CN1319140A - 重组celo病毒及celo病毒dna - Google Patents

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Abstract

重组CELO病毒或在CELO病毒基因组右末端含有一处缺失的该病毒DNA,其允许大片段外来DNA的插入。该病毒可作为动物特别是鸟类的一种疫苗使用,也可用于人类的基因治疗和疫苗应用。该病毒还可用于重组蛋白的生产。

Description

重组CELO病毒及CELO病毒DNA
本发明涉及病毒载体和病毒DNA。
腺病毒在人类疾病中所起的作用已有研究(25)，它可作为分子生物学领域许多重要发现，包括mRNA剪接、DNA复制、转录和细胞转化的一种模式(综述见44)，以及最近作为暂时性基因表达的有效试剂(12,46)。对腺病毒生活史已比较了解(综述见50)。自从利用腺病毒作为基因转运载体的努力开始以来(18,52,28)，该病毒已成为常用载体，并已开发出通过在该病毒基因组中产生改变而携带新基因的多种方法(2,5,11,15,21,23,26,32,38,41,43,48，综述见31,49)。由于载体的构建和纯化很容易，而且由于这些载体具有较强的将新遗传物质暂时活体内转导到多种哺乳动物细胞类型的能力，腺病毒载体在临床基因治疗的早期努力中得到广泛利用。
不幸的是，最初使用的以腺病毒第5型(Ad5)为基础的载体，有几个特性限制了它在初步应用上的成功。这些特性包括宿主对腺病毒的免疫反应(综述见参考文献55)，以及病毒无法有效地进入某些靶细胞类型(20,58,59)。因此，目前有兴趣的是那些能够激发较低攻击性的宿主免疫反应，并能够以较高效率进入靶细胞的腺病毒类型。
已知大量可替换的腺病毒血清型，可在一些应用中提供胜过以Ad5-为基础的载体的优势。最近已经加以修饰而作为载体的其它腺病毒包括绵羊腺病毒287(29,53,56)、牛腺病毒第3型(40,60)和犬腺病毒(30)。考虑到这些可替换的血清型，将提供一种全新的载体骨架，它在靶宿主中没有预先存在的免疫反应，而且，因为腺病毒的复制性能具有严格的物种特异性(50)，所以通过使用衍生自亲缘关系遥远的腺病毒物种的载体，可获得一定程度的安全性以防不适当的载体复制。
有几方面的理由寻求这些可替换的病毒亚型。这些病毒，就其在非人类宿主上的疫苗应用而言，如果适当地加以修饰，可激发出比以人类腺病毒为基础的载体更有效的免疫应答。再者，可预期有复制能力的病毒将产生更强免疫应答；因此在可允许部分或完全复制的宿主中载体最有效。以人类腺病毒为基础的载体，在几乎所有的非人类宿主中均不会如此。
本发明的一个目标是提供一种可替换的腺病毒载体，其作为基因转运载体和疫苗使用。
为解决本发明的问题，已经挑选鸟类腺病毒CELO来加以修饰。1957年CELO(鸡胚致死孤儿病毒或禽腺病毒第1型，在39中回顾)被定性为传染原(57)。CELO病毒的感染少有严重危害健康或经济的后果。可从健康的鸡群中分离出CELO，且通常实验性地再导入鸡群不会引起疾病(10)。
CELO病毒在结构上与哺乳动物腺病毒(哺乳动物腺病毒属)类似，具有70-80nm的二十面体衣壳，该衣壳由六邻体和五邻体结构所构成(33)；该CELO病毒基因组为一种线形双链DNA分子，该DNA被病毒编码的核心蛋白聚集在病毒粒子中(33,36)。CELO病毒的基因组比Ad5的更大(44kb：约36kb，参考文献6,WO 97/40180)。CELO病毒粒子在每个顶点具有两根不同长度的纤维(24,33,35)，而大部分其他血清型只有单根纤维(在50中回顾)。CELO病毒不能够互补Ad5的E1A功能，而且CELO病毒的复制无法由Ad5的E1活性促进(37)。CELO的完整DNA序列(6,WO 97/40180)显示出CELO病毒与哺乳动物腺病毒属之间的额外差异，包括缺少与Ad5早期区域E1A、E1B、E3和E4相对应的序列。CELO基因组包含左末端约5kb的序列和右末端12kb的序列，富含开放阅读框，该框不含与Ad5同源的序列，但很可能编码该病毒的早期功能。
在将CELO发展成基因转运载体时，已经考虑到该病毒在哺乳动物细胞中为天然缺陷的，该特性应该限制了与野生型哺乳动物腺病毒互补的可能性。CELO病毒粒子比Ad5的病毒粒子具有增加了的DNA包装能力和高得多的物理稳定性。CELO的一个实用特性为能够使该病毒在鸡胚中生长，这是一种低成本、极方便的体系(9,33)。
在本发明的实验中，已经研究过CELO的边界序列，即CELO基因组最左边的5kb和最右边的13kb，大部分是未经勘察的而且不常见于其他腺病毒。已经应用病毒遗传学以确定在病毒复制时这些左末端和右末端CELO序列的必要特征。为了确认这些区域对于复制是必要或不必要的，已经在不连续的步骤中缺失了这些病毒序列。为便于监视突变种的复制，在被缺失的序列位置插入萤光素酶表达盒。经过修饰的CELO基因组利用在大肠杆菌中的同源重组作用改造成细菌质粒(5)。接着，病毒基因组通过酶消化作用从质粒骨架上释放出来之后，转染到一种支持野生型CELO复制的鸡细胞系中。通过优化聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染方法来促进病毒DNA大分子(大约50kb)的转染(1,3)。此外，对于所有的突变，利用一种带有突变种中已缺失的CELO序列的质粒进行第二次转染，以判定是否该突变是可以互补的。观察以初始转染物的裂解物处理过的细胞中萤光素酶的产生使我们能够判定是否已经发生了病毒复制和转导病毒颗粒的生产。使用这些策略来判定左边和右边边界序列的必要部分。像预期的一样，有些序列是顺式中所需要的，它们可能包含组装信号、转录启动子或其他转录信号。
本发明涉及重组CELO病毒和CELO病毒DNA，它们的跨CELO野生型病毒基因组核苷酸41731-43684的区域被完全或部分缺失和/或在该区域含有插入序列。
已经将该CELO病毒(DNA)及其衍生物分别命名为CELO AIM46或CELO AIM46衍生物。
在一个实施例中，本发明涉及在核苷酸41523-43684区域内完全或部分缺失和/或有插入的CELO AIM46衍生物。
在另一个实施例中，本发明涉及在核苷酸41002-43684区域内完全或部分缺失和/或有插入的CELO AIM46衍生物。
在另一个实施例中，本发明涉及在核苷酸40065-43684区域内完全或部分缺失和/或插入的CELO AIM46衍生物。
优选地，完全缺失以上所限定的区域以便提供更多空间在该缺失部位插入外来的DNA。
本发明的经过修饰的病毒，衍生自CELO病毒，在基因组右末端含有缺失和/或插入，具有复制能力并可携带比野生型基因组至少多3.2kb的DNA。
更特别地，本发明的CELO病毒和CELO病毒DNA携带一处野生型CELO序列的缺失供CELO病毒基因组中外来基因的一种表达盒的插入，该缺失跨越的区域大约从核苷酸40,000到病毒基因组右末端的大约200 bp以内。可能被完全或部分缺失或断裂的区域因此被限定为由最后三个向右的开放阅读框编码的99个以上氨基酸残基的肽，而正常存在于病毒基因组最后100-200bp内的病毒的末端重复功能仍维持连续。此外，本发明的CELO病毒和CELO病毒DNA视需要可在由CELO dUTPase(794-1330)的开放阅读框限定的区域内有一处缺失。
在本发明所用的CELO核苷酸序列编号衍生自参考文献6,WO97/40180，和GenBank U46933，其中描述了野生型CELO病毒基因组的序列。
由于上述所定义的CELO AIM46及其衍生物允许大片段外来DNA的插入，所以它们可用作生产CELO病毒载体的起始物。
人们惊奇地发现CELO AIM46可容忍3.3kb的插入序列而不损害病毒的生长，藉此可预期大到约10kb的更大DNA的插入序列也可被该病毒接受。可由技术人员在常规实验中逐渐增加插入序列的大小并判定病毒的生长参数从而能够轻易地测试最大片段的限制，就像在本发明的实验中一样。
除了允许一种基因表达盒的插入之外，本发明的重组CELO病毒已经显示能够在LMH细胞和鸡胚中复制，而无互补作用。
本发明的重组CELO病毒的另一个优点是，它所产生的病毒数量可与野生型CELO相比拟。还有，发现AIM46载体转导哺乳动物细胞的能力可与Ad5载体相比拟，证实CELO载体的有效哺乳动物细胞受体结合能力和/或进入活性。
