivado de los mismos (véase, por ejemplo, la publicación de patente del R.U. número GB 2034323A publicada el 4 de junio de 1980; Ganem y Varmus, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56:651-693; Tiollais et al., 1985, Nature 317:489-495). El genoma del VHB (subtipo adw) está contenido en el plásmido pAM6 (Moriarty et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2606-2610, disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), número de acceso 45020), un vector basado en pBR322 que es replicable en E. coli.

En otra realización, el antígeno expresado por el vesiculovirus recombinante presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno del virus de la gripe equina o herpesvirus equino. Los ejemplos de tales antígenos son neuraminidasa Alaska 91 del virus de la gripe equina de tipo A, neuraminidasa Miami 63 del virus de la gripe equina de tipo A, neuraminidasa Kentucky 81 del virus de la gripe equina de tipo A, glicoproteína B del herpesvirus equino de tipo 1 y glicoproteína D del herpesvirus equino de tipo 1.

En otra realización, el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno del virus respiratorio sincitial bovino o del virus parainfluenza bovino. Por ejemplo, tales antígenos incluyen pero no se limitan a la proteína de unión del virus sincitial respiratorio bovino (VRSB G), la proteína de fusión del virus respiratorio sincitial bovino (VRSB G), la proteína de la nucleocápsida del virus respiratorio sincitial bovino (VRSB N) la proteína de fusión del virus parainfluenza bovino de tipo 3 y la hemaglutinina-neuraminidasa del virus parainfluenza de tipo 3.

En otra realización, el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de la glicoproteína 48 o la glicoproteína 53 del virus de la diarrea viral bovina.

En otra realización, el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno del virus de la bursitis infecciosa. Los ejemplos de tales antígenos con la poliproteína y VP2 del virus de la bursitis infecciosa.

Pueden identificarse antígenos potencialmente útiles o derivados de los mismos para su uso como antígenos expresados mediante vesiculovirus recombinantes mediante diversos criterios, tales como la implicación del antígeno en la neutralización de la infectividad del patógeno (Norrby, 1985, Summary, en Vaccines 85, Lerner et al. (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, págs. 388-389), la especificidad de tipo o grupo, el reconocimiento por antisueros o células inmunitarias de los pacientes y/o la demostración de los efectos protectores de antisueros o células inmunitarias específicas para el antígeno. Además, el epítopo codificado del antígeno no debe presentar o presentar preferiblemente una pequeña variación antigénica con el tiempo o entre diferentes aislados del mismo patógeno.

En una realización preferida, el ADN extraño insertado dentro del ADN (-) de vesiculovirus codifica un epítopo dominante inmunopotente de un patógeno. El ADN extraño que codifica epítopos que son reactivos con el anticuerpo aunque no pueden provocar respuestas inmunitarias, tiene todavía usos potenciales en inmunoensayos (véase la sección 5.8, a continuación).

En otra realización, el ARN extraño del vesiculovirus recombinante dirige la producción de un antígeno que comprende un epítopo, que cuando se introduce el vesiculovirus recombinante en un huésped deseado, induce una respuesta inmunitaria que protege contra una afección o trastorno provocado por una entidad que contiene el epítopo. Por ejemplo, el antígeno puede ser un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumor, para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora contra un tumor (por ejemplo, un tumor maligno). Tales antígenos específicos de tumor o asociados a tumor incluyen pero no se limitan a antígeno de pan-carcinoma KS 1/4 (Perez y Walker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4): 407-415); antígeno de carcinoma de ovario (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2):468-475); fosfato ácido prostático (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); antígeno específico de próstata (Henttu y Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230); antígeno p97 asociado a melanoma (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-446); antígeno gp75 de melanoma (Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171 (4):1375-1380); antígeno de melanoma de alto peso molecular (Natali et al., 1987, Cancer 59:55-63) y antígeno de membrana específico de próstata.

En otra realización de la invención, el antígeno expresado por el vesiculovirus recombinante comprende grandes regiones de proteína que contienen varios epítopos de células B (es decir, epítopos que pueden atraer una respuesta inmunitaria humoral) y epítopos de células T (es decir, epítopos que pueden inducir una respuesta inmunitaria mediada por células).

Pueden usarse péptidos o proteínas que se sabe que contienen determinantes antigénicos como antígeno. Si se desconocen los antígenos deseados específicos, puede llevarse a cabo la identificación y caracterización de las secuencias inmunorreactivas. Una forma por la que lograr esto es a través del uso de anticuerpos monoclonales generados en la superficie u otras moléculas de un patógeno o tumor, como puede ser el caso. Las secuencias peptídicas que pueden reconocerse por los anticuerpos son epítopos definidos. Como alternativa, pueden someterse a prueba pequeños péptidos sintéticos conjugados con moléculas vehículo para la generación de anticuerpos monoclonales que se unen a los sitios correspondientes en el péptido, sobre la molécula intacta (véase, por ejemplo, Wilson et al., 1984, Cell 37:767).

En una realización específica, pueden identificarse antígenos apropiados, incluyendo fragmentos o derivados de antígenos conocidos, en virtud de su hidrofilicidad, llevando a cabo un análisis de hidrofilicidad (Hopp y Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824) para generar un perfil de hidrofilicidad. Puede usarse un perfil de hidrofilicidad para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas de una proteína y las correspondientes regiones de la secuencia génica que codifican tales proteínas. Se pronostica que las regiones hidrófilas son inmunogénicas/antigénicas. Otros procedimientos conocidos en la técnica que pueden emplearse para la identificación y caracterización de determinantes antigénicos están también dentro del alcance de la invención.

El ADN extraño que codifica el antígeno, que se inserta dentro de un sitio no esencial del ADN (-) de vesiculovirus, puede comprender además opcionalmente una secuencia de ADN extraño que codifica una citocina que puede expresarse y estimular una respuesta inmunitaria en un huésped infectado por el vesiculovirus recombinante. Por ejemplo, tales citocinas incluyen pero no se limitan a interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, interferones, factores estimulantes de colonias de granulocitos y macrófagos y receptores de interleucinas.

El ADN extraño puede comprender además opcionalmente una secuencia que codifica y puede expresar un marcador detectable (por ejemplo, B-galactosidasa).

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5.3 Construcción de ADN (-) de vesiculovirus que contiene ADN extraño

Para la producción inicial de un vesiculovirus recombinante, el ADN extraño que comprende una secuencia que codifica el antígeno deseado se inserta dentro y/o sustituye a una región del ADN (-) de vesiculovirus no esencial para la replicación. Pueden usarse muchas estrategias conocidas en la técnica para la construcción del ADN (-) de vesiculovirus que contiene el ADN extraño. Por ejemplo, las secuencias relevantes del ADN extraño y del ADN (-) de vesiculovirus pueden romperse, mediante técnicas conocidas en la técnica, en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, aislarse y ligarse in vitro. Si se generan extremos cohesivos mediante digestión con endonucleasas de restricción, puede no necesitarse más modificación del ADN antes de la ligación. Sin embargo, si no están disponibles extremos cohesivos del ADN para la generación mediante digestión con endonucleasas de restricción o se prefieren sitios diferentes distintos de los disponibles, puede usarse cualquiera de las numerosas técnicas conocidas en la técnica para conseguir la ligación del ADN heterólogo en los sitios deseados. En una realización preferida, se introduce fácilmente un sitio de enzima de restricción deseada en el ADN deseado mediante amplificación del ADN mediante el uso de PCR con cebadores que contienen el sitio de enzima de restricción. A modo de otro ejemplo, a la rotura con una enzima de restricción le puede seguir la modificación para crear extremos romos digiriendo de nuevo o rellenando los extremos de ADN monocatenario antes de la ligación. Como alternativa, los extremos rotos del ADN (-) de vesiculovirus o el ADN extraño pueden "digerirse de nuevo" ("chewed back") usando una nucleasa tal como la nucleasa Bal 31, la exonucleasa III, la exonucleasa lambda, la nucleasa mung bean o la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa de T4, por nombrar sólo unas pocas, con el fin de eliminar partes de la secuencia.

Para facilitar la inserción del ADN extraño, puede insertarse una secuencia de oligonucleótido (un ligador) que codifica uno o más sitios de restricción en una región del ADN (-) de vesiculovirus (véase, por ejemplo, el poliligador en pVSVSS1, figura 2) mediante ligación a los extremos del ADN. También puede usarse un ligador para generar sitios de restricción adecuados en la secuencia de ADN extraño.

Adicionalmente, pueden mutarse in vitro o in vivo secuencias de ADN (-) de vesiculovirus o de ADN extraño con el fin de formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar los procedimientos de ligación in vitro. Puede usarse cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), mutagénesis química, etc.

Si se desea, pueden "almacenarse" secuencias del ADN (-) de vesiculovirus que se han modificado de manera no deseable mediante tales manipulaciones in vitro, mediante la introducción de secuencias apropiadas en los sitios deseados.

La estrategia particular para insertar el ADN extraño dependerá del sitio del ADN (-) de vesiculovirus específico que va a sustituirse o insertarse dentro, así como del ADN extraño que va a insertarse.

Las secuencias que codifican los péptidos o proteínas inmunogénicas están presentes preferiblemente en copias únicas, pero también pueden estar presentes en múltiples copias dentro del genoma del virus.

Puede confirmarse la formación del ADN (-) de vesiculovirus que contiene el ADN extraño mediante procedimientos convencionales tales como análisis de la secuencia de ADN, análisis de hibridación y/o mapeo de restricción, usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

El ADN extraño que codifica un antígeno deseado puede obtenerse a partir de cualquiera de las numerosas fuentes tales como ADN clonado, ADN genómico o ADNc preparado a partir de ARN del patógeno o tumor deseado, como puede ser el caso, o ADN sintetizado químicamente y manipulado mediante metodología de ADN recombinante bien conocida en la técnica (véase Sambrook et al., 1991, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York). En una realización preferida, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el fragmento deseado de ADN extraño de entre una preparación en bruto de ADN o una muestra pequeña del ADN, mediante procedimientos convencionales. Pueden deducirse fácilmente cebadores apropiados para su uso en la PCR basándose en secuencias publicadas.

Con el fin de generar fragmentos de ADN apropiados, puede romperse el ADN (por ejemplo del patógeno o tumor de interés) en sitios específicos usando diversas enzimas de restricción. Como alternativa, puede usarse ADNasaI en presencia de manganeso, o nucleasa mung bean (McCutchan et al., 1984, Science 225:626) para fragmentar el ADN, o el ADN puede cortarse físicamente, como por ejemplo, mediante sonicación. Entonces, los fragmentos de ADN lineal pueden separarse según el tamaño mediante técnicas convencionales, incluyendo, pero sin limitarse a, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida y cromatografía en columna.

Lo más preferiblemente, se lleva a cabo la amplificación por PCR de fragmentos de ADN que contienen el/los epítopo(s) deseados, en la que los cebadores de PCR contienen y por tanto introducen en el ADN amplificado un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción deseado. Como alternativa, puede usarse cualquier enzima o combinación de enzimas de restricción para generar fragmento(s) de ADN que contienen el/los epítopo(s) deseados, siempre que las enzimas no destruyan la inmunopotencia del producto codificado. En consecuencia, pueden usarse muchas combinaciones de enzimas de restricción para generar fragmentos de ADN que, cuando se insertan dentro del ADN (-) de vesiculovirus, pueden producir vesiculovirus recombinantes que dirigen la producción del péptido que contiene el/los epítopo(s).

Una vez que se generan los fragmentos de ADN, puede conseguirse la identificación del fragmento específico que contiene la secuencia deseada de varias formas. Por ejemplo, si está disponible previamente una pequeña cantidad de la secuencia de ADN deseada o una secuencia homóloga, puede usarse como una sonda marcada (por ejemplo, traducida por mellas) para detectar el fragmento de ADN que contiene la secuencia deseada, mediante hibridación con ácido nucleico. Como alternativa, si se conoce la secuencia del gen o fragmento génico derivado, pueden secuenciarse los fragmentos aislados o partes de los mismos mediante procedimientos conocidos en la técnica, e identificarse mediante una comparación de la secuencia derivada con la de la secuencia de la proteína o de ADN conocida. Como alternativa, puede identificarse el fragmento deseado mediante técnicas que incluyen pero no se limitan a selección de ARNm, fabricando ADNc con el ARNm identificado, sintetizando químicamente la secuencia génica (siempre que se conozca la secuencia) o selección basándose en la expresión de la proteína codificada (por ejemplo, mediante unión a anticuerpos) tras la "clonación en perdigonada" de diversos fragmentos de ADN en un sistema de expresión.

Las secuencias que codifican péptidos que van a expresarse en vesiculovirus recombinantes según la presente invención, ya se produzcan mediante procedimientos de ADN recombinante, síntesis química o técnicas de purificación, incluyen pero no se limitan a secuencias que codifican toda o parte (fragmentos) de las secuencias de aminoácidos de antígenos específicos de patógeno y específicos de tumor, así como otros derivados y análogos de los mismos que presentan la antigenicidad o inmunogenicidad de los mismos. Pueden someterse a prueba derivados o análogos de antígenos para detectar la actividad deseada mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a inmunoensayos convencionales.

