HU208494B - Process for producing serum and active component against pig-cholera virus - Google Patents
Process for producing serum and active component against pig-cholera virus Download PDFInfo
- Publication number
- HU208494B HU208494B HU901571A HU157190A HU208494B HU 208494 B HU208494 B HU 208494B HU 901571 A HU901571 A HU 901571A HU 157190 A HU157190 A HU 157190A HU 208494 B HU208494 B HU 208494B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sequence
- cdna
- polypeptide
- hcv
- dna
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 title claims description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001479434 Agfa Species 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000686824 Enterobacteria phage N4 Virion DNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 101000644628 Escherichia phage Mu Tail fiber assembly protein U Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 HCV nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001374849 Liparis atlanticus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 101150015940 gL gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás sertéskolera-vírusra jellemző polipeptid, ilyen polipeptideket kódoló nukleinsavszekvencia, ilyen nukleinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsav-molekula, ilyen rekombináns nukleinsav-molekulát tartalmazó gazdasejt, valamint sertéskolera-vírus elleni oltóanyag előállítására.
A klasszikus sertésláz vagy sertéskolera (HC) világszerte, számos országban gazdaságilag jelentékeny sertésbetegség. Ismereteink szerint természetes viszonyok között csak a sertés érzékeny a sertés-kolerára. A sertéskolera nagymértékben fertőző betegség, amely a kapillárisok falának degenerációját okozza. Ennek következtében a belső szervek vérzése és elhalása következik be. A sertéskolera első szakaszát láz, anorexia, hányás és hasmenés jellemzi, amit a betegség krónikus szakasza követhet, ez az anyagdisznók meddőségével, elvetélésével, illetve gyenge fejlettségű utódokkal jár együtt. Az első tünetek megjelenését követő két héten belül azonban majdnem valamennyi sertés elpusztul.
A kórokozó, a sertéskolera-vírus (HCV) szerkezeti és szerológiai szempontból hasonló az állatok szarvasmarhahasmenés vírusához (BVDV), és a juh határkor vírusához (BDV). Ezeket a vírusokat a togaviridae családon belül a pestivírus-nemzetségen belül csoportosítják. A pestivírus típusok genetikai anyagát RNStermészetűnek tartották, azaz olyan pozitív szálú RNSnek, amelynek jelentős poliadenilezési hiánya van. A HCV valószínűleg 3-5 szerkezeti proteint tartalmaz, és lehet, hogy közülük kettő glikozilezett. A nem szerkezeti vírus-proteinek száma ismeretlen.
A sertéskolera fertőzés leküzdésére (gyengített vírusokat [6 610 013 számú holland közrebocsátási irat] vagy inaktivált vírusokat tartalmazó [Nippon Jouigaku Zasshi 24, 71-80 (1962); a 3 455 782 számú USA-beli szabadalmi leírás és a 2 714 258 számú NSZK-beli közrebocsátási irat]) módosított HCV oltóanyagokat már kidolgoztak, és ilyenek jelenleg használatban vannak. Azonban az ilyen módosított vírus elleni oltóanyagban használandó HCV anyag előállítására szolgáló szövettenyészet-infekció kis víruskitermelést eredményez, és a virionokat nehezen lehet tisztítani. A módosított élő vírust tartalmazó oltóanyagok mindig magukban rejtik annak veszélyét, hogy az állatokat olyan részlegesen gyengített kórokozó HCV-vel oltják be, amelyek még fertőzőek. Ez a beoltott állat vagy utódja megbetegedését okozhatja, az oltóanyagban lévő egyéb vírusok pedig kontaminációt okozhatnak. Ezenkívül a gyengített vírus visszanyerheti virulens állapotát.
Inaktívált oltóanyagok használatának tehát számos hátránya van, éspedig a vírusok csak részleges inaktiválásának veszélye; az, hogy csak alacsony immunitási szint érhető el, és ezáltal további immunizálás szükséges, valamint az, hogy az inaktiválási kezelés által az antigén determinánsok megváltoznak, és így az inaktivált vírus kevésbé immunizálóvá válik.
A módosított HCV oltóanyag alkalmazása nem megfelelő továbbá állatállomány kiirtása szempontjából sem.
Ismereteink szerint eddig nem álltak rendelkezésre olyan diagnosztikai vizsgálatok, amelyekkel sertések esetén különbséget tehetünk HCV és BVDV fertőzés között. Ez fontos körülmény mivel sertések BVDV fertőzése kisebb jelentőségű, mint a HCV fertőzés. Ez azt jelenti, hogy BVDV fertőzött sertéseket nem kell kiirtani.
Olyan oltóanyagok, amelyek csak azt a szükséges és releváns HCV immunizáló anyagot tartalmazzák, amely alkalmas a kórokozókkal szembeni immunválasz kiderítésére, nem járnak a módosított oltóanyagok fent tárgyalt hátrányaival.
A találmány tárgyát képező eljárás olyan nukleinsav-szekvencia előállítására, amely a sertéskolera-vírusra jellemző polipeptidet kódolja. Az említett nukleinsav-szekvencia vagy polipeptid fragmentumainak előállítására szolgáló eljárás szintén a találmány tárgyát képezi. Mind a nukleinsav-szekvenciát, mind a polipeptidet vagy azok fragmentumait használjuk olyan oltóanyag előállítására, amely csak az állatok HCV fertőzése elleni immunizálásához szükséges és releváns immunizáló anyagot tartalmazza. „Nukleinsav-szekvencia” a leírásban mind RNS-, mind DNSszekvenciát jelöl.
Egy, a találmány szerinti nukleinsav-szekvenciát mutat be a 2. ábra. A technika állása szerint ismert, hogy a genetikai kód degenerációja lehetővé teszi, hogy egy kodonban helyettesítsünk bázisokat, ami egy másik kodont eredményez, amely azonban ugyanazt az aminosavat kódolja, például mind GAT, mind GAA a glutaminsav kodonja. Következésképpen nyilvánvaló, hogy a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciájú polipeptid kifejezésre használhatunk olyan nukleinsav-szekvenciát, amelynek alternatív kodon kompozíciója eltér a 2. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvenciától.
A találmány tárgyköréhez tartozik továbbá olyan nukleinsav-szekvenciák előállítási eljárása, amelyek szigorú körülmények között a 2. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvenciához hibridizálnak. Ezek a nukleinsav-szekvenciák hasonlóak a 2. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvenciához, azonban tartalmazhatnak nukleotid helyettesítéseket, mutációkat, betoldásokat, kiiktatásokat és hasonlókat, és olyan polipeptideket kódolnak, amelyek funkcionálisan egyenértékűek a 2. ábrán bemutatott polipeptiddel, azaz egy hasonló polipeptid aminosav-szekvenciája nem azonos a 2. ábrán bemutatott aminosav-szekvenciával, azonban a HCV jellemző immunológiai tulajdonságainak megfelelően viselkedik.
A találmány tárgyköréhez tartozik olyan polipeptidek előállítására szolgáló eljárás is, amelyeket ilyen hasonló nukleinsav-szekvenciák kódolnak.
A 2. ábrán bemutatott nukleinsav-szekvencia egy, a HCV genomiális RNS-éről [Vírus Rés. 11 /4/, 281-91 (1988)] származtatott cDNS-szekvencia [Virology 171 /1/, 18-27 (1989)]. Ez a folytonos szekvencia 12 284 nukleotid hosszúságú, és egy nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz, amely a 364-366 helyzetű ATG kodonnál kezdődik, és a 12 058-12 060 helyzetben transzlációs stop-kodonként elhelyezkedő TGA kodon2
HU 208 494 Β nal végződik. Ez az ORF 435 kDa protein kódolására képes 3898 kodonból áll.
