KR0179993B1

KR0179993B1 - 돼지 콜레라 비루스 백신 및 그의 진단방법

Info

Publication number: KR0179993B1
Application number: KR1019900003575A
Authority: KR
Inventors: 메이어스 그레고르; 뤼메나프 틸만; 티일 하인즈-쥐르겐
Original assignee: 에프.쥐.엠.헤르만스; 에이.쥐.제이.베르 미렌; 악조 엔. 브이.
Priority date: 1989-03-19
Filing date: 1990-03-17
Publication date: 1999-04-01
Also published as: EP0614979A1; DE10075036I2; EP0614979B1; DE69027339T2; CN1047531A; EP0713915A1; DE69027339D1; EP0389034B2; ES2261148T3; DE69034218D1; HU208494B; DE69012386D1; CN1053012C; JPH03164181A; DE69012386T2; EP1087014A1; CA2012414C; CA2012414A1; DE69012386T3; DK0614979T3

Abstract

내용 없음.

Description

돼지 콜레라 비루스 백신 및 그의 진단 방법

제1도는 서로 다른 돼지 콜레라 비루스(Hog cholera virus;HCV)-유래 cDNA 클론들의 물리 지도와 RNA 게놈(상부라인)에 대한 그들의 상대적인 위치를 나타낸 것이다. 항체 프로브(0.8kb 클론) 또는 축퇴(degenerated) 올리고뉴클레오티드 프로브(0.75kb 클론)로 선별처리한 후, 분리한 HCV 유래 cDNA 클론들이 두번째 라인에 도시되어 있으며, 뉴클레오티드 시퀀싱 목적으로 선택된 cDNA 단편들도 표시되어 있다. 모든 숫자들은 DNA 단편들의 크기(kb)를 나타낸다.

제한부위 : B=Bgl Ⅱ; E=EcoRI; H=Hind Ⅲ; K=Kpn Ⅰ; S=Sal Ⅰ; Sm=sma Ⅰ.

제2도는 HCV의 핵산서열 및 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 추론된 아미노산 서열을 도시한 것으로서, 서로 다른 cDNA 클론들간의 뉴클레오티드 교환 및, 결과로서 생성된 아미노산 서열이 표시되어 있다. 선별 목적으로 사용된 올리고뉴클레오티드와 상응하는 서열의 일부에는 밑줄이 그어져 있다.

제3도는 λgt11 클론의 0.8kb HCV 삽입물(insert) 부위로부터의 cDNA 서열이 도시되어 있으며, 또한 추론된 아미노산 서열이 1-문자 코드로 나타나 있다.

제4도는 pGS 62 벡타내에 클로닝된 HCV DNA의 길이를 나타내는 것으로서, 엑소뉴클레아제 Ⅲ로 처리하고 이어서 pGS 62 벡타내에서 클로닝시킴으로써 생성된 일련의 cDNA 클론 pHCK 11로부터 유래된 15개의 결실 돌연변이체들이 pGS 62-3.8 Exo 1-15로 도시되어 있으며, 또한 3' 말단 뉴클레오티드들도 표시되어 있다.

본 발명은 돼지 콜레라 비루스의 특징적인 폴리펩티드를 코드하는 핵산서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산분자, 상기 재조합 핵산분자를 포함하는 재조합 형질발현 시스템, 돼지 콜레라 비루스의 특징적인 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드 또는 재조합 형질발현 시스템을 포함하는 백신 및 상기 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

재래종 돼지의 발열 질병 또는 돼지 콜레라(hog cholera;HC)는 세계 각국에서 농가 경제에 손실을 입히는 심각한 돼지 질병이다. 천연 조건하에서는 돼지가 HC에 감염되기 쉬운 유일한 동물인 것으로 알려져 있다. 돼지 콜레라는 전염성이 매우 강한 질병으로서, 모세혈관 벽을 손상시켜 내장기관들의 출혈과 괴사를 초래한다. 돼지 콜레라의 초기 증상은 발열, 식욕 감퇴, 구토 및 설사로 나타나고, 뒤이어 만성적인 징후로서 불임, 유산 및 암돼지의 배란 약화가 일어난다.

그러나, 거의 모든 돼지는 첫번째 징후가 나타난 후 2주 이내에 죽는다.

원인이 되는 돼지 콜레라 비루스(HCV)는 소의 소 비루스성 설사 비루스(BVDV) 및 양의 보더(border) 질병 비루스(BDV)와 구조적 및 혈청학적으로 관련이 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 이들 비루스는 토가비리다에(togaviridae)군에 속하는 콜레라 비루스 속(genus pestivirus)에 함께 포함된다. 상기 콜레라 비루스들이 갖는 유전 물질의 본질은 오랫동안 RNA, 즉, 중요한 폴리아데닐화가 결손된 포지티브-가닥 RNA인 것으로 알려져 왔다. HCV는 아마도 3-5개의 구조 단백질들로 구성되어 있고, 이들중 2개는 아마도 글리코실화되어 있는 것으로 추론되고 있다. 비-구조성 비루스 단백질들의 수는 알려져 있지 않다.

HC 감염을 억제하기 위한 변형시킨 HCV 백신(약독화 또는 사멸시킨 비루스들을 함유)이 개발되어 현재 사용되고 있다. 그러나, 상기 변형시킨 비루스 백신내에 사용하기 위한 HCV를 얻기 위한 목적으로 조직 배양세포를 감염시킬 경우, 비루스 수율이 낮을뿐만 아니라 수득된 비루스들을 정제하기가 어렵다. 변형시킨 살아있는 비루스 백신들은 항상 여전히 병원성을 지니며 접종받은 동물 또는 새끼에게 있어서 발병을 유도할 수도 있는 부분적으로 약독화된 병원성 HCV를 동물들에게 접종하는 위험성과, 백신내에 존재하는 다른 비루스들에 의해 오염될 우려가 있는 문제점을 수반한다. 또한, 약독화된 비루스가 병원성 상태로 환원될 수도 있다.

