DE19615803A1 - CELO-Virus - Google Patents

Description

Die große Familie der Adenoviren wird nach ihrem Wirt in Adenoviren, die Säugetiere infizieren (die Mastadenoviridae) und Adenoviren, die Vögel infizieren (die Aviadenoviridae) unterteilt. Das CELO-Virus ("Chicken Embryo Lethal Orphan"; Übersichtsartikel von McFerran, et al., 1977; McCracken und Adair, 1993) wurde 1957 als infektiöses Agens identifiziert (Yates und Fry, 1957). Das CELO-Virus wird als Geflügel-Adenovirus Typ 1 (FAV-1) klassifiziert und erregte zunächst aufgrund seiner Eigenschaft, in Baby-Hamstern tumorigen zu sein, Interesse. Da jedoch eine Infektion mit dem CELO-Virus keine ernsten gesundheitlichen und wirtschaftlichen Folgen hat, schwand das Interesse an diesem Virus in den letzten Jahren. Die FAV-1-Adenoviren können aus gesunden Hühnern isoliert werden und verursachen keine Erkrankung, wenn sie experimentell wieder in Hühner eingeführt werden (Cowen, et al., 1978). Ihre Isolierung aus erkrankten Vögeln ist wahrscheinlich das Ergebnis einer Adenovirus-Replikation in einem Wirt, der aufgrund anderer Einflußfaktoren ein geschwächtes Immunsystem hat.

Die allgemeine strukturelle Organisation von CELO-Virus ist mit einem icosahedralen Kapsid von 70-80 nm, aufgebaut aus Hexon- und Pentonstrukturen, ähnlich wie bei den Säugetier-Adenoviren (Laver, et al., 1971). Das CELO-Virus-Genom ist ein lineares, doppelsträngiges DNA- Molekül, wobei die DNA innerhalb des Virions von viruskodierte Kernproteinen kondensiert wird (Laver, et al., 1971; Li, et al., 1984b). Das CELO-Virus-Genom hat kovalent gebundene terminale Proteine (Li, et al., 1983) und das Genom hat invertierte terminale Wiederholungen ("Inverted Terminal Repeats", ITRs), wenn auch kürzer als die Säugetier-ITRs (Aleström, et al., 1982b; Sheppard und Trist, 1992). Das CELO-Virus kodiert eine Protease mit 61-69% Homologie zu den Säugetier- Adenovirus-Proteasen (Cai und Weber, 1993).

Es gibt deutliche Unterschiede zwischen CELO-Virus und den Mastadenoviren. CELO-Virus hat ein größeres Genom, mit einer nur in zwei kurzen Regionen des CELO-Virus- Genoms (durch Hybridisierung) festzustellenden Sequenzhomologie zu Ad5 (Aleström, et al., 1982a). Vom CELO-Virion wurde berichtet, daß es an jedem Vertex zwei Fasern unterschiedlicher Länge hat. Das CELO-Virus kann die E1A-Funktionen von Ad5 nicht komplementieren, und die Replikation von CELO-Virus wird durch die Aktivität von Ad5E1 nicht erleichtert (Li, et al., 1984c).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine vollständige Sequenzanalyse des CELO-Virus vorgenommen; einerseits weil es für das Verständnis der Biologie von Adenoviren nützlich ist, die genomische Organisation eines Adenovirus aufzuklären, der von den im allgemeinen studierten Säugetier-Adenoviren weit entfernt ist. Da wahrscheinlich die Übertragungs- und Überlebensbedingungen für ein Virus, das eine Vogelart infiziert, anders sind als für Säugetierviren, ist es möglich, daß die Vogel-Adenoviren neue Virusfunktionen erworben haben oder ein größeres Maß an Variabilität zeigen als die Mastadenoviridae. Die vollständige CELO- Virus-Sequenz ermöglicht außerdem Änderungen im CELO- Virus-Genom im Hinblick auf Funktionsanalysen.

