ES2213743T3 - Vacuna de subunidad de coronavirus canino. - Google Patents
Vacuna de subunidad de coronavirus canino.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA DE ESPIGAS DE CANINE CORONAVIRUS (CCV). TAL PROTEINA SE PUEDE UTILIZAR PARA LA INMUNIZACION DE PERROS CONTRA LA INFECCION DE CCV. LA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA PROTEINA DE ESPIGAS DE CCV SE PUEDE APLICAR PARA LA PREPARACION DE LA PROTEINA DE ESPIGAS MEDIANTE TECNICAS DE INGENIERIA GENETICA O SE PUEDE APLICAR PARA LA PREPARACION DE VACUNAS DE VECTORES.
Description
Vacuna de subunidad de coronavirus canino.
La presente invención se refiere a una secuencia
de ácido nucleico que codifica una proteína con proyecciones de CCV,
a un vector recombinante o un virus de vector recombinante que
comprende tal secuencia de ácido nucleico, a una célula hospedadora
transformada con tal vector recombinante o infectada con el virus de
vector recombinante, así como a una vacuna contra la infección por
CCV en perros.
El coronavirus canino (CCV) es un miembro de la
familia vírica bien caracterizada de los Coronavirus. Se sabe que
los virus que pertenecen a este género infectan a una diversidad de
especies animales, incluyendo al hombre. Causan diversas
enfermedades tales como gastroenteritis (en cerdos, pavos, ratones,
terneros, perros, gatos y hombres), infecciones de las glándulas
salivares (en roedores), enfermedades respiratorias (en hombres,
cerdos, aves y perros) y encefalitis (en cerdos jóvenes).
El CCV se aisló por primera vez en perros
militares en Alemania en 1971 y se ha descubierto que es altamente
contagioso y que se propaga rápidamente entre perros susceptibles.
Normalmente, el CCV se ingiere con materiales contaminados por heces
infectadas. La infección oral conduce a la replicación del virus en
las células epiteliales del intestino delgado y también se ha
descubierto CCV en los ganglios linfáticos intestinales.
Los síntomas de la enfermedad se pueden
desarrollar 1-3 días después de la infección e
incluyen vómitos, diarrea, anorexia, depresión y deshidratación. La
persistencia y gravedad de los signos está relacionada habitualmente
con el estrés y la presencia de otros virus, parásitos o bacterias.
Aunque los síntomas entéricos son predominantes, también se ha
informado de signos respiratorios incluyendo descarga nasal y
ocular.
Los perros son el único hospedador conocido del
CCV. Aunque la inoculación de CCV en gatos y cerdos tiene como
resultado la infección, el CCV no provoca ninguna enfermedad clínica
en estas especies. No existen indicios de que los seres humanos, el
ganado ni los ratones sean susceptibles al CCV.
Los estudios de protección cruzada han demostrado
que los Coronavirus inducen poca o ninguna inmunidad entre sí. Por
ejemplo, la infección experimental de perros con el virus de la
gastroenteritis transmisible (TGEV) del cerdo o el virus de la
peritonitis infecciosa felina (FIPV) del gato no les protege frente
a los efectos de una infección posterior con CCV.
Los Coronavirus constan de un grupo de virus con
envuelta que contienen un genoma que consta de ARN monocatenario de
aproximadamente 30 kb. Este genoma codifica, entre otras, tres
proteínas estructurales importantes: una proteína con proyecciones
(S), una proteína de membrana (M) y una proteína de la nucleocápsida
(N). La proteína de proyecciones glicosilada S_{o} se escinde para
formar S_{1} y S_{2} en algunos coronavirus. Dos o tres copias
de cada una de S_{1} y S_{2} forman una estructura
característica en la superficie del CCV, la proyección o peplómero.
La proteína de las proyecciones y los polipéptidos constituyentes de
la misma tienen un papel importante en la inducción de una
respuesta inmune que neutralice el virus en los animales
infectados.
Las vacunas convencionales de CCV comprenden
vacunas con virus inactivados químicamente o vacunas con virus vivos
modificados. Sin embargo, las vacunas inactivadas requieren
inmunizaciones adicionales, contienen desfavorablemente adyuvantes y
son caras de producir. Además, algunas partículas víricas
infecciosas pueden sobrevivir al proceso de inactivación y pueden
provocar la enfermedad después de la administración al animal.
En general, se prefieren vacunas con virus vivos
atenuados porque provocan una respuesta inmune que se basa
habitualmente en reacciones tanto humorales como celulares. Hasta el
momento, tales vacunas basadas en cepas de CCV sólo se pueden
preparar mediante el paso en serie de cepas virulentas en cultivo de
tejidos. Sin embargo, debido a este tratamiento se introducen
mutaciones incontroladas en el genoma vírico, teniendo como
resultando una población de partículas víricas heterogéneas en su
virulencia y en sus propiedades de inmunización. Además, es bien
conocido que tales vacunas de virus vivos atenuados tradicionales
pueden volver a ser virulentas causando la enfermedad en animales
inoculados y la posible propagación del patógeno a otros
animales.
Se podrían construir vacunas mejoradas basándose
en la tecnología de ADN recombinante, que sólo contuvieran el
material inmunogénico de CCV necesario y relevante capaz de provocar
una respuesta inmune contra los patógenos de CCV, o que contuviera
la información genética que codifica dicho material y no mostrara
los inconvenientes mencionados anteriormente para las vacunas vivas
o inactivadas.
En el documento EP295057 se describe una vacuna
del CCV que comprende la proteína de peplómero de CCV asociada a
células. El peplómero asociado a células descrito en el documento
EP295057 se puede obtener infectando un cultivo celular con CCV y
rompiendo las células cultivadas para recoger la proteína de
peplómero asociada a las células.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada y purificada que
codifica un polipéptido que tiene uno o más determinantes
inmunogénicos de una proteína de proyecciones de CCV que se puede
aplicar para la preparación de una vacuna para la inmunización de
perros contra la infección por CCV.
"Secuencia de ácido nucleico", como se usa
en este documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos
de cualquier longitud, tanto a secuencias de ácido ribonucleico como
a secuencias de ácido desoxirribonucleico. En principio, este
término se refiere a la estructura primaria de la molécula. De esta
forma, este término incluye ADN mono y bicatenario, así como ARN
mono y bicatenario y modificaciones de los mismos.
En general, el término "polipéptido" se
refiere a una cadena molecular de aminoácidos con una actividad
biológica, no se refiere a una longitud específica del producto y,
si se necesita, se puede modificar in vivo o in
vitro, por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación
o fosforilación; por lo tanto, están incluidos, entre otros,
péptidos, oligopéptidos y proteínas.
La expresión "polipéptido con uno o más
determinantes inmunogénicos de una proteína de proyecciones de
CCV" se refiere a un polipéptido con uno o más epítopos que puede
provocar una respuesta inmune protectora en un perro frente a una
enfermedad o infección por CCV.
En particular, la presente invención proporciona
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que
tiene uno o más determinantes inmunogénicos de la proteína de
proyecciones de CCV que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada
en la SEC ID NO: 2, 4 ó 6.
También se incluyen dentro del alcance de la
presente invención secuencias de ácido nucleico que codifican una
variante funcional del polipéptido mostrado en la SEC ID NO: 2, 4 ó
6. Estas variantes funcionales son polipéptidos que tienen una
secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos
descrita específicamente en la SEC ID NO: 2, 4 ó 6, pero conservan
uno o más determinantes inmunogénicos de una proteína de
proyecciones de CCV, es decir, dichas variantes tienen uno o más
epítopos que pueden provocar una respuesta inmune protectora en un
perro frente a la infección o enfermedad por CCV.