또한, 불활성화시킨 백신을 사용할때 나타나는 여러가지 단점들, 예컨대, 단지 부분적으로만 불활성화시킨 비루스를 사용함에 따르는 위험성, 단지 낮은 정도의 면역성이 부여되므로 추가로 면역 접종하여야 하는 문제점, 및 불활성화 처리에 의해 항원 결정인자가 변경됨에 따라 보다 면역성이 적은 불활성화된 비루스들이 남게되는 문제점이 있다.

나아가, 변형시킨 HCV 백신을 사용하면 HCV의 완전 퇴치가 어렵다.

지금까지 알려진 바에 의하면, HCV 또는 BVDV 감염을 구별할 수 있는 돼지에 대한 진단시험이 없다. 이러한 사실은, 돼지에게 있어서의 BVDV 감염은 HCV 감염보다는 그 심각성이 보다 낮다는 측면에서, 즉, BVDV 감염된 돼지는 반드시 죽이지는 않아도 된다는 측면에서 중요하다.

병원체에 대하여 면역반응을 일으킬 수 있는 적절하고도 필수적인 HCV 면역원 물질만을 함유하는 백신은 변형시킨 백신들이 갖는 상술한 단점을 수반하지 않는다.

본 발명은 돼지 콜레라 비루스의 독특한 폴리펩티드를 코드하는 핵산서열을 제공한다. 상기 핵산서열 또는 상기 폴리펩티드의 단편들도 또한 본 발명의 범위에 속한다. 핵산 서열과 폴리펩티드 또는 이들의 단편들 모두가 HCV 감염에 대하여 동물들을 면역화시키기 위한 필요하고도 적합한 면역원 물질만을 함유하는 백신을 제조하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 상기 핵산서열은 리보핵산 서열 및 데옥시-리보핵산 서열 둘다를 지칭한다.

본 발명에 따른 핵산서열은 첨부하는 도면 제2도에 도시되어 있다. 본 발명이 속하는 당해 기술분야에 주지되어 있는 바와 같이, 유전 코드의 축퇴(degeneracy)로 인하여 코오돈 내의 염기들을 치환시키는 것이 가능하게 되었고, 그 결과로 동일한 아미노산을 코오딩하는 다른 코오돈이 생성되어, 예컨대 아미노산인 글루타민산을 코오딩하는 코오돈이 GAT 및 GAA 둘다가 될 수 있다. 결론적으로, 제2도에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 목적으로, 제2도에 나타낸 핵산 서열과 상이한 또 다른 코오돈 조성을 갖는 핵산 서열을 이용할 수 있다는 사실을 알 수 있다.

엄격한 조건들(stringent condition)하에서 제2도에 나타낸 핵산서열과 하이브리드를 형성하는 핵산서열도 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

이들 핵산서열은 제2도에 나타낸 핵산서열과 유사하되, 치환, 돌연변이, 삽입 및 결실 뉴클레오티드를 포함하며, 그러나 제2도에 나타낸 폴리펩티드와 동등한 기능을 발휘한다. 즉, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 제2도에 나타낸 아미노산 서열과 동일하지는 않으나, HCV의 독특한 면역학적 성질들과 상응하는 특성들을 갖는다.

상술한 바와 같은, 유사한 핵산서열을 코오딩하는 폴리펩티드도 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

제2도에 나타낸 핵산 서열은 HCV의 게놈 RNA로부터 유래된 cDNA 서열이다. 이와같은 연속서열은 12284 뉴클레오티드 길이를 가지며, 364-366 위치에 존재하는 ATG 코오돈으로부터 시작되어 12058-12060 위치에 존재하는 번역(translation) 중지 코오돈인 TGA 코오돈에서 끝나는 긴 오픈 리딩 프레임(ORF:open reading frame)을 함유한다. 상기 ORF은 435KDa의 단백질을 코오딩할 수 있는 3898 코오돈으로 구성된다.

생체내에서는, 감염된 세포내에서 HCV가 복제되는 동안에 단백질이 폴리단백질 전구체(polyprotein precursor)분자로서 합성되고, 뒤이어 상기 전구체 분자가(효소에 의해) 절단되어 단편상태의 폴리펩티드가 생성된다. 이들 단편은 가능한 번역-후 변형후, 비루스의 구조 및 비-구조 단백질들을 형성한다. 바람직한 핵산서열은 HCV에 대한 면역성 부여 특성 또는 HCV에 특징적인 면역학적 특성을 갖는 상기 단편에 대한 유전정보를 함유하거나, 또는 HCV에 대한 면역성 부여 특성 또는 HCV에 특징적인 면역학적 특성을 여전히 갖는 상기 단편의 일부에 대한 유전정보를 함유하는 것이다.

제2도에 나타낸 폴리펩티드의 단편 폴리펩티드 및 이들의 일부는 동물들에게 HC에 대하여 면역성 부여 또는 HC의 진단 목적으로 사용될 수 있으며, 따라서 이들도 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 단편을 코오딩하는 영역은 약 1-249, 263-487, 488-688 또는 689-1067 아미노산 위치에 존재한다. 1-249 영역은 주로 코어(core) 단백질을 갖는 반면에, 263-487, 488-688 및 689-1067 영역은 주로 각각 33KD, 44/48KD 및 55KD의 당단백질을 나타낸다. 상술한 코오딩 영역들중 하나 이상에 대한 유전 정보를 포함하는 핵산서열 또는 그의 일부도 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

HCV 감염에 대한 백신내에 포함시키고자 하는 바람직한 영역은 HCV의 55KD 단백질 또는 면역성 부여 활성을 여전히 갖는 상기 단백질의 일부에 상응하는 영역이다.

또한, 상기 55KD 단백질 또는 그의 일부를 코오딩하는 서열을 포함하는 핵산서열 모두가 본 발명에 따라 유용하게 사용될 수 있다.

또한, HCV 감염에 대하여 돼지를 면역화시키기 위한 목적으로 사용 가능한 HCV 55KD의 바람직한 부위는, 비루스 중화 활성을 갖는 항-55KD 단백질 단일클론 항체들을 사용하여 HCV 결실 변이주를 분석함으로써 결정된다.