In vivő, egy fertőzött sejtben végbemenő HCV replikáció során ez a protein poliprotein prekuzrzor molekulaként szintetizálódik, amely ezután a prekurzor molekula (enzimatikus) hasítása útján polipeptid fragmentumokká alakul. Ezek a fragmentumok képezik - lehetséges transzláció utáni módosulások útján - a vírus szerkezeti és nem szerkezeti proteinjeit. Egy előnyös nukleinsav-szekvencia tartalmazza egy olyan fragmentum genetikai információját, amely HCV ellen immunizáló tulajdonságú, vagy HCV-re jellemző immunológiai tulajdonságú, vagy tartalmazza egy olyan fragmentum részletének genetikai információját, amely még mindig rendelkezik az immunizáló tulajdonságokkal vagy a HCV-re jellemző immunológiai tulajdonságúA 2. ábrának megfelelő polipeptid olyan polipeptidfragmentumainak előállítása, amelyek állatok HC elleni immunizálására használhatók, szintén a találmány tárgykörébe tartozik. Fragmentumot kódoló tartomány az 1-249, 263-487, 488-688 vagy 689-1067 helyzetű aminosav-tartományban helyezkedik el. Az 1-249 tartomány lényegében a magproteint képviseli, míg a 263-487, 488-688 és 689-1067 tartományok lényegében 44/48 kD, 33 kD, illetve 55 kD glükoproteineket képviselnek. Az említett kódoló tartományt vagy tartományokat vagy azok részleteit kódoló genetikai információt tartalmazó nukleinsav-szekvenciák előállítása szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
Egy HCV elleni oltóanyagban előnyösen alkalmazandó tartomány a HCV 55 kD proteinje vagy ennek olyan részlete, amely még rendelkezik immunizáló aktivitással.
A találmány szerint előnyösen alkalmazható továbbá egy olyan nukleinsav-szekvencia, amely legalább az említett 55 kD proteint vagy annak részletét kódolja.
Kiiktatásos HCV mutánsok vírust semlegesítő hatású anti-55 kD protein monokláris antitestekkel végzett vizsgálataival meghatároztuk továbbá a HCV 55 kD proteinnek egy olyan előnyös részletét, amely alkalmazható sertések HCV fertőzés elleni immunizálására. Egy ilyen, epitópot tartalmazó részlet átíveli a 812-859 helyzetű aminosav-szekvenciát, és ezt a 2799-2938 helyzetű nukleinsav-szekvencia kódolja. Egy ilyen aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptid vagy az ennek megfelelő nukleinsav-szekvenciát tartalmazó nukleinsav-szekvencia előállítása szintén tárgya a találmánynak.
Az 55 kD proteinből származtatható olyan további nukleinsav-szekvencia is, amelyet alkalmazhatunk sertések HCV fertőzésének diagnosztizálására, a HCV és BVDV megkülönböztetésére.
Egy ilyen nukleinsav-szekvenciát előnyösen az 55 kD proteint kódoló gén részét képező 2587-2619 vagy 2842-2880 helyzetű nukleinsav-szekvenciából származtathatunk. Diagnosztikai célokra előnyös oligonukleotid:
5’-CCT ACT AAC CAC GTT AAG TGC TGT GACTTTAAA-3’ vagy 5’-TTC TGT TCT CAA GGT TGT GGG GCT CAC TGC TGT GCA CTC-3’
A 2. ábrán bemutatott polipeptidekben vagy azok fragmentumaiban lehetségesek olyan változatok vagy módosulatok, így különböző törzsek vagy más származékok közötti természetes változatok, amelyek ugyanazon immunológiai tulajdonságokat őrzik meg. Ezeket a változatokat jelezheti(k) az általános szekvenciában lévő aminosav-különbség(ek) vagy a tárgyalt polipeptidben aminosav(ak) kiiktatása, helyettesítése, betoldása, inverziója vagy addíciója.
Ezentúl a rekombináns DNS technológia alkalmazásával fennáll az a lehetőség, hogy a 2. ábrán bemutatott polipeptid vagy annak fragmentumainak különféle származékait állítsuk elő azáltal, hogy az alapul szolgáló DNS-t különféle módon egyszeres vagy többszörös aminosav-helyettesítéssel, kiiktatással, addícióval vagy helyettesítéssel, például adott helyzetbe irányított mutagenézis útján módosítjuk. Minden ilyen módosítás, amely a 2. ábrán bemutatott polipeptid vagy fragmentumainak származékait eredményezi, a találmány tárgyát képezi, amíg a tárgyalt polipeptid vagy annak fragmentumának alapvető jellegzetes aktivitása lényegében változatlan marad.
Pelletizált virionokból (virionon egyetlen vírust értünk) RNS-t izoláltunk, és cDNS szintéziséhez használtunk. Ezt a cDNS-t Egtll fágba klónoztuk, és az illető tárat tenyésztettük, majd kecske anti-HCV antiszérummal válogató vizsgálatnak vetettük alá. Két pozitív kiónt azonosíthattunk, amelyekből kimutathattuk, hogy 0,8 kb és 1,8 kb méretű betoldásokat tartalmaznak. A 0,8 kb Ágtll betoldás szekvenciáját részlegesen meghatároztuk, és megállapítottuk, hogy az a HCV genomon az 1,2 és 2,0 kb között helyezkedik el (lásd a
2. ábrát).
A 2. ábrán bemutatott 5551-5793 helyzetű nukleotidszekvencia egy olyan, a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciát reprezentál, amely fertőzött állatokban HCV diagnosztizálására használható, és amely meglepő módon alkalmas HCV és BVDV megkülönböztetésére.
Egy olyan nukleinsav-szekvencia előállítása, amely az említett nukleinsav-szekvencia legalább egy szubszekvenciáját tartalmazza, amely még mindig alkalmazható HCV és BVDV megkülönböztetésére, szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
Rekombináns nukleinsav-molekula képzése céljából egy, a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia különféle vektormolekulákhoz kapcsolható, így plazmid DNS-hez, bakteriofág- vagy vírus-DNS-hez. A vektormolekulák további DNS-szekvenciákat tartalmaznak a transzkripció és transzláció iniciálására, szabályozására és befejezésére. Egy ilyen rekombináns nukleinsav molekulát tartalmazó gazdaszervezettel jellemzett rekombináns kifejező rendszert használhatunk arra, hogy egy, a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvencia által kódolt polipeptidet fejezzünk ki. A fenti rekombináns kifejező rendszer gazdaszervezetei lehetnek prokarióta eredetűek, például baktériumok, így E. coli, B. subtilis és
HU 208 494 B
Pseudomonas: vírusok, így tehénhimlő vírus és kiütéses baromfivírus vagy eukarióta eredetűek, így gombák vagy magasabbrendű eukarióta sejtek, így rovar-, növényi vagy állati sejtek.
Állatok HC elleni immunizálását elérhetjük például azáltal, hogy az állatoknak egy, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet úgynevezett „szubegység” oltóanyagként adunk be. A találmány szerinti eljárással előállított szub-egység oltóanyag polipeptidet tartalmaz általában tiszta formában, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozó jelenlétében.
Kis fragmentumokat előnyösen hordozó-molekulákhoz kapcsolunk immunizáló hatásuk fokozása érdekében. Erre a célra alkalmas hordozók makromolekulák, így természetes polimerek (proteinek, így a tapadó tengeri csigában lévő hemocianin, albumin, toxinok), szintetikus polimerek, így poliaminosavak (polilizin, polialanin) vagy amfifil vegyületek micellái, így szaponinok. Adott esetben ezek a fragmentumok polimerek, előnyösen lineáris polimerek formájában biztosíthatók. Ilyen szub-egység oltóanyagokban alkalmazandó polipeptideket előállíthatunk a technika állása szerint ismert eljárásokkal, így a fenti polipeptidek sertéskolera-vírusból történő izolálásával, rekombináns DNS műveletekkel vagy kémiai szintézissel.
Kívánt esetben az oltóanyagban használandó, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet módosíthatjuk in vitro vagy in vivő, például aminezés, karboxilezés vagy foszforilezés útján.
