JP6298499B2 - 生弱毒化パルボウイルス - Google Patents

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Description

本発明は、生弱毒化パルボウイルス、その用途、そのような生弱毒化パルボウイルスを含むワクチン、およびそれらの製造方法に関する。
パルボウイルスは一本鎖ＤＮＡウイルスの科に属する。パルボウイルスはネコ、イヌおよびブタのような種々の動物において疾患を引き起こしうる。該ウイルスは、複製するためには、活発に分裂している細胞を必要とするため、感染する組織型は動物の年齢によって様々である。胃腸管およびリンパ系はいずれの年齢でも冒される可能性があり、それにより嘔吐、下痢および免疫抑制が生じうるが、小脳発育不全は子宮内または２週齢未満で感染したネコで見られるに過ぎず、心筋の疾患は３〜８週齢で感染した子イヌで見られる。
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、若いイヌでは特に致命的な疾患であり、約８０％の致死性を示し、非常に若い子イヌにおいては胃腸管損傷および脱水ならびに心臓症候群を引き起こす。それは、感染したイヌの糞との接触により広がる。症状は嗜眠、重度の下痢、発熱、嘔吐、食欲不振および脱水を含む。ブタパルボウイルスは、死産、ミイラ化、胚死および不妊を表すＳＭＥＤＩとしての公知の、ブタにおける生殖疾患を引き起こす。ネコジステンパーとして一般に公知であるネコ汎白血球減少症は、イヌパルボウイルスの近縁ウイルスであるネコパルボウイルス（ＦＰＶ）により引き起こされる、ネコを冒すウイルス感染症である。ネコ汎白血球減少症は子ネコで一般的であり、発熱、低白血球数、下痢および死を引き起こす。ネコ胎児および２週齢未満の子ネコへの感染は小脳発育不全を引き起こす。ミンク腸炎ウイルスは、それが小脳発育不全を引き起こさないこと以外はネコ汎白血球減少症と実質的に類似している。別のパルボウイルスは、リンパ節障害、脾腫、糸球体腎炎、貧血および死亡により特徴づけられる、ミンクおよび他のイタチ科動物におけるアリューシャン病を引き起こす。パルボウイルスの最も正確な診断はＥＬＩＳＡによるものである。一般に、イヌ、ネコおよびブタはパルボウイルスに対してワクチン接種される。
ＤＮＡレベルでは、イヌ、ネコおよびブタパルボウイルスは高度に相同なゲノムを有することが公知である。イヌパルボウイルスＣＰＶ２は、イヌにおける急性で時には致死性の腸炎を引き起こすウイルスである（Ｋｅｌｌｙ，Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．５４；５９３，１９７８；Ａｐｐｅｌら，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１０５；１５６−１５９，１９７９）。該ウイルスは１９７７年頃に最初に出現し、おそらく、ネコにおける非常に密接に関連したウイルスであるネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）から、単一カプシドタンパク質における少数の突然変異［ミンクまたはアライグマのような他の肉食動物における中間的移行を含んでいた可能性のある種間跳躍（ｓｐｅｃｉｅｓ ｊｕｍｐ）］により生じたのであろう（Ｔｒｕｙｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１５，１８６−１８９，１９９６）。
早くも１９７９年に、ＣＰＶ２ａと称される、ＣＰＶ２の最初の変異体が出現し、その後まもなく、１９８４年にＣＰＶ２ｂが出現した（Ｐａｒｒｉｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１０４６−１０４８，１９８５およびＪ．Ｖｉｒｏｌ．６５；６５４４−６５５２，１９９１）。
その元の２型ウイルスは現在では野外から消え、該２ａおよび２ｂ型がそれに取って代わっており、これらの２つの型の相対比率は国によって様々である（Ｔｒｕｙｅｎら，前掲；Ｃｈｉｎｃｈｋａｒら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５１，１８８１−１８８７，２００６；Ｐｅｒｅｉｒａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３，３９９−４０９，２００７）。２から２ａおよび２ｂへの変化を特徴づける、カプシドタンパク質（ＶＰ２）におけるアミノ酸変化は非常に限定的である。８７位（ＭｅｔからＬｅｕへ）、３００位（ＡｌａからＧｌｙへ）、３０５位（ＡｓｐからＴｙｒへ）および５５５位（ＶａｌからＩｌｅへ）の置換は２から２ａへの進化において生じ、４２６位（ＡｓｎからＡｓｐへ）および５５５位（ＩｌｅからＶａｌへ）の置換は２ａから２ｂへの出現において生じた（Ｐａｒｒｉｓｈら，前掲；Ｔｒｕｙｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，４７０２−４７１０，１９９５）。最近、５５５位のＶａｌからＩｌｅへの置換を欠く２ａ株が報告された（Ｗａｎｇら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３１，１７１−１７４，２００５；Ｍａｒｔｅｌｌａら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３３，１１−１３，２００６）。単一アミノ酸変化がＣＰＶ２ａとＣＰＶ２ｂとのＶＰ２配列を区別しうるらしい。
より最近になって、４２６位のアミノ酸（２ａではＡｓｎ、そして２ｂではＡｓｐ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基になった株がイタリアにおいて出現した（Ｂｕｏｎａｖｏｇｌｉａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，３０２１−３０２５，２００１；Ｍａｒｔｅｌｌａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，１３３３−１３３６，２００４）。ＣＰＶ２ｃウイルスと称されるこれらのＧｌｕ ４２６変異体がイタリアおよび他の欧州諸国において広がりつつあり、他のＣＰＶ型と共存しており（Ｄｅｃａｒｏら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｖｅｔ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ５３，４６８−４７２，２００６）、ベトナムおよびスコットランドのような地理的に様々な国々でも分離されている（Ｎａｋａｍｕｒａら，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１４９，２２６１−２２６９，２００４，Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８−５５，２００８）ことは、それらがイヌ集団の少なくとも一部における利点を有することを示唆している。