Debe apreciarse que para el polipéptido
particular incluido en este documento, derivado de la cepa
CCV-6, Insavc-1 o Liverpool C54,
pueden existir variaciones naturales entre virus concretos o cepas
de coronavirus caninos. Estas variaciones pueden demostrarse por
diferencia(s) de aminoácidos en la secuencia global o por
deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de
uno o varios aminoácidos en dicha secuencia. Se han descrito las
sustituciones de aminoácidos que se espera que no alteren
sustancialmente la actividad biológica e inmunológica. Las
sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o las
sustituciones que han tenido lugar habitualmente en la evolución
son, entre otras Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase
Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed.
Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Basándose en
esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la
comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 277,
1435-1441, 1985) y para determinar la similitud
funcional entre polipéptidos homólogos. Las secuencias de ácido
nucleico que codifican tales variantes funcionales homólogas están
incluidas dentro del alcance de esta invención. Además, existe el
potencial de usar la tecnología de ADN recombinante para la
preparación de secuencias de ácido nucleico que codifican estas
distintas variantes funcionales.
Las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con
la invención pueden proceder de aislados de cepas de CCV tales como
CCV-6, Insavc-1 (documento EP
396.193), CCV 1-71 (ATCC VR-809) o
CCV TN449 (ATCC VR-2068).
En otro aspecto de la invención, se proporcionan
secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente que se pueden
usar para la preparación de una vacuna para proteger a gatos contra
la infección por FIPV.
La información que se proporciona en la SEC ID
NO: 1-6 permite al especialista en la técnica aislar
e identificar las secuencias de ácido nucleico que codifican los
distintos polipéptidos con variantes funcionales mencionados
anteriormente que tienen características inmunológicas equivalentes
a las de la proteína de proyecciones de CCV descrita
específicamente en este documento. Para este propósito se puede usar
la técnica de transferencia de Southern que se aplica generalmente
o la hibridación de colonias (Experiments in Molecular Biology, ed.
R.J. Slater, Clifton, U.S.A., 1986; Singer-Sam, J.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80,
802-806, 1983; Maniatis T. et al., Molecular
Cloning, A laboratory Manual, segunda edición; Cold Spring Harbor
Laboratory Press, USA, 1989). Por ejemplo, el ARN o ADNc derivado
de una cepa específica de CCV se somete a electroforesis y
posteriormente se transfiere ("blotted") a una pieza de filtro
de nitrocelulosa. Entonces es posible identificar las secuencias de
ácido nucleico de la proteína de proyecciones de CCV en el filtro
por hibridación con un fragmento definido de ADN marcado o
"sonda", es decir, un fragmento de secuencia poli- u
oligonucleotídica (sintética) de la secuencia de ácido nucleico que
se muestra en la SEC ID NO: 1, 3 ó 5 que, en condiciones
específicas de concentración de sal y temperatura hibrida con las
secuencias homólogas de ácido nucleico presentes en el filtro.
Después de lavar el filtro, el material hibridado se puede detectar
por autorradiografía. Después, el fragmento de ADN correspondiente
se puede eluir del gel de agarosa y usarse para dirigir la síntesis
de una variante funcional del polipéptido descrito en la SEC ID NO:
2, 4 ó 6.
Por lo tanto, una variante funcional preferida de
acuerdo con la invención es un polipéptido que comprende uno o más
determinantes inmunogénicos de una proteína de proyecciones de CCV y
se codifica por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con la
secuencia de ADN que se muestra en la SEC ID NO: 1, 3 ó 5.
De otra forma, el ADNc de CCV se puede clonar en
un fago \kappagt11 como se describe en Huynh et al. (En: D.
Glover (ed.), DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press Oxford,
49-78, 1985) y expresarse en un hospedador
bacteriano. Después, los fagos recombinantes se pueden seleccionar
con suero policlonal inducido contra la proteína de proyecciones de
CCV purificada descrita en la SEC ID NO: 2, 4 ó 6 determinando la
presencia de las regiones inmunológicas correspondientes del
polipéptido variante. A continuación se describe la producción del
suero policlonal que se usa en este documento inducido contra la
proteína de proyecciones de CCV.
Como es bien conocido en la técnica, la
degeneración del código genético permite la sustitución de bases en
un codón dando como resultado otro codón pero que codifica el mismo
aminoácido, por ejemplo, el codón del aminoácido ácido glutámico es
GAT y GAA. Por consiguiente, es evidente que para la expresión de un
polipéptido con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC
ID NO: 2, 4 ó 6, se puede hacer uso de una secuencia de ácido
nucleico derivada con tal composición de codones alternativa
distinta de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID
NO: 1, 3 ó 5 respectivamente.
Además, los fragmentos de las secuencias de ácido
nucleico que codifican la proteína de proyecciones de CCV descrita
específicamente o las variantes funcionales de las mismas también
están incluidos en la presente invención.
El término "fragmento", como se usa en este
documento, se refiere a una secuencia de ADN o de aminoácidos que
comprende una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico o del
polipéptido de la invención. Dicho fragmento es, o codifica un
polipéptido que tiene uno o más determinantes inmunogénicos de una
proteína de proyecciones de CCV, es decir, tiene uno o más epítopos
que pueden provocar una respuesta inmune protectora en un perro. A
continuación se describen métodos para determinar fragmentos de
polipéptidos utilizables. Los fragmentos se pueden producir, entre
otros procesos, por escisión enzimática de moléculas precursoras,
usando endonucleasas de restricción para el ADN y proteasas para los
polipéptidos. Otros métodos incluyen la síntesis química de los
fragmentos o la expresión de fragmentos polipeptídicos por
fragmentos de ADN.
Las secuencias típicas que codifican precursores
de la proteína de proyecciones de CCV se muestran en las SEC ID NO:
1, 3 y 5. Estas secuencias de ADNc tienen una longitud de
aproximadamente 4328, 4352 y 4358 nucleótidos, respectivamente, y
codifican un polipéptido de 1443, 1451 y 1453 aminoácidos,
respectivamente.
Una secuencia de ácido nucleico preferida de
acuerdo con la invención se caracteriza porque dicha secuencia
contiene al menos parte de la secuencia de ADN descrita en la SEC ID
NO: 1, 3 ó 5.
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la
invención se puede aislar a partir de una cepa particular de CCV y
multiplicarse por técnicas de ADN recombinante incluyendo la
tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o se puede
sintetizar químicamente in vitro por métodos conocidos en la
técnica.
Todas las modificaciones que tienen como
resultado las variantes funcionales mencionadas anteriormente del
polipéptido ejemplificado específicamente están incluidas dentro
del alcance de la presente invención siempre que los polipéptidos
resultantes conserven uno o más determinantes inmunogénicos de una
proteína de proyecciones de CCV.
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la
presente invención se puede ligar a diversas secuencias de ADN que
efectúan la replicación con las que no se asocia o se une de forma
natural, dando como resultado la denominada molécula de vector
recombinante que se puede usar para la transformación de un
hospedador adecuado. Las moléculas de vector recombinante útiles
derivan preferiblemente de, por ejemplo, plásmidos, bacteriófagos,
cósmidos o virus.
Los vectores específicos o vehículos de clonación
que se pueden usar para clonar secuencias de ácido nucleico de
acuerdo con la invención son conocidos en la técnica e incluyen,
entre otros, vectores plasmídicos tales como pBR322, los diversos
plásmidos pUC, pGEM y Bluescript, bacteriófagos, por ejemplo,
\kappagt-Wes, Charon 28 y los fagos derivados de
M13 o vectores virales tales como SV40, adenovirus o virus del
polioma (véase también Rodriguez, R.L. y D.T. Denhardt, ed.,
Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses,
Butterworths, 1988; Lenstra, J.A. et al., Arch. Virol.