A szub-egység oltóanyagok egyik alternatíváját jelentik a „vektor”-oltóanyagok. A találmány szerinti eljárással előállított egyik nukleinsav-szekvenciát rekombináns műveletekkel integráljuk (például transzformáljuk) egy másik mikroorganizmus (azaz vírus vagy baktérium) genetikai anyagába, ezáltal lehetővé tesszük, hogy a mikroorganizmus kifejezzen egy, a találmánynak megfelelő polipeptidet. Ezt a rekombináns kifejező rendszert beadjuk az immunizálandó állatnak, ezt követően az replikálódik az állatban, és kifejezi a polipeptidet, ami az állat immunrendszerének stimulálását eredményezi. Oltóanyag-vektorok alkalmas példái himlővírusok (így tehénhimlő-, házinyúlvírusok), madárhimlő-vírusok (így baromfihimlő-vírus), Aujeszky-betegség vírusa, mirigy-vírusok, influenza-vírusok, bakteriofágok vagy baktériumok (így E. coli és Salmonella).
Az olyan rekombináns kifejező rendszert, amelynek nukleinsav-szekvenciájába betoldottunk egy, a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciát, tenyészthetjük például sejtkultúrákban, és kívánt esetben összegyűjthetjük a beoltott sejtekből, és adott esetben liofilizált - oltóanyaggá alakíthatjuk. A fenti, genetikailag manipulált mikroorganizmusokat is összegyűjthetjük az azokkal fertőzött élő állatokból. A fenti rekombináns kifejező rendszert szintén tenyészthetjük olyan sejtkultúrában, amely egy, a találmánynak megfelelő polipeptidet fejez ki, majd ezt követően a polipeptidet izoláljuk a sejtkultúrából.
Egy, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet vagy rekombináns kifejező rendszert tartalmazó oltóanyagot a technika állása szerint ilyen oltóanyagok előállítására ismert eljárásokkal állíthatunk elő. A találmány szerinti eljárással előállított oltóanyag állhat többek között a fentiekben ismertetett egész gazdaszervezetből, annak extraktumából, részlegesen vagy teljesen tisztított polipeptidből, valamint részlegesen vagy egészen tisztított rekombináns kifejező rendszerből.
A találmány szerinti eljárással előállított oltóanyagot hagyományos aktív immunizálási séma szerint adhatjuk be: lehetséges egyetlen vagy ismételt beadás egyezésben a formálási dózissal és olyan mennyiségben, amely terápiás szempontból hatékony és immunizáló hatású. Az oltóanyag beadható intradermálisan, szubkután, intramuszkulárisan, intravénásán vagy intranazálisan. Parenterális beadás esetére az oltóanyagok tartalmazhatnak még alkalmas hordozót, így vizet, sóoldatot vagy pufferoldatot hatásjavító szerrel vagy anélkül, stabilizáló, olthatóságot növelő, emulgeáló anyagokat és hasonlókat. Vakcina alkalmazását és a beadás módját a 4. és 5. példa szemlélteti.
Az oltóanyag tartalmazhat továbbá más kórok elleni immunizáló anyagokat vagy ezen immunizáló anyagok, így a parvovírus, Aujeszky-betegség vírus, sertésinfluenza-vírus, TGE-vírus, rotavírus, E. coli, Bordetella, Pasteurella, Erysipelas és mások antigénjeit kódoló nukleinsav-szekvenciákat.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket diagnosztikai vizsgálatokban is használhatjuk annak megállapítására, hogy egy állatban jelen van-e HCV antigén vagy antitest. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav-szekvenciákat használhatjuk továbbá olyan polipeptidek termelésére, amelyeket alkalmazhatunk a fenti diagnosztikai vizsgálatokban, vagy olyan hibridizációs próbaként, amellyel egy mintában HCV nukleinsav jelenléte megállapítható.
Az 1. ábra különböző HCV-eredetű cDNS kiónok fizikai térképét és azok RNS-genomhoz viszonyított helyzetét mutatja be (felső vonal). Két HCV eredetű cDNS kiónt mutat a második vonal, amelyeket vagy az antitest mintával (0,8 kb klón) vagy a degenerált oligonukleotid mintával (0,75 kb) végzett válogatás után izoláltunk. Alul láthatók a nukleinsav-szekvencia meghatározásra kiválasztott cDNS fragmentumok. Az öszszes szám kb egységben jelöli a DNS fragmentumok méretét. Restrikciós helyek: B = Bgl II, E = EcoRI, H = HindlII, K = KpnI, S = Sáli, Sm = Smal.
A 2. ábra egy HCV nukleinsav-szekvenciát és a hosszú nyitott leolvasási keret levezetett aminosavszekvenciáját mutatja. Utóbbi (ATG) startkodonnal kezdődik a 364-366 helyzetben, és ezt a keretet leolvasva a 12 058-12 060 (TGA) helyzetig nem fordul elő stop-kodon. Fel vannak tüntetve különböző cDNS kiónok közötti nukleotid kicserélődések és az aminosav-szekvenciában beálló változások. A válogató kísérletekhez használt oligonukleotidnak megfelelő szekvenciarész aláhúzással van jelölve.
A 3. ábra bemutatja egy Ágtll klón 0,8 kb HCV betoldásától kezdődő részének cDNS szekvenciáját és a levezetett aminosav-szekvenciát egybetűs kódokkal jelölve.
HU 208 494 Β
A 4. ábra mutatja a pGS62 vektorba klónozott HCV DNS hosszúságát. A cDNS pHCK.ll klónból származtatott, 15 kiiktatásos mutánsból álló sorozatot Exonuclease III-mal végzett kezeléssel hoztuk létre, és a pGS62 vektorba klónoztuk, ami kedvező volt pGS62-3.8Exo 1-15 szempontjából. A 3’ terminális nukleotidokat az ábra jobb oldalán tüntettük fel.
A találmányt a következőkben példákkal illusztráljuk.
1. példa cDNS klánok immunológiai azonosítása
Sejtek fertőzése és a vírus összegyűjtése
PK15 (sertésveséből származó sejtvonalú; ATCC megrendelési kód: CCL 33; [Am. J. Vet. Rés. 29, 153— 164 (1968); J. Gén. Virol. 10, 195-198 (1971)]) és 38A)D (leukémiás sertésből származó állandó sejtvonalú [Virology 57, 175-178 (1974)]) sejteket tenyésztettünk DMEM (Gibco) tápközegben 10% magzati borjúszérum (FCS) mellett, és szuszpenzióban megfertőztük az Alfort törzs virulens HCV (Veterinary School, Hannover, NSZK) útján, amelyet 20-30 ml térfogatban alkalmaztunk 5xl07/ml sejtkoncentrációban 37 °C hőmérsékleten 90 percig (immunfluoreszcens vizsgálat szerint) a fertőzési faktor (m. o. i.) 0,01— 0,001 értékénél. Ezután a PK15 sejteket (150 mm átmérőjű) szövettenyészeti tányérokra oltottuk rá, míg a szuszpenzióban lévő 38 AtD sejteket palackokban inkubáltuk enyhe kevertetés (Tecnomara, Svájc) mellett. A cDNS szintézis számára a fertőzést követően 48 óra múlva a szövettenyészet felülúszóját összegyűjtöttük, 12 000 g-vel centrifugálva átlátszóvá tisztítottuk, és ezután a vírust egy TFA 20 (Contron, Olaszország) rotorban 54 000 g-vel 12 órán keresztül centrifugálva pelletizáltuk.
