ES2261148T3 - Vacuna y diagnostico del virus del colera porcino. - Google Patents
Vacuna y diagnostico del virus del colera porcino.Info
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Abstract
Un polipéptido del virus del cólera porcino (HCV) con un peso molecular de 44/48 kD que reacciona con un antisuero monoespecífico preparado contra una proteína de fusión existente de AA262-546 de la SEC ID Nº 1.
Description
Vacuna y diagnóstico del virus del cólera
porcino.
La presente invención se refiere a una secuencia
de ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico recombinante que
comprende dicha secuencia de ácido nucleico, un sistema de expresión
recombinante que comprende dicha molécula de ácido nucleico
recombinante, un polipéptido característico del virus del cólera
porcino, una vacuna que comprende dicho polipéptido o sistema de
expresión recombinante así como un método para la preparación de
dichas vacunas.
La peste porcina clásica o cólera porcino (HC)
representa una enfermedad del cerdo de importancia económica en
muchos países en todo el mundo. En condiciones naturales, el cerdo
es el único animal que se sabe que es susceptible a HC. El cólera
porcino es una enfermedad altamente contagiosa que causa la
degeneración en las paredes de los capilares, dando como resultado
hemorragias y necrosis de los órganos internos. En primer lugar el
cólera porcino se caracteriza por fiebre, anorexia, vómitos y
diarrea que pueden ir seguidos por un proceso crónico de la
enfermedad caracterizado por infertilidad, aborto y descendencia
débil de las cerdas. Sin embargo, casi todos los cerdos mueren en 2
semanas después de que aparezcan los primeros síntomas.
El agente causante, el virus del cólera porcino
(HCV) ha demostrado estar estructural y serológicamente relacionado
con el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) de vacas y con el
virus de la enfermedad de la frontera (BDV) de ovejas. Estos virus
están agrupados conjuntamente en el género pestivirus en la familia
togaviridae. Se sabe desde hace mucho que la naturaleza del material
genético de los pestivirus es ARN, es decir ARN de cadena positiva
que carece de poliadenilación significativa. El HCV probablemente
comprende 3-5 proteínas estructurales de las que
dos están posiblemente glicosiladas. Se desconoce la cantidad de
proteínas virales no estructurales.
Se han desarrollado y se usan en este momento
vacunas de HCV modificado (que comprenden virus atenuados o muertos)
para combatir la infección por HC. Sin embargo, la infección de
células de cultivo tisular para obtener material de HCV a usar en
dichas vacunas de virus modificado, conduce a bajos rendimientos de
virus y los viriones son difíciles de purificar. Las vacunas de
virus vivos modificados siempre implican el riesgo de inocular
animales con HCV patógeno patogénico parcialmente atenuado que aún
sea patogénico y pueda causar enfermedad en el animal inoculado o en
la descendencia y de contaminación por otros virus en la vacuna.
Además el virus atenuado puede revertir a un estado virulento.
Hay también varias desventajas usando vacunas
inactivadas, por ejemplo, el riesgo de inactivación solamente
parcial de los virus, el problema de que sólo se consiga un nivel
bajo de inmunidad que requiera inmunizaciones adicionales y el
problema de que los determinantes antigénicos estén alterados por el
tratamiento de inactivación dejando el virus inactivado menos
inmunogénico.
Además, el uso de vacunas de HCV modificado no
es adecuado para programas de erradicación.
Hasta ahora, de acuerdo con lo que se sabe no
hay disponibles ensayos de diagnóstico en cerdos que puedan
distinguir entre infección por HCV o BVDV. Esto es importante puesto
que la infección por BVDV en cerdos es de menor importancia que la
infección por HCV lo que significa que los cerdos infectados por
BVDV no tienen que ser erradicados.
Las vacunas que contienen sólo el material
inmunogénico de HCV necesario y relevante que es capaz de provocar
una respuesta inmune contra el patógeno no presentan las desventajas
mencionadas anteriormente de las vacunas modificadas.
De acuerdo con la presente invención, se ha
descubierto una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido característico del virus del cólera porcino. Tanto la
secuencia de ácido nucleico como el polipéptido o fragmentos del
mismo pueden usarse para la preparación de una vacuna que contenga
sólo el material inmunogénico necesario y relevante para inmunizar
animales contra la infección por HCV. "Secuencia de ácido
nucleico" se refiere tanto a una secuencia de ácido ribonucleico
como a una secuencia de ácido desoxirribonucleico.
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con
la presente invención se muestra en la figura 2 (SEC ID Nº 1). Como
bien se sabe en la técnica, la degeneración del código genético
permite la sustitución de bases en un codón dando como resultado
otro codón pero que aún codifica el mismo aminoácido, por ejemplo,
el codón para el aminoácido ácido glutámico es tanto GAT como GAA.
Por consiguiente, está claro que para la expresión de un polipéptido
con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID Nº
1-2) se puede hacer uso de una secuencia de ácido
nucleico con dicha composición de codones alternativa diferente de
la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 2 (SEC ID Nº
1).
La secuencia de ácido nucleico mostrada en la
figura 2 (SEC ID Nº 1) es una secuencia de ADNc derivada del ARN
genómico de HCV. Esta secuencia continua es de 12284 nucleótidos de
longitud, y contiene una fase de lectura abierto (ORF) larga, que
comienza con el codón ATG en la posición 364 a 366 y termina con un
codón TGA como codón de parada de la traducción en la posición 12058
a 12060. Este ORF consta de 3898 codones capaces de codificar 435
kDa de proteína.
