JP2002537766A

JP2002537766A - ブタ組換えアデノウイルスをベースとするウイルス性ベクターおよびワクチン

Info

Publication number: JP2002537766A
Application number: JP2000598651A
Authority: JP
Inventors: エロワ，マルク; クロンジュコワスキ，ベルナール，ジョルジュ
Original assignee: メリアル; エコールナショナルヴェテリネールドゥメゾンアルフォール
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2002-11-12
Also published as: FR2789695B1; MXPA01008069A; ATE316580T1; EP1151121A1; DE60025701T2; CN1343257A; CN1869243B; KR100818673B1; AU781195B2; AU2553700A; ES2258970T3; WO2000047756A1; DK1151121T3; PL205524B1; PL350182A1; CA2362454C; FR2789695A1; KR20020013502A; CA2362454A1; BR0008205A

Abstract

(57)【要約】【課題】インビボで組換え、複製可能なブタアデノウイルス。【解決手段】ブタアデノウイルスのゲノムにヘテロな塩基配列を挿入する。ヘテロな塩基配列をインビボで複製でき且つ発現できる条件下で挿入し、アデノウイルスゲノムをセロタイプ３または５（ＰＡＶ−３またはＰＡＶ−５）のアデノウイルスに由来するものにする。ブタアデノウイルスのＥ３領域の本質的でない領域に好ましくは欠失を伴って挿入される。本発明はさらに上記のブタアデノウイルスを含む組換えブタワクチンと、インビボで複製されかつゲノムの本質的でない領域内で欠失したセロタイプ３または５のブタアデノウイルスベクターとに関する。本発明はさらに配列ＩＤ番号５で表される塩基配列の全部または一部を含むＤＮＡ断片に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明はヘテロな塩基配列を挿入して組換えたセロタイプ３および５のブタア
デノウイルス（adenovirus）に関するものである。このアデノウイルスはインビ
ボで自己複製してヘテロな塩基配列を発現することができる。本発明はさらに、上記アデノウイルスを用いて得られるブタワクチンと、この
ワクチンを用いてブタを免疫する方法と、欠失した複製アデノウイルスベクター
と、これらアデノウイルス、ワクチンおよびベクターの製造方法とに関するもの
である。なお、本明細書で引用する文献およびそれらの文献で引用された文献は本願明
細書の一部をなす。

【０００２】

【従来の技術】

アデノウイルスは各終末が反転反複する配列の直線状二本鎖ＤＮＡ分子のウイ
ルスである。アデノウイルスはアデノウイルス科の一部であり、多くの種族、例
えばサル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ネズミ、イヌ、トリに発症する病気の原
因である。種およびアデノウイルスの種類によってアデノウイルス感染症は脳炎
、肺炎、腎病変、下痢および肝炎の徴候で特徴付けられる。

【０００３】アデノウイルスゲノムは種ごとに異なる［（Ｔ．Ａｄｒｉａｎ達、Ａｒｃｈ．
Ｖｉｒｏｌ．１９８６，９１，２７７−２９０）、（Ｊ．Ｈａｍｌｉｎ達、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８８，２６，３１−３３）、（Ｒ．Ａｓｓ
ａｆ達、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．１９８３，４７，４６０−４６３）、
（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ達、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９７８，２８，２１２−２１８
）、（Ｓ．−Ｌ．Ｈｕ達、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８４，５１，８８０−８８３）
（Ｌ．Ｚｓａｋ達、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ１９８４，２２，１１０−１
１４）］。動物のアデノウイルスはヒトのアデノウイルスとは違って宿主が極め
て限られ、起源種に属する動物にのみ感染することが多い。

【０００４】最初のブタアデノウイルス（ＰＡＶ）は１９６４年に単離された（Ｄ．Ｈａｉ
ｇ達、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１９６４，７４，８１−８４）。その後、
５つのブタアデノウイルスセロタイプが同定され、報告されている（Ｈｉｒａｈ
ａｒａ達、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．１９９０，５２，４０７−４０９）。セロタイ
プ１およびセロタイプ２のアデノウイルスは下痢に関係があり、セロタイプ４の
アデノウイルスは肺炎および脳炎の症状に関係がある。ブタアデノウイルスはセ
ロタイプ１〜セロタイプ４ＰＡＶに特有の抗血清による交差中和がないため、第
５のセロタイプに分類されてきた。ＰＡＶ−５のゲノムは分析され、制限地図が
確立している（Ｔｕｂｏｌｙ達、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９９５，３７，４９−
５４）。この分析からＰＡＶ−５制限地図と他のセロタイプのＰＡＶ、すなわち
ＰＡＶ−１およびＰＡＶ−２（Ｒｅｄｄｙ達、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９
５、１４０、１９５−２００）、ＰＡＶ−３（Ｒｅｄｄｙ達、Ｉｎｔｅｒｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ１９９３，３６，１６１−１６８）およびＰＡＶ−４（Ｋｌｅｉ
ｂｏｅｋｅｒ達、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３、１３３、３５７−３６８）
の制限地図との間に類似点がないことが分かっている。セロタイプ３〜５の中に
はブタにとっては本来非病原性の株が存在する。

【０００５】ＰＡＶのゲノムの大きさは約３２〜約３４ｋｂｐである。ＰＡＶ−１のゲノム
の大きさは約３３．５ｋｂｐであり、ＰＡＶ−２のゲノムの大きさは約３３．３
ｋｂｐである。ＰＡＶ−３ウイルスの完全な配列は最近確立され、遺伝子データ
バンクに番号ＡＦ０８３１３２（Ｐ．Ｓ．Ｒｅｄｄｙ達、Ｖｉｒｏｌ．１９９
８、２５１、４１４−４２６）で寄託され、大きさは３４０９４塩基対（ｂｐ）
である。ＰＡＶ−４のゲノムの大きさは約３２ｋｂｐであり、ＰＡＶ−５のゲノ
ムの大きさは約３３．２ｋｂｐである。ＰＡＶ−５のＥ３領域の完全なゲノムは
配列決定はされておらず、開示もされていない。アデノウイルスの主要な用途はヒトの遺伝子治療分野であり、極めて多くの構
築物および系が提案されている。アデノウイルスはヒトおよび動物を多くの病原
性ウイルスから守るための免疫組成物の組換えベクターとしても提案されている
。

【０００６】組換えアデノウイルスベクターを作る方法は現在までに２つ開発されている（
Ｍ．Ｅｌｏｉｔ＆Ｍ．Ａｄａｍ，Ｊ，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５，７６，１
５８３−１５８９）。第１の方法はアデノウイルスの複製に必須な領域に発現カセットを挿入する方
法であるが、それと同時にウイルスの複製を確実に行うために超相補系（system
s des transcomplementation）を開発する必要がある。ブタアデノウイルスでは
挿入部位としてＥ１領域が提案されている（Ｐ．Ｓ．Ｒｅｄｄｙ達、Ｖｉｒｕ
ｓ．Ｒｅｓ．１９９８、５８、９７−１０６）。しかし、この方法で作られた組
換えベクターは投与した宿主内で複製されないため「非複製」とよばれる。

【０００７】第１の方法の変形例では標的動物内で非複製であるウイルスを用いる。特にＰ
ＲＶｇＤ発現カセットがブタでは非複製であるセロタイプ５のヒトアデノウイ
ルスのＥ１Ａ領域に挿入されている（Ｍ．Ｍｏｎｔｅｉｌ．達、Ｊ，Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．１９９７，７８，３３０３−３３１０；Ａ．Ａｍｂｒｉｏｖｉｃ達、
Ｖｉｒｏｌ．１９９７，２３８，３２７−３３５）。第２の方法は、アデノウイルスの複製に必須でないウイルス性ゲノムの領域に
発現カセットを挿入する方法である。アデノウイルスの必須でない領域を決定す
るのが難しく、リジドなキャプシドが存在するため、この第２の方法は実施が困
難である。

【０００８】すなわち、アデノウイルスの本質的特徴の１つはリジッドなキャプシドを有し
、形成されるＤＮＡ分子の大きさが厳密に制限されることにある。一般に、ゲノ
ムの大きさの１０５〜１１４％に対応するＤＮＡ分子（これはゲノムの寸法では
約１．７〜約３．９ｋｂｐの挿入断片に相当する）はキャプシド形成(encapside
r)できると考えられる。過度に大きな場合には、組換えゲノム中で望ましくない
欠失および／または再編成が起こることになる。Ｅ３領域は大きさの点でも特定種のアデノウイルス間の遺伝的機構の点でも、
各種ステレオタイプのブタアデノウイルス間で保存されない（Ｓ．Ｋｌｅｉｂｏ
ｅｋｅｒ、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９９４，３１，１７−２５）。

【０００９】ＰＡＶ−３のＥ３領域の大きさは１１７９塩基対である。この領域は少なくと
も３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする複雑な領域であ
る。これらのＯＲＦは互いに重複し、さらに第１のＯＲＦの一部は必須蛋白であ
るｐＶＩＩＩ蛋白をコードする遺伝子と重複している（Ｐ．Ｓ．Ｒｅｄｄｙ達
、Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．１９９５、３６、９７−１０６）。Ｅ３領域のこれらの重複するＯＲＦは組換えアデノウイルスがブタ内で複製を
維持する挿入部位および／または欠失限界を決定する際に大きな問題となる。