에피토프(epitope)를 포함하는 상기 부위는 약 812-859의 아미노산 서열을 차지하며, 약 2799-2938의 뉴클레오티드 서열에 의해 코오딩되어 있다. 상기 아미노산 서열을 포함하는 모든 폴리펩티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모든 핵산 서열도 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

돼지에게 있어서의 HCV 감염을 진단하기 위한 목적으로 사용할 수 있으며, 또한 HCV와 BVDV를 구별하기 위한 목적으로 이용할 수 있는, 본 발명에 따른 핵산서열은, 55KD 단백질을 코오딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다.

뉴클레오티드 서열 2587-2619 또는 2842-2880으로부터 상기 핵산 서열을 얻는 것이 바람직하며, 상기 2가지 서열은 모두가 55KD 단백질을 코오딩하는 유전자의 일부이다. 진단목적에 바람직한 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:

5'-CCT ACT AAC CAC GTT AAG TGC TGT GAC TTT AAA-3'

또는 5'-TTC TGT TCT CAA GGT TGT GGG GCT CAC TGC TGT GCA CTC-3'

또한, 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 서브(sub)-서열을 포함하며, HCV와 BVDV를 구별하기 위한 목적으로 이용될 수 있는 핵산 서열도, 본 발명의 일부를 구성한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 서열을 함유하는, 분석시 사용할 수 있는 시험키트와도 관련된 것으로서, 시험 키트가 상술한 올리고뉴클레오티드 또는 최소한 그의 서브-서열이라도 포함하는 핵산서열을 포함하는 것이 바람직하다.

동일한 면역학적 특성들을 유지하면서, 제2도에 나타낸 폴리펩트드 또는 그의 단편들을, 상이한 균주들 또는 다른 유도체들간의 자연발생 변이와 같이, 변형 또는 변화시키는 것이 가능하다. 이와같은 변화는 전체적인 서열내의 아미노산 차이(들) 또는 상기 폴리펩티드내의 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가에 의해서 나타난다.

또한 생성된 단일 또는 다중 아미노산 치환체, 결실체, 첨가 또는 치환체에 의한, 예컨대 밑줄그은 DNA의 자리와 관련된 돌연변이를 이용하여, 제2도에 나타낸 폴리펩티드 또는 그의 단편들의 다양한 유도체를 제조하기 위한 목적으로 DNA 재조합 기술을 이용하는 것도 가능하다. 제2도에 나타낸 폴리펩티드 또는 그의 단편들의 유도체내에 생성되는 상술한 모든 변형들도, 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편이 갖는 기본적인 독특한 활성이 본질적으로 영향받지 않는 한도내에서, 본 발명의 범위에 포함된다.

펠릿형 비리온(pelleted virion)으로부터 분리된 RNA는 cDNA의 합성목적으로 분리 및 사용된다. 이 cDNA를 파아지 λgtll내에 클로닝시키고, 각각의 라이브러리를 증폭시킨 후, 염소 항-HCV 항혈청을 사용하여 스크리닝한다. 2개의 포지티브 클론들이 0.8kb 및 1.8kb 크기의 삽입물을 갖는 것으로 확인되었다. 0.8kb λgtll 삽입물을 부분적으로 시퀀싱하여(제3도 참조) HCV 게놈상에 약 1.2 및 2.0kb 사이에 위치하는 것으로 결정되었다(제2도 참조)

감염된 동물내에서 HCV를 검출(진단)하기 위한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 놀랍게도 HCV와 BVDV를 구별하기 위한 목적으로 이용될 수 있는 본 발명에 따른 핵산서열은, 제2도에 도시한 뉴클레오티드 서열 5551-5793으로 나타나 있다.

또한, 적어도 상기 뉴클레오티드 서열의 서브-서열을 포함하며, 여전히 HCV와 BVDV를 구별하기 위한 목적으로 이용될 수 있는 핵산서열도 본 발명의 일부를 구성한다.

본 발명은 또한 분석시 사용하기 위한 시험키트와도 관련된 것으로서, 이 시험키트는 본 발명에 따른 핵산 서열을 함유한다.

상기 시험키트가 제2도에 나타낸 뉴클레오티드 서열 5551-5793으로 표시되는 핵산서열 또는 상술한 서브-서열을 포함하는 핵산서열을 함유하는 것이 바람직하다.

펠릿형 비리온으로부터 분리된 RNA는 cDNA의 합성 목적으로 분리 및 사용된다. 이 cDNA를 파아지 λgt11내에 클로닝시키고, 각각의 라이브러리를 증폭시킨 후, 염소항-HCV 항혈청을 사용하여 스크리닝한다. 2개의 포지티브 클론들이 0.8kb 및 1.8kb의 크기를 갖는 삽입물을 갖는 것으로 확인되었다. 0.8kb λgt11 삽입물을 부분적으로 시퀀싱하여(제3도 참조) HCV 게놈상에서 약 1.2 및 2.0kb 사이에 위치하는 것으로 결정되었다(제2도 참조).

본 발명에 따른 핵산서열은 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA 또는 비루스 DNA와 같은 각종 베타의 핵산분자와 결찰시켜 재조합 핵산분자를 얻을 수 있다. 상기 벡타 핵산분자는 전사 및 번역을 개시, 조절 및 종결시키는 DNA 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 상기 재조합 핵산분자를 함유하는 숙주를 포함하는 재조합 형질발현 시스템을 이용하여, 본 발명에 따른 핵산서열로 하여금 상기 핵산서열이 코오딩하고 있는 폴리펩티드를 발현시키도록 할 수 있다. 상술한 재조합 형질발현 시스템의 숙주로서는 원핵세포, 예컨대 E. coli, B. subtilis 및 Pseudomonas와 같은 박테리아, 백시니아(vaccinia) 및 계두(fowl pox) 비루스와 같은 비루스류, 또는 효모와 같은 진핵세포 또는 곤충, 식물 또는 동물세포와 같은 고등동물의 진핵세포를 이용할 수 있다.

HC에 대한 동물의 면역화는 예를들면 동물에게 본 발명에 따른 폴리펩티드를 소위 서브-유니트 백신(sub-unit vaccine)으로 투여되는 것이다. 본 발명에 따른 서브-유니트 백신은 일반적으로 순수한 상태의 폴리펩티드를, 임의로 약학적으로 허용되는 담체 존재하에 포함한다.