En vivo, durante la replicación del HCV
en una célula infectada, esta proteína se sintetiza como una
molécula precursora de poliproteína que se procesa posteriormente en
fragmentos de polipéptidos por escisión (enzimática) de la molécula
precursora. Estos fragmentos forman, después de posibles
modificaciones post-traduccionales, las proteínas
estructurales y no estructurales del virus. Una secuencia de ácido
nucleico preferida contiene la información genética para dicho
fragmento con propiedades inmunizantes contra HCV o propiedades
inmunológicas características para HCV o contiene la información
genética para una porción de dicho fragmento que aún tiene las
propiedades inmunizantes o las propiedades inmunológicas
características para HCV.
Una región codificante de fragmento se localiza
en la posición de aminoácido aproximadamente 1-249,
263-487, 488-688 ó
689-1067. La región 1-249 representa
básicamente la proteína principal mientras que las regiones
263-487, 488-688 y
689-1067 representan básicamente glicoproteínas de
33 kD, 44/48 kD y 55 kD respectivamente. Dentro del alcance de la
invención también están secuencias de ácido nucleico que comprenden
la información genética para una o más de las regiones codificantes
mencionadas anteriormente o porciones de las mismas.
Una región preferida a incorporar en una vacuna
contra infección por HCV es la región correspondiente a la proteína
de HCV de 55 kD o una porción de la misma que aún tenga actividad
inmunizante.
Además, una secuencia de ácido nucleico que
comprende al menos las secuencias codificantes para dicha proteína
de 55 kD o una porción de la misma puede aplicarse de forma
ventajosa de acuerdo con la presente invención.
Además, una porción preferida de la proteína de
HCV de 55 kD, que puede usarse para la inmunización de cerdos contra
la infección por HCV, se determina por análisis de mutantes de
deleción de HCV con anticuerpos monoclonales
anti-proteína de 55 kD que tienen actividad
neutralizante de virus. Dicha porción que comprende un epítopo
abarca la secuencia de aminoácidos aproximadamente
812-859 y está codificada por la secuencia de
nucleótidos aproximadamente 2799-2938. Un
polipéptido que comprende al menos dicha secuencia de aminoácidos o
una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos dicha
secuencia de nucleótidos también forma parte de la presente
invención.
invención.
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con
la invención que puede usarse para el diagnóstico de infección por
HCV en cerdos y que puede aplicarse para distinguir HCV de BVDV
puede obtenerse del gen que codifica la proteína de 55 kD.
Preferiblemente, dicha secuencia de ácido
nucleico se obtiene de las secuencias de nucleótidos
2587-2619 ó 2842-2880, formando
parte ambas secuencias del gen que codifica la proteína de 55 kD. Un
oligonucleótido preferido para propósitos de diagnóstico es (SEC ID
Nº 3 y 4, respectivamente):
5' - CCT ACT AAC CAC GTT AAG TGC
TGT GAC TTT AAA -
3'
o
5' - TTC TGT TCT CAA GGT TGT GGG
GCT CAC TGC TGT GCA CTC -
3'
Además, una secuencia de ácido nucleico que
comprende al menos una sub-secuencia de dichos
oligonucleótidos y que aún puede usarse para diferenciar entre HCV y
BVDV forma parte de la invención.
La invención también se refiere a un kit de
ensayo a usar en un ensayo, conteniendo este kit de ensayo una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, el kit de ensayo comprende un
oligonucleótido mencionado anteriormente o una secuencia de ácido
nucleico que comprende al menos una sub-secuencia
del mismo.
Variaciones o modificaciones en el polipéptido
mostrado en la figura 2 (SEC ID Nº 1-2) o fragmentos
del mismo, tales como variaciones naturales entre diferentes cepas u
otros derivados, son posibles manteniendo las mismas propiedades
inmunológicas. Estas variaciones pueden demostrarse por una
diferencia o diferencias de aminoácido la secuencia global o por
deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de
un aminoácido o aminoácidos en dicho polipéptido.
Además, existe el potencial, en el uso de la
tecnología de ADN recombinante, para la preparación de diversos
derivados del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID Nº
1-2) o fragmentos del mismo, modificados de diversas
maneras por sustituciones, deleciones, adiciones o remplazos de
aminoácidos sencillos o múltiples resultantes, por ejemplo, por
medio de mutagénesis dirigida al sitio del ADN subyacente. Todas
estas modificaciones que dan como resultado derivados del
polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID Nº 1-2)
o fragmentos del mismo se incluyen en el alcance de la presente
invención mientras la actividad característica esencial de dicho
polipéptido o fragmento del mismo, permanezca inalterada en su
esencia.
El ARN aislado de viriones sedimentados se aisló
y se usó para la síntesis de ADNc. Este ADNc se clonó en el fago
\lambdagt11 y la biblioteca respectiva se amplificó y se exploró
con antisuero de cabra anti-HCV. Se pudieron
identificar dos clones positivos y demostraron tener insertos con
tamaños de 0,8 kb y 1,8 kb. El inserto de \lambdagt11 de 0,8 kb se
secuenció parcialmente (véase figura 3, SEC ID Nº
8-9) y se determinó que estaba localizado entre
aproximadamente 1,2 y 2,0 kb en el genoma de HCV (véase figura
2).
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con
la invención que puede usarse para el diagnóstico de HCV en animales
infectados y que de forma sorprendente puede aplicarse para
distinguir HCV de BVDV está representada por la secuencia de
nucleótidos 5551-5793 mostrada en la figura 2 (SEC
ID Nº 1).
Además, una secuencia de ácido nucleico que
comprende al menos una sub-secuencia de dicha
secuencia de nucleótidos y que aún puede usarse para diferenciar
entre HCV y BVDV forma parte de la invención.
La invención también se refiere a un kit de
ensayo a usar en un ensayo, conteniendo este kit de ensayo una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, el kit de ensayo comprende la
secuencia de ácido nucleico representada por la secuencia de
nucleótidos 5551-5793 mostrada en la figura 2 (SEC
ID Nº 1) o una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos
una sub-secuencia de la misma mencionada
anteriormente.