En particular, pueden prepararse derivados de antígenos alterando las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos mediante sustituciones, adiciones o deleciones que no destruyen la antigenicidad o inmunogenicidad del antígeno. Por ejemplo, debido a la degeneración de la secuencias codificantes de nucleótidos, pueden usarse en la práctica de la presente invención otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen de antígeno nativo o parte del mismo. Otros ejemplos pueden incluir pero no se limitan a secuencias de nucleótidos que comprenden todo o parte de los genes o ADNc que están alterados mediante la sustitución de diferentes codones que codifican un residuo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Por ejemplo, pueden sustituirse uno o más residuos de aminoácido dentro de la secuencia por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Pueden seleccionarse sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y glutámico.

Los derivados y análogos de antígenos pueden producirse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede modificarse una secuencia génica clonada mediante cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York).

La secuencia puede romperse en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido por modificación enzimática adicional si se desea, aislarse y ligarse in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de un antígeno, debe tenerse cuidado para garantizar que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura traduccional que el antígeno, ininterrumpido mediante señales de parada de la traducción, en la región génica en la que se codifica(n) el/los epítopo(s) deseado(s).

Adicionalmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno puede mutarse in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir los preexistentes, para facilitar la modificación in vitro adicional. Puede usarse cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253:6551), uso de ligadores TAB® (Pharmacia), etc.

En otra realización específica, el derivado de antígeno codificado es una proteína quimérica o de fusión que comprende una primera proteína o fragmento de la misma fusionada con una segunda secuencia de aminoácidos diferente. Tal proteína quimérica está codificada por un ácido nucleico quimérico en el que las dos secuencias codificantes están unidas en marco. Puede prepararse un producto quimérico de este tipo ligando las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí mediante procedimientos conocidos en la técnica, en el marco codificante apropiado. En una realización específica, se produce una proteína de fusión en la que la primera secuencia de proteína contiene un epítopo de un antígeno y la segunda secuencia de proteína contiene un epítopo de un antígeno diferente.

Pueden someterse a prueba fácilmente derivados y fragmentos de antígenos conocidos mediante técnicas de inmunoensayo convencionales para determinar si presentan la inmunogenicidad o antigenicidad deseada, convirtiendo una secuencia de ADN que codifica tal fragmento o derivado en adecuada para su inserción en el ADN (-) de vesiculovirus.

Una secuencia de ADN que codifica un epítopo que es un hapteno, es decir, una molécula que es antigénica porque puede reaccionar selectivamente con anticuerpos análogos, pero no inmunogénica porque no puede provocar una respuesta inmunitaria cuando se administra sin adyuvantes o proteínas vehículo, también puede aislarse para su uso, ya que se prevé que, en realizaciones particulares, la presentación mediante los vesiculovirus de la invención puede conferir inmunogenicidad al hapteno expresado por el virus.

Una vez identificado y aislado, el ADN extraño que contiene la(s) secuencia(s) de interés se inserta entonces dentro del ADN (-) de vesiculovirus, para la producción de un vesiculovirus recombinante.

5.4. Producción de vesiculovirus recombinantes

Los vesiculovirus recombinantes de la invención se producen proporcionando en una célula huésped apropiada: ADN (-) de vesiculovirus, en el que regiones no esenciales para la replicación se han insertado dentro o sustituido por ADN extraño que comprende una secuencia que codifica un antígeno, y fuentes recombinantes de proteína N, proteína P y proteína L de vesiculovirus. La producción es preferiblemente in vitro, en cultivo celular.

La célula huésped usada para la producción de vesiculovirus recombinante puede ser cualquier célula en la que crezcan los vesiculovirus, por ejemplo, células de mamífero y algunas células de insecto (por ejemplo, Drosophila). Pueden usarse células primarias, o más preferiblemente, líneas celulares. Están disponibles para su uso un vasto número de líneas celulares conocidas comúnmente en la técnica. A modo de ejemplo, tales líneas celulares incluyen pero no se limitan a células BHK (riñón de crías de hámster), células CHO (ovario de hámster chino), células HeLA (humanas), células L de ratón, células Vero (mono), células ESK-4, PK-15, EMSK, células MDCK (riñón canino Madin-Darby), células MDBK (riñón bovino Madin-Darby), células 293 (humanas) y células Hep-2.

Las fuentes de proteínas N, P y L pueden ser el/los mismo(s) o diferente(s) ácido(s) nucleico(s) recombinante(s), que codifican y pueden expresar las proteínas N, P y L en la célula huésped en la que se desea producir vesiculovirus recombinantes.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas N, P y L se obtienen mediante cualquier medio disponible en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico de N, P y L se han dado a conocer y pueden usarse. Por ejemplo, véase el número de acceso de GenBank J02428; Rose y Schubert, 1987, en The Viruses: The Rhabdoviruses, Plenum Press, NY, págs. 129-166. También pueden obtenerse las secuencias que codifican los genes de N, P y L a partir del plásmido pVSVFL(+), depositado en la ATCC y al que se le asignó el número de acceso 97134, por ejemplo mediante amplificación por PCR del gen deseado (PCR; patentes estadounidenses números 4.683.202, 4.683.195 y 4.889.818; Gyllenstein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7652-7656; Ochman et al., 1988, Genetics 120:621-623; Loh et al., 1989, Science 243:217-220). Si no está todavía disponible un clon de ácido nucleico de cualquiera de los genes de N, P o L, el clon puede obtenerse mediante el uso de metodología de ADN recombinante convencional. Por ejemplo, el ADN puede obtenerse mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica mediante purificación de ARN a partir de vesiculovirus seguido por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (Mullis y Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155:335-350). Las alternativas al aislamiento de un gen de N, P o L incluyen, pero no se limitan a sintetizar químicamente la propia secuencia génica. Son posibles otros procedimientos y están dentro del alcance de la invención.

Si se desea, el gen identificado y aislado puede insertarse entonces óptimamente en un vector de clonación apropiado antes de transferirse a un vector de expresión.

Los ácidos nucleicos que codifican derivados (incluyendo fragmentos) y análogos de genes de N, P y L nativos, así como derivados y análogos del ADN (-) de vesiculovirus, también pueden usarse en la presente invención, siempre que tales derivados y análogos conserven su función, tal como se ejemplifica mediante la capacidad cuando se usan según la invención para producir un vesiculovirus replicable que contiene un ARN genómico que contiene ARN extraño. En particular, pueden prepararse derivados alterando secuencias mediante sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente activas. Además, debido a la degeneración inherente de las secuencias codificantes de nucleótidos, pueden usarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente en la puesta en práctica de los procedimientos de la invención. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados.

El ácido nucleico que codifica N/P/L deseado se inserta entonces preferiblemente en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica la proteína insertada en el huésped en el que se desea producir el vesiculovirus recombinante, para crear un vector que funciona para dirigir la síntesis de la proteína N/P/L que se ensamblará posteriormente con el ARN genómico de vesiculovirus que contiene la secuencia extraña (producida en la célula huésped a partir de ARN (+) de vesiculovirus antigenómico producido mediante la transcripción del ADN (-) de vesiculovirus). Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector para expresar las secuencias que codifican N, P y L, así como para transcribir el ADN (-) de vesiculovirus que contiene el ADN extraño, siempre que el vector sea funcional en el huésped y compatible con cualquier otro vector presente. Tales vectores incluyen pero no se limitan a bacteriófagos, plásmidos o cósmidos. En un aspecto preferido, se usa un vector de expresión de plásmido. Los elementos de expresión de vectores varían en sus potencias y especificidades. Puede usarse uno cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados, siempre que sean funcionales en el huésped.

Pueden usarse procedimientos de ADN recombinante convencionales para construir vectores de expresión que contienen ADN que codifica las proteínas N, P y L, y el ADN (-) de vesiculovirus que contiene el ADN extraño, que comprende señales de control transcripcional/traduccional apropiadas (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, citado anteriormente, y procedimientos descritos a continuación en el presente documento). (No se necesitan señales de control traduccional para la transcripción del ADN (-) de vesiculovirus, y por tanto pueden omitirse de un vector que contiene el ADN (-) de vesiculovirus, aunque tales señales pueden estar presentes en el vector y operativamente unidas a otras secuencias que codifican una proteína que se desea expresar). La expresión puede controlarse mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión pueden ser constitutivos o inducibles. En una realización específica, el promotor es un promotor de la ARN polimerasa.

También se incluyen preferiblemente señales de terminación de la transcripción (en sentido 3' respecto al gen) y marcadores seleccionables en un vector de expresión de plásmido. Además de las secuencias promotoras, los vectores de expresión para las proteínas N, P y L contienen preferiblemente señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias de N/P/L insertadas, por ejemplo, un sitio de unión a ribosomas.

Se requieren señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias que codifican proteínas insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los que el gen de N, P o L completo incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes se insertan en los vectores apropiados, pueden no necesitarse señales de control traduccional adicionales. Sin embargo, en casos en los que sólo se inserta una parte de la secuencia génica, deben proporcionarse señales de control traduccional exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de las secuencias que codifican la proteína para garantizar la traducción del inserto completo. Estas señales de control traduccional exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos.

En una realización específica, un vector de expresión recombinante proporcionado por la invención, que codifica una proteína N, P y/o L o derivado funcional de la misma, comprende los siguientes componentes operativamente unidos: un promotor que controla la expresión de la proteína N, P o L o derivado funcional de la misma, una señal de iniciación de la traducción, una secuencia de ADN que codifica la proteína N, P o L o derivado funcional de la misma y una señal de terminación de la transcripción. En un aspecto preferido, los componentes anteriores están presentes en orden 5' a 3' tal como se enumeraron anteriormente.

En otra realización específica, el gen que codifica la proteína N, P o L se inserta en sentido 3' respecto al promotor de la ARN polimerasa de T7 del gen 10 del fago T7, situado con una A en la posición -3. También se incluyen en el vector de expresión un terminador de la ARN polimerasa de T7 y un replicón. En esta realización, se proporciona una ARN polimerasa de T7 para transcribir la secuencia de N/P/L. La ARN polimerasa de T7 puede producirse a partir de una secuencia integrada cromosómicamente o de manera episomal, y se proporciona lo más preferiblemente mediante expresión intracelular a partir de un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa de T7 (véase a continuación). Preferiblemente, las proteínas N, P y L se codifican cada una mediante una secuencia de ADN operativamente unida a un promotor en un plásmido de expresión, que contiene las señales reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de las proteínas N, P y L. Un plásmido de expresión de este tipo incluye preferiblemente un promotor, la secuencia codificante y una señal de terminación de la transcripción/poliadenilación, y opcionalmente, un marcador seleccionable (por ejemplo, \beta-galactosidasa). Las proteínas N, P y L pueden codificarse mediante los mismos o diferentes plásmidos, o una combinación de los mismos, y están preferiblemente en diferentes plásmidos. Menos preferiblemente, pueden expresarse una o más de las proteínas N, P y L de manera intracromosómica.

Las secuencias clonadas que comprenden el ADN (-) de vesiculovirus que contiene el ADN extraño, y las secuencias clonadas que comprenden secuencias que codifican las proteínas N, P y L, pueden introducirse en la célula huésped deseada mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, infección (cuando las secuencias están contenidas, por ejemplo, en un vector viral), microinyección, etc.

En una realización preferida, ADN que comprende ADN (-) de vesiculovirus que contiene ADN extraño que codifica un antígeno, operativamente unido a un promotor de la ARN polimerasa (preferiblemente un promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago); ADN que codifica N, operativamente unido al mismo promotor de la ARN polimerasa; ADN que codifica P, operativamente unido al mismo promotor de la polimerasa; y ADN que codifica L, operativamente unido al mismo promotor de la polimerasa; se introducen todos (preferiblemente mediante transfección) en la misma célula huésped, célula huésped en la que se ha proporcionado la ARN polimerasa de manera citoplasmática. La ARN polimerasa se proporciona de manera citoplasmática preferiblemente mediante expresión a partir de un virus recombinante que se replica en el citoplasma y expresa la ARN polimerasa, lo más preferiblemente un virus vaccinia (véase la sección a continuación en el presente documento), que se ha introducido (por ejemplo, mediante infección) en la misma célula huésped. Se prefiere la provisión citoplasmática de ARN polimerasa, dado que esto dará como resultado la transcripción y el procesamiento citoplasmáticos del ADN (-) de VEV que comprende el ADN extraño y de las proteínas N, P y L, evitando el mecanismo de corte y empalme en el núcleo celular, y maximizando así el procesamiento y la producción apropiados de las proteínas N, P y L y dando como resultado el ensamblaje del vesiculovirus recombinante. Por ejemplo, el virus vaccinia proporciona también de manera citoplasmática enzimas para el procesamiento (ocupación de extremos y poliadenilación) de ARNm, facilitando la traducción apropiada. En un aspecto más preferido, se emplean promotores de la ARN polimerasa de T7, y se proporciona una fuente citoplasmática de la ARN polimerasa de T7 introduciendo también en la célula huésped un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa de T7 en la célula huésped. Tales virus vaccinia puede obtenerse mediante procedimientos bien conocidos (véase la sección 5.5, a continuación). En un aspecto preferido, puede usarse un virus vaccinia recombinante tal como vTF7-3 (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:8122-8126). En un aspecto más preferido, el ADN que comprende ADN (-) de vesiculovirus que contiene ADN extraño es el plásmido pVSVSS1 en el que se ha insertado ADN extraño en la región de poliligador.

