RU2527157C2 - Аттенуированный рекомбинантный парвовирус, пригодный для защиты собак от инфицирования парвовирусом - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области вирусных вакцин для защиты собак от инфицирования парвовирусом, их получению и применению. Более конкретно, изобретение относится к аттенуированному рекомбинантному парвовирусу, который содержит последовательность ДНК из аттенуированного первого парвовируса типа 2, причем ДНК, кодирующая капсидный белок первого парвовируса, замещена на капсидный белок парвовируса типа 2с. Вакцина на основе указанного выше вируса способна индуцировать более высокие титры защитных антител от угрозы инфицирования парвовирусом типа 2с, в то же время, сохраняя хороший иммунитет против парвовируса типа 2. Штаммы рекомбинантного вируса также оставались аттенуированными. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Description

Область изобретения

Изобретение относится к области вирусных вакцин для защиты животных от парвовирусной инфекции, их получению и применению. Более конкретно, изобретение относится к вакцине, содержащей аттенуированный парвовирус, содержащей капсидный белок или его фрагмент, получаемый из нового изолята парвовируса.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Парвовирус принадлежит к семейству одноцепочечных ДНК-вирусов. Парвовирусы могут вызывать заболевание у некоторых животных, таких как кошки, собаки и свиньи. Вследствие того, что вирусам для самовоспроизведения необходимы активно делящиеся клетки, тип инфицированной ткани варьирует в зависимости от возраста животного. Желудочно-кишечный тракт и лимфатическая система могут быть поражены в любом возрасте, что ведет к рвоте, диарее и иммуносупрессии, но мозжечковую гипоплазию наблюдают только у кошек, которые были инфицированы в матке или в возрасте до двух недель, и заболевание миокарда наблюдают у щенков, которые были инфицированы в возрасте между тремя и восьмью неделями.

Собачий парвовирус является особо опасным заболеванием для щенков, приблизительно 80% случаев являются смертельными, вызывая повреждения желудочно-кишечного тракта и дегидратацию, а также кардиальный синдром у очень маленьких щенков. Он распространяется при контакте с инфицированными фекалиями собак. Симптомы включают сонливость, тяжелую диарею, лихорадку, рвоту, потерю аппетита и дегидратацию. Свиной парвовирус вызывает заболевание репродуктивной системы у свиней, известное как SMEDI, что расшифровывается как мертворождение, мумификация плода в матке, эмбриональная смерть и бесплодие. Панлейкопения кошек распространена среди котят и вызывает лихорадку, низкий уровень лейкоцитов в крови, диарею и смерть. Инфекция плода кошек и котят младше двух недель вызывает мозжечковую гипоплазию. Вирус энтерита норки, по существу, схож с панлейкопенией кошек, за исключением того, что он не вызывает мозжечковую гипоплазию. Иной парвовирус вызывает алеутскую болезнь норок и других куниц, характеризующуюся лимфоаденопатией, спленомегалией, гломерулонефритов, анемией и смертельным исходом. Наиболее точно парвовирус диагностируется посредством ELISA. Собак, кошек и свиней можно вакцинировать против парвовируса.

Известно, что на уровне ДНК собачий, кошачий и свиной парвовирусы имеют крайне гомологичный геном. Собачий парвовирус (CPV2) является вирусом, вызывающим острый и иногда летальный энтерит у собак (Kelly, Aust. Vet. J. 54; 593, 1978; Appel et al., Vet. Rec. 105; 156-159, 1979). Этот вирус, который впервые появился в 1977 году, возможно, возник из очень близкородственного вируса у кошек, вируса панлейкопении кошек (FPLV), посредством небольшого числа мутаций в единственном капсидном белке; видового скачка, который возможно включал промежуточный перенос в других хищниках, таких как норка или еноты (Truyen et al., Virology 215, 186-189, 1996).

Еще в 1979 году появились первые варианты CPV2, названные CPV2a, и вскоре за ними последовало появление CPV2b в 1984 году. (Parrish et al., Science 230 1046-1048, 1985, и J. Virol. 65; 6544-6552, 1991).

