CN102791288B - 重组的减毒细小病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于用于保护动物免于细小病毒感染的病毒疫苗、它们的生产和用途的领域。更具体地，本发明涉及包含减毒细小病毒的疫苗，所述减毒细小病毒包括可源自另一种细小病毒的衣壳蛋白及其片段。令人惊讶的是发现这种疫苗能够诱导更高滴度的免于第二种类型的细小病毒株攻击的保护性抗体，同时保持针对第一种类型的细小病毒的良好的免疫力。重组病毒株也仍然是减毒的。

Description

重组的减毒细小病毒
技术领域
本发明属于用于保护动物免于细小病毒感染的病毒疫苗、它们的生产和用途的领域。更具体地，本发明涉及包含减毒细小病毒的疫苗，所述减毒细小病毒包括可源自新的细小病毒分离物的衣壳蛋白及其片段。
背景技术
细小病毒属于单链DNA病毒科。在一些动物如猫、狗和猪中，细小病毒可引起疾病。因为病毒需要活跃分裂的细胞以便复制，感染的组织的类型随动物的年龄而变化。在任何年龄都可以影响胃肠道和淋巴系统，导致呕吐、腹泻和免疫抑制，但是在子宫内或在小于两周龄时被感染的猫中仅看到小脑发育不全，在3周和8周龄之间被感染的小狗中看到心肌疾病。
犬细小病毒是在年幼小狗中尤其致命的疾病，约80％致死，在非常年幼的小狗中引起胃肠道损伤和脱水以及心脏综合症。它是通过与被感染的狗的粪便接触而传播的。症状包括嗜睡、严重腹泻、发烧、呕吐、食欲不振和脱水。猪细小病毒在猪中引起被称为SMEDI的生殖疾病，其代表为死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕。猫泛白细胞减少症在小猫中常见，并引起发烧、低白细胞数、腹泻和死亡。小于两周的猫胎儿和小猫的感染引起小脑发育不全。水貂肠炎病毒在对猫泛白细胞减少症的作用中是相似的，除了它不会引起小脑发育不全。不同的细小病毒在水貂和其它鼬科动物中引起阿留申病(Aleutian Disease)，其特征在于淋巴结病、脾肿大、肾小球性肾炎、贫血和死亡。细小病毒的最准确的诊断方法是通过ELISA。可以对猫、狗和猪进行针对细小病毒的免疫。
在DNA水平上，已知犬、猫和猪细小病毒具有高度同源的基因组。犬细小病毒(CPV2)是一种在狗中引起急性、且有时是致命的肠炎的病毒(Kelly, Aust. Vet. J. 54；593, 1978；Appel等, Vet. Rec. 105；156-159, 1979)。1977年左右首先出现的该病毒可能通过单个衣壳蛋白中少数突变而从在猫中非常密切相关的病毒(即猫泛白细胞减少症病毒(FPLV))产生的；物种跳跃可能涉及在其它食肉动物(如水貂或浣熊)的中间传递(Truyen等, Virology 215, 186-189, 1996)。
早在1979年，出现了CPV2的第一种变异体，被称为CPV2a，随后很快在1984年出现了CPV2b(Parrish等, Science 230, 1046-1048, 1985,和J. Virol. 65；6544-6552, 1991)。
最初的2型病毒现在已经从野外(field)中消失，被2a和2b变异体所替代；尽管这两种类型的相对比例在国与国间有变化(前面的Truyen等；Chinchkar等, Arch. Virol. 151, 1881-1887, 2006；Pereira等, Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007)。在衣壳蛋白(VP2)中的氨基酸变化，其特征为从2至2a以及至2b的转变，是非常有限的。在87(Met至Leu)、300 (Gly至Ala)、305 (Tyr至Asp)和555 (Val至Ile)位的替换发生在2至2a的进化中，在426(Asn至Asp)和555(Ile至Val)的替换发生在从2a出现2b中(前面的Parrish等；Truyen等, J. Virol. 69, 4702-4710, 1995)。最近，报道了在555位缺乏Val至Ile替换的2a株(Wang等, Virus Genes 31, 171-174, 2005；Martella等, Virus Genes 33, 11-13, 2006)。似乎单一的氨基酸改变可以区分CPV2a和CPV2b VP2序列。
新近，在意大利出现了病毒株，其中426位的氨基酸(2a中为Asn，2b中为Asp)已经变为谷氨酸(Glu)残基(Buonavoglia等, J. Gen. Virol. 82, 3021-3025, 2001；Martella等, J. Clin. Microbiol. 42, 1333-1336, 2004)。这些被称为CPV2c病毒的Glu 426变异体是在意大利和其他欧洲国家传播的（circulating）并与其它CPV类型共存(Decaro等, J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006)，并且也已经在地理上多样的国家如越南和苏格兰分离得到(Nakamura等, Arch Virol.149, 2261-2269, 2004, Spibey等, Vet.Microbiol 128, 48-55, 2008)，这些事实表明它们在至少一定比例的狗群体中具有优势。