El ARN aislado de viriones sedimentados se aisló
y se usó para la síntesis de ADNc. Este ADNc se clonó en el fago
\lambdagt11 y la biblioteca respectiva se amplificó y se exploró
con antisuero de cabra anti-HCV. Se pudieron
identificar dos clones positivos y demostraron tener insertos con
tamaños de 0,8 kb y 1,8 kb. El inserto de \lambdagt11 de 0,8 kb se
secuenció parcialmente (véase figura 3, SEC ID Nº
8-9) y se determinó que estaba localizada entre
aproximadamente 1,2 y 2,0 kb en el genoma de HCV (véase figura
2).
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con
la presente invención puede ligarse a diversas moléculas de ácido
nucleico vectores, tales como ADN plasmídico, ADN de bacteriófago, o
ADN viral para formar una molécula de ácido nucleico recombinante.
Las moléculas de ácido nucleico vectores preferiblemente contienen
secuencias de ADN para iniciar, controlar y terminar la trascripción
y la traducción. Un sistema de expresión recombinante que comprende
un hospedador que contiene dicha molécula de ácido nucleico
recombinante puede usarse para permitir que una secuencia de ácido
nucleico de acuerdo con la presente invención exprese un polipéptido
codificado por dicha secuencia de ácido nucleico. El hospedador del
sistema de expresión recombinante mencionado anteriormente puede ser
de origen procariota, por ejemplo, bacterias tales como E.
coli, B subtilis y Pseudomonas, virus tales como
virus vaccinia y virus de la viruela aviar o de origen eucariota tal
como levaduras o células eucariotas superiores tales como células
de insectos, plantas o animales.
La inmunización de animales contra HC puede, por
ejemplo, conseguirse administrando al animal un polipéptido de
acuerdo con la invención como una vacuna denominada de
"subunidad". La vacuna de subunidad de acuerdo con la invención
comprende un polipéptido generalmente en forma pura, opcionalmente
en presencia de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente se conjugan fragmentos pequeños
con moléculas vehículo para elevar su inmunogenicidad. Vehículos
adecuados para este propósito son macromoléculas, tales como
polímeros naturales (proteínas como hemocianina de lapa
californiana, albúmina, toxinas), polímeros sintéticos como
poliaminoácidos (polilisina, polialanina), o micelas de compuestos
anfífilos como saponinas. Como alternativa, estos fragmentos pueden
proporcionarse en forma de polímeros de los mismos, preferiblemente
polímeros lineales. Los polipéptidos a usar en dichas vacunas de
subunidad pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por
ejemplo, por aislamiento de dichos polipéptidos a partir del virus
del cólera porcino, por técnicas de ADN recombinante o por síntesis
química.
Si es necesario, los polipéptidos de acuerdo con
la invención a usar en una vacuna pueden modificarse in vitro
o in vivo, por ejemplo por glicosilación, amidación,
carboxilación o fosforilación.
Una alternativa a las vacunas de subunidad son
las vacunas "vector". Una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo con la invención se integra por técnicas de recombinación
dentro del material genético de otro microorganismo (por ejemplo,
virus o bacteria) posibilitando de este modo que el microorganismo
exprese un polipéptido de acuerdo con la invención. Este sistema de
expresión recombinante se administra al animal a inmunizar después
de lo cual se replica en el animal inoculado y expresa el
polipéptido dando como resultado la estimulación del sistema inmune
del animal. Ejemplos adecuados de vectores vacuna son los poxvirus
(tales como vaccinia, viruela bovina, viruela del conejo), poxvirus
de aves (tales como el virus de la viruela aviar), virus de la
pseudorrabia, adenovirus, virus de influenza, bacteriófagos o
bacterias (tales como Escherichia coli y
Salmonella).
El sistema de expresión recombinante que tiene
una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención
insertada en su secuencia de ácido nucleico puede, por ejemplo,
hacerse crecer en un cultivo celular y puede, si se desea, recogerse
de las células infectadas y formar una vacuna opcionalmente en forma
liofilizada. Dicho microorganismo manipulado genéticamente puede
también recogerse de animales vivos infectados con dicho
microorganismo. El sistema de expresión recombinante mencionado
anteriormente puede también propagarse en un cultivo celular que
expresa un polipéptido de acuerdo con la invención, después de lo
cual el polipéptido se aísla del cultivo.
Una vacuna que comprende un polipéptido o un
sistema de expresión recombinante de acuerdo con la presente
invención puede prepararse por procedimientos bien conocidos en la
técnica para dichas vacunas. Una vacuna de acuerdo con la invención
puede estar constituida por, entre otros, un hospedador completo, un
extracto del hospedador, un polipéptido purificado parcial o
completamente, o un sistema de expresión recombinante purificado
parcial o completamente como se ha mencionado anteriormente.
La vacuna de acuerdo con la invención puede
administrarse en un programa de inmunización activa convencional:
administración única o repetida de un modo compatible con la
formulación de dosificación y en una cantidad tal que será
terapéuticamente eficaz e inmunogénica. La administración de la
vacuna puede hacerse, por ejemplo, por vía intradérmica, subcutánea,
intramuscular, intravenosa o intranasal. Para la administración
parenteral las vacunas pueden contener adicionalmente un vehículo
adecuado, por ejemplo, agua, solución salina o solución tampón con o
sin adyuvantes, estabilizantes, solubilizantes, emulsionantes
etc.
La vacuna puede contener adicionalmente
inmunógenos relacionados con otras enfermedades o secuencias de
ácido nucleico que codifican dichos inmunógenos como antígenos de
parvovirus, virus de la pseudorrabia, virus de influenza en cerdos,
virus TGE, rotavirus, Escherichia coli, Bordetella,
Pasteurella, Erisipela etc. para producir una vacuna
multivalente.