Исходный вирус типа 2 в настоящее время исчез из области наблюдения, его место заняли варианты 2а и 2b; хотя относительные доли этих двух типов варьируют от страны к стране (Truyen et al., выше; Chinchkar et al., Arch. Virol. 151, 1881-1887, 2006; Pereira et al., Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007). Замены аминокислот в капсидном белке (VP2), которые характеризуют сдвиг от 2 до 2a и до 2b, очень ограничены. При эволюции от 2 к 2а произошли замены в положении 87 (Met на Leu), 300 (Gly на Ala), 305 (Tyr на Asp) и 555 (Val на Ile), и при появлении 2b из 2a произошли замены 426 (Asn на Asp) и 555 (Ile на Val) (Parrish et al., выше; Truyen et al., J. Virol. 69, 4702-4710, 1995). Недавно сообщали о штаммах 2a, у которых не хватало замены Val на Ile в положении 555 (Wang et al., Virus Genes 31, 171-174, 2005; Martella et al., Virus Genes 33, 11-13, 2006). Оказалось, что единичная замена аминокислот может устанавливать различие между последовательностями CPV2a и CPV2b VP2.

Совсем недавно в Италии появились штаммы, в которых аминокислота в положении 426 (Asn в 2a и Asp в 2b) стала остатком глутаминовой кислоты (Glu) (Buonavoglia et al., J. Gen. Virol. 82, 3021-3025, 2001; Martella et al., J. Clin. Microbiol. 42, 1333-1336, 2004). Тот факт, что эти варианты Glu 426, названные вирусами CPV2c, циркулируют и сосуществуют с другими типами CPV в Италии и других европейских странах (Decaro et al., J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006) и их выделили в таких географически удаленных странах, как Вьетнам и Шотландия (Nakamura et al., Arch Virol. 149, 2261-2269, 2004, Spibey et al., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008), позволяют предположить, что у них имеется преимущество, по меньшей мере, в относительном содержании в популяции собак.

Результатом относительно быстрой эволюции собачьего парвовируса стала потеря, а затем восстановление круга хозяев (Truyen et al., 1996 выше), и это восстановленная способность реплицироваться в кошках может хорошо объяснять замещение исходного вируса типа 2 вариантами 2a, 2b и 2c. В конце 1970-х годов и начале 1980-х годов обе, живую и инактивированную, FPL вакцины применяли для защиты собак от заболевания CPV благодаря близкородственным антигенам, которые стимулировали перекрестный иммунитет, однако уровни защиты, которые они предоставляли, были низкими, и длительность действия иммунитета была короткой. Эти вакцины заменили живыми аттенуированными CPV вакцинами, которые обеспечивали отличную защиту и более долгий срок действия иммунитета. В настоящее время живые аттенуированные вакцины получают на основе изолятов CPV2b или исходного вируса типа 2. Вследствие того, что вирус типа 2 полностью заменили на практике вирусами 2a, 2b и сейчас 2c, существует обеспокоенность уровнем защиты, предоставляемой аттенуированными вакцинами типа 2 (Pratelli et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001; Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999).

Однако на основе исследований доступных моноклональных антител выявлено, что каждый новый антигенный вариант потерял, по меньшей мере, один нейтрализующий эпитоп по сравнению с предшествующим вариантом (Strassheim et al., Virology 198, 175-184, 1994; Pereira et al., выше). Ранее продемонстрировали, что живая аттенуированная вакцина CPV2 способна защитить собак от угрозы инфицирования 2а и 2b (Greenwood et al., Vet. Record. 136, 63-67, 1995) даже, несмотря на то что исследования перекрестной нейтрализации, проведенные in vitro с применением сыворотки, индуцированной против различных антигенных типов, показывают заметные различия (Pratelli et al., выше).

Недавно было показано, что живая аттенуированная вакцина типа 2 (Nobivac-Intervet) способна защитить собак от угрозы инфицирования самым последним вариантом CPV, CPV2c (Spibey et al., Vet. Microbiol 128, 48-55, 2008).