110, 1-24, 1990). Los especialistas
habituales en la técnica conocen los métodos que se usan para la
construcción de una molécula de vector recombinante de acuerdo con
la invención y se describen, entre otros textos, en Maniatis, T.
et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda
edición; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Por ejemplo, la inserción de la secuencia de
ácido nucleico de acuerdo con la invención en un vector de clonación
se puede realizar fácilmente cuando los genes y el vehículo de
clonación deseado se han cortado con la misma o las mismas enzimas
de restricción, ya que se producen extremos de ADN
complementarios.
Como alternativa, puede ser necesario modificar
los sitios de restricción que se producen en los extremos romos
digiriendo el ADN monocatenario o rellenando los extremos
monocatenarios con una ADN polimerasa apropiada. Posteriormente, se
puede realizar la unión de los extremos romos con una enzima tal
como la ADN ligasa de T4.
Si se desea, se puede producir cualquier sitio de
restricción uniendo engarces al extremo de ADN. Tales engarces
pueden comprender secuencias específicas de oligonucleótidos que
codifican secuencias de sitios de restricción. El vector escindido
con la enzima de restricción y la secuencia de ácido nucleico
también se pueden modificar por la adición de colas
homopoliméricas.
El término "transformación", como se usa en
este documento, se refiere a la introducción de una secuencia
heteróloga de ácido nucleico en una célula hospedadora,
independientemente del método usado, por ejemplo, la captación
directa o transducción. La secuencia heteróloga de ácido nucleico se
puede mantener mediante replicación autónoma o, como alternativa, se
puede integrar en el genoma del hospedador. Si se desea, las
moléculas de vector recombinante se proporcionan con secuencias de
control apropiadas compatibles con el hospedador designado que
pueden regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico
insertada. Además de microorganismos, también se pueden usar como
hospedadores cultivos de células derivadas de organismos
multicelulares.
Las moléculas de vector recombinante de acuerdo
con la invención contienen preferiblemente una o más actividades de
marcaje que se pueden usar para seleccionar los transformantes
deseados, tales como resistencia a ampicilina y tetraciclina en
pBR322, resistencia a ampicilina y actividad
\beta-galactosidasa en pUC8.
Una célula hospedadora adecuada es un
microorganismo o célula que se puede transformar con una secuencia
de ácido nucleico que codifica un polipéptido o con una molécula de
vector recombinante que comprende tal secuencia de ácido nucleico y
que si, se desea, se puede usar para expresar dicho polipéptido
codificado por dicha secuencia de ácido nucleico. La célula
hospedadora puede ser de origen procariótico, por ejemplo bacterias
tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis y
especies de Pseudomonas; o de origen eucariótico tales como
levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae o células
eucarióticas superiores tales como células de insectos, plantas o
mamíferos, incluyendo células HeLa y células de ovario de hámster
chino (CHO). Las células de insectos incluyen la línea celular Sf9
de Spodoptera frugiperda (Luckow et al.,
Bio-technology 6, 47-55,
1988). La información con respecto a la clonación y expresión de la
secuencia de ácido nucleico de la presente invención en sistemas de
clonación eucarióticos se puede encontrar en Esser, K. et
al. (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag,
1986).
En general, se prefieren procariotas para la
construcción de las moléculas de vector recombinante útiles en la
invención. Por ejemplo, son particularmente útiles cepas K12 de
E. coli tales como DH5\alpha o JM101.
Para la expresión, se introducen las secuencias
de ácido nucleico de la presente invención en un vector de
expresión, es decir, dichas secuencias se unen operativamente a
secuencias de control de expresión. Tales secuencias de control
pueden comprender promotores, potenciadores, operadores, inductores,
sitios de unión a ribosomas, etc. Por lo tanto, la presente
invención proporciona una molécula de vector recombinante que
comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína
de proyecciones de CCV unida operativamente a secuencias de control
de la expresión, que puede expresar las secuencias de ADN
contenidas en la misma en células hospedadoras transformadas.
Por supuesto, debe apreciarse que las secuencias
de nucleótidos insertadas en el sitio seleccionando del vector de
clonación pueden incluir nucleótidos que no son parte del gen
estructural real del polipéptido deseado o pueden incluir solamente
un fragmento del gen estructural completo de la proteína deseada
siempre que el hospedador transformado produzca un polipéptido que
tenga al menos uno o más determinantes inmunogénicos de una proteína
de proyecciones de CCV.
Cuando las células hospedadoras son bacterias,
las secuencias de control de la expresión útiles ilustrativas
incluyen el promotor y operador Trp (Goeddel, et al., Nucl.
Acids Res. 8, 4057, 1980); el promotor y operador lac
(Chang, et al., Nature 275, 615, 1978); el promotor
de la proteína de membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, M., EMBO
J. 1, 771-775, 1982); los promotores y
operadores del bacteriófago \kappa (Remaut, E. et al.,
Nucl. Acids Res. 11, 4677-4688, 1983); el
promotor y operador de la \alpha-amilasa (B.
subtilis), la secuencia de terminación y otras secuencias de
control y potenciación de la expresión compatibles con la célula
hospedador seleccionada. Cuando la célula hospedadora es una
levadura, las secuencias de control de la expresión útiles
ilustrativas incluyen, por ejemplo, el factor de acoplamiento
\alpha. Para las células de insectos se pueden usar la
polihedrina o los promotores p10 de baculovirus (Smith, G.E. et
al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983).
Si la célula hospedadora procede de un mamífero, las secuencias de
control de la expresión útiles ilustrativas incluyen, por ejemplo,
el promotor de SV-40 (Berman, P.W. et al.,
Science 222, 524-527, 1983) o, por ejemplo,
el promotor de la metalotioneína (Brinster, R.L., Nature
296, 39-42, 1982) o un promotor de choque
térmico (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82, 4949-53, 1985). Para la maximización de
la expresión del gen, véase también Roberts y Lauer (Methods in
Enzymology 68, 473, 1979).
Por lo tanto, la invención también comprende una
o más células hospedadoras transformadas con una secuencia de ácido
nucleico o una molécula de vector de expresión recombinante descrita
anteriormente, que puede producir la proteína de proyecciones de CCV
por expresión de la secuencia de ácido nucleico.
La presente invención también proporciona un
proceso para la preparación de un polipéptido purificado que muestra
características inmunológicas de una proteína de proyecciones de
CCV, es decir, el polipéptido tiene uno o más determinantes
inmunogénicos de una proteína de proyecciones de CCV, y carece
esencialmente de virus completos u otras proteínas con las que se
asocia habitualmente.
Más particularmente, la invención proporciona un
proceso para la preparación de un polipéptido que comprende al menos
parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2, 4
ó 6 o una variante funcional de la misma.
En la presente invención también se prepara un
polipéptido que comprende sustancialmente un fragmento inmunogénico
de la proteína de proyecciones de CCV que se puede usar para
inmunizar perros contra la infección por CCV o con fines de
diagnóstico. Se conocen distintos métodos para detectar tales
fragmentos inmunogénicos utilizables dentro de una secuencia de
aminoácidos.
Los fragmentos de polipéptidos inmunoquímicamente
activos adecuados de un polipéptido de acuerdo con la invención que
contienen uno o más epítopos se pueden encontrar por medio del
método descrito en la Solicitud de Patente WO 86/06487, Geysen, H.M.
et al. (Prod. Natl. Acad. Sci. 81,
3998-4002, 1984), Geysen, H.M. et al. (J.
Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987) que se
basa el denominado método pep-scan, en el que se
sintetiza una serie de péptidos que solapan parcialmente con
secuencias parciales del polipéptido completo en cuestión y se
investiga su reactividad con anticuerpos.