イヌパルボウイルスの相対的に急速な進化はネコ宿主域の喪失およびそれに続く再獲得をもたらしており（Ｔｒｕｙｅｎら，１９９６ 前掲）、この再獲得された、ネコにおいて複製する能力は、元の２型ウイルスが２ａ、２ｂおよび２ｃ変異体によって取って代えられたこと説明しうる。１９７０年代後半および１９８０年代初期に、生および不活化ＦＰＬワクチンの両方が、交差防御を刺激する共有抗原により、ＣＰＶ疾患からイヌを防御するために使用されたが、それらがもたらした防御レベルは低く、免疫持続期間は短かった。これらのワクチンは生弱毒化ＣＰＶワクチンによって取って代えられており、これは優れた防御およびより長い免疫持続期間をもたらした。現在、該生弱毒化ワクチンはＣＰＶ２ｂ分離体または元の２型ウイルスから誘導されている。該２型ウイルスは野外では２ａ、２ｂおよび現在は２ｃウイルスによって完全に取って代えられているため、弱毒化２型ワクチンによりもたらされる防御レベルに関する懸念が存在する（Ｐｒａｔｅｌｌｉら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，６１２−６１５，２００１；Ｔｒｕｙｅｎ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，４７−５０，１９９９）。
しかし、利用可能なモノクローナル抗体での研究に基づけば、それぞれの新たな抗原変異体は、以前の変異体と比較して少なくとも１つの中和エピトープを喪失している（Ｓｔｒａｓｓｈｅｉｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８，１７５−１８４，１９９４；Ｐｅｒｅｉｒａら，前掲）。種々の抗原型に対して産生された血清を使用してインビトロで行われた交差中和研究が顕著な相違を示している場合であっても（Ｐｒａｔｅｌｌｉら，前掲）、生弱毒化ＣＰＶ２ワクチンは２ａおよび２ｂ野外チャレンジに対してイヌを防御しうることがこれまでに示されている（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら，Ｖｅｔ．Ｒｅｃｏｒｄ．１３６，６３−６７，１９９５）。
最近、生弱毒化２型ワクチン（Ｎｏｂｉｖａｃ−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）が、最も最近のＣＰＶ変異体であるＣＰＶ２ｃでのチャレンジからイヌを防御しうることが示された（Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８−５５，２００８）。
それでもなお、パルボウイルスの感染に対する動物、特にネコ、イヌおよびブタにおける十分なレベルの免疫の誘導と、高度に弱毒化された挙動とを併せ持つワクチンが、当分野において必要とされている。
本発明の目的は、弱毒化されているが尚も免疫原性である新規生パルボウイルスを提供することである。そのようなウイルスは安全なワクチンのための基礎を提供する。
この点において、本発明の１つの実施形態は、カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位にイソロイシン以外のアミノ酸を、および／またはカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位にグルタミン以外のアミノ酸を含む生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）に関する（ただし、該ＰＶは、イヌパルボウイルスワクチンＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ中に存在するＣＰＶではない）。このＣＰＶ（イヌパルボウイルスワクチンＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ ＣのＣＰＶ）に含まれる配列を配列番号１に示す。
驚くべきことに、これらの２つの部位、すなわち、カプシド遺伝子のアミノ酸２１９位および３８６位は該ウイルスの弱毒化において重要な役割を果たしていることが見出された。現在までは、主として、カプシド領域以外のアミノ酸が該ウイルスのビルレンス／弱毒化に関与していると考えられていた。
カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位のイソロイシンおよびカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位の位置は、血清型には無関係に、イヌおよびネコの両方のパルボウイルスにおいて同一である。これは、本発明が、少なくとも、ネコパルボウイルスおよびイヌパルボウイルスに普遍的に適用されうることを意味する。本発明はまた、例えば、カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位にイソロイシンを、および／またはカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位にグルタミンを有するブタパルボウイルスにも適用されうる。
特に、配列番号１に示す配列を含むイヌパルボウイルスワクチンＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）中に存在するＣＰＶは、本発明における特許請求の範囲から除かれている。
したがって、本発明の第１の実施形態は、カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位においてイソロイシン以外のアミノ酸を、および／またはカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位においてグルタミン以外のアミノ酸をコードするカプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）に関する。ただし、ＰＶは、配列番号１に示されている配列を含まない。