작은 단편들은 면역성을 강화시키기 위해서 담체분자와 결합시키는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 적당한 담체로서는 천연 중합체(단백질, 키이홀 림펫(key hole limpet) 헤모시아닌, 알부민, 독소), 합성 중합체 형태의 폴리아미노산(폴리리신, 폴리알리닌)과 같은 고분자, 또는 사포닌과 같은 양쪽성 화합물들의 마이셀(micelles)을 사용할 수 있다. 또는, 상술한 단편들은 중합체 형태로, 바람직하게로는 직선형 중합체 형태로 제공될 수 있다. 상기 서브유니트 백신내에 사용하고자 하는 폴리펩티드는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법으로, 예컨대 돼지 콜레라 비루스로부터 상기 폴리펩티드를 분리하거나, DNA 재조합기술 또는 화학합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

필요에 따라, 백신내에 사용하고자 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를, 시험관내 또는 생체내에서, 예컨대 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 포스포릴화 반응을 이용하여 변형시킬 수도 있다.

서브 유니트 백신의 대체물로서 벡타 백신(vector vaccine)이 있다. 본 발명에 따른 핵산서열을 재조합 기술을 이용하여 또 다른 미생물(예, 비루스 또는 세균)의 유전물질내로 통합시킴으로써, 상기 미생물로 하여금 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하도록 한다. 이와같은 재조합 형질발현 시스템을 면역성을 부여하고자하는 동물내에 투여하게 되면, 접종된 동물내에서의 복제를 거쳐서, 폴리펩티드를 발현시키게 되고, 이것은 해당 동물의 면역계를 자극시키게 된다. 적당한 백신 벡타의 예로서는 폭스(pox) 비루스류(백시니아, 소 두창, 토끼 두창), 조류의 폭스 비루스(예, 계두 비루스), 광견병 비루스, 아데노 비루스, 인플루엔자 비루스, 박테리오파지 또는 박테리아(예, 대장균, 살로넬라균)를 들 수 있다.

자체의 핵산서열내에 본 발명에 따른 핵산서열을 갖는 재조합 형질발현 시스템은 예를들면 세포배양물중에서 성장시킬 수 있으며, 필요에 따라서는 감염된 세포들로부터 수거하여 임의로 동결건조시킨 상태의 백신을 얻을 수 있다. 이와같은, 유전학적으로 조작된 미생물은 상기 미생물로 감염시킨 살아있는 동물로부터 수거할 수도 있다. 상술한 재조합 형질발현 시스템을 또한 세포 배양물중에서 증식시켜 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하도록 한 후, 배양물로부터 폴리펩티드를 분리할 수도 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 재조합 형질발현 시스템을 포함하는 백신은 당해 기술분야에 주지되어 있는 방법들을 이용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 특히 전체 숙주, 숙주 추출물, 부분적으로 또는 완전히 정제한 폴리펩티드, 또는 부분 또는 완전 정제한 상술한 재조합 형질발현시스템으로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 백신은 종래의 활성 면역화 체계에 따라 투여할 수 있다: 제형에 적합한 방식으로, 또한 치료학적으로 유효하며 면역성을 부여할 수 있는 양으로 단일 또는 반복 투여할 수 있다. 이때, 백신의 투여는, 예컨대, 피내, 피하, 근육내, 정맥내 또는 비강내 경로로 행할 수 있다. 비경구 투여시에는, 백신이 부가적으로 적당한 담체, 예컨대, 물, 식염수 또는 완충용액을, 보조제, 안정화제, 유화제 등과 같은 물질의 존재 또는 부재하에 함유할 수도 있다.

또한, 백신이 부가적으로 다른 질병들과 관련된 면역원 또는 파보비루스, 광견병 비루스, 돼지 인플루엔자 비루스, TGE비룻, 로타비루스, 대장균, 보르데텔라(Bordetella), Pasteurella, Erysipelas등의 항원과 같은 이들 면역원을 코오딩하는 핵산서열을 포함하도록 하여 다가 백신(multivalent vaccine)을 얻을 수도 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 동물체내에서 HCV항원 또는 항체의 존재를 검출하기 위한 진단방법들에서도 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산서열을 이용하여 상술한 진단방법들에서 사용할 수 있는 폴리펩티드를 제조할 수도 있고, 또는 시료내에서 HCV 핵산의 존재를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브로 이용할 수도 있다.

[실시예 1]

[cDNA 클론의 면역학적 규명]

[세포 감염 및 비루스의 수거]

PK15 및 38A₁D 세포를 10% FCS와 함께 DMEM 중에서 성장시킨후, 37℃ 및 5×10⁷/ml 세포농도에서 20-30ml 부피의 전염성 HCV 균주 알포트(Alfort)로, 0.01-0.001 m.o.i.(면역형광 분석법으로 측정)로 현탁액 상태에서 감염시킨다. 이어 PK15 세포를 조직배양 플레이트(직경 150mm)중에서 접종하고, 현탁세포 38A₁D를 부드럽게 교반하며 병속에서 배양한다(Tecnomara, 스위스연방). cDNA 합성을 위해, 조직배양 상충액을 감염후 48시간되는 때에 수거하고, 12,000g로 맑게 한 후, TFA 20 로타(Contron, 이탈리아공화국)중에서 54,000g로 12시간동안 작동시켜 비루스 펠릿을 얻었다.

[염소 항-HCV 혈청의 제조]

표준 세포 배양 기술을 이용하여 어린 염소의 피부생검으로부터 섬유아세포성 세포균주를 얻는다. 상기 세포를 초기에는 10% FCS와 함께 F-10배지중에서 성장시키고, 그후에는 10% FCS와 함께 DMEM 배지중에서 성장시킨다. 염소 섬유아세포를 HCV로 감염시킨다. 처음 26시간 동안은 세포들을 매 8시간마다 3회씩 PBS로 세정하고, 그후에는 10% 예비면역 처리한 염소혈청(PGS)과 함께 DMEM중에서 배양한다. 48시간 경과후, 조직배양 상층액을 수거하여 스톡(stock) 비루스로 사용한다. 면역 처리에 앞서, 30개의 조직배양 접시들(직경 150mm)의 염소세포들을 10% PGS를 함유하는 배지로 3회 교환해주고, 이어서 스톡 비루스로 감염시킨다. 48시간후, X-선 불활성화 처리한 펠릿형 비루스로 감염시킨 세포들로 염소를 면역시킨다. 상기 펠릿형 비루스 및 감염시킨 세포들은 둘다 프로인트 보조제(기본 면역화용으로는 완전하나, 접종 주사용으로서는 불완전함)중에 유화시켜 피하주사한다. 변성 분자들을 인지하는 항체들을 얻기 위해서, 주사하기에 앞서 항원제제들을 0.2% SDS, 3mM DTT 중에서 95℃에서 5분간 배양한다.