También pueden usarse polipéptidos de acuerdo
con la presente invención en métodos de diagnóstico para detectar la
presencia de antígeno o anticuerpo de HCV en un animal. Además,
pueden usarse secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la
invención para producir polipéptidos a usar en los métodos de
diagnóstico mencionados anteriormente o en forma de una sonda de
hibridación para la detección de la presencia de ácido nucleico de
HCV en una muestra.
Infección de células y recogida de virus.
Se hicieron crecer células pK15 y 38A_{1}D en DMEM con FCS al 10%
y se infectaron en suspensión por la cepa de HCV virulenta Alfort en
un volumen de 20-30 ml a una concentración celular
de 5 x 10^{7}/ml a 37ºC durante 90 minutos con una m.o.i. de 0,01
a 0,001 (determinada por un ensayo de inmunofluorescencia). Después,
las células PK15 se sembraron en placas de cultivo tisular (150 mm
de diámetro), mientras las células 38A_{1}D en suspensión se
incubaron en frascos con agitación suave (Tecnomara, Suiza). Para la
síntesis de ADNc, se recogió el sobrenadante del cultivo tisular 48
horas después de la infección, se aclaró a 12.000 g, y después los
virus se sedimentaron en un rotor TFA 20 (Contron, Italia) a 54.000
g durante 12 horas.
Preparación de suero de cabra
anti-HCV. Se estableció una cepa de células
fibroblásticas a partir de la biopsia de piel de una cabra joven por
técnicas de cultivo celular convencionales. Las células se hicieron
crecer inicialmente en medio F-10 con FCS al 10% y
después en DMEM con FCS al 10%. Los fibroblastos de cabra se
infectaron con HCV. Durante las primeras 26 horas después de la
infección, las células se lavaron cada 8 horas 3 veces con PBS y
después se incubaron en DMEM con suero de cabra preinmune (PGS) al
10%. El sobrenadante del cultivo tisular se recogió y se uso como
virus patrón 48 horas después de la infección. Antes de la
inmunización, las células de cabra para 30 placas de cultivo tisular
(150 mm de diámetro) se mantuvieron durante 3 pases en medio con PGS
al 10% y después se infectaron con el virus patrón. La cabra se
inmunizó con virus sedimentados inactivados con rayos X y células
infectadas 48 horas después de la infección. Ambos se emulsionaron
en adyuvante de Freund (completo para inmunización básica,
incompleto para inyecciones de refuerzo) y se inyectaron por vía
subcutánea. Para obtener anticuerpos que reconozcan moléculas
desnaturalizadas, las preparaciones del antígeno se incubaron en SDS
al 0,2%, DTT 3 mM a 95ºC durante 5 minutos antes de la
inyección.
Preparación de ARN, síntesis y clonación de
ADNc. Se aisló ARN de viriones usando el método del tiocianato
de guanidina descrito por Chirgwin et al. (1979). El ARN de
viriones sedimentados (5 \mug de ARN total, aproximadamente 0,5
\mug de ARN de HCV) y 0,1 \mug de cebador hexanucleotídico
aleatorio (Pharmacia, Suecia) en 20 \mul de agua se calentaron a
65ºC durante 10 minutos, se enfriaron en hielo, y se ajustaron a un
tampón de primera cadena (Tris-HCl 50 mM pH 8,3; KCl
30 mM; MgCl_{2} 8 mM; DTT 1 mM, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 1 mM cada
uno y 500 unidades de RNAguard [Pharmacia Suecia] por ml) en un
volumen final de 32 \mul. Se añadieron 35 unidades de
transcriptasa inversa AMV (Life Sciences Inc., Estados Unidos).
Después de 1 hora a 43ºC, la mezcla de reacción se añadió a un vial
de mezcla de síntesis de segunda cadena (kit de síntesis de ADNc,
Pharmacia, Suecia). La síntesis de segunda cadena, la preparación
de extremos romos, y el ligamiento con adaptador Eco RI y la
fosforilación se hicieron según lo recomendado por el proveedor.
El ADNc se fraccionó por tamaños por
electroforesis preparativa en gel de agarosa. La parte del gen que
contenía moléculas de ADN menores de 0,5 kb se desechó. El ADN
restante se concentró corriendo el gel de forma inversa durante 15
minutos y se extrajo de la agarosa después de 3 ciclos de
congelación y descongelación con fenol.
El ADNc co-precipitado con
etanol y el ADN de \lambdagt11 (1 \mug de brazos desfosforilados
digeridos con EcoRI, Promega, Estados unidos) se ligó por 3 unidades
de ADN ligasa T4 (Pharmacia, Suecia) en un volumen total de 10
\mul de tampón ligasa (Tris-HCl 30 mM pH 7,4;
MgCl_{2} 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1mM). El envasado in vitro
con un extracto disponible en el mercado (Packagene, Promega,
Estados Unidos) y la infección de células K12 de E. coli,
cepa Y 1090, con los fagos resultantes se realizó según lo
recomendado por el proveedor. La biblioteca se amplificó una vez
como se ha descrito (Davis et al., 1986).
Exploración de la biblioteca de
\lambdagt11. La exploración se realizó básicamente como
se ha descrito (Young y Davis, 1983) usando el sistema Protoblot
adquirido en Promega, Estados unidos (Huynh et al., 1985) y
una dilución de suero de 10^{-3}. Para la reducción de fondo, el
suero de cabra anti-HCV se trató con lisado de E.
coli (cepa Y 1090) a 0,8 mg/ml (Huynh et al., 1985). Se
pudieron identificar dos clones positivos que tenían insertos de 0,8
kb y 1,8 kb, respectivamente.
Traslado de mella e hibridación de
Northern. Se hibridaron 50 ng de la secuencia de ácido nucleico
de HCV de 0,8 kb marcada con [\alpha^{32}P] dCTP (3000 Ci por
mMol, Amersham Buchler, FRG) por traslado de mella (kit de traslado
de mella, Amersham Buchler, FGR) con filtros Northern a una
concentración de 5 ng por ml de mezcla de hibridación (5 x SSC; 1 x
solución de Denhart; fosfato sódico 20 nM pH 6,8; SDS al 0,1% y 100
\mug de ARNt de levadura [Boehringer-Mannheim,
FRG] por ml) a 68ºC durante 12 a 14 horas. Las membranas se lavaron
después como se ha descrito (Keil et al., 1984) y se
expusieron a -70ºC a películas Kodak X-Omat AR
durante tiempos variados usando pantallas de intensificación Agfa
Curix MR 800.
La secuencia de ácido nucleico de 0,8 kb hibridó
no sólo con el ARN de HCV intacto sino también con productos de
degradación del mismo. La secuencia de ácido nucleico de 0,8 kb no
hibridó con la secuencia de ácido nucleico de 1,8 kb, indicando que
estas dos secuencias de ácido nucleico corresponden a fragmentos del
genoma del HCV que no están localizados en la misma región del ARN
genómico.
Secuenciación de nucleótidos. La
subclonación de insertos de ADN de fago específico de HCV en el
plásmido pEMBL 18 plus se hizo de acuerdo con los procedimientos
convencionales (Maniatis et al., 1982). El ADN de cadena
sencilla de plásmidos pEMBL recombinantes se preparó como se ha
descrito (Dente et al., 1985). Las reacciones de
secuenciación con didesoxi (Sanger et al., 1977) se
realizaron según lo recomendado por el proveedor (Pharmacia,
Suecia).
Preparación de ARN, síntesis y clonación de
ADNc. La preparación de ARN, la síntesis de ADNc, la selección
de tamaños y el ligamiento del ADNc co-precipitado y
el ADN de \lambdagt10 (1 \mug de brazos desfosforilados
digeridos con EcoRI, Promega, Estados Unidos) se hicieron como se ha
descrito anteriormente. El envasado in vitro del ADN del fago
usando Packagene (Promega, Estados Unidos) y la titulación de los
fagos en la cepa C 600 HFL de E. coli se realizaron según lo
sugerido por el proveedor. La biblioteca se amplificó una vez (Davis
et al., 1986), y réplicas transferidas a membranas de
nitrocelulosa (Amershan Buchler, FRG) (Benton y Davis, 1977) se
hibridaron con oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente
para la hibridación de Northern. La exploración con fragmentos de
ADNc marcados con [\alpha^{32}P] dCTP por traslado de mella (kit
de traslado de mella, Amersham Buchler, FRG) se hizo como se
describe por Benton y Davis (1977). Los clones positivos se
purificaron en placas y los insertos se subclonaron en plásmidos
pEMBL (Maniatis et al., 1982; Dente et al., 1985;
Davis et al., 1986)
Un oligonucleótido de 17 bases marcado en el
extremo 5' con A^{32}P complementario a la secuencia de ARN que
codifica la secuencia de aminoácidos Cys Gly Asp Asp Gly Phe se usó
para explorar una biblioteca de ADNc de \lambdagt10. Este
oligonucleótido que hibridó con el ARN genómico de HCV de
aproximadamente 12 kb, identificó entre otros un clon con un inserto
de 0,75 kb, que hibridó también con ARN de HCV. Esta secuencia de
ácido nucleico de 0,75 kb que representa un fragmento del genoma de
HCV junto con el inserto de la secuencia de ácido nucleico de
\lambdagt11 de 0,8 kb se usaron para explorar adicionalmente la
biblioteca dando como resultado una serie de secuencias de ácido
nucleico de HCV solapantes de las que las posiciones relativas y los
mapas de sitios de restricción se muestran en la figura 1. Estos
fragmentos de secuencia de ácido nucleico del genoma de HCV se
localizan entre las siguientes posiciones de ácido nucleico
Fragmento de 4,0 kb: 27-4027
Fragmento de 4,5 kb: 54-4494
Fragmento de 0,8 kb:
1140-2002
Fragmento de 4,2 kb:
3246-7252
Fragmento de 5,5 kb:
6656-11819
y dentro de aproximadamente las siguientes
posiciones de ácido nucleico
Fragmento de 3,0 kb:
8920-11920
Fragmento de 1,9 kb:
10384-12284
Fragmento de 0,75 kb:
10913-11663
Secuenciación de nucleótidos. Para la
determinación de la secuencia de nucleótidos completa se usaron
exonucleasa III y nucleasa S1 (enzimas de Boehringer Mannheim, FRG)
para establecer bibliotecas de deleción de insertos de ADNc
derivados de HCV subclonados en plásmidos pEMBL 18+ o 19+
(Hennikoff, 1987). La secuenciación con didesoxi (Sanger et
al. 1977) de moldes de ADN de cadena sencilla (Dente et
al., 1985) o de doble cadena se realizó usando el kit de
secuenciación con polimerasa T7 (Pharmacia, Suecia).
A partir de los fragmentos de ADNc se pudo
determinar una secuencia continua de 12284 nucleótidos de longitud
como se muestra en la figura 2 (SEC ID Nº 1). Esta secuencia
contiene una fase de lectura abierta (ORF) larga, que comienza con
el codón ATG en la posición 364 a 366 y termina con TAG como un
codón de parada de la traducción en 12058 a 12060. Esta ORF está
constituida por 3898 codones capaces de codificar una proteína de
435 kDa con una secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2
(SEC ID Nº 1-2). Se detectaron tres intercambios de
nucleótidos como resultado de diferencias en la secuencia de
nucleótidos causadas por posible heterogeneidad de la población de
virus, dos de los cuales dieron como resultado cambios en la
secuencia de aminoácidos deducida (figura 2,
SEC ID Nº 1-2).
SEC ID Nº 1-2).
Se concluye que el genoma de HCV casi completo
se ha clonado y secuenciado por los procedimientos descritos
anteriormente.
La secuencia de ácido nucleico de \lambdagt11
de 0,8 kb que codifica un polipéptido de HCV inmunogénico
identificada con suero anti-HCV se secuenció
parcialmente (véase figura 3, SEC ID Nº 8-9), lo que
puso de manifiesto que esta secuencia está localizada en 1,2 y 2,0
kb en el ARN de HCV.
Los fragmentos de ADNc derivados de dos regiones
del genoma de HCV, es decir el inserto de \lambdagt11 de 0,8 kb
del ejemplo 1 que codifica los aminoácidos 262-546
(véase figura 2, SEC ID Nº 1-2) y la secuencia de
ácido nucleico que codifica los aminoácidos 747-1071
(figura 2, SEC ID Nº 1-2), se expresan como
proteínas de fusión en el sistema pEx (Strebel, K et al.,
1986).
Los extractos bacterianos se separaron por
SDS-PAGE y se tiñeron de acuerdo con procedimientos
convencionales, y después se ensayaron para la reactividad con el
suero de cabra anti-HCV del ejemplo 1 en una
transferencia de Western.
Las proteínas de fusión específicas de HCV se
purificaron parcialmente por SDS-PAGE y se
transfirieron a nitrocelulosa y se incubaron con el suero de cabra
anti-HCV. Se obtuvieron anticuerpos específicos
contra dichas proteínas de fusión después de la elución.
Se emplearon anticuerpos específicos para las
proteínas de fusión mencionadas anteriormente en un ensayo de
radioinmunoprecipitación.
Ambas proteínas de fusión expresadas en el
sistema pEx se identificaron claramente como específicas para HCV
después de la reacción con el suero de cabra
anti-HCV.
El antisuero monoespecífico preparado contra
ambas proteínas de fusión precipitó glicoproteínas de HCV.
Los anticuerpos específicos para la proteína de
fusión 262-546 precipitaron las proteínas de 44/48
kD y 33 kD, los anticuerpos específicos para la proteína de fusión
747-1071 precipitaron la proteína de 55 kD en
células infectadas con virus.
Un fragmento del clon de 4,0 kb mostrado en la
figura 1 (pHCK11) se prepara comenzando en el sitio de restricción
HinfI (nucleótido 372) y terminando en un sitio EcoRI artificial
(nucleótido 4000) (Maniatis et al. 1982). Para el extremo 5'
se sintetizó un adaptador de oligonucleótido que contenía un
saliente compatible con BamHI, el
ATG(364-366) original como codón de comienzo
de la traducción y un extremo sobresaliente compatible con HinfI en
el extremo 3' (SEC ID Nº 5 y 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5' \+ GATCCACC ATG GAGTT \+ HinfI\cr BamHI \+
\hskip1cm GTGGTACCTCAACTTA \+
5'\cr}
En el extremo 3' de la construcción se introdujo
un codón de parada de la traducción por deleción del extremo
sobresaliente EcoRI con nucleasa de frijol Mungo y el ligamiento a
un resto adaptador StuI/EcoRI de extremo romo (SEC ID Nº 7):
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5' \+ GCC TGA ATTC \+ 3'EcoRI\cr \+
CGGACTTAAG\+\cr}
(Maniatis et al.
1982).
Antes de insertar las secuencias de HCV
mencionadas anteriormente en virus vaccinia el gen heterogéneo se
clona en un vector de recombinación. Para este propósito se usó un
plásmido pGS62 (Cranage, M.P. et al. 1986) que contiene un
sitio de clonación cadena abajo del promotor P7.5K en la secuencia
timidina quinasa de 4,9 kb. El sitio de clonación comprende tres
sitios únicos de restricción, BamHI, SmaI y EcoRI. El vector de
recombinación pGS62-3.8 se estableció por ligamiento
de la secuencia de HCV descrita (372-4000) junto con
los adaptadores en el pGS62 digerido con BamHI/EcoRI.
En base al plásmido se estableció una serie de
15 mutantes de deleción. Mediante el tratamiento con Exonucleasa III
(Hennikof et al., 1987) se realizó el acortamiento posterior
del ADNc de HCV desde el extremo 3'. Todas las deleciones se
localizan en la región que codifica la proteína de 55 kD de HCV por
la retirada de aproximadamente 100 pb; la mayor parte de la proteína
de 55 kD se pierde en el mutante 15 que termina en el nucleótido
2589. Los clones de ADNc acortados con ExoII se ligaron en el pGS62
dando lugar al pGS62-3.8Exo 1-15
(figura 4).
Se infectaron células CVI con vaccinia (cepa
Copenhagen, mutante TS7) a una MOI de 0,1. Tres horas después de la
infección se transfectó el ADN de pGS62-3.8 así como
el ADN de vaccinia WR por el método de precipitación con
Ca_{3}(PO_{4})_{2} y se incubó durante dos días.
La progenie del virus se recogió y seleccionó para el fenotipo tk en
células 143 tk en presencia de
bromo-desoxi-Uridina (100
\mug/ml). Esta selección se realizó al menos dos veces seguidas
por dos ciclos adicionales de purificación en placas.
Se infectaron células CVI a una MOI entre 2 y 10
con recombinantes vaccinia-HCV y se incubaron
durante 8-16 horas. Después de la fijación de las
células se realizó inmunofluorescencia indirecta usando anticuerpos
monoclonales específicos para la proteína de 55 kD de HCV o sueros
anti-HCV polivalentes. En todos los casos se pudo
demostrar una fluorescencia citoplasmática.
Después de los análisis por
radioinmunoprecipitación y transferencia de western de las células
infectadas con recombinantes de vaccinia se detectaron cuatro
proteínas específicas de HCV. El marcaje con [^{3}H] glucosamina
demostró que tres de estas proteínas están glicosiladas. Los pesos
moleculares aparentes de estas proteínas fueron idénticos a los
encontrados en células infectadas por HCV con sueros específicos
para HCV, concretamente 20 kD (principal), 44/48 kD, 33 kD y 55
kD.
El procesamiento y las modificaciones
proteolíticos parecen ser auténticos puesto que las proteínas de HCV
producidas por la expresión por virus vaccinia tienen los mismos
pesos moleculares aparentes que en células infectadas por HCV.
Se infectaron cuatro grupos de ratones (3
ratones/grupo) una vez con
| a. Vaccinia WR tipo silvestre | (5x10^{6} pfu/individuo) | WR |
| b. Vaccinia 3.8 recombinante | (5x10^{7} pfu/individuo) | VAC3.8 |
| c. Vaccinia 3.8Exo 4 (55 kD delecionado) | (5x10^{7} pfu/individuo) | VAC3.8Exo 4 |
| d. Vaccinia 3.8Exo 5 | (5x10^{7} pfu/individuo) | VAC3.8Exo 5 |
| e. Vaccinia 3.8Exo 15 (55 kD delecionado) | (5x10^{7} pfu/individuo) | VAC3.8Exo 15 |
por inyección de virus purificado por vía
intraperitoneal.
Se tomaron muestras de sangre de los ratones
tres semanas después. La reactividad de los sueros se comprobó en un
ensayo de neutralización del virus con HCV (Alfort) en células
PK[15] después de dilución en serie.
(Rümenapf, T. et al. 1989).
\newpage
- a. WR
- <1:2
- b. VAC3.8
- 1:96
- c. VAC3.8Exo 4
- 1:96
- d. VAC3.8Exo 5
- <1:2
- e. VAC3.8Exo 15
- <1:2
A partir de lo anterior se puede concluir que el
virus vaccinia que contiene una secuencia de ácido nucleico que
comprende la información genética para todas las proteínas
estructurales (VAC3.8) es capaz de inducir anticuerpos
neutralizantes de virus en ratones, mientras que las construcciones
incompletas VAC3.8Exo 5-15 y WR no.
Puesto que todas las deleciones están
localizadas en la región que codifica la proteína de 55 kD de HCV
(la mayor parte de la proteína de 55 KD se ha perdido en el mutante
15 que termina en el nucleótido 2589) y las otras proteínas
estructurales aún se expresan por los virus vaccinia recombinantes,
está claro que la proteína de 55 kD es responsable de la inducción
de anticuerpos neutralizantes de HCV.
De tres cerditos (de aproximadamente 20 kg de
peso) un animal (nº 28) se infectó con virus vaccinia tipo silvestre
(cepa WR) y los otros dos (nº 26, 27) con VAC3.8 recombinante (i.p.,
i.v. e i.d., respectivamente). Para la infección se aplicó a cada
animal 1x10^{8} pfu de virus vaccinia.
Los síntomas clínicos en el transcurso de la
infección por vaccinia eran evidentes en forma de eritema en el lado
de escarificación y fiebre (41ºC) en el día seis después de la
infección.
Tres semanas después de la infección se comprobó
la reactividad de los respectivos sueros contra vaccinia (WR en
células CVI) y HCV (Alfort en células PK15).
La neutralización se ensayó después de dilución
en serie de los sueros comprobando la ausencia completa de cpe
(vaccinia) o señales específicas en inmunofluorescencia (HCV).
(Rumenapf, T. et al. 1989).
- cerdo 28 (WR)
- 1:8
- cerdo 26 (VAC3.8)
- 1:16
- cerdo 27 (VAC3.8)
- 1:16
\vskip1.000000\baselineskip
- cerdo 28 (WR)
- <1:2
- cerdo 26 (VAC3.8)
- 1:32
- cerdo 27 (VAC3.8)
- 1:16
Cuatro semanas después de la inmunización con
vaccinia cada uno de los cerdos se expuso por infección con HCV
Alfort 5x10^{7} TCID_{50}. El virus se aplicó por vía oronasal
de acuerdo con la vía natural de infección. Se ha determinado de
forma experimental que esta cantidad de virus es forzosamente letal
para los cerdos.
En el día cinco después de la infección de
exposición el cerdo 28 mostró fiebre de 41,5ºC y mantuvo esta
temperatura hasta el día 12. El animal moribundo se sacrificó ese
día expresando síntomas clínicos típicos de cólera porcino
agudo.
Los dos cerdos (26, 27) inmunizados con VAC3.8
no mostraron ningún síntoma de enfermedad después de la exposición
con HCV durante más de 14 días.
Ejemplo Comparativo
6
El clon pHCK11 se digiere con enzimas de
restricción SacI y HpaI de acuerdo con técnicas convencionales.
El fragmento de 1,3 kb resultante, localizado
entre los nucleótidos 2672 (AGCTC) y 3971 (GTT) que comprende la
mayor parte de la proteína de 55 kD de HCV, se aísla y se clona en
el gen gX del virus de la pseudorrabia (PRV) (Maniatis et al.
1982).
Brevemente, la secuencia gX clonada se digirió
con SacI y ApaI. Los extremos ApaI 5' sobresalientes se hicieron
romos llenándolos con fragmento Klenow. Después del ligamiento, el
supuesta secuencia que codifica el péptido líder gX se localizó
justo cadena arriba de la secuencia de 55 kD de HCV insertada.
Se introdujo un codón de parada de la traducción
cadena abajo de la secuencia de HCV por digestión con Bgl II (sitio
Bgl II: 3936-3941) y religamiento después de llenar
los salientes con fragmento Klenow. Esta construcción se colocó
cadena abajo del promotor gX de PRV (clon 16/4-1.3).
El clon 16/4-1.3 se transfectó en células MDBK por
el método de DEAE dextrano (Maniatis et al. 1989). Las
células se infectaron 16 horas después con PRV (m.o.i.=1). Las
células se fijaron 4 horas después de la infección con una mezcla de
metanol/acetona fría (-20ºC). La inmunofluorescencia indirecta con
anticuerpos monoclonales (MAB) anti-proteína de 55
kD de HCV mostró una señal específica en el 5-10% de
las células. Las células infectadas por PRV sin transfección y las
células transfectadas sólo con el clon 16/4-1.3 no
mostraron ninguna señal en este ensayo.
La Figura 1 muestra mapas físicos de diferentes
clones de ADNc derivados de HCV y su posición en relación con el
genoma de ARN (línea superior). Dos clones de ADNc derivados de HCV
aislados después de la exploración con la sonda de anticuerpo (clon
de 0,8 kb) o con la sonda oligonucleotídica degenerada (clon de 0,75
kb) se muestran en la segunda línea. Los fragmentos de ADNc elegidos
para la secuenciación de nucleótidos se indican más adelante. Todos
los números representan tamaños de fragmentos de ADN en kb. Sitios
de restricción: B = Bgl II; E = EcoRI; H = Hind III; K = Kpn I; S =
Sal I; Sm = Sma I.
La Figura 2 representa una secuencia de ácido
nucleico de HCV y la secuencia de aminoácidos deducida de la fase de
lectura abierta larga. Se indican los intercambios de nucleótidos
entre diferentes clones de ADNc y los cambios resultantes en la
secuencia de aminoácidos. La parte de la secuencia correspondiente
al oligonucleótido usado para la exploración está subrayada.
La Figura 3 muestra la secuencia de ADNc de
parte del inserto de 0,8 kb de HCV de un clon de \lambdagt11 y la
secuencia de aminoácidos deducida en código de una letra.
La Figura 4 muestra la longitud del ADN de HCV
clonado en el vector pGS62. Una serie de 15 mutantes de deleción
derivados del clon de ADNc pHCK11 se estableció por tratamiento con
Exonucleasa III y se clonó en el vector pGS62 dando lugar a
pGS62-3.8Exo 1-15. Se indican los
nucleótidos del extremo 3'.
BENTON, W., y DAVIS, R.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Azko N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Amhen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 04120-66379
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 04120-50592
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 37503 akpha nl
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna y diagnóstico del virus del cólera porcino
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12284 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: virus del cólera porcino
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Alfort
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- ESTIRPE CELULAR: PK 15 y 38A1D
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 364..12060
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= 435_kDA_protein
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: primer_bind
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (2587..2619)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= primer_1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: primer_bind
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (2842..2880)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= primer_2
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: variación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: remplazo(127, "c")
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: variación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: remplazo(1522, "g")
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: variación
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: remplazo(10989, "t")
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3898 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..33
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= primer_1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTACTAACC ACGTTAAGTG CTGTGACTTT AAA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..39
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= primer_2
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTGTTCTC AAGGTTGTGG GGCTCACTGC TGTGCACTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= Adaptator_1/nota= "Cadena superior del adaptador Bam HI - Hinf I, que contiene ATG en 364-366"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCACCAT GGAGTT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= Adaptator_2/nota= "Cadena inferior del adaptador Bam HI - Hinf I, que contiene ATG en 364-366"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGTACCTC AACTTA
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..10
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /etiqueta= Adaptator_3/nota= "Adaptador romo de doble cadena Stu I - Eco RI"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTGAATTC
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 300 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: clon de lambda gt11
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..300
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /nota= "Parte del fragmento insertado de 0,8 kb de Lambda gt11"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 100 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
Claims (10)
1. Un polipéptido del virus del cólera
porcino (HCV) con un peso molecular de 44/48 kD que reacciona con un
antisuero monoespecífico preparado contra una proteína de fusión
existente de AA262-546 de la SEC ID Nº 1.
2. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que contiene una o más
modificaciones post-traduccionales.
3. Una secuencia de ácido nucleico, que
es un fragmento del genoma de HCV, que codifica el polipéptido de la
reivindicación 1.
4. Una molécula de ácido nucleico
recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico vector y
una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación
3.
5. Una célula hospedadora capaz de
producir un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que
comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con
la reivindicación 4.
6. Una célula hospedadora de acuerdo con
la reivindicación 5, caracterizada en que la célula
hospedadora es una bacteria.
7. Un virus recombinante que contiene
una molécula de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la
reivindicación 4.
8. Una vacuna para la protección de
animales contra la infección por HCV, caracterizada en que
comprende una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6
o un virus recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un método para la preparación de una
vacuna de HCV, caracterizado en que una célula hospedadora de
acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 o un virus recombinante de
acuerdo con la reivindicación 7 se propaga en un cultivo, después de
lo cual la célula hospedadora o el virus recombinante se recoge y se
formula en una preparación farmacéutica con actividad
inmunizante.
10. Uso in vitro de un polipéptido
de acuerdo con la reivindicación 1 en un método de diagnóstico para
detectar la presencia de antígeno o anticuerpo de HCV.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89104921 | 1989-03-19 | ||
| EP89104921 | 1989-03-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2261148T3 true ES2261148T3 (es) | 2006-11-16 |
Family
ID=8201107
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00204410T Expired - Lifetime ES2261148T3 (es) | 1989-03-19 | 1990-03-12 | Vacuna y diagnostico del virus del colera porcino. |
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