アミノ酸２１９位のイソロイシンおよびアミノ酸３８６位のグルタミンの位置を示すために、ほとんどのＣＰＶおよびＦＰＶ株において見られる配列環境の一例として、それらの２つのアミノ酸（太字）を以下に示す。
ｙｆｑｗｄｒｔｌｉｐｓｈｔｇｔｓｇ（イソロイシン２１９＝太字）
ｙａｆｇｒｑｈｇｑｋｔｔｔｔｇｅｔ（グルタミン３８６＝太字）
本発明における一方または両方のアミノ酸の置換のために出発物質として使用される株によっては、２１９位または３８６位におけるアミノ酸の単一置換は、例えば非常に若い動物において該ウイルスを安全にするのに十分でない可能性がある。更なる弱毒化が要求される場合、アミノ酸２１９位および３８６位の両方の置換が好ましい。
したがって、この実施形態の好ましい形態は、カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位においてイソロイシン以外のアミノ酸を、およびカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位においてグルタミン以外のアミノ酸をコードするカプシド遺伝子を含む、本発明の生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）に関する。
この実施形態のより好ましい形態は、カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位においてバリンを、および／またはカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位においてリシンをコードするカプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）に関する。
この実施形態のより一層好ましい形態は、カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位においてバリンを、およびカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位においてリシンコードするカプシド遺伝子を含む生弱毒化パルボウイルス（ＰＶ）に関する。
更なる弱毒化が好ましい場合には、本発明におけるアミノ酸置換の導入のための出発物質として別の弱毒化突然変異を既に有するパルボウイルスを使用することが好都合でありうるであろう。好ましくは、そのような弱毒化突然変異はカプシド領域外に位置する。これは、本発明のウイルスの非カプシド領域の一部のＤＮＡ断片を、その領域内に弱毒化を含有するパルボウイルス株の相同非カプシド領域で置換することを可能にするであろう。該非カプシド領域の一部において弱毒化を含有するパルボウイルスとしては、例えば、商業的に入手可能なイヌパルボウイルスワクチンＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）が挙げられる。そのようなアプローチの利点は、そのようなウイルスがより一層高い弱毒化レベルを有することである。したがって、この実施形態のより一層好ましい形態は、パルボウイルスが組換えパルボウイルスであり、ここで、該パルボウイルスの非カプシド領域の一部のＤＮＡ断片が、第２パルボウイルスに由来する非カプシド領域の一部の相同ＤＮＡ断片により置換されており、ここで、該第２パルボウイルスの相同ＤＮＡ断片が弱毒化突然変異を含有する、本発明の生弱毒化パルボウイルスに関する。
第２パルボウイルスからの相同ＤＮＡ断片は、本発明のパルボウイルスのＤＮＡ断片と同じ機能を有するＤＮＡ断片であるが、それが、該ウイルスの弱毒化挙動を招く突然変異を含有する点で、そのＤＮＡ断片とは異なる。単なる一例としてであるが、ＤＮＡ断片が、２つの特異的制限部位の間のＤＮＡ断片内に弱毒化突然変異を含み、これらの２つの制限部位が、その突然変異を有さないウイルスにおける同じ位置に存在する場合、該突然変異を含有する制限断片は、その突然変異を有さないウイルスからの同じ断片と相同とみなされるであろう。
この実施形態の非常に好ましい形態は、該第２パルボウイルスの相同ＤＮＡ断片が２０６１〜２０７０位の領域の非構造領域内に弱毒化突然変異を含有する、本発明の生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明の生弱毒化パルボウイルスは、いずれかの更なる弱毒化（例えば、弱毒化非カプシド領域）の追加的存在には無関係に、該カプシドタンパク質内の本発明のイソロイシン／Ｘ１および／またはグルタミン／Ｘ２転移が施されうる全てのパルボウイルスから、したがって少なくとも、ＣＰＶおよびＦＰＶの現在配列決定されている全メンバーから得られうる、と理解されるであろう（Ｘ１およびＸ２はそれぞれイソロイシンおよびグルタミン以外のアミノ酸である）。
また、ＦＰＶ−カプシドおよびＣＰＶ−非カプシドバックボーンを含むハイブリッドウイルス、ならびにＣＰＶ−カプシドおよびＦＰＶ−非カプシドバックボーンを含むハイブリッドウイルスは本発明に含まれる、と理解されるであろう。
パルボウイルス感染に対する動物の防御（より詳しくはペット）のためにワクチンを開発しようとする場合、そのようなワクチンにおいて使用するための好ましいパルボウイルスはイヌパルボウイルスまたはネコパルボウイルスであろう。したがって、この実施形態のより一層好ましい形態は、該パルボウイルスがイヌパルボウイルスまたはネコパルボウイルスである、本発明の生弱毒化パルボウイルスに関する。
特に、ワクチンが、特にＣＰＶおよびＦＰＶに対するそれぞれイヌおよびネコの防御を目的とする場合には、本発明のウイルスのカプシド遺伝子は、好ましくは、ＣＰＶ血清型２ａ、２ｂもしくは２ｃのカプシドタンパク質またはネコパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするであろう。前記のとおり、該パルボウイルスの非カプシド部分はＣＰＶまたはＦＰＶ由来でありうる。したがって、この実施形態のより一層好ましい形態は、該パルボウイルスがＣＰＶ血清型２ａ、２ｂもしくは２ｃのカプシドタンパク質またはネコパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードする、本発明の生弱毒化ＣＰＶに関する。