[RNA 제조, cDNA 합성 및 클로닝]

비리온들로부터 얻은 RNA를 치르그윈(Chirgwin)등이 발표한 구아니딘 티오시아네이트 방법(1979)을 이용하여 분리한다. 펠릿 상태의 비리온들로부터 얻은 RNA(총 RNA 5㎍, 약 0.5㎍ HCV RNA)와 20㎕ 수중의 0.01㎕ 랜덤 헥사뉴클레오티드 프라이머(Pharmacia, 스웨덴)를 65℃로 10분간 가열하고, 얼음위에서 냉각시킨 후, 제1가닥 완충액(50mM 트리스-HCl pH 8.3; 30mM KCl; 8mM MgCl₂; DTT dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 1mM 및 500units RNAguard[Pharmacia, 스웨덴]/1ml)중에 최종 부피 32㎕로 조절한다. 35units의 AMV 역전사효소(Life Sciences Inc., 미합중국)를 가한다. 43℃에서 1시간 경과후, 반응 혼합물을 제2가닥 합성 혼합물(cDNA 합성키트, Pharmacia, 스웨덴) 1바이알에 가한다. 제2가닥 합성, 점착성 말단의 제조 및 EcoRI 어댑터 결찰 및 인산화처리는 당해 기술분야에서 권장되는 바대로 수행한다.

분취용(preparative) 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 cDNA를 크기-분별한다. 0.5kb보다 작은 DNA 분자를 함유하는 겔의 일부를 제거한다. 나머지 DNA를 겔에 역으로 15분간 통과시켜 농축시킨후, 페놀로 3회 얼림·녹임 처리하고, 아가로스로 추출한다.

에탄올 공동-침전된 cDNA와 λgt11 DNA(1㎍ EcoRI 분해된 탈인산화 암(arms), Promega, 미합중국)를 총부피 10㎕의 리가아제 완충액(30mM 트리스-HCl pH 7.4; 10mM MgCl₂; 10mM DTT; 1mM ATP)중에서 3units의 T4 DNA 리가아제(pharmacia, 스웨덴 왕국)를 이용하여 결찰시킨다. 당해기술분야에서 권장하는 바대로, 생성된 파아지들을 시험관내에서 시판중인 추출물(Packagene, Promega, 미합중국)로 팩키징 처리하고, E. coli K12 세포, 균주 Y 1090으로 감염시킨다. 라이브러리를 공지의 방법(Davis 등, 1986)으로 1회 증폭시킨다.

[λgt11 라이브러리의 선별]

스크리닝은 기본적으로 미합중국 프로메가(Promega)로부터 입수한 프로토블롯(Protoblot) 시스템(Huynh 등)과 10^-3배 희석된 혈청을 사용하여 발표된 방법(Young and Davis, 1983)으로 실시한다. 백그라운드 감소를 위해, 염소 항 HCV 혈청을 0.8㎎/ml의 E. coli 용해물(균주 Y 1090)로 처리한다(Huynh 등, 1985).

0.8kb 및 1.8kb의 삽입물 각각을 갖는 2개의 포지티브 클론들을 확인할 수 있었다.

[니크(Nick) 번역 및 노오던(Northern) 하이브리드화 처리]

니크(nick) 번역(니크 번역 키트, Amersham Buchler, FRG)에 의해 [α³²P]dCTP(단위 밀리몰당 3000Ci, Amersham Buchler, FRG) 표지된 50ng의 0.8kb HCV 핵산 서열을 노오던 필터에서 하이브리드화 혼합물(5×SSC; 1×덴하르트; 20mM 인산나트륨 pH 6.8; 0.1% SDS 및 100㎍ 효모 tRNA[Boehringer-Mannheim, FRG]/ml) 단위 ml당 5ng의 농도로 68℃에서 12-14시간 동안 하이브리드화시킨다. 이어서 멤브레인을 종래 방법(케일(Keil) 등, 1984)대로 세정하고, -70℃에서 Kodak X-Omat AR 필름에 Agfa Curix MR 800 증감 스크린(intensifying screen)을 사용하여 시간을 변화시키면서 노출시킨다.

0.8kb 핵산 서열은 온전한 HCV RNA, 뿐만 아니라 그의 분해 생성물들과도 하이브리드를 형성했다. 상기 0.8kb 핵산 서열은 1.8kb 핵산 서열과는 하이브리드를 형성하지 않았으며, 이는 이들 2개의 핵산 서열이 게놈 RNA의 동일한 영역내에 위치하지 않는 HCV 게놈의 단면과 일치한다는 것을 나타낸다.

[뉴클레오티드 시퀀싱]

표준 방법들(Maniatis 등, 1982)에 따라 플라스미드 pEMBL 18 플러스내에 HCV 특이적인 파아지 DNA 삽입물을 서브 클로닝한다. 재조합 pEMBL 플라스미드의 단일-가닥 DNA를 종래 방법(덴트(Dente) 등, 1985)에 따라 준비한다. 디데옥시 시퀀싱 반응(Sanger 등, 1977)을 제조자(Pharmacia, 스웨덴)에서 권장하는 바대로 수행한다.

[실시예 2]

[HCV 게놈의 분자 클로닝 및 뉴클레오티드 서열]

[RNA 제조, cDNA 합성 및 클로닝]

공동-침전된 cDNA와 λgt10 DNA(1㎍ EcoRI 분해 탈인산화된 암(arms), 프로메가, 미합중국) RNA 제조, cDNA 합성, 크기 선별 및 결찰 공정을 전술한 방법대로 수행한다. 팩카겐(Packagene, 프로메가, 미합중국)을 사용한 시험관 내에서의 파아지 DNA의 팩키징 및 E. coli 균주 C600 HFL 상에서의 파아지의 적정 처리를 공급처에서 제안하는 바 대로 실시한다.