Однако в данной области существует необходимость в вакцинах, которые повышают иммунитет у животных, в частности, у кошек, собак и свиней, против новых типов парвовирусов. Однако такие вакцины не доступны, в частности, не доступны вакцины, специфичные для собачьего парвовируса типа 2с.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение представляет собой решение вышеизложенной проблемы, которое состоит в том, что предоставляемая вакцина содержит рекомбинантный парвовирус, содержащий последовательность ДНК, получаемую из аттенуированного первого парвовируса, где ДНК, кодирующую капсидный белок или его фрагмент, относящиеся к указанному первому парвовирусу, заменяют капсидным белком или его фрагментом, полученным из второго парвовируса, такого как собачий парвовирус, более конкретно, парвовирус типа 2c, и фармацевтически приемлемый носитель.

Неожиданно обнаружено, что такая вакцина способна индуцировать выработку более высоких титров защитных антител против угрозы инфицирования вторым собачьим парвовирусом, при этом сохраняя хороший иммунитет против штаммов типа 2, в то время как рекомбинантый собачий парвовирус оставался аттенуированным.

Подробное описание изобретения

Вирусную ДНК, кодирующую капсидный белок второго собачьего парвовируса, можно получать из штамма, выделенного в данной области посредством стандартных умений специалистом в данной области. В разделе примеров это иллюстрируют посредством изолята типа 2c. В данной области также доступна вирусная ДНК из аттенуированного собачьего парвовируса. В примерах показана изоляция исходного вируса типа 2, входящего в состав вакцинного штамма, полученного из Intervet (Nobivac parvo).

Более конкретно, вирусную ДНК получали из полевых изолятов CPV типа 2c. Каждый препарат ДНК расщепляли посредством различных рестриктаз, также как и когда получали два перекрывающихся фрагмента из каждого препарата. Фрагменты очищали и разделяли. Выбранные фрагменты затем трансфицировали в чувствительные клетки. Это схематично показано на фигуре 1.

На основе естественной рекомбинации этих двух фрагментов получали гибридный вирус, содержащий капсидный белок изолята типа 2c, в отношении ДНК-последовательности общепринятого аттенуированного вируса типа 2. Этот вирус выделяли, очищали и перемешивали с фармацевтически приемлемым носителем и применяли в качестве вакцины.

Собак, которые получали новую вакцину, подвергали угрозе инфицирования изолятами вируса CPV типа 2c и родительским вирусом вакцины типа 2.

Неожиданным образом новая вакцина представляла адекватный титр антител к общепринятым изолятам типа 2 и повышенную защиту от CPV типа 2c.

Такую вакцину можно преимущественно применять для защиты собак от инфицирования собачьим парвовирусом, в частности типом 2c.

В более общих чертах, приведенные выше данные демонстрируют, что аттенуированный вирус можно использовать в качестве основы для рекомбинантной вакцины против инфицирования другим собачьим парвовирусом посредством замены капсидной области первого собачьего парвовируса на капсидную область или ее релевантные фрагменты второго собачьего парвовируса.

Таким образом, изобретение относится к рекомбинантному парвовирусу, содержащему ДНК-последовательность, получаемую из аттенуированного первого парвовируса, где ДНК, кодирующую капсидный белок или его фрагмент указанного первого парвовируса, заменяют капсидным белком или его фрагментом, получаемым из второго парвовируса.

Капсидные белки из первого и второго парвовирусов должны различаться по меньшей мере одной аминокислотой. Термин "капсидный белок или его фрагмент" в этом контексте означает полноразмерный капсидный белок или такую его часть, которая содержит различия в капсидных белках между первым и вторым парвовирусами.

Предпочтительно полноразмерный капсидный белок первого парвовируса заменяют полноразмерным капсидным белком второго парвовируса.

Под терминами "полноразмерный" и "по существу полноразмерный", как применяют в настоящем документе, имеют ввиду указание на то, что белковая или нуклеиново-кислотная последовательность содержит все необходимые элементы для осуществления ее функции, предпочтительно последовательность должна содержать все элементы (аминокислоты или нуклеотиды) естественной последовательности.