Como alternativa, pero menos preferiblemente, puede proporcionarse la ARN polimerasa (por ejemplo, la ARN polimerasa de T7) mediante el uso de una célula huésped que expresa la ARN polimerasa de T7 a partir de una secuencia integrada cromosómicamente (por ejemplo, insertada originalmente en el cromosoma mediante recombinación homóloga), preferiblemente de manera constitutiva, o que expresa la ARN polimerasa de T7 de manera episomal, a partir de un plásmido.

En otra realización menos preferida, el ADN (-) de VEV que codifica un antígeno, operativamente unido a un promotor, puede transfectarse en una célula huésped que expresa de manera recombinante y estable las proteínas N, P y L a partir de secuencias integradas cromosómicamente.

Se cultivan las células y se recupera el vesiculovirus recombinante, mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, y no como limitación, tras aproximadamente 24 horas, se recogen las células y el medio, se congelan-descongelan y se clarifican los lisados para producir preparaciones de virus. Como alternativa, se recogen las células y el medio y se clarifican simplemente las células y los desechos mediante centrifugación a baja velocidad.

Entonces, se lleva a cabo preferiblemente la confirmación de que está presente la secuencia extraña apropiada en el genoma del vesiculovirus recombinante y dirige la producción de la(s) proteína(s) deseada(s) en una célula infectada. Pueden usarse para este fin procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, se obtiene ARN genómico a partir del vesiculovirus mediante extracción con SDS fenol de preparaciones de virus, y puede someterse a transcripción inversa (y PCR, si se desea) seguido por secuenciación, hibridación de tipo Southern usando una sonda específica para el ADN extraño o mapeo con enzimas de restricción, etc. El virus puede usarse para infectar células huésped, que entonces pueden someterse a ensayo para detectar la expresión de la proteína deseada mediante técnicas de inmunoensayo convencionales usando un anticuerpo frente a la proteína, o mediante ensayos basados en la actividad funcional de la proteína. En la técnica se conocen y pueden usarse otras técnicas.

La invención también proporciona kits para la producción de vesiculovirus recombinantes. En una realización, el kit comprende en uno o más recipientes (y lo más preferiblemente, en recipientes separados): (a) un primer ADN recombinante que puede transcribirse en una célula huésped adecuada para producir un ARN (+) antigenómico de vesiculovirus en el que a una parte del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus se le ha insertado dentro o sustituido por una secuencia de ARN extraño; (b) un segundo ADN recombinante que comprende una secuencia que codifica una proteína N de vesiculovirus; (c) un tercer ADN recombinante que comprende una secuencia que codifica una proteína L de vesiculovirus; y (d) un cuarto ADN recombinante que comprende una secuencia que codifica una proteína P de vesiculovirus. El segundo, tercero y cuarto ADN recombinantes pueden ser parte de las mismas y diferentes moléculas de ADN. En una realización preferida, las secuencias que codifican las proteínas N, L y P están cada una operativamente unidas a un promotor que controla la expresión de las proteínas N, L y P, respectivamente, en la célula huésped adecuada. En diversas realizaciones, el kit puede contener los diversos ácidos nucleicos, por ejemplo, vectores de expresión de plásmido, descritos anteriormente en el presente documento, para su uso en la producción de vesiculovirus recombinantes.

En otra realización, un kit de la invención comprende (a) un primer ADN recombinante que puede transcribirse en una célula huésped adecuada para producir un ADN antigenómico de vesiculovirus en el que a una parte del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus se le ha insertado dentro o se ha sustituido por una secuencia de ARN extraño; y (b) una célula huésped que expresa de manera recombinante las proteínas N, P y L de vesiculovirus.

En una realización preferida, un kit de la invención comprende en recipientes separados:

(a) un primer plásmido que comprende los siguientes componentes operativamente unidos: (i) un promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago, (ii) un ADN que comprende una secuencia que puede transcribirse en una célula huésped apropiada para producir una molécula de ARN que comprende un ARN antigenómico de vesiculovirus en el que a una parte del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus se le ha insertado dentro o sustituido por una secuencia de ARN extraño, y en el que el extremo 3' del ARN antigenómico es inmediatamente adyacente a una secuencia de ribozima que rompe en el extremo 3' del ARN antigenómico, y (iii) una señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa de bacteriófago; y

(b) un segundo plásmido que comprende los siguientes componentes operativamente unidos: (i) el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago, (ii) un ADN que comprende una secuencia que codifica la proteína N de vesiculovirus y (ii) una señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa de bacteriófago; y

(c) un tercer plásmido que comprende los siguientes componentes operativamente unidos: (i) el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago, (ii) un ADN que comprende una secuencia que codifica la proteína P de vesiculovirus y (ii) una señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa de bacteriófago; y

(d) un cuarto plásmido que comprende los siguientes componentes operativamente unidos: (i) el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago, (ii) un ADN que comprende una secuencia que codifica la proteína L de vesiculovirus y (ii) una señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa de bacteriófago.

En otra realización, un kit de la invención comprende además en un recipiente separado un virus vaccinia recombinante que codifica y puede expresar la ARN polimerasa de bacteriófago.

En una realización preferida, los componentes de los recipientes están en forma purificada.

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5.4.1 Virus vaccinia recombinantes que codifican y pueden expresar ARN polimerasas extrañas

En un aspecto preferido de la invención, la transcripción del ADN (-) de vesiculovirus que contiene el ADN extraño que codifica un antígeno y/o la transcripción del ADN que codifica las proteínas N, P y L en la célula huésped, está controlada mediante un promotor de la ARN polimerasa (preferiblemente uno en el que la ARN polimerasa no es endógena para la célula huésped), y la ARN polimerasa (que inicia la transcripción a partir del promotor) se proporciona de manera recombinante en la célula huésped mediante la expresión a partir de un virus vaccinia recombinante. Las secuencias de ADN que codifican ARN polimerasas se conocen bien y están disponibles en la técnica y pueden usarse. Por ejemplo, puede obtenerse ADN de fago y usarse PCR para amplificar el gen de la polimerasa deseado.

La inserción de la secuencia de ADN recombinante deseada que codifica y que puede expresar la ARN polimerasa en un virus vaccinia para su expresión por el virus vaccinia se consigue preferiblemente insertando en primer lugar la secuencia de ADN en un vector de plásmido que puede transferirse posteriormente a un genoma de virus vaccinia mediante recombinación homóloga. Por tanto, en un aspecto preferido de la invención para construir los virus vaccinia recombinantes, se inserta la secuencia de ADN deseada que codifica la polimerasa, usando metodología de ADN recombinante (véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) en un vector de inserción (preferiblemente, un plásmido) flanqueado por (preferiblemente) secuencias de ADN de vaccinia no esenciales, proporcionando así la transferencia posterior de su(s) gene(s) quimérico(s) en virus vaccinia mediante recombinación homóloga. Las secuencias se colocan en el vector de modo que pueden expresarse bajo el control de un promotor funcional en virus vaccinia.

La expresión de ADN extraño en virus vaccinia recombinantes requiere el posicionamiento de promotores funcionales en vaccinia de manera que dirijan la expresión de las secuencias de ADN de polimerasa que codifican la proteína. Se han construido vectores de inserción de plásmido para insertar genes quiméricos en virus vaccinia para su expresión en los mismos. Se describen ejemplos de tales vectores por Mackett (Mackett et al., 1984. J. Virol. 49:857-864). Se inserta el ADN que codifica la polimerasa en un sitio de clonación de endonucleasas de restricción adecuado. Además de los vectores de inserción de plásmido, pueden usarse vectores de inserción basados en ADN de bacteriófago M13 monocatenario (Wilson et al., 1986, Gene 49:207-213).

El ADN de polimerasa insertado no debe contener preferiblemente intrones, y la inserción debe ser preferiblemente de manera que coloque las secuencias codificantes en proximidad estrecha con el promotor, sin otros codones de iniciación entre el iniciador ATG y el extremo 5' del transcrito.

El vector de inserción de plásmido debe contener elementos reguladores transcripcionales y traduccionales que sean activos en virus vaccinia. El plásmido debe configurarse de modo que las secuencias de polimerasa estén bajo el control de un promotor activo en virus vaccinia. Los promotores que pueden usarse en los vectores de inserción incluyen pero no se limitan al promotor de la timidina quinasa (TK) del virus vaccinia, el promotor 7.5K (Cochran et al., 1985, J. Virol. 54:30-37), el promotor 11K (publicación de patente europea 0198328), el promotor F (Paoletti et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:193-197) y diversos promotores de vaccinia tempranos y tardíos (véase Moss, 1990, Virology, 2ª Ed., cap. 74, Fields et al., eds., Raven Press, Ltd., Nueva York, págs. 2079-2111).

En una realización específica, el vector de inserción de plásmido contiene (para la transferencia final en virus vaccinia) una secuencia que codifica la ARN polimerasa de T7 bajo el control de un promotor activo en virus vaccinia. En otra realización específica, un vector de inserción de plásmido contiene un sistema de expresión conjunta constituido por promotores orientados de manera divergente, uno que dirige la transcripción de las secuencias de polimerasa, dirigiendo el otro la transcripción de un gen indicador o marcador seleccionable, para facilitar la detección o selección del virus vaccinia recombinante final (véase, por ejemplo, Fuerst et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 5:1918-1924).

Tal como se describió anteriormente, el vector de inserción de plásmido contiene al menos un conjunto de secuencias que codifican polimerasa operativamente unidas a un promotor, flanqueadas por secuencias preferiblemente no esenciales para la replicación viral de vaccinia. Tales secuencias no esenciales incluyen pero no se limitan al gen de la TK (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864), el fragmento de ADN HindIII-F de vaccinia (Paoletti et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:193-197), el gen del factor de crecimiento de vaccinia situado dentro de ambas repeticiones terminales (Buller et al., 1988, J. Virol. 62:866-874), los genes N2 y M1 (Tamin et al., 1988, Virology 165:141-150), la subunidad M1 del gen de la ribonucleótido reductasa en el fragmento de ADN HindIII-I de vaccinia (Child et al., 1990, Virology 174:625-629), la hemaglutinina de vaccinia (Shida et al., 1988, J. Virol. 62:4474-4480), el gen de la proteína de fusión de 14 kD de vaccinia (Rodriguez et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1287-1291), etc. (véase también Buller y Palumbo, 1991, Microbiol. Rev. 55(1):80-122). Se prefieren para su uso las secuencias de TK; el uso de tales secuencias da como resultado la generación de virus recombinantes TK^{-}.

Los virus vaccinia recombinantes se producen preferiblemente mediante transfección de los vectores de inserción recombinantes que contiene las secuencias de polimerasa en células infectadas previamente con virus vaccinia. Como alternativa, la transfección puede tener lugar antes de la infección con el virus vaccinia. La recombinación homóloga tiene lugar dentro de las células infectadas y da como resultado la inserción del gen extraño en el genoma viral, en la región correspondiente a las regiones que flanquean al vector de inserción. Las células infectadas pueden examinarse usando una variedad de procedimientos tales como técnicas inmunológicas, hibridación en placa de ADN o selección genética de virus recombinantes que posteriormente pueden aislarse. Estos recombinantes de vaccinia conservan preferiblemente su infectividad y funciones esenciales y pueden construirse para que acomoden hasta aproximadamente 35 kilobases de ADN extraño.

Las transfecciones pueden realizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo un procedimiento mediado por cloruro de calcio (Mackett et al., 1985, The construction and characterization of vaccinia virus recombinants expressing foreign genes, en DNA Cloning, Vol. II, Rickwood y Hames (eds.), IRL Press, Oxford-Washington, D.C.) o un procedimiento mediado por liposomas (Rose et al., 1991, Biotechniques 10:520-525).

Cuando, tal como se prefiere, se usan secuencias de TK flanqueantes para promover la recombinación homóloga, los virus recombinantes resultantes tienen así una región de TK deteriorada, que les permite crecer en una línea celular huésped TK^{-} tal como Rat2 (número de acceso de la ATCC CRL 1764) en presencia de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BUDR), en condiciones en las que no crecerán virus no recombinantes (TK^{+}).

En otra realización, pueden prepararse virus vaccinia recombinantes de la invención mediante clonación in vitro, y luego empaquetarse con un poxvirus sensible a una condición de selección, en lugar de mediante recombinación homóloga (véase la publicación internacional número WO 94/12617 con fecha del 9 de 1994). Por ejemplo, pueden insertarse las secuencias de ADN del VHB en el ADN genómico de vaccinia usando técnicas de ADN recombinante convencionales in vitro; este ADN recombinante puede empaquetarse entonces en presencia de un poxvirus "auxiliar" tal como un mutante de virus vaccinia sensible a la temperatura o un virus de la viruela aviar que puede seleccionarse en las condiciones apropiadas.