Da sich Adenovirus-Vektoren als sehr leistungsfähige Vektoren für den Gentransfer erwiesen haben (Übersichtsartikel von Graham, 1990; Kozarsky und Wilson, 1993; Trapnell und Gorziglia, 1994), ist die vollständige CELO-Virus-Sequenz andererseits insbesondere als Grundlage für die Herstellung neuer rekombinanter Vektoren für den Gentransfer von Interesse.

Die Sequenz-Analyse hat gezeigt, daß das CELO-Virus- Genom 43.8 kb aufweist, womit es um mehr als 8 kb länger ist als die humanen Subtypen Ad2 und Ad5. Die Gene für die Hauptstrukturproteine (Hexon, Pentonbasis, IIIa, Faser, pVI, pVII, pVIII) sind einerseits sowohl vorhanden, andererseits befinden sie sich auch an den entsprechenden Stellen im Genom. Die Gene der Early Region 2 (E2; DNA-Bindungsprotein, DNA-Polymerase und terminales Protein) sind ebenfalls vorhanden. Dem CELO- Virus fehlen jedoch Sequenzen, die den Regionen E1, E3 und E4 der Säugetier-Adenoviren homolog sind. Es gibt ungefähr 5 kb am linken Ende und 15 kb am rechten Ende des CELO-Virus-Genoms, wo eine nur beschränkte oder gar keine Homologie mit den Mastadenovirus-Genomen vorhanden ist. Diese neuen Sequenzen enthalten eine Anzahl von offenen Leserahmen, und es ist anzunehmen, daß diese für Funktionen kodieren, die die fehlenden E1-, E3- und möglicherweise E4-Regionen ersetzen.

Teile der CELO-Virus-Sequenz wurden bereits publiziert; sie sind in Tabelle 1 aufgelistet, ebenso die Unterschiede zwischen der aus der Datenbank bekannten und der im Rahmen der vorliegenden Erfindung ermittelten Sequenz. Aus Studien, die sich auf bestimmte virale Gene konzentrierten, wurde ein Homologes des VA-RNA-Gens von Mastadenovirus bekannt (Larsson, et al., 1986), und ein Teil der Genomsequenz, die die Endoprotease trägt, wurde beschrieben (Cai und Weber, 1993). Außerdem wurden Fragmente des CELO-Virus-Genoms publiziert (Akopian, et al., 1990; Akopian, et al., 1992; Hess, et al., 1995). Die Sequenz der Pentonbasis von dem verwandten Virus FAV-10 wurde ebenfalls berichtet (Sheppard und Trist, 1992) . Einige weitere Sequenzfragmente wurden in der Datenbank hinterlegt und sind ebenfalls in Tabelle 1 angegeben. Insgesamt waren ca. 50% des CELO-Virus- Genoms in Form von Fragmenten verfügbar (insgesamt ca. 24 kb). Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltene Sequenz ist vollständig und hat den Vorteil, daß sie von einem einzigen Isolat erhalten wurde.

Die vollständige Sequenz des CELO-Virus, die in Fig. 5 dargestellt ist, zeigt eine große Anzahl von auffallenden Unterschieden zwischen Ad2 und dem CELO- Virus. Die Organisation der erkennbaren offenen Leserahmen (ORFs) des CELO-Virus-Genoms auf der Grundlage der Sequenzanalyse, im Vergleich mit Ad2, ist in Fig. 1A dargestellt: Die Figur zeigt eine Übersicht der genomischen Organisation von Ad2/5 und CELO-Virus. Die Pfeile geben die Lage der kodierenden Regionen an, jedoch nicht die genauen Spaltmuster der Genprodukte. Das Muster des CELO-Virus gibt auch (in den ersten 6.000 bp und in den letzten 13.000 bp) alle nicht zugeordneten offenen Leserahmen an, die mit einem Methionin beginnen und die für mehr als 99 Aminosäurereste kodieren. Die zentrale Region der beiden Genome, die aufgrund der Dot-Matrix-Analyse Homologie zeigen (vgl. Fig. 3) sowie die Regionen an den Enden des CELO-Virus-Genoms, die keine Homologie zu anderen Adenoviren aufweisen ("Unique to CELO") sind angegeben. Die Abkürzungen in der Figur, die auch denen in den Tabellen entsprechen, bedeuten: PB, Pentonbasis; EP, Endoproteinase; DBP, DNA-Bindungsprotein; bTP, pre-terminal Protein; pol, DNA-Polymerase.