Рекомбинантный парвовирус по изобретению можно предпочтительно применять в вакцине для защиты животных от инфицирования парвовирусом. Выявлено, что такие вакцины защищают животных от инфицирования первым, а также вторым вирусом, в то время как рекомбинантная вакцина оставалась аттенуированной, не могла индуцировать какие-либо клинические симптомы парвовирусной инфекции.

Это изобретение также относится к способу получения рекомбинантного парвовируса по изобретению, включающему стадии:

а. Получение по меньшей мере одного первого фрагмента ДНК из аттенуированного первого штамма парвовируса, указанный первый фрагмент ДНК не кодирует капсидный белок.

b. Получение по меньшей мере одного второго фрагмента ДНК из второго штамма парвовируса, указанный второй фрагмент ДНК кодирует капсидный белок.

c. Трансфекцию клетки, пермиссивной для парвовируса, фрагментами ДНК, полученными на этапах a и b.

d. Обеспечение рекомбинации фрагментов ДНК.

e. Отбор аттенуированного рекомбинантного вируса, который кодирует вирусный капсидный белок, полученный от второго парвовируса в генетическом окружении генома первого парвовируса.

f. Культивирование клетки в условиях, которые позволяют продуцировать парвовирус в клеточной культуре.

g. Получение рекомбинантного парвовируса из клеточной культуры.

Предпочтительно парвовирус является собачьим парвовирусом, даже более предпочтительно первый парвовирус является собачьим парвовирусом типа 2, и второй собачий парвовирус является собачьим парвовирусом типа 2с; результатом этого является вакцина, которая защищает собак от инфицирования типом 2, а также типом 2c, сохраняя свои аттенуированные свойства.

Чтобы однозначно продемонстрировать, что сайт аттенуации не располагается в капсидном белке, ген капсидного белка в аттенуированном штамме замещали посредством химически синтезированного варианта, последовательность которого была получена от вирулентного полевого изолята 2c. Этим способом также производили аттенуированный вирус по изобретению.

Условные обозначения к фигурам

Фигура 1: Схематическое представление способа естественной рекомбинации (не GM) для получения изолята гибридного вируса 2/2c. Два перекрывающихся фрагмента из вакцины типа 2 и полевого вируса типа 2c трансфицировали в клетки, и вирус выделяли после гомологичной рекомбинации.

Фигура 2. Схематическое представление инфицированного плазмидного клона штамма CPV 154att, демонстрирующее сайты распознавания рестриктаз Pac I и Xmn I. Затушеванные прямоугольники иллюстрируют терминальные палиндромные последовательности.

Фигура 3: Схематическое представление выбранного продукта неполного расщепления Pac I/Xmn I, который выбирали для дальнейшей обработки

Фигура 4: Плазмида, содержащая ДНК вакцинного вируса 154att, в которой капсидный ген заменяют вирулентной капсидной последовательностью CPV2c.

Примеры

Пример 1: Получение рекомбинантного вируса

Штамм 154 att получали из коммерчески доступного Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health), и штамм Jess являлся полевым изолятом вируса типа 2c.

Вирусы выращивали на адгезивных клетках почек собак или кошек (например, A72 и CrFK) с применением среды M6B8, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Репликативную форму (RF) ДНК получали из инфицированных клеточных культур с применением модификации стандартного способа "Hirt" (McMaster et al 1981).

RF ДНК, полученную из штамма 154 att, расщепляли рестриктазой PstI, и фрагменты разделяли посредством электрофореза в агарозном геле. Окрашенную полосу из 3055 пар нуклеотидов (п.н.) (соответствующую левому концу CPV) вырезали из геля и очищали с применением гелевых экстракционных колонок Qiagen Qiaquick. RF ДНК, выделенную из клеток, инфицированных CPV Jess, расщепляли рестриктазой XmnI. Еще раз фрагменты ДНК разделяли посредством электрофореза в агарозном геле, с последующей очисткой окрашенной полоски из приблизительно 2750 п.н. (соответствующей правому концу CPV, включающей капсидную последовательность) с применением гелевых экстракционных колонок Qiagen Qiaquick.

Очищенные фрагменты 3055 п.н. и 2750 п.н. из 154att и Jess объединяли и трансфицировали в A72 или CrFK клетки в культуре. Трансфекции проводили с применением липофектамина 2000 (Invitrogen) с приблизительно 3 мкг каждого фрагмента, следуя инструкциям производителя.