Kecske anti-HCV szérum készítése
Egy fiatal kecskét használva szokásos sejttenyészeti eljárásokkal kötőszöveti sejttörzset létesítettünk bőrkimetszés útján. A sejteket kezdetben F-10 tápközegben (Gibco) tenyésztettük 10% FCS mellett, majd DMEM táp közegben (Gibco) 10% FCS mellett. A kecske kötőszöveti sejteket megfertőztük HCV-vel. A fertőzés utáni első 26 órában a sejteket 8 óránként 3szor mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és ezután DMEM-ben inkubáltuk 10% preimmun kecskeszérummal (PGS). A fertőzés után 48 órával a szövettenyészet felülúszóját összegyűjtöttük és törzs vírusként használtuk. Immunizálás előtt 30 (150 mm átmérőjű) szövettenyészeti tányér számára szánt kecskesejtet 3 cikluson keresztül 10% PGS-t tartalmazó tápközegben tartottunk, majd megfertőztük a törzs-vírussal. 48 órával a fertőzés után a kecskét röntgen-sugarakkal inaktivált, pelletizált vírussal és fertőzött sejtekkel immunizáltuk. Mindkét immunizáló anyagot Freud-adjuvánsban emulgeáltuk (amely alapimmunizálásra elegendő, emlékeztető oltásra nem), és szubkután injekcióban adtuk be. Denaturált molekulákat észlelő antitestek előállítására az antigén készítményeket az injekció beadása előtt 0,2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 3 mmól 1,4-ditio-treitol (DTT) közegben 95 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáltuk.
RNS készítés, cDNS szintézis és klónozás
RNS-t izoláltunk pelletizált virionokból az irodalomban közölt, guanidin-tiocianátot alkalmazó módszerrel [Chirgwin J. M., Przybyla A. E., MacDonald R. J. és Rutter W. J.: Isolation of biologically active ribunucleic acid from sources enriched in ribonuclease, Biochemistry, 18, 5294-5299, (1979)]. Pelletizált virionokból származó RNS-t (5 mikrogramm összes RNS, közelítőleg 0,5 mikrogramm HCV RNS) és 0,1 mikrogramm randon hexanukleotid prímért (Pharmacia, Svédország) 20 mikroliter vízben 10 percig 65 °C hőmérsékleten tartottunk, jégen gyorsan lehűtöttük, 32 mikroliter végtérfogatban az első szál pufferévé alakítottuk (50 mmól Tris-HCl, pH = 8,3, 30 mmól KC1, 8 mmól MgCl2, 1 mmól DTT, egyenként 1 mmól dATP, dGTP, dTTP és 500 egység /Pharmacia, Svédország gyártmányú/ RNAguard ml-re vonatkoztatva) 35 egység AMV reverz transzkriptázt (Life Sciences, Inc., USA) adagoltunk hozzá. Egy órán keresztül 43 °C hőmérsékleten tartottuk a reakcióelegyet, ezáltal létrehoztuk a cDNS első szálát, majd hozzáadtuk egy ampulla második szál szintéziselegyhez (cDNS szintézis-készlet, Pharmacia, Svédország). A cDNS második szálának szintézisét, a tompa végek előállítását és EcoRI adaptor kapcsolást és foszforilezést a gyártó ajánlása szerint végeztük.
A cDNS-t preparatív agaróz gél elektroforézissel méret szerint frakcionáltuk. A gélnek azt a részét, amely 0,5 kb-nél kisebb DNS-molekulákat tartalmaz, eldobtuk. A maradó DNS-t a gél 15 perces reverz futtatásával koncentráltuk, és az agaróztól fenollal végzett háromszori fagyasztás/kiolvasztás ciklussal extraháltuk.
Etanollal együttesen kicsapott cDNS-t és Agtll DNS-t (1 mikrogramm EcoRI emésztésű defoszforilezett ágak, Promega, USA) 3 egység T4 DNS ligázhoz (Pharmacia, Svédország) kapcsoltunk 10 mikroliter ligáz puffer (30 mmól Tris-HCl, pH = 7,4, 10 mmól MgCl2, 10 mmól DTT, 1 mmól ATP) össztérfogatban. Egy kereskedelmi forgalomban kapható extraktummal (Packagene, Promega, USA) való in vitro összekapcsolást és Y 1090 törzshöz tartozó E. coli K12 sejteknek a keletkező fágokkal történő fertőzését a gyártó ajánlásai szerint végeztük A tárat egyszer tenyésztettük az irodalomban ismertetett módon [Davis L. G., Dibner M. D. és Battey J. F.: Basic Methods in Molecular Biology, 190-191, Elsevier, New York, Amsterdam, London, (1986)].
A kgtll tár válogatása
A válogatást lényegében a Young és Davis által ismertetett módon [Young R. A. és Davis R. W.: Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 1194-1198, USA, (1983)] végeztük, a Promega (USA) cég által forgalomba hozott Protoblot rendszert [Huynh T. V, Young R. A. és Davis
HU 208 494 Β
R. W.: Vol. 2., Glover D. M. ed.. IRL Press Oxford, pp. 49-78, (1985)] és 10‘2 3 szérumhígítást használva. Háttér-redukcióhoz a kecske HCV antiszérumot 0,8 mg/ml (Y1090 törzshöz tartozó) E. coli lizátummal kezeltük [Huynh T. V., Young R. A. és Davis R. W.: Vol. 2, Glover D. M. ed, IRL Press Oxford, pp. 49-78, (1985)]. Két pozitív, 0,8 kb, illetve 1,8 kb betoldású kiónt azonosíthattunk.
Nick transzláció és Northern hibridizáció ng 0,8 kb [a32P]dCTP jelzett (3000 Ci/mmól,
Amersham Buchler, NSZK) HCV nukleinsav-szekvenciát Nick transzláció útján (Nick transzlációs felszerelés, Amersham Buchler, NSZK) Northern szurokhoz hibridizáltunk 5 ng/ml hibridizációs keverék koncentrációnál (5xSS, lxDenhardt, 20 mmól nátrium-foszfát pH = 6,8, 0 ,1% SDS és 100 mikrogramm élesztőgomba tRNS (Boehringer-Mannheim, NSZK, ml-enként) 68 °C hőmérsékleten 12-14 óra időtartamig. A membránokat ezután az irodalomban leírt módon [Keil G. M., Ebeling-Keil A. és Koszínowski U. H.: J. Virol. 50, 784-795, (1984)] mostuk, és -70 °C hőmérsékleten Agfa Curix MR 800 intenzifikáló ernyőket használva különböző időkig Kodak X-omat AR filmeket exponáltunk.
A 0,8 kb nukleinsav-szekvencia nemcsak a teljes HCV RNS-hez, hanem annak degradációs termékeihez is hibridizálódott. A 0,8 kb nukleinsav-szekvencia nem hibridizálódott az 1,8 kb nukleinsav-szekvenciához, jelezve, hogy ez a két nukleinsav-szekvencia a HCV genom olyan fragmentumainak felel meg, amelyek a genomiális RNS nem ugyanazon tartományában helyezkednek el.
Nukleotid-szekvencia meghatározása
HCV-specifikus fág DNS betoldásokat szubklónoztunk pEMBL 18+ plazmidba (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, NSZK; a + jelzés a polilinker orientációjára utal, amely a pEMBL- plazmid által tartalmazott polilinker orientációjának tükörképe) szokásos eljárásokkal [Maniatis T., Fritsch E. F. és Sambrooks S.: Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982],
Rekombináns pEMBL plazmidok egyszálú DNS-ét állítottuk elő az irodalomban közölt módon [Dente L., Sollazzo M., Baldari C„ Cesareni G. és Cortese R.: Vol. 1, Glover D. M. ed, IRL Press Oxford/Washington DC, pp. 101-107, 1985]. Didezoxid szekvencia meghatározó reakciókat [Sanger F., Nicklen S. és Coulson A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5363-5467, (1977)] a gyártó (Pharmacia, Svédország) előírásai szerint végeztük.