本発明のもう１つの実施形態は、パルボウイルスの感染に対する動物の防御のためのワクチンに関する。そのようなワクチンは本発明の生弱毒化パルボウイルスと医薬上許容される担体とを含む。
ワクチンにおいて使用するための本発明のパルボウイルスの適量は、多くの場合、弱毒化のレベルおよび該ウイルスの複製特徴に応じて１０３〜１０９ ＴＣＩＤ５０の範囲内であろう。１０３ ＴＣＩＤ５０未満のウイルスの感染量は、多くの場合、低すぎると考えられるであろう。なぜなら、免疫系を惹起するのに十分に高いレベルまで該ウイルスが複製されるのには時間がかかり過ぎるからである。１０９ ＴＣＩＤ５０を超える量は商業的な理由からだけでも不都合であろう。非常に適当な用量は１０５〜１０８ ＴＣＩＤ５０の範囲内、より好ましくは１０６〜１０８ ＴＣＩＤ５０の範囲内であろう。
医薬上許容される担体は当技術分野で良く知られている。単なる一例として挙げると、そのような担体は無菌水またはバッファー溶液、例えばＰＢＳのような簡便なものでありうる。
本発明のワクチンは幾つかの方法で投与されうる。該ワクチンは生弱毒化ウイルスを含むため、例えば経口、鼻腔内、Ｉ．Ｍ．および皮下投与のような多数の投与方法が実施可能である。好ましい投与経路は皮下投与である。
パルボウイルス感染に感受性である動物、例えば、とりわけ、ネコおよびイヌは、幾つかの他の疾患に対して同時にワクチン接種されることが多い。したがって、本発明のワクチンを、イヌおよびネコに対して病原性であるウイルスまたは微生物の追加的抗原または該抗原をコードする遺伝的情報と組合せることが実用的であろう。したがって、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のワクチンと、動物に対して病原性であるウイルスもしくは微生物の追加的抗原または該ウイルスもしくは微生物の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝的情報とを含む混合ワクチン（組合せワクチン）に関する。
ウイルスまたは微生物の追加的抗原は、該全ウイルスもしくは微生物（生弱毒化形態または不活化形態のもの）またはそのウイルスもしくは微生物の免疫原性ポリペプチドもしくは別の免疫原性部分、例えば（リポ−）多糖であって、防御免疫応答を誘導しうるものでありうる。
好ましくは、動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物は、エールリチア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）、ボゲリ（ｖｏｇｅｌｉ）、ロッシイ（ｒｏｓｓｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、レプトスイラ・インタロガンス・セロバル・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ）、イクテロヘモラジエ（ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、ポモナ（ｐｏｍｏｎａ）、グリッポチホサ（ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、ブラチスラバ（ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘパトゾーン・カニス（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症およびクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）の群から選択される。
生弱毒化ウイルスを含むワクチンは低温で保存される必要があり、あるいはそれらは凍結乾燥形態でなければならない。凍結乾燥ワクチンは適度な冷却条件下または更には室温で維持されうる。しばしば、分解し易いタンパク質の分解を防ぐため、該ワクチンの貯蔵寿命を延長させるため、または凍結乾燥効率を改善するために、該ワクチンは安定剤と混合される。有用な安定剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインまたはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。したがって、好ましくは、本発明の（混合）ワクチンは凍結乾燥形態である。また、該ワクチンは、生理的に許容される希釈剤に懸濁されうる。そのようなバッファーは、例えば、無菌水、バッファーなどでありうる。言うまでもなく、ウイルスを乳化または安定化させるための希釈剤および化合物も本発明に含まれる。
本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明の（混合）ワクチンの製造方法に関する。これらの方法は、本発明の生弱毒化パルボウイルスを医薬上許容される担体と混合することを含む。
本発明の更にもう１つの実施形態は、医薬として使用するための、本発明の生弱毒化パルボウイルスに関する。より詳しくは、この実施形態は、パルボウイルス感染の治療において使用するための、本発明の生弱毒化パルボウイルスに関する。
本発明の更にもう１つの実施形態は、パルボウイルス感染の治療のための、本発明の生弱毒化パルボウイルスの使用に関する。
最後に、本発明のもう１つの実施形態は、本発明のパルボウイルス突然変異体の製造方法に関する。そのような方法は、イソロイシンをコードするコドンをアミノ酸２１９位に有する及び／又はグルタミンをコードするコドンをアミノ酸３８６位に有するパルボウイルスカプシドタンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ断片を、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンをアミノ酸２１９位に有する及び／又はグルタミン以外のアミノ酸をコードするコドンをアミノ酸３８６位に有するパルボウイルスカプシドタンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ断片により置換することを含む。
ＤＮＡのそのような置換は、当技術分野で良く知られた組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的突然変異誘発、制限断片の置換などを用いて行われうる。２１９イソロイシンをＸ１置換または３８６グルタミンをＸ２置換にするための幾つかの方法が存在する。そのような変化は、化学合成、またはＰＣＲ、およびそれに続く、ウイルスＤＮＡでの新たに合成された断片の組換えにより導入されうるであろう。
ｐＣＰＶ Ａの構築。 ｐＣＰＶ Ｃの構築。 ｐＣＰＶ ＡＣの構築。 ｐＣＰＶ １５４ａｔｔの構築。 ｐ６３０の構築。 ｐ６３０ａｔｔの構築。 ハイブリッド２／２ｃウイルス分離体を得るための自然組換え（非ＧＭ）法の図示。２型ワクチンおよび２ｃ型野外ウイルスからの２つの重複断片を細胞内にトランスフェクトし、相同組換え後、ウイルスを分離した。 制限酵素部位ＰａｃＩおよびＸｍｎＩを示すＣＰＶ株１５４ａｔｔの感染性プラスミドクローンの図示。陰影付きの箱は末端回文配列を示す。 更なる操作のために選択された部分的ＰａｃＩ／ＸｍｎＩ消化の選択された産物の図示。 カプシド遺伝子がビルレントＣＰＶ２ｃカプシド配列により置換されている、１５４ａｔｔワクチンウイルスＤＮＡを含有するプラスミド。 実施例 実施例１：イヌパルボウイルスクローン６３０ａｔｔの製造 出発物質 ウイルス：
Figure 0006298499
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子ストックセンター（ＵＳＡ）から得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＣ８１１および株ＤＬ７９５（Ｋｒａｍｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ）を完全感染性クローンのプラスミド増殖のために選択した。
ＤＮＡ合成
特製ＤＮＡ合成がＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ ＧｍｂＨにより行われた。合成されたＤＮＡ断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔクローニングプラスミド形態で供給された。
イヌパルボウイルスクローン６３０ａｔｔの構築は多段階法であり、ここではその別々の工程として記載されている。
１）Ｎｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（ｐ１５４ａｔｔ）の感染性分子クローンの構築
複製形態（ＲＦ）ウイルスＤＮＡを、改変された「ヒルト（Ｈｉｒｔ）」調製法（Ｐａｒｒｉｓｈら １９８８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６６，２９３−３０７）を用いて、Ｎｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ感染細胞に感染したＡ７２細胞から得た。ウイルスＤＮＡを幾つかの制限酵素で消化し、通常のクローニング法を用いて該ゲノムをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中で合体させた。該クローニング手順の概要を図１〜４に示す。まず、ＣＰＶ １５４ａｔｔのＲＦ ＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して「末端を埋める（エンドフィル）」。ついで該ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化した。これらの酵素はそれぞれ１０９９位および３４５９位で一度に切断した。この消化は、それらのサイズの順でＡ、ＢおよびＣとして示される３つの断片を生成した。断片をゲル電気泳動で分離し、ついでＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ断片（断片Ａ）を、同じ酵素での消化により調製されたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にクローニングした（図１を参照されたい）。ついで該ＲＦ ＤＮＡ消化物からのＥｃｏＲＩ末端断片（断片Ｃ）を、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にクローニングして、ｐＣＰＶ Ｃを得た（図２を参照されたい。）イヌパルボウイルスＡおよびＣ断片を一緒に同一プラスミド内にサブクローニングした。プラスミドｐＣＰＶ ＡおよびＰＣＰＶＣをＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。該ＣＰＶインサートをｐＣＰＶから精製し、該ベクター部分をｐＣＰＶ Ｃから採取した。ついで連結は、断片ＡおよびＣが「再結合」されたプラスミドを与えた（図３を参照されたい）。ついで該ＣＰＶ ＲＦ ＤＮＡ消化物からのＳｐｅＩ末端断片（断片Ｂ）をｐＣＰＶ ＡＣ内にクローニングした。プラスミドｐＣＰＶ ＡＣをＳｐｅＩおよび酵素ＨｉｎｃＩＩ（これは切断により平滑末端を与える）で消化した。該断片を連結し、クローニングした（図４を参照されたい）。
得られたプラスミドをｐ１５４ａｔｔと命名した。
Ａ７２細胞内に該プラスミドＤＮＡをトランスフェクトして感染性ウイルスを得ることにより、完全なクローンが構築されたという確認がなされた。
該プラスミドクローンのＤＮＡ配列分析を行った。以下に更に詳しく示すとおり、該配列は、感染細胞から抽出されたウイルスＤＮＡから決定されたものと同一であることが示された。
２）２／２ｃハイブリッドＤ９の構築
Ｎｏｂｉｖａｃ ｐａｒｖｏ Ｃ感染細胞およびそれとは別のＣＰＶ２ｃ「Ｊｅｓ」感染細胞の両方からウイルスＤＮＡを得た。ウイルスＤＮＡ調製物をそれぞれ、単一制限酵素で消化して、それぞれから２つのＤＮＡ断片を得た。Ｎｏｂｉｖａｃゲノムの左側の断片および「Ｊｅｓ」ゲノムの右側の断片が＞２００ｂｐの重複配列を共有するように該酵素消化を行った。Ｎｏｂｉｖａｃの左側および「Ｊｅｓ」の右側断片を分離し、精製し、混合した（図７）。
これらの重複断片でのＡ７２およびＣｒＦＫ細胞のトランスフェクションは感染性ウイルスが自然組換えにより生じることを可能にした。得られたウイルスを限界希釈によりクローニングし、２／２ｃハイブリッドＤ９と命名した。
３）クローン６３０の構築
感染性プラスミドクローンｐ１５４ａｔｔからクローン６３０を作製し、ＤＮＡを２／２ｃハイブリッドＤ９から調製した。
制限酵素ＰａｃＩは５６１位および４６５１位のあたりの２つの位置（該ゲノムのずっと左側および右側の末端）でＣＰＶゲノムを切断する。したがって、プラスミドｐ１５４ａｔｔをＰａｃＩで消化し、該ゲノムの８０％以上を含有する〜４ｋｂｐのＰａｃＩ断片を該ベクターおよび末端配列から分離し、２／２ｃハイブリッドＤ９ ＤＮＡから得られたもので置換した。得られたプラスミドをｐ６３０と命名した。これを図５に示す。
予想どおり、ｐ６３０でのＡ７２またはＣｒＦＫ細胞のトランスフェクションは感染性ウイルスを生成し、このウイルスを６３０と命名した。
ウイルス６３０は、２／２ｃハイブリッドＤ９と同様に、低レベルの病原性を保有していた。
４）クローン６３０ａｔｔの構築
６３０ウイルスは、イヌに注射された場合、幾つかの低レベルの臨床徴候を示した。
該カプシド遺伝子の部分を、Ｎｏｂｉｖａｃ ｐａｒｖｏ Ｃにおいては観察されるが野外株には存在することが見出されないアミノ酸変化を含むように化学合成した。ついで、この断片によりプラスミドｐ６３０における同じ領域を置換して、プラスミドｐ６３０ａｔｔを得た。これを図６に示す。
ＣＰＶゲノム上の３３５６位と４０２９位との間のＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を合成した。本明細書中で配列番号２として示されるその厳密なＤＮＡ配列を以下に示す。
Figure 0006298499
制限酵素部位ＢｇｌＩＩおよびＸｃｍＩは下線付き太字で示されている。
該配列を該プラスミドから遊離させた。この場合、それはＢｇｌＩＩおよびＸｃｍＩでの消化により得られた。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、６７２ｂｐの断片を単離し、精製した。
ｐ６３０ａｔｔでのＡ７２またはＣｒＦＫ細胞のトランスフェクションは感染性ウイルス（６３０ａｔｔ）を与え、これは、子イヌに投与された場合に臨床徴候を何ら示さなかった。
比較研究において、クローン６３０を含むワクチンと、クローン６３０ａｔｔを含むワクチンとを比較した。５頭のＭＤＡ陰性イヌに１ｍｌ中の１０８．０〜１０８．３ ＴＣＩＤ５０のクローン６３０を皮下にワクチン接種した。これは全てのイヌにおいて軽度ないし中等度の徴候を引き起こした。５日間にわたる体重変化は、以下の表に示すとおり、５頭のイヌにおける平均で−６％であった。
Figure 0006298499
５頭のＭＤＡ陰性イヌに１ｍｌ中の１０８．０〜１０８．３ ＴＣＩＤ５０のクローン６３０ａｔｔを皮下にワクチン接種した。
この群においては、臨床症状は認められず、体温は上昇せず、白血球減少は認められず、下痢も嘔吐も認められなかった。更に、以下の表に示すとおり、この群においては相当な体重増加が認められた。
Figure 0006298499
したがって、クローン６３０ａｔｔに基づくワクチンは、クローン６３０と比較して、実際に弱毒化体として挙動し、優れた安全性プロファイルを有する、と結論づけられた。
実施例２：カプシド遺伝子の外部に弱毒化突然変異を有する組換えウイルスの製造
商業的に入手可能なＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）から株１５４ａｔｔを得た。株Ｊｅｓｓは２ｃ型ウイルスの野外分離体であった。
５％ ウシ胎児血清を含有するＭ６Ｂ８培地を使用して、ウイルスを接着性イヌまたはネコ腎細胞（例えば、Ａ７２およびＣｒＦＫ）上で増殖させた。標準的な「ヒルト（Ｈｉｒｔ）」（ＭｃＭａｓｔｅｒら １９８１）の変法を用いて、複製形態（ＲＦ）ＤＮＡを感染細胞培養から調製した。
１５４ａｔｔ株から調製されたＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化し、断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。３０５５塩基対（ｂｐ）のバンド（ＣＰＶの左側末端に対応する）を該ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して精製した。ＣＰＶ Ｊｅｓｓ感染細胞から単離されたＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＸｍｎＩで消化した。この場合も、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、ついで、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して、約２７５０ｂｐのバンド（該カプシド配列を含むＣＰＶの右側末端に対応する）を精製した。
１５４ａｔｔおよびＪｅｓｓからの該精製３０５５ｂｐおよび２７５０ｂｐ断片を合わせ、培養内のＡ７２またはＣｒＦＫ細胞内にトランスフェクトした。約３μｇの各断片と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、トランスフェクションを行った。
トランスフェクション後、細胞を継代し、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによりモニターした。継代４においてＨＡによりウイルスが検出された。ハイブリッドウイルスのＤＮＡ配列決定を、ＲＦ ＤＮＡまたはＰＣＲ断片鋳型を使用する標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて行った。接着性感受性イヌまたはネコ細胞上の限界希釈によりウイルスを精製した。
実施例３：クローン化ウイルスＤＮＡから構築された組換えウイルス
組換えウイルスをクローン化断片から製造した。ウイルス株１５４ａｔｔのゲノムを標準的なクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｉｎｃ．）内にクローニングした。回文末端配列を完全なままに維持するために、幾つかの組換え系を欠損している細菌宿主ＤＬ７９５において該プラスミドを増殖させた。パルボウイルスゲノムのクローニングは文献に記載されており、必要な技術は当業者に公知である。１５４ａｔｔの得られたクローン（ｐ１５４ａｔｔ）を制限酵素ＰａｃＩで消化した。この場合、該消化が完全には進行しないようにした。すなわち、該制限酵素消化は部分的に過ぎなかった。ついで該消化断片を制限酵素ＸｍｎＩでの消化に付した。ついで該消化ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、以下の図に示されている断片を該ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して精製した。該ＸｍｎＩおよび右側Ｐａｃ部位はパルボウイルスゲノム内でカプシド領域に隣接している。以下のとおりに、１５４ａｔｔのカプシド遺伝子をＣＰＶのビルレント株のカプシド遺伝子により置換した。図８に示されているＸｍｎＩ部位および右側ＰａｃＩは該カプシド遺伝子の境界の外部に位置する。ＰａｃＩ部位と該カプシド遺伝子の末端との間の約１１０ｂｐの配列は１５４ａｔｔ株とビルレント分離体との間で有意に異なる。現在のところ、ＸｍｎＩ部位とカプシド遺伝子の開始部位との間の短い配列（〜５５ｂｐ）において、記録された配列変化は存在しない。したがって、材料における置換を該カプシド配列のみに限定するために、該ビルレントＣＰＶカプシド配列を化学合成し、ＰａｃＩ部位とカプシド終止シグナルとの間のワクチン特異的配列を維持した。
以下に、ＣＰＶカプシド遺伝子を含有する化学合成配列を示す。以下に示す配列は本明細書中に配列番号３として記載されている。
Figure 0006298499
Figure 0006298499

ＸｍｎＩおよびＰａｃＩ部位は下線で示されている。カプシドコード領域の終止コドン（ＴＡＡ）およびカプシド（Ｖｐ１／Ｖｐ２）コード配列は太字で示されている。
該合成断片を該プラスミドから遊離させた。この場合、それは、酵素ＸｍｎＩおよびＰａｃＩを使用して得られた。ついで、それを、図９に示されている断片に連結した。コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株ＤＬ７９５）を、標準的なプロトコールを用いて、該連結混合物で形質転換し、該組換えプラスミドを含有する細菌を単離し、特定した。ついで、以下（図１０）に示されている得られたプラスミドｐ１５４２ｃを該クローン化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製した。ハイブリッドウイルスを以下のとおりに調製した。プラスミドｐ１５４２ｃ ＤＮＡを培養内のＡ７２またはＣｒＦＫ細胞内にトランスフェクトした。約３μｇのＤＮＡと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクション後、細胞を継代し、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによりモニターした。継代４においてＨＡによりウイルスが検出された。ハイブリッドウイルスのＤＮＡ配列決定を、ＲＦ ＤＮＡまたはＰＣＲ断片鋳型を使用する標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて行った。接着性感受性イヌまたはネコ細胞上の限界希釈によりウイルスを精製した。

Claims (14)

  1. ＣＰＶ２血清型２ａ、２ｂまたは２ｃのカプシドタンパク質をコードする生弱毒化CPV２であって、該ＣＰＶ２がカプシドタンパク質のアミノ酸２１９位においてイソロイシン以外のアミノ酸をコードし、カプシドタンパク質のアミノ酸３８６位においてグルタミン以外のアミノ酸をコードするカプシド遺伝子を含み、上記アミノ酸の位置が下記アミノ酸配列に基づく、前記生弱毒化ＣＰＶ２。
    Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala
    Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile
    Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu
    Ile Thr Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
    Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met Ala Leu Asp Asp
    Ile His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp
    Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser
    Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
    Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn
    Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp
    Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Val Pro
    Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
    Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu
    Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln
    Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ala
    Thr Asn Phe Gly Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
    Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala
    Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Thr Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly
    Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asn Pro Arg Tyr Ala Phe
    Gly Arg Gln His Gly Lys Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
    Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe
    Asn Leu Pro Val Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr
    Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val
    Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
    Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly Gln Leu Phe Val
    Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg
    Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg
    Ala Ser His Thr Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
    Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser Gln Leu Ala Pro
    Arg Lys Leu Tyr
  2. カプシドタンパク質のアミノ酸２１９位においてバリンをコードし、および／またはカプシドタンパク質のアミノ酸３８６位においてリシンをコードするカプシド遺伝子を含む、請求項１記載の生弱毒化ＣＰＶ２。
  3. 非カプシド領域の一部のＤＮＡ断片が、第２パルボウイルスに由来する非カプシド領域の一部の相同ＤＮＡ断片により置換されており、ここで、該第２パルボウイルスの相同ＤＮＡ断片が弱毒化突然変異を含有する、請求項１または２記載の生弱毒化ＣＰＶ２。
  4. 該第２パルボウイルスの相同ＤＮＡ断片が２０６１〜２０７２位の領域の非構造領域内に弱毒化突然変異を含有し、当該位置が配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、請求項３記載の生弱毒化ＣＰＶ２。
  5. 該第２パルボウイルスの相同ＤＮＡ断片が、アミノ酸配列ＬＴＰＬをコードする２０６１〜２０７２位の領域内における野生型ＣＰＶ２のＤＮＡ配列のアミノ酸配列ＨＶＲＭをコードするＤＮＡ配列との置換による弱毒化突然変異を含有し、当該位置が配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、請求項４記載の弱毒化ＣＰＶ２。
  6. イヌパルボウイルスである、請求項１〜５のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２と医薬上許容される担体とを含む、パルボウイルスの感染に対して動物を防御するためのワクチン。
  8. 請求項７記載のワクチンと、動物に対して病原性であるウイルスもしくは微生物の追加的抗原または該ウイルスもしくは微生物の免疫原性タンパク質をコードする核酸とを含む、病原体に対して動物を防御するための混合ワクチン。
  9. 動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物が、エールリチア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）、バベシア・ボゲリ（Ｂａｂｅｓｉａ ｖｏｇｅｌｉ）、バベシア・ロッシイ（Ｂａｂｅｓｉａ ｒｏｓｓｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）複合体、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、レプトスピラ・インタロガンス・セロバル・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・グリッポチホサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、イヌ肝炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヘパトゾーン・カニス（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルスおよびクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）からなる群から選択される、請求項８記載の混合ワクチン。
  10. 請求項１〜６のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２と医薬上許容される担体とを混合することを含む、請求項７記載のワクチンまたは請求項８もしくは９記載の混合ワクチンの製造方法。
  11. 医薬として使用するための、請求項１〜６のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２。
  12. パルボウイルス感染の治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２。
  13. イソロイシンをコードするアミノ酸２１９位におけるコドンおよび／またはグルタミンをコードするアミノ酸３８６位におけるコドンを、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするアミノ酸２１９位におけるコドンおよび／またはグルタミン以外のアミノ酸をコードするアミノ酸３８６位におけるコドンへと、組換えＤＮＡ技術により改変する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２の製造方法。
  14. イソロイシンをコードするコドンをアミノ酸２１９位に有する及び／又はグルタミンをコードするコドンをアミノ酸３８６位に有するパルボウイルスカプシドタンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ断片を、イソロイシン以外のアミノ酸をコードするコドンをアミノ酸２１９位に有する及び／又はグルタミン以外のアミノ酸をコードするコドンをアミノ酸３８６位に有するパルボウイルスカプシドタンパク質の同じ部分をコードするＤＮＡ断片により置換する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の生弱毒化ＣＰＶ２の製造方法。
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