JPS60500214A - パルヴオウイルス・ワクチン開発の方法と材料 - Google Patents

パルヴオウイルス・ワクチン開発の方法と材料

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JPS60500214A JP50074884A JP50074884A JPS60500214A JP S60500214 A JPS60500214 A JP S60500214A JP 50074884 A JP50074884 A JP 50074884A JP 50074884 A JP50074884 A JP 50074884A JP S60500214 A JPS60500214 A JP S60500214A
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フオツクス,ギヤリー エム.
ハ,シルヴイア エス.
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アムジエン
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(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

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【発明の詳細な説明】 「バルヴオウイルス・ワクチン開発の方法と材料Jこれは「バルヴオウイルス・ ワクチンの開発方法と材料(Methods and Materials f or Development of ParvovirusVaccines ) JとしてGray M、 Fox等により1983年1月19日に提出され た会衆国国特許出願番号459.203の一部継続出願である。
この発明は、一般に哺乳動物のパルヴオウイルスに関するものであり、より具体 的には、バルヴオウィルス感染に対するワクチン免疫を成立させるのに有益な免 疫学的に活性をもったポリペプチドに関する。
h■ovir旦憇且に属するバルウォウイルスは、真核細胞に感染することが知 られている最も単純なウィルスの中に含まれる。3つの属のうちで、パルヴオウ イルス(Parvovirus)お、ヨエびアデノアソシエイテノドウイルス( Adeno−associaもed−virus) (AAV)のサブグループ は、を椎動物のウィルスを網羅し、これに対してDenSOvirus属(de nsonucleosisウィルス、 DNV )は1節足動物の因子を構成す る。パルヴオウイルスの感染のを椎動物宿主には。
ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒトおよびある種の鳥類が含まれる。
を椎動物のバルヴオウイルスは、ヘルパーウィルスを必要とするか否かで2つの 属あるいはサブグループに分けられる。最大のサブグループのウィルスであるパ ルヴオウイルス(Parvovirus)属は1通常は「非欠陥ウィルス(no ndefective) Jあるいは自律パルヴオウイルスと呼ばれる。これら のウィルスは、現在までに研究された宿主細胞の殆どにおいて、ヘルパーウィル スの助けを必要するものは全てが「欠陥ウィルス(defective) Jで あり、これまでに調べた系の全てにおいて1自己複製においてアデノウィルスと の混合感染に依存する。これらのウィルスは、生理化学的特徴。
生体外での成長特性、そして一般に病原性が非常によく似ている。
これらは既知の最も小さなりNAウィルスの1つであり2球状で。
直径が20〜25nmのエンヴエロープを被っていない粒子(nonenvel opad particles)である。これらの粒子を電子顕微鏡で見ると、 正二十面体様対称性があり、32個の形態学上キャプソメア(capsomer )から成る。感染性の粒子はゲノム(ger+ome)を含んでおり、このゲノ ムは主に一本鎖の線状DNA分子であり1分子量は1.35 X 106から1 .70 x106である。このDNAは全ヴイリオン質量(ν1rion ma ss)の約25%を占め、残りは検知可能なRNAを含まない蛋白質、多糖体あ るいは脂質である。ウィルスは、熱、冷凍および解凍、脂質溶剤、乾燥、洗剤お よび低濃度のchaotropic剤に対しても非常に安定している。
殆ど総てのを椎動物ウィルスは赤血球凝集素用を示す。これらウィルスは、交叉 反応グループは別として、赤血球凝集素の阻害および補体結合により測定すると 、殆どの場合抗原性の点で特異である。これらの交叉反応グループ内において5 個々のウィルスは、それらが凝集させる鼻血球種、宿主域、および時には病原性 によって区別することができる。一般に「哺乳動物パルヴオウイルスの複製(R eplication of Marmalian Parvoviruses ) J 、 Wardand Tattersall kJa集、 ColdS pring Harbor Laboratory (19’18)を参照のこ と。
この発明の背景に特に関係するものとして、ブタのパルヴオウイルス(PPV) に関する出版物がいくらかある。ブタのバルヴオウィルスは自律パルヴオウイル スで5会衆国の多くの地域および世界中の主要なブタの育成地域においてブタの 繁殖不全の主要な原因である。一般に、 Joo等、八rch、 Virol、 、 51 、123 (1976); OMengeling等Am、J、Ve t、Res、、 37.1393 (1976) ; Johnson等。
Au5tralian Vet、Jour、、52,80 (1976) :お よびFlengel ing+J、Am、−Vet、Med、As5oc、、  172.1291 (1978)を参照のこと。成熟したブタがPPVに感染し たときの徴候は普通は無症状である。妊娠した雌が妊娠期間の前半に感染すると 、一般に胚死および胎児のミイラ化が起きる。病気の主な発現は9分娩の失敗、 長引く妊娠期間と分娩間隔の増加、同腹仔数の減少、死産児およびミイラ化した 胎児の分娩、子宮内壁への胎児の吸収および新生児の死亡あるいは体力の減退で ある。Cutlip等+ Am、J、Vet、Res、、 36゜1751 ( 1975)を参照のこと。
ブタのPPvによる感染に対するワクチンによる免疫と受身免疫の効果に関する 研究がいくらか成されている。Paul等。
Am、J、νet、Res 、、4L 1368 (1980)および、その参 照文献を参照のこと。不活化ウィルスワクチン(inactivated vi rus vaccine)が既に開発され、 ppvに誘発される繁殖不全をあ る程度防止できることが認められている。Fuj 1saki等1精r片 埴1 .ハ堕。
Health Quarterly [Tokyo ) 18.184 (19 78) ; Joo等。
Au5t、Vet、Jour、、 53.550 (1977) ; Meng eling等。
八m、J、Vet、Res、、 40 、204 (1979) ;および5u zuki等。
Nat’ 1. In旦、 Anim、 Health Quarterly  (Tokyo ] 16+81 (1976)を参照のこと。もっと最近では、 改良生PPvウィルス・ワクチンおよび二価のワクチン(仏性狂犬病(pseu dorabies)の免疫原を含む)がブタの繁殖不全を抑制する能力の評価が 行ねれと。
先に述べたように1粒子の生あるいは死バルヴオウイルス・ワクチンの開発には かなりの努力がなされているが、ノマルヴオウイルス感染を阻止する免疫応答を 生み出すのにサブユニットワクチンを使用することはこれまで報告されていない 。実際のところ。
ブタのバルヴオウィルスの構造蛋白質が分離され、イウイルス粒子との蛋白質と の関連には影響されない免疫能を持つことが判明したことが発表されたのは極め て最近のことである。もつと具体的に云うと、コー不ル(Cornell )大 学で1982年8月2日〜4日に開催されたAmerican 5ociety  for Virology (ウィルス学アメリカ学会)の会合において、  H,S、 Jooは、ブタの胎児に継代されたブタのパルヴオウイルスの構造蛋 白質の特徴付けと免疫原性に関してミネソタ(Minnesota )大学で行 った最近の研究の成果を口頭で報告した。報告によると、ウィルス蛋白質の5D S−PAGE分離およびv−8プロテアーゼ処理により、3つの構造的に類似し た分子量がそれぞれ90 kd、 65 kd、および60 kdの蛋白質が存 在することが示された。これらの蛋白質は、ウサギの体内における抗PPv抗体 の産出を刺激することが出来ると報告されている。この研究の成果はその後にM o1itor等、、’、 Virol、、 45.842−854 (1983 )において報告され、各蛋白質に対して作られた抗血清はウィルスの作用を無効 にする能力をある程度有することを検証している。