2. példa
HCV genom molekuláris klónozása és nukleotid-szekvenciája RNS előállítása, cDNS szintézise és klónozása
Az RNS előállítását, a cDNS szintézisét, az együttesen kicsapott cDNS és Xgtll DNS méret szerinti frakcionálását és kapcsolását (1 mikrogramm EcoRI emésztésű defoszforilezett ágak, Promega, USA) a fent leírt módon végeztük. A DNS fág Packagene (Promega, USA) alkalmazásával történő in vitro összekapcsolását és a fágok titrálását C600 HFL törzsbe tartozó E. coli-ra [D. Glover (szerk.) DNA cloning 1, IRL Press Ltd. 56-110] a gyártó (Promega) előírásai szerint végeztük. A tárat egyszer tenyésztettük [Davis L. G., Dibner M. D. és Battey J. F.: Basic Methods in Molecular Biology, 190-191, Elsevier, New York, Amsterdam, London, 1986], és a nitrocellulóz membránokra (Amersham Buchler, NSZK) átvitt replikákat [Benton W. és Davis R.: Screening Xgt recombinant clones by hybridization to single plaques in sity, Science 196, 180-182, (1977)] a Northern hibridizációnál fent leírtak szerint hibridizáltunk oligonukleotidokkal. [a32P] dCTP jelzett cDNS fragmentumok Nick transzlációval (Nick transzlációs felszerelés, Amersham Buchler, NSZK) történő válogatásával az irodalomban közölt [Benton W. és Davis R.: Screening Ágt recombinant clones by hybridization to single plaques in sity. Science 196, 180-182, (1977)] módon végeztük. A pozitív kiónokat plakk-tisztítás útján kezeltük, és a betoldásokat pEMBL plazmidokba szubklónoztuk [Maniatis T., Fritsch E. F. és Sambrooks S.: Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982., Dente L., Sollazzo M., Baldari C., Cesareni G. és Cortese R.: Vol. 1, Glover D. M. ed., IRL Press Oxford/Washington DC, pp. 101-107, 1985., Davis L. G., Dibner M. D. és Battey J. E: Basic Methods in Molecular Biology, 190-191, Elsevier, New York, Amsterdam, London, 1986],
Egy ÁgtlO-cDNS tár válogatására olyan 17—bázisos, 5’-végén 32P-ral jelzett oligonukleotidot használtunk, amely a Cys Gly Asp Asp Gly Phe aminosavszekvenciát kódoló RNS-szekvenciával komplementer. Ez az - a HCV genom mintegy 12 kb RNS-éhez hibridizálódott - oligonukleotid többek között egy olyan 0,75 kb betoldásos kiónt azonosított, amely szintén HCV RNS-éhez hibridizálódott. Ezt a HCV genom egy fragmentumát képviselő 0,75 kb nukleinsav-szekvenciát a 0,8 kb Agtll nukleinsav-szekvenciával együtt további tárválogatásra használtuk, amely egymással átfedésben lévő HCV nukleinsav-szekvenciák sorozatát eredményezte. Ezek viszonylagos helyzetét és a restrikciós hely térképeket az 1. ábra tünteti fel. A HCV genom ezen nukleinsav-szekvencia fragmentumai a következő nukleinsav-helyzetek között helyezkednek el:
| 4,0 | kb fragmentum: | 27^1027 |
| 4,5 | kb fragmentum: | 54-4494 |
| 0,8 | kb fragmentum: | 1140-2002 |
| 4,2 | kb fragmentum: | 3246-7252 |
| 5,5 | kb fragmentum: | 6656-11819, és körülbelül a következő |
| nukleinsav-helyzeteken belül | ||
| 3,0 | kb fragmentum: | 8920-11920 |
| 1,9 | kb fragmentum: | 10384-12284 |
| 0,75 kb fragmentum: | 10913-11663. |
HU 208 494 B
Nukleotid-szekvencia meghatározása
A teljes nukleotid-szekvencia meghatározásához exonukleáz III és nukleáz SÍ (Boehringer Mannheim, NSZK) enzimeket használtunk HCV eredetű pEMBL 18+ vagy 19+ plazmidokba szubklónozott [Sanger E, Nicklen S. és Coulson A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5363-5467, (1977)] cDNS betoldások kiiktatási könyvtárának megállapítására. Egyszálú [Dente L., Sollazzo M., Baldari C., Cesreni G. és Cortese R.: Vol. 1, Glover D. M. ed, IRL Press Oxford/Washington CD, 101-107, 1985] vagy kétszálú DNS tempátok didezoxi szekvenciameghatározását [Sanger E, Nicklen S. és Coulson A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5363— 5467, (1977)] a T7 polimeráz szekvenciakészlet (Pharmacia, Svédország) alkalmazását végeztük.
A cDNS fragmentumokból a 2. ábrán bemutatott, 12284 nukleotid hosszúságú folytonos szekvenciát határozhattunk meg. Ez a szekvencia jellegénél fogva egy hosszú nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz, amely a 364-366 helyzetű ATG kodonnal kezdődik, és a 12058-12060 helyzetű TGA mint transzlációs stopkodonnal fejeződik be. Ez az ORF 3898 kodonból áll, amely egy, a 2. ábrán bemutatott aminosavszekvenciájú 435 kDa proteint képes kódolni. Három nukleotidcsere volt detektálható a víruspopuláció lehetséges heterogenitása által a nukleotid szekvenciában okozott eltérések eredményeként, amelyek közül kettő változásokhoz vezetett a levezetett aminosav-szekvenciában (2. ábra).
Arra a következtetésre jutottunk, hogy a fenti eljárás majdnem a teljes HCV genom klónozását és szekvenciájának meghatározását eredményezi.
Anti HCV szérummal azonosított, immunogén HCV polipeptidet kódoló 0,8 kb Xgtll nukleinsavszekvenciáját részlegesen megállapítottuk (lásd a 3. ábrát), ami kimutatta, hogy ez a szekvencia a HCV RNS-en az 1,2 és 2,0 kb között helyezkedik el.
3. példa
HCV fúziós proteinek molekuláris klónozása és kifejezése
A HCV genom két szakaszából származó (a teljes 44/48 kD proteint és a 33 kD protein egy részét tartalmazó) cDNS fragmentumokat, azaz a 262-546 helyzetű aminosavakat (lásd a 2. ábrát) kódoló 1. példa szerinti 0,8 kb Ágtll betoldást és a 747-1071 helyzetű aminosavakat (2. ábra) kódoló nukleinsavakat fúziós proteinként fejezzük ki a pEx rendszerben [Strebel K. és munkatársai: J. Virology 57, 983-991, (1986)].
Baktérium-extraktumokat SDS-PAGE útján szeparáltunk, és szokásos eljárásokkal színeztünk, majd reaktivitás szempontjából az 1. példa szerinti kecske anti-HCV szérummal vizsgáltuk Western-blot analízissel.
A HCV-specifíkus fúziós proteineket részlegesen tisztítottuk SDS-PAGE útján, majd nitrocellulózra vittük át, és kecske anti-HCV szérummal inkubáltuk. Fenti fúziós proteinek elleni specifikus antitesteket eluálás után nyertünk.
A fenti fúziós proteinekre nézve specifikus antitesteket alkalmaztunk radio-immun kicsapásos vizsgálatban.
Eredmények
A pEx rendszerben kifejezett mindkét fúziós proteint egyértelműen HCV-specifikusnak azonosítottuk a kecske anti-HCV szérummal adott reakció után.
A két fúziós protein ellen készített monospecifikus antiszérum kicsapta a HCV glükoproteineket.
A 262-546 fúziós proteinre specifikus antitestek kicsapták a 44/48 kD és 33 kD proteint, az 55 kD protein nagy fragmentumát képviselő 747-1071 fúziós proteinre specifikus antitestek kicsapták az 55 kD proteint a vírussal fertőzött sejtekből.
4. példa
Szerkezeti proteinek molekuláris klónozása és kifejezése tehénhimlő vírus útján A vizsgálatokat pHCKll kiónnal végeztük, amely HCV 4 kb cDNS-betoldást tartalmazó pEMBL plazmid (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, NSZK) neve. A betoldás térképét az 1. ábra tünteti fel, ahol a betoldás a HCVszekvenciájából a 2. ábrán megadott 1-4000 helyzetű tartományt fogja át.