После трансфекции клетки пассировали и контролировали посредством реакции гемагглютинации (HA). Вирус выявляли посредством HA на 4 пассаже. Определение последовательности ДНК гибридных вирусов проводили с применением стандартных протоколов секвенирования ДНК с применением образцов RF ДНК или ПЦР фрагмента. Вирус очищали посредством предельного разведения на адгезивных чувствительных клетках собак или кошек.

Пример 2: Рекомбинантный вирус, сконструированный из клонированной вирусной ДНК

Рекомбинантный вирус получали из клонированных фрагментов. Геном штамма вируса 154att клонировали в стандартный клонирующий вектор pBluescript (Stratagene inc.). Для сохранения палиндромных терминальных последовательностей интактную плазмиду выращивали в бактериальном носителе DL795, который является дефектным в ряде рекомбинантных систем. Клонирование парвовирусных геномов описано в литературе, и необходимые способы известны специалисту в данной области.

Полученный клон 154att (p154) расщепляли рестриктазой Pac I таким образом, чтобы не позволить завершиться расщеплению, т.е. расщепление рестриктазой было только частичным. Расщепленные фрагменты затем подвергали расщеплению рестриктазой Xmn I. Расщепленные фрагменты ДНК затем разделяли посредством электрофореза в агарозном геле, и фрагмент, указанный в диаграмме ниже, вырезали из геля и очищали с применением гелевых экстракционных колонок Qiagen Qiaquick. Сайты Xmn I и правый Pac прилегают к капсидной области в геноме парвовируса.

Затем капсидный ген 154 att замещали капсидным геном вирулентного штамма CPV. Сайт Xmn I и правый Pac I, показанные на фиг.2, располагаются за границами капсидного гена. Последовательность из приблизительно 110 п.н. между сайтом Pac I и концом капсидного гена значительно отличается у штамма 154att и вирулентных изолятов. До сих пор не было задокументированных изменений последовательности в короткой последовательности (~55 п.н.) между сайтом Xmn I и началом капсидного гена. Таким образом, для ограничения замены материала только на капсидную последовательность, вирулентную капсидную последовательность CPV химически синтезировали и сохраняли вакцинную специфическую последовательность между сайтом PacI и капсидным стоп-сигналом. Ниже представлена химически синтезированная последовательность, содержащая CPV капсидный ген. Последовательность, как показано ниже, представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 1.

Сайты Xmn I и Pac I показаны и выделены. Стоп-кодон (TAA) кодирующей области капсида, кодирующая последовательность капсида (Vp1/Vp2) выделены жирным шрифтом.

Синтезированный фрагмент освобождали от плазмиды, в которой он был представлен, с применением ферментов Xmn I и Pac I, затем его лигировали с фрагментом, представленным на фигуре 3. Компетентные E.coli (штамм DL795) трансформировали посредством смеси для лигирования с применением стандартных протоколов, и бактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды, разделяли и идентифицировали. Полученную в результате плазмиду p1542c, показанную ниже (фигура 4), получали из клонированной E.coli.

Гибридный вирус получали следующим образом. ДНК плазмиды p1542c трансфицировали в A72 или CrFK клетки в культуре. Трансфекции проводили с применением липофектамина 2000 (Invitrogen) с приблизительно 3 мкг ДНК по инструкциям производителя. После трансфекции клетки пассировали и контролировали посредством реакции гемагглютинации (HA). Вирус обнаруживали посредством HA на 4 пассаже. Определение последовательности ДНК гибридных вирусов проводили с применением стандартных протоколов секвенирования ДНК с применением образцов RF ДНК или ПЦР фрагмента. Вирус очищали посредством предельного разведения на адгезивных чувствительных клетках собак и кошек.

Пример 3: тестирование in vivo

Три группы 6-недельных SPF невакцинированных щенков, рожденных от невакцинированных матерей, таким образом, лишенных каких-либо материнских антител, направленных против CPV, заражали гибридным вирусом 2/2c и каждым родительским вирусом (вакцина типа 2 и полевой вирус типа 2c). За животными проводили клиническое наблюдение, и делали заборы крови у животных.