犬细小病毒的相对快速进化已经导致猫宿主范围的丢失以及然后重新获得(前面的Truyen等, 1996)，这种重新获得的在猫中复制的能力可以很好地解释2a、2b和2c变异体对最初的2型病毒的替代。在二十世纪七十年代末期和二十世纪八十年代早期，由于刺激交叉保护的共享抗原，活的和灭活的FPL疫苗用于保护狗免于CPV疾病，然而它们提供的保护水平较差，免疫持续时间较短。这些疫苗被活的减毒CPV疫苗所替代，其提供了优异的保护和更长的免疫持续时间。目前活的减毒疫苗来自CPV2b分离物或最初的2型病毒。由于2型病毒已经在该野外中被2a、2b以及现在的2c病毒完全替代，已经考虑到对于减毒的2型疫苗提供的保护水平(Pratelli等, Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001；Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999)。
然而，基于现有的单克隆抗体的研究，与以前的变异体相比，每种新的抗原变异体已经失去至少一个中和表位(Strassheim等, Virology 198, 175-184, 1994；前面的Pereira等)。以前已经表明，即使用针对各种抗原类型产生的血清在体外进行的交叉中和研究的确显示出显著差异(前面的Pratelli等)，活的减毒的CPV2疫苗能够保护狗免于2a和2b野外攻击(Greenwood等, Vet. Record. 136, 63-67, 1995)。
最近显示，活的减毒的2型疫苗(Nobivac-Intervet)能够保护狗免于用最近的CPV变异体CPV2c的攻击(Spibey等, Vet.Microbiol 128, 48-55, 2008)。
尽管如此，在该领域中存在着提高动物(尤其是猫、狗和猪)免于新型细小病毒感染的免疫力的疫苗的需求。然而，未获得这种疫苗，尤其是未获得对于犬细小病毒2c型特异性的疫苗。
发明内容
本发明提供了对上述问题的解决方案，其在于提供了一种包含重组细小病毒和药学上可接受的载体的疫苗，所述重组细小病毒包含从减毒的第一细小病毒可获得的DNA序列，其中编码所述第一细小病毒的衣壳蛋白或其片段的DNA被可源自第二细小病毒(如犬细小病毒，更具体是2c型细小病毒)的衣壳蛋白或其片段所替代。
令人惊讶的是，发明人发现，这种疫苗能够诱导更高滴度的免于第二犬细小病毒攻击的保护性抗体，同时保持了针对2型株的良好的免疫力，而重组的犬细小病毒仍然是减毒的。
发明详述
可以用本领域技术人员的普通技术从野外分离的病毒株获得编码第二犬细小病毒的衣壳蛋白的病毒DNA。在实施例部分，通过使用2c型分离物说明了这一点。来自减毒的犬细小病毒的病毒DNA也是本领域可以获得的，实施例显示了从Intervet (Nobivac parvo)获得的疫苗株中包含的最初的2型病毒的分离。
更具体地，病毒DNA从CPV 2c型野外分离物获得。用不同的限制性酶消化每种DNA制备物从而使从每种制备物产生两种重叠的片段。纯化并分离片段。然后将选择的片段转染进易感细胞。这如图1所图示。
两种片段天然重组后，获得了在常规的减毒的2型病毒的背景下包含2c型分离物的衣壳蛋白的杂合病毒。分离并纯化这种病毒，并与药学上可接受的载体混合并作为疫苗使用。
用CPV2c型病毒的野外分离物和用2型疫苗的亲本病毒攻击接受新疫苗的狗。
令人惊讶的是，新的疫苗提供了足够的针对常规的2型分离物的抗体滴度，并提供了针对2c型CPV的改进的保护。
可以有利地将这种疫苗用于保护狗免于犬细小病毒、尤其是2c型的感染。
更通常地，上述发现显示，通过用第二犬细小病毒的衣壳区域或其相关片段替换第一犬细小病毒的衣壳区域，减毒的病毒可作为用于免于另一犬细小病毒感染的重组疫苗的基础。
因此，本发明涉及重组细小病毒，其包括从减毒的第一细小病毒获得的DNA序列，其中编码所述第一细小病毒的衣壳蛋白或其片段的DNA被源自第二细小病毒的衣壳蛋白或其片段所替代。
来自第一和第二细小病毒的衣壳蛋白需要至少一个氨基酸不同。在这种背景下的术语“衣壳蛋白或其片段”是指包含第一和第二细小病毒之间的衣壳蛋白的差异的全长衣壳蛋白或其这种部分。
优选地，用第二细小病毒的全长衣壳蛋白替代第一细小病毒的全长衣壳蛋白。
本发明使用的术语“全长”和“基本上全长”意在表明，蛋白或核酸序列包含行使其功能所必要的所有的元件，优选地，该序列应当包含天然序列的所有元件(氨基酸或核苷酸)。
本发明的重组细小病毒可以有利地用于保护动物免于细小病毒感染的疫苗中。发现这种疫苗保护动物免于第一以及第二病毒的感染，而重组疫苗保持减毒从而使它不能诱导任何细小病毒感染的临床症状。