A pHCKll kiónt (5 pg-os mintát) először 37 °C hőmérsékleten 2 óra időtartamig foszfortartalmú teljes pufferben (Pharmacia) 10 U EcoRI útján emésztettük, majd pedig 10 U Mungó-bab nukleázzal (Pharmacia) kezeltük 30 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten (4,6 pH-jú) 30 mmólos nátrium-acetát pufferben, amely még 50 mmol nátrium-kloridot, mmol cink-kloridot és 5 tömeg% glicerint tartalmazott. Ezen kezelés után a DNS-t fenollal extraháltuk és etanollal kicsapattuk. A pelletet foszfortartalmú teljes pufferhez adtuk, az elegyhez 10 U Hinfl-t (Pharmacia) adtunk, majd 2 óra időtartamig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A második emésztés után a fragmentumokat gélen elválasztottuk, és a nukleotid fragmentumból (a 372-4000 nukleotidtól) elválasztottuk a 3,6 kb-os fragmentumot. Ezután mindkét szintetikus linkért 20 pl ligáz-pufferben (30 mmol Tris-HCl pH = 7,4, 10 mmol MgCl2, 10 mmol DTT és 1 mmol ATP) lévő 3 U T4 DNS ligáz (Pharmacia) útján a 3,6 kb-os fragmentumhoz ligáltuk. Az inkubálást éjszaka, szobahőmérsékleten végeztük. Ligálás után a fragmentumot a fentiek szerint EcoRI útján ismét emésztettük, majd agaróz-gélen tisztítottuk. Az immár BamHI és EcoRI kiálló végekkel ellátott fragmentumot a fentiekben ismertetett módon a BamHI és EcoRI emésztésű pGS62 vektorba ligáivá előállítottuk a pGS62-3,8 vektort.
Mutánsokat a pGS62-3,8 vektornak 10 U Stul (Pharmacia) útján foszfortartalmú teljes pufferben óra időtartamig 37 °C hőmérsékleten végzett emésztése során állítottunk elő. Az emésztés után a plazmidot 0,01 U exonukleáz ΙΠ-mal (Pharmacia) kezeltünk 60 mmol Tris-HCl (pH = 8), 0,66 mmol MgCl2 és 1 mmol β-mekapto-etahol tartalmú pufferben 37 °C hőmérsékleten. Különböző hosszúságú mutánsok elő7
HU 208 494 Β állítására különböző inkubációs időtartamokat alkalmaztunk. A reakciót fenollal végzett extrakcióval állítottuk meg. Az exonukleázzal kezelt pGS62-3,8 kicsapatást követően a mintákat tompa végek kialakítása céljából a fentiek szerint Mungo-bab exonukleázzal kezeltünk. Ezután a plazmidokat a fent ismertetett módon ismét T4 ligázt használva önmagukkal ligáltuk. Transzfekció után a mutánsokat válogatva további vizsgálatokhoz használtuk.
A pGS 62-3,8 plazmidból 15 kiiktatásos mutáns sorozatát hoztuk létre nukleotidokat távolítva el a HCV betoldott 4 kb cDNS-e 3’ végéről. A pGS62 vektorba klónozott szülő-cDNS hossza 4 kb. A 15 mutáns sajátosságait a 4. ábra mutatja, amelyből látható, hogy az 1. mutáns olyan pGS62 plazmid, amelynek HCV cDNS betoldása a 2. ábrán feltüntetett 1-3825 helyzetű nukleotidokat tartalmazza. A 2. mutáns a HCV 1-3761 helyzetű cDNS-szekvenciát tartalmazza. A további mutánsok cDNS-szekvenciája is leolvasható a 4. ábráról. A 15. mutánsban a szülő-klónhoz viszonyítva a 25904000 helyzetű teljes nukleotid-szekvencia hiányzik. A 15. mutáns transzlációs polipeptidje ezért olyan aminosavak sorozatát kódolja, amely a 364 helyzetű nukleotidnak megfelelő 1. aminosavval (Met) kezdődik és a 2590 helyzetű nukleotidnak megfelelő 742. aminosavval (Phe) végződik.
CVI sejteket megfertőztünk tehénhimlővel (Copenhagen törzs TS7 mutáns) 0,1 m. o. i. érték mellett. A fertőzés után 3 órával pGS62-3,8 DNS, valamint tehénhimlő WR DNS transzfekciót hajtottunk végre a Ca3(PO4)2 kicsapás módszerével, és 2 napig inkubáltuk. A vírusszaporulatot összegyűjtöttük és (100 mikrogramm/ml) bróm-dezoxi-uridin jelenlétében 143 tksejteken tk-fenotípusra válogattuk. Ezt a válogatást legalább kétszer végeztük, amit a plakk-tisztítás további két ciklusa követett.
Tehénhimlő-HCV rekombinánsok jellemzése
CVI sejteket megfertőztük HCV-rekombinánsokkal 2-10 közötti m. o. i. érték mellett, és 8-16 óráig inkubáltuk. A sejtek rögzítése után indirekt immunofluoreszcenciás vizsgálatot végeztünk, vagy a HVC 55 kD proteinre specifikus monoklón antitesteket, vagy többcélú anti-HCV szérumokat használva. Minden esetben citoplazma fluoreszcencia volt megfigyelhető.
Tehénhimlő rekombinánsokkal fertőzött sejtek radio-immuno-kicsapása és Western-blot analízise útján négy HCV-specifikus proteint detektáltunk. [3H] glukozaninnal végzett jelzés után igazoltuk, hogy ezen proteinek közül három glikozilált. E proteinek látszólagos molekulatömege azonos a HCV-specifikus szérumú, HCV-vel fertőzött sejtekben megállapítottakkal, nevezetesen 20 kD (mag), 44/48 kD, 33 kD és 55 kD.
A proteolitikus eljárások és modifikációk autentukusnak tűnnek, mivel a tehénhimlő vírusok által történő kifejezés útján előállított HCV proteinek látszólagos molekulatömege ugyanaz, mint a HCV-fertőzött sejtekben lévő proteineké.
HCV elleni semlegesítő antitestek indukálása egerekben
Egerek öt csoportját (három egér/csoport) egyszer fertőztük az alábbi módon:
a. vad típusú WR tehénhimlő (5x 106 pfu/egyed)
WR
b. rekombináns 3.8 tehénhimlő (5xl07 pfu/egyed)
VÁC 3.8 ~
c. 3.8 Exo 4 tehénhimlő (5x107 pfu/egyed)
VÁC 3.8 Exo 4
d. 3.8 Exo 5 tehénhimlő (5xl07 pfu/egyed)
VÁC 3.8 Exo 5
e. 3.8 Exo 15 tehénhimlő (5x 107 pfu/egyed)
VÁC 3.8 Exo 15 (55 kD kiiktatás) tisztított vírusok intraperitoneális injekcióban való beadásával. Az egerekből három hét múlva vérmintát vettünk. A szérumok reaktivitását (Alfort) HCV-vel PK/15/ sejteken végzett vírus semlegesítési vizsgálattal ellenőriztük sorozatos hígítást követően (Rümenopf T. és munkatársai: Virology 171, 18-27, 1989).
Semlegesítési literek
a. WR 1:2
b. VÁC 3.8 1:96
c. VÁC 3.8 Exo 4 1:96
d. VÁC 3.8 Exo 5 1:2
e. VÁC 3.8 Exo 15 1:2.
A fenti eredményekből arra következtethetünk, hogy az összes szerkezeti proteinre (VAC3.8) vonatkozó genetikai információval bíró nukleinsav-szekvenciát tartalmazó tehénhimlő vírus képes vírust semlegesítő antitesteket indukálni egerekben, míg a nem teljes VAC3.8 Exo 5-15 képződmények és WR erre nem képes.