Pueden usarse diversas cepas de virus vaccinia conocidas en la técnica para generar los virus recombinantes de la invención. Un virus vaccinia preferido es la cepa de los laboratorios del Departamento de Sanidad de la ciudad de Nueva York ("New York City Department of Health Laboratories"), preparada por Wyeth (disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), número de acceso VR-325). Otras cepas de vaccinia incluyen pero no se limitan a las cepas Elstree y Moscow, la cepa de Rivers (CV-1 y CV-2), y la cepa LC16m8 de Hashizume.

La selección del virus vaccinia recombinante puede ser mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo técnicas de hibridación (por ejemplo, usando secuencias de ADN de polimerasa como sonda de hibridación), técnicas inmunológicas (por ejemplo, ensayo para detectar la unión a anticuerpos que reconocen el/los epítopo(s) de polimerasa codificado(s)), etc. En un aspecto preferido en el que se usan secuencias flanqueantes de TK en el vector de inserción, la selección es para detectar recombinantes TK^{-}, tal como se describió anteriormente; entonces puede llevarse a cabo el examen para seleccionar el recombinante correcto mediante análisis moleculares convencionales. En muchos aspectos preferidos, el método de elección para la selección lo dicta el marcador seleccionable en un vector de inserción usado para generar los virus recombinantes.

Entonces, el virus vaccinia recombinante seleccionado se purifica generalmente por placas, y se somete preferiblemente a análisis de proteínas y ácidos nucleicos convencionales para verificar su identidad y pureza, y la expresión de la polimerasa insertada.

5.5. Crecimiento y purificación a gran escala de vesiculovirus replicables recombinantes

El vesiculovirus recombinante recuperado, tras la purificación por placas, puede hacerse crecer entonces en grandes números, a modo de ejemplo, tal como sigue. Se recupera virus a partir de una única placa (\sim10^{6} ufp) y se usa para infectar \sim10^{7} células (por ejemplo, células BHK) para producir, normalmente, 10 ml a un título de 10^{9}-10^{10} ufp/ml para un total de aproximadamente 10^{11} ufp. Entonces, puede llevarse a cabo la infección de \sim10^{12} células (con una multiplicidad de infección de 0,1), y las células pueden hacerse crecer en cultivo en suspensión, placas grandes o frascos rotativos mediante procedimientos convencionales.

Se observa que los vesiculovirus recombinantes que ya no expresan más la región extracelular de la proteína G de vesiculovirus (que determina el rango de huésped) y que, en su lugar, expresan una glicoproteína de la envuelta de un virus diferente, necesitará hacerse crecer en células que son susceptibles a la infección mediante el virus diferente (y células que expresan así un receptor que promueve la infección por un virus que expresa la glicoproteína de la envuelta del virus diferente). Por tanto, por ejemplo, cuando el vesiculovirus recombinante expresa la glicoproteína de la envuelta de VIH, el virus se hace crecer en células CD4^{+} (por ejemplo, células linfoides CD4^{+}).

Entonces, pueden recogerse virus para preparaciones de vacuna de sobrenadantes de cultivo, y clarificarse los sobrenadantes para eliminar los desechos celulares. Si se desea, un procedimiento de aislamiento y concentración del virus que puede emplearse es mediante el pase del sobrenadante a través de una concentración de membrana de flujo tangencial. Además puede reducirse el volumen de la recogida mediante sedimentación a través de un cojín de glicerol y mediante concentración en un gradiente escalonado de sacarosa. Un procedimiento alternativo de concentración es la purificación en columna de afinidad (Daniel et al., 1988, Int. J. Cancer 41:601-608). Sin embargo, también pueden usarse otros procedimiento para la purificación (véase, por ejemplo Arthur et al., 1986, J. Cell. Biochem. Suppl. 10A:226), y el experto en la técnica reconocerá fácilmente cualquier modificación posible del procedimiento anterior. La purificación debe ser tan suave como sea posible, de manera que se mantenga la integridad de la partícula del virus.

5.6. Vesiculovirus replicables recombinantes para su uso como vacunas activadas

En una realización de la invención, se usan los vesiculovirus replicables recombinantes que expresan un antígeno inmunogénico como vacunas activadas.

Preferiblemente, los vesiculovirus recombinantes para su uso como vacunas activadas terapéuticas o profilácticas según la invención están algo atenuados. Las cepas más disponibles, por ejemplo cepas de laboratorio de VEV, pueden estar lo suficientemente atenuadas para su uso. Si se desea atenuación adicional, por ejemplo, basándose en pruebas de patogenicidad en animales, la atenuación se logra lo más preferiblemente de manera sencilla mediante el pase en laboratorio del vesiculovirus recombinante (por ejemplo, en BHK o cualquier otra línea celular adecuada). Generalmente, pueden obtenerse virus atenuados mediante numerosos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo pero sin limitarse a mutagénesis química, inserción genética, deleción (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) o recombinación usando metodología de ADN recombinante (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), selección en laboratorio de mutantes naturales, etc.

En esta realización de la invención, se formula una vacuna en la que el inmunógeno es uno o varios vesiculovirus recombinante(s), en los que el ARN extraño en el genoma dirige la producción de un antígeno en un huésped de manera que se provoca una respuesta inmunitaria (humoral y/o mediada por células) en el huésped que es profiláctica o terapéutica. En una realización en la que el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno de un patógeno, se lleva a cabo la administración de la vacuna para prevenir o tratar una infección por el patógeno y/o el trastorno infeccioso resultante y/u otros correlatos no deseables de la infección. En una realización en la que el antígeno en un antígeno tumoral, se lleva a cabo la administración de la vacuna para prevenir o tratar tumores (particularmente, cáncer).

En una realización específica preferida, los vesiculovirus recombinantes se administran profilácticamente para prevenir/proteger contra una infección y/o enfermedades infecciosas o formación de tumores (por ejemplo, cáncer).

En una realización específica dirigida a productos terapéuticos, los vesiculovirus recombinantes de la invención, que codifican epítopo(s) inmunogénico(s), se administran terapéuticamente para el tratamiento de infección o formación de tumores. Puede usarse la administración de tales virus, por ejemplo, a neonatos y otros sujetos humanos como un procedimiento de inmunoestimulación, para reforzar el sistema inmunitario del huésped, potenciar la inmunidad humoral y/o mediada por células y facilitar el aclaramiento de agentes infecciosos o tumores. Los virus de la invención pueden administrarse solos o en combinación con otras terapias (ejemplos de terapias antivirales, incluyen pero no se limitan a \alpha-interferón y fosfato de vidarabina; ejemplos de terapia tumoral incluyendo pero sin limitarse a radiación y quimioterapia de cáncer).

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5.7. Vesiculovirus recombinantes inactivados para su uso en vacunas

En una realización específica, los vesiculovirus replicables recombinantes de la invención se inactivan (es decir, destruidos, convertidos en no replicables) antes de su uso en vacunas, para proporcionar una vacuna inactivada. Dado que la envuelta del vesiculovirus es sumamente inmunogénica, en una realización en la que se incorpora una o más proteínas extrañas (por ejemplo, una glicoproteína de la envuelta de un virus distinto de un vesiculovirus) en la envuelta del vesiculovirus, un virus de este tipo, incluso en forma destruida, puede ser eficaz para proporcionar una respuesta inmunitaria contra dicha(s) proteína(s) extraña(s) en un huésped al que se le administra. En una realización específica, está presente en la partícula de vesiculovirus recombinante una multiplicidad de antígenos, que presenta cada uno la inmunogenicidad o antigenicidad de una glicoproteína de la envuelta de un virus diferente.

Los virus recombinantes inactivados de la invención difieren de las partículas interferentes defectuosas en que, antes de la inactivación, el virus es replicable (es decir, codifica todas las proteínas de vesiculovirus necesarias para permitirle replicarse en una célula infectada). Por tanto, dado que el virus está originalmente en un estado replicable, puede propagarse y hacerse crecer fácilmente en grandes cantidades antes de la inactivación, para proporcionar una gran cantidad de virus destruidos para su uso en vacunas, o para la expresión del antígeno expresado para su uso en una vacuna de subunidades (véase la sección 5.8, a continuación).

Se conocen en la técnica diversos procedimientos y pueden usarse para inactivar los vesiculovirus replicables recombinantes de la invención, para su uso como vacunas inactivadas. Tales procedimientos incluyen pero no se limitan a inactivación mediante el uso de formalina, betapropiolactona, irradiación gamma y psoraleno más luz ultravioleta.

En una realización específica, pueden inactivarse fácilmente vesiculovirus recombinantes mediante resuspensión de viriones purificados en una concentración adecuada de formaldehído. Aunque puede ser suficiente 0,8 formaldehído, la verificación de la concentración óptima de formaldehído puede determinarse fácilmente para un virus particular mediante titulación de diluciones en serie de formaldehído con virus infeccioso para determinar la curva de inactivación de formalina para ese virus. Esta técnica se ha descrito con detalle por Salk y Gori, 1960, Ann. N.Y. Acad. Sci. 83:609-637). Mediante extrapolación hasta cero, puede estimarse la concentración esperada para inactivar la última partícula infecciosa. Utilizando una concentración sustancialmente superior, por ejemplo 4 veces mayor que la concentración estimada, puede garantizarse la inactivación completa.

Aunque se ha demostrado que la inactivación con formalina sola es eficaz, puede ser deseable, para fines de seguridad y reguladores, destruir el virus dos o más veces, usando uno o más de los otros numerosos procedimientos conocidos actualmente para la inactivación de virus. Por tanto, aunque no es esencial, se contempla que el virus usado en la formulación final estará a menudo inactivado mediante un segundo agente tras el tratamiento con formalina.

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5.8. Uso de vesiculovirus replicables recombinantes en la producción de vacunas de subunidades

Dado que los vesiculovirus recombinantes de la invención pueden propagarse y hacerse crecer en grandes cantidades, cuando los vesiculovirus recombinantes expresan un antígeno, el crecimiento de tales vesiculovirus proporciona un procedimiento para la producción y purificación fácil a gran escala del antígeno expresado, particularmente cuando el antígeno se incorpora en la envuelta del vesiculovirus recombinante. En una realización específica, el antígeno es toda o una parte de una glicoproteína de la envuelta de otro virus, por ejemplo, gp160 de VIH, expresada como una proteína no de fusión, o expresada como una fusión con el dominio citoplasmático de una proteína G de vesiculovirus.

Los antígenos así producidos y purificados se usan en vacunas de subunidades.

Los vesiculovirus recombinantes que expresan también pueden usarse para producir de manera recombinante el antígeno en células infectadas in vitro, para proporcionar una fuente de antígeno para su uso en inmunoensayos, por ejemplo, para detectar o medir en una muestra de fluido corporal de un sujeto vacunado la presencia de anticuerpos frente al antígeno, y diagnosticar así la infección o la presencia de un tumor y/o controlar la respuesta inmunitaria del sujeto tras la vacunación.

5.9. Determinación de la eficacia de la vacuna

Puede determinarse la inmunopotencia de uno o más antígeno(s) en su formulación de vacuna de vesiculovirus activado o inactivado, o en su formulación de vacuna de subunidades, controlando la respuesta inmunitaria de animales de prueba tras la inmunización con el/los vesiculovirus recombinante(s) que expresan el/los antígeno(s) o con la vacuna de subunidades que contiene el antígeno, mediante el uso de cualquier inmunoensayo conocido en la técnica. Puede tomarse la generación de una respuesta humoral (anticuerpos) y/o inmunidad mediada por células como una indicación de una respuesta inmunitaria. Los animales de prueba pueden incluir ratones, hámsteres, perros, gatos, monos, conejos, chimpancés, etc. y finalmente sujetos humanos.

Los procedimientos de introducción de la vacuna pueden incluir la vía oral, intracerebral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o cualquier otras vías convencionales de inmunización. La respuesta inmunitaria de los sujetos de prueba puede analizarse mediante diversos enfoques tales como: la reactividad del suero inmunitario resultante frente al antígeno, tal como se somete a ensayo mediante técnicas conocidas, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencias, radioinmunoprecipitaciones, etc.; o, en el caso en el que el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno de un patógeno, mediante protección de huéspedes inmunizados frente a la infección mediante el patógeno y/o atenuación de los síntomas debidos a la infección por el patógeno en huéspedes inmunizados; o, en el caso en el que el antígeno presenta la antigenicidad o inmunogenicidad de un antígeno tumoral, mediante la prevención de la formación de tumores o la prevención de la metástasis, o mediante la regresión, o mediante la inhibición de la progresión tumoral, en huéspedes inmunizados.

Como un ejemplo de pruebas en animales adecuadas de una vacuna activada, pueden someterse a prueba las vacunas activadas de la invención en conejos para determinar la capacidad de inducir una respuesta de anticuerpos frente a los antígenos. Pueden usarse conejos New Zealand White adultos jóvenes machos libres de patógenos específicos (SPF). Cada grupo de prueba de conejos recibe aproximadamente 5 x 10^{8} ufp (unidades formadoras de placa) de la vacuna. Un grupo control de conejos recibe una inyección en Tris-HCl 1 mM pH 9,0 de un vesiculovirus no recombinante o de un vesiculovirus recombinante que no expresa el mismo antígeno.

Pueden extraerse muestras de sangre de los conejos cada una o dos semanas y analizarse el suero para detectar anticuerpos frente al/a los antígeno(s). Puede someterse a ensayo la presencia de anticuerpos específicos para el/los antígeno(s), por ejemplo, usando un ELISA.

También pueden usarse animales para someter a prueba la eficacia de la vacuna (por ejemplo, experimentos de exposición). Por ejemplo, en una realización específica referente a una formulación de vacuna activada, cada mono recibe por vía intradérmica aproximadamente 5 x 10^{8} ufp de vesiculovirus recombinante. Un mono control recibe (control) virus no recombinante por vía intradérmica. Se extrae sangre semanalmente durante 12 semanas y se analiza el suero para detectar anticuerpos frente al/a los antígeno(s).

5.10. Formulación de vacuna y administración

Las vacunas de la invención pueden ser multivalentes o univalentes. Las vacunas multivalentes se preparan a partir de virus recombinantes que dirigen la expresión de más de un antígeno, de los mismos o diferentes virus recombinantes.

Pueden usarse muchos procedimientos para introducir las formulaciones de vacuna de la invención; estos incluyen pero no se limitan a la vía oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal y mediante escarificación (raspando las capas superiores de la piel, por ejemplo, usando una aguja bifurcada).

El paciente al que se le administra la vacuna es preferiblemente un mamífero, lo más preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un animal no humano incluyendo pero sin limitarse a vacas, caballos, ovejas, cerdos, aves de corral (por ejemplo, pollos), cabras, perros, gatos, hámsteres, ratones y ratas. Al usar una vacuna de vesiculovirus activado, el paciente puede ser cualquier animal en el que se replique el vesiculovirus (por ejemplo, los animales enumerados anteriormente).

Las formulaciones de vacuna de virus de la invención comprenden una cantidad inmunizante eficaz de uno o más vesiculovirus recombinantes (activados o inactivados, como puede ser el caso) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las vacunas de subunidades comprenden una cantidad inmunizante eficaz de uno o más antígenos y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se conocen en la técnica vehículos farmacéuticamente aceptables e incluyen pero no se limitan a solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico estéril y combinaciones de los mismos. Un ejemplo de un vehículo aceptable de este tipo es un medio de cultivo fisiológicamente equilibrado que contiene uno o más agentes estabilizadores tales como proteínas estabilizadas, hidrolizadas, lactosa, etc. El vehículo es preferiblemente estéril. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. La composición puede ser una disolución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

Generalmente, los ingredientes se suministran o bien por separado o bien se mezclan juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de principio activo. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de diluyente estéril de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

En una realización específica, se proporciona un vesiculovirus recombinante liofilizado de la invención en un primer recipiente; un segundo recipiente comprende diluyente constituido por una disolución acuosa de glicerina al 50%, fenol al 0,25% y un antiséptico (por ejemplo, verde brillante al 0,005%).

La dosis precisa de virus, o vacuna de subunidades, que va a emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del paciente, y debe decidirse según la evaluación del médico y las circunstancias de cada paciente según técnicas clínicas convencionales. Una cantidad inmunizante eficaz es aquella cantidad suficiente para producir una respuesta inmunitaria frente al antígeno en el huésped al que se le administra el vesiculovirus recombinante o la vacuna de subunidades.

En una realización específica, una cantidad inmunizante eficaz de un vesiculovirus recombinante vivo de la presente invención está dentro del intervalo de 10^{3} a 10^{9} ufp/dosis, más preferiblemente de 10^{6} a 10^{9} ufp/dosis. Es posible el refuerzo pero no se prefiere. Si se desea el refuerzo, puede reforzarse opcionalmente con el antígeno en forma purificada en lugar de usar un vesiculovirus recombinante de la invención.

Para vacunas de vesiculovirus recombinante inactivado, la formulación de vacuna comprende una cantidad inmunizante eficaz del virus inactivado, preferiblemente en combinación con un inmunoestimulante; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente contexto, "inmunoestimulante" pretende abarcar cualquier compuesto o composición que tiene la capacidad de potenciar la actividad del sistema inmunitario, ya sea un efecto potenciador específico en combinación con un antígeno específico, o simplemente un efecto independiente tras la actividad de uno o más elementos de la respuesta inmunitaria. Algunos de los compuestos inmunoestimulantes más comúnmente utilizados en composiciones de vacuna son los adyuvantes alumbre o muramildipéptido de (MDP) y sus análogos. Se conocen en la técnica procedimientos de utilización de estos materiales, y está dentro de la capacidad del experto determinar una cantidad óptima de estimulante para una vacuna de virus dada. También puede desearse usar más de un inmunoestimulante en una formulación dada.

La cantidad exacta de virus inactivado utilizada en una preparación dada no es crítica, siempre que se administre la cantidad mínima de virus necesaria para provocar una respuesta inmunitaria. Se contempla un intervalo de dosificación de tan sólo aproximadamente 10 \mug, hasta una cantidad de un miligramo o más. Como un ejemplo, en una realización específica, las dosificaciones individuales pueden oscilar entre aproximadamente 50-650 \mug por inmunización.

Puede llevarse a cabo el uso de antígenos purificados como vacunas de subunidades mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, la(s) proteína(s) purificada(s) deben ajustarse a una concentración apropiada, formularse con cualquier adyuvante de vacuna adecuado y envasarse para su uso. Los adyuvantes adecuados pueden incluir, pero no se limitan a: geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos; polianiones; péptidos; emulsiones de aceite; alumbre y MDP. El inmunógeno también puede incorporarse en liposomas, o conjugarse con polisacáridos y/u otros polímeros para su uso en una formulación de vacuna. En casos en los que el antígeno recombinante es un hapteno, es decir, una molécula que es antigénica porque puede reaccionar selectivamente con anticuerpos análogos, pero no inmunogénica porque no puede provocar una respuesta inmunitaria, el hapteno puede unirse covalentemente a un vehículo o molécula inmunogénica; por ejemplo, una proteína grande tal como seroalbúmina conferirá inmunogenicidad al hapteno acoplado a la misma. El hapteno-vehículo puede formularse para su uso como vacuna.

Las dosis eficaces (cantidades inmunizantes) de las vacunas de la invención también pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba en modelos animales.

La invención también proporciona un envase o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que comprenden uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención. Asociada con tal(es) recipien-
te(s), puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, notificación que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración a seres humanos.

La presente invención proporciona por tanto un procedimiento de inmunización de un animal, o tratamiento o prevención de diversas enfermedades o trastornos en un animal, que comprende administrar al animal una dosis inmunizante eficaz de una vacuna de la presente invención.

5.11. Uso de anticuerpos generados por las vacunas de la invención

Los anticuerpos generados contra el antígeno mediante inmunización con los virus recombinantes de la presente invención también tienen usos potenciales en inmunoensayos de diagnóstico, inmunoterapia pasiva y generación de anticuerpos antiidiopáticos.

Los anticuerpos generados pueden aislarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.) y usarse en inmunoensayos de diagnóstico. Los anticuerpos también pueden usarse para controlar el tratamiento y/o la progresión de la enfermedad. Puede usarse para este fin cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica, tal como los enumerados anteriormente, incluyendo pero sin limitarse a sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación al complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, por nombrar sólo unos pocos.

Las formulaciones de vacuna de la presente invención también pueden usarse para producir anticuerpos para su uso en inmunoterapia pasiva, en la que se logra protección a corto plazo de un huésped mediante la administración de anticuerpos formados previamente dirigidos contra un organismo heterólogo.

Los anticuerpos generados por las formulaciones de vacuna de la presente invención también pueden usarse en la producción de anticuerpo antiidiopático. Entonces, el anticuerpo antiidiopático puede usarse a su vez para la inmunización, con el fin de producir una subpoblación de anticuerpos que se unen al antígeno inicial del microorganismo patógeno (Jerne, 1974, Ann. Immunol. (París) 125c:373; Jerne, et al., 1982, EMBO J. 1:234).

6. Virus recombinante de estomatitis vesicular a partir de ADN

Se ensambló un clon de ADN que contenía la secuencia de 11.161 nucleótidos del rabdovirus prototipo, virus de estomatitis vesicular (VEV), de modo que podía transcribirse por la ARN polimerasa de bacteriófago T7 dando un ARN de cadena positiva de longitud completa complementario al genoma del VEV. La expresión de este ARN en células que expresan también la proteína de la nucleocápsida del VEV y las dos subunidades de polimerasa de VEV dio como resultado la producción de VEV con las características de crecimiento del VEV de tipo natural. Se verificó la recuperación de virus a partir de ADN mediante: 1) la presencia de dos etiquetas genéticas que generaban nuevos sitios de restricción en ADN derivado del genoma; 2) la secuenciación directa del ARN genómico del virus recuperado, y 3), la producción de un VEV recombinante en el que la glicoproteína se derivaba de un segundo serotipo. La capacidad para generar VEV a partir de ADN abre numerosas posibilidades para el análisis genético de la replicación del VEV. Además, debido a que VEV puede hacerse crecer hasta títulos muy altos y en grandes cantidades con relativa facilidad, pueden modificarse mediante ingeniería genética los VEV recombinantes que presentan antígenos novedosos. Tales virus modificados pueden usarse como vacunas que confieren protección frente a otros virus o microorganismos patógenos, o para producir inmunidad en general frente a un antígeno extraño codificado.

6.1. Materiales y procedimientos

Construcción de plásmidos. Se construyó el plásmido pVSVFL(+) que expresa la secuencia de ARN del VEV (antigenómico) de cadena positiva de 11.161 nucleótidos a partir de cuatro fragmentos de ADN clonados en pBluescript SK^{+} (Stratagene). El plásmido de partida para la construcción, pVSVFL(-), expresó el ARN genómico de VEV de sentido negativo completo (serotipo Indiana) a partir de un promotor T7. Se generó este plásmido en un procedimiento de clonación de nueve etapas que implicaba unir los cinco clones de ADNc originales de los ARNm de VEV (Gallione et al., 1981, J. Virol. 39:529-535; Rose y Gallione, 1981, J. Virol. 39:519-528; Schubert et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7984-7988) con fragmentos de unión génica y fragmentos terminales. Se generaron estos fragmentos mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) (Mullis y Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155:335-350) a partir de ARN genómico de VEV (M.A. Whitt, R. Burdine, E.A. Stillman y J.K. Rose, original en preparación). Para facilitar la modificación mediante ingeniería genética del genoma de VEV y proporcionar etiquetas genéticas, se introdujeron sitios únicos de enzima de restricción Mlu I y Nhe I mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos en las regiones no codificantes 5' y 3' que flanquean el gen de glicoproteína de VEV antes de la construcción del genoma de cadena completa.

En la etapa inicial de construcción de pVSVFL(+) se usaron los cebadores (5'CCGGCTCGAGTTGTAATAC
GACTCACTATAGGGACGAAGACAAACAAACCATTATTAT C-3') (SEC ID NO:38) y (5'GAACTCTCCTCTA
GATGAGAAC-3') (SEC ID NO:39) para amplificar (Mullis y Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155:335-350) un fragmento de 2.124 nucleótidos a partir de pVSVFL(-) (nº 1, figura 4A). Este fragmento corresponde al extremo 3' del genoma del VEV. El primer cebador introdujo un sitio Xho I y un promotor de T7 (subrayado) precediendo inmediatamente la secuencia complementaria al extremo 3' del genoma del VEV. El segundo cebador cubrió un sitio Xba I único presente en el gen de P de VEV. Se digirió el producto de PCR con Xho I y Xba I y se clonó en pBluescript SK^{+} (Stratagene) que se había digerido con Xho I y Xba I. El plásmido resultante que portaba la secuencia correspondiente al extremo 3' del genoma del VEV precedido por un promotor de T7 se designó pBSXX. Obsérvese que también está presente un promotor de T7 adicional en sentido 5' del sitio Xho I en el vector. A continuación se generó la secuencia correspondiente al extremo 5' del genoma del VEV y parte de la ribozima del virus de hepatitis delta (VHD) (Pattnaik et al., 1992, Cell 69:1011-1120; Perrotta y Been, 1991, Nature 350:434-436). Se amplificó un producto de PCR de 147 nucleótidos (nº 3, figura 4A) a partir de pVSVFL(-) con los cebadores (5'AGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGA
GATGCCATGCCGACCCACGAAGACCACAAAACCAG -3') (SEC ID NO:40) y (5'ATGTTGAAGAGTGACCTA
CACG-3') (SEC ID NO:41). El primer cebador contenía 39 nucleótidos de la secuencia que codificaba la ribozima del VHD (subrayado) seguida por 19 nucleótidos complementarios al extremo 3' terminal del ARN antigenómico de VEV. El segundo cebador se hibridaba dentro del gen L (figura 4A). Se digirió el producto de PCR con Afl II y Rsr II y se ligó el fragmento de Afl II-Rsr II de 80 nucleótidos a un fragmento de Rsr II-Sac I de 225 nucleótidos (nº 4, figura 4A) derivado de un plásmido designado pBS-GMG (Stillman et al., original presentado). El fragmento 4 contenía la secuencia de terminación de T7 y el parte restante de la secuencia que codificaba la ribozima de VHD. Se digirieron los productos ligados con Afl II y Sac I y se clonó el producto de Afl II-Sac I de 305 nucleótidos en los sitios Afl II y Sac I de un vector pBSXX modificado que contenía un sitio Afl II insertado en el sitio Not I único dentro del poliligador. Este plásmido que contenía el fragmento de Afl II-Sac I se designó pBXXAS. Para completar la construcción, se insertó un fragmento de Bst 1107 I a Afl II de 10.077 nucleótidos (nº 2, figura 4A) que contenía el 90% de las secuencias del VEV a partir del pVSVFL(-) en los sitios Bst 1107 I y AflII únicos de pBXXAS. El plásmido final se designó pVSVFL(+). Se determinaron las secuencias en este plásmido generadas mediante PCR (secuencias sombreadas, figura 4B) y no contenían ningún error. También se preparó un plásmido en el que la secuencia del gen de G del serotipo Indiana de VEV (MluI-NheI) se sustituyó por el gen de G del serotipo New Jersey de VEV (Gallione y Rose,
1983, J. Virol. 46:162-169). Este plásmido se denomina pVSVFL(+)_{I/NJG} y tiene solamente un único promotor de T7.

Transfección y recuperación de VEV recombinante. Se mantuvieron células de riñón de cría de hámster (BHK-21, ATCC) en DME (medio de Eagle modificado por Dulbecco) complementado con suero bovino fetal al 5% (FBS). Se infectaron las células en placas de 10 cm (confluencia del ^{-}70%) a una multiplicidad de 10 con vTF7-3 (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126). Tras 30 min., se transfectaron plásmidos que codifican el ARN antigenómico de VEV y las proteínas N, P y L en las células usando un kit de transfección de fosfato de calcio según las direcciones suministradas (Stratagene). Se expresaron cada una de las regiones codificantes para las proteínas N, P y L en pBluescript SK(+) a partir del promotor de T7. Las cantidades de plásmido fueron 10 \mug de pVSVFL(+), 5 \mug de pBS-N, 4 \mug de pBS-P y 2 \mug de pBS-L. Tras 24-48 h de incubación a 37ºC en CO_{2} al 3%, se rasparon las células de la placa y se sometieron a tres series de congelación-descongelación (-70ºC, 37ºC) para liberar el virus asociado a las células. Se sedimentó el desecho de los lisados celulares mediante centrifugación a 1.250 x g durante 5 min. Se añadieron cinco ml de este lisado a aproximadamente 10^{6} células BHK sobre una placa de 10 cm en 10 ml de DME + FBS al 5%. Tras 48 h se clarificó el medio mediante centrifugación a 1.250 x g durante 10 min. y se pasó a través de un filtro para eliminar la mayor parte del virus vaccinia (tamaño de poro de 0,2 \mum, Gelman Sciences). Entonces se añadió directamente un ml a las células BHK que se habían sembrado en placa sobre un cubreobjetos en una placa de 35 mm. Tras cuatro horas, se fijaron las células en paraformaldehído al 3% y se tiñeron con anticuerpo monoclonal I1 frente a la proteína G_{I} de VEV (Lefrancois y Lyles, 1982, Virology 121:168-174) o 9B5 (Bricker et al., 1987, Virology 161:533-540) frente a la proteína G_{NJ} de VEV seguido de anticuerpo conjugado con rodamina de cabra anti-ratón (Jackson Research). Entonces se examinaron las células mediante inmunofluorescencia indirecta usando un microscopio Microphot-FX de Nikon equipado con un objetivo Planapochromat 40x. Si la recuperación de VEV era satisfactoria, el 100% de las células mostraban la tinción brillante típica para la proteína G característica de una infección con VEV.

Preparación y análisis de proteína y ARN de VEV. Se usaron VEV recombinante y VEV de tipo natural aislado de placas individuales (\sim10^{5} unidades formadoras de placa) para infectar una monocapa de células BHK (confluencia de \sim80%) sobre una placa de 10 cm en 10 ml de DME más FBS al 5%. Tras 24 h, se eliminaron los desechos celulares y los núcleos mediante centrifugación a 1.250 x g durante 5 min., y entonces se sedimentó el virus a partir del medio a 35.000 RPM en un rotor Beckman SW41 durante una hora. Se resuspendieron los sedimentos de virus en 0,5 ml Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 para el análisis de proteínas. Para el aislamiento del ARN, se resuspendió el virus en 0,2 ml de SDS 0,5% /acetato de sodio 0,2 M, pH 8,0, seguido de extracción con fenol/CHCl_{3}. Se precipitó el ARN con etanol al 95% y 5 \mug de ARNt portador. Se sedimentó el ARN mediante centrifugación a 12.000 x g durante 15 min. y se resuspendió en agua con 1 unidad de RNasin (Promega). Para el análisis de ARN mediante RT-PCR, se usaron parejas de cebadores que flanqueaban los sitios novedosos Nhe I o bien Mlu I. Se llevó a cabo la reacción de síntesis de la primera cadena ADN en 50 \mul de tampón para PCR (Promega) que contenía MgCl_{2} 5 mM, dNTPs 1 mM, 1 unidad de ARN en (Promega), 1 unidad de transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviar (AMV RT; Promega) cebador 0,75 \muM y aproximadamente 0,25 \mug de ARN genómico de VEV. La incubación fue a 42ºC durante 15 min. seguido de 5 min. a 99ºC y 5 min. a 5ºC. Se llevó a cabo la PCR mediante la adición de Taq polimerasa 0,5 U, el ajuste de la concentración de MgCl_{2} a 1,25 mM y la adición del segundo cebador (0,75 \muM). Se sometió la reacción a 20 ciclos térmicos: 95ºC, 1 min.; 60ºC 1,5 min. Entonces se incubó la reacción a 60ºC durante 7 min.

Se realizó la secuenciación directa del ARN genómico de VEV según un protocolo descrito previamente basado en el procedimiento de terminación de cadena didesoxi (Mierendorf y Pfeffer, 1987, Methods in Enzymology 152:563-566) excepto en que se usó [\alpha-^{33}P]dATP (Amersham, Inc.). Cada reacción incluía aproximadamente 0,25 \mug de ARN genómico de VEV.

6.2. Resultados

Para construir un clon de ADNc que codifica todo el genoma del VEV 11.161, se unieron individualmente clones de ADNc de los ARNm de VEV usando fragmentos pequeños de ADN generados mediante RT-PCR que cubrían las cuatro uniones génicas. También se generaron secuencias terminales genómicas correctas mediante RT-PCR del genoma del VEV, y éstas se unieron a otros ADN usando sitios de restricción. Se construyó este clon inicial con un promotor de T7 que dirigía la síntesis del ARN de VEV de cadena negativa de longitud completa. A pesar de los numerosos intentos, no se pudo recuperar VEV de las células que expresaban el ARN genómico de VEV y las proteínas N, P y L de VEV. Por tanto se rediseñó el VEV construido para expresar el ADN antigenómico de VEV. La estrategia de construcción se describe en Materiales y Procedimientos y en las figuras 4A-B. Se clonó la secuencia de VEV entera así como un promotor de T7, secuencia de terminación y de ribozima de VHD en pBluescript SK+ entre los sitios Xho I y Sac I (figura 4B; figura 1). También está presente un promotor adicional de T7 en sentido 5' del sitio Xho I en el plásmido. Se usó una estrategia de clonación ligeramente diferente para generar plásmidos que carecían del promotor de T7 en sentido 5' y también se ha recuperado VEV a partir de estos constructos.

Recuperación de VEV a partir de ADN. Para determinar si se podía recuperar VEV a partir de ADN de plásmido, se infectaron células con vaccinia, vTF7-3 (Fuerst et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126) proporcionando ARN polimerasa de T7 citoplasmático. Entonces se transfectaron estas células con pVSVFL(+), que expresa el ARN de VEV antigenómico a partir de un promotor de T7, y los tres otros plásmidos que expresan las proteínas N, P y L de VEV. Se requirió la expresión de la proteína N para ensamblar el ARN antigenómico de VEV naciente en nucleocápsidas. Una vez formados, estas nucleocápsidas deben servir como moldes para la síntesis de ARN de cadena negativa mediante el complejo de L/P polimerasa. Entonces, el ARN de cadena negativa en la cápsida debe ser un molde para la transcripción, iniciando el ciclo infeccioso del VEV.

El experimento de recuperación inicial empleó dos placas de 10 cm de células BHK (\sim5 x 10^{6} células cada una). A las 24 horas tras la infección con vTF7-3 y transfección con los cuatro plásmidos, se congelaron y descongelaron las células y el medio para liberar cualquier VEV asociado a las células, y se añadieron los lisados clarificados a células BHK nuevas. Tras 48 horas, amblas placas mostraron graves efectos citopáticos que podrían haberse debido al virus vaccinia o bien al VEV recuperado. Entonces se añadió un ml de cada sobrenadante a placas pequeñas de células BHK sobre cubreobjetos. Tras dos horas, uno de estos cubreobjetos mostraba células redondeadas características de una infección por VEV, mientras que la otra no lo hacía. Tras 4 horas, se fijaron células sobre ambos cubreobjetos, se tiñeron con los anticuerpos apropiados y se examinaron mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta para detectar la proteína G de VEV. Todas las células sobre el cubreobjeto que mostraba células redondeadas revelaban una fluorescencia intensa característica de la expresión de la proteína G durante la infección por VEV (datos no mostrados). Los pases y análisis siguientes descritos a continuación mostraron que se había recuperado VEV a partir de la transfección. El otro cubreobjetos no mostró expresión de G, y no pudo recuperarse VEV tras pases.

Basándose en la frecuencia con la que se recuperaron los minigenomas del virus de la rabia (Schnell et al., 1994, EMBO J. 13:4195-4203) y del VEV (Stillman et al., original presentado), se anticipó que la recuperación del VEV completo, si podía obtenerse, sería un acontecimiento poco frecuente. La recuperación inicial de VEV a partir de sólo una de dos transfecciones sugirió la posibilidad de que el título inicial en el lisado positivo fuera muy bajo. Para examinar este título, se infectaron células BHK sobre cubreobjetos con una décima parte del lisado (1 ml) derivada de cada transfección inicial. Tras ocho horas, se examinaron las células para determinar la expresión de la proteína G mediante inmunofluorescencia indirecta. Un barrido de todo el cubreobjetos no reveló infección por VEV del lisado negativo, y sólo cinco zonas pequeñas de infección (2-6 células cada una) del lisado que dieron lugar a expresión de G de VEV en pases posteriores. El título inicial fue por tanto muy bajo tal como se sospechaba, y posiblemente representó un total de aproximadamente 50 partículas infecciosas, derivadas probablemente de una infección por VEV iniciada en sólo una célula de 2 x 10^{7} transfectadas. Esta baja tasa de recuperación de VEV infecciosa es típica de la observada en varios experimentos.

Análisis de proteínas virales. Los pases y ensayos en placa posteriores de VEV recuperado en tres experimentos independientes revelaron placas que eran detectables en menos de 16 horas y títulos de hasta 2 x 10^{9} ufp/ml característicos de VEV. Para una verificación adicional de que se había recuperado VEV, se examinaron las proteínas en el virus sedimentado mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE). La figura 5 muestra el gel teñido con Coomassie de proteínas de VEV recuperadas a partir de ADN recombinante (VEVr) y VEV de tipo natural. Las movilidades y las cantidades relativas de las cinco proteínas virales eran indistinguibles en virus de tipo natural y recombinante.

Identificación de etiquetas de secuencia. En pVSVFL(+), se alteró la secuencia de nucleótidos de VEV mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para generar sitios únicos de enzima de restricción Mlu I y Nhe I en las regiones no codificantes 5' y 3' del gen de glicoproteína. Para verificar que estos sitios estaban presentes en el virus recuperado, se llevó a cabo la transcripción inversa del ARN genómico purificado a partir de viriones recombinantes o de tipo natural usando cebadores en sentido de 5' de cada sitio de restricción. Entonces se amplificaron los productos de la transcripción inversa mediante PCR usando un cebador adicional en el sentido de 5' de cada sitio de restricción. Se verificó la presencia de la etiqueta genética en el virus recombinante mediante la digestión de los productos de PCR con las enzimas de restricción apropiadas. Usando este método, se verificó la presencia de las secuencias tanto de Mlu I como de Nhe I en el ARN del virus recuperado ARN, y en la figura 6 se muestran los resultados para el sitio Nhe I. Se amplificaron en paralelo las secuencias del VEV de tipo natural y del VEV recombinante y se obtuvo un fragmento de 620 nucleótidos en ambos casos (carriles 3 y 5). No se obtuvo ningún producto cuando se omitió la transcriptasa inversa de las reacciones antes de la PCR (carriles 1 y 2), lo que indicaba que el producto de PCR se derivaba del ARN, no del ADN contaminante. Tras la digestión con Nhe I, se obtuvieron los fragmentos esperados de 273 y 347 pares de bases a partir del ARN de VEV recombinante, mientras que el ADN derivado del ARN de tipo natural permaneció sin digerir (carriles 4 y 6).

Secuenciación directa de ARN genómico etiquetado. La presencia de nuevos sitios de restricción en el ADN generado mediante PCR proporcionó pruebas fuertes de que se había recuperado VEV a partir del ADN. Para garantizar que la identificación de las etiquetas genéticas mediante PCR no había resultado de una contaminación inadvertida por el ADN de plásmido, se llevó a cabo un análisis de secuencia directo del ARN genómico usando transcriptasa inversa y un cebador que hibrida en sentido 5' respecto al sitio Nhe I. La secuencia del autorradiograma mostrado en la figura 7 está completamente de acuerdo con la secuencia publicada del ARNm de G de VEV (Rose y Gallione, 1981, J. Virol. 39:519-528) excepto en que están presentes los cambios de cuatro nucleótidos usados para generar el sitio Nhe I (GCACAA a GCTAGC). Estos resultados muestran inequívocamente que la etiqueta de secuencia está presente en el ARN genómico.

Virus VEV Indiana recombinante que porta la glicoproteína del serotipo New Jersey. Existen dos serotipos de VEV designados Indiana y New Jersey. Las glicoproteínas de los dos serotipos comparten aproximadamente un 50% de identidad de secuencia (Gallione y Rose, 1983, J. Virol. 46:162-169). En estudios anteriores se encontró que la glicoproteína del serotipo New Jersey podía complementar a un mutante del serotipo VEV_{I} que hace a una glicoproteína defectuosa (Whitt et al., 1989, J. Virol. 63:3569-3578). Por tanto, parece posible que un VEV recombinante en el que el gen de glicoproteína Indiana (G_{I}) se sustituyó por el gen de glicoproteína New Jersey (G_{NJ}) sería viable a pesar de la extensa divergencia de secuencia. Para generar un recombinante tal, se amplificó el ADNc de G_{NJ} mediante PCR usando cebadores que introdujeron sitios Mlu I y Nhe I en las regiones no codificantes 5' y 3' a cada extremo del gen. Se clonó el ADN amplificado en pBluescript y se expresó la proteína G_{NJ} en células BHK usando el sistema de vaccinia-T7. Se demostró que la proteína expresada tenía actividad de fusión de membrana por debajo de pH 6,0, lo que indicaba que era funcional (datos no mostrados). Entonces se clonó el ADNc de G_{NJ} en los sitios Mlu I y Nhe I únicos del constructo de longitud completa tras la eliminación de las secuencias que codifican G_{I}. Se recuperó VEV recombinante esencialmente tal como se describió anteriormente excepto en que se dejó continuar la transfección inicial durante 48 horas antes de la etapa de congelación-descongelación. Tras el primer pase, se verificó la expresión de la proteína G_{NJ} mediante inmunofluorescencia indirecta usando un anticuerpo monoclonal específico frente a G_{NJ} (Bricker et al., 1987, Virology 161:533-540). Entonces se purificó en placa el virus y se hizo crecer. Para examinar las proteínas presentes en el virus recombinante, se analizaron el virus recuperado de células infectadas con VEV_{I} , VEV_{NJ}, y el VEV_{I/NJG} recombinante mediante SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie. Cada una de las proteínas G, N, P y M de VEV_{I} tienen movilidades distintas de sus homólogos de VEV_{NJ} (figura 8, carriles 1 y 3). El VEV_{I/NJG} muestra la diferencia de movilidad en sólo la proteína G tal como se esperaba (carril 2). También se verificó la presencia de los sitios Nhe I y Mlu I novedosos en el recombinante (datos no mostrados).

6.3. Discusión

Los resultados presentados en el presente documento establecen que VEV infeccioso puede recuperarse a partir del ADN recombinante. Se cree que la expresión del ARN antigenómico, cadena positiva, en presencia de las proteínas N, P y L era crítica para el éxito porque no se ha recuperado virus partiendo de un constructo equivalente que codifica el ARN genómico.

¿Por qué es tan poco frecuente el acontecimiento inicial de generar VEV, que se produce aparentemente en sólo 1 en 10^{7} a 10^{8} células transfectadas? Una posibilidad es que este clon contenga una secuencia errónea que no se corrige sólo mediante un acontecimiento mutacional poco frecuente. Se cree que éste no es el caso porque el clon estaba completamente secuenciado antes de ensamblar y se corrigieron las diferencias con respecto a las secuencias publicadas, o se demostró que las proteínas eran funcionales en ensayos de complementación. Además, la frecuencia de recuperación es en realidad mayor de lo esperado basándose en las observaciones con minigenomas que codifican una o dos proteínas de VEV (Stillman et al., original presentado). En estos casos se encontró que se recuperaba un minigenoma de transcripción y replicación (ARN \sim2kb) en aproximadamente 1 en 10^{2} células transfectadas que expresan el ARN con las proteínas N, P y L. La adición de un segundo cistrón (ARN adicional de 0,85 kb) que codifica la proteína M disminuyó la tasa de recuperación hasta aproximadamente 1 en 10^{3} células transfectadas. Si existe una disminución de diez veces en la tasa de recuperación para cada kilobase adicional de ARN añadido, puede pensarse fácilmente una frecuencia incluso menor de recuperación para el genoma de 11.161 kb del observado. Aunque estos minigenomas codifican ARN de sentido negativo, la comparación de la frecuencia de recuperación con la de la longitud completa más el constructo es probablemente válida porque la expresión de los ARNm N, P y L no generarían ARNm complementarios al minigenoma.

Aunque la etapa limitativa de la velocidad en la generación de VEV infeccioso no se conoce, es posible que esté al nivel de la síntesis y encapsidación del ARN antigenómico grande, que debe producirse antes de la replicación y transcripción. La encapsidación completa con la proteína N probablemente tiene que producirse en el ARN naciente para protegerle de la degradación, y las células en las que esto se produce también deben producir cantidades apropiadas de proteínas L y P para iniciar la replicación. Sin embargo, una vez que se ha producido esto, la transcripción y traducción del genoma deben generar proteínas N, P y L adicionales así como las proteínas G y M requeridas para el brote de virus infeccioso.

La recuperación de VEV a partir de ADN abre numerosos aspectos del ciclo de vida viral al análisis genético. Los estudios de las señales genéticas implicadas en la transcripción y replicación se han limitado hasta la fecha al análisis de ARN defectuosos que no codifican proteínas virales (Pattnaik et al., 1992, Cell 69:1011-1120; Wertz et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8587-8591). Estas y otras señales pueden examinarse ahora en el contexto de una infección por VEV que se produce en ausencia de una infección por virus vaccinia. El sistema que se ha descrito también proporciona una oportunidad para estudiar los papeles de dominios proteicos virales individuales y las modificaciones en el ensamblaje y replicación virales. Previamente, estos análisis se han limitado a sistemas in vitro o al análisis empleando la complementación de mutantes que se producen en la naturaleza en los que la síntesis de la proteína mutante puede complicar el análisis.

Quizá incluso más apasionante es la capacidad de usar VEV como vector para expresar otras proteínas. El experimento en el que se recuperó VEV Indiana que portaba la glicoproteína del serotipo New Jersey (figura 8) ilustra que pueden prepararse recombinantes viables. Por motivos que no están claros, los títulos del virus recombinante fueron al menos diez veces inferiores que los obtenidos con cualquier virus original. El título inferior no resultó aparentemente de un defecto en el ensamblaje viral porque las cantidades de proteínas en los viriones recombinantes y de tipo natural al final de la infección fueron comparables (figura 8). Los experimentos previos mostraron que podría incorporarse una glicoproteína extraña que porta la señal de cola citoplasmática apropiada en la envuelta de VEV (Owens y Rose, 1993, J. Virol. 67:360-365). Esto sugiere que pueden generarse VEV recombinantes que portan proteínas novedosas en sus envueltas. Si estos están atenuados de manera apropiada, pueden usarse como vacunas contra otras enfermedades virales.

Los genomas truncados de partículas interferentes defectuosas se replican y empaquetan muy bien, por tanto, se sospecha que habrá flexibilidad también en la longitud máxima del genoma que puede empaquetarse. Presumiblemente, puede empaquetarse una nucleocápsida más larga como una partícula con forma de bala más larga. Debido a la naturaleza modular del genoma de VEV, con secuencias de iniciación y final de genes conservados en las uniones génicas (Rose y Schubert, 1987, en The Virus: The Rhabdoviruses, Plenum Publishing Corp., NY, págs. 129-166), debe ser relativamente fácil diseñar por ingeniería genética genes adicionales en VEV.

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7. Depósito de microorganismos

Se depositó el plásmido pVSVFL(+) el 2 de mayo de 1995 en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, según las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para fines de procedimientos de patente, y se le asignó el numero de registro 97134.

El alcance de la presente invención no está limitado por el microorganismo depositado o las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, resultarán evidentes para el experto en la técnica diversas modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Tales modificaciones están definidas por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

4

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Rose, John K.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VESICULOVIRUS RECOMBINANTES Y SUS USOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 41

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: PENNIE & EDMONDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1155 Avenue of the Americas

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 10036-2711

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: Por asignar

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: en la misma fecha que el presente documento

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(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Misrock, S. Leslie

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 18.872

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 6523-009-228

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (212) 790-9090

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (212) 869-9741/8864

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 66141 PENNIE

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14311 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 760..2025

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 2092..2886

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 2946..3632

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 3774..5306

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 5429..11755

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 422 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 265 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 229 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 511 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2109 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

29

30

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14311 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

34

35

36

37

38

39

40

41

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTAATACG ACTCACTATA GGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTAATACG ACTCACTATA GGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGAAGACAA ACAAACCATT ATTATCATTA AAAGGCTCAG GAGAAACTTT

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 136 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 630 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 630 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UCAGGAGAAA C

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' Gppp

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGUAAUC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUUACUGUU AAAGUUUCUC CUGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: polyA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCUACAUAUG

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' Gppp

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGAUAUC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUAUCUGUU AGUUUUUUUC AUAUGUAGC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: polyA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GUAGACUAUG

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' Gppp

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGAUAUC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUAUCUGUU ACUUUUUUUC AUAGUCUAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico.

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: polyA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UAUCCCUAUG

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' Gppp

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGAGAUC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUCUCUGW AGUUUUUUUC AUAGGGAUA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: polyA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAUUUUUAUG

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' Gppp

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGCAAUC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAWGCUGW AGUUUUUUUC AUAAAAAUU

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: polyA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UUUAAGUAUG

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAUCAAAG UUUUUUUCAU ACUUAAA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTCAAGAC GCTGCTTCGC AACTTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGAATGTT AACATCTCAA GA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: rasgo misceláneo

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 11..12

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: dinucleótido intergénico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUNNCUGUU ANUUUUUUUC AUA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UAUGAAAAAA A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

UUUUUUUCAU A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATGAAAAAA A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGCTCGAG TTGTAATACG ACTCACTATA GGGACGAAGA CAAACAAACC ATTATTATC

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACTCTCCT CTAGATGAGA AC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 58 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCGGACC GCGAGGAGGT GGAGATGCCA TGCCGACCCA CGAAGACCAC AAAACCAG

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTTGAAGA GTGACCTACA CG

\hfill

22

Claims

1. Un vesiculovirus replicable recombinante, que comprende las proteínas N, P y L de vesiculovirus y un ARN genómico de sentido (-) de vesiculorivus replicable, en el que dicho ARN genómico de sentido (-) se modifica mediante:

(a) la inserción de una secuencia de ARN extraño en una parte no esencial de dicho ARN genómico de sentido (-) de vesiculovirus replicable; o

(b) la sustitución de una parte no esencial de dicho ARN genómico de sentido (-) de vesiculovirus replicable por una secuencia de ARN extraño, en el que una secuencia de ARN complementaria a dicha secuencia de ARN extraño codifica un péptido o una proteína que inducirá una respuesta inmunitaria frente a dicho péptido o proteína cuando se expresa en un huésped adecuado infectado con dicho vesiculovirus replicable recombinante modificado.

2. El vesiculovirus según la reivindicación 1, en el que el péptido o la proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a, un antígeno de un microorganismo patógeno.

3. El vesiculovirus según la reivindicación 2, en el que el microorganismo patógeno es un virus.

4. El vesiculovirus según la reivindicación 2, en el que el microorganismo patógeno es una bacteria.

5. El vesiculovirus según la reivindicación 2, en el que el microorganismo patógeno es un parásito.

6. El vesiculovirus según la reivindicación 2, en el que el microorganismo patógeno es un patógeno humano.

7. El vesiculovirus según la reivindicación 2, en el que el microorganismo patógeno es un patógeno no humano.

8. El vesiculovirus según la reivindicación 1, en el que el péptido o proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a, un antígeno específico de tumor o asociado a tumor.

9. El vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es un virus de estomatitis vesicular.

10. El vesiculovirus según la reivindicación 2, en el que el péptido o la proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a, una glicoproteína de la envuelta de un virus diferente del vesiculovirus.

11. El vesiculovirus según la reivindicación 10, en el que la glicoproteína de la envuelta es una glicoproteína de la envuelta de un virus de la inmunodeficiencia humana.

12. El vesiculovirus según la reivindicación 10, en el que el péptido o la proteína se incorpora en la envuelta del vesiculovirus.

13. El vesiculovirus según la reivindicación 10, en el que el péptido o la proteína se expresa como una proteína de fusión que comprende el dominio citoplasmático de una proteína G de vesiculovirus.

14. El vesiculovirus según la reivindicación 10, en el que también se expresa la proteína G endógena del vesiculovirus.

15. El vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que una segunda secuencia de ARN complementaria a dicha secuencia de ARN extraño codifica un segundo péptido o proteína que se expresa en el huésped adecuado, en el que el primer péptido o proteína y el segundo péptido o proteína pueden unirse inmunoespecíficamente mediante anticuerpos a diferentes antígenos o provocar una respuesta inmunitaria frente a diferentes antígenos.

16. Una célula huésped que contiene el vesiculovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. La célula huésped según la reivindicación 16, que produce el vesiculovirus replicable recombinante modificado, conteniendo dicha célula huésped (a) un ácido nucleico recombinante que puede transcribirse para producir una molécula de ARN que comprende un ARN antigenómico (+) de vesiculovirus que contiene el promotor de vesiculovirus para la replicación, en el que una región del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus se ha insertado, o sustituido por, dicha secuencia de ARN extraño; (b) un segundo ácido nucleico recombinante que codifica una proteína N de vesiculovirus; (c) un tercer ácido nucleico recombinante que codifica una proteína L de vesiculovirus; y (d) un cuarto ácido nucleico recombinante que codifica una proteína P de vesiculovirus.

18. La célula huésped según la reivindicación 16, que produce el vesiculovirus replicable recombinante modificado, conteniendo dicha célula huésped:

(a) un primer vector de plásmido de ADN que comprende los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): un promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(ii): una primera secuencia de ADN que se transcribe en la célula para producir una molécula de ARN que comprende (A) un ARN antigenómico (+) de vesiculovirus en el que una región del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus se ha insertado, o sustituido por, dicha secuencia de ARN extraño, y (B) una secuencia de ribozima inmediatamente en sentido descendente con respecto a dicho ARN antigenómico (+), que rompe en el extremo 3' terminal del ARN antigenómico; y

(iii): una señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa

(b) un segundo vector de plásmido de ADN que comprende los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(ii): una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína N del vesiculovirus; y

(iii): una segunda señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa;

(c) un tercer vector de plásmido de ADN que comprende los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(ii): una tercera secuencia de ADN que codifica una proteína P del vesiculovirus; y

(iii): una tercera señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa;

(d) un cuarto vector de plásmido de ADN que comprende los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(ii): una cuarta secuencia de ADN que codifica una proteína L del vesiculovirus; y

(iii): una cuarta señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa; y

(e) un virus vaccinia recombinante que comprende una secuencia que codifica la ARN polimerasa de bacteriófago; mediante lo cual en dicha célula se transcribe la primera secuencia de ADN para producir dicha molécula de ARN, se expresan las proteínas N, P y L y la ARN polimerasa de bacteriófago, y se produce el vesiculovirus replicable recombinante modificado que tiene un genoma que es el complemento de dicho ARN antigenómico que comprende dicha secuencia de ARN extraño.

19. Una formulación de vacuna que comprende una cantidad del vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra el péptido o proteína; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para su uso como medicamento.

21. Un vesiculovirus según la reivindicación 20, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o un trastorno en un sujeto.

22. Un vesiculovirus según la reivindicación 21, en el que la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno provocado por un microorganismo patógeno.

23. Un vesiculovirus según la reivindicación 21, en el que la enfermedad o trastorno es un tumor.

24. Un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que el sujeto es un ser humano.

25. Un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que el sujeto es un animal no humano.

26. El uso de una cantidad inmunizante eficaz de un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno en un sujeto provocado por un microorganismo patógeno.

27. El uso de una cantidad inmunizante eficaz de un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un tumor en un sujeto.

28. El uso según la reivindicación 26 ó 27, en el que el sujeto es un ser humano.

29. El uso según la reivindicación 26 ó 27, en el que el sujeto es un animal no humano.

30. Un kit que comprende una cantidad del vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra el péptido o la proteína.

31. Un procedimiento de producción de un vesiculovirus replicable recombinante que comprende cultivar una célula que contiene

(a) un primer ácido nucleico recombinante que puede transcribirse para producir una molécula de ARN que comprende (A) un ARN (+) antigenómico de vesiculovirus y (B) una secuencia de ribozima inmediatamente en sentido descendente con respecto a dicho ARN (+) antigenómico, que rompe en el extremo 3' terminal del ARN (+) antigenómico, en el que una secuencia de ARN extraño se inserta dentro o sustituye a una región del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus, teniendo dicho primer ácido nucleico recombinante los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): un primer promotor;

(ii): una primera secuencia de ADN que puede transcribirse bajo el control del primer promotor en la célula para producir dicha molécula de ARN; y

(iii): una primera señal de terminación de la transcripción;

(b) un segundo ácido nucleico recombinante que codifica una proteína N de vesiculovirus y que tiene los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): un segundo promotor que controla la expresión de la proteína N;

(ii): una primera señal de iniciación de la traducción;

(iii): una segunda secuencia de ADN que codifica la proteína N; y

(iv): una segunda señal de terminación de la transcripción;

(c) un tercer ácido nucleico recombinante que codifica una proteína L de vesiculovirus y que tiene los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): un tercer promotor que controla la expresión de la proteína L;

(ii): una segunda señal de iniciación de la traducción;

(iii): una tercera secuencia de ADN que codifica la proteína L; y

(iv): una tercera señal de terminación de la transcripción;

(d) un cuarto ácido nucleico recombinante que codifica una proteína P de vesiculovirus y que tiene los siguientes componentes operativamente unidos:

(i): un cuarto promotor que controla la expresión de la proteína P;

(ii): una tercera señal de iniciación de la traducción;

(iii): una cuarta secuencia de ADN que codifica la proteína P; y

(iv): una cuarta señal de terminación de la transcripción;

mediante lo cual se transcribe el primer ácido nucleico recombinante en la célula para producir dicha molécula de ARN y se expresan las proteínas N, L y P en la célula, y se produce un vesiculovirus replicable recombinante que tiene un genoma que es el complemento de dicho ARN antigenómico que comprende dicha secuencia de ARN extraño, en el que dicha secuencia de ARN extraño codifica un péptido o una proteína que se expresa e induce una respuesta inmunitaria frente a dicho péptido o proteína en un huésped adecuado infectado por el vesiculovirus.

32. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que la célula es una célula de mamífero.

33. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que el primer ácido nucleico recombinante es un vector de plásmido de ADN.

34. El procedimiento según la reivindicación 31 ó 33, en el que el segundo ácido nucleico recombinante es un vector de plásmido de ADN; y en el que el tercer ácido nucleico recombinante es un vector de plásmido de ADN; y en el que el cuarto ácido nucleico recombinante es un vector de plásmido de ADN.

35. El procedimiento según la reivindicación 34, en el que el primer ácido nucleico recombinante, el segundo ácido nucleico recombinante, el tercer ácido nucleico recombinante y el cuarto ácido nucleico recombinante comprenden cada uno además un marcador seleccionable.

36. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que el segundo, tercero y cuarto ácidos nucleicos recombinantes forman parte de un único ácido nucleico recombinante que no contiene tampoco dicho primer ácido nucleico recombinante.

37. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias promotoras son secuencias promotoras de la ARN polimerasa para la misma ARN polimerasa, y en el que la célula también contiene una fuente citoplasmática de dicha ARN polimerasa.

38. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la fuente citoplasmática de dicha ARN polimerasa es un virus vaccinia recombinante que expresa dicha ARN polimerasa en la célula.

39. Un procedimiento de producción de un vesiculovirus replicable recombinante que comprende cultivar una célula de mamífero que contiene:

(i): un promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(ii): una primera secuencia de ADN que se transcribe en la célula para producir una molécula de ARN que comprende (A) un ARN (+) antigenómico de vesiculovirus, en la que una secuencia de ARN extraño se inserta dentro o sustituye a una región del ARN no esencial para la replicación del vesiculovirus, y (B) una secuencia de ribozima inmediatamente en sentido descendente con respecto a dicho ARN (+) antigenómico, que rompe en el extremo 3' terminal del ARN antigenómico; y

(iii): una señal de terminación de la transcripción para la ARN polimerasa;

(i): el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(i): el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(i): el promotor de la ARN polimerasa de bacteriófago;

(e) un virus vaccinia recombinante que comprende una secuencia que codifica la ARN polimerasa de bacteriófago; mediante lo cual se transcribe en dicha célula la primera secuencia de ADN para producir dicha molécula de ARN, se expresan las proteínas N, P y L y la ARN polimerasa de bacteriófago, y se produce un vesiculovirus replicable recombinante que tiene un genoma que es el complemento de dicho ARN antigenómico que comprende dicha secuencia de ARN extraño, en el que dicha secuencia de ARN extraño codifica un péptido o una proteína que se expresa e induce una respuesta inmunitaria frente a dicho péptido o proteína en un huésped adecuado infectado por el vesiculovirus.

40. El procedimiento según la reivindicación 39, en el que la secuencia de ribozima es la secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis delta y la ARN polimerasa de bacteriófago es la ARN polimerasa de T7.

41. El procedimiento según la reivindicación 31 ó 39, en el que la proteína o el péptido puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a, un antígeno de un microorganismo patógeno.

42. El procedimiento según la reivindicación 31 ó 39, en el que la proteína o el péptido puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a, un antígeno específico de tumor.

43. El procedimiento según la reivindicación 39, que comprende además antes de la etapa (a) la etapa de introducir dicho primer, segundo, tercer y cuarto vectores de plásmido y dicho virus vaccinia recombinante en dicha célula.

44. Un vesiculovirus recombinante inactivado que es el producto de un procedimiento que comprende inactivar un vesiculovirus replicable recombinante, comprendiendo dicho vesiculovirus replicable recombinante las proteína N, P y L de vesiculovirus y un ARN genómico de sentido (-) de vesiculovirus replicable, en el que dicho ARN genómico de sentido (-) se modifica mediante:

(b) la sustitución de una parte no esencial de dicho ARN genómico de sentido (-) de vesiculovirus replicable por una secuencia de ARN extraño, en el que una secuencia de ARN complementaria a dicha secuencia de ARN extraño codifica un péptido o una proteína que inducirá una respuesta inmunitaria frente a dicho péptido o proteína cuando se expresa en un huésped adecuado infectado con dicho vesiculovirus replicable recombinante.

45. El vesiculovirus según la reivindicación 44, en el que el péptido o la proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno de un microorganismo patógeno.

46. El vesiculovirus según la reivindicación 44, en el que el péptido o la proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a un antígeno asociado a tumor o específico de tumor.

47. El vesiculovirus según la reivindicación 44, en el que una segunda secuencia de ARN complementaria a dicha secuencia de ARN extraño codifica un segundo péptido o proteína que se expresa en el huésped adecuado, en el que el primer péptido o proteína y el segundo péptido o proteína pueden unirse inmunoespecíficamente mediante anticuerpos a diferentes antígenos o provocar una respuesta inmunitaria frente a diferentes antígenos.

48. El vesiculovirus según la reivindicación 44, en el que el péptido o la proteína puede unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo a, o provocar una respuesta inmunitaria frente a una glicoproteína de la envuelta de un virus diferente de un vesiculovirus.

49. El vesiculovirus según la reivindicación 48, en el que la glicoproteína de la envuelta es una glicoproteína de la envuelta de un virus de la inmunodeficiencia humana.

50. El vesiculovirus según la reivindicación 48, en el que el péptido o la proteína se expresa como una proteína de fusión que comprende el dominio citoplasmático de una proteína G de vesiculovirus.

51. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad del vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra el péptido o la proteína en un mamífero; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

52. Un kit que comprende en un recipiente una cantidad del vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, eficaz para inducir una respuesta inmunitaria contra el péptido o la proteína en un mamífero.

53. Un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, para su uso como medicamento.

54. Un vesiculovirus según la reivindicación 53, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o un trastorno en un sujeto.

55. Un vesiculovirus según la reivindicación 54, en el que la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno provocado por un microorganismo patógeno.

56. Un vesiculovirus según la reivindicación 54, en el que la enfermedad o el trastorno es un tumor.

57. Un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 54 a 56, en el que el sujeto es un ser humano.

58. Un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 54 a 56, en el que el sujeto es un animal no humano.

59. El uso de una cantidad inmunizante eficaz de un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno en un sujeto provocado por un microorganismo patógeno.

60. El uso de una cantidad inmunizante eficaz de un vesiculovirus según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un tumor en un sujeto.

61. El uso según la reivindicación 59 ó 60, en el que el sujeto es un ser humano.

62. El uso según la reivindicación 59 ó 60, en el que el sujeto es un animal no humano.