Das sequenzierte CELO-Virus-Genom weist eine Länge von 43.804 bp auf und hat einen Gehalt an G+C von 54.3%. Es wurde bereits früher vermutet, daß das CELO-Virus-Genom viel größer ist als die Mastadenovirus-Genome mit 34- 36 kb; es wurde gefunden, daß die CELO-Virus-DNA ein Gewicht von 30 × 106 Dalton, bestimmt nach seinem Sedimentationskoeffizienten, aufweist (Laver, et al., 1971), im Vergleich zu 24 × 106 Dalton für Ad2 (Green, et al., 1967). Die Größe des CELO-Virus-Genoms, bestimmt durch Addition der Restriktionsfragmente, beträgt ca. 43 kb (Cai und Weber, 1993; Denisova, et al., 1979). Eine Pulsed Field Gel Analyse des aus gereinigten Virionen isolierten CELO-Virus-Genoms ist in Fig. 2A gezeigt und wird mit der aus Ad5 d11014 isolierten DNA (34.600 bp; Bridge und Ketner, 1989) oder Wildtyp Ad5- Virionen (35.935 bp; vt300; Chroboczek, et al., 1992; Jones und Shenk, 1978) verglichen; als Größenmarker wurde eine Mischung von nicht-gespaltener Bakteriophagen λ-DNA und λ-DNA, gespalten mit fünf verschiedenen Restriktionsenzymen (Biorad), verwendet (Spuren 1 und 7 zeigen die Molekulargewichtsmarker, Spur 2 die DNA von Ad5 d11014, Spur 3 die DNA von Ad5 wt300, Spur 4 die CELO-Virus-DNA, Spur 5 die DNA von OTE, Spur 6 die DNA von Indiana C). Fig. 2A zeigt, daß das CELO-Virus Genom eine Länge von 44 kb aufweist. Aus dieser Analyse ist ersichtlich, daß das CELO-Virus-Genom tatsächlich wesentlich größer ist als das Genom des Säugetiervirus. Berechnungen auf der Grundlage der Wanderung von Fragmenten des Lambda-Bakteriophagen ergeben für das CELO-Virus-Genom eine Größe von 43 kb. Die aus zwei weiteren FAV-1-Isolaten, Indiana C und OTE, extrahierte DNA co-migriert mit der CELO-Virus-Spezies, was ein weiterer Beweis für die Größe des CELO-Virus-Genoms ist. Fig. 2B zeigt, daß die auf dem bakteriellen Plasmid pBR327 enthaltene CELO-Virus-Sequenz dieselbe Größe aufweist.

Es existiert keine identifizierbare El-Region. Es konnte keine signifikante Homologie zwischen dem CELO-Virus- Genom und den ersten 4.000 bp von Ad2 festgestellt werden. Es gibt einige kleine offene Leserahmen in den ersten 5.000 bp von CELO-Virus, die möglicherweise einige der E1-Aufgaben erfüllen. Ein offener Leserahmen am rechten Ende des Virus-Genoms (GAM-1) kann E1B 19K in funktionellen Assays ersetzen, ohne daß eine signifikante Homologie zwischen GAM-1 und E1B 19K besteht. Um zu bestätigen, daß das linke Ende vom Wildtyp CELO-Virus-Genom stammt und nicht die Sequenz einer klonierten Variante darstellt, wurden verschiedene Tests durchgeführt: Vergleich der direkten Sequenzanalyse von CELO-Virionen an drei verschiedenen Stellen mit den entsprechenden Stellen der klonierten Sequenzen; Southern Analysen mit DNA aus verschiedenen Virusisolaten, die dieselben Restriktionsfragmente ergaben; Pulsed Field Gelelektrophorese verschiedener Virus-Genome, die keine Heterogenizität zeigte.