【００１０】Ｅ３領域の第２のＯＲＦでコードされたアミノ酸配列はＰＡＶ−３アデノウイ
ルスとＨＡＶ−２アデノウイルス（セロタイプ２のヒトアデノウイルス）と相同
性がなく、現在知られている他のいずれのアデノウイルス蛋白（Ｐ．Ｓ．Ｒｅｄ
ｄｙ達、Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．１９９５、３６、９７−１０６）とも相同性が
ないことを示している。ＰＡＶ−３のＥ３領域の第１ＯＲＦの塩基配列から予測
されるアミノ酸配列はセロタイプ２のイヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２）との同
一性はわずか３３．３％である。種々のアデノウイルスのＥ３領域でコードされ
た蛋白が相同でないだけでなく、Ｅ３領域のＯＲＦでコードされた蛋白もＰＡＶ
−３とＰＡＶ−４アデノウイルスとの間で相同性を示さない（Ｓ．Ｂ．Ｋｌｅｉ
ｂｏｅｋｅｒ、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９９４，３１，１７−２５）。

【００１１】（５個のＯＲＦを有する）ＰＡＶ−１のＥ３領域の大きさは１１６２ｂｐであ
り、（５個のＯＲＦを有する）ＰＡＶ−２では１２２２ｂｐ（Ｐ．Ｓ．Ｒｅｄｄ
ｙ達、Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．１９９５、３６、９７−１０６）であり、（６個
のＯＲＦを有する）ＰＡＶ−４では１８７９ｂｐである。（１３．２ｋＤａ蛋白
に対応する）ＰＡＶ−４ウイルスのＥ３領域の第４ＯＲＦのみがＥ３領域の別の
公知ＯＲＦと相同性を示し、タイプ５のヒトアデノウイルス（ヒトアデノウイル
ス５またはＨＡＶ−５とよばれる）の１４．７ｋＤａ蛋白をコードする。ＰＡＶ
−４のＥ３領域は他のブタアデノウイルスのＥ３領域、特にＰＡＶ−３およびＰ
ＡＶ−５のＥ３領域との配列の相同性を全く示さない。

【００１２】インビボでの複製性保存の限界を定義できないという問題に加えて、Ｅ３領域
内の欠失には危険が伴う。Ｅ３領域内の欠失は実際には組換えアデノウイルスの
病原性に何らかの影響を与えると思える。すなわち、ＨＡＶ−５ウイルスのＥ３
領域内の欠失がこのウイルス肺の病原性を増やすことが感染実験モデルのコトン
ラットで示されている（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ達、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８９，８６，３８２３−３８２７）。このことから、アデノウイルスのＥ３領域での欠失の影響は実施した一つの特
定のアデノウイルスで観察した結果を単に他のアデノウイルスに置きかえること
はできず、ケースバイケースで考慮しなければならないことがわかる。ＰＡＶ−
３のＥ３領域の遺伝子機構は独特であり、ＰＡＶ−５のＥ３領域の遺伝子機構も
独特である。

【００１３】Ｅ３領域内の挿入部位の詳細な位置決定は、アデノウイルスに特有の錯体スプ
ライシング領域とポリアデニレーション領域とが存在するため、さらに複雑であ
る（Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ達、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１９９５，１９９，１３９−１７１）。Ｅ３領域のスプライシング領域
はＥ３領域の外側の配列によってコードされた多くの重要なメッセンジャーＲＮ
Ａの成熟にとって重要である。Ｅ３領域は高転写活性条件のゲノム領域内に位置
する（Ｐ．シャープ達、１９８４、ＴｈｅＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ｅｄ。Ｈ．
Ｓ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＰｌｅｎｕｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗｙｏｒｋａｎｄＬ
ｏｎｄｏｎ，１７３−２０４）ので、Ｅ３領域でのヘテロな塩基配列の挿入は組
換えウィルスの生態学的活性に有害な影響を与える。さらに、Ｅ３領域は主要な
後期プロモータ（ＭＬＰ）の下流に位置する。この位置では挿入断片の転写とＭ
ＬＰで始まる転写との間に干渉が存在することが分かっている（Ｘｕ達、Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５，７６，１９７１−１９８０）。従って、他の種（ヒト、ウシ、ヒツジ等）由来のアデノウイルスで得られた結
果をブタアデノウイルスに置きかえることはできない。従って、現在までブタア
デノウイルスから複製可能な組換えベクターは製造されていない。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】

本出願人の目的は、インビボでの複製能力を実質的に変えずにヘテロな遺伝子
をＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５ウイルスのゲノムに挿入ずきるようにすることに
ある。本発明の他の目的は、複製能力に問題を与えずに、欠失させることができる挿
入部位を提供して、ウイルスへの挿入能力を高めることにある。本発明のさらに別の目的は、インビボで複製能力を保存する組換えＰＡＶ−３
およびＰＡＶ−５ウイルスを提供し、これらのウイルスを、粘膜経路および／ま
たは母体起源の抗体の存在下で投与されるワクチンを含む組換え生ワクチンとし
て使用できるようにすることにある。本出願人はインビボでの複製能力を保存したままＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５
のＥ３領域を修飾することに成功した。さらに、この領域に挿入された遺伝子の
インビボ発現も証明できたので、ＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５を複製発現ベクタ
ーとして用いることが可能になった。

【００１５】

【課題を解決するための手段】

本発明の対象は、ＰＡＶ−３またはＰＡＶ−５のゲノムに挿入された少なくと
も１つのヘテロな塩基配列を有するセロタイプ３または５のブタアデノウイルス
であって、上記のヘテロな塩基配列は、得られた組換えウイルスがブタでインビ
ボで複製でき且つ挿入された塩基配列を発現できるような条件下で挿入されたブ
タアデノウイルスにある。本発明の改質ウイルスはワクチン接種において大きな利点を有し、特に、母体
の抗体の存在下でも有効であり、粘膜経路で有効に使用できる。上記のヘテロな塩基配列はゲノムのＥ３領域の本質的でない領域、特にＥ３領
域に挿入するのが好ましい。「ある領域を欠失する」とは挿入領域の完全または
部分的な欠失、好ましくは完全な欠失を意味する。換言すれば、上記のヘテロな
塩基配列は挿入領域の全部または一部の代わりに、好ましくはこの領域の全部の
代わりに挿入される。

【００１６】ＰＡＶ−３の場合、Ｅ３領域に挿入する好ましい領域はＧｅｎｂａｎｋＡＮ
番号Ｕｌ０４３３に開示の配列位置２７７９４〜２８７１２に対応するＰ．Ｓ．
Ｒｅｄｄｙｅｔａｌ．ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９９５．３６−９７−
１０６が開示した配列のヌクレオチド７０６〜１６２４を含む領域の全部または
一部を含む領域である。換言すれば、この挿入領域および可能な欠失は配列７０
６〜１６２４の全部または一部のみを含むことができ、および／またはＥ３領域
内で限界７０６および／または限界１６２４を超えて延びることができ、必要に
応じてさらにＥ３全体を含むことができる。この領域はＥ３領域、ヌクレオチド
７０６〜１６２４、ヌクレオチド１００２〜１６２４または配列７０６〜１００
２の全部または一部からなるか、これらを含むのが好ましい。特に、この領域は
少なくとも配列１００２〜１６２４を含む。

【００１７】ＰＡＶ−５の場合には、Ｅ３領域は配列ＩＤ番号５の塩基配列２３８２〜４０
４２で定義される。この挿入領域および可能な欠失はＥ３領域を含み、且つ、配
列ＩＤ番号５のヌクレオチド２０６４〜４０８３の全部または一部、例えばヌク
レオチド２３８９〜３８６１の全部または一部を含む（図１３）。換言すれば、
この挿入領域および可能な欠失は配列２３８９〜３８６１の一部のみを含むこと
ができ、および／またはＥ３領域内で限界２３８９および／または限界３８６１
を超えて延びることができ、必要に応じてさらにＥ３全体を含むことができる。
ヌクレオチド４０８３まで欠失したときは、ヌクレオチド４０８３にスプライス
アクセプター部位を挿入するのが好ましい。この挿入領域は本質的にヌクレオチ
ド２３８９〜３８６１からなるのが好ましい。

【００１８】本発明が、本発明の基準株の配列とは異なるＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５の他
の株の塩基配列で定義される対応する領域への挿入も含むものであるということ
はいうまでもない。本発明のさらに他の対象は、ブタでのインビボでの複製能力を維持したまま寸
法の大きなものを挿入することができるＰＡＶ−３またはＰＡＶ−５ウイルスに
ある。宿主内での複製性は最適な保護効果が得られるように維持されことが望ま
れ、特に粘膜経路および／または母体の抗体の存在下で、免疫組成物を用い行う
ことが望まれている。

【００１９】挿入能力の向上は欠失、例えばＥ３領域の全部またはｐＶＩＩＩ蛋白をコード
する遺伝子と線維をコードする遺伝子との間のＥ３領域の欠失可能な一部の欠失
で達成される。特に、本発明では組換えウイルスの複製性を保存しながら、ＰＡ
Ｖ−３ウイルスのＥ３領域に形成することができる６２２ｂｐ〜９１９ｂｐの欠
失ができる（実施例６〜１０参照）。本発明ではさらに、ＰＡＶ−５ウイルスの
Ｅ３領域内の１４７２ｂｐの欠失で組換えウイルスに同じ表現型の特徴が得られ
ることが示される（実施例１４〜１７参照）。本発明のＰＡＶ−３またはＰＡＶ−５組換えアデノウイルスは、ＰＡＶ−３ウ
イルスでは最大寸法の約３．０ｋｂｐを挿入し、ＰＡＶ−５ウイルスでは最大寸
法の約３．５ｋｂｐを挿入して、ブタ内で発現させるのが有利である。

【００２０】本発明のさらに他の対象は、特に上記領域内で欠失した、すなわち問題の領域
の全部または一部、好ましくはこの領域の全部が欠失した、特にＥ３領域内で欠
失した複製可能性を保持したＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５ベクターにある。挿入可能なヘテロな塩基配列は免疫原または免疫学的活性断片または免疫原、
例えば免疫原のエピトープ、特にブタ病原体の免疫原をコードする遺伝子または
遺伝子断片（例えばエピトープ）をコードする配列である。本発明では、同じウイルスに一つまたは複数のヘテロな塩基配列を挿入できる
ということは当然である。特に、同じウイルスまたは異なるウイルスに由来のヘ
テロな配列をそのウイルスに挿入することができる。

【００２１】本発明の１つの方法では、「ポリエピトープ配列」とよばれる同じ病原体また
は異なる病原体に由来の複数の断片またはエピトープを組み合わせた人工配列を
挿入することができる。後者の場合は、ポリエピトープ配列を単一のプロモータ
の制御下に配置する。さらに、免疫調節物質、特にサイトカイン、好ましくはブタサイトカイン、例
えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｐｏＧＭ−ＣＳＦ）、ブタインタ
ーロイキン４（ｐｏＩＬ−４）、ブタＩＬ−１２またはブタＩＬ−１８をコード
する配列を挿入することができる。

【００２２】挿入部位に挿入される複数のヘテロな遺伝子は特に下記のウイルスから得られ
た「ＩＲＥＳ」（Internal Ribosome Entry Site、内部リボソーム侵入部位）と
よばれる配列を挿入座位に挿入することによって発現することもできる：例えばブタの小嚢病ウイルス（ＳＶＤＶ;Ｂ．‐Ｆ．Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３、６７，２１４２−２１４８）、脳心筋炎ウ
イルス（ＥＭＣＶ；Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９１、１９，４４８５−４４９０)、手足口
病ウイルス（ＦＭＤＶ；Ｎ．ＬｕｚＡＮＤＥ．Ｂｅｃｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１９９１、６５，６４８６−６４９４)、または他に由来のウイルス。これ
ら３つの論文の内容は参考として本明細書の一部を成す。従って、２つの遺伝子
を発現するためのカセットはプロモータ（任意）−遺伝子１−ＩＲＥＳ−遺伝子
２−ポリアデニレーションシグナルの最小構造を有する。従って、本発明の組換
え生ワクチンはプロモータと、ＩＲＥＳによって対で分離された２つまたはそれ
以上の遺伝子と、ポリアデニレーションシグナルとを順次含む発現カセットが挿
入部位に挿入された状態で有する。

【００２３】ブタの病原体はオーエスキー病ウイルス（ＰＲＶまたは仮性狂犬病ウイルス）
、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイ
ルス（ＰＲＲＳウイルス）、パルボウィルス（ＰＰＶ）、雄ブタコレラウイルス
（ＨＣＶ）、ブタサーコウイルス、特にタイプ２のブタサーコウイルス（Ｐｏｒ
ｃｉｎｅＣｉｒｃｏＶｉｒｕｓｔｙｐｅ２、ＰＣＶ２または子豚全身性萎縮症
候群ウイルス）、アクシノバシラスプルーノニューモニア(Ａｃｔｉｎｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ)およびミコプラスマヒオニュ
ーモニア(Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ)からなる群の中か
ら選択されるウイルス、バクテリアおよび寄生虫である。

【００２４】オーエスキー結合価に関しては、ｇＢ遺伝子（ＲｏｂｂｉｎｓＡ．Ｋ．達、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８７，６１，２６９１−２７０１ＧｅｎｂａｎｋＡＮ番
号Ｍ１７３２１）、ｇＣ遺伝子（ＩｓｈｉｋａｗａＫ．達Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．１９９６，４９，２６７−２７２ＧｅｎｂａｎｋＡＮ番号Ｄ４９４
３５）および／またはｇＤ遺伝子（ＲｉｖｉｅｒｅＭ．達、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
１９９２，６６，３４２４−３４３４およびＨｏｎｇＷ．Ｚ．達、Ｇｅｎｂａ
ｎｋＡＮ番号ＡＦ０８６７０２）を未変成または分泌物の形で用いることがで
きる。

【００２５】ブタインフルエンザウイルス結合価に関しては、ＨＡ遺伝子（国際出願第９８
／０３６５８、例１０および例１２）（未変成または分泌物）、ＮＡ遺伝子（Ｎ
ｅｒｏｍｅＫ．達、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５，７６，６１３−６２
４ＧｅｎｂａｎｋＡＮ番号Ｄ２１１９４）（未変成または分泌物）および／ま
たはＮＰ遺伝子（国際出願第９８／０３６５８、例１１および例１３）を用いる
のが好ましい。

【００２６】ＰＲＲＳ結合価に関しては、ヨーロッパ株（ＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇＪ．達、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，１９２，６２−７２）およびアメリカ株（Ｍａｒ
ｄａｓｓｉＨ．達、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１９９５，１４０，１４０５−１
４１８）に由来のＯＲＦ４遺伝子、ＯＲＦ３遺伝子（未変成または分泌物）、Ｏ
ＲＦ５遺伝子（未変成または分泌物）、ＯＲＦ６遺伝子および／またはＯＲＦ７
遺伝子を用いるのが好ましい。

【００２７】雄ブタコレラウイルス結合価に関しては、Ｅ０遺伝子、Ｅ１遺伝子（未変成ま
たは分泌物）および／またはＥ２遺伝子（未変成または分泌物）（Ｍｅｙｅｒｓ
Ｇ．達、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８９，１７１，１８−２７）を用いるのが好
ましい。パルボウィルスの結合価に関しては、ＶＰ２キャプシド遺伝子（Ｖａｓｕｄｅ
ｖａｃｈａｒｙａＪ．達、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，１７８，６１１−６
１６）を用いるのが好ましい。ＰＣＶ２の結合価に関しては、ＯＲＦ１および／またはＯＲＦ２遺伝子、好ま
しくはＯＲＦ１およびＯＲＦ２遺伝子（ＭｅｅｈａｎＢ．達、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．１９９８，７９，２１７１−２１７９）を用いるのが好ましい。

【００２８】ヘテロな配列は転写調節信号、特にプロモータの制御下で、好ましくは組換え
中に挿入される。しかし、これらのヘテロな配列をベクターの役目をするアデノ
ウイルスに固有の信号の制御下に発現することも考えられる。強い真核生物プロモータとしては、例えばラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモー
タ、好ましくはサイトメガロウイルス即時初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌ
ｙ）(ＣＭＶ−ＩＥ)プロモータ、特に、ネズミのプロモータ（ＭＣＭＶ−ＩＥ)
またはヒトのプロモータ（ＨＣＭＶＩＥ）、あるいは由来の異なるＣＭＶ−Ｉ
Ｅプロモータ、例えばブタ、サル、ラットまたはモルモット由来のプロモータを
使用するのが好ましい。

【００２９】特に有利な態様では、ＣＭＶ−ＩＥプロモータをエンハンサーと一緒に使用で
きる（米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，９６８，６１５号、米
国特許第４，９６３，４８１号）。プロモータ活性を保存するこれらのプロモー
タの断片を好ましくはエンハンサー、例えば国際特許第９８／００１６６号に記
載の切断型ＣＭＶ−ＩＥプロモータと一緒に使用するのが有利である。これ以上
の説明が必要な場合には国際特許第９８／００１６６号の特に例１２を参照され
たい。

【００３０】本発明のさらに他の対象は、獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤、必要
に応じてさらにアジュバント中に本発明の組換えアデノウイルスを含む免疫原性
または免疫学的製剤と、ブタワクチンとにある。定義上、免疫原性または免疫学
的製剤は動物に投与した後に少なくとも１つの免疫応答（細胞性および／または
体液性）を誘発するものをいう。

【００３１】アジュバントはアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン
酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から選択するのが好ましい。特に好ましい化合物は糖のポリアルケニルエーテルまたはポリアルコールと架
橋したアクリルまたはメタクリル酸ポリマーである。これらの化合物は「カルボ
マー」（ＰｈａｒｍｅｕｒｏｐａＶｏｌ．８、Ｎｏ．２、Ｊｕｎｅ１９９６）
として知られている。この種のアクリルポリマーを記載した米国特許第２，９０
９，４６２号も参照されたい。この特許ではアクリルポリマーは少なくとも３個
、好ましくは８個以下のヒドロキシ基を含むポリヒドロキシ化合物と架橋し、少
なくとも３個のヒドロキシルの炭素原子が少なくとも２個の炭素原子を含む不飽
和脂肪族基に置換される。好ましい基は２〜４個の炭素原子を含む基、例えばビ
ニル基、アリル基および他の不飽和エチレン基である。不飽和基自体は他の置換
基、例えばメチルを含むことができる。商品名、カルボポル(Ｃａｒｂｏｐｏｌ)
（登録商標）（ＢＦＧｏｏｄｒｉｃｈ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）で市販の製品が特
に適している。この製品はアリルスクロースまたはアリルペンタエリトリトール
で架橋される。中でも、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ、９３４Ｐおよ
び９７１Ｐを挙げることができる。

【００３２】無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーとしては直鎖または例えば
ジビニルエーテルと架橋可能な無水マレイン酸とエチレンとのコポリマーである
ＥＭＡ（登録商標）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が好ましい。Ｊ．Ｆｉｅｌｄ達、Ｎａ
ｔｕｒｅ，１８６，７７８−７８０、Ｊｕｎｅ４，１９６０を参照されたい。構造の観点から、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびＥＭＡ（登
録商標）は下記の化学式の基本単位から形成されるのが好ましい：

【００３３】

【化１】

【００３４】（ここで、Ｒ₁およびＲ₂はＨまたはＣＨ₃を表し、同一でも異なっていてもよく、Ｘ＝０または１、好ましくはｘ＝１Ｙ＝１または２、ｘ＋ｙ＝２）ＥＭＡ（登録商標）ではｘ＝０およびｙ＝２。カルボマーではｘ＝ｙ＝１。

【００３５】これらのポリマーを水に溶解した酸性溶液を好ましくは生理的ｐＨまで中和し
てアジュバント溶液にし、これに実際のワクチンを組み込む。この場合、ポリマ
ーのカルボキシル基の一部がＣＯＯ^-型になる。本発明のアジュバント溶液、特にカルボマーは得られる溶液が酸性ｐＨになる
ように蒸留水中で好ましくは塩化ナトリウムの存在下で調製するのが好ましい。
（所望の最終濃度を得るのに）必要な量またはその大部分の量のＮａＣｌを含む
水、好ましくは生理食塩水（６ｇ／ｌのＮａＣｌ）をこの材料溶液に添加し、一
段階以上の好ましくはＮａＯＨによる同時または連続中和（ｐＨ７．３〜７．４
）で希釈する。生理的ｐＨの溶液をこれ以上改質せずに使用し、特に凍結乾燥型で貯蔵された
ワクチンに加える。

【００３６】最終免疫化組成物中のポリマー濃度は０．０１％〜２％Ｗ／Ｖ、特に０．０６
〜１％Ｗ／Ｖ、好ましくは０．１〜０．６％Ｗ／Ｖにする。本発明の免疫原性製剤およびワクチンは、同一および／または異なる病原体に
由来する異なるヘテロな塩基配列を含む本発明の複数の組換えアデノウイルスを
含むことができる。本発明のさらに他の対象は、上記の免疫原性製剤およびワクチンの有効量を投
与することを含む、一種または複数のブタの病原に対してブタを免疫化する方法
にある。有効量は例えば１０⁴〜１０⁷ＣＣＩＤ₅₀にする。

【００３７】本発明は特に、これらの免疫原性製剤およびワクチンの口、鼻または眼などの
粘膜経路による投与および／または母体の抗体を有する未熟な動物に対して用い
ることができる。ブタのワクチン接種で一般的に用いられる他の経路（特に筋肉
経路、皮内経路等）も用いることができる。本発明のさらに他の対象は、ＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５ベクターと、これら
を組み込んだ免疫原性製剤およびワクチンの製造方法とにある。本発明のさらに他の対象は、粘膜経路および／または母体の抗体を有する未熟
な動物および／または一般的な経路で投与可能な本発明の免疫原性製剤およびワ
クチンでの上記ベクターの使用にある。

【００３８】本発明のさらに他の対象は、Ｅ３領域を含み且つ本発明で使用される特定の株
で下記の配列ＩＤ番号５の塩基配列を有するＰＡＶ−５ＤＮＡ断片にある。本発
明はこの配列の任意の断片、特にＰＡＶ−５の特異性を保存する任意の断片にも
関するものである。従って、本発明の対象は配列２０６４〜４０８３およびその
断片、特に本発明で使用される特定の株でのヌクレオチド２３８２〜４０４２で
定義されるＰＡＶ−５のＥ３配列と、その断片、特に配列ＩＤ番号５の配列２３
８９〜３８６１の全部または一部にある。本発明は上記と均等な配列すなわち上記配列の株の特徴または上記配列により
コードされるポリペプチドの機能を変更しない配列も含むものであるということ
は当然である。また、コードの欠失(degenerescence du code)により変化した配
列も含むということは理解できよう。

【００３９】本発明はさらに、厳密な条件下で上記配列と混成（ハイブリッド化）が可能で
、および／または、本発明株と高い相同性、すなわち８５％以上、特に９０％以
上、さらには９５％以上の相同性を有するという意味で均等なＰＡＶ−５に特有
な配列も含むものである。以下、図面を参照して本発明の実施例をさらに詳細に説明するが、本発明が下
記実施例に限定されるものではない。

【００４０】

【実施例】実施例１細胞およびウイルス細胞倍地および試薬はＧｉｂｃｏＢＲＬから提供された。倍地（Ｇｌｕｔａ
ｍａｘ−１で調製されたＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭカタログ番号１１３６０−
０３９）に１ｍＭのナトリウムピルベート（カタログ番号１１３６０−０３９）
、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ、カタログ番号１０２７０−１０６、ロット
４０Ｑ５７７４Ｋ）を補った。ＰＫ−１５細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ３３）およびＳＴセル（ＡＴＣＣＮｏ
．ＣＲＬ１７５６）をウイルス培養に用いた。

【００４１】ブタの非病原性野生型タイプ３のブタアデノウイルス（＝ＰＡＶ−３）はＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｒ．ＥＶＡＮａｇｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ
Ｇｕｅｌｐｈ，ＰａｔｈｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，５０Ｓｔｏｎｅ
Ｇｕｅｌｐｈ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ，ＮＩＧ２Ｗ１）（Ｒｅｄｄｙ
Ｐ．ｅｔａｌ．、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．１９９６、４３、９９−１０９）から
得た。ブタの非病原性野生型タイプ５のブタアデノウイルス（＝ＰＡＶ−５）はＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｒ．ＴａｄａｓｈｉＨｉｒａｈａｒａ（京都微研研
究室、獣医学微生物学部、日本国、６１１、京都、宇治市、槙島町２４−１６）
（ＨｉｒａｈａｒａＴ．ｅｔａｌ．、Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．１９９０、５２、４０
７−４０９）から得た。

【００４２】培養および継代条件：週に２回、細胞をイール（Ｅａｒｌ）平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬカタ
ログ番号１４１５５−０３０）で１／５０に希釈した（２．５％トリプシン溶液
（Ｓｉｇｍａカタログ番号０４４−５０７５））でトリプシン処理し、培地（
希釈度１：６）中に再懸濁する。細胞は５％Ｃｏ₂の存在下で＋３７℃で培養し
、その後、再培養する。

【００４３】実施例２酵素、バクテリア、プラスミドおよび分子生物学技術制限酵素、連鎖増幅反応用Ｔａｑポリメラーゼおよび種々のＤＮＡ修飾に必要
なその他の酵素はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂＩｎｃ．、Ｒｏｃｈｅ
ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓａｎｄＧｉｂｃｏ−ＢＲＬから提供された。これら全ての酵素はメーカーの推奨法に従って用いた。標準的な分子生物学技
術は「分子生物学：研究室マニュアル」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ
．, ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｅｗＹｏｒ
ｋ、１９８９）の説明に従って行った。

【００４４】コンピテントバクテリアＢＪ５１８３（ＨａｎａｈａｎＤ．、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１９８３、１６６、５５７−５８０）は下記処方で調製した：塩化カルシウム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．１９８９）に従って、これ
らのバクテリアの培養物６０ｍｌを対数期中に調製した。これらを最終体積２ｍ
ｌの５０ｍＭＣａＣｌ₂に回収した。このバクテリア懸濁液３００μｌを体積１
００μｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４に含まれた種々の相同組換
えパートナーＤＮＡと混合し、溶ける氷に３０分間接触させ、次いでバクテリア
を４５℃で２分間熱ショック処理し、溶ける氷の上に１０分間置き、最後に選択
培地上でプレートに置く。

【００４５】実施例３ＰＡＶ−３およびＰＡＶ−５ウイルス性ＤＮＡの抽出実施例１の条件下で１０ｃｍ³容のファルコンフラスコでウイルスを培養して
増幅する。ＣＰＥが完了したとき、細胞を回収して３回凍結／融解サイクルにか
け、次いでウイルス性懸濁液を低速で遠心分離する。ＰＡＶ−３およびＰＡＶ−
５ウイルスを塩化セシウム勾配（１．３４ｇ／ｍｌ）で精製し、ウイルス帯を回
収し、精製し、次いでプロテナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルム（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．１９８９）で抽出した後、ウイルス性ＤＮＡが得る
。次いでこれらのＤＮＡをクローニングまたはポリメラーゼ連鎖増幅（ＰＣＡ）
の各段階で用いる。

【００４６】実施例４ｐＩＴＲｓＰＡＶ３プラスミドの作製実施例３で調製したＰＡＶ−３ウイルスのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片で処
理し、アガロースゲル電気泳動で２４５−ｂｐＥｃｏＲＩＤ断片を単離した。
この断片を予めＥｃｏＲＩで処理して脱リン酸したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＫ
Ｓプラスミド（ｐＢＳＫＳ）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＩｎｃ．ＬａＪｏｌｌ
ａ，ＣＡ)に導入して「ｐＫＳ−ＥｃｏＤＰＡＶ３」プラスミドを得た。ｐＫＳ−ＥｃｏＤＰＡＶ３プラスミドマトリクスと、下記のオリゴヌクレオチ
ドとを用いてＰＣＡ反応を行った：

【００４７】

【化２】

【００４８】

【化３】

【００４９】増幅生成物（３６７ｂｐ）をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ブラントエン
ドを作り、次いでＣｌａＩ酵素で処理して、予めＣｌａＩとＥｃｏＲＶで処理し
たｐＢＳ−ＫＳプラスミドに導入して、「ｐＫＳ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ３」プラ
スミド（図１）を得た。このｐＫＳ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ３プラスミドを酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで
処理してＥｃｏＲＩＤ断片を単離した。３５３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ制
限断片を予めＢａｍＨＩとＫｐｎＩで処理したｐＰｏｌｙＩＩプラスミド（Ｌａ
ｔｈｅＲ．ｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ，１９８７、５７、１９３−２０１）（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ番号Ｇ２０９１１３）に導入して「ｐＰｏｌｙＩＩ−ＲｉｇｈｔＩ
ＴＲ３」プラスミド（図１）を得た。

【００５０】実施例３で調製したＰＡＶ−３ウイルスのゲノムＤＮＡをＫｐｎＩ断片で処理
し、アガロースゲル電気泳動で９３９−ｂｐＫｐｎＩＦ末端断片を単離した。
この断片を予めＫｐｎＩで処理して脱リン酸したｐＢＳ−ＫＳプラスミドに導入
して「ｐＫＳ−ＫｐｎＦＰＡＶ３」プラスミドを得た。ｐＫＳ−ＫｐｎＦＰＡＶ３プラスミドマトリクスと下記のオリゴヌクレオチド
とを用いてＰＣＡ反応を行った：

【００５１】

【化４】

【００５２】

【化５】

【００５３】増幅生成物（１０８６ｂｐ）をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ブラントエ
ンドを作り、次いでＸｈｏＩ酵素で処理して、予めＢｇｌＩＩで処理し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＸｈｏＩで処理したｐＰｏｌｙＩＩ−Ｒｉｇ
ｈｔＩＴＲ３プラスミドに導入して、「ｐＩＴＲｓＰＡＶ３」プラスミド（図
１）を得た。

【００５４】実施例５ｐＰＡＶ３プラスミドの作製ＣｌａＩで処理して直線化したｐＩＴＲｓＰＡＶ３プラスミド（実施例４）
と、実施例２で調製したＰＡＶ−３ウイルスゲノムＤＮＡとをＢＪ５１８３コン
ピテントバクテリア中で同時形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。
この同時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｃｈａｒｔｉｅ
ｒＣ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６，７０，４８０５−４８１０）
中で相同組換えが行われ、ＰＡＶ−３の完全にクローニングしたゲノムを含むプ
ラスミドが得られた。このプラスミドを「ｐＰＡＶ３」とよぶ。

【００５５】実施例６ＰＡＶ−３シャトルプラスミドの作製６．１．Ｅ３領域内の６２２塩基対の欠失（小さい欠失）を伴うプラスミドの作製ｐＮＥＢ１９３プラスミド（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂカタログ番
号３０５−１）をＰａｃＩで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いで
自己再連結して「ｐＮＥＢＰａｃ−」プラスミドを得た。

【００５６】ｐＰＡＶ３プラスミド（実施例５）をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理してＥ３領
域を含む４３４４ｂｐのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離した（Ｒｅｄｄｙｅ
ｔａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，２５１，４１４−４２６）。この断片
を予めＫｐｎＩとＢａｍＨＩで処理したｐＮＥＢＰａｃ−プラスミドに導入して
「ｐＥ３ＰＡＶ３」プラスミド（図２）を得た。ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片の配
列を調べると、ＲｅｄｄｙＰ．ｅｔａｌ．が開示した配列（ＶｉｒｕｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ，１９９５，３６，９７−１０６およびＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９
８，２５１，４１４−４２６）（ＧｅｎｂａｎｋＡＮ番号Ｕｌ０４３３および
ＡＮ番号ＡＦ０８３１３２）と同一であることがわかった。当業者はこれらの参
考文献を参照することができる。

【００５７】ｐＥＧＦＰ−Ｆプラスミド（ＣｈａｌｆｉｅＭ．ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９９４，２６３，８０２−８０５；Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６０７
４−１）を修飾してポリリンカーを完全に除去した。この欠失はＢａｍＨＩで処
理した後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して得られた。こうして修飾されたベ
クターを自己再連結してｐＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドを得た。次いで、ｐＣＭ
Ｖ−ＥＧＦＰプラスミドをＡｓｎＩとＭｌｕＩ酵素で処理し、次いでＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処理して１．６−ｋｂｐＡｓｎＩ（ブラントエンド）−Ｍｌｕ
Ｉ（ブラントエンド）断片（＝ＣＭＶ−ＥＧＦＰ発現カセット）を単離した。こ
の断片を予めＢｓｒＧＩとＳｎａＢＩで処理してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理
したｐＥ３ＰＡＶ３プラスミドに導入してｐＥ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプ
ラスミド（図２）を得た。ＰＡＶ３ウイルスのＥ３領域のＢｓｒＧＩ部位とＳｎ
ａＢＩ部位との間に生じた欠失の大きさは６２２塩基対である。この欠失はＰ．
Ｒｅｄｄｙｅｔａｌ．が開示した配列のヌクレオチド１００２〜１６２４（Ｖ
ｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，３６，９７−１０６）（Ｇｅｎｂａｎ
ｋＡＮ番号Ｕｌ０４３３）に及ぶ。

【００５８】ｐＣＭＶ−ｇＤプラスミド（ＡｍｂｒｉｏｖｉｃＡ．ｅｔａｌ．Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，１９９７，２３８，３２７−３３５）をＳｎａＢＩとＣｌａＩで処理し
て１．８−ｋｂｐのＳｎａＢＩ−ＣｌａＩ断片（ＣＭＶプロモータの３'部分と
ＰＲＶｇＤ遺伝子とを含む）を単離した。次いでこの断片をＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、次いで予めＳｎａＢＩとＨｐａＩで処
理したｐＥ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドに導入して、ｐＥ３ｄｌ６
２２ＣＭＶ−ｇＤプラスミド（図２）を得た。

【００５９】６．２．Ｅ３領域内の９１９塩基対の欠失（大きい欠失）を伴うプラスミドの作製ｐＥ３ＰＡＶ３プラスミド（６．１参照）をＳｇｒＡＩとＳａｃＩで処理して
６４４ｂｐのＳｇｒＡＩ−ＳａｃＩ断片を単離した。この断片をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで処理し、ブラントエンドを作り、次いで予めＥｃｏＲＩで処理してＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＳａｃＩで処理したｐＮＥＢＰａｃ−プ
ラスミド（６．１参照）に導入してｐＳｇｒＡＩ−ＳａｃＩプラスミドを得た。ｐＥ３ＰＡＶ３プラスミドをＳｎａＢＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理して２．４−
ｋｂｐのＳｎａＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離した。この断片を予めＰｍｅＩ
とＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＳｇｒＡＩ−ＳａｃＩプラスミドに導入して、ｐ
Ｅ３ｄｌ９１９プラスミド（図３）を得た。ＰＡＶ３ウイルスのＥ３領域のＳａ
ｃＩ部位とＳｎａＢＩ部位との間に生じた欠失の大きさは９１９塩基対である。
この欠失はＰ．Ｒｅｄｄｙｅｔａｌ．が開示した配列のヌクレオチド７０６〜
１６２４（ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，３６，９７−１０６）（
ＧｅｎｂａｎｋＡＮ番号Ｕｌ０４３３）に及ぶ。

【００６０】ｐＣＭＶ−ｇＤプラスミド（実施例６．１)をＳｎａＢＩとＣｌａＩで処理し
、１．８ｋｂｐのＳｎａＢＩ−ＣｌａＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポリ
メラーゼのクレノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＳｎａＢＩとＨ
ｐａＩで処理して脱リン酸したｐＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例６．１)
に導入してｐｇＤプラスミド（図４）を得た。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例６．１)をＡｓｎＩとＭｌｕＩで処理
して１．８−ｋｂｐのＡｓｎＩ−ＭｌｕＩ断片（ＣＭＶ−ＥＧＦＰカセット）を
単離した。この断片をＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理し、ブラントエ
ンドを作り、予めＡｓｃＩで処理してＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理
してブラントエンドを作り脱リン酸したｐＥ３ｄｌ９１９プラスミドに導入して
ｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（図５)を得た。

【００６１】ｐｇＤプラスミド（上記)をＡｓｎＩとＭｌｕＩで処理して２．３−ｋｂｐの
ＡｓｎＩ−ＭｌｕＩ断片を単離した。この断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、ブラントエンドを作り、予めＡｓｃＩで処理してＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウ断片で処理してブラントエンドを作り脱リン酸したｐＥ３ｄｌ９１９プラス
ミドに導入してｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤプラスミド（図５)を得た。

【００６２】実施例７組換えゲノムｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰとｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ｇＤの作製ｐＥ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例６．１）をＫｐｎＩと
ＢａｍＨＩで処理して５．５−ｋｂｐのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離した。
この断片と、ＳｎａＢＩ酵素で処理して直線化したｐＰＡＶ３プラスミド（実施
例５）とをＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同
時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ
、ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドが得られた。ｐＥ３ＣＭＶｇＤプラスミド（実施例６．１）をＥｃｏＲＩとＰｍｅＩで処理
して６．０−ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｍｅＩ断片を単離した。この断片と、Ｓｎ
ａＢＩ酵素で処理して直線化したｐＰＡＶ３プラスミド（実施例５）とをＢＪ５
１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時形質転換によっ
てＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ、ｐＰＡＶ３ｄｌ
６２２ＣＭＶｇＤプラスミドが得られた。

【００６３】実施例８組換えゲノムｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ＥＧＦＰとｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤの作製ｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例６．２）をＨｉｎｄＩ
ＩＩで処理し、次いでＳｎａＢＩ酵素で処理して直線化したｐＰＡＶ３プラスミ
ド（実施例５）と、ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した
。この同時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換え
が行われ、ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドが得られた。ｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤプラスミド（実施例６．２）をＨｉｎｄＩＩＩ
で処理し、次いでＳｎａＢＩ酵素で処理して直線化したｐＰＡＶ３プラスミド（
実施例５）と、ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。こ
の同時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行
われ、ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤプラスミドが得られた。

【００６４】実施例９組換えゲノムｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰ、ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ｇＤ、ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰおよびｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ｇＤの作製（ＣＭＶプロモータ配列を含まないコード配列の挿入）９．１．ｐＥ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰとｐＥ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰプラスミドの作製ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例６．１)をＮｈｅＩとＭｌｕＩで処理
して１．０−ｋｂｐのＮｈｅＩ−ＭｌｕＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポ
リメラーゼのクレノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＢｓｒＧＩで
処理してＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理してブラントエンドを作り最
後にＳｎａＢＩで処理したｐＥ３ＰＡＶ３プラスミド（実施例６．１）に導入し
てｐＥ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰプラスミド（図６)を得た。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドをＮｈｅＩとＭｌｕＩで処理して１．０−ｋｂ
ｐのＮｈｅＩ−ＭｌｕＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＡｓｃＩで処理してＤＮＡポリ
メラーゼのクレノウ断片で処理して脱リン酸したｐＥ３ｄｌ９１９プラスミドに
導入してｐＥ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰプラスミド（図６)を得た。

【００６５】９．２．ｐＥ３ｄｌ６２２ｇＤとｐＥ３ｄｌ９１９ｇＤプラスミドの作製ｐｇＤプラスミド（実施例６．２)をＸｈｏＩとＣｌａＩで処理して１．５−
ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポリメラーゼの
クレノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＢｓｒＧＩで処理してＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノウ断片で処理してＳｎａＢＩで処理したｐＥ３ＰＡＶ３
プラスミド（実施例６．１）に導入してｐＥ３ｄｌ６２２ｇＤプラスミド（図７
)を得た。ｐｇＤプラスミド（実施例６．２)をＸｈｏＩとＣｌａＩで処理して１．５−
ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポリメラーゼの
クレノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＡｓｃＩで処理してＤＮＡ
ポリメラーゼのクレノウ断片で処理して最後に脱リン酸したｐＥ３ｄｌ９１９プ
ラスミド（実施例６．２）に導入してｐＥ３ｄｌ９１９ｇＤプラスミド（図７)
を得た。

【００６６】９．３．ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰ、ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ｇＤ、ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰおよびｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ｇＤプラスミドの作製ｐＥ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰプラスミド（実施例９．１）をＫｐｎＩとＢａｍＨ
Ｉで処理し、次いでＳｎａＢＩ酵素で処理して直線化したｐＰＡＶ３プラスミド
（実施例５）と、ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。
この同時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが
行われ、ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰプラスミドが得られた。ｐＥ３ｄｌ６２２ｇＤプラスミド（実施例９．２）をＥｃｏＲＩとＰｍｅＩで
処理し、次いでＳｎａＢＩ酵素で処理して直線化したｐＰＡＶ３プラスミド（実
施例５）と、ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この
同時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行わ
れ、ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ｇＤプラスミドが得られた。

【００６７】ｐＥ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰプラスミド（実施例９．１）をＨｉｎｄＩＩＩで処
理して直線化し、次いで予めＳｎａＢＩで処理したｐＰＡＶ３プラスミド（実施
例５）と、ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同
時形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ
、ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰプラスミドが得られた。ｐＥ３ｄｌ９１９ｇＤプラスミド（実施例９．２）をｉｎｄＩＩＩで処理して
直線化し、次いで予めＳｎａＢＩで処理したｐＰＡＶ３プラスミド（実施例５）
と、ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時形質
転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ、ｐＰ
ＡＶ３ｄｌ９１９ｇＤプラスミドが得られた。

【００６８】実施例１０Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにクローニングした組換えＰＡＶ３ゲノムと
のトランスフェクションによる組換えＰＡＶ３ウイルスの製造ＰＫ−１５またはＳＴ細胞（実施例１参照）と、予めＰａｃＩで処理して４〜
１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，カタログ番号１
８３２４−０１２）の存在下で株細胞に依存して希釈された２μｇの組換えＰＡ
Ｖ−３ゲノムＤＮＡとを６穴プレートで６０〜８０％の集密度までトランスフェ
クションする。供給者が推奨する条件に従ってトランスフェクションした後、この細胞をウイ
ルス性ＣＰＥが現れるまで数日間培地に置く。次いでさらに細胞の継代培養を行
い、得られた組替えウイルスを増幅させる。

【００６９】ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例７）とのトランス
フェクションによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−１が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ｇＤプラスミド（実施例７）とのトランスフェ
クションによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−２が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例８）とのトランス
フェクションによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−３が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤプラスミド（実施例８）とのトランスフェ
クションによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−４が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰプラスミド（実施例９．３）とのトランスフェ
クションによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−５が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ６２２ｇＤプラスミド（実施例９．３）とのトランスフェクシ
ョンによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−６が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰプラスミド（実施例９．３）とのトランスフェ
クションによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−７が得られた。ｐＰＡＶ３ｄｌ９１９ｇＤプラスミド（実施例９．３）とのトランスフェクシ
ョンによって組換えウイルスｖＰＡＶ３−８が得られた。

【００７０】実施例１１ｐＩＴＲｓＰＡＶ５プラスミドの作製１１．１．右末端ゲノム断片のクローニング実施例３で調製したＰＡＶ−５ウイルスのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理し
、アガロースゲル電気泳動で０．９−ｋｂｐのＥｃｏＲＩＩ右末端断片を単離
した。この断片を予めＥｃｏＲＩで処理して脱リン酸したｐＢＳ−ＫＳプラスミ
ドに導入して「ｐＫＳ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５」プラスミドを得た。ｐＫＳ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５プラスミドマトリクスと、下記のオリゴヌクレ
オチドとを用いてＰＣＡ反応を行い、１．０ｋｂｐ断片を作製した：

【００７１】

【化６】

【００７２】

【化７】

【００７３】この断片をｐＣＲＩＩプラスミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＯｒｉｇｉｎａｌ
ＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ，カタログ番号Ｋ２０００−０１）に導入して「ｐ
ＣＲ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５」プラスミド（図８）を得た。

【００７４】１１．２．左末端ゲノム断片のクローニング実施例３で調製したＰＡＶ−５ウイルスのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで処
理し、アガロースゲル電気泳動を行って、１．２−ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ左末
端断片を単離した。この断片を予めＨｉｎｄＩＩＩで処理して脱リン酸したｐＢ
Ｓ−ＫＳプラスミドに導入して「ｐＫＳ−ＬｅｆｔＩＴＲ５」プラスミドを得
た。ｐＫＳ−ＬｅｆｔＩＴＲ５プラスミドマトリクスと、下記のオリゴヌクレオチ
ドとを用いてＰＣＡ反応を行い、１．３ｋｂｐ断片を作製した：

【００７５】

【化８】

【００７６】

【化９】

【００７７】この断片をｐＣＲＩＩプラスミドに導入して「ｐＣＲ−ＬｅｆｔＩＴＲ５」
プラスミド（図８）を得た。

【００７８】１１．３．ｐＰｏｌｙＩＩ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５プラスミドの作製ｐＣＲ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５プラスミド（実施例１１．１）をＢａｍＨＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで処理して１．０ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単
離した。この断片を予めＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＰｏｌｙＩＩ
プラスミド（実施例４参照）に導入して、「ｐＰｏｌｙＩＩ−ＲｉｇｈｔＩＴ
Ｒ５」プラスミド（図８）を得た。

【００７９】１１．４．ｐＩＴＲｓＰＡＶ５プラスミドの作製ｐＣＲ−ＬｅｆｔＩＴＲ５プラスミド（実施例１１．２）をＢａｍＨＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩで処理して１．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離
した。この断片を予めＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＰｏｌｙＩＩ―
Ｒｉｇｈｔプラスミドに導入して、「ｐＩＴＲｓＰＡＶ５」プラスミド（図８
）を得た。

【００８０】実施例１２ｐＰＡＶ５プラスミドの作製ｐＩＴＲｓＰＡＶ５プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで処理して直線化した。得
られた断片を次いで実施例３で調製したＰＡＶ−５ウイルスのゲノムＤＮＡと、
ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時形質転換
によって相同組換えが行われ、ＰＡＶ−５ウイルスの全てのゲノムを含むプラス
ミドが得られた。このプラスミドは「ｐＰＡＶ５」と呼ばれる。

【００８１】実施例１３ＰＡＶ−５シャトルプラスミドの作製１３．１．Ｅ３ＰＡＶ−５シャトルプラスミドの作製ｐＰＡＶ５プラスミド（実施例１２）をＳａｃＩとＭｌｕＩで処理してＥ３領
域を含む４３７２ｂｐのＳａｃＩ−ＭｌｕＩ断片を単離した。この断片を予めＳ
ｍａＩとＡｓｃＩで処理したｐＮＥＢ１９３プラスミド（実施例６．１）に導入
して「ｐＥ３ＰＡＶ５」プラスミド（図９）を得た。ｐＥ３ＰＡＶ５プラスミドにクローニングしたＳａｃＩ−ＭｌｕＩ断片は完全
に配列決定されていた。この配列と、ｐＰＡＶ５上に存在する隣接する配列の分
析から、クローニングされた断片が実際にＰＡＶ−５ウイルスのＥ３領域である
ことが確認された。この領域の配列（５６１４塩基対）（配列ＩＤ番号５）は図
１３に示されている。

【００８２】１３．２．Ｅ３領域内の１４７２塩基対の欠失を伴うドナーＣＭＶ−ＥＧＦＰとＣＭＶ−ＰＲＶｇＤプラスミドの作製ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例６．１）をＡｓｎＩとＭｌｕＩ酵素で処
理し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して１．６ｋｂｐのＡｓｎＩ（ブラ
ントエンド）−ＭｌｕＩ（ブラントエンド）断片を単離した。この断片を予めＰ
ｖｕＩＩとＢｇｌＩで処理してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐＥ３ＰＡＶ
５プラスミド（実施例１３．１参照）に導入して、ｐＥ３ｄｌ１４７２ＣＭＶ−
ＥＧＦＰプラスミド（図１０）を得た。ＰｖｕＩＩ部位とＢｇｌＩ部位との間に
導入された欠失の大きさは１４７２ｂｐである。この欠失は図１３に示された配
列（配列ＩＤ番号５）のヌクレオチド２３８９〜３８６１である。

【００８３】ｐｇＤプラスミド（実施例６．１)をＡｓｎＩとＭｌｕＩ酵素で処理し、２．
３ｋｂｐのＡｓｎＩ−ＭｌｕＩ断片を単離した。この断片をＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで処理し、ブラントエンドを作り、予めＰｖｕＩＩとＢｇｌＩで処理してＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐＥ３ＰＡＶ５プラスミドに導入してｐＥ３ｄ
ｌ１４７２ＣＭＶｇＤプラスミド（図１０）を得た。ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドをＮｈｅＩとＭｌｕＩで処理して１．０−ｋｂ
ｐのＮｈｅＩ−ＭｌｕＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＰｖｕＩＩとＢｇｌＩで処理し
てＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐＥ３ＰＡＶ５プラスミドに導入してｐＥ
３ｄｌ１４７２ＥＧＦＰプラスミド（図１１)を得た。

【００８４】ｐＣＭＶｇＤプラスミド（実施例６)をＸｈｏＩとＣｌａＩで処理して１．５
−ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片を単離した。この断片をＤＮＡポリメラーゼ
のクレノウ断片で処理し、ブラントエンドを作り、予めＰｖｕＩＩとＢｇｌＩで
処理してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理したｐＥ３ＰＡＶ５プラスミドに導入し
てｐＥ３ｄｌ１４７２ｇＤプラスミド（図１２)を得た。

【００８５】実施例１４組換えゲノムｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ＥＧＦＰとｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ｇＤの作製ＰｍｅＩで直線化したｐＥ３ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施
例１３．２）と、ＢａｍＨＩ酵素で一部処理して直線化したｐＰＡＶ５プラスミ
ド（実施例１２）（制限細断片ＢａｍＨＩＡ−ＢａｍＨＩＤの連結部位、図１
２）とをＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時
形質転換によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ、
ｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドが得られた。ＰｍｅＩで処理したｐＥ３ｄｌ１４７２ＣＭＶｇＤプラスミド（実施例１３．
２）と、ＢａｍＨＩ酵素で一部処理して直線化したｐＰＡＶ５プラスミド（実施
例１２）（制限細断片ＢａｍＨＩＡ−ＢａｍＨＩＤの連結部位、図１２）とを
ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時形質転換
によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ、ｐＰＡＶ
５ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ｇＤプラスミドが得られた。

【００８６】実施例１５組換えゲノムｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＥＧＦＰとｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ｇＤの作製（ＣＭＶプロモータ配列を含まないコード配列の挿入）ＰｍｅＩで直線化したｐＥ３ｄｌ１４７２ＥＧＦＰプラスミド（実施例１３．
２）と、ＢａｍＨＩ酵素で一部処理して直線化したｐＰＡＶ５プラスミド（実施
例１２）（制限細断片ＢａｍＨＩＡ−ＢａｍＨＩＤの連結部位、図１２）とを
ＢＪ５１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時形質転換
によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ、ｐＰＡＶ
５ｄｌ１４７２ＥＧＦＰプラスミドが得られた。ＰｍｅＩで処理したｐＥ３ｄｌ１４７２ｇＤプラスミド（実施例１３．２）と
、ＢａｍＨＩ酵素で一部処理して直線化したｐＰＡＶ５プラスミド（実施例１２
）（制限細断片ＢａｍＨＩＡ−ＢａｍＨＩＤの連結部位、図１２）とをＢＪ５
１８３コンピテントバクテリア中で同時形質転換した。この同時形質転換によっ
てＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で相同組換えが行われ、ｐＰＡＶ５ｄｌ
１４７２ｇＤプラスミドが得られた。

【００８７】実施例１６Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにクローニングした組換えＰＡＶ５ゲノムと
のトランスフェクションによる組換えＰＡＶ５ウイルスの製造ＰＫ−１５またはＳＴ細胞（実施例１参照）と、予めＰａｃＩで処理して４〜
１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，カタログ番号１
８３２４−０１２）の存在下で株細胞に依存して希釈された２μｇの組換えＰＡ
Ｖ−５ゲノムＤＮＡとを６穴プレートで６０〜８０％の集密度までトランスフェ
クションする。供給者が推奨する条件に従って、トランスフェクションした後、この細胞をウ
イルス性ＣＰＥが現れるまで数日間培地に置く。次いで継代を行い、得られた組
替えウイルスを増幅させる。

【００８８】ｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（実施例１４）とのトラ
ンスフェクションによって組換えウイルスｖＰＡＶ５−１が得られた。ｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＣＭＶ−ｇＤプラスミド（実施例１４）とのトランス
フェクションによって組換えウイルスｖＰＡＶ５−２が得られた。ｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ＥＧＦＰプラスミド（実施例１５）とのトランスフェ
クションによって組換えウイルスｖＰＡＶ５−３が得られた。ｐＰＡＶ５ｄｌ１４７２ｇＤプラスミド（実施例１５）とのトランスフェクシ
ョンによって組換えウイルスｖＰＡＶ５−４が得られた。

【００８９】実施例１９本発明のワクチンの製造本発明に従って得られた組換えウイルスをＰＫ１５細胞培地で培養して増やす
。完全な細胞変性効果が見られた後に上澄みを回収した。低速での遠心分離によ
って清澄化し、細胞片を除去し、その後、遠心分離によってビリオンを濃縮し、
ウイルスのペレットを洗浄し、このペレットを培地溶液に取る。次いで、最終の
ウイルス力価が１０⁴ ５０％細胞培養感染投与量（ＣＣＩＤ₅₀）〜１０⁷ＣＣＩ
Ｄ₅₀／ｍｌになるように、ウィルスの力価を必要に応じて希釈して調整する。次いでウイルス懸濁液を凍結、好ましくは凍結乾燥基質の存在下で凍結乾燥す
る。

【００９０】実施例２０ブタのワクチン接種凍結乾燥させた投与量を解凍または水中に取り、必要に応じてアジュバントを
添加して注射用製剤を作り、各組換えウイルスを１０⁴〜１０⁷ＣＣＩＤ₅₀の投与
量でブタに接種する。このワクチンは異なる免疫原を発現する一つまたは複数の
組換えＰＡＶウイルスを含んでいる。ワクチンは注射針（筋肉経路）によって投与量２ｍｌで投与されるか、粘膜経
路（鼻腔内経路または点眼）によって投与される（投与量は各経路に合わせる）
。ＰＩＧＪＥＴ装置（ＳｏｃｉｅｔｅＥｎｄｏｓｃｏｐｔｉｃ，Ｌａｏｎ，Ｆ
ｒａｎｃｅ）等の針のない注射器を用いて皮内投与することもできる。

【００９１】実施例２１仮性狂犬病用のワクチン接種／試験プロトコルワクチン接種／試験プロトコルを用いてアジュバントを含まない組換えｖＰＡ
Ｖ３−２ウイルス（本発明の実施例１０）の懸濁液からなるワクチンの効力を評
価した。妊娠初期に仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）に対するワクチン接種をした雌豚か
ら生まれた８〜１０才の６匹の子豚からなる複数の群を作った。全ての子豚がワ
クチン接種の日Ｄ０に母体の抗ＰＲＶ抗体を有することは明らかである。１群お
よび２群の子豚にはＤ０の日に力価が１０⁷ＣＣＩＤ₅₀／ｍｌ（鼻孔当たり０．
５ｍｌ）の組換えウイルスｖＰＡＶ３−２（ＰＡＶ−３／ＰＲＶｇＤ）の懸濁
液１ミリリットル（ｍｌ）を鼻腔内にワクチン接種した。２群には同じ日にワク
チン接種したが、Ｄ２１の日にも２回目の投与を行った。３群にはＤ０の日に力
価が１０⁷ＣＣＩＤ₅₀／ｍｌのＰＡＶ−３／ｇＤのウイルス懸濁液１ｍｌを筋肉
内投与した。４群には３群と同様にワクチン接種したが、Ｄ２１の日に２回目の
ウイルス懸濁液の投与を行った。５群にはワクチン接種をせずに試験用の負対照
群の役目をさせた。

【００９２】Ｄ３５の日に力価が少なくとも１０^7.3ｐｆｕ／ｍｌのＰＲＶＮＩＡ３株の懸
濁液２ｍｌ（鼻腔当たり１ｍｌ）を投与して全ての群を試験した。試験後、重量変化の基準（ｄｅｌｔａＧ７）（ＳｔｅｌｌｍａｎｎＣ．ｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ，１９８９，１７，１−１１）（試験
後Ｄ０〜Ｄ７）および鼻腔粘膜経路によるウイルス排出レベルに基づいて、さら
に、ＥＬＩＳＡ抗体力価および抗ＰＲＶ血清中和力価に基づいてブタを観察した
。添付の請求の範囲によって定義される本発明は上記の特定の実施例に限定され
るものではなく、本発明の範囲および精神から逸脱しない変形例を包含するとい
うことは理解できよう。

【配列表】

配列ＩＤ番号１＝オリゴヌクレオチドＩＴＲＰＡＶ３配列ＩＤ番号２＝オリゴヌクレオチドＴ３配列ＩＤ番号３＝オリゴヌクレオチドＴ７配列ＩＤ番号４＝オリゴヌクレオチドＩＴＲＰＡＶ５配列ＩＤ番号５＝ＰＡＶ−５ウイルスのＥ３領域の配列

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＫＳ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ３、ｐＰｏｌｙＩＩ−ＲｉｇｈｔＩ
ＴＲ３およびｐＩＴＲｓＰＡＶ３プラスミドの模式図

【図２】ｐＥ３ＰＡＶ３、ｐＥ３ｄｌ６２２ＣＭＶ−ＥＧＦＰおよびｐＥ３
ｄｌ６２２ＣＭＶ−ｇＤプラスミドの模式図

【図３】ｐＥ３ＰＡＶ３およびｐＥ３ｄｌ９１９の制限地図

【図４】ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ｇＤおよびｐｇＤプラスミドの模
式図

【図５】ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐｇＤ、ｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ＥＧＦＰ
およびｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤプラスミドの制限地図

【図６】ｐＥ３ｄｌ６２２ＥＧＦＰおよびｐＥ３ｄｌ９１９ＥＧＦＰプラス
ミドの制限地図

【図７】ｐＥ３ｄｌ６２２ｇＤおよびｐＥ３ｄｌ９１９ＣＭＶ−ｇＤプラス
ミドの制限地図

【図８】ｐＣＲ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５、ｐＣＲ−ＬｅｆｔＩＴＲ５、ｐＰ
ｏｌｙＩＩ−ＲｉｇｈｔＩＴＲ５およびｐＩＴＲ−ＰＡＶ５プラスミドの制限
地図

【図９】ｐＥ３ＰＡＶ５プラスミドの制限地図

【図１０】ｐＥ３ｄｌｎ４７２ＣＭＶ−ＥＧＦＰおよびｐＥ３ｄｌ１４７２
ＣＭＶ−ｇＤプラスミドの制限地図

【図１１】ｐＥ３ｄｌ１４７２ＥＧＦＰおよびｐＥ３ｄｌ１４７２ｇＤプラ
スミドの制限地図

【図１２】ＢａｍＨＩで消化したＰＡＶ−５の物理地図

【図１３】５６１４塩基対の配列（Ｅ３領域および隣接するＰＡＶ−５ウイ
ルスの配列）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クロンジュコワスキ，ベルナール，ジョルジュフランス国 75012 パリブルヴァールドゥピクピュス 12−14 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA32 CA04 CA06 DA02 EA02 GA11 HA17 4B065 AA95X AA95Y AA99Y AB01 AC20 BA01 CA45 4C085 AA03 AA38 BA77 CC08 DD62 EE01 EE06 FF17 GG10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ブタアデノウイルスのゲノムにヘテロな塩基配列が挿入され、
このヘテロな塩基配列はインビボで複製でき且つ発現できる条件下で挿入された
ものであり且つアデノウイルスゲノムがセロタイプ３または５のアデノウイルス
（ＰＡＶ−３またはＰＡＶ−５）に由来することを特徴とするインビボで複製可
能な組換えブタアデノウイルス。
【請求項２】ヘテロな塩基配列がブタアデノウイルスのＥ３領域の本質的で
ない領域に挿入される請求項１に記載のブタアデノウイルス。
【請求項３】ヘテロな塩基配列がブタアデノウイルスのＥ３領域の本質的で
ない領域に欠失を伴って挿入される請求項１に記載のブタアデノウイルス。
【請求項４】アデノウイルスゲノムがＰＡＶ−３に由来し、ヘテロな塩基配
列がＥ３領域のヌクレオチド７０６〜１６２４からなる領域に挿入される請求項
１〜３のいずれか一項に記載のブタアデノウイルス。
【請求項５】ヘテロな塩基配列がＥ３領域のヌクレオチド７０６〜１６２４の
代わりに挿入される請求項４に記載のブタアデノウイルス。
【請求項６】アデノウイルスゲノムがＰＡＶ−５に由来し、ヘテロな塩基配
列が配列ＩＤ番号５のヌクレオチド２０６４〜４０８３、特に２３８９〜３８６
１の全部または一部を含む領域に挿入される請求項１〜３のいずれか一項に記載
のブタアデノウイルス。
【請求項７】ヘテロな塩基配列が配列ＩＤ番号５のヌクレオチド２０６４〜
４０８３、特に２３８９〜３８６１の代わりに挿入される請求項６に記載のブタ
アデノウイルス。
【請求項８】ヘテロな塩基配列が免疫原または免疫学的活性断片または免疫
原、ブタの病原のエピトープをコードし、および／または免疫調節物質をコード
する請求項１〜７のいずれか一項に記載のブタアデノウイルス。
【請求項９】複数のヘテロな塩基配列が挿入されている請求項１〜８のいず
れか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】ポリエピトープ配列が挿入される請求項１〜８のいずれか一
項に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】ＩＲＥＳ配列が挿入される請求項１〜８のいずれか一項に記
載のアデノウイルス。
【請求項１２】ウイルス、バクテリアおよび寄生虫からなる群の中から選択
されるブタの病原物質に由来するヘテロな塩基配列からなる請求項１〜１１のい
ずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ生
殖器および呼吸器症候群ウイルス、パルボウィルス、雄ブタコレラウイルス、タ
イプ２のブタサーコウイルス、アクシノバシラスプルーノニューモニア(Ａｃｔ
ｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ)およびミコプラス
マヒオニューモニア(Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ)からな
る群の中から選択されるブタの病原物質に由来するヘテロな塩基配列を含む請求
項１２に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】ヘテロな塩基配列が仮性狂犬病ウイルスのｇＢ遺伝子、ｇＣ
遺伝子またはｇＤ遺伝子、ブタインフルエンザウイルスＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子
またはＮＰ遺伝子、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスのＯＲＦ４遺伝子ま
たはＯＲＦ７遺伝子、雄ブタコレラウイルスのＥ１遺伝子またはＥ２遺伝子、パ
ルボウィルスのＶＰ２遺伝子、タイプ２のブタサーコウイルスのＯＲＦ１遺伝子
またはＯＲＦ２遺伝子、およびこれらの遺伝子の免疫学的活性断片およびエピト
ープからなる群の中から選択される請求項１３に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】ブタサイトカインをコードするヘテロな塩基配列を含む請求
項１〜１４のいずれか一項に記載のブタアデノウイルス。
【請求項１６】ブタサイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１２お
よびＩＬ−１８からなる群の中から選択される請求項１５に記載のアデノウイル
ス。
【請求項１７】請求項１〜１６のいずれか一項に記載のブタアデノウイルス
と、獣医学上許容されるビヒクルまたは賦形剤とを含む組換えブタワクチン。
【請求項１８】異なるヘテロな塩基配列からなる請求項１〜１６のいずれか
一項に記載の複数のブタアデノウイルスを含む請求項１７に記載の組換えブタワ
クチン。
【請求項１９】アジュバントを含む請求項１７または１８に記載の組換えブ
タワクチン。
【請求項２０】アジュバントがアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーま
たは無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーから選択される請求項１
９に記載の組換えブタワクチン。
【請求項２１】アジュバントがカルボマー(carbomere)である請求項２０に
記載の組換えブタワクチン。
【請求項２２】インビボで複製可能で且つゲノムの本質的でない領域で欠失
しているセロタイプ３または５のアデノウイルス性ベクター。
【請求項２３】インビボで複製可能で且つＥ３領域で欠失しているセロタイ
プ３または５のアデノウイルス性ベクター。
【請求項２４】Ｅ３領域のヌクレオチド７０６〜１６２４を欠失したセロタ
イプ３のブタアデノウイルスを含む請求項２３に記載のブタアデノウイルス性ベ
クター。
【請求項２５】Ｅ３領域内の欠失が本質的にヌクレオチド７０６〜１６２４
の欠失からなる請求項２４に記載のブタアデノウイルス性ベクター。
【請求項２６】配列ＩＤ番号５のヌクレオチド２０６４〜４０８３、特に２
３８９〜３８６１の全部または一部を含む領域を欠失したセロタイプ５のブタア
デノウイルスを含む請求項２３に記載のブタアデノウイルス性ベクター。
【請求項２７】配列ＩＤ番号５のヌクレオチド２０６４〜４０８３、特に２
３８９〜３８６１を欠失した請求項２６に記載のブタアデノウイルス性ベクター
。
【請求項２８】Ｅ３領域を含み且つ特定のＰＡＶ−５株中に配列ＩＤ番号５
の塩基配列を有する、ＰＡＶ−５の塩基配列の全部または一部を含むＤＮＡ断片
。
【請求項２９】Ｅ３領域に対応しかつ特定の株において配列ＩＤ番号５のヌ
クレオチド２３８２〜４０４２に定義のＰＡＶ−５の塩基配列を含むＤＮＡ断片
。