これまでに自律的複製バルヴオウイルスの構造研究が幾つか成されている。As tel1等Ce1l、 17.691 (1979) ; Rhodd等。
ム Virol、、41 、990 (1982) ; Revie、 P、N 、A、S、、 76、5539の論文は、 ppvゲノムの構造に関する研究、 あるいはゲノムの構造とウィルス蛋白質の構造との関係に関する研究は含んでい ない。
パルヴオウイルス・ゲノムに関するより最近の研究は、 Rhode等、J、  Virol、、 45.173−184 (1984)およびAstell等。
る。いずれの研究もそれぞれH−1およびMVMと呼ばれる圀歯動物パルウオウ イルス(rodent parvovirus)に関するものである。
Rhode等はト1のヌクレオチド配列を確定し、それをバルヴオウイルスのキ ャブジッド蛋白質(parvovirus capsid proteins)  VPIおよびVP2’ 、並びにキャブジッドを持たないウィルス蛋白質NC VPIの既知の構造特性に相関させた。H−1ゲノムは、開始コドン(codo n)を先頭に持つか開始コドンに続く2つの大きな開いた読み枠を持つ5176 ヌクレオチドを含むことがわかった。ウィルス蛋白質のmRNAの構造を図示す ると、 NCVPIは一番左の読み枠にあり。
vPlおよびVP2°蛋白質の開始位置にわずかに重なっている。一方。
ゲノムの右半分にある第二の開いた読み枠は、 VPIおよびVP2’に割り当 てられているが、コード配列の詳細な構造は分かつていない。VPIは、 VF 6“の開始部位のすく左で始まることが示された。
VPIおよび2゛は双方ともmRNA地図の同じ点で終結することが図示された 。
^5tel1等(1983)は、ネズミのマイニ、x−ト・ウィルス(MVM) のゲノムの5081のヌクレオチド配列を決定し、そのゲノムにパルヴオウイル ス・ゲノムH−1についてRhode等によって報告されたものと類似した開い た読み枠を観察した。予備試験によると、3つのウィルス・キャブジッド蛋白質 、vPl (83,000ダルトン)。
VF6 (64,000ダルトン)およびVF3 (61,000ダルトン)は 、ゲノムの右半分によりコート化され、一方、 85,000ダルトンの非キャ ブジッド・ポリペプチドは、少なくとも部分的にはゲノムの左半分によってコー ド化される。この研究のmRN八地へは、 VPIメツセージはゲノムの一番左 側の部分で開始し、大きな介在配列によって中断され、その後ゲノムの全長に達 することを示している。
VF6ば、 VPl地図に完全に含まれることが示され、そのメーセージは、小 さな中央介在配列の左に始まり、地図の右側まで続(。
さらにこの発明の背景に関連するのは、サブユニット・ウィルス・ワクチン物質 の開発に組み換え方法と材料を使用するための最近の活動である。この種の研究 活動の典型的な例は、 12182年10月13日に公表されたRutter等 のヨーロッパ特許出願番号0062574に見ることができる。しかしながら9 .パルヴオウイルス・ゲノムの配列決定、特徴付け、あるいはバルヴオウイルス 蛋白質配列の全部あるいは部分に重複した免疫活性ポリペプチドの微生物による 発現を可能とする仕方での取り扱いにおいて、有効な組み換え方法は現在に到る まで生み出されていない。
肚 この発明は1パルヴオウイルスによる感染1例えばブタのバルヴオウイルス(P PV )よる感染に対するワクチン免疫性を生み出すのに役立つ免疫学的な活性 を有するポリペプチドをもたらす。
この発明のポリペプチドは一般にアミノ酸配列から構成されるものであり、この アミノ酸配列は、パルヴオウイルス・ヴイリオン(parvovirus vi rion)の主要な蛍白質成分に存在すると想定される配列を重複したあるいは 実質的に重複したものである。この発明において現在望ましいとされるポリペプ チドは、バルヴオウイルス・ゲノムに存在するDNA配列を完全にあるいは部分 的に重複する新規の且つヘクター(vector)に媒介されるDNA配列の微 生物による発現の生成物を含む。この発明の微生物により発現されるポリペプチ ドの特に望ましいものは、ブタのパルヴオウイルス蛋白質エンヴエロープ内の配 列を重複する一連の親水性アミノ酸から成るポリペプチドを含む。
発明の実例としてプラスミド(plasmid)pss17を示すが、これは主 にpBR322DNAから成り、ブタのバルヴオウイルスの二本鎖複製型(RF ) DIIAに存在するIIINA配列を重゛複する約780の塩基対の[IN A介在配列挿入物を含む。pss17内のクローニングしたPPvのDNA挿入 物は操作的にE、coli )リプトファン(tryptophan)合成酵素 E遺伝子のプロモーター/レギュレーター(promoter/regulat or)および蛋白質コード開始位置に結合され7選択された宿主細胞内でのpp vとE、c、oli由来の融合ポリペプチド(fusion polypept ide)の誘導しうる発現を可能とする。
この発明によってもたらされるその他の例示的な微生物による発現システムは、 プラスミ)’ p/)16を含み、このプラスミドにおいては、 pss17の 断片が、’、fun−aWa’JJ発現ヘクターpcFM414の温度感受性の 複写制御領域と操作的に結合され、多量の「融合ポリペプチド’(fuc、io n polypeptide)」を選択された宿主細胞内で発現することを可能 とする。
別のプラスミド’ S/S3も、もたらされるが、このプラスミドは。
ブタのパルヴオウイルスの二本鎖RF DNΔに存在するtlNA配列に重複す る約350塩基対のDNA挿入物を、 trpプロモーター(trp prom oter) 1つおよびTインターフェロンのアミノ酸4つを含むpBR322 から誘導された配列とともに含み1選択された宿主細胞内でのγインターフェロ ン7ppv融合ポリペプチドのMmしうる発現を可能とする。
約475塩基対から成る第3のPPv断片は、βガラクトシダーゼポリペプチド (βgalactosidase)の一部と共に2選択された宿主細胞に形質転 換されたプラスミドpE/H2,5内におし)で融合ポリペプチドとして発現さ れる。pE/82.5も主にpBI+322 DNAfi己列力)ら成り、 l i、coli)リブトファン合成酵素E遺伝子のプロモーター/レギュレーター と蛋白質コード化の開始領域を含む。
さらに、この発明は、パルヴオウイルスのアミノ酸配列を完全にあるいは部分的 に重複するアミノ酸配列を有する現在望まし17)合成ペプチドをも包含する。
この発明による例示的な望ましし)合成ペプチド配列は。
NHz −八5n−Leu−Ala−Ly’5−Lys−Lys−Ala−Ly s−Gly−Thr−5er−As12−Thr−Asn−5er−COOHで ある。
発明の免疫活性ポリペプチドは、微生物発現ポリペプチド、融合ポリペプチドお よび合成ポリペプチドを含めて、ポリペプチドを処方した宿主動物の体内でのパ ルヴメウイルス特異抗体の合成をもたらし、それによって生した抗体反応は、そ の後のバルヴオウイルス感染、特にブタのパルヴオウイルス感染を阻止するもの と思われる。この発明によるポリペプチドの考えられる抗原性および免疫原性は 、インヴイトロ・プレイド・バインディング検定法(in vit、ro pl ate bindingassays)およびプラック減少(中和)検定法(p laque reduction (neutralizing) assay s)により例示される。従って、この発明によって提供されるものは、この発明 の1つ以上のポリペプチドの免疫学的に有効な星と免疫学的に許容出来る希釈液 、アジュバント(adjuvants)あるいはキャリアー(carriers )から成るワクチン成分である。この発明のポリペプチドは、流体サンプル中の パルヴオウイルス抗原あるいはバルヴオウイルス関連抗体の定量的な検出のため の検定法の試薬成分として使用するのにも適している。同様な仕方で、この発明 のDNA配列は、 DNA−DNA ハイブリダイゼーション(hybridi zation)手順における探針として1種々の起源のサンプル内の相補的なバ ルヴオウイルスDNA配列を検知するためにも使用することが出来る。
この発明のその他の態様および利点は、下記の詳細な説明を考慮した上で明らか になるものと思われるが、説明中の第1図はPPvゲノムの制限地図であり、第 2図はこの発明に従うプラスミドρ5S17の製造に用いられる操作処置を図示 したものである。
詳細な説明 この本発明の実例となる新規のポリペプチド製品と製造方法は下記の例に説明し てあり、下記の例は2代表的なパルヴオウィルスであるブタ・パルヴオウィルス (PPいのDNAおよび蛋白質成分の分離および特性把握に関連する手順、およ びPPvポリペプチドの微生物宿主細胞(培養した細菌、醇母および哺乳動物の 細胞を含む)による発現を確実に行うこと、且つポリペプチドの抗原性および免 疫原性を検定することに関連する手順を取り扱っている。
下記の例は培養ppvの増殖と分離に関する。
[ )゛ダパルヴオウイルス(National Animal Disease  Center。