Es gibt keine identifizierbare E3-Region; die beiden kleinen offenen Leserahmen in der entsprechenden Region von CELO-Virus haben keine signifikante Homologie mit beschriebenen E3-Funktionen.

Es gibt eine Gruppe von kleinen offenen Leserahmen zwischen 36.000 und 31.000, deren Lage auf die Säugetiervirus-E4-Region hinweist, jedoch mit zusätzlichen 8 kb Sequenz am rechten Ende des CELO- Virus.

Es wurde auch keine Protein IX ähnliche Sequenz identifiziert (das Protein IX ist für die Hexon-Hexon- Wechselwirkungen und die Stabilität der Säugetieradenovirus-Virionen wesentlich).

Auch ein Protein V-Gen wurde nicht identifiziert.

Folgende Regionen sind zwischen CELO-Virus und Ad2 konserviert: Der zentrale Anteil des CELO-Virus-Genoms, vom IVa2-Gen (ca. ab Nukleotid (nt) 5.000) auf dem linken Strang bis zu den Fasergenen am rechten Strang (ca. bis nt 33.000) ist wie bei den Mastadenoviren organisiert, und die meisten der wichtigen viralen Gene können sowohl nach Position als auch durch Sequenzhomologie identifiziert werden. Frühere Studien zur Homologie zwischen CELO und Ad2 (Aleström, et al., 1982a) zeigten zwei Regionen des CELO-Virus, die mit der Ad2-Sequenz kreuzhybridisieren. Diese beiden Fragmente sind nt 5.626 bis 8.877 (kodierend für IVa2 und den Carboxy-Terminus der DNA-Polymerase) und nt 17.881 bis 21.607 (kodierend für das Hexon). Die in Fig. 3 dargestellte Dot Matrix-Analyse (durchgeführt unter Verwendung des UWGCG-Programms Compare mit einem Fenster von 30 und einer Stringenz von 20; zusammengefaßt in Fig. 1A) zeigt, daß die gesamte DNA-Sequenzhomologie zwischen CELO-Virus und Ad5 in der mittleren Region des CELO-Virus-Genoms kartiert. Das kann deshalb erwartet werden, weil in dieser zentralen Region die Kapsidproteine kodiert sind und die Grobstruktur des CELO-Virions mit dem Kapsid des Säugetieradenovirus vergleichbar ist (Laver, et al., 1971; Li, et al., 1984a). Die Gene, die für Proteine kodieren, die den humanen Adenovirusproteinen Hexon, IIIa, Pentonbasis, Protein VI und Protein VIII entsprechen, sind vorhanden und zwar in der erwarteten Reihenfolge und Lage (Fig. 1A und Tabelle 2A; Tabelle 2B zeigt nicht zugeordnete offene Leserahmen, die für Genprodukte mit mehr als 99 Aminosäureresten kodieren) . Jeder Vertex des Mastadenovirus-Virions enthält ein Pentamer des Pentonbasisproteins in Verbindung mit einer einzigen Faser, bestehend aus drei Kopien des Faserpolypeptids. Ad2 hat, wie die meisten Mastadenoviren, ein einziges Fasergen, manche Adenovirustypen haben zwei Fasergene.

Das CELO-Virus-Genom kodiert für zwei Faserpolypeptide verschiedener Länge und Sequenz.

In der Region E2 wurden DNA-Bindungsproteine identifiziert (Li, et al., 1984c); es wurden vier Proteine mit ähnlichen Peptidkarten beschrieben, was auf einen einzigen Vorläufer schließen läßt, der dann gespalten oder abgebaut wird. Der linke offene Leserahmen des CELO-Virus-Genoms, beginnend bei nt 23.224, liegt in der erwarteten DNA-Bindungsprotein- Region. Die Gene, kodierend für DNA-Polymerase und pTP (pre-terminal Protein) sind vorhanden und in den erwarteten Positionen (Fig. 1A, Tabelle 2A).

Im Hinblick auf die Herstellung von Vektoren auf der Grundlage des CELO-Virus ist es von Interesse, die Mechanismen zu identifizieren, die das CELO-Virus verwendet, um nahezu 44 kb DNA in ein Virion zu verpacken, das eine ähnliche Größe aufweist wie die humanen Adenoviren, die hinsichtlich ihrer Verpackungskapazität starken Beschränkungen unterworfen sind (Bett, et al., 1983; Caravokyri und Leppard, 1995; Ghosh-Choudhury, 1987). Eine Möglichkeit besteht darin, daß das CELO-Virion, obwohl größenmäßig beinahe identisch mit Ad2 und Ad5, genügend erweiterte Struktur hat, um das größere Genom unterzubringen. Eine alternative Hypothese ist, daß CELO über einen anderen Mechanismus der DNA-Kondensierung verfügt und daher Unterschiede in der Ausstattung mit Kernproteinen aufweist, die für die DNA-Verpackung zuständig sind. Laver, et al., 1971 identifizierten zwei Proteine im Kern von CELO-Virus und bemerkten das Fehlen eines Protein V-ähnlichen Moleküls. Li, et al., 1984b, verwendeten eine Elektrophorese mit höherer Auflösung und berichteten eine Kernstruktur mit drei Polypeptiden (20 kD, 12 kD und 9.5 kD). Aus beiden Befunden läßt sich schließen, daß dem CELO-Virus das größere basische Kernprotein V (41 kD), das in Säugetieradenoviren vorkommt, fehlen dürfte. Vielleicht ist das Fehlen von Protein V und/oder die Gegenwart von kleineren, basischen Proteinen für die zusätzliche Verpackungskapazität des CELO-Virions verantwortlich. Das kleinste der von Li, et al., 1984b, identifizierten CELO-Virus-Kernproteine (9.5 kD) assoziiert am engsten mit der Virus-DNA, ähnlich wie das Protein VII des humanen Adenovirus. Ein offener Leserahmen, der ein Protein mit 8.597 D mit 72 Aminosäuren erwarten läßt, liegt bei nt 16.679; das kodierte Protein ist reich an Arginin (32.9 Mol%) und enthält zwei Spaltstellen für Protease (pVII von Ad2 hat nur eine Spaltstelle). Ein offener Leserahmen, der ein Protein mit 19.777 D mit 188 Aminosäureresten erwarten läßt, liegt bei nt 16.929. Das Protein hat Protease-Spaltstellen nach den Resten 22, 128 und 145, und die carboxy-terminalen Reste haben Homologie mit pX von Mastadenovirus. Fig. 4 zeigt die Aminosäuresequenzen von Protein VII und pX von verschiedenen Mastadenoviren im Vergleich zum CELO-Virus sowie die Kernproteine Core 2 und Core 1 von FAV-10. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des UWGCG Bestfit Programms mit einer Lückengewichtung ("Gap Weight") von 3.0 und einer Gewicht und der Lückenlänge ("Gap Length Weight") von 0.1 angeordnet. Die Proteasespaltstellen von Adenovirus sind unterstrichen. In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, daß das aus 19 Resten bestehende Mastadenovirus-DNA-Bindungsprotein der Bezeichnung "mu" durch zwei Proteasespaltungen des pX- Vorläufers gebildet wird (Hosokava und Sung, 1976; Weber und Anderson, 1988; Anderson, et al., 1989; ). Eine Spaltung des 188 Reste aufweisenden Proteins nach den Resten 128 und 145 würde ein aus 17 Resten bestehendes mu-ähnliches basisches Protein (41% Arginin, 12% Lysin) ergeben. Die nicht gespaltene Form des Proteins ist ebenfalls stark basisch; die nichtgespaltenen Kopien dieses Proteins könnten den von Li, et al., 1984b, beobachteten 20 kD Kernprotein entsprechen; ein drittes von diesen Autoren identifiziertes 12 kD Kernprotein konnte noch nicht zugeordnet werden.