本发明还涉及用于获得本发明的重组细小病毒的方法，其包括以下步骤：
a. 从减毒的第一细小病毒株获得至少一种第一DNA片段，所述第一DNA片段不编码衣壳蛋白，
b. 从第二细小病毒株获得至少一种第二DNA片段，所述第二DNA片段编码衣壳蛋白，
c. 用步骤a和b中获得的DNA片段转染对于细小病毒容许(permissive)的细胞，
d. 允许DNA片段重组，
e. 在第一细小病毒的基因组的遗传背景中筛选编码源自第二细小病毒的病毒衣壳蛋白的减毒的重组病毒，
f. 在允许在细胞培养物中生产细小病毒的条件下培养细胞，
g. 从细胞培养物获得重组细小病毒。
优选地，细小病毒是犬细小病毒，甚至更优选地，第一细小病毒是2型犬细小病毒，第二犬细小病毒是2c型犬细小病毒；这导致产生保护狗免于2型以及2c型感染、同时保持其减毒特性的疫苗。
为了明确地显示减毒位点不在衣壳蛋白中，用化学合成的版本替代减毒株中的衣壳蛋白基因，所述化学合成的版本的序列源自强毒的2c野外分离物。这种方法也产生了根据本发明的减毒病毒。
附图说明
图1：获得杂合的2/2c病毒分离物的天然重组(非GM)方法的示意图。将源自2型疫苗和2c型野外病毒的两种重叠片段转染进细胞，并在同源重组后分离病毒。
图2：显示限制性酶位点Pac I和Xmn I的CPV株154att的感染性质粒克隆的示意图。阴影方框表示末端回文序列。
图3：显示选择用于进一步操作的部分Pac I/Xmn I消化的选择的产物的示意图。
图4：包含其中衣壳基因被强毒的CPV2c衣壳序列替代的154att疫苗病毒DNA的质粒。
实施例
实施例1：重组病毒的产生
从商售的Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health)获得154 att株，Jess株是2c型病毒的野外分离物。
使用包含5％胎牛血清的M6B8培养基使病毒生长在贴壁的犬或猫肾细胞(如A72 & CrFK)上。用标准“Hirt”法的修改方法从被感染的细胞培养物制备复制形式(RF)DNA(McMaster等 1981)。
用限制性酶PstI消化从154 att株制备的RF DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段。从凝胶切出3055碱基对(bp)条带(对应于CPV的左手末端)并用Qiagen Qiaquick凝胶提取柱纯化。用限制性酶XmnI消化从CPV Jess感染的细胞分离的RF DNA。再次通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，随后用Qiagen Qiaquick凝胶提取柱纯化约2750 bp条带(对应于包括衣壳序列的CPV的右手末端)。
将来自154att和Jess的纯化的3055 bp和2750bp片段合并并转染进培养中的A72或CrFK细胞。根据厂商说明书，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将约3μg的每种片段进行转染。
转染后，传代细胞并用血凝(HA)分析法监测。在第4代时用HA检测病毒。使用标准DNA测序方法，用RF DNA或PCR片段模板进行杂合病毒的DNA序列测定。通过有限稀释法纯化在贴壁的易感犬或猫细胞上的病毒。
实施例2：从克隆的病毒DNA构建的重组病毒
从克隆的片段产生重组病毒。将病毒株154att的基因组克隆进标准的克隆载体pBluescript(Stratagene inc.)。为了保持回文末端序列完整，将质粒在许多重组系统缺陷的细菌宿主DL795中繁殖。细小病毒基因组的克隆已经在文献中描述，所需的技术对于本领域技术人员而言是已知的。
用限制性酶Pac I消化获得的154att的克隆(p154)而不允许消化完整进行，即限制性酶消化仅仅是部分的。然后使消化的片段经受限制性酶Xmn I的消化。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的DNA片段，从凝胶切出下图中所示的片段，并用Qiagen Qiaquick凝胶提取柱纯化。Xmn I和右手的Pac位点位于细小病毒基因组中的衣壳区域的两侧。
如下用CPV的强毒株的衣壳基因替代154 att的衣壳基因。图2中所示的Xmn I位点和右手的Pac I位于衣壳基因的边界之外。Pac I位点和衣壳基因的末端之间约110bp序列在154att株和强毒的分离物之间差异显著。在Xmn I位点和衣壳基因的起始处之间的短序列(～55 bp)中还没有记录到序列改变。因此，为了将物质的交换仅仅限制在衣壳序列；化学合成了强毒的CPV衣壳序列，保留了PacI位点和衣壳终止信号之间的疫苗特异性序列。下面，显示了包含CPV衣壳基因的化学合成的序列。下面所示的序列在本文作为SEQ ID NO：1提供。
标注并用下划线表示了Xmn I和Pac I位点。衣壳编码区的终止密码子(TAA)用下划线表示。衣壳(Vp1/Vp2)编码序列用粗体表示。