라이브러리를 1회 증식시키고(데이비스(Davis) 등, 1986), 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Buchler, FRG)으로 옮긴 증식물(Benton and Davis, 1977)들을 노오던 하이브리드화 공정에서 기술한 바대로 올리고뉴클레오티드와 하이브리드를 형성하도록 한다. 이어서 벤톤 앤드 데이비스의 방법(1977)에 따라 니크 번역(니크 번역 키트, 아머샴 버클러, FRG)에 의해 [α³²P]dCTP-표지된 cDNA 단편들을 사용하여 선별한다. 포지티브 클론들을 플라아크 정제한 후, 삽입물들을 pEMBL 플라스미드내에 서브클로닝시킨다(마니아티스 등, 1982; 덴트 등, 1985; 데이비스 등, 1986).

아미노산 서열 Cys Gly Asp Asp Gly Phe을 코오딩하는 RNA 서열에 대해 상보적인 17개의 염기를 갖는³²P 5'-말단 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 λgt10 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다.

HCV의 약 12kb 게놈 RNA와 하이브리드를 형성한 상기 뉴클레오티드는 특히 0.75kb의 삽입물을 갖는 클론으로 규명되었으며, HCV RNA와도 또한 하이브리드를 형성하였다. 0.8kb λgt11 핵산 서열 삽입물과 함께 HCV 게놈의 단편을 나타내는 0.75kb 핵산 서열을 사용하여 다시 라이브러리 선별 처리를 실시함으로써 일련의 중복 HCV 핵산 서열이 생성되었으며, 이 서열의 상대적인 위치들 및 제한 부위 지도들이 제1도에 도시되어 있다. 이들 HCV 게놈의 핵산 서열 단편들은 다음과 같은 핵산 위치들 사이에,

또한 대략 다음과 같은 핵산 위치들 내에 위치하였다.

[뉴클레오티드 시퀀싱]

뉴클레오티드 서열을 완전히 결정하기 위해서, 엑소뉴클레아제 Ⅲ 및 뉴클레아제 S1(베링거 맨하임, FRG)을 사용하여 pEMBL 18+ 또는 19+ 플라스미드(Hennikoff, 1987)내에 서브클로닝된 HCV 유래 cDNA 삽입물의 결실 라이브러리를 준비한다. T7 폴리머라제 시퀀싱 키트(파마시아, 스웨덴)를 사용하여 단일 가닥(덴트 등, 1985) 또는 이중 가닥 DNA의 디데옥시 시퀀싱 처리(생거 등, 1977)를 실시한다.

cDNA 단편들로부터, 제2도에 도시한 바와 같은 12284 뉴클레오티드 길이의 연속 서열을 결정할 수 있었다. 이 서열은 364-366 위치에 존재하는 ATG 코오돈으로부터 시작되어 12058-12060 위치에 존재하는 번역 정지 코오돈 TGA로 끝나는 1개의 긴 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유한다. 상기 ORF은 제2도에 나타낸 아미노산 서열과 함께 435kDa 단백질을 코오딩할 수 있는 3898 코오돈들로 구성되어 있다. 비루스 집단의 가능한 이종성에 기인한 뉴클레오티드 서열의 차이로 인해 3가지 뉴클레오티드 교환이 검출되었으며, 이들중 2가지는 추론된 아미노산 서열(제2도)내에 변화를 초래했다.

결론적으로, 거의 모든 완전한 HCV 게놈이 상술한 공정들에 대해 클로닝 및 시퀀싱되었다고 말할 수 있다.

항 HCV 혈청과 함께 확인된 면역원성 HCV 폴리펩티드를 코오딩하는 0.8kb λgt11 핵산 서열이 부분적으로 시퀀싱되었으며(제3도 참조), 그로부터 상기 서열이 HCV RNA 상의 1.2 내지 2.0kb 사이에 위치하는 것으로 밝혀졌다.

[실시예 3]

[HCV 융합 단백질의 분자 클로닝 및 발현]

HCV 게놈의 2가지 영역, 즉 아미노산 262-546을 코오딩하는 실시예 1의 0.8kb λgt11 삽입물(제2도 참조) 및 아미노산 747-1071을 코오딩하는 핵산 서열(제2도 참조)로부터 유래된 cDNA 단편들을 pEx 시스템(Strebel, K. 등. 1986)내에서 융합 단백질로 발현시키다.

SDS-PAGE를 이용하여 박테리아 추출물들을 분리한 후, 표준 방법들에 따라 염색하고, 이어서 웨스턴 블롯내에서 실시예 1의 염소 항-HCV 혈청과의 반응성을 시험한다.

SDS-PAGE로 HCV 특이적인 융합 단백질들을 부분 정제한 후, 니트로셀룰로오스로 옮겨 염소 항-HCV 혈청과 함께 배양한다. 용출처리 후, 상기 융합 단백질들에 대한 특이 항체들이 수득되었다.

상술한 융합 단백질들에 대하여 특이적인 항체들을 사용하여 방사된-면역 침전 분석을 실시하였다.

[결과]

pEx 시스템내에서 발현된 2개의 융합 단백질 모두가 염소 항-HCV 혈청과의 반응 후 HCV 특이성을 갖는 것으로 명백하게 규명되었다.

2가지 융합 단백질들 모두에 대하여 제조된 단일 특이성 항 혈청이 HCV 당단백질을 침전시켰다.

262-546-융합 단백질에 대한 특이성을 갖는 항체는 44/48KD 및 33KD 단백질을 침전시켰고, 747-1071-융합 단백질에 대한 특이성을 갖는 항체들은 비루스 감염된 세포의 55KD 단백질을 침전시켰다.

[실시예 4]

[백시니아 비루스를 이용한 구조 단백질의 분자 클로닝 및 발현]

HinfI 제한 부위(뉴클레오티드 372)로부터 시작되어 인공 EcoRI 부위(뉴클레오티드 4000)에서 끝나는, 제1도에 나타낸 4.0kb 클론의 단편(pHCK 11)을 준비한다(마니아티스 등, 1982).