由于CELO AIM46的41731-43684缺失，仅移走从核苷酸41002开始的开放阅读框的一部分，整个的ORF应该是可有可无的因此可将其缺失。因此，该缺失可包括从核苷酸41002-43684的序列。
在本发明的一个实施例中，将目的基因插入缺失区域以外的其它基因组位置，所指缺失位置分别从核苷酸41731-43684、41523-43684、41002-43684或40065-43684；在该情况下，载体还可另外提供空间以插入其它外来的遗传物质。任何证实为可有可无的区域均可选择，插入外来DNA的一个优选区域是在dUTPase开放阅读框(核苷酸794-1330)。
本发明所指的病毒生长至野生型水平并形成一种有复制竞争力的疫苗株系的基础。CELO AIM46还用于开始进行CELO细胞有关物种和细胞类型向性的分析，获得该载体开发应用方面的重要信息。CELO AIM46及其包括额外修饰的衍生物，可用于转运基因到鸟类细胞中，该转运的效率比带有相同标记基因的Ad5载体的效率好10-100倍。惊人的是，许多哺乳动物细胞类型，例如人类、牛、马、猴、鼠、狗中，CELO AIM46的功能效率可与Ad5载体相比拟，证实了CELO载体在哺乳动物基因运送应用上的效用。
在另一个实施例中，本发明涉及重组CELO AIM46病毒及其衍生物的制备。
为了制备重组CELO病毒，CELO病毒DNA被导入支持CELO病毒复制的细胞。可使用任何标准的基因转移方法以导入DNA，例如转染、显微注射，等等。优选地，病毒DNA通过聚乙烯亚胺介导的转染途径被导入细胞中，如同(3)所描述。
支持CELO病毒复制并因此用于CELO病毒生产的细胞，可选自永生化细胞系如LMH(27)或选自原代鸟胚细胞，特别是肾或肝细胞。要确认有用的细胞系，可测试细胞的传染能力和扩增病毒接种物的能力。
换言之，重组CELO病毒可通过将CELO病毒导入鸡胚来制备，优选地先以CELO病毒DNA转染上述细胞，并将该细胞培养一段时间，以产生足够的病毒量供鸡胚注射并在其中扩增该病毒。
为了制备重组CELO病毒，首先确认对病毒复制可有可无的区域。为此，在质粒上克隆CELO基因组的亚片段，该片段大到足以促进CELO基因组的重建(例如1,000-15,000bp)并且小到具有至少一个，优选地5-10个特有的限制位点。所克隆的质粒经标准限制酶消化处理，缺失CELO基因组的各个片段，并在相应位置插入报告基因构建体。然后使用标准的连接或重组方法，将这一经过处理的片段插入完整的CELO基因组中，例如细菌质粒中，代替相对应的野生型片段。然后通过限制消化作用使经过修饰的CELO基因组从质粒主链中释放出来，并导入支持CELO病毒复制的细胞内，如图1示例。
在CELO AIM46的案例中，亚片段含有从核苷酸1-5503和30502-30644和40064-43804的CELO序列。缺失41731-43684的EcoRV片段代之以一种表达盒，例如萤光素酶表达盒，以产生pAIM44。以HpaⅠ将其线性化，与野生型CELO DNA重组以产生pAIM46。通过SpeⅠ消化作用从质粒上切下CELO序列，并导入LMH细胞中，开始病毒的复制。
另外，重组可在支持病毒复制的鸟类细胞中进行，例如LMH细胞，通过导入含有用第二个CELO片段缺失/插入的经过修饰的CELO亚片段，使得在两个片段之间有部分重叠的同源性，从而能重组出带有所需缺失/插入的全长CELO基因组。
在本发明的实验中，已经确认病毒复制所必需的CELO基因组区域。最重要的是，已经确认病毒基因组左末端的一个可以缺失并以反式提供的区域。因此该区域可用来建立一种互补的细胞株。还有，已经确认该基因组右末端的一个区域可以缺失而对于病毒在细胞培养或是在胚胎中的复制并无可察觉的影响。已经显示在该区域可插入外来基因的表达盒。已经证实CELO载体能够组装成比野生型基因组的大小再多3.2kb的DNA序列，该野生型基因组已经比Ad5载体大8kb。已经开发出带有萤光素酶表达盒或EGFP表达盒的有复制能力的CELO载体。这些载体转导各种鸟类和哺乳动物细胞类型的能力被监视。如同预期的，CELO载体在鸟类细胞中工作得比Ad5载体好很多。然而，对测试过的所有哺乳动物细胞类型中，CELO载体的转导效率意外地可与Ad5载体相比拟。
本发明的载体在鸟类中作为疫苗应用，其中病毒的复制可激发免疫应答。病毒能够在廉价的鸡胚中繁殖的能力，有助于为这些用途中的任何一种产生大量的载体。
关于疫苗的应用，外来DNA编码一种或多种抗原，它们在个体中诱发免疫应答。该抗原可以是衍生自病原体的天然蛋白质，或是其免疫原性的片段，例如免疫原性肽。
为驱动该外来基因的表达，可使用表达盒，它通常包含一个在靶细胞中具有活性的启动子、目的cDNA、一种多聚腺苷酸化信号以及一个可选的内含子。另外，插入修饰过的CELO基因组内的DNA可包括内源性CELO启动子、内含子和多聚腺苷酸化信号，来驱动目的cDNA表达。
可通过常规方法制备的有效表达盒的一个实例，是在本发明实施例12中描述的构建体，其衍生自命名为PPM7的质粒。它含有巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子，接着是带有PacⅠ、HpaⅠ和KpnⅠ位点的短的多聚连接子，接着是一种兔子β球蛋白内含子/聚腺苷酸化信号。该CMV/β-球蛋白物质可衍生自本领域中已有的质粒(例如质粒pLuc(74)，它带有萤光素酶基因)，通过PCR修饰加入侧翼限制位点，例如BamH1，随后通过同源重组修饰作用，以PacⅠ/HpaⅠ/KpnⅠ多聚连接子代替萤光素酶cDNA。可将最后的BamHⅠ表达盒克隆到pSP65中以产生pPM7。使用特有的限制位点(PacⅠ/HpaⅠ/KpnⅠ)，将欲克隆到CELO AIM46衍生物中的cDNA先克隆到pPM7内。接着制备含有CMV启动子/cDNA/β-球蛋白单元的限制或PCR片段，例如BamHⅠ片段，其通过同源重组导入被PacⅠ线性化的pAIM46。CMV和β球蛋白序列为重组提供了同源性，因此可利用目的新cDNA代替萤光素酶cDNA。
可修饰上述的表达盒，例如通过使用各种其他的病毒或细胞启动子，包括但不限于SV40增强子启动子、劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(RSVLTR)、人类β-肌动蛋白启动子、CELO病毒主要晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、大鼠胰岛素启动子等，来代替CMV增强子/启动子。
另外，对于兔子β-球蛋白内含子/多聚腺苷酸化信号，可包括但不限于得自SV40、得自其他病毒和得自其他细胞基因的内含子/多聚腺苷酸化信号。
另外，关于使用表达盒，外来的cDNA可以是在一段限定的CELOAIM46区域或脱氧UTP酶区域内的一处简单插入，因此使用内源性的CELO调节序列，例如启动子、内含子、多聚腺苷酸化信号。
在欲从CELO载体中表达两种不同的外来cDNA的情况下，例如编码得自一种病原体的两种不同抗原的cDNA，可以使用下列策略：在第一个实施例中，可将两个基因表达盒(带有不同的cDNA和不同的调节序列)插入CELO基因组中。另外，亦可使用一处内部的核糖体进入位点(IRES)，从而用单一的启动子，提供两种cDNA的表达，如同例如70；67；71；72所述。因此，用于CELO AIM46的、带有两种待表达的cDNA的代表性表达盒，包括一个启动子、第一条cDNA、一处IRES和第二条cDNA，随后是可选的一个内含子和一种多聚腺苷酸化信号。
外来的cDNA，例如抗原cDNA，可利用标准方法来从病原体的基因组中分离，例如通过PCR或限制消化作用，可选地包括反转录作用，将RNA转变为DNA，并导入一种带有调节序列和特有限制位点的转运载体内，例如pPM7。随后，在带有CELO基因组，并具有同样调节序列和相应的限制位点的线状质粒，例如质粒pAIM46中，重组该抗原表达盒。所产生的带有该抗原cDNA的CELO-AIM46载体可以生长于鸡胚并从鸡胚中纯化。
在WO 97/40180中提供了适用于疫苗应用的抗原的实例，在此全文引用作为参考。
可由疫苗病毒携带的抗原的更多实例有，传染性腔上囊病病毒(IBDV；64)的抗原和鸡球虫的抗原，例如堆型艾美虫(Eimeria acervulina)、波氏艾美虫(Eimeria brunetti)、巨型艾美虫(Eimeria maxima)、和缓艾美虫(Eimeriamitis)、尼氏艾美虫(Eimeria necatrix)、塞前艾美虫(Eimeria praecox)和禽艾美虫(Eimeria tenella)(61,62,63)，抗原的实例为寄生虫折射体转氢酶、乳酸脱氢酶、EalA和EaSC2(在77中回顾)。