Ll、S、D、A、、 Ames、 Iohaから入手したNADI、−2病毒 性ストレイン)は。
ブタの細胞(例えば、 PK−15,A、T、C,C,No、 CCL−33) の適切な連続培養中で増殖され、ブタ細胞は5%ウシ胎仔血清を加えたダルベツ コ(Dulbecco)が変更したイーグル(Eagle)培地で増殖される。
下記の例は、 ppv蛋白質成分の分離と特性決定の結果を要約したものである 。
炭」 PPν感染細胞の溶解産物は、培地内で353−メチオニンへの取り込みによっ て生体内でラベル付けを行った。遊離したラベル付PPvヴイリオンは、ペレッ ト化およびCsCl平衡沈降により精製された。
5O5−PAGEの解析によって、3つの主なポリペプチド成分が明らかになり 、それらの分子量はそれぞれ90,00.0ダルトン、 65,000ダルトン および60,000ダルトンであった。測定の結果、これら3つの蛋白質の相対 量は、ヴイリオン量のそれぞれ3%、80〜90%および7%であることが分か った。3つの精製された各蛋白質のV−8プロテアーゼ消化物は、基本的に互い に同一の切断パターンを示し1より小さな蛋白質の配列は大きな蛋白質の配列の 中に含まれていることを示唆した。3つの蛋白質は全て、プレイド・パインディ ング検定法を用いて調べたところ、 PPV惑染の回復期にあるブタから採取し た中和血清と反応することが分かった。気相蛋白質マイクロシークエネイクー( microsequenator )を用いて3つの蛋白質の配列を決定するす る試みは成功せず、3つのppv蛋白質は全て変更されたあるいはブロックされ たアミノ末端を有する下記の例は、 PPV DNAの分離と、 ppvゲノム の制限エンドヌクレアーゼ消化地図の作成に関する。
炭」 例1に従って増殖されたppvの感染性ヴイリオンは、浮遊密度が1.375g /c、c、であることが分り、さらにCsC1勾配中でバンディングを行うこと によって精製することができた。PPvのゲノムは。
311−チミジンを用いて生体内でラベル付けすることが出来、さらにフェノー ルを用いてヴイリオンから抽出することができた。ゲル電気泳動法および電子顕 微鏡分析によって、 ppvのゲノムのDNAは線状の殆ど一本mD N A分 子で1分子量が1.76X]06ダルトンあるいは5.0キロヘースであること が判明した。しかしながら、 ppvDNAの約6%はSl−ヌクレアーゼ消化 に対する耐性を示し、その他の非欠陥パルウォウィルスに見られるような、ゲノ ムの端部の2つの互いに異なる自己相補的構造を表すものであろう。
ppvに怒染した細胞から採取したDNAは、標準旧rt抽出法を実施した後に 調製された。旧rt、 J、Mo1.Biol、、26.365 [1967) を参照のこと。上澄み液分側から採取したDNAをアガロースゲル電気泳動(a garose gel electrophoresis)によって分析すると 、二重単量体(MD、 3 xlO6ダルトン)および二量体(DD、 6.7  XIO’ダルトン)のゲノム長さに対応するハンドが観察された。熱変性させ 、急冷すると、 MD分子の33%は二重間を再生し、これらのMD分子は、二 つの共有結合した相補的な鎖を持たなければならないことを示している。しかし 残りの66%のMD分子は、この処理を行うと一本鎖ゲツム長さのDNA (5 5)となり、「開いた(open) J末端を有することを示している。それゆ えにMD個体群は、「折り返った(fold−back) J末端あるいは「延 びた(extended) J末端のいずれかを持つ二つの型の分子から成る。
一方、 00分子は1加熱および急冷後にMDとSSに完全に変換し。
分子の中央近くに特定の一本鎖ニツク(single−stranded n1 cks)が存在することを示した。
準備されたゲルからPPvOMD型とDD型のものを分離した後に。
PPVの制限エンドヌクレアーゼ切断地図が作成されたが、それを第1図に示す 。要約すると、5キロヘースのppv単量体の複製型は、多くの制限酵素と幾つ かの二重消化組合せにより消化され。
図示した制限切断地図が出来上がった。酵素5all、 HpaT、 Smal およびBamHIは、 PPV DNAを切断しない。ハイブリダイゼーション の研究と塩基配列により定められた翻訳の方向は矢印で示されている。
MD DNAの左末端はある制限酵素に切断されるとしばしば二重バンドに分解 されたが、この現象はその他の非欠陥バルヴオウイルスにも観察されている。二 重ハンドのうちの移動の遅いバンドは上記の「延びた(extended) J 型を表し、移動の早いハンドはr折り返った(snap−back) J型を表 すことが示唆されている。第1図の右側末端は均質であり、切断すると常に一本 ハンドが得られた。
パルヴオウイルスの相補的鎖合成で知られている自己プライミング機構は、「折 り返った(snap−back) J構造を有するMD分子は制限酵素で切断さ れると二つの共有結合した鎖を持つ断片を生し。
且つこの断片は元のウィルスDNA鎖の3’−OH末端を含むことを示唆してい る。
この仮説に基づくと、地図は、ウィルスDNAの極性の方向を第1図に示したよ うに定め、左端がウィルスDN^の3”−末端に対応するようにすることが適切 である。
この方向付けを支持する別の証拠は、 ppvの転写方向の分析によってもたら される。ppv感染細胞からポリA配列をもつ1)NAを分離し、断片化し、さ らに選別して13゛転写部位が豊富な低分子重量の個体群をつくった。放射能で ラベルを付けたcDNA探針が、オリゴ(dt)プライマーおよび逆転写酵素を 用いて合成された。これらの探針は、 r’PV DNAの種々の制限酵素消化 物のサザン・トランスフy (Southern transfer)にハイブ リッド形成された。
その結果、右端(第1図)断片ば探針と強力にハイブリッド形成されたが、一方 、左端断片はハイブリッド形成を行わないことが分かったが、これは右端がRN A転写の3゛末端に対して相補的な配列を含んでいることを示している。I’P V mRNΔはウィルス[lNAと反対の極性を有しているために、左端はウィ ルスDNAの3°末端に対応すると推定できる。
ppv二重二量体(DD) DNAインターミーディエツト(intermed iate)の制限エンドヌクレアーゼ分析により、二量体型は2つのMD分子が ティルーツウーティル(Lail−to−tXlil)構造に接合し。
ウィルス鎖の3゛末端が共存的に相補鎖に結合していることがあきらかになった 。貯蔵したppv二量体は操作を加えずとも二重単量体(MD)に変化すること が観察されたが、これは順にずれた特定の一本鎖ニツクが反対側の鎖の不安定な ゲノム単位長さの位置。
即ち二量体の中央にあり、さらに二つのユニットを一緒にする塩基対合はやや不 安定であることを示している。
下記の例は、クローニングしたPPvゲノム断片のDNA配列の分析に関する。
炎」 5kb隼量体の複製型から得られた断片は、門13ファージ(phage)ある いはpBR322にクローニングされた。これらのクローンは。
2つの主なグループ,即ち,(1)ランダムなクローンで, 5kb分子(ある いは分子の一部)がAluT, RsalあるいはSau3Aで切断され,続い て適切に切断されたM13ml18に結合されたもの,および{2}特定のクロ ーンで,第1図の地図に示した制限部位を用いて作られるものに分かれる。これ らの殆どは. M13mp8とM13mp9の双方にクローニングされた非対称 な二重消化物であり,それによって制限地図に対する消化物の向きもわかった。
加えて,第1図の部位0.3から3.6までの3. 3kb Ps tl /  EcoR1断片はpBR322にクローニングされた。
分離後,いくつかの大きなランダムなクローンの位置と向きが,制限分析により 決定された。M13ファージDNAは単鎖であるので,これらのクローンのヴイ リオンDNA((−)鎖であることが判明している)へのハイブリダイゼーショ ンによって,制限地図のmRNΔコーF鎮との関係が第1図に示すように明らか になった。この結論は以下に説明するようにその後の配列分析によって検証され た。
上記の多くのランダムなクローンと特別に作られたクローン全ては,旧3/ジデ オキシ(dideoxy )法を用いて塩基配列を決定された。重なったクロー ンのデータが集められ,以下の表1に示す0.3〜3.85kbの,そして以下 の表Hに示す約4.25〜4.6kbの完全なヌクレオチド配列が得られた。