用酶Xmn I和Pac I将合成的片段从提供其的质粒中切出释放，然后将其连接至图3所示的片段。用标准方法以连接混合物转化感受态E.coli(菌株DL795)，分离并鉴定包含重组质粒的细菌。然后从克隆的E.coli制备下面所示的获得的质粒p1542c(图4)。
如下制备杂合病毒。将质粒p1542c DNA转染进培养中的A72或CrFK细胞。根据厂商说明书，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)将约3微克DNA进行转染。转染后，传代细胞并用血凝(HA)分析法监测。在第4代时用HA检测病毒。使用标准DNA测序方法，用RF DNA或PCR片段模板进行杂合病毒的DNA序列测定。通过有限稀释法纯化在贴壁的易感犬或猫细胞上的病毒。
实施例3:体内测试
用2/2c杂合病毒以及每种亲本病毒(2型疫苗和2c型野外病毒)接种三组6周大的由未免疫的母亲生育的SPF级未免疫的小狗，其因此缺乏任何针对CPV的母体来源的抗体。临床监测动物并采集血样。
第1组包含5只用Parvo C(包含2型CPV的常规Intervet疫苗)皮下接种的狗。第2组包含5只用107.5 TCID50/ml的新型杂合的2/2c疫苗皮下接种的狗。
发现与针对杂合病毒相比，第1组的狗表现出更高滴度的针对2型病毒的特异性抗体。相反，第2组的狗表现出更高滴度的针对杂合病毒的血凝抑制(HAI)以及血清中和(SN)滴度。
因此，可以得出结论，杂合病毒株提供了针对CPV2c型感染的改进的保护，同时保持了对于常规的2型病毒株的足够的保护。
以现有的疫苗接种的狗都没有显示出疾病的迹象，而用野外病毒接种的对照狗表现出严重的出血性肠炎。因此，我们惊讶地发现，CPV中的主要减毒突变位于衣壳蛋白基因之外。
实施例4: 安全测试
进行研究以检查在具有母体来源抗体(MDA)的小狗中2/2c杂合病毒的安全性。在整个研究中，所有免疫的小狗仍然完全正常。而且，已经用杂合病毒免疫的狗表现出良好的血清学反应，表明杂合病毒能够突破正常水平的MDA，这是有效的犬细小病毒疫苗的基本要求。
                                             序列表
 
<110>  Intervet International B.V.
 
<120>  细小病毒
<130>  2010 002
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  2451
<212>  DNA
<213>  犬细小病毒
 
<400>  1
agaggcagac ctgagagcca tctttacttc tgaacaattg gaagaagatt ttcgagacga       60
cttggattaa ggtacgatgg cacctccggc aaagagagcc aggagaggta agggtgtgtt      120
agtaaagtgg ggggagagga aagatttaat aacttaacta agtatgtgtt tttttatagg      180
acttgtgcct ccaggttata aatatcttgg gcctgggaac agtcttgacc aaggagaacc      240
aactaaccct tctgacgccg ctgcaaaaga acacgacgaa gcttacgctg cttatcttcg      300
ctctggtaaa aacccatact tatatttctc gccagcagat caacgcttta tagatcaaac      360
taaggacgct aaagattggg gggggaaaat aggacattat ttttttagag ctaaaaaggc      420
aattgctcca gtattaactg atacaccaga tcatccatca acatcaagac caacaaaacc      480
aactaaaaga agtaaaccac cacctcatat tttcattaat cttgcaaaaa aaaaaaaagc      540
cggtgcagga caagtaaaaa gagacaatct tgcaccaatg agtgatggag cagttcaacc      600
agacggtggt caacctgctg tcagaaatga aagagcaaca ggatctggga acgggtctgg      660
aggcgggggt ggtggtggtt ctgggggtgt ggggatttct acgggtactt tcaataatca      720
gacggaattt aaatttttgg aaaacggatg ggtggaaatc acagcaaact caagcagact      780
tgtacattta aatatgccag aaagtgaaaa ttatagaaga gtggttgtaa ataatttgga      840
taaaactgca gttaacggaa acatggcttt agatgatact catgcacaaa ttgtaacacc      900
ttggtcattg gttgatgcaa atgcttgggg agtttggttt aatccaggag attggcaact      960
aattgttaat actatgagtg agttgcattt agttagtttt gaacaagaaa tttttaatgt     1020
tgttttaaag actgtttcag aatctgctac tcagccacca actaaagttt ataataatga     1080
tttaactgca tcattgatgg ttgcattaga tagtaataat actatgccat ttactccagc     1140
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gagatattat tttcaatggg atagaacatt aataccatct catactggaa ctagtggcac     1260
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tcaacaagat aaaagacgtg gtgtaactca aatgggaaat acaaactata ttactgaagc     1560
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tgtttgtcaa aataattgtc ctggtcaatt atttgtaaaa gttgcgccta atttaacaaa     2100
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tcaacaaatg agtattaatg tagataacca atttaactat gtaccaagta atattggagg     2280
tatgaaaatt gtatatgaaa aatctcagct agcacctaga aaattatatt aacatactta     2340
ctatgttttt atgtttatta catatcaact aacacctaga aaattatatt aatatactta     2400
ctatgttttt atgtttatta catattattt taagattaat taaggcgcgc c              2451

Claims (4)

1.一种减毒的重组细小病毒，其包含来自减毒的2型犬细小病毒的DNA序列，其中编码衣壳蛋白的DNA被来自2c型犬细小病毒的编码衣壳蛋白的DNA所替代。
2.用于保护动物免于细小病毒感染的疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1所述的重组细小病毒和药学上可接受的载体。
3.用于获得根据权利要求1所述的重组细小病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 从不编码衣壳蛋白的减毒的2型犬细小病毒株获得至少一种DNA片段，
b. 从编码衣壳蛋白的2c型犬细小病毒株获得至少一种DNA片段，
c. 用步骤a和b中获得的DNA片段转染对于细小病毒容许的细胞，
d. 允许DNA片段重组，
e. 在2型犬细小病毒的基因组的遗传背景中筛选编码源自2c型犬细小病毒的病毒衣壳蛋白的减毒的重组病毒，
f. 在允许在细胞培养物中生产细小病毒的条件下培养细胞，
g. 从细胞培养物获得重组细小病毒。
4.根据权利要求1所述的重组细小病毒在制备用于保护动物免于犬细小病毒感染的疫苗中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012021650A2 (pt) * 2010-03-05 2017-02-21 Intervet Int Bv "parvovírus recombinante atenuado, vacina para a proteção de animais contra infecção com parvovírus, método para a obtenção de um parvovírus recombinante, e, uso de uma vacina."
US9314519B2 (en) 2012-08-21 2016-04-19 Intervet Inc. Liquid stable virus vaccines
US20140234354A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine parvovirus 5b, methods of use and vaccine
AR097762A1 (es) 2013-09-27 2016-04-13 Intervet Int Bv Formulaciones secas de vacunas que son estables a temperatura ambiente
CN105263953B (zh) * 2014-01-15 2020-01-07 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 猪细小病毒5a、使用方法及疫苗
US10398773B2 (en) 2014-04-17 2019-09-03 Intervet Inc. Porcine parvovirus
PT3534939T (pt) 2016-11-03 2023-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vacina contra parvovírus porcino e vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina e métodos da sua produção
UA127859C2 (uk) 2016-11-03 2024-01-31 Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх Вакцина проти свинячого парвовірусу
CA3196668A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Intervet International B.V. Canine parvovirus
CN114957406B (zh) * 2022-05-26 2024-02-02 吉林大学 一种犬细小病毒的三价抗原和三价病毒样颗粒以及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8502399D0 (en) * 1985-01-31 1985-03-06 Akzo Nv Canine parvovirus vaccines
US6491907B1 (en) 1998-11-10 2002-12-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombinant parvovirus vectors and method of making
WO2007012944A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Pfizer Products Inc. Methods of vaccine administration, new feline caliciviruses, and treatments for immunizing animals against feline paraovirus and feline herpes virus
CN101815528A (zh) * 2007-06-14 2010-08-25 俄克拉荷马州大学评议会 包含犬细小病毒遗传性变体的疫苗
BR112012021650A2 (pt) * 2010-03-05 2017-02-21 Intervet Int Bv "parvovírus recombinante atenuado, vacina para a proteção de animais contra infecção com parvovírus, método para a obtenção de um parvovírus recombinante, e, uso de uma vacina."

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization and recombination mapping of an antigenic and host range mutation of canine parvovirus;Parrish CR等;《Virology》;19860115;第148卷(第1期);摘要、图5 *
Recombination between vaccine and field strains of canine parvovirus is revealed by isolation of virus in canine and feline cell cultures;Mochizuki M等;《The journal of veterinary medical science》;20081231;第70卷(第12期);1305-1314 *

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