还有些抗原实例为猪病原体猪α疱疹病毒1型的糖蛋白C(gC，糖蛋白gⅢ)(假性狂犬(Aujeszky′s)病的致病原)(75；76；69)。可使用携带gC的CELOAIM46载体，在猪身上诱发抗-假性狂犬病的应答。
如同上文提及的，使用具有复制竞争力的病毒可预期到强有力的免疫应答。因此，一种载体在部分或完全允许其复制的宿主中是最有用的。根据这点，本发明的CELO载体，即CELO AIM46及其衍生物，理论上适合于鸟类疫苗的应用。
本发明的重组CELO病毒载体，亦可用于人类疫苗的应用，在此情况下，外来的DNA编码衍生自人类病原体的抗原。
以根据本发明修饰过的CELO基因组为基础的CELO载体，亦可用于哺乳动物体系的基因转移；用人类腺病毒进行人类基因治疗的经验导致对非-人类腺病毒还有争论。预先存在的对人类腺病毒免疫应答，可损害基于人类腺病毒的载体的起始转导，或可能加重对转导细胞的细胞免疫反应。患者可能缺乏应对来自遥远物种的腺病毒的免疫经验(虽然2/7的患者具有犬腺病毒载体的中和抗体；30)，而宿主对病毒抗原的应答将不会影响转导的起始。除了某些农业工作者之外，不能期望大部分的人群曾经与CELO抗原有免疫接触。因此CELO载体可能具有胜过基于较常见的人类腺病毒血清型的载体的优点。
本发明以CELO为基础的载体另一个概念上的优点为，CELO就像牛、羊和犬的腺病毒一样，在人类细胞中是天然复制缺陷的。因此，在人类患者中将不会出现这些载体的复制，即使存在野生型人类腺病毒的感染也是如此。
再者，通过本发明的缺失分析，将促进产生具有复制缺陷的CELO载体的能力。本发明的发现提供了构建表达CELO互补功能的细胞株的基础。
对于基因治疗的应用，外来DNA可包括任何一个或多个DNA分子，它们编码具有治疗活性的蛋白质。实例是免疫调节蛋白，如细胞因子，受体、酶、影响凋亡的蛋白质，调节血管生长的蛋白质，例如sFLT、FGF受体等等。对于肿瘤疫苗的应用，外来DNA编码一种或多种肿瘤抗原或其片段，优选地与一种细胞因子组合。
在WO 97/40180中提供了人类疫苗应用、基因治疗和肿瘤疫苗应用的实例，在此全文引用作为参考。
对于疫苗的应用，可将本发明的载体包装成肠衣包被剂、或供肌肉内、腹腔内或皮下注射的注射剂。另外，该载体还可以膏药剂或液体剂形式通过鼻腔内或气管内给药的方式使用，如气溶胶或眼内滴剂。该载体还可以合并至饲料颗粒内或投放在饮用水中来提供。
导入每例患者、动物或胚中的病毒量，可在1-1012个颗粒的范围内。
病毒制品可含有生理缓冲盐水或HEPES缓冲盐水，并可视需要混合以诸如维生素-E乙酸酯、油/水乳剂、氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、矿物油乳剂，如Bayol或Marco152，和皂角苷之类的佐剂。
还可使用冻干的病毒做为疫苗(78)。可通过受控的两步干燥法包含如10％蔗糖等稳定剂(78)。其他的稳定剂包括碳水化合物，如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白质，如白蛋白或酪蛋白，或其降解产物。
在疫苗应用中，为了增强宿主的免疫应答，通过带有特定抗原的CELO疫苗载体的应用所诱发的免疫应答，可通过再次给予相同抗原或其免疫原性片段来加强。优选地，再次给予的抗原是重组的，可利用标准方法获得，或通过下文所述的方法，使用CELO载体从胚中获得重组蛋白。载体与抗原的组合应用可按照(65,73)的描述完成。优选先给予CELO载体，再视需要与免疫刺激佐剂一起给予重组的抗原。
在本发明的另一方面中，使用CELO病毒来制备任何目的蛋白质。
在本发明的这一实施例中，以基因工程改造CELO病毒，例如CELOAIM46或其衍生物，如上所述，将编码目的蛋白质的cDNA或优选表达盒，导入本发明的重组CELO DNA的插入位点之一。病毒可通过在适当细胞中的复制而获得，如上所述，重组病毒优选通过注射入鸡胚的尿囊腔中而导入。优选地，将大约4×107个病毒颗粒导入7-9日龄的鸡胚尿囊腔中，接着在37℃下培养3-4天。然后从尿囊液、血清、卵黄、羊水中，或从胚胎本身中回收重组的物质。
目的蛋白质可以是细胞内的或分泌性的蛋白质。对于细胞内的蛋白质，在本发明的实验中(实施例11)为报告蛋白eGFP，该蛋白质可通过裂解尿囊液中堆积的感染细胞来回收。对于分泌性的蛋白质，可从胚胎的各种细胞外液(尿囊液、羊水、血清、卵黄)中回收该物质，或使用类似回收细胞内蛋白质的方法，通过裂解感染的细胞来回收。
在一优选的实施例中，目的蛋白质表达成融合蛋白，其包括该蛋白质以及作为稳定序列的免疫球蛋白Fc区。该重组蛋白的分泌可由该蛋白质的天然信号序列指导，该序列除了信号功能之外，还具有稳定作用。Fc区在细胞外空间中赋予该蛋白质稳定性，并提供一种蛋白质序列，该序列可用于利用例如蛋白质A或蛋白质A/G层析树脂进行的重组蛋白的亲和纯化。包括起稳定作用的Fc区并因此可由CELO表达的构建体已用于制造可溶形式的FGF受体2(sFGFr；66)和VEGF受体1(sFLT；68)。
除了FLT和FGF受体的信号序列之外，亦可使用来自或与卵清蛋白、伴清蛋白、抗生物素蛋白和溶菌酶融合的信号序列。这些蛋白质在鸡的肝脏和/或输卵管中合成，并在蛋中积累。因此，这些与目的蛋白融合的蛋白质，利用其一部分或全部的密码序列，可预期产生分泌性重组蛋白，它们在发育的胚胎中是稳定的；此外，使用这类序列，例如抗生物素蛋白，提供了有利于层析纯化的标签。
附图简述：
图1携带野生型和突变CELO基因组的质粒的构建；
图1A携带CELO基因组末端的质粒的构建；
图1B全长CELO基因组作为细菌质粒的克隆；
图1C经过修饰的CELO基因组的克隆；
图2 CELO左末端突变的分析；
图2，上图：开放阅读框；
图2，下图：复制的分析；
图3 CELO右末端突变的分析
图3，上图：开放阅读框；
图3，下图：复制的分析
图4野生型CELO与CELO AIM46的PCR分析；
图5免疫荧光法，监测野生型CELO与CELO AIM46的复制；
图6 AIM46与AdLuc的热稳定性；
图7 CELO与Ad5的向性；
图8使用重组Ad5或CELO载体的EGFP的转导；
图9 CELO右末端突变的分析；
图9，上图：开放阅读框；
图9，下图：复制的分析；
图10 CELO AIM46对于不同动物种的向性；
图11利用CELO AIM46衍生物制备重组的GFP；
图12利用CELO AIM46衍生物制备可溶性Fc-稳定的重组蛋白；
除非另外说明，在实施例中使用下列材料和方法：a) CELO基因组的末端片段的克隆
克隆CELO的两个末端HindⅢ片段。以HindⅢ消化CELO基因组DNA(经CsCl纯化)，1601bp的左末端片段和959bp的右末端片段从低熔点琼脂糖凝胶中纯化出来。用磷酸二酯键将腺病毒基因组的5′末端与病毒末端蛋白质上的丝氨酸残基连接(22,47)。必须去除蛋白酶消化之后遗留下的肽以便允许连接和克隆。因此，该末端肽通过加入NaOH至0.3N并加热至37℃90分钟，从DNA片段中去除(22)。然后将该溶液冷却至室温，加入Tris pH7.4至0.1M，并加入HCl至0.3M，以中和NaOH。将该片段加热至56℃20分钟，并缓慢地冷却至室温(1小时)以促进重新退火。然后纯化该DNA(Qiaquick柱，Qiagen)，加入SpeⅠ连接子(New England Biolabs目录第1085号)，并在被破坏的EcoRⅠ位点含有SpeⅠ位点(参见图1A)的pBR327(GenBankL08856，参考文献51)衍生物中，经由SpeⅠ和HindⅢ位点克隆入每个片段。左末端和右末端的HindⅢ片段都以该方式克隆并进行DNA序列分析，证实每个片段均具有300bp端。
接着，在含有一个SpeⅠ位点、一个被破坏的EcoRⅠ位点和一个ClaⅠ/BamHⅠ切除的pBR327衍生物中克隆入上述两个CELO末端片段以去除第二个HindⅢ位点，产生质粒pWü-H35(参见图1A)。b)克隆整个CELO基因组
将以HindⅢ线性化、以碱性磷酸酶处理的pWü-H35载体与纯化的CELO病毒DNA混合，并导入电穿孔诱导的感受态大肠杆菌JC8679(17,42)。在pWü-H35上的CELO末端序列与CELO基因组DNA的末端之间进行重组，产生含有全长CELO基因组的质粒(pCELO)，其侧面具有SpeⅠ位点(图1B)。c)CELO基因组左末端的修饰
含有巨细胞病毒立即早期增强子/启动子、萤光素酶cDNA(14)，接着是兔子β球蛋白内含子/多聚腺苷酸化信号的萤光素酶表达盒，衍生自pCLuc(45)，经过PCR修饰在侧翼加入BamHⅠ位点并克隆到pBlueScriptⅡ(SK)内，产生pBlueLuc。对于大部分的CELO插入序列而言，萤光素酶表达盒经BamHⅠ消化从pBlueLuc中分离出来，并以Klenow酶处理将其末端钝化。
左末端CELO区域的修饰使用pAMI3进行，它在pBR327骨架上含有CELO左末端(核苷酸1-5501)和一部分右末端(核苷酸30500-30639，以及核苷酸40065-43804；通过从pWüHpa中去除一个Asp718片段而衍生出来)。CELO基因组中的这种缺失，涉及在pAIM3的CELO左末端序列中两个酶位置处消化，亚区域的切除，接着是萤光素酶表达盒的插入。所有操作均通过限制性分析和序列分析证实。该策略被用于产生转移质粒pAIM7、16、22、23和24(参见表1)。CELO核苷酸序列的编号是衍生自参考文献6和GenBankU46933。d)重组CELO基因组的产生
使用Asp718和HpaⅠ通过双重消化作用，将质粒pAIM7、16、22、23和24线性化，并通过同源重组在大肠杆菌BJ5183中与纯化的CELO DNA重组(5,13)，产生CELO基因组质粒pAIM11、21、25、26和27。图1C和表1解释了所应用的技术：
图1C显示经过修饰的CELO基因组的克隆。步骤1：转运载体的制备是使用标准连接克隆法处理CELO基因组如pWü-H35(带有CELO的末端HindⅢ片段)或pWüHpa(带有CELO的末端HpaⅠ片段)的亚片段，以缺失部分CELO基因组并插入一个萤光素酶表达盒。步骤2：将线性化的转运载体与野生型CELO基因组DNA重组。重组以两种方式发生，或者包括缺失/萤光素酶表达盒，或者排除缺失/萤光素酶表达盒，以产生野生型CELO质粒。通过限制酶消化和测序来确认帝有所需突变的质粒，并用于启始病毒的感染。(测序所有构建体的缺失区域以确认该构建体；参见表1)。e)CELO基因组右末端的修饰
使用类似上述那些方法，产生含CELO左、右HpaⅠ片段的质粒，并处理以插入萤光素酶表达盒，并从33358-43684(pAIM43)或41731-43684(pAIM44)中去除EcoRV片段。这些质粒在特有的HpaⅠ位点处线性化，并在BJ5183细胞中与野生型CELODNA重组，产生pAIM45或pAIM46。f)对LMH细胞中重组CELO基因组的评估和病毒母液的制备
以SpeⅠ消化重组CELO质粒，从该质粒中释放出病毒基因组，以酚、氯仿提取，然后通过以TE平衡的凝胶过滤(Pharmacia Nick Column)纯化。
使用改良的PEI技术制备转染复合物(1,3)。通过以下两个步骤用PEI浓缩DNA：将分子量2000的PEI(2.5μL 10mM PEI在125μL HBS(150mMNaCl、20mM HEPES,pH7.4)中)逐滴加至以125μL HBS稀释的3μg DNA中。样品在室温下孵育20分钟。接着将分子量25000的PEI(3.5μL 10mM在125μL HBS中)逐滴加至样品中，并在室温下再孵育该复合物20分钟。
将雄性来亨鸡肝癌(LMH)细胞(27)在转染前一天接种在24孔板上(24孔板)，7×104个细胞/孔。转染时，细胞培养基以400μL补充有10μg/ml多粘菌素B的DMEM(无血清)代替。将转染复合物(90μL/孔)加至细胞中，37℃4小时，随后将该培养基替换为新鲜的、含有血清的培养基。转染24小时后，通过测量细胞裂解液中萤光素酶的活性监测转染效率。
为测试病毒的扩增作用，按下述制备澄清的转染或转导细胞裂解液。收获细胞和上清液，离心收集细胞，并将细胞团重新悬浮于2ml处理过的上清液中。将该物质冻融3次，在超声波震荡浴中震荡以释放出病毒颗粒，细胞碎片通过离心去除，澄清的裂解液用于在新鲜的LMH细胞培养基上进一步扩增。按前述用CsCl梯度进行CELO的纯化(9)。病毒的定量以蛋白质含量为基础，转换系数为1mg/ml蛋白质等于3.4×1012个病毒颗粒/ml(34)。g)表达CELO AIM46衍生物(CELO AIM53)的EGFP的构建
pAIM46中的萤光素酶cDNA以EGFP cDNA代替后产生pAIM53。该替换是通过大肠杆菌中pAIM46与pAIM52之间的同源重组作用完成的，其中pAIM46在萤光素酶cDNA特有的PacⅠ位点处线性化pAIM52是一种带有EGFP cDNA的转运载体，所述EGFP cDNA受控于在pAIM46的萤光素酶表达盒中使用的相同的CMV启动子和β-球蛋白内含子，以及多聚腺苷酸化信号，因此提供重组的同源性。h)pPM7的构建
转移质粒pPM7含有巨细胞病毒立即早期增强子/启动子，接着是带有PacⅠ、HpaⅠ和KpnⅠ位点的短的多聚连接子，然后是兔子β-球蛋白内含子/多聚腺苷酸化信号。它的获得方法如下：由pCLuc(74)产生CMV/β-球蛋白物质，经PCR修饰在侧翼加入BamHⅠ，并通过同源重组作用修饰，以PacⅠ/HpaⅠ/KpnⅠ多聚连接子替换萤光素酶cDNA。将最后的BamHⅠ表达盒克隆到pSP65中产生pPM7。j)重组腺病毒5型的制备
AdLuc：经由侧面的BamHⅠ位点将萤光素酶表达盒克隆到pDElsp1B内(2)，产生pDElsplBluc，其中萤光素酶cDNA具有与E1转录相同的方位。将pDElsplBLuc与pJM17(2)共同转染到293细胞(19)内之后，通过重组作用，产生重组的病毒。转染10天后，制备细胞裂解液，用于感染新鲜的293单层细胞，病毒从单个空斑中扩增。使该物质再通过2轮斑点纯化、扩增，经CsCl梯度纯化，并通过蛋白质含量定量(1mg/ml蛋白质=3.4×1012个病毒颗粒/ml；参考文献34)从中制备此处所用的病毒母液。
AdGFP：使用AseⅠ/Mlul从pEGFP-Cl(Clontech)中切下一个含有CMV启动子、EGFP编码区和SV40 poly A序列的片段。利用Klenow技术填满突出端，并克隆到pDElsp1B的EcoRV位点(2)内，该质粒中的EGFP表达盒与E1转录的方位相同。依上述通过与pJM17在293细胞中的重组作用，产生重组的病毒。k)病毒的热稳定性的分析
在HBS中将CELO AIM46和AdLuc稀释成4×109颗粒/100μL的浓度(甘油终浓度为2.4％(体积/体积))，并暴露在从48-68℃范围的温度下30分钟。随后，测试一等份病毒将萤光素酶活性转导至A549或CEF38细胞中的能力。l)免疫荧光法
将LMH细胞接种在包被着明胶的玻片(Labtek,Nunc)上，密度为105个细胞/室，并在第二天用CELO AIM46或野生型CELO病毒以500个病毒颗粒/细胞的浓度在含有2％FCS的DMEM中感染。感染后在指定的培养时间点，将细胞在室温下固定在冷甲醇∶丙酮(1∶1)中，通过如下的免疫荧光法观察CELO蛋白质：非特异性的结合位点用PBS+1％BSA在室温下1小时封闭。多克隆抗CELO抗体以PBS+1％BSA按1∶1000稀释，并孵育1小时。随后在室温下以PBS冲洗3次，每次5分钟，加入与FITC(1∶400稀释)偶联的山羊抗兔(Boehringer-Mannheim)检测抗体的PBS+1％BSA溶液。再度冲洗玻片，在最后一次冲洗时加入DAPI使核呈现，将该玻片封固于MOWIOL上，进行荧光显微镜检查。m)抗-CELO病毒粒子多克隆血清的制备
以100μg在完全弗氏佐剂中，经CsCl纯化、热灭活(70℃,60分钟)的CELO病毒粒子注射兔子，在2、4和5周时以100μg在不完全弗氏佐剂中的CELO加强免疫，随后收集血清。蛋白质分析证实此处所用的收集血清，与所有主要的CELO衣壳蛋白特异地反应，但不与未感染的鸟类细胞的裂解物反应。n)其它试剂
如前所述(9)，从感染的鸡胚中纯化出野生型CELO(FAV-1,Phelps)(鸟类腺病毒1型，鸡胚致死孤儿病毒；CELO美国典型培养物保藏中心：ATCCVR-432；病毒株：Phelps；(57))。
LHM细胞系(27)获自ATCC第CRL-2117号，A549细胞系也获自ATCC第CCL-185号，而正常的人类真皮成纤维细胞则获自Clonetics，并于传代5-15次之间使用。命名为CEF 38的鸡胚成纤维细胞系，是根据已知的方法，从成纤维细胞中建立的；它允许CELO病毒进入，但并不支持CELO复制。所有四种细胞类型均在DMEM/10％FCS中培养。
293细胞系(19)获自ATCC(第CRL-1573号)，并培养在含有10％新生牛血清的MEMalpha中。
细胞系MA-104(恒河猴(Macaca mulatta)(恒河猴肾脏、胚胎、上皮))获自ATCC(第CRL-2378号)。
细胞系ED-2(马，真皮成纤维细胞)获自ATCC(第CCL-57号)。
以下细胞系获自BFAfV；Riems(Zellbank fur Zellinien in derVeterinarmedizin；BFAf.Viruskrankheiten derTiere,17498 Insel Riems)：SPEV(猪，肾脏，胚胎，“verseniert”；目录第8号)；FLU-R(猪，肺，胎儿；目录第113号)；WSH-R(野猪，皮肤，胎儿；目录第388号)；KN-R1(牛，肾脏，胎儿；目录第028号)；KMU-R(牛，肌肉，胚胎；目录第098号)；KLU-R1(牛，肺，胚胎；目录第091号)。
实施例1CELO基因组的质粒拷贝的构建
一开始从CELO病毒DNA中纯化出CELO的末端HindⅢ片段，通过碱处理去除末端肽，加入编码SpeⅠ限制位点的连接子，将两个末端片段以正确的方位克隆到低拷贝数目的质粒内(图1A描述带有CELO基因组末端的质粒的构建。以HindⅢ消化CELO基因组DNA，分离两个末端片段并进行处理以便去除末端肽，并在加入SpeⅠ连接子之后以SpeⅠ、HindⅢ片段的形式进行充隆，产生质粒pWü-H35。)。利用特有的HindⅢ位点将编码病毒两个末端的质粒(pWü-H35)线性化，并与CELO基因组DNA重组，在细菌质粒上产生全长CELO基因组，其侧面有SpeⅠ位点(参见图1B，其显示全长的CELO基因组的细菌质粒克隆。利用HindⅢ将pWü-H35线性化，并与CELO基因组DNA重组，产生CELO基因组的全长质粒克隆。天然末端重复序列侧翼为SpeⅠ位点，以允许从细菌质粒中切除病毒的基因组。在CELO基因组内并没有SpeⅠ位点。)。由此获得该病毒基因组几个独立的克隆，并通过限制性分析和转染所产生的病毒量确认其正确的结构。
实施例2a)病毒复制所需的特有序列的分析
开发出一种筛选方法，用于确定病毒复制所需的CELO序列。在细菌中使用同源重组，将缺失首先导入病毒基因组的细菌质粒拷贝中。在各种情况下，均使用萤光素酶表达盒代替所缺失的病毒序列，以允许在支持野生型病毒复制的细胞中监测最初的转染效率，以及在后续传代中监测突变病毒的复制和转导潜能。如同下文所示，该CELO基因组允许插入至少比野生型的基因组大1.7kb的序列，因此不会发生因导入萤光素酶表达盒本身而导致对复制的损害。从质粒中切下突变的病毒基因组，并单独转染至LMH细胞以确定是否该缺失去了必要的DNA序列，或者与带有跨越该缺失的CELO基因组区域的质粒一起转染LMH细胞，以确定是否该缺失的互补作用会发生。转染5天后，将细胞裂解，一部分裂解液用于测定萤光素酶活性以监测转染的效率，第二部分裂解液用于感染新鲜的单层LMH细胞。再过5天后，监测致细胞病变效应，制备裂解液并测定萤光毒酶，并再使用一部分裂解液来感染新鲜的LMH细胞。b)CELO左末端的分析
使用a)中所描述的策略，分析特有的左末端CELO序列的复制功能。在图2A中显示99个氨基酸和更多的左末端开放阅读框的图谱；CELO基因组左侧约5000个核苷酸中超过99个氨基酸残基的开放阅读框以黑色(向右转录)或灰色(向左转录)指示。标出了编码脱氧UTP酶(dUTPase)和与小DNA病毒REP同源的蛋白质(REP)的开放阅读框。编码有功能的dUTPase的开放阅读框发现于位置784处(54)。始于位置1991处的开放阅读框编码一种与小DNA病毒REP基因显著同源的蛋白质。另外五个开放阅读框也被标出。
图2显示对复制的分析。导入CELO基因组内的缺失的核苷酸编号列在图2的上图和表2中。利用SpeⅠ将修饰过的CELO基因组线性化，以便从细菌质粒中释放出基因组，并单独转染到LMH细胞中，或在带有野生型CELO序列1-5501的质粒(pB5.5)的存在下(“加上左末端”)转染LMH细胞。转染5天后，收获细胞，通过冻/融和超声波震荡将细胞裂解，细胞裂解液用于新鲜的LMH培养。该扩增作用被重复两次，并测试病毒第三次传代的等份试样将萤光素酶活性转导至LMH细胞中的能力。三次转导作用的平均值和标准差被标出。
突变基因组的构建首先去除整个区域(pAIM11)或缺失开放阅读框(pAIM21、25、26、27)的单个或一小组。当通过转染导入LMH细胞时，具有去除了整个区域的缺失的pAIM11，在第一次裂解液中萤光素酶是呈阳性的，但是不能在后续的传代中转移荧光素酶的基因表达，不管是否有互补的左末端片段的存在。
更具个别性的突变(pAIM21)，仅中断未知ORF中的三个，却保留完整的dUTPase和REP样ORF。然而，与pAIM11相似，pAIM21基因组亦不能在后续的传代中转移萤光素酶的基因表达，不管是否有互补的左末端片段的存在(图2B)。因此，两种突变作用改变的序列一定是以顺式存在于病毒复制中。pAIM27仅缺失REP，而pAIM25和26缺失dUTPase、REP和一个未知的开放阅读框。这三个基因组均在第一次的裂解液中产生萤光素酶活性。后续的传代显示，CELO AIM25、26和27均不能在缺乏互补之下复制。然而，不像pAIM11和21，如果最初的转染包含了互补的左末端质粒，则观察到可传代的萤光素酶活性(图2B)。这三种互补的病毒(CELO AIM25+、26+和27+)在LMH细胞中再传代扩增6次后，令人惊讶的是，其转导萤光素酶活性的能力仅适度地下降(结果未显示)。PCR和DNA分析显示在传代3次的物质中，明显地显示了大量的野生型CELO，证实重组已经发生，原始的突变中被缺失的序列被重新导入。因此，产生了大量的野生型CELO，并给带有萤光素酶突变的CELO提供了互补功能。
总之，左末端序列的一个区域(在2981和4334之间)被确认为是病毒以顺式复制所必要的。第二个区域(在938和2900之间)被确认为是病毒复制所必需的，但可反式提供。形式上，一连串的重组事件是有可能产生包含原来被缺失的序列和萤光素酶表达盒的病毒基因组，然而，该模式最简单的解释是在pB5.5和突变CELO基因组之间发生了简单的重组，产生野生型CELO基因组，在后续的传代中给该混合物中少量的突变(萤光素酶阳性)病毒提供了互补活性。这些病毒基因组中，有一些含有超过野生型大小的净插入序列，其中最大的含有1616bp的缺失与3.3kb萤光素酶表达盒的插入序列组合。因此，野生型的CELO，已经比Ad5大8kb，可包装至少另外1700bp的序列。
实施例3一部分CELO右末端是可有可无的
使用类似的突变策略，进行CELO右末端序列的最初分析。基因组质粒pAIM45含有33358-43684的大缺失，缺失了99个或更多的氨基酸的10个ORFs，包括先前定性过的GAM1基因(图3，参考文献7)。质粒pAIM46含有更具个别性的41731-43684的缺失，中断了两个ORFs(图3描述CELO右末端突变的分析)。所进行的分析概述在实施例3图2B，除了右末端的互补质粒pB13.3被用来代替pB5.5(泳道标以“加右末端”)。两种突变基因组均包括以萤光素酶表达盒来代替所缺失的序列。
将pAIM45和pAIM46单独转染到LMH细胞内，或与带有野生型CELO右末端序列的质粒(pB13.3)一起转染。所转染的细胞裂解物中获得萤光素酶活性，证实转染的成功(结果未显示)。该物质在新鲜的LMH细胞上后续的传代显示，带有大范围右末端缺失的pAIM46，不能产生感染性CELO颗粒，无论是否有完整的右末端序列的存在(图3)。不必惊讶，该大范围缺失作用去除了必要的序列，而且很最可能其中一些必需以顺式存在，如同通过野生型右末端序列的互补的缺乏所证明。相反，pAIM46基因组不管是否存在互补基因组片段，均发现产生感染性和可传代的病毒(图3)。因此，pAIM46中两个中断的开放阅读框，对于CELO在细胞培养基中生长和在鸡胚中生长，是可有可无的(参见实施例5)。
为证实pAIM46和CELO AIM46所携带的基因组的结构，进行了PCR分析以便证实质粒中构建的缺失/插入保留在扩增过的CELO AIM46病毒的基因组中。
PCR所用的引物如下：
OAIM24:(CCGAGAATCCACCAATCGTA)是在CELO右末端(在核苷酸41699处)杂交的正义寡核苷酸链。
OAIM25:(CAGCGTGTCGCTATACGCAA)是在CELO右末端(在核苷酸43752处)杂交的反义寡核苷酸链。
OAIM26:(GCGATGACGAAATTCTTAGC)是在萤光素酶表达盒中杂交的正义寡核苷酸链。
使用引物OAIM24和25的PCR，以野生型CELO为模板应产生一段2053bp的产物，以AIM46为模板应产生一段3422bp的产物。使用引物OAIM24和26的PCR，以AIM46为模板应产生一段958bp的产物，而以野生型CELO为模板则没有产物产生。
野生型CELO与CELO AIM46的PCR分析结果显示在图4：
以M标示的泳道：标记物DNA，(EcoRⅠ/HindⅢ切割的λDNA)；泳道2-6：使用引物OAIM24+OAIM26，其中泳道2：无关的目标DNA；泳道3：野生型CELO DNA；泳道4：质粒pAIM46 DNA；泳道5和6：分离自CELOAIM46的DNA；泳道7-11：使用引物OAIM24和OAIM26，其中泳道7：无关的DNA；泳道8：野生型CELO DNA；泳道9：质粒pAIM46 DNA；泳道10和11：分离自CELO AIM46 DNA的DNA。一些标记分子(左侧)和预期的PCR产物(右侧)标示出DNA的大小(以bp计)。
如图4所示，质粒pAIM46和分离自病毒CELO AIM46的DNA都产生预期的PCR产物。跨越缺失/插入位点的引物产生的预测PCR产物为：pAIM46目标DNA(图4，泳道4)和衍生自两种CELO AIM46制品的DNA(图4，泳道5和6)的产物为3422bp，而以野生型CELO DNA为模板的PCR，产生2039bp的预期DNA分子(图4，泳道3)。再者，识别萤光素酶插入序列的引物产生的958bp预期产物，是来自pAIM46衍生的DNA或来自CELOAIM46的两种分离物(图4，泳道9-11)，而不是来自野生型CELO衍生的DNA(图4，泳道8)。
实施例4CELO AIM46与野生型CELO复制的免疫荧光分析
萤光素酶数据显示CELO AIM46可在缺乏互补作用时在LMH细胞中复制。为更直接地分析CELO AIM46的复制，与野生型CELO做比较，使用这两种病毒类型感染LMH细胞，并通过免疫荧光显微镜用抗CELO衣壳蛋白的多充隆抗血清，来监测病毒感染的进程。图5显示免疫荧光法，监测野生型CELO与CELO AIM46的复制。利用CELO AIM46(上排)或野生型CELO(下排)感染LMH培养物，500个颗粒/细胞。在感染后的指定时间点，固定细胞样品，CELO病毒粒子蛋白质的产生通过免疫荧光法使用抗CELO病毒粒子的抗血清进行监测。对野生型CELO和CELO AIM46而言，复制首先在感染之后10小时检测到，且该信号在随后的30小时内增强，直至细胞病变效应导致细胞脱落和萤光信号的下降。因此，在细胞培养物的感染中，CELO AIM46似乎与野生型CELO以类似的动力学复制。
实施例5CELO AIM46在鸡胚中的生长
在本项工作的初期阶段，使用LMH细胞培养CELO AIM46。因为建立该细胞系的转化事件的性质不清楚，所以LMH细胞仍有可能给CELO AIM46提供一些野生型鸡胚细胞可能缺乏的辅助功能。本实验还应确定是否CELOAIM46能够在鸡胚中生长，以便做实际的考虑：低成本并容易操作的鸡胚将促进这些病毒的制备。将等量的野生型CELO或CELO AIM46注射到9日龄鸡胚的尿囊腔中，37℃下培养4天后，收获尿囊液，并通过CsCl密度梯度来纯化病毒。经过纯化的野生型CELO的产量，为每个鸡胚0.149-0.9mg(平均：0.427mg/鸡胚)，而CELO AIM46的产量为每个鸡胚0.119-0.828mg(平均：0.301mg/鸡胚；表3)。导入CELO AIM46中的修饰似乎对鸡胚中AIM46的生长仅有适中程度的影响。
实施例6CELO AIM46的物理稳定性
CELO病毒粒子的一个显著特性为物理稳定性，最容易通过病毒粒子对升高的温度的抵抗力来测量。而(大多数)哺乳动物腺病毒如Ad5当暴露在48℃和更高的温度下会失活(4,8,16)，最初报告CELO在56℃下是稳定的(57)，并已有报告指出该病毒后续的分离物在更高的温度，以及其他苛刻的处理下具有稳定性(在39中回顾)。尚未确定CELO稳定性的分子性质。尚未在CELO中确认出Ad5衣壳稳定性的主要成份，pIX。或许六邻体或其他衣壳成份已经改变了序列，允许更稳定的蛋白质/蛋白质交互作用。可能该稳定性在野外对于CELO病毒存活于苛刻的鸟类环境中是很重要的。不管是何种情况，有兴趣的是确定是否CELO重组载体保留了野生型CELO病毒粒子的稳定性。
将带有萤光素酶表达盒的重组腺病毒5型(AdLuc)和CELO AIM45暴露在一种热滴定下(从42-68℃暴露30分钟)。随后，测试每种样品将萤光素酶活性转移至人A549或鸟CEF细胞中的能力。图6显示免疫荧光测定法监测野生型CELO与CELO AIM46的复制。用CELO AIM46(上排)或野生型CELO(下排)感染LMH培养物，500个颗粒/细胞。在感染后的指定时间点，固定细胞样品，并通过免疫荧光法使用抗CELO病毒粒子的抗血清来监测CELO病毒粒子蛋白质的产生。
如以前对Ad5所证实，病毒衣壳，以及由此病毒的转导能力对热是敏感的(4,8,16)。人类细胞的Ad5转导，当暴露在48℃下30分钟时，会以超过100的系数下降，而在52℃和更高的温度下会失活(图6)。与之强烈对比的是，CELO AIM46的转导能力不受56℃加热的影响，而且该病毒在暴露于60℃下30分钟时，才开始丧失活性(图6)。发现野生型CELO的转导作用表现出类似的热稳定性，表明在CELO AIM46中导入的改变，并未明显地改变病毒粒子的稳定性。
实施例7CELO可转导多种细胞类型
考虑到将来的应用，有兴趣的是确定能够通过基于CELO的载体转导的细胞类型。一批常用的哺乳动物和鸡细胞类型测试了被CELO AIM46转导的可能性。作为比较，使用带有相同萤光素酶表达盒的Ad5衍生物AdLuc。图7显示4种细胞类型的结果，显示出CELO及Ad5的向性。所指定的细胞类型，以每个细胞10000、3000、1000或300个颗粒的量，与AdLuc或CELOAIM46接触(参见方法部分的24孔板操作)。在感染24小时后，测定萤光素酶活性。带有标准差的三次转导的平均值，表明鸟类来源细胞(例如鸡成纤维细胞系CEF38)，利用CELO载体转导比以人类AdLuc转导，几乎高出100倍的效力(图7)。注意CEF 38细胞不支持病毒复制，所以Ad5载体与CELO载体之间的差异不能归咎于与病毒复制有关的扩增作用。而且肯定是因为最初的转导作用或基因表达的效果。在所测试的人类细胞类型中，CELO的作用与Ad5相当。这些包括肝癌细胞系HepG2、肺上皮癌细胞系A549和人真皮成纤维细胞原代培养物(图7)。在人类癌症细胞系HeLa、鼠成肌细胞系C2C12和犬上皮细胞系MDCK中观察到类似的结果。
总之，发现CELO AIM46能够转导鸟类细胞，比人类Ad5载体的效率高大约100倍。惊人的是，CELO AIM46也能够转导哺乳动物细胞类型，其效率与基于Ad5的载体相当。
实施例8从腺病毒和CELO载体中表达GFP
绿色萤光蛋白质(GFP)已是基因转移研究的有效标记物。因此，制备出了在CELO AIM46背景下表达EGFP(Clontech)的CELO载体(CELOAIM53)。将该载体与带有相同CMV/EGFP/β球蛋白表达盒的Ad5载体进行比较。发现两种载体在人类A549细胞中均有转移GFP基因的功能。结果显示在图8中，描述使用重组Ad5或CELO载体进行的EGFP的转导。使用表达EGFP的腺病毒AdGFP和CELO AIM53以病毒/细胞比例的范围(每个细胞10-1000颗粒)感染人类A549细胞。在感染24小时后，固定细胞并通过萤光显微镜监测GFP的表达。虽然此方式无法定量GFP的免疫荧光，但似乎与萤光素酶的重组物类似，当转导人类A549细胞时，CELO与Ad5 EGFP病毒之间的转导能力上并无很大的差异。
实施例9CELO右末端的进一步缺失
使用与实施例3类似的突变策略，在CELO的右末端序列中产生额外的缺失。基因组质粒pAIM69含有从41523-43684的缺失，破坏了与CELOAIM46中同样受影响的两个开放阅读框。基因组质粒pAIM70含有从40065-43684的稍大的缺失，并破坏了与AIM46和AIM69一样的两个ORFs外加另一个ORF。按照在实施例3，图2B，的概述进行分析，不同的是使用右末端的互补质粒pB13.3来代替pB5.5(图9，泳道标示为“加右末端”)。两种突变基因组均在被缺失的序列处包含萤光素酶表达盒。
将pAIM69和pAIM70单独转染至LMH细胞内，或与带有野生型CELO右末端序列的质粒(pB13.3)一起转染。转染细胞的裂解物中获得萤光素酶活性，证实转染的成功。在新鲜LMH细胞上的后续传代显示，AIM69和AIM70能够在缺乏完整的右末端序列时，产生感染性CELO颗粒(图9)。如同CELOAIM46所示，在pAIM69中两个被破坏的开放阅读框因此对于CELO在细胞生长是可有可无的。在AIM70中被破坏的另一个开放阅读框，显然对细胞生长也是可有可无的。
实施例10腺病毒5与CELO的向性的比较
为了比较Ad5与和CELO的向性，感染下列来自各种动物种的细胞类型：MA-104(恒河猴)、ED-2(马)、SPEV(猪)、FLU-R(猪)、WSH-R(野猪)、KN-R1(牛)、KMU-R(牛)、KLU-R1(牛)。
以每个细胞10,000、3,000、1,000、300、100、30或10个颗粒的量，使上文列举的细胞类型与AdLuc或CELO AIM46接触(参见方法部分的24孔板操作)。所有细胞均培养在外加10％胎牛血清的Dulbecco′s改良型Eagle氏培养基(DMEM)中(DMEM,2mM谷氨酰胺，100 IU青霉素，100μg/ml链霉素和10％(体积/体积)胎牛血清(FCS)，所有血清在56℃下60分钟加热灭活)。在转导之前，将细胞接种至24孔培养板培养大约18小时，5×104个细胞/孔。转导时，将培养基换成包含指定病毒颗粒的含有2％马血清的DMEM(500μl/孔)。37℃下4小时之后，将培养基换成DMEM/10％FCS。感染24小时后，测定萤光素酶活性。在图10a-10h中给出的值，代表三次转导的平均值和标准差。依据上文先前的描述，进行病毒的生长、纯化和定量(实施例7)。
实施例11使用CELO AIM46衍生物产生重组蛋白
以4×107个CELO AIM53颗粒(一种CELO AIM46的衍生物)，感染鸡胚(9日龄)。在37℃培养4天之后，收获尿囊液(AF)(每胚大约12ml AF)。用SDS-PAGE分离每等份试样AF，转移至硝酸纤维素膜上，利用识别eGFP的抗体(Clontech)通过免疫染色及随后的ECL检测法(Amersham)检测eGFP(图11)。包括等份试样的纯化eGFP参考。将在未经分离的AF中的eGFP产量与参考样做比较，可计算出28μl AF中含有大约1.25μg eGFP，因此12ml AF将产生大约500μg eGFP。类似含量的eGFP获自5个分别感染的鸡胚中。
实施例12
将来自sFGFR2(66)或sFLT(sFLT；68)的编码Fc-稳定化可溶性受体构建体的cDNA，克隆到转移质粒pPM7的CMV启动子与β球蛋白内含子/多聚腺苷酸化序列之间。接着，将CMV启动子/sFGFr/β球蛋白或CMV启动子/sFLT/β球蛋白片段通过同源重组导入用PacⅠ线性化的pAIM46中，产生pCELOsFGFr或pCELOsFLT。该重组用可溶性受体cDNA来代替pAIM46的萤光素酶cDNA。利用SpeⅠ切开pCELOsFGFr或pCELOsFLT，释放出病毒的基因组，并转染到LMH细胞内，开始病毒的复制。在病毒扩增并在CsCl梯度上纯化之后，将每种病毒各一等份试样(4×107个颗粒)导入9日龄鸡胚的尿囊腔中。4天后收获尿囊液(每胚大约12ml)。通过免疫印迹法，使用Fc区特异性的抗体，测定Fc-稳定化可溶性受体的含量。图12显示以CELOsFLT感染鸡胚的结果。泳道Ig：以1μg鼠Ig为标准物；泳道K：来自未感染的鸡胚的35μl尿囊液；泳道1-7：来自以CELOsFLT感染的鸡胚的35μl尿囊液；免疫球蛋白标准物(Ig)和大约120kd的sFLT分子(sFLT)的移动被标出。可从标准物计算出每个鸡胚含有300-500μg的可溶性受体。
                         表1CELO重组构建中所使用的质粒
质粒名称 CELO左末端序列    CELO右末端序列            注释
pWü-H35     1-1601  42845-43804 CELO的左和右末端HindⅢ片段利用pBR327中的侧翼SpeⅠ连接子克隆
pB5.5     1-5503       - 在pBluescript中左末端的CELO HpaⅠ片段
pB13.3       -  30502-43804 在pBluescript中右末端的CELO HpaⅠ片段
pWüHpa     1-5503  30502-43804 CELO的左和右末端HpaⅠ片段，在pBR327中侧面带有SpeⅠ连接子的
pAIM3     1-5503  30502-3064340064-43804 pWüHpa衍生物(去除Asp718片段)
pAIM7(luc*)     1-10694339-5503  30502-3064340064-43 804 pWüHpa衍生物pAIM11的转运载体
pAIM16(luc)     1-29814339-5503  30502-3064340064-43804 pWüHpa衍生物pAIM21的转运载体
pAIM22(luc)     1-9402303-5503  30502-3064340064-43804 pWüHpa衍生物pAIM25的转运载体
pAIM23(luc)     1-10692681-5503  30502-3064340064-43804 pWüHpa衍生物pAIM26的转运载体
pAIM24(luc)     1-16892903-5503  30502-3064340064-43804 PWüHpa衍生物PAIM27的转运载体
pAIM43(luc)     1-5503  30502-3064340064-43804 PWüHpa衍生物PAIM45的转运载体
pAIM44(luc)     1-5503  30502-3064340064-43804 PWüHpa衍生物PAIM46的转运载体
pAIM52(EGFP)      -       - 与pAIM44同源重组的转运载体
luc*=萤光素酶
                               表2含有CELO变体的质粒
CELO基因组构建体 缺失的CELO序列 在LMH细胞中的复制
CELO左末端
pAIM11 1065-4334(3269bp)AatⅡ+NcoⅠ 有缺陷的，不能互补
pAIM25 938-2300(1362bp)Eco47-3 有缺陷的，能互补
pAIM26 1065-2681(1616bp)AatⅡ+SphⅠ 有缺陷的，能互补
pAIM27 1687-2900(1213bp)PmaCI 有缺陷的，能互补
pAIM21 2981-4334(1353bp)StyⅠ 有缺陷的，不能互补
CELO右末端
pAIM45 33358-43684(10326bp)EcoRⅤ 有缺陷的，不能互补
pAIM46pAIM53 41731-43684(1953bp)EcoRⅤ 有复制竞争力
pAIM69 41523-43684(2161bp)PvuⅡ-EcoRⅤ 有复制竞争力
pAIM70 40065-43684(3619bp)Asp718+EcoRⅤ 有复制竞争力
                                    表3鸡胚中CELO病毒的产量1
病毒类型 制剂号 产量(mg CsCl纯化病毒) 鸡胚数 病毒/鸡胚(mg) 平均产量/鸡胚(mg)
野生型CELO     1     1.80     2     0.90     0.427
野生型CELO     2     0.496     2     0.248
野生型CELO     3     0.345     2     O.173
野生型CELO     4     1.33     2     0.665
野生型CELO     5     5.96     40     0.149
 CELO AIM46     1     1.66     2     0.828     0.301
 CELO AIM46     2     0.133     1     0.133
 CELO AIM46     3     0.247     1     0.247
 CELO AIM46     4     0.618     2     0.309
 CELO AIM46     5     0.340     2     0.170
 CELO AIM46     6     0.237     2     0.119
注释1．将野生型CELO或CELO AIM46(100μl HBS含8×108个颗粒)注射至9日龄鸡胚的尿囊腔中。37℃培养4天后，收集尿囊液，并依前述通过CsCl密度梯度纯化病毒(9)。2．病毒的产量按经过纯化的病毒蛋白质来表示。蛋白质的测定按Bradford测定法使用牛血清白蛋白为标准来进行。
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(ⅰ)申请者：
    (A)姓名：Boehringer Ingelheim International GmbH
    (B)街道：Binger Strasse 173
    (C)城市：Ingelheim am Rhein
    (D)国家：德国(Germany)
    (F)邮政编码(ZIP):55216
    (G)电话：06132/772282
    (H)电传：06132/774377
(ⅱ)发明标题：重组CELO病毒及CELO病毒DNA
(ⅲ)序列数目：3
(ⅳ)机读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容型
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：专利发布(PatentIn Release)#1.0，第#1.30版(EPO)(2)序列识别信息1号：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：单链
    (D)拓朴学：线形
(ⅱ)分子类型：合成的DNA
(ⅹⅰ)序列说明：序列识别1号：CCGAGAATCC ACCAATCGTA                               20(2)序列识别信息2号：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：单链
    (D)拓朴学：线形
(ⅱ)分子类型：合成的DNA
(ⅹⅰ)序列说明：序列识别2号：CAGCGTGTCG CTATACGCAA                                  20(2)序列识别信息3号：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链：单链
    (D)拓朴学：线形
(ⅱ)分子类型：合成的DNA
(ⅹⅰ)序列说明：序列识别3号：GCGATGACGA AATTCTTAGC                                  20

Claims (33)

1．重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于野生型CELO病毒基因组中跨41731-43684的核苷酸区域被完全或部分缺失，并/或包含外来DNA的插入。
2．权利要求1的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该缺失跨核苷酸41523-43684的区域。
3．权利要求1的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该缺失跨核苷酸41002-43684的区域。
4．权利要求1的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该缺失跨核苷酸40065-43684的区域。
5．权利要求1-4中任一项的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于它除了包含权利要求1-4所定义的缺失，还包含核苷酸794-1330区域的完全或部分缺失或在该区域内包含外来DNA的插入。
6．权利要求1-5中任一项的重组CELO病毒DNA，其包含在可于原核或真核细胞中复制的质粒内。
7．权利要求1-6中任一项的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于它包含外来DNA的插入代替缺失。
8．权利要求7的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于它包含外来DNA的插入以替代权利要求1-4中任一项所指的区域或将所述外来DNA插入在所述区域内，和/或以所述外来DNA的插入替代权利要求5中所定义的缺失。
9．权利要求7或8的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该外来DNA编码一种衍生自动物病原体的抗原。
10．权利要求9的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所指病原体是鸟类的病原体。
11．权利要求7或8的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述外来DNA编码人类蛋白质。
12．权利要求11的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述DNA编码一种有治疗活性的蛋白质。
13．权利要求12的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述外来DNA编码一种免疫刺激性蛋白。
14．权利要求13的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该免疫刺激性蛋白是一种细胞因子。
15．权利要求11的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该外来DNA编码一种肿瘤抗原或其片段。
16．权利要求12的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于该外来DNA编码一种调节血管生成的蛋白质。
17．权利要求11的重组CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述外来DNA编码一种衍生自人类病原体的抗原。
18．一种制备权利要求1-17中任一项的重组CELO病毒的方法，其特征在于在质粒来源的CELO病毒DNA上进行所述缺失并可任选插入，和将该重组CELO病毒DNA导入可支持病毒复制的宿主内。
19．权利要求18的方法，其特征在于所指宿主是一种原代细胞或一种永生化细胞系的细胞。
20．权利要求18的方法，其特征在于所指宿主是一种鸟类胚胎。
21．权利要求19的方法，其特征在于权利要求19中所定义的细胞用重组CELO病毒DNA转染并持续培养以产生一定量的病毒，所指病毒的量接种在一种鸟类胚胎内并扩增。
22．权利要求21的方法，其特征在于所指胚胎是鸡胚。
23．一种抗动物传染病的疫苗，其包括权利要求9的CELO病毒。
24．一种抗鸟类传染病的疫苗，其包括权利要求10的CELO病毒。
25．一种抗人类传染病的疫苗，其包括权利要求17的CELO病毒。
26．一种药用组合物，其含有权利要求12的CELO病毒。
27．权利要求13、14或15中任一项的CELO病毒，其用于制备肿瘤疫苗。
28．一种制备目的重组蛋白的方法，其特征在于将权利要求7的重组CELO病毒导入鸟类的胚胎中，使该病毒扩增以产生目的蛋白，和回收该蛋白质，其中所述外来DNA编码所述目的蛋白。
29．权利要求28的方法，其中编码目的蛋白的DNA与编码免疫球蛋白Fc区的DNA分子融合。
30．权利要求29的方法，其中所述外来DNA还包括信号序列。
31．权利要求30的方法，其中所述目的蛋白是分泌蛋白，所述信号序列是其天然信号序列。
32．权利要求30的方法，其中所述信号序列衍生自一种天然分泌至鸡胚中的蛋白质，所述蛋白质不同于所述目的蛋白。
33．权利要求32的方法，其中所述信号序列衍生自卵清蛋白、抗生物素蛋白、伴清蛋白或溶菌酶。
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