Mivel az összes kiiktatás a HCV 55 kD proteint kódoló tartományban van (a 2598 helyzetű nukleotidnál) végződő 15. mutánsban az 55 kD protein legnagyobb része hiányzik), és a rekombináns tehénhimlő vírus a többi szerkezeti proteint még mindig kifejezi, ebből következik, hogy az 55 kD protein felelős a HCV semlegesítő antitestek indukálásáért.
5. példa
Sertések immunizálása VAC3.8 útján
Három (kb. 20 kg tömegű) malac közül egy (a 28. számú) állatot vad típusú (WR törzsű) tehénhimlő vírussal, a két másik (26., 27. számú) állatot rekombináns VAC3.8 útján (intraperitoneálisan, intravénásain, illetve intradermálisan) fertőztük. A fertőzéshez minden állat esetén lxlO8 pfu tehénhimlő vírust alkalmaztunk.
A tehénhimlő fertőzés során klinikai tünetek a bemetszés oldalán bőrpírként és lázként (41 ’C) jelentkeznek a fertőzés utáni 6. napon.
Tehénhimlő és sertéskoleravírus elleni titerek
Három héttel a fertőzés után megvizsgáltuk a tehénhimlő (CVI sejteken WR) és HCV (PK15 sejteken Alfort) elleni vonatkozó szérumok reaktivitását.
A semlegesítést a szérumok sorozatos hígítását köHU 208 494 Β vetően vizsgáltuk epe (tehénhimlő) vagy specifikus immuno-fluoreszcenciás jelek (HCV) teljes hiánya szempontjából [Römenopf T. és munkatársai: Virology 171,18-27,(1989)].
Semlegesítési titerek tehénhimlő ellen:
28. számú malac (WR) 1:8
26. számú malac (VAC3.8) 1:16
27. számú malac (VAC3.8) 1:16
Semlegesítési titerek HCV ellen:
28. számú malac (WR) <1:2
26. számú malac (VAC3.8) 1:32
27. számú malac (VAC3.8) 1:16
HCV immunpróba
Tehénhimlővel végzett immunizálás után négy héttel mindegyik malacot immunpróbának vetettünk alá 5x107 Alfort törzsű TCID50 HCV vírussal. A vírust a fertőzés természetes módjának megfelelően szájon vagy orron keresztül alkalmaztuk. Ilyen mennyiségű vírusról kísérletileg beigazolódott, hogy sertésekre nézve biztosan halálos.
Az immunpróba fertőzés utáni 5. napon a 28. számú malac 41,5 °C lázat kapott, és ez a hőmérséklet fennmaradt a 12. napig. Az akut sertéskolera tipikus klinikai tüneteit mutató halódó állatot azon a napon megölték.
A VAC3.8 útján immunizált két (26., 27. számú) malac a HCV immunpróba fertőzés után több, mint 14 napig semmilyen tünetét nem mutatta a betegségnek.
6. példa kD proteint kifejező vektor előállítása pHCKll kiónt szokásos eljárásokkal a SacI és
Hpal restrikciós enzimekkel emésztünk.
A kapott 1,3 kb fragmentumot, amely a 2. ábrán feltüntetett 2672 helyzetű (AGCTC) és 3971 helyzetű (GTT) nukleotidok között helyezkedik el, és a HCV 55 kD protein nagy részét tartalmazza, izoláltuk, és az Aujeszky-betegség vírusának (PRV) gX génjébe klónoztuk [Maniatis T, Fritsch E. F. és Sambrooks S.: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982], A gX gént plazmid-vektorba klónozott PRV Ka szálának genomiális DNS-éből származó 6,6 kbp Sphlfragmentum tartalmazza. A kapott plazmidot 16/4 klónként jelöljük. Az említett fragmentum a gX gén mellett a gp50 és a gp63 glükoproteineket kódoló géneket, valamint a gl gén gliikoproteinje egy részét is tartalmazza. A fragmentum a gX gén metionin startkodonjától felfelé 600 bp távolságban kezdődik.
Röviden, a klónozott gX szekvenciát SacI és Apai útján emésztettük. Az Apai 5’ kiálló végeket a Klenowfragmentumokkal való feltöltéssel tompa végekké alakítottuk. A hozzákapcsolás után a gX szignálpeptid kódoló szekvencia éppen a betoldott KCV 55 kD szekvenciától felfelé helyezkedett el.
A HCV szekvenciától lefelé egy transzlációs stop kodont úgy iktattunk be, hogy Bgl Π útján emésztést végeztünk (Bgl II hely: 3936-3941), és a túlnyúló végek Klenow-fragmentummal való feltöltése után ismét ligálást végeztünk. Ezt a képződményt a PRV gX promotortól (16/4-1.3 klón) lefelé helyeztük el. (ABacI hely agX gén 96 és 97 helyzetű kodonjával lapolódik át, a jelző-pepüdáz a gpX 20 helyzetű aminosavja után végez hasítást.) A 16/4-1.3 klón MDBK sejtekbe (szarvasmarhaveséből származó sejtvonalú; ATCC megrendelési kód: CCL 22; [Proc. Soc. Bioi. Med. 98,574 (1958)]) történő transzfekcióját a DEAE dextrán módszerrel valósítottuk meg [Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 16 óra múlva a sejteket PRV útján fertőztük (m. o. i. = 1). A fertőzés után négy órával a sejteket metanol/aceton hideg (-20 °C) keverékével rögzítettük. Monokloniális antitestekkel (MABs), egyetlen egérhibridoma sejtből származó antitestekkel, amelyek sajátosan a HCV 55 kD proteinjével szemben vannak érzékenyítve) végzett indirekt immunofluoreszcenciás vizsgálattal a sejtek 5-10%-ában az antiHCV 55 kD protein.specifikus jelet mutatott. Transzfekciómentes PRV-fertőzött sejtek, illetve a csak 16/4-1.3 klón transzfekciójú sejtek ebben a vizsgálatban nem eredményeztek jeleket. Csak az 1,3 kb fragmentum inszertálásával kapott PRV bizonyult képesnek az 55 kD protein legalább egy részének kifejezésére.
Claims (14)
1. Eljárás sertéskolera-vírusra jellemző antigén tulajdonságú polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) a sertéskolera-vírusnak szigorú körülmények között a 2. ábra szerinti DNS-szekvenciához hibridizálódó szekvenciát tartalmazó genomiális RNS-éről vagy annak egy fragmenséről cDNS-t állítanak elő,
b) a kapott cDNS-t és egy DNS-vektort restrikciós enzimekkel hasítják,
c) a cNDS-t és a vektort DNS kifejezésére alkalmas rekombináns molekulává ligálják,
d) a polipeptidet gazdaszervezetben kifejezzük, és
e) a polipeptidet izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a 44/48 kD-os polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben cDNS-ként a 2. ábra szerinti 263—487 DNSszekvenciát kódoló aminosav-szekvenciát állítjuk elő.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a 33 kD-os polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben cDNS-ként a 2. ábra szerinti 488-688 DNS-szekvenciát kódoló aminosav-szekvenciát állítjuk elő.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás az 55 kD-os polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben cDNS-ként a 2. ábra szerinti 689-1067 DNS-szekvenciát kódoló aminosav-szekvenciát állítjuk elő.
5. Eljárás az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polipeptideket kódoló DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy sertéskolera-vírus genomiális RNS-éről vagy a megfelelő fragmenséről cDNS-t állítunk elő.
HU 208 494 Β
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy cDNS-szekvenciaként a 2. ábra szerinti 263-487 szekvenciát vagy szigorú körülmények között ezen szekvenciához hibridizáló szekvenciát állítjuk elő.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-szekvenciaként a 2. ábra szerinti 689-1067 szekvenciát vagy szigorú körülmények között ezen szekvenciához hibridizálódó szekvenciát állítjuk elő.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cDNS-szekvenciaként a 2. ábra szerinti 26723971 szekvenciát vagy szigorú körülmények között ezen szekvenciához hibridizálódó szekvenciát állítjuk elő.