5' 말단에 올리고뉴클레오티드 어댑터를 합성하였으며, 상기 어댑터는 BamHI과 융화될 수 있는 오버행(overhang), 번역 시작 코오돈으로서의 고유한 ATG(364-366) 및 HinfI과 융화될 수 있는 돌출된 말단을 3' 말단에 함유한다.

구조체의 3' 말단에, 멍빈(Mung bean) 뉴클레아제를 사용하여 EcoRI 돌출 말단을 제거시키고 이어서 StuI/EcoRI 어댑터 잔기의 점착성-말단과 결찰시켜 번역 정지 코오돈을 도입한다:

상술한 HCV 서열을 백시니아 비루스내에 삽입시키기에 앞서, 이종 유전자를 재조합 벡타내에 클로닝한다. 위와 같은 목적으로, 4.9kb 티미딘 키나아제 서열 내부의 P7.5K 프로모터 하류에 클로닝 부위를 갖는 pGS 62 플라스미드(크랜에지(Cranage) 엠.피. 등, 1986)를 사용하였다.

상기 클로닝 부위는 3가지 독특한 제한 부위, BamHI, SmaI 및 EcoRI을 포함한다. 전술한 HCV 서열(372-4000)을 어댑터와 함께 BamHI/EcoRI 분해된 pGS 62 내에 결찰시켜 재조합 벡타 pGS 62-3.8을 얻는다.

상기 플라스미드를 기초로 하여 일련의 15 결실 변이체들을 얻는다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ(헨니코프 등, 1987)으로 처리하고, 이어서 HCV cDNA를 3' 말단에서부터 단축시킨다. 약 100bp을 제거하여 HCV 55KD 단백질을 코오딩하는 영역 모두를 결실시킴으로써; 뉴클레오티드 2589에서 끝나는 변이주 15 내에서 대부분의 55KD 단백질이 소실되도록 하였다. Exo Ⅲ 단축된 cDNA 클론들을 pGS 62 내에 결찰시켜 pGS 62-3.8 Exo 1.15(제4도)를 얻었다.

CVI 세포를 0.1의 MOI에서 백시니아(종두증)(균주 코펜하겐, TS7 변이주)감염시킨다. 감염시키고 3시간 후, pGS 62-3.8 DNA 뿐만 아니라 종두증 WR DNA를 Ca₃(PO₄)₂침전법으로 감염시키고, 이어서 2일간 배양한다. 번식한 비루스들을 수거하여 143tk-세포들상에서 브롬-데옥시-우리딘(100㎍/ml) 존재하에 tk-표현형을 선별한다. 위와 같은 선별 처리를 적어도 2회 실시한 다음, 다시 2회 주기로 플라아크 정제를 실시한다.

[종두증-HCV 재조합체의 특성 규명]

CVI 세포를 2-10의 MOI에서 종두증-HCV 재조합체로 감염시키고, 8-16시간동안 배양한다. 세포들을 고정시킨 후, HCV 55KD 단백질에 대한 특이성을 갖는 단일 클론 항체 또는 다가 항 HCV 혈청을 간접적인 면역형광법을 사용하여 실시한다. 결과적으로 모든 경우에서, 세포질에서 형광이 관찰되었다.

종두증 재조합체로 감염시킨 세포들에 대하여 방사선 면역 침전 및 웨스턴 블롯 분석을 실시한 결과, 4개의 HCV-특이성 단백질들이 검출되었다. [³H] 글루코사민으로 표지시켜 상기 단백질들중 3개가 글리코실화된 것으로 나타났다. 이들 단백질의 겉보기 분자량은 HCV 특이성 혈청으로 감염시킨 HCV 세포내에서 발견되는 것들, 즉 20KD(핵), 44/48KD, 33KD 및 55KD과 동일하였다.

따라서, 종두증 비루스를 이용한 발현에 의해 생성된 HCV 단백질들이 HCV 감염 세포들내에서와 동일한 겉보기 분자량을 가지므로, 상술한 단백질 분해 처리 및 변형 처리들이 신뢰성 있는 결과를 제공한다는 것을 알 수 있다.

[생쥐(mouse) 내에서의 HCV에 대한 중화항체의 유도]

4군의 생쥐(1군 3마리)들에게 다음과 같은 정제 비루스를 복강내 주사(1회)하여 감염시킨다.

a. 종두증 WR 야생형 (5×10⁶pfu/개체) WR

b. 종두증 3.8 재조합체 (5×10⁷pfu/개체) VAC3.8

c. 종두증 3.8 Exo4 (5×10⁷pfu/개체) VAC3.8Exo 4(55KD누락)

d. 종두증 3.8 Exo5 (5×10⁷pfu/개체) VAC3.8Exo 5

e. 종두증 3.8 Exo15 (5×10⁷pfu/개체) VAC3.8Exo 15(55KD누락)

3주 후, 생쥐들로부터 채혈한다. 한 개 희석 후, PK[15] 세포들상에서 HCV를 사용한 비루스 중화분석(Alfort)을 실시하여 혈청의 반응성을 조사하였다(R

menapf. T. 등, 1989).

[중화역가]

상술한 바로 부터, 모든 구조 단백질들(VAC3.8)에 대한 유전 정보를 포함하는 핵산 서열을 함유하는 종두증 비루스가 생쥐에게 있어서 비루스 중화항체를 유도할 수 있는 반면에 불완전한 구조체 VAC3.8Exo 5-15 및 WR은 그러하지 못하다는 결론을 내릴 수 있다.

모든 결실체들이 HCV 55KD 단백질을 코오딩하는 영역내에 위치하고(대부분의 55KD 단백질이 뉴클레오티드 2589에서 끝나는 변이주 15 내에서 소실되어 있음) 또한 재조합 종두증 비루스에 의해 다른 구조 단백질들이 여전히 발현되므로, 이로부터 상기 55KD 단백질이 HCV 중화항체의 유도에 관여한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 5]

[VAC3.8을 사용한 돼지의 면역화]

3마리의 새끼 돼지(체중 약 20kg)들중 1마리(28호)에게는 야생형 종두증 비루스(WR 균주)를 감염시키고, 다른 2마리(26,27호)에게는 재조합체 VAC3.8을 감염(각각 복강내, 정맥내 및 피내 접종)시킨다. 상기 감염 목적으로 1×10⁸pfu의 종두증 비루스를 각각의 동물에게 투여한다.