Группа 1 состояла из 5 собак, подкожно вакцинированных Parvo C, общепринятой вакциной Intervet, содержащей CPV типа 2. Группа 2 состояла из 5 собак, подкожно вакцинированных новой гибридной вакциной 2/2c при дозировке 107,5 TCID50 на мл.

Выявлено, что собаки в группе 1 демонстрировали более высокий титр специфичных антител против вируса типа 2, чем против гибрида. Собаки группы 2 напротив демонстрировали более высокие титры ингибирования гемагглютинации (HAI), а также титры нейтрализации сыворотки (SN) против гибридного вируса.

Таким образом, можно заключить, что штамм гибридного вируса обеспечивает улучшенную защиту от инфекции CPV типа 2c, в то же время сохраняя адекватную защиту от общепринятых штаммов вируса типа 2.

Ни одна из собак, зараженных существующей вакциной, не демонстрировала признаки заболевания, тогда как контрольные собаки, которые были заражены полевым вирусом, демонстрировали тяжелый геморрагический энтерит. Таким образом, мы с удивлением обнаружили, что главные аттенуирующие мутации в CPV лежат за пределами гена капсидного белка.

Пример 4: тестирование безопасности

Проводили исследования для изучения безопасности гибридного вируса 2/2c у щенков, которые получили антитела от матери (MDA). Все вакцинированные щенки оставались совершенно нормальными на протяжении всего исследования. Кроме того, у собак, которых вакцинировали гибридным вирусом, развилась хорошая серологическая реакция, указывающая на то, что гибридный вирус способен выйти за нормальные уровни MDA, обязательное требование для эффективной вакцины от собачьего парвовируса.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Intervet International B.V.

<120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ПАРВОВИРУС

<130> 2010 002

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2451

<212> ДНК

<213> собачий парвовирус

<400> 1

agaggcagac ctgagagcca tctttacttc tgaacaattg gaagaagatt ttcgagacga 60

cttggattaa ggtacgatgg cacctccggc aaagagagcc aggagaggta agggtgtgtt 120

agtaaagtgg ggggagagga aagatttaat aacttaacta agtatgtgtt tttttatagg 180

acttgtgcct ccaggttata aatatcttgg gcctgggaac agtcttgacc aaggagaacc 240

aactaaccct tctgacgccg ctgcaaaaga acacgacgaa gcttacgctg cttatcttcg 300

ctctggtaaa aacccatact tatatttctc gccagcagat caacgcttta tagatcaaac 360

taaggacgct aaagattggg gggggaaaat aggacattat ttttttagag ctaaaaaggc 420

aattgctcca gtattaactg atacaccaga tcatccatca acatcaagac caacaaaacc 480

aactaaaaga agtaaaccac cacctcatat tttcattaat cttgcaaaaa aaaaaaaagc 540

cggtgcagga caagtaaaaa gagacaatct tgcaccaatg agtgatggag cagttcaacc 600

agacggtggt caacctgctg tcagaaatga aagagcaaca ggatctggga acgggtctgg 660

aggcgggggt ggtggtggtt ctgggggtgt ggggatttct acgggtactt tcaataatca 720

gacggaattt aaatttttgg aaaacggatg ggtggaaatc acagcaaact caagcagact 780

tgtacattta aatatgccag aaagtgaaaa ttatagaaga gtggttgtaa ataatttgga 840

taaaactgca gttaacggaa acatggcttt agatgatact catgcacaaa ttgtaacacc 900

ttggtcattg gttgatgcaa atgcttgggg agtttggttt aatccaggag attggcaact 960

aattgttaat actatgagtg agttgcattt agttagtttt gaacaagaaa tttttaatgt 1020

tgttttaaag actgtttcag aatctgctac tcagccacca actaaagttt ataataatga 1080

tttaactgca tcattgatgg ttgcattaga tagtaataat actatgccat ttactccagc 1140

agctatgaga tctgagacat tgggttttta tccatggaaa ccaaccatac caactccatg 1200

gagatattat tttcaatggg atagaacatt aataccatct catactggaa ctagtggcac 1260

accaacaaat atataccatg gtacagatcc agatgatgtt caattttata ctattgaaaa 1320

ttctgtgcca gtacacttac taagaacagg tgatgaattt gctacaggaa catttttttt 1380

tgattgtaaa ccatgtagac taacacatac atggcaaaca aatagagcat tgggcttacc 1440

accatttcta aattctttgc ctcaagctga aggaggtact aactttggtt atataggagt 1500

tcaacaagat aaaagacgtg gtgtaactca aatgggaaat acaaactata ttactgaagc 1560

tactattatg agaccagctg aggttggtta tagtgcacca tattattctt ttgaggcgtc 1620

tacacaaggg ccatttaaaa cacctattgc agcaggacgg gggggagcgc aaacagatga 1680

aaatcaagca gcagatggtg atccaagata tgcatttggt agacaacatg gtcaaaaaac 1740

taccacaaca ggagaaacac ctgagagatt tacatatata gcacatcaag atacaggaag 1800

atatccagaa ggagattgga ttcaaaatat taactttaac cttcctgtaa cagaagataa 1860

tgtattgcta ccaacagatc caattggagg taaaacagga attaactata ctaatatatt 1920

taatacttat ggtcctttaa ctgcattaaa taatgtacca ccagtttatc caaatggtca 1980

aatttgggat aaagaatttg atactgactt aaaaccaaga cttcatgtaa atgcaccatt 2040

tgtttgtcaa aataattgtc ctggtcaatt atttgtaaaa gttgcgccta atttaacaaa 2100

tgaatatgat cctgatgcat ctgctaatat gtcaagaatt gtaacttact cagatttttg 2160

gtggaaaggt aaattagtat ttaaagctaa actaagagcc tctcatactt ggaatccaat 2220

tcaacaaatg agtattaatg tagataacca atttaactat gtaccaagta atattggagg 2280

tatgaaaatt gtatatgaaa aatctcagct agcacctaga aaattatatt aacatactta 2340

ctatgttttt atgtttatta catatcaact aacacctaga aaattatatt aatatactta 2400

ctatgttttt atgtttatta catattattt taagattaat taaggcgcgc c 2451

Claims (6)

1. Аттенуированный рекомбинантный парвовирус, пригодный для защиты собак от инфицирования парвовирусом, содержащий последовательность ДНК, получаемую из аттенуированного первого парвовируса, где ДНК, кодирующую капсидный белок указанного первого парвовируса, замещают капсидным белком, полученным от второго парвовируса, где указанный первый парвовирус является собачьим парвовирусом типа 2 и где указанный второй парвовирус является собачьим парвовирусом типа 2с.

2. Рекомбинантный парвовирус по п.1, где последовательность ДНК, получаемая от аттенуированного первого парвовируса, является, по существу, полноразмерной.

3. Рекомбинантный парвовирус по п. 1 или 2, где указанный капсидный белок от указанного второго парвовируса является, по существу, полноразмерным.

4. Вакцина для защиты собак от инфицирования парвовирусом, содержащая рекомбинантный парвовирус по какому-либо из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Способ получения рекомбинантного парвовируса по любму из пп. 1-3, включающий:
а. Получение по меньшей мере одного фрагмента ДНК из штамма аттенуированного первого парвовируса, не кодирующего капсидный белок.
b. Получение по меньшей мере одного фрагмента ДНК штамма второго парвовируса, кодирующего капсидный белок.
c. Трансфицирование клетки, пермиссивной для парвовируса, фрагментами ДНК, полученными на стадиях a и b.
d. Обеспечение рекомбинации фрагментов ДНК.
e. Отбор аттенуированного рекомбинантного вируса, который кодирует вирусный капсидный белок, полученный от второго парвовируса в генетическом окружении генома первого парвовируса.
f. Культивирование клетки в условиях, которые позволяют продуцировать парвовирус в клеточной культуре.
g. Получение рекомбинантного парвовируса из клеточной культуры.

6. Применение вакцины по п.4 для защиты собак от инфицирования собачьим парвовирусом.

Images