第上表 AlaAIaTrpGInArgGIuThrLeuThrArgLysArg TyrOC LysLeuProThrGIyPheLyslleMetLeu LysCysSerMetAIaAlaGIyAsnThrTyrSerGlu GIuVa]LeuLysAIaThrAsnTrpLeuGInAspAsn AlaGlnLeuGInHisGlySerGlyLysHisLeuLeu GlyArgGIyThrLysSerTyrGInLeuAlaSerArg OC CysSerI CTGCAGCATGGCAGCGGGAAACACT TACTCGGAAGAGGTACTAAAAGCTACCAACTGGCTT CAAGATAATGCTCAGACGTCGTACCGTCGCCCTTTG TGAATGAGCCTTCTCCATGATTTTCGATGGTTGACC GAAGTTCTATTACG/lGTGInLeuMetAlaAlaPro PheValOC GluSerSerThrSerPheAlaValLeu GInSerOP SerLeuAIaOPCysCysProLeuProP heCysLysSerProLeuProVaILeuLeuAM TrpS erA]aGluLeuTyrHisG] uPhe八laAlaHisCys ArgSerValSerValArgPheLeuTyrAM PheSer GlyValProLysLeuIlelleSerLeuLysLysHis SerLeuMetTyrLeuLysHisLysLysSertleOC  MetGluLysLysLeuLeuGlyT]eThrThrLysG]u AlaPheserTyrValPheLysThrGlnLysValAsn LeuAsnGlyLysGIuIIeAl aTrpAsnAsnTyrLy sArgSerlleLeuLeuCyslleOC’AsnThrLysSe rGlnSerLysTrpLysArgAsnCysLeuGluOC Le u76 AAAAGAAGCATTCTCTTATGTATTTAAAACAC AAAAAGTCAATCTAAATGGAAAAGAAATTGCTTGGA ATAACTATTTTCTTCGTAAGAGAATACATAAATTTT GTGTTTTTCAGTTAGATTTACCTTTTCTTTAACGAA CCTTATTGATPheSerAlaAsnGIuOC ThrAsnLe uValCysPheThrLeuArgPheProPheSerlleA] aGInPheLeuAMLeuLeuMetArgLys}IislleOC  PheValPheLeuOP AspLeuHisPheLeuPheGI nLysSerTyrSerCysPhePheCysGluArglleTy rLysPheCysLeuPheAsplleAM IIeSerPhePh eAsnSerProlleValValThrLysIIeGInGlnMe tArgLysOP QC ThrTyrLysGluGluGlnLysHi sHisGlyThrArgGlnGInThr八snLysAspThrTh rAspAIaGIuMetIleAsnLeuGInArgGIyAIaGI uThrSerTrpAspGInAIaThrAspGInGlnArgTy rAsnArgcysG]yAsnAspLysProThrLysArgSe rArgAsnTleMetG]yProG]yAsnArg151 CAAC AAAGATACAACAGATGCGGAAATGATAAACCTACAA AGAGGAGCAGAAACATCATGGGACCAGGCAACAGAG TTGTTTCTATGTTGTCTACGCCTTTACTATTTGGAT GTTTCTCCTCGTCTTTGTAGTACCCTGGTCCGTTGT CTLeuLeuSerValValserAlaserI]eIlePheA rgCysLeuProA]aSerValAspHisSerTrpAlaV aISerCys LeuTyrLeuLeuH i sProPheSerL euG l yVa l PheLeuLeuLeuPheMe tMe tP roG I yProLeuLeuCysValPheIIeCysCysll eArgPhe}lisTyrValAM LeuSerSerCysPheC ysOP ProValLeuCysCysVal・第11表・(社)き) TrpAsnG]yAsnG]nLysSerThrAIaSerGInAsn GlyLysTyrOP PheLeuThrLeuLeuLeuLysAsn 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GIyAM PheOC GlyGlyGlyGIy llisThrTyrLysThrAsnCysLysOC PhePheTy rIleGluGlnGluValArgValValLeuArgGlyTr pTrpAlaTyrIleOC AsnOC LeuGlnllellePh eLeuTyrArgAlaArgGIyLysGIySerPheLysG] yValVaIGIyI]eHisIIeLysLeuThrAIaAsnAs nPhePheI]eSerCysSerThrLeuThrThrLysLe uProHisllisAIaTyrl’letTyrPheAM SerCy sllelleLysLysTyrA I aLeuProLeuProLeu LysLeuProThrThrProMetCys I ] ePheSer Val^laPheLeuLysLyslleTyrLeuLeuLeuTyr ProTyrAsnOC P.roProProProCysValTyrLe uValLeuGlnLeuTyrAsnLysOC IleLeuGlnAs pOC LeuTyrGlnAspThrAsnThrLeuValGlnGl uThrHisAM ThrLysGluAsnG]nLeulle11eTh rGlyLeuThrLeuProGlyTyrLysTyrLeuGIyPr oGlyAsnSerLeuAspGlnG]yGluProThrAsnTy rTyrArgThrAsnSerThrArgTIeGlnI1eProTr pSerArgLysLeuThrArgProArgArgThrAsnOc 2101TATTACAGGACTAACTCTACCAGGATACAAAT ACCTTGGTCCAGGAAACTCACTAGACCAAGGAGAAC CAACTAA八T八八TGTCCTGATTGAGATGGTCCTATGT TTATGGAACCAGGTCCTTTGAGTGATCTGGTTCCTC TTGGTTGATT[1eValProSerVal八rgGIyProTy rLeuTyrArgProGIyProPheGIuSerSerTrpPr oSerGlyVaILeuQC LeuValLeuGIuValLeull eCyslleGlyGlnAspLeuPheSerValLeuGlyLe uLeuValLeuAM 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第1表は、確認されたブタ・パルヴオウィルスRF DNAの塩基対の連続配列 を大文字で表示するが、 5kb PPVゲノムの約300番目の塩基から開始 しく即ち、第1図の左のハ(1制限部位の近くで開始する)、その後締3400 の塩基を示す(即ち、第1図の右のHae III制限部位まで)。DNA 、 配列の側面に位置するのは6つのれる。終止コドンは、ocあるいはoPあるい はAMで示される。もっと具体的に述べると、 DNA配列の上になる3つのア ミノ酸配列は。
上部DNA鎖の3つの左から右への翻訳を表し、下になる配列は考えられる3つ の右から左への翻訳を表す。
合衆国特許出願番号459,203の第2図に開示されたブタ・パルヴオウイル スRF DNA塩基対の連続配列を後に検証した結果、第2図の元の配列に存在 した4個の塩基は確認されず、それゆえにこの明細書の第1表の配列には示され ていない。130個の塩基が元の配列から取り除かれ、ここに挿入された。さら に9塩基は親出願の第2図に誤って表示されているので、ここにこの第1表で修 正する。
具体的な修正点は第1表の配列に下記のように示す。
(1)第1表の配列の参照番号199において5原出願ではA/T対1つが存在 することを示しているが、この対は配列の検証では確認できなかった。
(2)第1表の配列の参照番号273がら401までは、原出願の第2図に表示 されていない129個の塩基の配列である。
(3] 第1表の配列の参照番号488において、原出願はG/C対1つが存在 していることを示しているが、この対は配列の検証では確認できなかった。
(4)第1表の配列の参照番号494〜496において、原出願の第2図は3つ のT/A対が存在することを示しているが、それらは配列の検証ではA/T対で あることが示された。
(5)第1表の配列の参照番号520では、出願番号459,203は追加のA /T対1つが存在することを示しているが、その存在は配列の検証では確認でき なかった。
(6)第1表の配列の参照番号557では、出願番号459.203は配列の検 証で明らかにされたG/C対の存在を示していなかった。
(7)第1表の配列の参照番号702では、出願番号459.203はT/^対 1つが存在することを示しているがいるが、配列の検証では確認できなかった。
(8)第1表の配列の参照番号816から821までては、出願番号459.2 03は下記の配列 5’ −CCAAAA−3’ 3’ −GGTTTT−5” が存在することを示しているが、それは配列検証によって5’ −TTCCCC −3’ 3’−AAGGGG−5’ であると決定された。