9. Eljárás sertéskolera-vírusra jellemző antigén tulajdonságú polipeptidet kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított cDNS-szekvenciát vektormolekulába inszertáljuk.
10. Eljárás sertéskolera-vírusra jellemző antigén tulajdonságú polipeptidet kifejező transzformált vagy transzfektált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdaszervezetet a 9. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns DNS-molekulával transzformálunk vagy transzfektálunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy gazdaszervezetként eukarióta vagy prokarióta sejtet használunk.
12. Eljárás a genomjában - sertéskolera-vírusra jellemző antigén tulajdonságú polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy a vírusmolekula genomjába integráljuk az 5-8. igénypontok szerinti eljárással előállított DNS-szekvenciát.
13. Eljárás sertéskolera-vírus elleni oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított polipeptidet az oltóanyagkészítésben szokásos segédanyagokkal és/vagy hordozókkal összekeverünk.
14. Eljárás sertéskolera-vírus elleni oltóanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) a 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárással előállított gazdasejteket táptalajban tenyésztjük, majd a tenyésztett sejteket összegyűjtjük, vagy
b) a 12. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns vírusokat felszaporítjuk, összegyűjtjük, és az oltóanyagkészítésben szokásos segédanyagokkal és/vagy hordozókkal összekeverjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89104921 | 1989-03-19 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU901571D0 HU901571D0 (en) | 1990-06-28 |
| HUT56286A HUT56286A (en) | 1991-08-28 |
| HU208494B true HU208494B (en) | 1993-11-29 |
Family
ID=8201107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU901571A HU208494B (en) | 1989-03-19 | 1990-03-14 | Process for producing serum and active component against pig-cholera virus |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP1087014B1 (hu) |
| JP (1) | JP3262787B2 (hu) |
| KR (1) | KR0179993B1 (hu) |
| CN (1) | CN1053012C (hu) |
| AU (1) | AU632545B2 (hu) |
| CA (1) | CA2012414C (hu) |
| DE (4) | DE69012386T3 (hu) |
| DK (3) | DK0389034T4 (hu) |
| ES (3) | ES2091083T3 (hu) |
| HU (1) | HU208494B (hu) |
| NZ (1) | NZ232947A (hu) |
| ZA (1) | ZA901719B (hu) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8901651A (nl) * | 1989-06-29 | 1991-01-16 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Vaccin tegen pestivirusinfecties, zoals varkenspest; daarvoor bruikbare nucleotidesequenties en polypeptiden. |
| DE4105480A1 (de) * | 1991-02-21 | 1992-08-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen |
| GB2300419A (en) * | 1994-11-01 | 1996-11-06 | Mini Agriculture & Fisheries | Detection of classical swine fever virus |
| EP0924298A1 (en) * | 1997-12-18 | 1999-06-23 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Protein expression in baculovirus vector expression systems |
| EP1035205A1 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-13 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Non-spreading pestivirus |
| CN1338309A (zh) * | 2000-08-10 | 2002-03-06 | 清华大学 | 一种合成肽猪瘟疫苗及其制备方法 |
| PL199190B1 (pl) * | 2002-12-31 | 2008-08-29 | Inst Biotechnologii I Antybiot | Ciałka inkluzyjne jako antygeny do pokarmowej immunizacji zwierząt |
| CU23544A1 (es) | 2006-02-28 | 2010-06-17 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica |
| EP3147365B1 (en) * | 2006-04-21 | 2019-12-04 | Intervet International B.V. | Pestivirus species |
| CN109182380B (zh) * | 2018-08-14 | 2022-06-03 | 浙江大学 | 杆状病毒表达的猪瘟e2亚单位疫苗的制备方法及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE870507L (en) * | 1986-03-07 | 1987-09-07 | Biothechnological Res Partners | Bovine virus diarrhea and hog cholera vaccines |
| NL8901651A (nl) * | 1989-06-29 | 1991-01-16 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Vaccin tegen pestivirusinfecties, zoals varkenspest; daarvoor bruikbare nucleotidesequenties en polypeptiden. |
-
1990
- 1990-03-06 ZA ZA901719A patent/ZA901719B/xx unknown
- 1990-03-12 DK DK90200573T patent/DK0389034T4/da active
- 1990-03-12 ES ES94200200T patent/ES2091083T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 EP EP00204410A patent/EP1087014B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 EP EP95202375A patent/EP0713915A1/en not_active Withdrawn
- 1990-03-12 DE DE69012386T patent/DE69012386T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 DE DE2000175036 patent/DE10075036I2/de active Active
- 1990-03-12 DE DE69034218T patent/DE69034218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 ES ES00204410T patent/ES2261148T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 EP EP94200200A patent/EP0614979B1/en not_active Revoked
- 1990-03-12 DK DK00204410T patent/DK1087014T3/da active
- 1990-03-12 EP EP90200573A patent/EP0389034B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 ES ES90200573T patent/ES2063897T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-12 DE DE69027339T patent/DE69027339T2/de not_active Revoked
- 1990-03-12 DK DK94200200.7T patent/DK0614979T3/da active
- 1990-03-14 HU HU901571A patent/HU208494B/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1990-03-16 CA CA002012414A patent/CA2012414C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-16 NZ NZ232947A patent/NZ232947A/en unknown
- 1990-03-17 KR KR1019900003575A patent/KR0179993B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-19 CN CN90101494A patent/CN1053012C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 JP JP06953790A patent/JP3262787B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-19 AU AU51451/90A patent/AU632545B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT55243A (en) | Process for producing recombinant subunite vaccine against pseudolyssa | |
| US7645455B2 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| HUT62325A (en) | Chicken anaemia virus vaccine and diagnostic | |
| CZ369696A3 (en) | Nucleotide sequences pestviral strains, polypetides encoded by those sequences and their use in diagnostic and prevention of pestviral infections | |
| US5858373A (en) | Recombinant poxvirus-feline infectious peritionitis virus, compositions thereof and methods for making and using them | |
| HU208494B (en) | Process for producing serum and active component against pig-cholera virus | |
| JP2005502361A (ja) | 感染性ウシウイルス性下痢ウイルスクローン | |
| US5811103A (en) | Hog cholera virus vaccine and diagnostic | |
| EP0772632B1 (en) | T cell stimulating protein of pestivirus | |
| EP0479866B1 (en) | Pestivirus nucleotide sequences and polypeptides, in particular from hog cholera virus | |
| EP0423869B1 (en) | Infectious bronchitis virus vaccine | |
| HU218102B (hu) | Rekombináns vakcinák Marek-féle betegség ellen | |
| US5935582A (en) | Hog cholera virus vaccine and diagnostic | |
| US7238672B1 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
| BRPI0009746B1 (pt) | molécula de veículo contendo plasmídeo pg-pviii compreendendo uma seqúência que codifica uma parte de uma glicoproteína de lissavírus contendo pelo menos o sítio iii da glicoproteína de lissavírus mas não contendo o sítio ii, e, composição imunogênica | |
| SONDERMEIJER et al. | Sommaire du brevet 2028045 | |
| SONDERMEIJER et al. | Patent 2028045 Summary |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG4S | Grant of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)-E2 SUBUMIT ANTIGEN; REG. NO/DATE: EU/2/99/016/001-006 20000609 Spc suppl protection certif: S0400054 Filing date: 20041027 Expiry date: 20100314 Extension date: 20150314 Free format text: PRODUCT NAME: CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)-E2 SUBUMIT ANTIGEN (PORCILIS PESTI); REGISRATION NO/DATE: EU/2/99/016/001-006 20000609 Spc suppl protection certif: S0400054 Filing date: 20041027 Expiry date: 20100314 Extension date: 20150314 |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL |