KR20010086357A - 재조합 ｃｅｌｏ 바이러스 및 ｃｅｌｏ 바이러스 ｄｎａ - Google Patents
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Abstract
큰 외부 DNA 조각의 삽입을 허용하는 바이러스 게놈의 우측단에 결실을 갖는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA. 바이러스는 동물, 특히 새에 대한 백신으로서, 및 인간에서 유전자 치료 및 백신 적용에 유용하다. 바이러스는 또한 재조합 단백질 생산에 사용될 수 있다.
Description
아데노바이러스는 mRNA 스플라이싱, DNA 복제, 전사 및 세포 형질전환(44에서 리뷰)을 포함하는 분자 생물학에서 매우 중요한 발견을 위한 모델로서 또한 보다 최근에는 일시적인 유전자 발현을 위한 강력한 도구(12, 46)로서 인간 질병에서의 그의 역할(25)에 대해 연구되어 왔다. 아데노바이러스의 생활사에 대한 상세한 연구가 잘 확립되어 있다(50에서 리뷰(reviewed)). 유전자 전달 벡터로서 아데노바이러스를 이용하는 초기 노력이래로(18, 52, 28), 이 바이러스는 벡터로서 인기를 얻었고, 신규한 유전자를 수반하는 바이러스 게놈에서 변형을 일으키는 다수의 방법이 개발되었다(2, 5, 11, 15, 21, 23, 26, 32, 38, 41, 43, 31에서 리뷰된 48, 49). 벡터 작제 및 정제의 용이성 때문에, 및 이들 벡터가 생체내에서 다양한 포유동물 세포형에서 신규의 유전자 물질을 일시적으로 형질도입하는 효능있는 능력을 가졌기 때문에, 아데노바이러스가 임상적 유전자 치료에서의 초기 노력에서 광범위하게 사용되었다.
불행하게도, 초기에 사용된 아데노바이러스 5형(Ad5)에 기초한 벡터의 수개의 특징이 초기 적용에서 성공을 제한하였다. 이들은 아데노바이러스에 대한 숙주의 면역 반응(참조문헌 55에서 리뷰) 및 바이러스가 특정의 표적 세포형에 효율적으로 도입되는 것의 실패(20, 58, 59)를 포함한다. 따라서, 덜 공격적인 숙주 면역 반응을 일으킬 수 있고, 보다 높은 효율로 표적 세포로 도입될 수 있는 아데노바이러스 형에 관심이 현재 두어지고 있다.
많은 수의 대체 아데노바이러스 혈청형이 알려져 있고, 일부 적용에서 Ad5-기초 벡터에 대해 잇점을 제공할 수 있다. 최근 벡터로서 변형된 추가의 아데노바이러스는 양 아데노바이러스 287(29, 53, 56), 소 아데노바이러스 3형(40, 60) 및 개 아데노바이러스(30)을 포함한다. 이들 대체 혈청형은 표적 세포에서 어떤 예비-존재 면역 반응이 없는 신규 벡터 백본(backbone)을 제공하는 것으로 여겨진다. 또한, 아데노바이러스는 그들의 복제 능력에서 매우 특이적인 종이기 때문에(5), 부적절한 벡터 복제에 대한 일정 보호도가 거리가 먼 아데노바이러스 종으로부터 유래된 바이러스를 사용하여 얻어진다.
이들 대체 바이러스 서브형을 추구하기위한 몇가지 사유가 있다. 비-인간 숙주에서 백신 적용 경우, 이들 바이러스는, 적절하게 변형된다면, 인간 아데노바이러스 기초한 벡터보다 효과적인 면역 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 보다 강한 면역반응이 복제 가능한 바이러스로부터 기대될 수도 있다; 따라서, 벡터는 복제가 부분적으로 또는 완전히 허용되는 숙주에서 가장 유용하다. 이는 거의 모든 비인간 숙주에서의 인간 아데노바이러스 기초 벡터경우는 그렇지 않다.
본 발명은 바이러스 벡터 및 바이러스 DNA에 관한 것이다.
도 1은 야생형 및 돌연변이체 CELO 게놈을 수반하는 플라스미드의 작제이다.
도 1a는 CELO 게놈의 말단을 갖는 플라스미드의 작제이다.
도 1b는 박테리아플라스미드로서 완전 길이의 CELO 게놈의 클로닝이다.
도 1c는 CELO 게놈의 변형된 버전의 클로닝이다.
도 2는 CELO 좌측단의 돌연변이의 분석이다.
도 2, 상부 패널:오픈 리딩 프레임
도 2, 하부 패널: 복제의 분석
도 3은 CELO 우측단 돌연변이의 분석
도 3, 상부 패널: 오픈 리딩 프레임
도 3, 하부 패널: 복제의 분석
도 4는 wt CELO 대 CELO AIM46의 PCR 분석이다.
도 5는 야생형 CELO 대 CELO AIM46의 복제를 추적하는 면역형광이다.
도 6은 AIM46 대 AdLuc의 열안정성이다.
도 7은 CELO 대 Ad5의 친화성이다.
도 8은 재조합형 Ad5 또는 CELO 벡터를 사용한 EGFP의 형질도입이다.
도 9는 CELO 좌측단의 돌연변이의 분석이다.
도 9, 상부 패널: 오픈 리딩 프레임
도 9, 하부 패널: 복제의 분석
도 10은 상이한 동물종에 대한 CELO AIM46의 친화성이다.
도 11은 CELO AIM46 유도체에 의한 재조합형 GFP의 생성이다.
도 12는 CELO AIM46 유도체에 의한 가용성 Fc-안정화된 재조합형 단백질의 생산이다.
달리 언급되지 않는 한, 하기 물질 및 방법이 실시예에서 사용되었다:
a) CELO 게놈의 말단 단편의 클로닝
CELO의 두 개의 말단 HindIII 단편을 클로닝시켰다. CELO 게놈 DNA(CsCl 정제된)을 HindIII로 분해하고, 1601 bp 좌측단 및 959 bp 좌측단 단편을 저융점 아가로즈 겔로부터 정제하였다. 아데노바이러스 게놈의 5' 말단을 바이러스 말단 단백질상의 세린 잔기에 포스포디에스테르 결합에 의해 결합시켰다(22, 47). 프로테인아제 분해후 남아있는 펩타이드를 결찰 및 클로닝을 가능하게 하기 위하여 제거하여야 한다. 따라서, 말단 펩타이드를 NaOH를 0.3N 까지 첨가하고 37℃에서 90분간 가열하여 DNA 단편으로부터 제거하였다(22). 이어서 용액을 실온으로 냉각시키고, 트리스 pH 7.4를 0.1M까지 첨가하고, HCl을 0.3M 까지 첨가하여 NaOH를 중화시켰다. 단편을 56℃까지 20분간 가열하고, 실온으로 서서히 냉각시켜(1시간) 리어닐링을 조장했다. 이어서 DNA를 정제하고(Qiaquick column, Quiagen), SpeI 링커(New England Biolabs cat #1085)를 첨가하며, 각 단편을 SpeI 및 HindIII 부위를 통해 파괴된 EcoR1 부위에 SpeI 부위를 함유하는 pBR327(GenBank L08856, 참조 51) 유도체에 클로닝시켰다(참조 도 1a). 좌측 및 우측 말단 HindIII단편을 상기와 같은 방법으로 클로닝시켜 DNA 서열 분석을 수행하여 양 단편의 말단 300 bp를 입증했다.
이어서, 두 개의 CELO 말단 단편을 SpeI 부위, 파괴된 EcoRI 부위 및 제 2 Hind III 부위를 제거하는 ClaI/BamHI 절제부를 함유하는 pBR327 유도체에 클로닝시켜, 플라스미드 pWue-H35를 만들었다(도 1a 참조).
b) 전 CELO 게놈의 클로닝
HindIII-선형화된, 알칼리성 포스파타제 처리된 pWue-H35 벡터를 정제된 CELO 바이러스 DNA와 혼합하여 일렉트로포레이션에 의해 일렉트로캄피턴트 (electrocompetent) 이. 콜라이 JC8679에 도입하였다. pWue-H35상의 CELO 말단 서열과 CELO 게놈 DNA사이의 재조합이 SpeI 부위가 인접하는 완전 길이의 CELO 게놈(pCELO)을 함유하는 플라스미드를 생성하였다.
c) CELO 게놈의 좌측단에서 변형
시토메갈로바이러스 바로 앞의 인핸서/프로모터, 토끼 β글로빈 인트론/폴리아데닐화 신호가 이어지는 루시페라제 cDNA(14)를 pCLuc(45)로부터 유도하여, PCR에 의해 변형시켜 인접 BamI 부위를 첨가하고 pBlueScript II(SK)에 클로닝시켜 pBlueLuc를 만들었다. 대부분의 CELO 삽입 경우, 루시페라제 카세트를 BamH1분해에 의해 pBlueLuc로부터 단리하고, 말단을 클레노우(klenow) 효소로 처리하여 블런트화시켰다.
좌측단 CELO 영역을 pBR327 백본에 CELO 좌측단(nt 1 내지 5501) 및 우측단의 일부분(nt 30500 내지 30639 및 nt 40065 내지 43804; pWueHpa로부터 Asp718을 제거하여 유도된)을 함유하는 pAIM3를 사용하여 변형시켰다. CELO 게놈에서의 결실은 CELO 좌측 단 서열중의 두 개의 효소 부위에서 pAIM3을 분해하고, 서브영역을 절제하고 루시페라제 카세트를 삽입하는 것을 포함한다. 모든 조작은 제한 분석 및 서열 분석에 의해 확인하였다. 이 전략은 전달 플라스미드 pAIM7, 16, 22, 23 및 24를 만드는데 사용하였다(참조 표 1). CELO 뉴클레오타이드 서열 넘버링은 참조 6 및 GenBank U46933으로부터 유래되었다.
d) 재조합 CELO 게놈의 생성
플라스미드 pAIM7, 16, 22, 23 및 24를 Asp718 및 HpaI를 사용하는 이중 분해에 의해 선형화시키고 이. 콜라이 BJ5183(5, 13)에서 상동성 재조합을 사용하여 정제된 CELO DNA와 재조합하여 CELO 게놈 플라스미드 pAIM11, 21, 25, 26 및 27을 만들었다. 도 1c 및 표 1은 적용된 기술을 예시한다.
도 1c는 CELO 게놈의 변형된 버전의 클로닝을 나타낸다. 단계 1: 전달 벡터를 CELO 게놈의 부분들을 결실시키고 루시페라제 카세트를 삽입시키기위하여 표준 결찰 클로닝 방법을 사용하여 pWue-H35(CELO의 말단 HindIII 단편을 갖는) 또는pWueHpa(CELO의 말단 Hpa I 단편을 갖는)로서 CELO게놈의 서브단편을 조작하여 제조하였다. 단계 2: 선형화된 전달 벡터를 야생형 게놈 CELO DNA와 재조합시켰다. 재조합은 결실/루시페라제 카세트를 포함하거나 결실/루시페라제 카세트를 배제하여 야생형 CELO 플라스미드를 만드는 두가지 방법으로 일어난다. 원하는 돌연변이를 갖는 플라스미드는 제한효소 분해 및 서열화에 의해 동정하고, 바이러스 감염을 개시하는데에 사용하였다(모든 작제물은 결실된 영역을 가로질러 서열화하여 작제물을 입증하였다; 표 1 참조).
e) CELO 게놈의 우측단에서의 변형
상기 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여, CELO의 좌측 및 우측 HpaI 단편을 함유하는 플라스미드를 만들고 조작하여 루시페라제 카세트를 삽입하고, 33358-43684(pAIM43) 또는 41731-43684(pAIM44)로부터 EcoRV 단편을 제거하였다. 이들 플라스미드를 독특한 Hpa I 부위에서 선형화시키고, BJ5183 세포에서 야생형 CELO DNA와 재조합시켜 pAIM45 또는 pAIM46을 만들었다.
f) LMH 세포상의 재조합 CELO 게놈의 평가 및 바이러스 저장물의 제조
재조합형 CELO 플라스미드를 SpeI로 분해하여 플라스미드로부터 바이러스 게놈을 방출하고, 페놀, 클로로포름으로 추출하고, 이어서 TE로 평형화된 겔 여과(Pharmacia Nick Column)에 의해 정제하였다.
트랜스펙션 복합체를 PEI 기술의 변형(1, 3)을 사용하여 제조하였다. DNA를 하기와 같이 두단계에서 PEI로 응축시켰다: PEI MW 2000(125㎕ HBS(150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4)중의 10mM PEI 2.5 ㎕)을 125 ㎕ HBS중에 희석된 3 ㎍의 DNA에 적가하였다. 샘플을 실온에서 20분동안 인큐베에션했다. 이어서, PEI MW 25000(125 ㎕의 HBS중의 10 mM의 3.5㎕)을 샘플에 적가하고, 복합체를 실온에서 추가로 20분동안 인큐베이션했다.
레그혼 숫컷 헤파토마(Hepatoma)(LMH) 세포(27)를 26웰 플레이트에 7x104세포/웰(24웰 디시)로 트랜스펙션 전날 씨딩했다(seeded). 트랜스펙션을 위하여 세포 배양 배지를 10㎍/ml 폴리믹신 B가 보충된 400 ㎕의 DMEM(혈청없음)으로 대체했다. 트랜스펙션 복합체(웰당 90㎕)를 37℃에서 4시간동안 세포에 첨가하고, 그후 배지를 새로운, 혈청을 함유하는 배지로 대체했다. 트랜스펙션 효율은 트랜스펙션 24시간후 세포 용균물에서 루시페라제 활성을 측정하여 추적하였다.
바이러스의 증폭을 시험하기 위하여, 트랜스펙션된 또는 형질도입된 세포로부터의 맑아진 용균물을 다음과 같이 제조하였다. 세포 더하기 상등액을 수확하고, 원심분리에 의해 수집하여 세포 펠리트를 2 ml의 처리된 상등액에 재현탁시켰다. 물질을 3회 냉동시키고 해동시키고, 배쓰 소니케이터에서 초음파 처리하여 바이러스 입자를 방출시키며, 세포 조각을 원심분리에 의해 제거하여 맑아진 용균물을 LMH 세포의 새로운 배양물에서 추가의 증폭을 위하여 사용하였다. CsCl 구배에 의한 CELO 정제는 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다(9). 바이러스를 3.4 x 1012바이러스 입자/ml에 상응하는 1 mg/ml 단백질의 전환 인자(34)로 단백질 함량을 기초로해서 정량화했다.
(g) CELO AIM46 유도체(CELO AIM53)을 발현하는 EGFP의 작제
pAIM46중의 루시페라제 cDNA를 EGFP cDNA로 대체하여 pAIM53을 만들었다. 이.콜라이에서 루시페라제 cDNA중의 독특한 PacI 부위에서 선형화된 pAIM46과 pAIM46의 루시페라제 카세트에서 사용된 동일한 CMV 프로모터의 조절하에 있는 EGFP cDNA 및 β-글로빈 인트론 및 폴리아데닐화 시그날을 수반하는 전달 플라스미드, pAIM52사이의 상동성 재조합에 의해 대체를 하여 재조합에 대한 상동성을 얻었다.
h) pPM7의 작제
전달 플라스미드 pPM7은 PacI, HpaI 및 KpnI 부위를 갖는 짧은 폴리링커가 이어지고, 토끼 β-글로빈 인트론/폴리아데닐화 시그날이 이어지는 시토메갈로바이러스 바로 앞의 인핸서/프로모터를 함유한다. 이는 다음과같이 수득된다: CMV/β-글로빈 물질을 pCLuc로부터 유도하고(74), 인접 BamH1을 첨가하도록 PCR로 변형하고, 상동성 재조합에 의해 변형하여, 루시페라제 cDNA를 PacI/HpaI/KpnI 폴리링커로 대체하였다. 최종 BamHi 카세트를 pSP65에 클로닝시켜 pPM7을 만들었다.
j) 재조합 5형 아데노바이러스의 제조
AdLuc: 루시페라제 카세트를 인접 BamHI 부위를 통해 pDE1sp1B에 클로닝시켜(2), 루시페라제 cDNA가 E1 전사와 동일한 배향에 있는 pDE1sp1BLuc를 제조하였다. 재조합형 바이러스를 pJM17과 함께 pDE1sp1BLuc(2)를 293 세포(19)에 공트랜스펙션시킨후 재조합에 의해 제조하였다. 트랜스펙션 10일후, 세포 용균물을 제조하고, 새로운 293 단층을 감염시키는데에 사용하고, 바이러스를 단일 플라크로부터 증폭시켰다. 여기서 사용되는 바이러스 저장물은 이어서 추가의 플라크2회 정제, 증폭, CsCl에서의 밴딩에 의해 정제되며, 단백질 함량에 의해 정량화된(1 mg/ml 단백질=3.4 x 1012바이러스 입자/ml; 참조 34)물질로부터 제조하였다.
AdGFP: CMV 프로모터, EGFP 코딩 영역 및 SV40 폴리 A 서열을 함유하는 단편을 Ase1/Mlu1을 사용하여 pEGFP-C1(Clontech)로부터 절제하였다. 오버행잉(overhanging) 말단을 클레나우에 의해 채우고 E1 전사와 같은 배향으로 EGFP 카세트와 함께 pDE1sp1B(2)의 EcoRV 부위에 클로닝시켰다. 재조합 바이러스를 293 세포에서 pJM17과의 재조합을 사용하여 상기와 같이 제조하였다.
k) 바이러스의 열 안정성의 분석
CELO AIM46 및 AdLuc를 HBS(최종 글리세롤 농도는 2.4%(부피/부피)이었다)중에서 4 x 109입자/100 ㎕ 농도로 희석시키고 30분간 48 내지 68℃범위의 온도에 노출시켰다. 이어서 바이러스의 분취량들을 A549 또는 CEF38 세포에 루시페라제 활성을 형질도입하는 능력에 대해 시험하였다.
l) 면역형광
LMH 세포를 챔버당 105세포로 젤라틴-코팅된 유리 슬라이드(labtek, Nunc)에 위치시키고, 다음날 2% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 500 바이러스 입자/세포로 CELO AIM46 또는 야생형 CELO 바이러스로 감염시켰다. 감염후 지정된 시각에서, 세포를 실온에서 차거운 메탄올:아세톤(1:1)중에서 고정시키고, CELO 단백질을 다음과같이 면역형광에 의해 시각화하였다. 비특이적 결합 부위를 실온에서 1시간동안 PBS+1% BSA를 사용하여 블로킹시켰다. 폴리클로날 항-CELO 항체를 PBS+1% BSA에서 1:1000으로 희석하고, 1시간동안 인큐베이션했다. 실온에서 PBS중에서 3회의 5분씩 세척후, FITC에 결합된 염소-항-토끼(Boehringer-Mannheim) 검출 항체(1:400 희석)를 PBS+1% BSA에 첨가했다. 슬라이드를 다시 세척후, 핵의 시각화를 위해 마지막 세척에 DMPI를 포함시키고, 슬라이드를 형광 현미경에 의한 조사를 위하여 MOWIOL에 탑재시켰다.
m) 항-CELO 비리온 폴리클로날 혈청의 제조
토끼에 완전한 프로인드(Freund) 어쥬번트중의 100 ㎍의 CsCl 정제된, 열 불활성화된(70℃, 60분) CELO 비리온을 주입하고, 2, 4 및 5주에 불완전한 프로인드 어쥬번트중의 100 ㎍의 CELO로 증대시키며, 이어서 혈청을 수집했다. 웨스턴 분석은 여기서 사용되는 모아진 혈청이 모든 주요 CELO 캡시드 단백질과 특이적으로 반응하나 비-감염된 조류 세포의 용균물과는 반응하지 않음을 나타냈다.
n) 추가의 시약
야생형 CELO(FAV-1, Phelps)(조류 아데노바이러스 1형, 병아리 배 치사 오펀); CELO 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션:ATCC VR-432; 균주: Phelps; (57))를 앞서 기술된 바와같이(9) 감염된 병아리 배로부터 정제하였다.
LMH 세포주(27)을 ATCC No. CRL-2117로부터 구입하고, 또한 A549 세포주를 ATCC No. CCL-185로부터 구입하였으며, 정상 인간 피부 섬유아세포를 Clogenetics로부터 구입하고, 계대 5 내지 15에서 사용하였다. CEF38로 지칭되는 병아리 섬유아세포주를 공지된 방법에 따라 섬유아세포로부터 확립하였다; 이는 CELO 바이러스진입을 허용하나 CELO 복제를 지지하지 않는다. 모두 4개 세포형이 DMEM/10% FCS에서 배양되었다.
293 세포주(19)를 ATCC(No. CRL-1573)으로부터 구입하고, 10% 새로태어난 송아지 혈청을 갖는 MEMalpha에서 배양했다.
세포주 MA-104(Macaca mulatta(원숭이, 리서스 원숭이, 신장, 배, 상피))를 ATCC(No. CRL-2378)로부터 구입하였다.
세포주 ED-2(개, 피부 섬유아세포)를 ATCC(No. CCL-57)로부터 수득하였다.
다음 세포주를 BFAfV; Riems(Zellbank fuer Zellinien in der Veterinaermedizin; BFA f. Viruskrankheiten der Tiere, 17498 Insel Reims)로부터 구입하였다:
SPEV(돼지, 신장, 엠브리오날, "Verseniert"; 카탈로그 No. 8);
FLU-R(돼지, 폐, 배; 카탈로그 No. 113)
WSH-R(멧돼지, 피부, 배: 카탈로그 No. 388);
KN-R1(소, 신장, 배; 카탈로그 No. 028);
KMU-R(소, 근육, 엠브리오날; 카탈로그 No. 098);
KLU-R1(소, 폐, 엠브리오날; 카탈로그 No. 091).
실시예 1
CELO 게놈의 플라스미드 카피(copy)의 작제
먼저 CELO의 말단 HindIII 단편을 CELO 바이러스 DNA로 부터 정제하고, 염기로 처리하여 말단 펩타이드를 제거하고, SpeI 제한 부위를 코딩하는 링커를 첨가하며, 두 개의 말단 단편을 올바를 배향으로 저카피 수 플라스미드에 클로닝시켰다(도 1A는 CELO 게놈의 말단을 함유하는 플라스미드의 작제를 묘사한다. CELO 게놈 DNA를 HindIII로 분해하고, 두 개의 말단 단편을 단리하고, 처리하여 SpeI 링커를 삽입한후, SpeI, HindIII 단편으로서 클로닝하여 플라스미드 pWue-H35를 만들었다). 바이러스의 두말단을 코딩하는 이 플라스미드(pWueH-35)를 독특한 HindIII 부위로 선형화시키고 CELO 게놈 DNA와 조합시켜 박테리아 플라스미드상에 SpeI 부위가 인접한 완전 길이의 CELO 게놈을 만들었고(도 1B 참조, 이는 박테리아 플라스미드로서 완전 길이의 CELO 게놈의 클로닝을 나타낸다. pWue-H35를 HindIII로 선형화시키고 CELO 게놈 DNA와 재조합시켜 CELO 게놈의 완전 길이의 플라스미드 클론을 만들었다. 천연 말단 반복(repeats)은 SpeI 부위에 의해 인접되어 박테리아 플라스미드로부터 바이러스 게놈의 절제(excision)를 가능하게 한다. CELO 게놈안에는 SpeI 부위가 없다). 수개의 독립적인 바이러스 게놈의 클론이 얻어졌고, 올바른 구조가 제한 분석에 의해 및 트랜스펙션시 바이러스의 생산에 의해 입증되었다.
실시예 2
바이러스 복제에 필요한 독특한 서열의 분석
바이러스 복제 경우 CELO 서열을 요구하는 것을 결정하는 스크리닝 방법이 개발되었다. 결실을 박테리아에서의 상동성 재조합을 사용하여 바이러스 게놈의박테리아 플라스미드 카피에 먼저 도입하였다. 모든 경우에, 결실된 바이러스 서열은 루시페라제 카세트에 의해 대체되어, 야생형 바이러스 복제를 지지하는 세포에로의 초기 형질도입 효율 및 추후 계대에서의 돌연변이체 바이러스의 복제 및 형질도입 잠재력을 추적하는 것을 가능하게 한다. 하기에 나타난 바와같이, CELO 게놈은 야생형 게놈 크기를 넘어선 적어도 1.7 kb의 서열의 삽입을 가능하게하고, 루시페라제 카세트 자체를 도입하는 것이 복제를 손상시킬 수있다는 염려는 실현되지 않았다. 돌연변이체 바이러스 게놈을 플라스미드로부터 절제하여 결실이 필수 DNA 서열을 제거하는 지를 결정하기 위하여 단독으로 또는 결실의 상보가 일어날 수 있는 지를 결정하기 위하여 결실을 걸치는(spans) CELO 게놈의 영역을 갖는 플라스미드와 함께 LMH 세포에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 5일후, 세포를 용균시키고, 용균물의 일부를 루시페라제 활성에 대해 분석하여 트랜스펙션 효율을 추적하고, 제 2 부분을 LMH 세포의 새로운 단일층을 감염시키는데에 사용하였다. 추가의 5일후, 세포를 세포독성 효과에 대해 추적하고, 용균물을 제조하여, 루시페라제에 대해 분석하고, 일 부분을 새로운 LMH 세포를 감염시키는데에 다시 사용하였다.
b) CELO 좌측단의 분석
a)에서 기술된 전략을 사용하여, 독특한 좌측단 CELO 서열을 복제기능에 대해 분석하였다. 99개 아미노산 또는 그보다 큰 좌측단 오픈 리딩 프레임의 지도가 도 2A에 나타나 있다: CELO 게놈의 좌측 약 5000 nt내의 99 아미노산 잔기보다 큰 오픈 리딩 프레임이 검게(우측 전사) 또는 회색(좌측 전사)으로 나타나 있다. 데옥시UTPase(dUTPase)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 파보바이러스(parvovirus)REP 상동성(REP)을 갖는 단백질이 표시되어 있다. 기능적인 dUTPase 를 코딩하는 오픈 리딩 프렘임이 위치 784에서 발견된다(54). 위치 1991에서 시작하는 오픈 리딩 프레임은 파보바이러스 REP 유전자에 상당한 상동성을 갖는 단백질을 코딩한다. 추가의 5개의 오픈 리딩 프레임이 또한 나타나 있다.
도 2는 복제의 분석을 나타낸다. CELO 게놈에 도입된 결실의 뉴클레오타이드 수가 도 2 및 표 2에서 상부 패널에 열거되어 있다. 변형된 CELO 게놈은 SpeI로 선형화되어 박테리아 플리스미드로부터 게놈을 방출하여 단독으로 또는 1-5501로부터 야생형 CELO 서열을 갖는 ("좌측단 더하기") 플라스미드(pB5.5)의 존재하에서 LMH 세포에 트랜스펙션된다. 트랜스펙션 후 5일째, 세포를 수확하고, 냉동/해동 및 초음파처리에 의해 용균시키고, 용균물을 새로운 LMH 배양물에 적용시켰다. 이 증폭을 2회 반복하고, 바이러스의 제 3 계대(passage)로부터 동등양의 분취량을 LMH 세포에서 루시페라제 활성을 형질도입하는 능력에 대해 시험하였다. 표준 편차와 함께 3개의 형질도입의 평균이 나타나 있다.
먼저 오픈 리딩 프레임의 전영역을 제거하거나(pAIM11) 단일 또는 소규모의 그룹을 결실한(pAIM21, 25, 26, 27) 돌연변이체 게놈을 작제하였다. 트랜스펙션에 의해 LMH에 도입되었을 때, 전 영역을 제거하는 결실을 가진 pAIM11은 첫 번째 용균물에서 루시페라제에 대해서 양성이었으나, 상보 좌측단 단편의 부재 또는 존재하에서 추후 계대 시도에서 루시페라제 유전자 발현을 전달할 수 없었다.
보다 구별되는 돌연변이체(pAIM21)는 오직 3개의 미지의 ORF를 파괴하나, dUTPase 및 REF-류 ORF는 완전하게 남겨 놓았다. 그러나, pAIM11과 유사하게,pAIM21 게놈은 또한 상보 좌측단 단편의 부재 또는 존재하에서 추후 계대 시도에서 루시페라제 유전자 발현을 전달할 수 없었다(도 2b). 따라서, 바이러스 복제에 대해 시스로 존재해야 하는 양 돌연변이는 서열을 변형시킨다. pAIM27은 오직 REP만 결실하나, pAIM25 및 26은 dUTPase, REP 및 하나의 미지의 오픈 리딩 프레임을 결실한다. 이들 3개의 게놈은 모두 첫 번째 용균물에서 루시페라제 활성을 생성하였다. 물질의 추후 계대는 상보의 부재하에서 CELO AIM 25, 26 및 27이 복제할 수 없다는 것을 밝혔다. 그러나, pAIM11 및 21과 다르게, 초기 트랜스펙션이 상보 좌측단 플라스미드를 함유한다면, 계대성 루시페라제 활성이 관찰되었다(도 2B). 이들 3개 상보된 바이러스(CELO AIM 25+, 25+ 및 27+)는 놀라웁게도 루시페라제 활성을 형질도입하는 능력에 있어 오직 간소한 저하와 함께 LMH 세포에서 추가의 6개 계대 경우 증폭되었다(결과는 나타내지 않음). PCR 및 사우던 분석은 계대 3 물질에서 명백한 야생형 CELO의 실질적인 기여를 밝혀, 원래의 돌연변이체에서 결여된 서열을 재도입하는 재조합이 일어난다는 것을 입증했다. 따라서, 명백한 야생형 CELO가 생성되고, 루시페라제-함유 돌연변이체 CELO에 대해 상보 기능을 제공하였다.
결론적으로, 바이러스 복제에서 시스에서 필수적인 좌측단 서열의 영역이 동정되었다(2981 내지 4334). 바이러스 복제에서 필수적이나 트랜스에서 공급될 수 있는 제 2 영역이 동정되었다(nt 938 내지 2900). 정식으로, 일련의 재조합 사건이 본래 결실된 서열 및 루시페라제 카세트를 함유하는 바이러스 게놈을 만든다는 것이 가능하다. 그러나, 이 패턴의 가장 간단한 설명은 간단한 재조합이 pB5.5와돌연변이체 CELO 게놈사이에서 일어나 야생형 CELO 게놈을 만들며, 이는 추후 계대에서 혼합물중의 소수의 돌연변이체(루시페라제 양성)에서 상보 활성을 제공하였다. 이들 바이러스 게놈의 일부는 3.3 kb의 루시페라제 카세트 삽입과 조합하여 가장 큰 것이 1616 bp 결실을 함유하여 야생형 크기에 비해 순수한 서열 삽입물을 함유한다. 따라서, 야생형태에서 Ad5보다 이미 8 kb 큰 CELO는 적어도 추가의 1700 bp 서열을 패키징할 수 있다.
실시예 3
CELO 우측단의 일부는 없어도 좋다
유사한 돌연변이 전략을 CELO 의 우측단 서열의 초기 분석에 사용하였다. 게놈 플라스미드 pAIM45는 이미 특징지워진 GAM1 유전자(도 3, 참조 7)를 포함하며, 99개 아미노산 잔기 또는 보다 큰 10개의 ORF를 결여하면서 33358-43684의 큰 결실을 함유한다. 플라스미드 pAIM46은 41731-43684의 보다 분명한 결실을 함유하며, 두 개의 ORF를 파괴한다(도 3은 CELO 우측단 돌연변이의 분석을 묘사한다). 분석을 우측단 상보 플라스미드 pB13.3을 pB5.5대신에 사용한것("더하기 우측단"이라고 표시된 레인)이외에는 실시예 3, 도 2B에서 개략된 바와같이 수행하였다. 양 돌연변이체 게놈은 결실된 서열대신에 루시페라제 카세트를 포함하였다.
pAIM45 및 pAIM46은 단독으로 또는 야생형 CELO 우측단 서열(pB13.3)을 갖는 플라스미드와 함께 LMH 세포에 트랜스펙션되었다. 루시페라제 활성이 트랜스펙션된 세포의 용균물에서 얻어져 성공적인 트랜스펙션을 입증했다(결과는 나타나지 않음). 새로운 LMH 세포에서 물질의 추후 계대는 철저하게 우측단이 결여된 pAIM45가 완전한 우측단 서열의 부재 또는 존재하에서 감염성 CELO 입자를 생성할 수 없음을 밝혀냈다(도 3). 놀랍지 않게, 이 철저한 결실은 필수적인 서열을 제거하였고, 가장 유사하게는, 이들중 일부는 야생형 우측단 서열에 의한 상보성의 결여에 의해 입증된 바와 같이 시스에서 요구된다. 대조적으로, pAIM46 게놈은 상보 게놈 단편의 존재하 또는 부재하에서 감염성 및 계대성 바이러스를 생산하는 것이 발견되었다(도 3). 따라서, pAIM46에서 두 개의 파괴된 오픈 리딩 프레임은 CELO의 세포 배양 성장 경우 및 병아리 배에서의 성장경우 없어도 되었다(실시예 5 참조).
pAIM46 및 CELO AIM46에 의해 수반되는 게놈의 구조를 입증하기 위하여, 플라스미드안에 작제된 결실/삽입이 증폭된 CELO AIM46 바이러스의 게놈에 유지된다는 것을 입증하기 위하여 PCR분석을 수행하였다.
PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
OAIM 24: (CCGAGAATCCACCAATCGTA)는 CELO 우측단에서(nt 41699에서) 혼성화하는 센스 올리고이다.
OAIM25: (CAGCGTGTCGCTATACGCAA)는 CELO 우측단에서(nt 43752에서) 혼성화하는 안티센스 올리고이다.
OAIM26: (GCGATGACGAAATTCTTAGC)는 루시페라제 발현 카세트에서 혼성화하는 센스 올리고이다.
OAIM24 및 25에 의한 PCR은 야생형 CELO 주형 경우 2053 bp의 생성물 및 AIM46 주형 경우 3422 bp 생성물을 제공해야 한다. OAIM24 및 26에 의한 PCR은AIM46 주형 경우 958 bp의 생성물을 제공하고, 야생형 CELO 주형 경우 생성물을 제공하지 않아야 한다.
wt CELO 대 CELO AIM46의 PCR 분석의 결과가 도 4에 나타나 있다.
M으로 표시된 레인: 마커 DNA(EcoR1/HindIII 절단 람다 DNA); 레인 2 내지 6:프라이머 OAIM24+OAIM26이 사용되었다. 레인 2: 관계없는 표적 DNA; 레인 3: wt CELO DNA; 레인 4: 플라스미드 pAIM46 DNA; 레인 5 및 6: CELO AIM46으로부터 단리된 DNA; 레인 7 내지 11: 프라이머 OAIM24 및 OAIM26이 사용되었다, 레인 7: 관계없는 DNA; 레인 8: wt CELO DNA; 레인 9: 플라스미드 pAIM46 DNA; 레인 10 및 11: CELO AIM46 DNA로부터 단리된 DNA. DNA 크기(염기 쌍)는 일부 마커 분자 경우(좌측) 및 예상되는 PCR 생성물(우측) 경우 나타내져 있다.
도 4에 나타난 바와 같이, 플라스미드 pAIM46 및 바이러스 CELO AIM46으로부터 단리된 DNA는 예상되는 PCR 생성물을 생산하였다. 결실/삽입 부위를 걸쳐 있는 프라이머는 pAIM46 표적 DNA(도 4, 레인 4) 및 두 개의 CELO AIM46 제조물로부터 유래된 DNA(도 4, 레인 4)를 갖는 3422 bp의 예견된 PCR생성물을 만들고, 한편 야생형 CELO DNA를 갖고한 PCR 은 2039 bp의 예견된 DNA분자(도 4, 레인 3)를 생산한다. 또한, 루시페라제 삽입물을 인식하는 프라이머는 pAIM46으로부터 또는 CELO AIM46의 두 개의 단리물(도 4, 레인 9-11)로부터 유래된 DNA로부터 예견된 958bp의 생성물을 생산하나, 야생형 CELO로부터 유래된 DNA(도 4, 레인 8)로부터는 생성물을 생산하지 않는다.
실시예 4
CELO AIM46 대 야생형 CELO 복제의 면역형광 분석
루시페라제 데이터는 CELO AIM46이 상보의 결여하에서 LMH 세포에서 복제할 수있다는 것을 나타냈다. 보다 직접적으로 야생형 CELO에 비교하여 CELO AIM46의 복제를 분석하기 위하여, 두 개의 바이러스 형을 LMH 세포를 감염시키는데에 사용하고, 바이러스 감염의 진행을 CELO 캡시드 단백질에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하는 면역형광 마이크로스코피에 의해 추적하였다. 도 5는 야생형 CELO 대 CELO AIM46의 복제를 추적하는 면역형광을 나타낸다. LMH 배양물을 세포당 500 개 입자로 CELO AIM46(상 줄) 또는 야생형 CELO(하 줄)로 감염시켰다. 세포 샘플을 감염후 표시된 시간에 고정시키고, CELO 비리온 단백질의 생성을 CELO 비리온에 대해 항혈청을 사용하는 면역형광에 의해 추적하였다. 야생형 CELO 및 CELO AIM46 경우, 복제가 감염후 10시간에서 처음으로 검출될 수 있었고, 시그날이 세포 독성 효과가 세포의 분리를 가져오고 형광 신호에서 하향을 가져올 때 까지 다음 30시간에 걸쳐 증가한다. 따라서, 세포 배양물 감염에서, CELO AIM46은 야생형 CELO와 유사한 키네틱으로 복제하는 것으로 나타난다.
실시예 5
병아리 배에서 CELO AIM46의 성장
이 작업의 초기 단계에서, LMH 세포를 CELO AIM46의 세포 배양물 증식을 위하여 사용하였다. 이 세포주를 확립한 형질전환 사건의 성질이 분명하지 않기 때문에 LMH 세포가 야생형 병아리 배 세포가 결여할 수 있는 CELO AIM46에 대한 약간의 헬퍼 기능을 제공할 가능성이 남아있다. 이 실험은 또한 실제적인 고려를 위하여 CELO AIM46이 병아리 배에서 성장할 수 있는 지를 결정해야 한다: 낮은 가격 및 배의 다룸의 용이는 이들 바이러스의 생산을 촉진한다. 야생형 CELO 또는 CELO AIM46의 동등한 양을 9주된 병아리 배의 요막강에 주입하였다. 37℃에서 4일동안 인큐베이션후, 요낭강 유체를 수확하고, 바이러스를 CsCl 밀도 구배에서 밴딩하여 정제하였다. 정제된 야생형 CELO의 수율은 계란당 0.149 내지 0.9 mg(평균:0.427 mg/계란)이고, 한편 CELO AIM46 수율은 계란당 0.119 내지 0.828 mg이었다(평균: 0.301 mg/계란; 표 3). CELO AIM46에 도입된 변형은 단지 간소한 정도로 병아리 배에서 AIM46의 성장에 영향을 끼치는 것으로 보인다.
실시예 6
CELO AIM46의 물리적 안정성
CELO 비리온의 특징적인 특성은 상승된 온도에 대한 비리온의 내성에 의해 가장 쉽게 측정되는 물리적 안정성이다. Ad5와 같은 매스트아데노바이러스는 48℃ 및 그이상의 온도(4, 8, 16)에 노출되어 불활성화되는 반면에, CELO는 본래 보고된대로 56℃에 안정하고(57), 바이러스의 이어진 단리물이 보다 고온 및 다른 가혹한 처리에도 안정성을 갖는 것으로 보고되어 있다(39에서 리뷰). CELO 안정성의 분자적 성질은 결정되지 않았다. Ad5 캡시드 안정성의 주요 성분, pIX는 CELO에서는 확인되지 않는다. 아마도 헥손 또는 다른 캡시드 성분이 변형된 서열을 갖고,이는 보다 안정한 단백질/단백질 상호작용을 가능하게 한다. 이들 안정성은 거친 조류 환경에서 야생에서 CELO 바이러스 생존에 중요한 것 같다. 어떤 경우든, CELO 재조합 벡터가 야생형 CELO 비리온의 안정성을 보유하는 지를 결정하는 것은 흥미로웠다.
루시페라제 발현 유니트(AdLuc)를 갖는 재조합 아데노바이러스 5형 및 CELO AIM45를 열 적정에 노출시켰다(한정된 온도 42 내지 68℃에 30분간 노출). 이어서, 각 샘플을 인간 A549 또는 조류 CEF 세포에 루시페라제 활성을 전달하는 능력에 대해 시험하였다. 도 6은 야생형 CELO 대 CELO AIM46의 복제를 추적하는 면역 형광 분석을 보여준다. LMH 배양물을 CELO AIM46(상 줄) 또는 야생형 CELO(하 줄)으로 세포당 500개 입자로 감염시켰다. 세포 샘플을 감염후의 나타내진 시간에 고정하고, CELO 비리온 단백질의 생성을 CELO 비리온에 대한 항혈청을 사용하는 면역형광에 의해 추적하였다.
Ad5에 대해 앞서 입증한 바와 같이, 바이러스 캡시드, 및 따라서 바이러스의 형질도입 능력이 열에 민감하였다(4, 8, 16). 인간 세포의 Ad5 형질도입은 48℃에서 30분간 노출되었을 때 100배이상의 인자로 하향했고, 52℃ 및 보다 고온에서 불활성화 된다(도 6). 강한 대조로, CELO AIM46 형질도입 능력은 56℃에서의 가열에 의해 영향을 받지않고, 바이러스는 60℃에 30분간 노출되었을 때 단지 활성을 상실하기 시작했다. 야생형 CELO에 의한 형질도입은 유사한 열 안정성을 나타내어, CELO AIM46에 도입된 변형이 비리온의 안정성을 심하게 변형시키지 않음을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
실시예 7
CELO는 다양한 세포형을 형질도입할 수있다.
미래의 적용을 고려하여, CELO-기초 벡터에 의해 형질도입될 수 있는 세포 유형을 결정하는 것이 흥미롭다. 흔히 사용되는 포유동물 및 병아리 세포형의 패널을 CELO AIM46에 의한 형질도입 능력에 대해 시험하였다. 비교를 위하여, 동일한 루시페라제 발현 카세트를 수반하는 Ad5 유도체 Adluc를 사용하였다. 이들 세포 유형 4개에 대한 결과가 도 7에 나타나 있고, 이는 CELO 대 Ad5의 친화성을 나타낸다. 나타내진 세포 유형을 세포당 10000, 3000, 1000, 또는 300개의 입자로 AdLuc 또는 CELO AIM46에 노출시켰다(24웰 플레이트에 대한 프로토콜에 대해 방법 섹션을 참조). 감염후 24시간에서, 루시페라제 활성을 측정하였다. 값은 표준 편차와 함께 3개 형질도입의 평균이고 조류 기원의 세포(예를들어, 병아리 섬유아세포주 CEF38)가 인간 AdLuc경우보다 CELO 벡터 경우 거의 100배큰 효율로 형질도입된다는 것을 나타냈다(도 7). CEF38 세포는 바이러스 복제를 지지하지 않아 Ad5벡터와 CELO 벡터사이의 차이는 바이러스 복제와 관련된 증식에 기인할 수 없고, 1차 형질도입 또는 유전자 발현 효과에 기인해야 한다는 것을 주목한다. 시험된 인간 세포 유형에서, CELO는 Ad5벡터에 비교할만하게 작용하였다. 이들은 헤파토마(hepatoma) 주 HepG2, 폐 상피 암세포주 A549 및 1차 인간 피부 섬유아세포를 포함한다(도 7). 유사한 결과가 인간 암세포주 HeLa, 쥐 근아세포주 C2C12, 및 개 상피주 MDCK 경우 얻어졌다.
결론적으로, CELO AIM46은 인간 Ad5벡터보다 대략 100배 더 효율적으로 조류세포를 형질도입할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 놀랍게도, CELO AIM46은 또한 Ad5 기초 벡터에 견줄만한 효율로 포유동물 세포형을 형질도입한다.
실시예 8
아데노바이러스 및 CELO 벡터로부터 GFP 발현
녹색 형광 단백질(GFP)이 유전자 전달 연구에서 유용한 마커로서 나타났다. 따라서, CELO AIM46 배경에서 EGFP를 발현하는 CELO 벡터(CELO AIM53)(Clontech)를 준비했다. 이 벡터를 동일한 CMV/EGFP/β글로빈 발현 유니트를 갖는 Ad5벡터에 비교하였다. 양 벡터는 인간 A549 세포에서 GFP 유전자를 전달하는 기능을 한다는 것이 밝혀졌다. 그 결과가 도 8에 나타나 있으며, 이는 재조합체 Ad5 또는 CELO 벡터를 사용하는 EGFP의 형질도입을 묘사한다. EGFP 발현 아데노바이러스 AdGFP 및 CELO AIM53을 바이러스/세포 비(세포당 10 내지 1000개 입자)의 범위에 걸쳐 인간 A549 세포를 감염시키는데에 사용하였다. 감염하고 24시간에 세포를 고정하고, GFP 발현을 형광 마이크로스코피에 의해 추적하였다. GFP 경우 면역형광이 이 포멧에서 정량적이지 않지만, 루시페라제 재조합체와 유사하게, 인간 A549 세포를 형질도입할 때 CELO와 Ad5 EGFP 바이러스사이에 형질도입 능력에 있어서 큰 차이는 없었다.
실시예 9
CELO 우측단의 추가의 결여
실시예 3에서와 같은 유사한 돌연변이 전략을 CELO의 우측단의 추가의 결여를 만드는데 사용하였다. 게놈 플라스미드 pAIM69는 41523-43684의 결실을 함유하고, CELO AIM46에서 영향을 받는 동일한 두 개의 오픈 리딩 프레임을 파괴한다. 게놈 플라스미드 pAIM70은 약간 큰 40065-43684의 결실을 함유하고, AIM46 및 AIM 69 더하기 하나의 추가의 ORF로서 동일한 두 개의 ORF를 파괴한다. 우측단을 상보하는 플라스미드 pB13.3을 pB5.5대신에 사용하는 것이외에는 (도 9, "더하기 우측단"이라고 표지된 레인), 실시예 3, 도 2b에서 개략된 바와 같이, 분석을 수행하였다. 양 돌연변이체 게놈은 결실된 서열대신에 루시페라제 카세트를 포함하였다.
pAIM69 및 pAIM70을 단독으로 또는 야생형 CELO 우측단 서열을 갖는 플라스미드(pB13.3)와 함께 LMH 세포에 형질도입시켰다. 루시페라제 활성을 트랜스펙션된 세포의 용균물에서 수득하여 성공적인 트랜스펙션을 입증했다. 새로운 LMH 세포에서 물질의 추후 계대는 AIM69 및 AIM70이 완전한 우측단 서열의 부재하에서 감염성 CELO 입자를 만들 수 있다는 것을 밝혀냈다(도 9). CELO AIM46경우에 나타난 바와 같이, pAIM69중의 두 개의 파괴된 오픈 리딩 프레임은 CELO 의 세포 배양물 성장에 없어도 된다. AIM70에서 파괴된 추가의 오픈 리딩은 세포 배양물 성장에서 명백히 또한 없어도 된다.
실시예 10
CELO와 아데노바이러스 5의 친화성의 비교
다양한 동물종으로부터의 하기 세포형을 Ad5 및 CELO의 친화성을 비교하기위하여 감염시켰다:
MA-104 (리서스 원숭이); ED-2 (말), SPEV(돼지), FLU-R(돼지), WSH-R(야생형 수퇘지), KN-R1(소), KMU-R(소); KLU-R1(소).
상기 열거된 세포형을 세포당 10,000, 3,000, 1,000, 300, 100, 30, 또는 10개의 입자로 AdLuc 또는 CELO AIM46에 노출시켰다(24 웰 플레이트에 대한 프로토콜의 방법 섹션 참조). 모든 세포를 10% 태아 송아지 혈청이 더해진 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM 2 mM 글루타민, 100 IU 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 10%(V/V) 태아 송아지 혈청, 모든 혈청은 56℃에서 60분간 열 불화성화시켰다)에서 성장시켰다. 세포를 대략 형질도입 18시간전 24 웰 플레이트에 5 x 104세포/웰로 플레이팅시켰다. 형질도입을 위해, 배지를 나타내진 바이러스 입자수를 함유하는, 2% 말 혈청을 함유하는 DMEM(웰당 500 ㎕)으로 변화시켰다. 37℃에서 4시간후, 배지를 DMEM/10% FCS로 변화시켰다. 감염하고 24시간에서 루시페라제 활성을 측정하였다. 도 10a-10h에 주어진 값은 나타내진 표준 편차와 함께 3개 형질도입의 평균이다. 바이러스 성장, 정제 및 정량은 상기 기술된 바와 같이 수행하였다(실시예 7).
실시예 11
CELO AIM46 유도체를 사용하는 재조합 단백질 생성
병아리 배(9일)를 CELO AIM53, CELO AIM46 유도체의 4 x 107의 입자로 감염시켰다. 37℃에서 4일간 인큐베이션후, 요막 유체(AF)를 수확하였다(배당 대략 12 ml의 AF). AF 분취량을 SDS-PAGE로 분할하고, 니트로셀룰로즈에 옮기고, eGFP를 eGFP를 인식하는 항체로 면역염색하여, 이어서 ECL 검출(Amersham)에 의해 검출하였다(도 11). 정제된 eGFP의 참조 분취량이 포함된다. 비분획된 AF중의 eGFB의 수율을 참조문헌과 비교하여, 28㎕의 AF가 대략 1.25 ㎍의 eGFP를 함유하며, 따라서 12 ml의 AF는 대략 500㎍의 eGFP를 얻었다. 유사한 양의 eGFP가 5개의 별개의 감염된 배로 부터 얻어졌다.
실시예 12
sFGFR2(66) 또는 sFLT(sFLT;68)로부터의 Fc-안정화된 가용성 수용체 작제물을 코딩하는 cDNA를 전달 플라스미드 pPM7의 CMV 프로모터와 β글로빈 인트론/폴리아데닐화 서열사이에 클로닝시켰다. 이어서, CMV 프로모터/sFGFr/β글로빈 또는 CMV 프로모터/sFLT/β글로빈 단편을 상동성 재조합을 사용하여 PacI 선형화된 pAIM46에 도입하여 pCELOsFGFr 또는 pCELOsFLT를 생성하였다. 재조합은 pAIM46의 루시페라제 cDNA를 가용성 수용체 cDNA로 대체하였다. pCELOsFGFr 또는 pCELOsFLT를 SpeI로 절단하여 바이러스 게놈을 방출하고, LMH 세포에 트랜스펙션을 시켜 바이러스 복제를 개시하였다. 바이러스를 증폭하고 CsCl 구배상에서 바이러스를 정제한후, 각 바이러스의 분취량(4 x 107입자)을 9주의 병아리 배의 요막강에 도입하였다. 4일후 요막 유체를 수확하였다(계란당 약 12 ml). Fc-안정화된 가용성 수용체의 함량을 Fc 도메인에 특이적인 항체를 사용하는 면역블로팅에 의해 결정하였다. 도 12는 CELOsFLT로 감염된 계란으로부터의 결과를 보여준다. 레인 Ig: 표준으로서 1 ㎍의 쥐 Ig, 레인 K: 비감염된 계란으로부터의 35㎕의 요막 유체; 레인 1-7: CELOsFLT로 감염된 계란으로부터의 요막 유체 35 ㎕; 면역글로불린 표준물(Ig)의 대사물 및 대략 120 kd의 sFLT 분자(sFLT)가 나타나 있다. 표준으로부터, 각 계란이 300-500 ㎍의 가용성 수용체를 함유함을 계산할 수 있다.
표 1
CELO 재조합체 작제에서 사용된 플라스미드
표 2
CELO 변이체를 함유하는 플라스미드
표 3
노트
1. 야생형 CELO 또는 CELO AIM46(100 ㎕ HBS중의 8 x 108입자)을 9일된 병아리 배의 요막강에 주입하였다. 37℃에서 4일간 인큐베이션후, 요막 유체를 수확하고, 바이러스를 앞서 기술된 바와 같이(9) CsCl 밀도 구배에서 밴딩하여 정제하였다.
2. 바이러스 수율은 정제된 바이러스 단백질로 표현된다. 단백질을 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하는 Bradford 분석에 의해 측정하였다.
본 발명의 목적은 유전자 전달 벡터로서 사용하고 백신으로서 사용하기 위한 대체 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명에 깔려있는 문제점을 해결하기 위하여, 조류의 아데노바이러스 CELO를 선택하여 변형시켰다. CELO(chicken embryo lethal orphan) 또는 가금 아데노바이러스 1형, 39에서 리뷰)는 1957년에 감염제로서 특징지워졌다(57). CELO 바이러스로 감염된 경우 심각한 건강이나 경제적인 결과가 거의 없었다. CELO는 건강한 병아리로부터 단리할 수 있고, 일반적으로 병아리에 실험적으로 재도입했을 때 질병을 유발하지 않는다(10).
CELO 바이러스는 헥손 및 펜톤 구조로 구성된 70-80 nm의 정 20면체의 캡시드를 갖는 포유동물 아데노바이러스(매스트아데노바이러스)와 구조적으로 유사하다(33); CELO 바이러스 게놈은 바이러스-코딩되는 코어 단배질에 의해 비리온내에 DNA가 응축된 선형의 이중-가닥 DNA 분자이다(33, 36). CELO 바이러스는 Ad5보다 큰 게놈을 갖는다(44 kb 대 약 36kb. 참조 6, WO 97/40180). CELO 비리온은 대부분의 다른 혈청형의 단일 섬유(50에서 리뷰)와는 달리 각 정점에 상이한 길이의 두개의 섬유를 갖는다(22, 33, 35). CELO 바이러스는 ASd5의 E1A 기능을 상보할 수 없고, CELO 바이러스 복제는 Ad5 E1활성에 의해 조장되지 않는다(37). CELO의 완전한 DNA 서열(6, WO 97/40180)은 Ad5 초기 영역 E1A, E1B, E3 및 E4에 상응하는 서열의 부재를 포함하는 CELO 바이러스와 매스트아데노바이스사이의 추가적인 차이를 밝혀냈다. CELO 게놈은 Ad5에 서열 상동성을 갖지 않으나 바이러스의 초기 기능을 아마도 코딩하는, 오픈 리딩 프레임이 풍부한 좌측단(left end)에 대략 5 kb의 서열 및 우측단에 12 kb의 서열을 함유한다.
CELO를 유전자 전달 벡터로 개발할 때, 이 바이러스는 포유동물에서 천연적으로 결여되어야 하고 이성질은 야생형 포유동물 아데노바이러스에 의한 상보의 가능성을 제한하여야 한다고 여겨졌다. CELO 비리온은 Ad5의 비리온보다 증가된 DNA 패킹 용량을 갖고, 훨씬 큰 물리적 안정성을 갖는다. CELO의 한가지 실제적인 특성은 비용이 낮고 편리성이 높은 시스템인 병아리 배에서 바이러스를 성장시키는 능력이다(9, 33).
본 발명의 실험에서, CELO의 미개척 서열, 즉 대부분 개발되지 않고 다른 아데노바이러스에 공통되지 않은 CELO 게놈의 가장 좌측 5kb 및 가장 우측 13 kb를 조사하였다. 바이러스 유전학이 바이러스 복제에서 좌측단 및 우측단 CELO 서열에 대한 요구사항을 특성화하는데에 사용되었다. 바이러스 서열을 복제에 필수적이거나 비필수적인 영역을 동정하기 위하여 별개의 단계에서 결여시켰다. 돌연변이체의 복제를 추적하는 것을 용이하게 하기 위하여, 루시페라제 발현 카세트를 결여된 서열대신에 삽입했다. 변형된 CELO 게놈을 이.콜라이에서 상동성 재조합을 사용하여 박테리아 플라스미드로서 조작하였다(5). 이어서, 효소 분해에 의해 플라스미드 백본으로부터 이들을 방출시킨후, 바이러스 게놈을 야생형 CELO 복제를 지지하는 병아리 세포주에 트랜스펙션시켰다. 큰 바이러스 DNA분자(약 50 kb)의 트랜스펙션은 폴리에틸렌이민(PEI) 중재된 트랜스펙션(transfection) 방법을 적정화하여 용이하게 했다(1, 3). 또한, 모든 돌연변이 경우, 돌연변이가 상보될 수있는지를 결정하기 위하여 돌여변이체로부터 결실된 CELO 서열을 갖는 플라스미드로 2차 트랜스펙션을 수행하였다. 초기 트랜스펙턴트의 용균물로 처리된 세포에서의 루시페라제의 생성의 추적이 바이러스 복제 및 형질도입 바이러스 입자가 생성되는지를 결정하는 것을 가능하게 했다. 이들 전략은 좌측 및 우측의 프론티어(frontier) 서열의 필수 부분을 결정하는데에 사용하였다. 예상된 바와같이, 서열의 일부는 시스로 요구되었고, 추측컨대, 이들은 패키징 시그날, 전사 프로모터 또는 다른 전사 시그날을 함유한다.
본 발명은 CELO 야생형 바이러스의 뉴클레오타이드 41731-43684에 걸치는 영역이 완전히 또는 부분적으로 결실되고/되거나 이 영역에 삽입물을 함유하는 재조합 CELO 바이러스 및 CELO 바이러스 DNA에 관한 것이다.
이 CELO 바이러스(DNA) 및 그의 유도체를 각각 CELO AIM46 또는 CELO AIM 46 유도체라고 지칭한다.
한 구체예에서, 본 발명은 영역 nt 41523-43684 내에 완전한 또는 부분적인 결실 및/또는 삽입을 갖는 CELO AIM46 유도체에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 영역 nt 41002-43684내에 완전한 또는 부분적인 결실 및/또는 삽입을 갖는 CELO AIM46 유도체에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 영역 nt 40065-43684내에 완전한 또는 부분적인 결실 및/또는 삽입을 갖는 CELO AIM46 유도체에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 업급된 영역은 완전히 결실되어 결실대신에 외부 DNA를 삽입하기 위한 보다 넓은 공간을 제공한다.
CELO 바이러스로부터 유도된 본 발명의 변형된 바이러스는 게놈의 우측단에결실 및/또는 삽입을 함유하고, 복제 가능하며, 야생형 게놈보다 적어도 3.2 kb의 보다 많은 DNA를 수반할 수 있다.
보다 특이적으로, 본 발명의 CELO 바이러스 및 CELO 바이러스 DNA는 CELO 바이러스 게놈에 외부 유전자용 발현 카세트의 삽입을 위해 야생형 CELO 서열의 결실을 수반하고, 결실은 nt 40,000 내지 대략 바이러스 게놈의 우측 말단 200 bp내의 영역에 이른다. 따라서 완전히 또는 부분적으로 결실 또는 파괴될 수 있는 영역은 99개 아미노산 잔기보다 큰 펩타이드를 코딩하는 마지막 3개의 우측 오픈 리딩 프레임에 의해 정의되고, 바이러스 게놈의 마지막 100-200 bp내에 정상적으로 잔류하는 말단 반복 기능은 파괴되지 않은 채 남아있다. 임의로 본 발명의 CELO 바이러스 및 CELO 바이러스 DNA는 또한 CELO UTPase에 대한 오픈 리딩에 의해 한정되는 영역에 결실을 갖는다(794-1330).
본 발명에서 사용되는 CELO 뉴크레오타이드 서열 넘버링은 야생형 CELO 바이러스 게놈의 서열을 기술하는 참조 6, WO 97/40180 및 GenBank U46933으로부터 유래된다.
상기 정의된 CELO AIM46 및 그의 유도체는 큰 조각의 외부 DNA 삽입을 허용하기 때문에, 이들은 CELO 바이러스 벡터를 생산하기 위한 출발물질로서 유용하다.
놀랍게도, 3.3 kb 삽입물이 바이러스 성장에 손상을 끼치지 않고 CELO AIM46에 의해 견딜 수 있다는 것이 밝혀졌고, 따라서, 상기 바이러스 경우 대략 10 kb 삽입물까지의 보다 큰 DNA가 허용될 수있다는 것이 예상될 수 있다. 최대 크기 한도는 본 발명의 실험에서와 같이 삽입물 크기를 점차로 증가시키고, 바이러스 성장파라미터를 결정하여 일상의 실험에서 숙련된자에 의해 쉽게 시험될 수있다. 유전자용 발현 카세트의 삽입을 허용하는 것을 별개로하여, 본 발명의 재조합 CELO 바이러스는 LMH 세포 및 병아리 배에서 상보(complementation)없이 복제할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 재조합 CELO 바이러스의 추가의 잇점은 이것이 야생형 CELO에 비교할만한 양의 바이러스를 생산한다는 것이다. 또한, AIM46 벡터는 Ad5 벡터에 비교될만하게 포유동물 세포를 형질도입시켜, CELO 벡터에의해 효율적인 포유동물 세포 수용체 결합 및/또는 진입 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
41731-43684의 CELO AIM46 결실은 nt 41002에서 시작하는 오픈 리딩 프레임의 오직 일부분만을 제거하기 때문에, 전 ORF는 없어도 좋아야하며, 따라서 결실될 수있다. 따라서, 결실은 nt 41002-43684의 서열을 포함할 수있다.
본 발명의 한 구체예에서, 관심의 대상이 되는 유전자는 각각 nt 41731-43684, 41523-43684, 41002-43684 또는 40065-43684의 결실된 영역보다 다른 게놈 부위에서 삽입된다; 이 경우, 벡터는 추가의 외부 유전 물질의 삽입을 위한 추가의 공간을 제공한다. 없어도 좋은 것으로 입증된 영역이 선택될 수 있어, 외부 DNA를 삽입하기 위한 바람직한 영역은 dUTPase 리딩 프레임에 있다(nt 794-1330).
본 발명의 바이러스는 야생형 수준으로 성장할 수 있고, 복제 능력이 있는 백신 균주의 기초를 형성한다. CELO AIM46은 또한 양 종 및 세포형과 관련하여 CELO의 세포 친화성의 분석을 시작하여 이 벡터의 적용을 개발하는데에 중요한 정보를 제공하는데에 사용되었다. 추가의 변형을 포함하는 CELO AIM46 및 그의 유도체는 동일한 마커 유전자를 갖는 Ad5 벡터보다 10-100배 높은 효율로 조류 세포에 유전자를 전달하는데에 사용될 수 있다. 놀랍게도, 다양한 포유동물 세포 형, 예를들어 인간, 소, 말, 원숭이, 쥐, 개에서, CELO AIM46은 Ad5 벡터에 견줄만한 효율로 작용하여, 포유동물 유전자 전달 적용을 위한 CELO 벡터의 유용성을 입증한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 재조합 CELO AIM46 바이러스 및 그의 유도체의 생산에 관한 것이다.
재조합 CELO 바이러스의 생산을 위해, CELO 바이러스 DNA는 CELO 바이러스 복제를 지지하는 세포에 도입된다. 유전자 전달을 위한 표준 방법, 예를들어 트랜스펙션, 미세주입등이 DNA를 도입하는데에 사용될 수있다. 바람직하게는, 바이러스 DNA는(3)에 기술된 바와 같이, 폴리에틸렌이민-중재된 트랜스펙션에 의해 세포에 도입된다.
CELO 바이러스 복제를 지지하고 따라서 CELO 바이러스 생산에 유용한 세포를 LMH(27)와 같은 불멸화된(immortalized) 세포로부터 또는 1차 조류 배 세포, 특히 신장 또는 간세포로부터 선택될 수 있다. 유용한 세포주를 동정하기 위하여, 세포를 감염능력(infectability) 및 접종 바이러스를 증폭시키는 능력에 대해 시험하였다.
다르게는, 재조합 CELO 바이러스를 병아리 배(chucken embryos)에 CELO 바이러스를 도입하여, 바람직하게는 먼저 상기 기술된 세포를 CELO 바이러스 DNA로 트랜스펙팅시키고, 세포를 병아리 배에 주입시키기에, 및 그것에서 증폭시키기에 충분한 양의 바이러스를 생산하기 위해 일정 기간동안 배지에서 유지하여 생산할 수있다.
재조합 CELO 바이러스를 생산하기 위하여, 바이러스 복제에 없어도 좋은 영역을 먼저 동정하였다. 이를 위해, CELO 게놈에 재구성시키기에 용이한 충분히 크고(예를들어 1,000 - 15,000 bp), 적어도 하나, 바람직하게는 5 - 10개의 독특한 제한 부위를 소유하기에 충분히 작은 CELO 게놈의 서브단편을 플라스미드에 클로닝시켰다. 플라스미드를 표준 제한 효소 분해로 조작하여 CELO 게놈의 다양한 단편을 결실시키고 그대신에 리포터 유전자 작제물(construct)을 삽입시켰다. 이 조작된 단편을 이어서 표준 결찰 또는 재조합 방법을 사용하여 예를들어 박테리아 플라스미드중의 완전한 CELO 게놈에 삽입시켜 상응하는 야생형 단편을 대체했다. 이어서, 변형된 CELO 게놈을 제한 분해에 의해 플라스미드 백본으로부터 방출시켜 도 1 에 예시된 바와같이 CELO 바이러스 복제를 지지하는 세포에 도입시킨다.
CELO AIM46 경우에, 서브단편은 nt 1-5503 및 30502-30644 및 40064-43804의 CELO 서열을 함유한다. 41731-43684의 EcoRV 단편이 결실되고 발현 카세트, 예를들어 루시페라제 발현 카세트로 대체되어 pAIM44를 생산한다. 이는 HpaI로 선형화되고, 야생형 CELO DNA와 재조합되어 pAIM46을 생산한다. CELO 서열은 SpeI 분해로 플라스미드로 부터 절제되어 LMH 세포에 도입되어 바이러스 복제를 개시한다.
다르게는, 재조합이 바이러스 복제를 지지하는 조류 세포에서, 예를들어 LMH 세포에서 결실/삽입을 함유하는 변형된 CELO 서브단편을 제 2 CELO 단편과 함께 도입하여 두 단편사이의 겹치는 상동성이 원하는 결실/삽입을 갖는 완전 길이의 CELO게놈에의 재조합을 가능하게 하여 수행될 수 있다.
본 발명의 실험에서, 바이러스 복제에 필수적인 CELO 게놈 영역이 동정되었다. 가장 중요하게는, 결실되어 트랜스로 공급될 수 있는 바이러스 게놈의 좌측단에 있는 영역이 동정되었다. 그러므로, 이 영역은 상보 세포주를 확립하는데에 유용하다. 또한, 세포 배양물 또는 배에서의 바이러스 복제에 어떤 검출가능한 효과도 없이 결실될 수 있는 게놈의 우측단의 영역이 동정되었다. 외부 유전자를 위한 발현 카세트가 이 영역에 삽입될 수 있는 것으로 나타났다. CELO 벡터는 이미 Ad5 벡터보다 8 kb 큰 야생형 게놈 크기에 비해 추가의 3.2 kb의 DNA 서열을 패키징할 수 있는 것으로 나타났다. 루시페라제 발현 유니트 또는 EGFP 발현 유니트를 갖는 복제가능한 CELO 벡터가 개발되었다. 이들 벡터는 다양한 조류 및 포유동물 세포형을 형질도입시킬 수 있는 능력에 대해 추적되었다. 예측된 바와같이, CELO 벡터는 조류세포에서 Ad5 벡터보다 훨씬 잘 작동하였다. 그러나, 시험된 모든 포유동물 세포형에서, CELO 벡터는 놀랍게도 Ad5 벡터에 견줄만한 형질도입 효율로 기능을 했다.
본 발명의 벡터는 바이러스 복제가 면역 반응을 촉진시킬 수 있는 조류종에서 백신 적용을 갖는다. 비싸지 않은 병아리 배에서 바이러스 증식 능력은 이들 적용을 위한 다량의 벡터의 생산을 용이하게한다.
백신 적용을 위해, 외부 DNA는 개개에서 면역반응을 유도하는 하나이상의 항원을 코딩한다. 항원은 병원체로부터 유도된 천연 단백질, 또는 그의 면역원 단편, 예를들어 면역원 펩타이드일 수 있다.
외부 DNA의 발현을 유도하기(drive) 위하여, 발현 카세트가 사용될 수 있고, 이는 전형적으로 표적 세포에서 활성인 프로모터, 관심의 대상이 되는 cDNA, 폴리아데닐화 시그날 및 임의의 엑손을 포함한다. 다르게는, 변형된 CELO 게놈에 삽입된 DNA는 내생적 CELO 프로모터, 인트론 및 관심의 대상이 되는 cDNA의 발현을 유도하는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수있다.
통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 유용한 발현 카세트의 예는 본 발명의 실시예 12에 기술된 작제물이고, 이는 pPM7이라고 지칭되는 플라스미드로부터 유래된다. 이는 PacI, HpaI 및 KpnI 부위를 갖는 짧은 폴리링커가 이어지고, 토끼 β글로빈 인트론/폴리아데닐화 시그날이 이어지는 시토메갈로바이러스(CMV) 바로 앞의 인핸서/프로모터를 함유한다. CMV/β-글로빈 물질은 본 분야에서 이용가능한 플라스미드(예를들어, 루시페라제 유전자를 수반하는 플라스미드 pLUC(74)로부터 유도되어, 인접하는(flanking) 제한부위, 예를들어 BamH1을 첨가하기 위하여 PCR에 의하여 변형되고, 이어서 루시페라제 cDNA를 PacI/HpaI/KpnI 폴리링커로 대체하는 상동성 재조합에 의해 변형될 수 있다. 최종 BamHI 카세트는 pSP65에 클로닝되어 pPM7을 생성시킬 수 있다. CELO AIM46 유도체에 클로닝되려는 cDNA를 먼저 독특한 제한 부위(PacI/HpaI/KpnI)를 사용하여 pPM7에 클로닝시킨다. 이어서 제한 또는 PCR 단편, 예를들어 BamHI 단편을 CMV 프로모터/cDNA/β-글로빈 유니트를 함유하게 제조되고, 이는 상동성 재조합에 의해 PacI 선형화된 pAIM46에 도입된다. CMV 및 β글로빈 서열은 재조합용 상동성을 제공하고, 따라서 루시페라제 cDNA는 관심의 대상이 되는 신규의 cDNA에 의해 대체된다.
상기 기술된 발현 카세트는 예를들어 CMV 인핸서/프로모터대신에 제한되는 것은 아니지만 SV40 인핸서 프로모터, 라우스 사코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus) 긴 말단 반복(RSV LTR), 인간 β-액틴 프로모터, CELO 바이러스 주요 늦은 프로모터, 아데노바이러스 주요 늦은 프로모터, 래트 인슐린 프로모터를 포함하는 다양한 다른 바이러스 또는 세포 프로모터를 사용하여 변형될 수 있다.
토끼 β-글로빈 인트론/폴리아데닐화 시그날에 대한 대안은 제한되는 것은 아니지만 SV40으로부터의 인트론/폴리아데닐화 시그날을 포함하고, 다른 바이러스 및 세포 유전자로 부터의 인트론 및 폴리아데닐화 시그날이 또한 사용될 수있다.
발현 카세트를 사용하는 것에 대한 대안으로, 외부 cDNA는 CELO AIM 46 또는 데옥시UTPase를 한정하는 영역내의 간단한 삽입물일 수 있고, 따라서 내생 CELO 조절 서열, 예를들어 프로모터, 인트론, 폴리아데닐화 시그날을 사용한다.
두 개의 상이한 외부 cDNA, 예를들어 병원체로부터의 두 개의 상이한 항원을 코딩하는 cDNA가 CELO 벡터로부터 발현되려는 경우, 다음의 전략이 사용될 수 있다: 첫 번째 구체예에서, 두 개의 유전자 발현 카세트(상이한 cDNA 및 상이한 조절 서열을 수반하는)가 CELO 게놈에 삽입될 수 있다. 다르게는, 내부 리보좀 진입 부위(IRES)를 예를들어 70; 67; 71; 72에 기술된 바와같이 단일 프로모터를 사용하는 두 개의 cDNA로부터 발현을 제공하기 위하여 사용될 수있다. 따라서, 발현되려는 두 개의 cDNA를 수반하는 CELO AIM46용 전형적인 발현 카세트는 프로모터, 첫 번째 cDNA, IRES, 및 임의의 인트론 및 폴리아데닐화 시그날이 이어지는 두 번째 cDNA를 포함한다.
외부 cDNA, 예를들어 항원 cDNA는 임의로는 RNA를 DNA로 전환시키는 역전사를 포함하는, 표준 방법, 예를들어 PCR에 의해 또는 제한 분해에 의해 병원체의 게놈으로부터 단리되어 조절 서열 및 독특한 제한 부위를 수반하는 트랜스퍼 벡터, 예를들어 pPM7에 도입될 수 있다. 이어서, 이 항원 발현 유니트는 CELO 게놈을 갖고, 동일한 조절 서열을 가지며, 상응하는 제한 부위를 갖는 선형 플라스미드, 예를들어 플라스미드 pAIM46에 재조합된다. 항원 cDNA를 수반하는, 결과적인 CELO-AIM46 벡터는 성장하여 병아리 배로부터 정제될 수있다.
백신 적용에 유용한 항원의 예는 WO 97/40180에 주어지고, 이는 완전히 본 명세서에 참고로 인용된다.
백신 적용용 바이러스에 의해 수반될 수 있는 항원에 대한 추가의 예는 감염성 버살(bursal) 질병 바이러스(IBDV; 64)의 항원 및 병아리 콕시디아(coccidia)의 항원, 예를들어 에이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina), 에이메리아 브루네티(Eimeria brunetti), 에이메리아 맥시마(Eimeria maxima), 에이메리아 미티스(Eimeria mitis), 에이메리아 네카트릭스(Eimeria necatrix), 에이메리아 프라에콕스(Eimeria praecox) 및 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella)(61, 62, 63)의 항원이고, 항원에 대한 예는 기생 리프렉타일 체(refractile body) 트랜스하이드로기나제, 락테이트 디하이드로기나제, Ea1A 및 EaSC2이다(77에서 리뷰).
항원에 대한 추가의 예는 돼지 병원체 슈도라비즈(pseudorabies) 바이러스의 당단백질 C(gC, 당단백질 gIII)(Aujeszky's 질병의 원인제)이다(75; 76; 69). gC를 수반하는 CELO AIM46 벡터는 돼지에서 항-슈도라비즈 반응을 유도하는데에 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 강력한 면역 반응이 복제 가능한 바이러스로부터 기대된다. 그러므로, 벡터는 복제가 부분적으로 또는 완전히 허용되는 숙주에서 가장 유용하다. 이와 관련하여, 본 발명의 CELO 벡터, CELO AIM46 및 그의 유도체가 조류 백신 적용에 이상적으로 적합하다.
본 발명의 재조합 CELO 바이러스 벡터는 또한 인간 백신 적용에서 유용하고, 이 경우에, 외부 DNA는 인간 병원체로부터 유래된 항원을 코딩한다.
본 발명에 따라 변형된 CELO 게놈에 기초한 CELO 벡터는 또한 포유동물 시스템에서 유전자 전달 적용에 또한 유용하다; 비-인간 아데노바이러스를 추구하는 추가의 논란이 인간 유전자 치료 적용에서 인간 아데노바이러스를 갖고한 실험으로부터 나온다. 인간 아데노바이러스에 대해 이미-존재하는 면역반응이 인간 아데노바이러스를 기초한 벡터에 의한 초기 형질도입을 손상시킬 수 있거나 형질도입된 세포에의 세포 면역 반응을 악화시킬 수있다. 환자는 거리가 먼 종으로부터의 아데노바이러스에 면역 경험을 갖지 않을 수 있고(7명 환자중 2명이 개 아데노바이러스에 대한 중화 항체를 가졌지만; 30), 초기 형질도입이 바이러스 항체에 대한 숙주 반응에 의해 타협되지 않는다. 특정의 농부를 제외한, CELO 항원에 대한 사전의 면역 노출은 대부분의 인간 군에서 기대되지 않는다. 그러므로, CELO 벡터는 보다 흔한 인간 아데노바이러스 혈청형에 기초한 벡터에 비해 잇점을 가질 수 있다.
본 발명의 CELO 기초한 벡터의 추가의 개념적 잇점은 소, 양, 및 개 아데노바이러스와 같은 CELO는 인간 세포에서는 결여된 천연적 복제이다. 따라서, 이들벡터의 복제는 야생형 인간 아데노바이러스 감염의 존재에서 조차 인간 환자에서는 일어나지 않는다.
또한, 복제 결함 CELO 벡터를 생산하는 능력은 본 발명에서 수행된 결실 분석에 의해 촉진된다. 본 발명의 밝힘은 CELO 상보 기능을 발현하는 세포주를 작제하기 위한 기초를 제공한다.
유전자 치료 적용에서, 외부 DNA는 치료적으로 활성인 단백질을 코딩하는 하나이상의 DNA 분자를 포함할 수 있다. 예는 사이토카인과 같은 면역조절 단백질; 수용체, 효소, 세포소멸을 일으키는 단백질, 혈관형성을 조절하는 단백질, 에를들어 sFLT, FGF 수용체등이다. 종양 백신 적용 경우, 외부 DNA는 바람직하게는 사이토카인과 조합하여 하나이상의 종양 항원 또는 그의 단편을 코딩한다.
인간 백신 적용, 유전자 치료 및 종양 백신 적용을 위한 예가 본 명세서에 완전히 참고로 인용되는 WO 97/40180에 나타나 있다.
백신 적용 경우, 본 발명의 벡터는 장(enteric) 코팅된 유니트로서, 또는 근육내, 복강내 또는 피하 주사용 주사 형태로서 패키징될 수있다. 다르게는, 벡터는 비강내 또는 기관내 페이스 또는 유체로서, 에어로졸 또는 점안제로서 투여될 수 있다. 벡터는 또한 음식물 펠리트 또는 음료에 혼입되어 공급될 수 있다. 환자, 동물 또는 계란당 도입되는 바이러스의 양은 1 내지 1012입자의 범위일 수 있다.
바이러스 제제는 생리학적 완충된 염수 또는 HEPES 완충된 염수를 포함할 수있고, 임의로 어쥬번트, 예를들어 비타민-E 아세테이트, 오일/물 유제, 수산화 알루미늄, -포스페이트 또는 -옥사이드, 미네랄유 유제, 예를들어 Bayol(R)또는 Marcol 52(R)및 사포닌과 혼합될 수 있다.
백신으로서 바이러스의 동결건조된 형태를 사용하는 것이 유용할 수있다(78). 예를들어 10% 슈크로즈와 같은 안정화제를 포함시키는 것이 조절된 2-단계 건조 공정과 함께 사용될 수 있다(78). 다른 안정화제는 탄수화물, 예를들어 소르비톨, 만니톨, 트레할로즈, 전분, 슈크로즈, 덱스트란 또는 글루코즈, 단백질, 예를들어 알부민 또는 카제인, 또는 그들의 분해 생성물을 포함한다.
백신 적용에서, 숙주 면역 반응을 향상시키기 위하여, 특정 항원을 수반하는 CELO 백신 벡터의 적용에 의해 유도되는 면역 반응은 동일한 항원 또는 그의 면역원 단편을 추가적으로 투여하여 증대될 수 있다. 바람직하게는, 추가로 투여되는 항원은 재조합체이다; 이는 표준 방법 또는 계란으로부터 재조합 단백질을 수득하기 위하여 CELO 벡터를 사용하는 하기 기술된 방법에 의해 얻어질 수있다. 벡터 및 항원의 조합된 적용은 (65, 73)에 의해 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항원은 CELO 벡터에 이어 임의로 면역조절 어쥬번트와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 추가의 면에서, CELO 바이러스는 관심의 대상이되는 단백질을 생산하기 위하여 사용된다.
본 발명의 본 구체예에서, CELO 바이러스, 예를들어 CELO AIM46 또는 그의 유도체는 본 발명의 재조합 CELO DNA의 삽입 부위의 하나에 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 cDNA 또는 바람직하게는 발현 카세트를 도입하여 상기한 바와 같이 조작된다. 바이러스는 상기한 바와같이 적절한 세포에서 복제에 의해 수득될 수 있고, 재조합 바이러스는 바람직하게는 조류 배의 요막(allantoic) 강에 주입하여 도입된다. 바람직하게는, 대략 4x107개의 입자가 7 내지 9일의 병아리 배의 요막강에 도입되고, 이는 이어서 37℃에서 3 내지 4일 인큐베이션된다. 이어서, 재조합 물질을 요막 유체, 혈청, 노른자위, 양수 또는 배 자체로부터 회수된다.
관심의 대상이 되는 단백질은 세포내 또는 분비된 단백질일 수 있다. 본 발명의 실험에서(실시예 11) 리포터 단백질 eGFP에 의해 예시된 세포내 단백질인 경우에, 단백질은 요막 유체에 축적되는 감염된 세포를 용균시켜 회수할 수있다. 분비된 단백질 경우, 물질은 배의 다양한 세포외 유체(요막 유체, 양수, 혈청, 노른자위)로부터 또는 세포내 단백질의 회수와 유사하게 감염된 세포를 용균시켜 회수될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 관심의 대상이 되는 단백질은 단백질 및 안정화 서열로서 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 퓨전 단백질로서 발현된다. 재조합 단백질의 분비는 시그날링 기능외에 안정화 기능을 가질 수 있는 단백질로부터의 천연 시그날 서열에 의해 지시될 수 있다. Fc 도메인은 세포외 공간의 단백질에 안정성을 부여하고, 예를들어 단백질 A 또는 단백질 A/G 크로마토그래피 수지를 사용하는 재조합 단백질의 친화력 정제에 사용될 수 있는 단백질 서열을 제공한다. 안정화를 위하여 Fc 도메인을 포함하고 따라서 CELO로부터 발현되는데 유용한 작제물은 FGF 수용체 2(sFGFr; 66) 및 VEGF 수용체 1(sFLT; 68)의 가용성 형태를 만드는데이용되어 왔다.
FLT 및 FGF 수용체의 시그날 서열에 대한 대안으로서, 단백질, 오브알부민, 콘알부민, 아비딘 및 라이소자임으로부터 또는 그와의 융합물로부터의 시그날 서열이 사용될 수 있다. 이들은 병아리의 간 및/또는 난관에서 합성되고, 계란안에 축적되는 단백질이다. 따라서, 관심의 대상이 되는 단백질에 융합된 이들 단백질의 코딩 서열의 일부 또는 전부를 사용하여 발달하는 배안에서 안정한 분비되는 재조합 단백질을 얻는 것이 예상된다; 또한, 이런 유형, 예를들어 아비딘의 서열을 이용하여 크로마토그래픽 정제를 용이하게 하는 태그를 제공한다.
Claims (33)
- 야생형 CELO 바이러스 게놈의 뉴클레오타이드 41731-43684에 걸친 영역이 완전히 또는 부분적으로 결실되고/되거나 외부 DNA의 삽입을 함유함을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 1 항에 있어서, 결실이 영역 nt 41523-43684에 걸친 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 1 항에 있어서, 결실이 영역 nt 41002-43684에 걸친 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 1 항에 있어서, 결실이 영역 nt 40065-43684에 걸친 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항에 있어서, 제 1 항 내지 제 4 항중에 정의된 결실외에 영역 nt 794-1330내에 완전한 또는 부분적인 결실 또는 외부 DNA의 삽입을 함유하는 것을 특징으로하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한항에 있어서, 원핵세포 또는 진핵세포중에서 복제될 수 있는 플라스미드상에 함유된 재조합 CELO 바이러스 DNA.
- 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한항에 있어서, 결실(들)대신에 외부 DNA 삽입을 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO-바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 7 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항에 따른 영역 대신에 또는 그중에 및/또는 제 5 항에 정의된 결실대신에 외부 DNA 삽입을 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO-바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 외부 DNA가 동물 병원체로부터 유래된 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 9 항에 있어서, 병원체가 조류인 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 외부 DNA가 인간 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 11 항에 있어서, DNA가 치료적으로 활성인 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 12 항에 있어서, 외부 DNA가 면역자극 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 13 항에 있어서, 면역자극 단백질이 사이토카인인 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 11 항에 있어서, 외부 DNA가 종양 항원 또는 그의 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 12 항에 있어서, 외부 DNA가 혈관형성을 조절하는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 제 11 항에 있어서, 외부 유전자가 인간 병원체로부터 유래된 항원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 CELO 바이러스 또는 CELO 바이러스 DNA.
- 결실(들) 및 임의의 삽입(들) 플라스미드-매개된 CELO 바이러스 DNA상에서 수행하고, 재조합 CELO 바이러스 DNA를 바이러스 복제를 지지하는 숙주에 도입시키는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 17 항중 어느 한항에 따른 재조합 CELO 바이러스를 생산하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 숙주가 1차 세포이거나 불멸화된 세포주의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18 항에 있어서, 숙주가 조류의 배인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 제 19 항에서 정의된 세포가 CELO 재조합 바이러스 DNA로 트랜스펙션되고, 배지에서 유지되어 소정량의 바이러스를 생산하고 상기 바이러스 양이 조류 배에 주입되어 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 배가 병아리인 방법.
- 제 9 항의 CELO 바이러스를 함유하는 동물의 감염성 질병에 대한 백신.
- 제 10 항의 CELO 바이러스를 함유하는 새의 감염성 질병에 대한 백신.
- 제 17 항의 CELO 바이러스를 함유하는 인간의 감염성 질병에 대한 백신.
- 제 12 항의 CELO 바이러스를 함유하는 약제학적 조성물.
- 제 13, 14 또는 15항중 어느 한항에 있어서, 종양 백신의 제조를 위한 CELO 바이러스.
- 외부 DNA가 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 제 7 항의 재조합 CELO 바이러스를 조류 배에 도입하고, 바이러스를 증폭시켜 관심의 대상이 되는 단백질을 생산하고, 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 관심의 대상이 되는 재조합 단백질을 생산하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 DNA가 면역글로불린 Fc 도메인을 코딩하는 DNA 분자에 융합된 방법.
- 제 29 항에 있어서, 외부 DNA가 추가로 시그날 서열을 함유하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 관심의 대상이 되는 단백질이 분비성 단백질이고, 시그날 서열이 그의 천연 시그날 서열인 방법.
- 제 30 항에 있어서, 시그날 서열이 계란으로 천연적으로 분비되는 단백질로부터 유래되고, 상기 단백질은 관심의 대상이 되는 단백질과 상이한 방법.
- 제 32 항에 있어서, 시그날 서열이 오브알부민, 아비딘, 콘알부민 또는 라이소자임으로부터 유래된 방법.
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