第1表の全配列を考えられる読み枠金てについて検討すると。
ハイブリダイゼーション・データが予測した方向に、即ち、第1回の左から右の 方向に、1つの主要なコード相が存在することが明らかになった。このオープン 枠は、 2.2kb近くの小領域を除いて1部位0.82から3.85kbに渡 って(その先まで延びる可能性もある)いる。コンピューターによる配列の探索 でも、幾つかの標準的なRNAスプライシング結合配列(RNA splici ng junctionsequences>が存在することが明らかになった 。左側スプライスの部位(AGGTA )は7つの場所に認められ、右側スプラ イスの部位(TT (何か)CAG )は2つの場所に認められる。これらの配 列は、その長さが5個だけの独特なヌクレオチドであるので、 1000ヌクレ オチドにつき約1度の割合でランダムに起こることが予測される。従って、それ らが存在する場合に限って、スプライシングが起きる可能性がある。しかし、ス プライシングは密接に関係したパルヴオウイルスH1で起こることが知られてお り、その場合には、 Slヌクレアーゼ遺伝地図作成実験によって、4.7kb 、3.OKb。
および2.8kbのウィルスの転写は普通の2.6kbセグメントともっと小さ な不連続セグメントのスプライシングによって得られたものであることが示され た。Green等、 Ce1l、17,967 (1979)を参照のこと。予 備結果はPPvにおいても同様な状況であることを示唆している。PPv感染細 胞から得た全〔ポリ八→RNA )を負鎖ゲノムDNAにハイブリダイゼーショ ンすると、中性アガロース・ゲル(neutral agarose gel) 上に2つの大きな耐8に重ハンドが生成し、その長さは2.8および2.6kb で、さらに4.7kbではもっと弱いハントがあった。さらに、電子顕微鏡で検 査した幾つかのハイフ゛リットは、スプライスされたRNAへのDNAのノ入イ フ゛リダイゼーションの結果であると思われるが、そのような証拠は確定的では ない。
第■表は、第1表のDNA配列を大文字で示し、それとともにコード化されたア ミノ酸配列を示し、その配列はブタ・パルヴオウイルスのDNAが指揮したウィ ルス蛋白質の産出の翻訳結果に重複するものである可能性が最も高いものである 。
第工衷 CysSerMetAlaA]aG]yAsnThrTyrSerGIuGIu ValLeuLysA]aThrAsnTrpLeu10 20 30 40  50 60 Bbvl Bbvl Mboll Rsal AlulG In AspAs  nA laG lnLysG IuA la PheSerTyrVa lPh eLysThrG l nLys Va IAs nLeu10 20 30  40 50 60 62 CAAGATAATGCTCAAA八八GAAGCATTCTCTTAT GTATTTAAAACACAAAAAGTCAATCTAGTTCTATTA CGAGTTTTTCTTCGTAAGAGAATACATAAATTTTGT GTTTTTCAGTTAGATAsnGlyLysGluI leAIaTr pAsnAsnTyrAsnLysAspThrThrAspAlaGIuMe tIle10 20 30 40 50 60 Asull SfaNI 122 AATGGAAAAGAAATTGCTTGGAATAACTACAA CAAAGATACAACAGATGCGGAAATGATArrAccnnc mAACGAACCTTATTGATGTTGTTTCTATGTTGTCTA CGCCTTTACTAT第■表(続き) AsnLeuGInArgG]yA]aGluThrSerTrpAspGln AlaThrAspMetGluTrpG]uSer10 20 30 4(+  50 60Mnl Asu.]Ecorll HinflGluI IeAs pSerLeuThrLysArBGlnVa]LeuIIePheAspSe rLeuVaILysLysCys10 20 30 40 50 60 Taql Mnl Rrul Hinf+LeuPheGluGIyI leL euGInLysAsnLeuSerProSerAspCysTyrTrpP heLeuG]n10 20 30 40 50 60 Ddel 旧sG]uH isG IyG ] nAspThrG I yTyrH is Cys}l i sVa l LeuLeuG lyG lyLysG lyL eu10 20 30 40 50 60 Rsal 362 CATGAACATGGTCAAGATACTGGCTATCACTG 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GGΔGTGTGGTTCAATCCAGCGGACTGGCAGT TAATATCCAACAACATGACAGAAATAAACCCTCACA CCAAGTTAGGTCGCCTGACCGTCAATTATAGGTTGT TGTACTGTCTTTATTTG第■表(続き) 1、euVa ] 5erPheG IuG lnG Iu T 1ePheA snVa I Va 1LeuLysThr T 1eThrG ] uSer A 1a10 2030 40 50 60 ThrSerProProThrLysI IeTyrAsnAsnAspLe uThrAlaserLeuMetVaIAIaI Ielo 20 30 4 0 50 60 Mn1 Mbol Hindlll nu4h1 3062 GACACCAATAACACACTTCCATACACACCAG CAGCACCTAGAAGTGAAACACTTGGTTTTCTGTGGT TATTGTGTGAAGGTATGTGTGGTCGTCGTGGATCTT CACTTTGTGAACCAAAAbvl TyrProTrpLeuProThrLysProThrGInTyrArg TyrTyrLeuSerCysI IeArgAsnlo 20 30 40  50 60 第■表(続き) LeuAsnProProThrTyrThrGlyGlnserGlnG]  nI 1eThrAspserI IeGInThrGIylo 20 30  40 50 60 infl LeuHisSerAspIleMetPheTyrThrI 1eGIuAs nAlaVaIProI ]eHisLeuLeuArg10 20 30 4 0 50 60 Rsal Mbol+ ThrG ] yAs pG l uPheSerThrG l y I 1e TyrHi 5PheAspThrLysProLeuLys l、euThr lo 20 30 40 50 60 cor1 3302 ACAGGAGATGAATTCTCCACAGGAATATATC ACTTTGACACAAAACCACTAAAATTAACTTGTCCTC TACTTAAGAGGTGTCCTTATATAGTGAAACTGTGTT TTGGTGATTTTAATTGA第■表(続き) 1(i 5SerTrpG 1 nTh rAsnArgSerLeuG l  yLeuProProLys Leu LeuThrG Iu ProThrl o 20 30 40 50 60 glll ThrGluGlyAspGlnl、euProG 1yThr LeuPr  oA la A 1 a As nThrArgLysG l yTyr411 s10 20 30 40 50 60 GInThrlleAsnAsnSerTyrThrGluAlaThrAla 11eArg10 20 30 40 (アミノ酸配列順序は、第1表のDNA鎖の上方の中間配列に見られる配列に対 応していることに留意すること。同様に、第■表のDNA !(!列は、第1表 に示された最初の塩基対C/Gが欠けている。)第■表も、普通の制限エンドヌ クレアーゼによる切断のコンピューターで推定した認識部位を示している。
第■表に開示された配列は、第1表の配列の上記の変更を除き。
合衆国特許出願番号459,203の第3図に対応するものである。しかし、第 1表および第■表にそれぞれ示した出願番号459,203の第2図および第3 図の配列になされた塩基の変更、消去および挿入の結果得られた塩基の数が3で 割り切ることが出来るものであったので、これらの変更は第■表の読み枠には影 響を及ぼさず。
それは第3図のものと同一である。その後の配列の検証によって得られた情報を 反映させるために、参照番号のみが変更された。
加えて1原出願の第2図および第3図の配列になされた最後の変更は、第1表お よび第■表の参照番号81Gから821までに起こり。
これは下記の例で用いたポリペプチドのコート領域の前にある。
第■表は、確認されたブタ・パルヴオウイルスRF DNAのDNA配列を大文 字で示し、 [![!列は5kbのPPvゲノムのほぼ4200番目の塩基から 開始しく即ち、第1図の右側のほぼ2番目のBgl 11制限部位から開始し) 、それに続くほぼ400個の塩基を含む(即ち、第1図の右側の2番目のへcc I′1Ii11限部位まで)。
DNA配列とともに示されているのは、ある開いた読み枠によって明らかになっ たアミノ酸配列で、1つ以上のPPvギャプシド蛋白質(PPV capsid  protein)のカルボキシ末端に存在するものと重複する可能性が非常に 高い。このアミノ酸配列は、 Astrell等(1983) 、前掲(sup ra) 、によって示唆されたカルボキシ末端に実質的に相同している。
第且表 As pLeuLysProArgLeuHis Va ] Th rA l  a ProPheVa l Cys LysThrAspAspPheAsnA laAspserProGInGlnProArgI leI 1eTh rT yr’5erAs n PheTrpTrpLysG l yThrLeuTh  rPheTh rA l aLysMetArgserserAsnMetT rpAsnProSerGInGlnHisThrT hrThrA laG  l uAsn IIeG 1 yAsnTyr I ]eProThrAsn  I IeG 1yTGTTGTCGTCTTTTGTAACCATTGATAT AAGGATGTTTAT八八CCA第■表(続亀λ− Glyl leArgMetPheProGluTyrserへへnLeul  1eProI 1eLysGG(、ATΔ八GへATGTTTCCAGAATA TTCACAACTTATACCAAT八へへへCCGTATTCTTACへΔ AGGTCTTATAAGTGTTGAATATGGTTATTTTLeuTy rAM TTATACTAGAAATAACTCTGTAAATAAへへACTCAGT TACTTGGTTTTAGTACATGATTGTAGTAAにATATG第 1表から第■表に示された情報は、始めて、 pp、vゲノムのコード領域から 得たゲノム断片の本当の意味のクロー二゛ングを翻訳枠内で可能とし、それによ って、バルヴオウィルス蛋白質に存在するアミノ酸配列に重複するポリペプチド の微生物による発現を可能とした。この配列データは1選別した。比較的に低分 子重量のポリペプチドの製造(例えば、化学合成によって)を可能にし。
前述のポリペプチドはそれらのアミノ酸配列がパルヴオウィルスに類似している ことからパルヴオウィルス蛋白質の微生物的特性。
例えば抗原性と免疫原性とを持つことを期待することが出来る。
さらに第1表から第■表に示された情報がもたらすものは、製造される選別され たパルヴオウィルスに重複するポリペブチF内の親水性が比較的に高い領域の予 測の基礎となるもので、これらの領域は抗原決定基を含む可能性が大きい。例え ば、 Hopp等。
P、N、A、S、、 78.3824 (1981)およびKyte等、 J、 Mo1.Biol、、157 。
刊屓(1982)を参照のこと。
実例として、第■表のアミノ酸配列は、 Hopp等の「方式(Method)  Jに従って、インテリジェネティノクス・インコーボレイテイソド(Inte lligenetics、 Inc、 ) 124 University A venue。
Pa1o Alto、 Ca1iforniaが提供したプログラムと指定のP EP資料56.7を用いて、親水性領域と疎水性領域のコンピューター分析に掛 けられた。第■表については、 1166番から1186番までの塩基対によっ てコードが決まるシリーズ Thr−Arg−^rg−Lys−Lys−Tyrから成るアミノ酸配列は、全 配列内の最も親水性の高い領域となる。このポリペプチド配列、あるいは実質的 にそれに重複する配列は、免疫学的にかなり重要であると予測される。しかし、 このポリペプチドのコートを決めるDNA配列は、キャブジッド蛋白質に翻訳で きそうもない介在配列領域に存在する。
下記の例は、この発明による代表的なりNAヘクターの作成に関する。
影 第2図に図示したように、DNAヘクターpss17が、 trpブロモびHi nd mを用いて5kb PPVの華量体複製型を消化し、78oの塩基対のP Pvゲノムの断片が切出された。Pvu Uは、第1図に図示した5kb制限地 図の位置2.56に示される部位を切断する。Pvu IIによる切断に関連し た特定の配列は、第■表の参照番号2262の側のDNA配列内に図示されてい る。Hindlllは、第1図の位置3.35に示される部位を切断し、この部 位は具体的には第■表の参照番号3050の側に図示されている。
この断片は旧3mp9に挿入され、挿入位置は肛匹■と肛閃■制限エンドヌクレ アーゼ酵素認識部位の間であった。それからこのDNAはHindllIおよび BamH+ によって消化され9元のPPV断片といくらかのM2Sのヌクレオ チドを合わせたものに重複する断片を産出した。pBR322から得られたプラ スミドp41 は、耐アンピシリン性(ampicillin resista nce)の遺伝子を保持し且っE、 co其の’trp」オペロンを含むもので あるが、操作的に全trpE構造遺伝子に関連し、さらにtrpD構造遺伝子[ Cheng等、 Gene、 14.121−130(1981) )の一部は 、 B、I IIとHindlI[によって消化された。前述のBgl IIの 切断消化は、 Pvu 11部位の下流にあるp41ヘクター(1398塩基) の最初の部位で起こった。それからHind m /Bam HI PPV断片 は、消化されたp41に挿入され、プラスミドpss17を形成するが、このプ ラスミドは、 trpEの最初の320のアミノ酸とPPV DNAによりコー ディングされた260のアミノ酸がら成る融合蛋白質を含むものである。
プラスチFpSS17のE、 coli菌株HB 1’o 1への形質転換は薬 剤耐性コロニーを産出し、これらコロニーは、全ゲノムPPvのニック・トラン スレーション(nick translation)によって放射性のラヘルを 付けた探針ヘハイブリダイゼーション(hybridization)を行うこ とにより、誘導されたPPv配列が存在するかスクリーニングを受けた。ppv 配列の存在は、 Ace L Pvu IIおよびHindlI[を用いた挿入 物の制限エンドヌクレアーゼ地図の作成によっても確認された。
上記の形質転換されたHBIOI菌株から分離されたプラスミドpss17によ って形質転換されたE、coli菌株AM7Φr細胞から調製された細菌溶解産 物は、目的のtrpE/PPV融合ポリペプチドを検知出来るが評価することが 難しい量だけ含んでいた。
下記の例は1例5の目的のtrp/PPV融合ポリペプチドを発現するために、 この発明による別のDNAヘクターを作成することに望みの融合蛋白質の高レベ ルのE、co¥L発現をもたらす発現ヘクターを生み出すためにさらに操作がな された。これらの操作にばプラスミドを使用したが、このプラスミドは、 Mo rrisと共同所有の同時係属合衆国特許出願番号521,964 、題名r  DNAヘクター(DNA Vector) Jの発明の内容である。前述の出願 に開示内容は。
この明細書において参照することにより具体的に取り入れる。要約すると1作成 に用いられたプラスミドpcFM414 (A、T、C,C。
40076)は、転写制御領域に温度感受性突然変位部分を含む。、】のヘクタ ーを用いて形質転換を行うと、34°Cで増殖させた宿主細胞培養はプラスミド の少数のコピーを持つ。プラスミドのコピー数は、培養温度が34°Cを上回る と、宿主細胞内で50倍Gこ〔即ち、rラン−アウェイ (runs away  ) J ) &こAl加する。37°Cでの増殖は通常は細胞の死を招く。
A、T、C,C,40076を用いたヘクターの作成に伴う具体的な操作は下記 の通りである。プラスミドpss17は、 1lindlIIとPvu 11で 消化され、 ppv構造遺伝子とそれに伴うtrpプロモーター/オペレー回復 しなかった。
プラスミドp/H6によって形質転換されたE、coli菌株Am70’細胞は 、 8 mg100リットルの細胞のオーダーと推定される測定可能な量のtr pE/PPV融合ポリペプチドを産出した。
下記の例は、この発明による別のPPv断片を用いた別のDNAヘクターの作成 に関する。
PPvゲノムの約350塩基対の第2の断片が、制限エンドヌクレアーゼ醇素S au 3Aを用いた皿回の消化により5kb PPV単量体複製型から切り出さ れた。Sau 3Aは、第1図の5kb制限工ンドヌクレアーゼ地図上の位置3 .33および3.68に示される2つの部位を切断する。Sau 3Aの切断に 関連する具体的な配列は、第■表の参照番号3034と3383の側のDNA配 列内に図示されている。
M13mp8内での増幅の後に、このSau 3A断片は、前辺ってハL旧によ って消化されたpBR−322−から得られたプラスミド’、 plNTr−t rpI7に挿入された。プラスミドplNT r 7 trp17は、Al t on等と共同所有の同時係属合衆国特許出願番号483,45L 題名「大型構 造遺伝子の製造と発現(The Manufacture and Expre ssion ofLarge 5tructural Genes)」に開示さ れている。前述の参照文献の開示は、ここに参照することによって具体的に取り 入れられる。
要約すると、 prNrγtrpT−7は下記の方法で作成された。
プラスミドPVvI (スタッフォード大学(Stanford Univer sity)。
ドのPvu 11部位に挿入された。それからこのハイブリッドのコピー Lt Eco R1オよび1lpa Iによって消化され、 trpプロモーター/オ ペレーター領域を含む245塩基対配列をもたらした。標準的手順によって、ヒ ト細胞のインターフェロンIP−4の配列のDNA配列サブユニットが展1部位 に加えられたが、これは完全なtrp翻訳開始信号の残りの37塩基対と、免疫 性インターフェロンの最初の4個のアミノ酸(Cys−Tyr−Cys−Gin  )のコドンを決める塩基を取り入れるためである。そして、生じたアッセンブ リーはpBR322の誘導物であるpINT3に挿入されたが、それはEco  R1およびBam l(+とによって消化されてプラスミドpINTγ−trp 17を産出した。
限部位を修復できなかった。生じたtrpプロモーターとγインターフェロンの 4個のアミノ酸の後にPPvゲノムを含んでいるプラスミドはS/S3と名付ら れた。
プラスミドPS/S3で形質転換されたE、coli菌株AM70’細胞は。
測定可能な量のγIFN /PPV融合ポリペプチドを産出したが、その量は、  5mg 100リツトル細胞のオーダーであると推定された。
下記の例は1 この発明によるPPvゲノムの3番目の断片を用いるさらに別の DNAベクターを作成することに関する。
±」 PPvゲノムの約479塩基対の第3の断片は、制限エンドヌクレフ −セ酵7 iHind mとHae mで消化することによって、 5kb PPV華され た部位を切断し、さらにそれは特に第■表の参照番号3050の照番号3524 の側のDNA配列内に開示されている。 この断片は増111M(7)タメニM 13mp9のHinc IIとHind I[[制限エンドヌクレアーゼ酵素間 に位置する269 PPVヌクレオチドを引いたものに重複する断片を産出する 。
先に例5で述べた。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドp41もEc o□R1で切断され、 ppv断片を挿入され、β−gal /PPv融合遺伝 子を含むプラスミドpE/H2,5が生じた。
プラスミドpE/H2,5で形質転換されたE、coli菌株AM7Φ′細胞は 、細菌溶解産物中に測定可能な量の融合ポリペプチドを生成し、その量は15m g100リツトルのオーダーであると推定された。
下記の例は、この本発明による合成PPvポリペプチドの開発に上記のppv断 片のコード領域をもたらした5 kb PPV単量体の領域(即ち、おおよそ位 置2.5から5.0)のアミノ酸配列は。
Hopp等のr方式(Method) Jに従って、インテリジェネティソクス ・インコーポレイティソド(Intelligenetics、 Tnc、、)  r124 University Avenue、 Pa1o Alto、  Ca1.が提供したプログラムと指定のPEP資料96.7を用いて、親水性領 域と疎水性領域のコンピューター分析に掛けられた。
2つのペプチド配列が、先天PPv分子の考えられる表面オリエンテーションを 予測する親水性プロフィールを持った。
NO3−Asn−Leu−Ala−Lys−Lys−Lys−八1a−Lys− Gly−Thr−3er−へ5n−Thr−八5n−3er−COOHおよび NI+2 −Thr−Thr−3er−Gin−Gln−Pro−Glu−Va l−Arg−八rg−3er−Pro−Arg−Lys−COOH。
下記の第■表は上記のように分析されたアミノ酸配列の疎水性(−)と親水性( +)を示す。
芽J【表 第■表参照番号 2309から2602の Set + 10 芽」!表(続き) 第■表参照番号 −〔疎水性/親水性〕の値2309から2602の Lys +11 芽己(表(続き) 第■表参照番号 −1東水才し4靭汐1t↓」λ愼−2309から2602の Asn川 2d■表(続き) 第■表参照番号 〔疎水性/親水性〕の値2309から2602の Set + 9 2番目の分析は、参照番号2480から2524迄の最初のペプチドに行われ、 それが隣接するアミノ酸から分離された時のその疎水性を決定した。TJ−1と 名付けられたこのペプチドは、下記の第V表に示すように非常に親水性が高いこ とが分り、そこで合成に選択された。
Set + 1 ペプチドTJ−1は、 Stewart等の「同相ペプチド合成(SolidP hase Peptide 5ynthesis) 」(W、 H,Freem an、 San Francisco。
1969)に記載されたメリフィールド(Merrif 1eld) レジン結 合手順によって化学的に合成された。要約すると1ペプチドは、ペプチドのカル ボキシ末端残基を形成するように選択された元のコラム結合残基への一連のアミ ノ酸の付加によって作られた。選択されたカルボキシ末端アミノ酸は、 BOC 保護アミノ酸としてポリスチレン樹脂に結合される。その後のアミノ酸の付加は 全てジシクロへキシルカルボジイミド(dicyclohexylcarbod iimide)と共になされるが、適切なりOCアミノ酸と下記の側鎖保護グル ープとを用いる。即ち、トレオニンを0−ヘンシル・トレオニン(0−benz ylthreonine)の形で、リジンを2−クロロカルポヘンゾキシ・リジ ン(2−chlorocarbo−benzoxy 1ysine)の形で、ア スパラギンをキサンチル・アスパラギン(xanthyl asparagin e)の形で、そしてセリンを0−ヘンシル・セリン(0−benzyl 5er ine)の形で用いる。出来上がった保護ペプチドは樹脂から無水HFを用いて 切断されるが、同時に保護が無くなる。ペプチドはセファデックスG25 (S ephadexG25)上のクロマトグラフィーおよび分取THANクロマトグ ラフィーの組合せによって精製された。望みの製品は安定した凍結乾燥した白色 の粉として分離された。組成はr蛋白質配列の決定(Protein 5equ ence Determination) J 197頁(S、 Needle man、ed、。
Sprinbger−Verlag、 1975 )に記載された11C1消化 の後のアミノ酸分析によって決定された。配列の検証が自動アミノ酸分析によっ てなされた。精製された製品はTLC上の単一点として移動した。
ブタノール、酢酸、水およびピリジン(15:3 :12:10)を成分とする pH4〜pH4,5の溶剤に溶かしたTJ−1のRf測定値は0.23であった 。
下記の例は、 ppvの抗血清を製造する際の上記のppv融合ポリペプチドお よび合成ペプチドの使用に関する。
側 上記のプラスミドE/H2,5,S/S 3およびPH6を含むl11M7Φ1 の分離物、コラムで精製したP)16の分離物、および合成ペプチドTJ−1の 調製物2つを用いて、プレイド・バインディング検定および中和検定に使用する ための抗血清が製造された。TJ−1調製物の1つは、ゲルタールアルデヒド( gluteraldehyde)を用いてBaron等の手順、鮭、筺、 pp 、 395−404 (1982)によってキーホール・リンペット・ヘモシア ニン(keyhole limpet hemocyanin) (KLII) に共有結合によって架橋されたが、もう1つは架橋されなかった。
抗血清は、ウサギに各分離物あるいはペプチド調製物を下記のプロトコル(pr otocol)によって注射することによって特に製造された。ます、免疫前血 清が各動物から採集された。最初の接種は下記の第■表に示した抗原量をフロイ ント’ (Freund)完全アジュハン)0.5mAとともに含んでいた。こ れに続く接種は抗原とフロインド不完全アジュバント(Freund’s im completeadjuvant)0.25m(!を含んでいた。動物は第2 8日と第63日に血液を採取された。
1 150 150 250 250 250 250下記の例は、上記のPP v融合ポリペプチドおよび合成ペプチドを用いて得られた抗血 清の免疫原性を 決定するためになされた試験に関する。
109 、129−135 (1972)およびVon Weemen等、 F EBS Letters。
24、77−81 (1972)の手順に従って実施され1例IOの抗血清を得 るために用いた抗原とPPvに対する例10で得た抗血清の試験がなされた。さ らに感染したブタから得た抗PPv血清が、各抗原に対して試験された。下記の 第■表に示される滴定量は、抗血清中の抗体と表示した抗原の結合が飽和レベル の半分まで降下した時、シ。
の血清希釈量である。
抗−E/H2,57,5XIO31,5XIO3抗−TJI (KLIIに結合 ) 1.6 Xl053.OXIO’抗−P/[66,25xlO’ <102 抗−Ppv E /H2,51,0xlO” 1.38xlO’TJI 2.O Xl02 P /H64,OxlO” これらの結果によって1合成TJIに対して作られた抗血清は。
その他の融合ペプチドと比較した場合、それ自身の抗原および感染したブタの血 清中の天然PPvと結合する能力があることが分かった。
B、プラーク減少検定法(Plaque Reduction As5ay)抗 血清はさらにr基礎ウィルス学的技法の手引(A Manual ofRasi c Virological Techniques) J CRovozzo 等)pp、 94−]03(Prentice−Hall、 Englewoo d C11ffs、 Nu、 1973)の手順に従い。
プラーク減少検定法によって試験され、 ppv感染を中和する抗血清の能力が 測定された。抗TJIの結果は、下記の第4表に報告されている。TJ−1抗血 清のみが検定法によって中和されることが証明されたが、自然感染から得た抗p pv血清よりも幾つかオーダーが低い滴定量である。ST細胞は、 60−mの 皿当たり1.5 Xl06細胞の密度で平板培養され、6時間後に検定された。
これらの結果は2合成ペプチドTJ−1に対して作られた抗血清は。
PPv感染した血清培養中に形成されたプラークの一定の減少を起、こすことに よってPPvの感染性を中和する能力があることを示している。
前記の例6および例7の融合ポリペプチドおよび例8の合成ペプチドを含めて、 この発明のポリペプチドは、パルウォウイルス感染に感染しやすい動物に投与す るワクチンの組成の免疫原性成分として著しい効力を発揮し且つワクチンを接種 した動物に防御免疫応答を誘発することが期待される。従って、この発明による ワクチンの組成は、免疫学的に効果的な量のこの発明のポリペプチドと免疫学的 に許容出来る希釈剤、アジュバントおよび担体から成る。先行技術の死菌および 変性パルウォウィルス・ワクチンと同様に、この発明によるワクチンは非経口的 に投与されると有効性が最適になると思われる。
この発明によってもたらされるポリペプチドは少なくとも部分的に、ブタ・バル ヴオウィルス蛋白質に存在するアミノ酸配列に重複するが、 ppv蛋白質とそ の他の宿主種に特有のパルヴオウィルスの蛋白質との間に予期される相同性は、  ppv以外のその他のパルヴオウィルス種(例えばイヌあるいはウシのパルヴ オウィルス)による感染に対するワクチン免疫性を作る際にこれらポリペプチド を有用なものにするものと思われる。天然パルヴッーウィルス蛋白質にこれらの 構造が類供しているので、この発明のポリペプチドは、動物血清等の体液サンプ ル内の抗パルヴオウィルス抗体の定量を行うための検定の試薬としても役立つも のと思われる。
この発明の免疫学的に活性のあるポリペプチドを製造するための現在望ましい方 法は、パルヴオウィルス・ゲノム内に存在する配列の全体64あるいは部分に重 複するDNA配列の微生物による発現によるものであるが、パルヴオウィルス・ ゲノム配列の「翻訳的同等物(translational equivale nts) Jである製造されたDNA配列も微生物製造プロセスに用いることが 出来るものと思われる。
特定の且つ免疫学的に活性のあるPPvポリペプチドが、 ppvゲノム断片と 同一のアミノ酸配列のコードを決定する製造されたDNA配列の微生物による発 現によって製造されるが、製造に選択された微生物内で転写上あるいは翻訳上の 優先を受ける可能性がある代替コドンによるものは、この発明の範囲に含まれる 。 (例えば。
合衆国特許番号4,356,270を参照のこと。)当業者にはこの発明がかな りの長さの免疫学的に活性のあるポリペプチド(例えば、 pss17のPPV  DNAの780塩基対配列によってコードを決定されたもの)の、および相当 な免疫学的な活性を持つ可能性があるもっと短い配列の良く知られた組み立て方 法を用いる化学的あるいは生物学的合成を包括するものであることが明らかであ ろう。一般に、この発明の生物学的あるいは化学的に合成されたポリペプチドは 6以上のアミノ酸を含む可能性がある。
免疫学の技術、および免疫学の技術に使用する組み換え方法の使用、およびポリ ペプチドの製造のための組み換え方法の使用に熟達した当業者には、これまで詳 細に説明されたこの発明に数多くの改良および変更を加えることが可能なことは 明らかであろう。
例えば、プラスミl”pH/6のPPV DNA配列の発現の対象とされたポリ ペプチドは融合ポリペプチドであろう。それゆえ、それは。
使用される前に月ユ coli trpEアミノ酸との関連を断たれるかもしれ ないし、あるいは1 それはPPvポリペプチドおよび非ウィルス・ポリペプチ ドの融合蛍白質の形で免疫学的に活性のある試薬として使用されるかもしれない 。或いは、当然ながら、pH/6のPPvから得られたDNAは+’trpJオ ペロン以外のプロモーター/レギュレーター配列を持つ適切な形質転換ヘクター に取り込まれることも出来、そしてこのヘククーはPPV DNAが制御する配 列の直接の発現を可能とするように設計することも出来る。
別例を挙げると、この発明のポリペプチドあるいはそれに対するモノクローン性 あるいはポリクローン性抗体は、 (放射性ラヘル等の検知可能なラヘルを付け ても付けなくても)体液サンプル中のブタおよびその他の種のパルヴオウィルス 抗原および/あるいは抗体の検出に用いるRIAやELISA等の免疫学的検定 法に役立つと思われる。同様に1 この発明がもたらすDNA配列(例えば。
自立的に複製するウィルスあるいは環状プラスミドDNAベクターに挿入物とし て増幅された形でもたらされるPPV DNA配列)は。
組織サンプル中のブタおよびその他の種のパルヴオウィルスDNAの検出に用い るDNA /DNAハイブリダイゼーション手順に使用される一本鎖DNAの有 用な供給源として期待される。 上記に鑑みて、この発明は添付する請求の範囲 によってのみ限定を受けるものとする。
麓 1 図 (六り〜−スi1我1) LENGT)I IN K11..0BASE PAIR’;l pvυII (虐も鵬7・1局1綻) E2図 国際調査報告 1°Ie+na“°nal A”pHcm+b+n No pl、、工/II! l?RII/。。。63Inls+nalional A°glica+i°n  No PCT/US811100063Inle+nalional ADO 11ea+、on No、 a”/υS 84 / 00063第1頁の続き

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.免疫学的に活性のあるポリペプチドで、バルウォウィルス感染に対するワク チン免疫を作るのに有用で、バルヴオウィルス・ゲノム内に存在するDNA配列 に、あるいはその翻訳的同等物に全体的にあるいは部分的に重複するDNA配列 の微生物による発現の産物であることを特徴とするもの。 2、請求の範囲第1項のポリペプチド産物で、微生物によって発現されるDNA 配列がブタ・バルヴオウィルス・ゲノムに存在する配列に重複するもの。 3、請求の範囲第1項のポリペプチド産物で、単独の翻訳事象における非ウィル ス・ポリペプチドとの共同微生物発現の産物であるもの。 4、請求の範囲第1項のポリペプチド産物で、第■表あるいは第■表に示された ものあるいはその翻訳的同等物に全体的にあるいは部分的に重複するDNA配列 の微生物による発現の産物であるもの。 5、請求の範囲第1項のポリペプチド産物で、一連の多数の親水性アミノ酸の存 在を特徴とするもの。 6、化学的に合成された免疫学的に活性のあるポリペプチドで。 バルヴオウィルス惑染に対するワクチン免疫を作るのに有用で。 第■表あるいは第■表に示されたアミノ酸配列に全体的にあるいは部分的に重複 する一連のアミノ酸の存在を特徴とするもの。 7、パルヴオウィルス感染に対する免疫応答防御を誘起するのに用いるワクチン 組成で、免疫学的に効果的な量の請求の範囲第1項あるいは第6項のポリペプチ ドおよび免疫学的に許容出来る希釈剤、アジュバントあるいは担体から成るもの 。 8、免疫学的に重要なポリペプチドの発現を可能にするのに用いるのに適したD NA形質形質転換ダクターパルヴオウイルス・ゲノムに存在する配列あるいはそ の翻訳的同等物に重複する配列にヌクレオチド塩基対が存在することを特徴とす るもの。 9、免疫学的に活性のあるポリペプチドを、産出するための方法で。 請求の範囲第8項に従ってヘクターを用いて適切な微生物宿主細胞を形質転換す ること、かく形質転換された細胞を適切な栄養条件のもとで増殖させ、且つ望み のポリペプチドをそれから分離することから成るもの。 10、第■表あるいは第■表に示されたDNA配列に全体的にあるいは部分的に 重複するDNA配列。 11、請求の範囲第10項のDNA配列と検出可能なラベルとから成る試薬材料 。 12、請求の範囲第11項の試薬材料で、検出可能なラベルが放射性ラベルであ るもの。 13、請求の範囲第1項あるいは第6項のポリペプチドあるいはその抗体および 検出可能なラベルとから成る試薬材料。 14、請求の範囲第13項の試薬材料で、検出可能なラベルが放射性ラベルであ るもの。
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