Además, varias regiones del polipéptido, con la
secuencia de aminoácidos descrita, se pueden denominar epítopos
basándose en consideraciones teóricas y la concordancia estructural
con los epítopos que se conocen en la actualidad. La determinación
de estas regiones se basa en una combinación de los criterios de
hidrofilia de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci.
78, 3824-3828, 1981) y los aspectos de la
estructura secundaria de acuerdo con Chou y Fasman (Advances in
Enzymology 47, 45-148, 1987).
Teóricamente, los epítopos de células T que
pueden ser necesarios se pueden obtener de forma similar, por
ejemplo, con la ayuda del criterio de anfifilia de Berzofsky.
(Science 235, 1059-62, 1987).
En otra realización de la invención se usa un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por
una secuencia de ácido nucleico mencionada anteriormente.
La inmunización de perros contra la infección por
CCV se puede realizar, por ejemplo, administrando a los animales un
polipéptido preparado de acuerdo con el proceso mencionado
anteriormente en un contexto inmunológicamente relevante en forma de
la llamada vacuna de subunidad. La vacuna de subunidad de acuerdo
con la invención puede comprender un polipéptido en forma pura,
opcionalmente en presencia de un vehículo farmacéuticamente
aceptable. El polipéptido puede estar opcionalmente unido
covalentemente a una proteína no relacionada, que puede ser, por
ejemplo, ventajosa en la purificación del producto de fusión. Son
algunos ejemplos \beta-galactosidasa, proteína A,
proquimosina, factor Xa de la coagulación sanguínea, etc.
En algunos casos, la capacidad para generar
anticuerpos neutralizadores frente a estos polipéptidos per
se puede ser baja. Preferiblemente, se conjugan pequeños
fragmentos con moléculas de vehículo para aumentar su
inmunogenicidad. Los vehículos apropiados para este fin son
macromoléculas, tales como polímeros naturales (proteínas tales como
hemocianina de la lapa californiana, albúmina, toxinas), polímeros
sintéticos tales como poliaminoácidos (polilisina, polialanina) o
micelas de compuestos anfífilos tales como saponinas. Como
alternativa, estos fragmentos se pueden proporcionar como polímeros
de los mismos, preferiblemente polímeros lineales.
Los polipéptidos a usar en tales vacunas de
subunidad se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica,
por ejemplo, aislando dichos polipéptidos a partir de CCV, por
técnicas de ADN recombinante o por síntesis química.
Si se desea, estos polipéptidos a usar en una
vacuna se pueden modificar in vitro o in vivo, por
ejemplo por glicosilación, amidación, carboxilación o
fosforilación.
Una alternativa a las vacunas de subunidad son
vacunas de vector vivo. Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo
con la invención se introduce por medio de técnicas de ADN
recombinante dentro de un microorganismo (por ejemplo, una bacteria
o un virus) de tal forma que el microorganismo recombinante todavía
pueda replicarse expresando de esta manera un polipéptido codificado
por la secuencia de ácido nucleico insertada y provocando una
respuesta inmune en el animal hospedador infectado.
Una realización preferida de la presente
invención es un virus de vector recombinante que comprende una
secuencia heteróloga de ácido nucleico descrita anteriormente, que
puede expresar la secuencia de ADN en una o más células hospedadoras
o en un animal hospedador infectado con el virus de vector
recombinante. El término "heterólogo" indica que la secuencia
de ácido nucleico de acuerdo con la invención no está presente
normalmente de forma natural en el virus de vector.
Además, la invención también comprende una o más
células hospedadoras o cultivo celular infectado con el virus de
vector recombinante, que puede producir la proteína de CCV por
expresión de la secuencia de ácido nucleico.
Se puede usar, por ejemplo, la técnica bien
conocida de recombinación homóloga in vivo para introducir
una secuencia heteróloga de ácido nucleico, por ejemplo, una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en el
genoma del virus del vector.
Primero se inserta un fragmento de ADN que
corresponde a una región de inserción del genoma del vector, es
decir, una región que se puede usar para la incorporación de una
secuencia heteróloga sin interrumpir las funciones esenciales del
vector tales como las necesarias para la infección o replicación,
en un vector de clonación de acuerdo con técnicas convencionales de
ADNrec. Se han descrito regiones de inserción para un gran número de
microorganismos (por ejemplo, en los documentos EP 80.806, EP
110.385, EP 83.286, US 4.769.330 y US 4.722.848).
En segundo lugar, si se desea, se puede
introducir una deleción en la región de inserción presente en la
molécula de vector recombinante obtenida en la primera etapa. Esto
se puede conseguir, por ejemplo, por digestión con una exonucleasa
III apropiada o por tratamiento con una enzima de restricción de la
molécula de vector recombinante de la primera etapa.
En tercer lugar, la secuencia heteróloga de ácido
nucleico se inserta en la región de inserción presente en la
molécula de vector recombinante de la primera etapa o en lugar del
ADN delecionado de dicha molécula de vector recombinante. La
secuencia de ADN de la región de inserción debe ser de una longitud
apropiada para permitir que tenga lugar la recombinación homóloga
con el genoma del vector.
Posteriormente, las células adecuadas se pueden
infectar con virus de vector de tipo silvestre o transformarse con
ADN genómico del vector en presencia de la molécula de vector
recombinante que contiene la inserción flanqueada por las secuencias
apropiadas de ADN del vector, donde la recombinación tiene lugar
entre las regiones correspondientes en la molécula de vector
recombinante y el genoma del vector. Entonces puede producirse la
progenie del vector recombinante en cultivo celular y se puede
seleccionar por ejemplo genotípicamente o fenotípicamente, por
ejemplo, por hibridación, detectando la actividad enzimática
codificada con un gen co-integrado junto con la
secuencia heteróloga de ácido nucleico, o detectando el polipéptido
antigénico heterólogo expresado inmunológicamente por el vector
recombinante.
Después, este microorganismo recombinante se
puede administrar a los perros para su inmunización, después de lo
cual se mantiene durante algún tiempo, o incluso se replica, en el
cuerpo del animal inoculado, expresando in vivo un
polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico insertada
de acuerdo con la invención, obteniéndose como resultado la
estimulación del sistema inmune del animal inoculado. Los vectores
adecuados para la incorporación de una secuencia de ácido nucleico
de acuerdo con la invención pueden proceder de virus tales como
poxvirus, por ejemplo virus de vaccinia (documentos EP 100.395, EP
83.286, US 4.769.330 y US 4.722.848), virus del herpes tales como el
virus del Herpes Felino, adenovirus (canino) (documento WO 91/11525)
o virus de la influenza, o bacterias tales como E. coli o
especies específicas de Salmonella. Con microorganismos
recombinantes de este tipo, el polipéptido sintetizado en el
hospedador se puede exponer como un antígeno de la superficie
celular. En este contexto, se puede concebir la fusión de dicho
polipéptido con proteínas OMP, o proteínas de pilus de, por
ejemplo, E. coli o la provisión sintética de secuencias señal
y de anclaje que sean reconocidas por el organismo. También es
posible que dicho polipéptido inmunogénico, si se desea como parte
de un conjunto mayor, se libere dentro del animal a inmunizar. En
todos estos casos también es posible que se expresen uno o más
productos inmunogénicos, lo que genera protección contra distintos
patógenos y/o contra distintos antígenos de un patógeno dado.
Una vacuna de acuerdo con la invención se puede
preparar cultivando una célula hospedadora infectada con un virus de
vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la invención, después de lo cual se puede recoger el
virus contenido en las células y/o los virus de vector recombinante
que han crecido en las células, opcionalmente en forma pura, y
formar una vacuna opcionalmente en forma liofilizada.
Las células hospedadoras transformadas con una
molécula de vector recombinante de acuerdo con la invención también
se pueden cultivar en condiciones favorables para la expresión de un
polipéptido codificado por dicha secuencia de ácido nucleico. Las
vacunas se pueden preparar usando muestras del cultivo bruto,
lisados de células hospedadoras o extractos de células
hospedadoras, aunque en otra realización se transforman polipéptidos
más purificados de acuerdo con la invención en una vacuna,
dependiendo de su uso futuro. Para purificar los polipéptidos
producidos, las células hospedadoras transformadas con un vector
recombinante de acuerdo con la invención se cultivan en un volumen
adecuado y los polipéptidos producidos se aislan de tales células o
del medio si la proteína se excreta.
Los polipéptidos excretados en el medio se pueden
aislar y purificar por técnicas convencionales, por ejemplo,
fraccionación salina, centrifugación, ultrafiltración,
cromatografía, cromatografía de exclusión molecular o cromatografía
de inmunoafinidad, mientras que los polipéptidos intracelulares se
pueden aislar recogiendo primero dichas células, rompiendo las
células, por ejemplo, por sonicación o por otros medios de ruptura
mecánica tales como la prensa francesa seguido de separación de los
polipéptidos de los otros componentes intracelulares y de la
formación de una vacuna con los polipéptidos. La ruptura de la
célula también se puede realizar por medios químicos (por ejemplo,
tratamiento con EDTA) o enzimáticos tales como digestión con
lisozimas.
La vacuna de acuerdo con la invención se puede
administrar en un esquema convencional de inmunización activa:
administración única o repetida de forma compatible con la
formulación de la dosificación y en tal cantidad que sea
profilácticamente y/o terapéuticamente eficaz e inmunogénica, es
decir, la cantidad de antígeno de inmunización o microorganismo
recombinante capaz de expresar dicho antígeno que inducirá la
inmunidad en un perro frente a la exposición a un CCV virulento. La
inmunidad se define como la inducción de un nivel significativo de
protección en un población de perros después de la vacunación en
comparación con un grupo no vacunado.
Para las vacunas vivas de vector vírico la
proporción de dosificación por perro puede variar de 10^{5} -
10^{8} pfu.
Un vacuna de subunidad típica de acuerdo con la
invención comprende 10 \mug -1 mg del polipéptido de acuerdo con
la invención.
La administración de la vacuna se puede realizar,
por ejemplo, por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa, oral o intranasal.
Adicionalmente, la vacuna puede contener también
un medio acuoso o una suspensión que contiene agua, mezclada
habitualmente con otros constituyentes, por ejemplo, para aumentar
la actividad y/o periodo de validez. Estos constituyentes pueden ser
sales, tampones de pH, estabilizadores (tales como leche desnatada o
hidrolizado de caseína), adyuvantes emulsionantes para mejorar la
respuesta inmune (por ejemplo, aceites, muramil dipéptido, hidróxido
de aluminio, saponina, polianiones y sustancias anfipáticas) y
conservantes.
Es evidente que una vacuna de acuerdo con la
invención también puede contener inmunógenos relacionados con otros
patógenos de los perros o puede contener secuencias de ácido
nucleico que codifican estos inmunógenos, tales como antígenos del
parvovirus canino (CPV), virus del moquillo canino, adenovirus
canino I, adenovirus canino II, virus de la parainfluenza canina,
rotavirus canino, o leptospira canicola para producir una
vacuna multivalente.
A.
Se infectaron células A-72
confluentes cultivadas en matraces de plástico para cultivo de
tejidos usando la modificación de Wellcome del medio mínimo de Eagle
(MEM) y suero de ternero fetal al 10% con CCV (NVSL Challenge virus
CCV-6 del National Veterinary Service Laboratory, PO
Box 844, Ames, Iowa 50010, USA) a una multiplicidad de infección
(MOI) de aproximadamente 0,1. Después de 24 horas, se recogió el
sobrenadante del cultivo, se enfrió a 4ºC y el desecho celular se
retiró por centrifugación a 3000 x g durante 15 minutos. El virus
se separó del sobrenadante por centrifugación a 53.000 x g durante
2 horas en un rotor Beckman de tipo 19. El sedimento se resuspendió
en 5 ml de TNE (Tris-Cl 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1
mM, pH 7,5) usando un homogenizador Dounce y se estratificó en un
gradiente lineal de 20-60% de sacarosa en TNE. El
virus formó bandas isopícnicas por centrifugación durante una noche
a 1000.000 x g en un rotor Beckman SW28. El gradiente se fraccionó
y se determinaron los valores de A_{280}y las densidades de las
fracciones. Se identificó un pico a la densidad característica de
1,18 g/cc. Las fracciones del pico se juntaron, se diluyeron en TNE
y el supuesto virus se sedimentó por centrifugación a 100.000 x g
durante 2 horas en el rotor Beckman SW28. El ARN se aisló del
sedimento del virus usando dos estrategias:
A. El sedimento se resuspendió en
Tris-Cl 0,1 M pH 8,0 que contenía SDS al 0,1% y se
digirió durante 3 horas a 50ºC con 20 \mug/ml de proteinasa K. La
mezcla se desproteinizó usando fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(50:49:1) saturado con TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM)
y el ácido nucleico se recuperó por precipitación con 2,5 volúmenes
de etanol/acetato sódico 0,3M pH 5,2. La preparación se analizó en
un gel de agarosa con Tris-borato EDTA al 1% que
contenía SDS al 1%; se identificó una banda de ARN de alto peso
molecular con la movilidad característica del ARN genómico del
coronavirus.
B. El sedimento se homogeneizó en isotiocianato
de guanidino/citrato sódico 5 mM (pH 7,0)/mercaptoetanol 0,1
M/N-lauroil sarcosinato al 0,5% y se añadió 1 g/ml
de CsCl a cada 2,5 ml del homogeneizado. Después, la mezcla se
estratificó sobre una capa de CsCl 5,7 M/EDTA 0,1 M y se centrifugó
a 108.000 x g durante 12 horas a 20ºC. El sedimento de ARN se
disolvió en TE que contenía SDS al 0,1%. La preparación se analizó
como se ha descrito anteriormente.
La síntesis de la primera cadena a partir de 2
\mug de ARN genómico de CCV preparado como se ha descrito
anteriormente en 1A se cebó con 1 ng de un oligonucleótido
específico (5' TTTTCAAATTGTCTTC
TACTT 3') usando 40 unidades de transcriptasa inversa de AMV en un volumen de reacción de 25 \mul que contenía Tris-Cl 20 mM (pH 8,3 a 42ºC), KCl 0,14 M, MgCl_{2} 10 mM, dNTP 1 mM, ditiotreitol 4 mM y 25 unidades de inhibidor de ribonucleasa placentaria humana. La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a 42ºC. La síntesis de la segunda cadena se consiguió por la adición de 46 \mul de una mezcla de reacción que contenía MgCl_{2} 7,6 mM, Tris-Cl 0,109 M pH 7,4, (NH_{4})_{2}SO_{4} 16,3 mM, 1000 unidades/ml de RNasaH, 10.000 unidades/ml de ADN polimerasa 1 de E. coli a la reacción de la primera cadena e incubación a 12ºC durante 1 hora seguido de incubación a 22ºC durante una hora más. Los productos de reacción se desproteinizaron con dos extracciones con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1) saturado con TE y se precipitaron con 2 volúmenes de etanol/acetato sódico 0,3 M pH 5,2. Al ADNc se le añadió una cola con restos de C usando desoxinucleotidil transferasa terminal usando el tampón y las condiciones suministradas por el fabricante (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, 20877, USA). Después se fraccionó por tamaños en una columna Sephacryl S-1000 de 2 ml y el ADNc con un tamaño mayor de 500 pares de bases se juntó, se precipitó con etanol y se disolvió en TE. 50 ng de este ADNc se templaron con 250 ng de pUC119 cortado con PstI con cola de dG. La mezcla se usó para transformar TG-1 de E. coli. Se escogieron los transformantes resistentes a ampicilina y se examinaron sus insertos de ADNc de CCV usando una sonda de ADNc producida por cebado aleatorio de transcripción inversa a partir del ARN genómico de CCV. Se examinó el tamaño de los insertos de ADNc en las colonias positivas mediante digestión con PstI de ADN mini-prep. Las relaciones entre los insertos se establecieron por análisis de enzimas de restricción. Se seleccionó el clon pBHl para el análisis de la secuencia. El tamaño del inserto de pBHl (4,0 kb) fue insuficiente para cubrir toda la región codificante de las proyecciones de CCV y se realizó una vuelta posterior de síntesis de ADNc y clonación usando otro cebador específico (5' CTAGGTAGTAACAC 3'). El ARN usado se aisló como se ha descrito anteriormente en 1B. La síntesis del ADNc se realizó usando un kit de síntesis de ADNc de Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim UK, Bell Lane, Lewes, East Sussex BN7 1LG) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, la síntesis de la primera cadena se realizó de nuevo usando la transcriptasa inversa de AMV, y la síntesis de la segunda cadena por acción de la ADN polimerasa 1 de E. coli 1 y RNasaH. El ADNc se transformó en ADN de extremos romos por acción de la ADN polimerasa de T4. El ADNc se unió a pUC18 fosfatado cortado con SmaI usando la ADN ligasa de T4 y el ADN se utilizó para transformar TG1 de E. coli. Inicialmente se examinaron los insertos de los clones resistentes a ampicilina usando selección de azul/blanco en placas de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido). Las colonias blancas se seleccionaron y se examinaron con respecto a la presencia de insertos de ADNc de CCV como se ha descrito anteriormente. El clon pBH2 (tamaño 2,8 kb) se seleccionó para el análisis de la secuencia.
TACTT 3') usando 40 unidades de transcriptasa inversa de AMV en un volumen de reacción de 25 \mul que contenía Tris-Cl 20 mM (pH 8,3 a 42ºC), KCl 0,14 M, MgCl_{2} 10 mM, dNTP 1 mM, ditiotreitol 4 mM y 25 unidades de inhibidor de ribonucleasa placentaria humana. La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a 42ºC. La síntesis de la segunda cadena se consiguió por la adición de 46 \mul de una mezcla de reacción que contenía MgCl_{2} 7,6 mM, Tris-Cl 0,109 M pH 7,4, (NH_{4})_{2}SO_{4} 16,3 mM, 1000 unidades/ml de RNasaH, 10.000 unidades/ml de ADN polimerasa 1 de E. coli a la reacción de la primera cadena e incubación a 12ºC durante 1 hora seguido de incubación a 22ºC durante una hora más. Los productos de reacción se desproteinizaron con dos extracciones con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1) saturado con TE y se precipitaron con 2 volúmenes de etanol/acetato sódico 0,3 M pH 5,2. Al ADNc se le añadió una cola con restos de C usando desoxinucleotidil transferasa terminal usando el tampón y las condiciones suministradas por el fabricante (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, 20877, USA). Después se fraccionó por tamaños en una columna Sephacryl S-1000 de 2 ml y el ADNc con un tamaño mayor de 500 pares de bases se juntó, se precipitó con etanol y se disolvió en TE. 50 ng de este ADNc se templaron con 250 ng de pUC119 cortado con PstI con cola de dG. La mezcla se usó para transformar TG-1 de E. coli. Se escogieron los transformantes resistentes a ampicilina y se examinaron sus insertos de ADNc de CCV usando una sonda de ADNc producida por cebado aleatorio de transcripción inversa a partir del ARN genómico de CCV. Se examinó el tamaño de los insertos de ADNc en las colonias positivas mediante digestión con PstI de ADN mini-prep. Las relaciones entre los insertos se establecieron por análisis de enzimas de restricción. Se seleccionó el clon pBHl para el análisis de la secuencia. El tamaño del inserto de pBHl (4,0 kb) fue insuficiente para cubrir toda la región codificante de las proyecciones de CCV y se realizó una vuelta posterior de síntesis de ADNc y clonación usando otro cebador específico (5' CTAGGTAGTAACAC 3'). El ARN usado se aisló como se ha descrito anteriormente en 1B. La síntesis del ADNc se realizó usando un kit de síntesis de ADNc de Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim UK, Bell Lane, Lewes, East Sussex BN7 1LG) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, la síntesis de la primera cadena se realizó de nuevo usando la transcriptasa inversa de AMV, y la síntesis de la segunda cadena por acción de la ADN polimerasa 1 de E. coli 1 y RNasaH. El ADNc se transformó en ADN de extremos romos por acción de la ADN polimerasa de T4. El ADNc se unió a pUC18 fosfatado cortado con SmaI usando la ADN ligasa de T4 y el ADN se utilizó para transformar TG1 de E. coli. Inicialmente se examinaron los insertos de los clones resistentes a ampicilina usando selección de azul/blanco en placas de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido). Las colonias blancas se seleccionaron y se examinaron con respecto a la presencia de insertos de ADNc de CCV como se ha descrito anteriormente. El clon pBH2 (tamaño 2,8 kb) se seleccionó para el análisis de la secuencia.
Para el aislamiento del gen de proyecciones de la
cepa CCV C54 se aplicó la misma estrategia descrita en el Ejemplo
1.1.B. y 1.2 para la cepa CCV CCV6. Tres clones solapantes, pBH3,
pBH4 y pBH11 cubrieron el gen de proyecciones hasta el extremo
romo.
Los insertos de ADNc de los clones pBH1, pBH2,
pBH3, pBH4 y pBH11 se secuenciaron usando el método de terminación
de cadena didesoxi de Sanger. Esta estrategia de pistola
("shotgun") se suplementó cuando fue necesario con
secuenciación a partir de cebadores oligonucleotídicos específicos
en plantillas de ADN de plásmidos bicatenarios. Para el análisis
shotgun se escindió el ADN del inserto de las secuencias del vector,
se circularizó, se sonicó, se seleccionó por tamaños en geles de
agarosa y se clonó en M13mp8 fosfatado cortado con SmaI. Los datos
de la secuencia shotgun se recogieron usando los programas DBUTIL y
DBAUTO de Staden y se analizaron usando los paquetes ANALYSEQ/NIP
de Staden. Se usaron un VAX 8350 y un micro VAX 3100 (Digital
Equipment Corporation). Los datos de la secuencia se presentan en la
SEC ID NO: 1 y 5.
Se infectaron células confluentes
A-72 cultivadas en matraces de plástico para cultivo
de tejidos usando la modificación de Wellcome del medio mínimo de
Eagle (MEM) y F.C.S al 10% con la cepa Insavc-1 de
CCV (Bert) (Intervet Labs.) a una m.o.i. de aproximadamente 0,1.
Después de 48 horas se recogió el sobrenadante del cultivo, se
enfrió a 4ºC y el desecho celular se retiró por centrifugación a
3000 x g durante 15 minutos. El virus se sedimentó del sobrenadante
a 53.000 x g durante 2 horas en un rotor Beckman de tipo 19. El
sedimento de virus se homogeneizó en 3,5 ml de isotiocianato de
guanidinio 6 M/citrato sódico 5 mM (pH 7,0), mercaptoetanol 0,1M), y
N-lauroil sarcosinato al 0,5%.
El homogeneizado se estratificó sobre una capa de
CsCl 5,7 M (1 ml) y se centrifugó a 108.000 g durante 18 horas a
18ºC. El sedimento de ARN se disolvió en TE que contenía SDS al 0,1%
y después se precipitó dos veces con 2,5 volúmenes de etanol/NaOAc
0,3M pH 5,2. La preparación se analizó como un gel de agarosa con
Tris-borato EDTA al 1% que contenía SDS al 1% y se
identificó una banda de ARN de alto peso molecular con la movilidad
característica del ARN genómico del coronavirus.
La síntesis de la primera y segunda cadena a
partir de 2 \mug de ARN genómico de CCV preparado como se ha
descrito anteriormente se cebó con oligo dT y pentanucleótidos
aleatorios del kit de síntesis de ADNc de Boehringer en las
condiciones especificadas por el protocolo de los fabricantes.
El ADNc de extremos romos resultante producido en
esta reacción se unió a pUC119 fosfatado cortado con SmaI usando ADN
ligasa de T4 y el ADN se utilizó para transformar TG1 de E.
coli. Inicialmente se examinaron los insertos de los clones
resistentes a ampicilina usando selección de azul/blanco en placas
de X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indetil-\beta-D-galactopiranósido).
Las colonias blancas se seleccionaron y se examinaron con respecto a
la presencia de insertos de ADNc de CCV usando ARN de CCV cebado
aleatoriamente como sonda. Se identificaron cinco clones
positivos.
El plásmido pBH6 se generó usando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). La información de secuencia de los
extremos de pBH5 y pBH7 permitió el diseño de cebadores BH7 y BH8.
Se incorporó un sitio Not 1 en los oligos para facilitar la
clonación. En resumen, se desproteinizó aproximadamente 1 ng de la
reacción de la primera cadena como se ha descrito previamente por
dos extracciones con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1)
saturado con TE, se pasó a través de una columna de centrifugación
G50 y se precipitó con dos volúmenes de etanol/acetato sódico 0,3 M
pH 5,3. Los híbridos de ADN:ARN se resuspendieron en 15 \mul de
TE. La reacción de PCR se realizó con el PHC-1
Dri-block programable de Techne.
El fragmento generado se precipitó con
fenol/cloroformo etanol como se ha descrito anteriormente y se
resuspendió en 20 \mul de TE. El ADN se escindió con Not 1 en las
condiciones recomendadas por el fabricante de la enzima y se eluyó
en gel. Después, el fragmento Not 1 se unió al vector fosfatado
cortado con Not 1 usando ADN ligasa de T4 y el ADN se usó para
transformar TG-1 de E. coli. Los clones que
contenían los insertos se identificaron como se ha descrito
previamente.
Los insertos de ADNc de los clones pBH5, pBH7,
pBH8, pBH9, pBH10 y el inserto de PCR pBH6 se secuenciaron usando el
método de terminación de cadena didesoxi de Sanger como se describe
por Barrel y Bankier (Methods in Enzymology 155,
51-93, 1987). Esta estrategia shotgun se suplementó
cuando fue necesario con secuenciación a partir de cebadores
oligonucleotídicos específicos en ADN plasmídico bicatenario o
monocatenario (origen f1 en pUC 119). Para el análisis shotgun se
escindió el ADN del inserto de las secuencias del vector, se
circularizó, se sonicó, se repararon los extremos, se seleccionó
por tamaños en geles de agarosa al 1% y se clonó en M13mp8
fosfatado cortado con SmaI. Los datos de la secuencia shotgun se
recogieron y se analizaron usando los programas SAP de Standen. Se
usaron un MicroVax 3100 (Digital Equipment Corporation). Los datos
de la secuencia se presentan en la SEC ID NO: 3.
La región de codificación completa del gen S de
CCV6 se reconstruyó a partir de 2 clones de ADNc solapantes, BH1 y
BH2. La estrategia de clonación se ilustra en la figura 1. El
inserto de 3,0 kb de pBH1 tiene identidad con S y 1b. para expresar
S, tuvo que retirarse la secuencia que codificaba la polimerasa. La
secuencia inmediatamente 5' de la metionina de inicio,
CTAAACTTTGGTAATCACTTGG TTAATGTGCC ATG se modificó por
mutagénesis de localización dirigida. Cuatro bases, ATCC se
intercalaron entre las bases TGG y TTA para crear un sitio BamHI
único, GGAATCC. Los mutantes se seleccionaron por digestión con
enzimas de restricción. Los clones positivos se secuenciaron a
través de este sitio ya que el fragmento Klenow de la ADN polimerasa
de E. coli usado en la reacción de mutagénesis puede
introducir mutaciones no especificadas con una frecuencia muy baja.
Se seleccionó un mutante que tenía el sitio BamHI y se designó
pBHI-bam. Este plásmido solapaba con pBH2 en
aproximadamente 30 pb. Se localizó un solo sitio Af1III en esta
región de solapamiento. La secuencia codificante de S proximal se
aisló a partir de pBH1-bam como un fragmento
AF1II-SphI de 1,5 kb y se unió a pBH2 digerido con
Af1II-SphI generando pCCV6. La secuencia completa
codificante de S se aisló como un fragmento BamH1 de 4,4 kb y
después se unió en el sitio BamH1 del vector de transferencia RK19
para formar pRKCCV6. La correcta orientación del gen se confirmó por
digestión con enzimas de restricción. De esta forma, el plásmido
RKCCV6 contiene el gen S de CCV 6 cadena abajo del promotor 4b y
flanqueado por las secuencias codificantes TK.
Se construyeron virus de vaccinia recombinantes
por procedimientos establecidos (Mackett & Smith, J.Gen.Virol.
67, 2067-2082, 1986). pRKCCV6 se usó para
transfectar células infectadas con virus de vaccinia y los
virus recombinantes se identificaron por hibridación
dot-blot usando el gen de proyecciones de CCV6
marcado con ^{32}P cebado aleatoriamente como sonda. La
purificación en placa y la selección se repitieron 3 veces antes de
preparar el material de reserva. El recombinante derivado de pRKCCV6
se denominó Vac4b-C6.
El gen Insavc-1 (Bert) S se montó
a partir de 3 clones de ADNc solapantes, BH8, BH9 y BH10. La
estrategia de clonación se ilustra en la figura 2. La digestión de
pBH8, que abarca la mitad del gen S con PvuII y HindIII produjo un
fragmento de 1,4 kb. Este fragmento se unió a un vector cortado con
PvuIII-HindIII, pING14.2 formando pINGMS. Este
plásmido se linealizó con HindIII, se fosfató y después se eluyó en
gel. La secuencia codificante del gen 3' S se aisló como un
fragmento HindIII de 1,1 kb de pBH10, y se subclonó en pINGMS
cortado con HindIII generando pINGM3'S. La correcta orientación del
fragmento HindIII clonado se confirmó por digestión con enzimas de
restricción. Antes de escindir la secuencia de codificación restante
de pBH9 se introdujo un solo sitio BamHI 10 pb corriente arriba del
codón de inicio AUG del peplómero mediante mutagénesis de
localización dirigida (figura 2). La secuencia codificante 5' del
gen S que se aisló como un fragmento PvuII de 1,9 kb y la secuencia
codificante del gen S restante, que se aisló como un fragmento
PvuII parcial-EcoRI de 2,5 kb a partir de pING3'S,
se unieron en una unión de dos fragmentos con pUC118 digerido con
BamHI-EcoRI. La secuencia completa de codificación
del gen de la proteína S se aisló como un fragmento BamH1 de 4,4 kb
y se subclonó en el vector de transferencia pRK19 cortado con BamH1,
generando pRKINSAVC-1. La correcta orientación del
gen se confirmó por digestión con enzimas de restricción. De esta
forma, el plásmido RKINSAVC-1 contiene el gen
CCV-INSAVC-1 S cadena abajo del
promotor de vaccinia 4b y flanqueado por secuencias
codificantes TK.
Se usó el plásmido RKINSAVC-1
para introducir la secuencia codificante del gen S en el virus de
vaccinia por transfección y selección de recombinantes
TK^{-} como se describe por Mackett y Smith (1986, ibid).
Los aislados de virus recombinantes identificados por hibridación
dot blot con una sonda de ADN S de CCV6 marcada con ^{32}P se
sometieron a tres vueltas de purificación en placa y se prepararon
materiales de reserva de virus. El recombinante derivado de
RKINSAVC-1 se denominó Vac4b-IN.
La secuencia codificante del gen S de C54 se
montó a partir de los 3 clones solapantes pBH3, pBH4 y pBH11. Se
creó un sitio BamH1 único 10 pb cadena abajo del codón de inicio AUG
del peplómero mediante mutagénesis de localización dirigida en el
clon proximal, generando pBH3 pBH3- bam (figura 3). Se aisló un
fragmento AflII-EcoRI de 2,0 kb a partir de este
plásmido y se unió a pBH4 digerido con AFlII-EcoRI
formando pBH5'MS. Este plásmido se escindió con HindIII, se fosfató
y se eluyó en gel. La secuencia codificante 3' se escindió como un
fragmento HindIII de 1,1 kb de pBH11, y después se unió con el
pBH5'MS digerido con HindIII generando pBHC54. La correcta
orientación del fragmento HindIII subclonado se determinó por
digestión con enzimas de restricción. El gen completo S de C54 se
escindió por digestión con BamH1 de pBHC54 y se unió al vector de
transferencia RK19 cortado con BamH1, formando pRKC54. De forma
similar, la orientación del gen S se determinó por digestión con
enzimas de restricción. De esta forma, el plásmido RKC54 contiene el
gen S de CCV C54 cadena abajo del promotor 4b y flanqueado por
secuencias codificantes TK. La estrategia de clonación se ilustra en
la
figura 3.
figura 3.
El plásmido RKC54 se transfectó en células
infectadas con virus de vaccinia. Se seleccionaron
recombinantes TK^{-} usando BUdR (Mackett y Smith, 1086,
ibid). Los aislados de virus recombinantes se identificaron
por hibridación dot blot y se sometieron a tres vueltas de
purificación en placa antes de preparar el material de reserva. El
recombinante derivado de pRKC54 se denominó
Vac4b-C54.
Se vacunaron gatos con las siguientes vacunas
(10^{7} pfu/gato):
(a) 4 gatos -Vac4b-IN
(b) 4 gatos - Vac4b-C6
(c) 2 gatos - Vac4b-gB
(Vac4b-gB) es el virus
Vaccinia recombinante que expresa la glicoproteína de
citomegalovirus gB bajo el control del promotor 4b).
(d) 2 gatos - sin vacunar.
A todos los gatos se les practicó una extracción
de sangre antes de la vacunación (Muestra A). 3 semanas después de
la vacunación se tomaron muestras de sangre otra vez (Muestra B) y
posteriormente se revacunaron como se ha indicado anteriormente.
2 semanas después de la revacunación se tomaron
muestras de sangre de todos los gatos (Muestra C).
Se infectaron células caninas A72 con un m.o.i.
de aproximadamente 10 con los virus recombinantes o se infectaron de
forma simulada, se incubaron durante 16 horas y se les privó de
metionina durante 1 hora. Las células infectadas se marcaron con
^{35}S metionina y se incubaron durante 30 minutos, se lavaron y
se lisaron posteriormente en tampón R.I.P.A. Se añadió 1 \mul de
antisuero de gato (Muestra C) al lisado radiomarcado y se incubó en
hielo durante 60 minutos. Se añadió proteína G y se incubó en hielo
durante 60 minutos. Después de lavar la proteína G en tampón
R.I.P.A. y tampón PBS, las proteínas unidas se recuperan con SDS al
2% y mercapto-etanol al 2%. Las proteínas se
separaron en gel de SDS-poliacrilamida al 10%.
Los sueros de la Muestra C precipitaron la
proteína de proyecciones en el caso de los gatos a los que se
administró Vac4b-C6 y Vac4b- IN. De esta forma, los
gatos inmunizados con el virus de vaccinia recombinante que
contenía los genes de proyecciones respondieron con anticuerpos
contra los genes de proyecciones.
Figura 1: muestra la estrategia de clonación para
la construcción del plásmido pRKCCV6 con los plásmidos pBH1 y
pBH2.
Figura 2: muestra la estrategia de clonación para
la construcción del plásmido pRKINSAVC-1 con los
plásmidos pBH8, pBH10 y pBH9.
Figura 3: muestra la estrategia de clonación para
la construcción del plásmido pRKC54 a partir de los plásmidos pBH3,
pBH4 y pBH11.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: AKZO N.V.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Arnhem
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Países Bajos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VACUNA DE SUBUNIDAD DEL CORONAVIRUS CANINO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº. 1.0, Versión Nº. 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 91.303.737.0
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 de abril de 1991
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4500 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: coronavirus canino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CCV-6
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 65..4393
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador = CCV6_Spikegene
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1443 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Coronavirus canino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CCV-6
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1443
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador = CCV6_Spike
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4429 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Coronavirus canino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CCVInSAVC-1
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 60..4412
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador = CCVInSAVC-1_Spikegene
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1451 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.333000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Coronavirus canino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CCVInSAVC-1
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1451
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador = CCVInSAVC-1_Spike
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4435 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Coronavirus canino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CCV-V54
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 60..4418
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador = CCV-C54_Spikegene
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1453 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Coronavirus canino
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CCV-C54
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1453
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: /marcador = CCV-C54_spike
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Una molécula de ADN que codifica un
polipéptido que tiene al menos un determinante inmunogénico de la
proteína de proyecciones de CCV, teniendo dicha proteína de
proyecciones de CCV una secuencia de aminoácidos de las mostradas en
la SEC ID NO: 2, 4 ó 6, siendo dicho polipéptido capaz de provocar
una respuesta inmune protectora en un perro contra la infección o
enfermedad por CCV.
2. Una molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, comprendiendo dicha molécula de ADN la secuencia
de ácido nucleico que se muestra en la SEC ID NO 1, 3 ó 5.
3. Una molécula de vector recombinante que
comprende una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, unida operativamente a una secuencia de control de la
expresión.
4. Un virus de vector recombinante, que contiene
una molécula de ADN heterólogo de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2.
5. Una célula hospedadora, transformada con una
molécula de vector recombinante de acuerdo con la reivindicación
3.
6. Una célula hospedadora, infectada con un virus
de vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 4.
7. Un proceso para la preparación de un
polipéptido que tiene uno o más epítopos capaz de provocar una
respuesta inmune protectora en un perro contra la infección o
enfermedad por CCV, comprendiendo dicho proceso: (a) cultivar las
células hospedadoras de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 en
condiciones en las que se exprese la secuencia de ácido nucleico y
(b) aislar el polipéptido del cultivo.
8. Una vacuna para la protección de perros contra
la infección o enfermedad por CCV, caracterizada porque
comprende un virus de vector recombinante de acuerdo con la
reivindicación 4 o una célula hospedadora de acuerdo con la
reivindicación 5 ó 6, junto con un vehículo aceptable.
9. Un proceso para la preparación de una vacuna
de CCV que comprende las etapas de cultivar una célula hospedadora
infectada de acuerdo con la reivindicación 6, recoger el material
vírico de vector recombinante y formular el material en una
preparación farmacéutica con actividad de inmunización.
10. Un proceso para la preparación de una vacuna
CCV que comprende:
- (a)
- cultivar células hospedadoras de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 en condiciones en las que se exprese la secuencia de ácido nucleico,
- (b)
- aislar el polipéptido del cultivo, y
- (c)
- formular el polipéptido aislado en una preparación farmacéutica con actividad de inmunización.
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