결과로, 종두증 감염에 따른 임상 징후가 감염 후 6일째되는 날 난절 부위의 홍반 및 발열(41℃) 증세로 명백히 나타났다.

[종두증 및 돼지 콜레라 비루스에 대한 역가]

감염시키고 3주 후에 각각의 혈청들에 대하여 종두증(CVI 세포상의 WR) 및 HCV(PK15 세포상의 Alfort)와의 반응성을 조사한다. 면역형광법(R

menapf, T. 등, 1989)을 실시하여 특이적인 시그날(HCV) 또는 cpe(종두증)의 완전 부재를 조사함으로써 혈청의 한계 희석 후 중화 여부를 분석한다.

[종두증에 대한 중화 역가]

[HCV에 대한 중화 역가]

[HCV로의 공격]

종두증 면역 처리 후 4주째되는 날에 각각의 돼지들에게 5×10⁷TCID₅₀HCV 알포트(Alfort)를 감염시켜 공격(challenge) 처리한다. 자연 상태의 감염 경로에 따라 비루스를 비강내로 투여한다. 상기 비루스의 양은 돼지에게 있어서 치사량인 것으로 실험적으로 측정된 바 있다.

공격 감염 처리 후 5일째 되는날에 돼지 28호가 41.5℃의 발열이 났으며, 12일째 되는 날까지 상기 발열이 계속되었다. 급성 돼지 콜레라의 전형적인 임상 징후를 나타내는 날 빈사 상태의 돼지를 죽인다.

VAC3.8로 면역 처리한 돼지(26.67)는 둘다 HCV 공격 후에도 14일 이상 아무런 발병 징후를 나타내지 않았다.

[실시예 6]

[55KD 단백질 발현 벡타의 구조]

클론 pHCK11을 표준 기술에 따라 제한 효소 SacI 및 HpaI로 분해시킨다.

대부분의 HCV 55KD 단백질을 포함하는 뉴클레오티드 2672(AGCTC) 및 3971(GTT) 사이에 위치하는, 생성된 1.3kb의 단편을 분리하여 슈도라비스(Pseudorabies) 비루스(PRV) gX 유전자내에 클로닝한다(마니아티스 등 1982).

요컨대, 클로닝된 gX 서열을 SacI 및 ApaI으로 분해한다. ApaI 5' 돌출 말단을 클레노우 단편을 채워 넣어 점착성 말단으로 만든다. 결찰 후, 추론되는 gX 리더 펩티드 코오딩 서열은 삽입된 HCV 55KD 서열의 바로 상류에 위치하였다.

Bgl Ⅱ로 분해하여(Bgl Ⅱ 부위:3936-3941) HCV 서열 상류에 번역 정지 코오돈을 도입하고, 오버행에 클레노우 단편을 채워 넣은 후 재결찰시킨다. 상기 구조체는 PRV gX 프로모터(클론 16/4-1.3)의 하류에 위치하였다. 클론 16/4-1.3을 DEAE 덱스트란 방법(마니아티스 등, 1989)을 이용하여 MDBK 세포내로 감염시킨다. 16시간 후, 세포들을 PRV(m.o.i=1)로 감염시킨다. 4시간 후, 세포들을 냉각된(-20℃) 메탄올/아세톤 혼합물로 고정시킨다. 간접적인 면역 형광법(단일 클론 항체(MABs) 사용)을 실시하여 항-HCV 55KD 단백질이 5-10% 세포중에서 특정 시그날을 나타냈다. 클론 16/4-1.3으로 감염시키지 않고 PRV로만 감염시킨 세포들과 클론 16/4-1.3으로만 감염시킨 세포들은 상기 분석에서 아무런 시그날도 나타내지 않았다.

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Claims

돼지 콜레라 비루스(HCV)의 55 kD 단백질 또는 아미노산 서열번호 812 내지 859 서열의 항원성 단편을 코드하는 DNA 서열과 벡터 핵산 분자를 함유하는 재조합 핵산 분자.
제1항에 있어서, 55 kD 단백질에 제2도에서 보여지는 아미노산 서열 번호 689 내지 1067의 서열, 또는 그것과 동일한 면역학적 특성 또는 생리학적 특성을 갖는 기능적 등가물을 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 서열이 발현 조절 서열에 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
제1항 또는 제2항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제3항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제4항에 있어서, 숙주 세포가 세균인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제5항에 있어서, 숙주 세포가 세균인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제1항 또는 제2항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스.
제3항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스.
제6항에 따른 숙주 세포를 배지에서 증식시켜서 HCV 단백질을 발현시키고, 그 후 배지로부터 상기 단백질을 분리시키는 것을 특징으로 하는 HCV 단백질을 발현시키는 방법.
제7항에 따른 숙주 세포를 배지에서 증식시켜서 HCV 단백질을 발현시키고, 그 후 배지로부터 상기 단백질을 분리시키는 것을 특징으로 하는 HCV 단백질을 발현시키는 방법.
제8항에 따른 재조합 바이러스를 배지에서 증식시켜서 HCV 단백질을 발현시키고, 그 후 배지로부터 상기 단백질을 분리시키는 것을 특징으로 하는 HCV 단백질을 발현시키는 방법.
제9항에 따른 재조합 바이러스를 배지에서 증식시켜서 HCV 단백질을 발현시키고, 그 후 배지로부터 상기 단백질을 분리시키는 것을 특징으로 하는 HCV 단백질을 발현시키는 방법.
제8항에 따른 재조합 바이러스, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 백신.
제9항에 따른 재조합 바이러스, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 백신.
제10항에 따른 방법에 의하여 발현된 HCV 단백질, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 백신.
제11항에 따른 방법에 의하여 발현된 HCV 단백질, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 백신.
제12항에 따른 방법에 의하여 발현된 HCV 단백질, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 백신.
제13항에 따른 방법에 의하여 발현된 HCV 단백질, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HCV 감염에 대하여 동물을 보호하기 위한 백신.