Im CELO-Virus-Genom wurden ferner einige neue oder nicht zugeordnete offene Leserahmen gefunden. Eine Zusammenstellung dieser offenen Leserahmen ist in Tabelle 2A gezeigt; diese offenen Leserahmen sind auch in Fig. 1A angegeben. Diese Zusammenstellung wurde auf die Sequenzen von nt 0-6.000 sowie 31.000-43.804 beschränkt und nur ORFs, die einen Methioninrest enthalten sowie für ein Protein von <99 Aminosäureresten kodieren, sind angegeben. Wie bereits erwähnt, gibt es einen ORF bei nt 1999, der für ein Protein mit Homologien zu Parvovirus-REP kodiert, und einen ORF bei nt 794 mit Homologie zu dUTPase und Ad2 E4 ORF1.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues CELO-Virus bereitzustellen.

Auf der Grundlage der vollständigen CELO-Virus-Genom- Sequenz betrifft die vorliegende Erfindung somit ein CELO-Virus, das durch in vitro Manipulation von genomischer CELO-Virus-DNA erhältlich ist.

Das erfindungsgemäße, von der genomischen DNA abgeleitete CELO-Virus enthält in einer bevorzugten Ausführungsform den linken und rechten terminalen Repeat sowie das Verpackungssignal und weist in davon verschiedenen Regionen der CELO-Virus-DNA-Modifikationen in Form von Insertionen und/oder Deletionen und/oder Mutationen auf.

Der linke bzw. rechte terminale Repeat ("Inverted Terminal Repeat", ITR) erstreckt sich von den Nukleotiden 1-68 bzw. von den Nukleotiden 43734-43804, das Verpackungssignal (auch "Psi" bezeichnet) erstreckt sich von den Nukleotiden 70-200. Durch Modifikationen in anderen als diesen DNA-Abschnitten wird bewirkt, daß die durch die Modifikation betroffenen Gene nicht-funktionell bzw. deletiert werden.

Bevorzugt werden Modifikationen des CELO-Virus-Genoms vorgenommen, die auf einem Abschnitt der CELO-Virus-DNA liegen, der die Nukleotide von ca. 201-ca. 5.000 umfaßt (im Anschluß an den linken terminalen Repeat der Abschnitt am linken Ende, im folgenden als "Abschnitt A" bezeichnet) und/oder auf einem Abschnitt, der die Nukleotide von ca. 31.800-ca. 43.734 umfaßt (der vor dem rechten terminalen Repeat gelegene Abschnitt am rechten Ende, im folgenden "Abschnitt B" bezeichnet) und/oder auf einem Abschnitt, der die Nukleotide von ca. 28.114-30.495 umfaßt (die Region des Faser 1 Gens.

Ein CELO-Virus, dem bestimmte Gene nicht-funktionell bzw. deletiert sind, z. B. Gene, die die Immunantwort des Wirts beeinflussen, wie Gegenspieler von Genen der E3- Region von Säugetier-Adenoviren, kann als Vakzin verwendet werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung enthält das CELO- Virus eine oder mehrere Fremd-DNA-Moleküle, insbesondere eine in einem Wirtsorganismus zu exprimierende Fremd- DNA. In dieser Ausführungsform fungiert das CELO-Virus als Vektor, der die Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen, Gewebe oder Organismen, insbesondere Säugetiere und Vögel, transportieren und zur Expression bringen kann.

Geeignete Insertionsstellen für die Fremd-DNA sind die Abschnitte A und/oder B und/oder C.

Die Fremd-DNA ersetzt vorzugsweise eine oder mehrere Sequenzen aus diesen Abschnitten ersetzen.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße CELO-Virus auf einem Plasmid, das in Bakterien oder Hefe replizierbar ist und nach Einbringen in geeignete Zellen Viruspartikel liefert, enthalten. Beispiele für geeignete Zellen sind Vogelembryonieren- oder -leberzellen.

Im Hinblick auf die Anwendung des eines rekombinanten CELO-Virus-Vektors für die Gentherapie kann die Fremd- DNA aus einem oder mehreren therapeutisch wirksamen Genen bestehen. Beispiele sind Gene, kodierend für Immunmodulatoren bzw. Modulatoren von Entzündungsprozessen (Zytokine wie IL-2, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-12; Interferone, Tumorantigene, IKB und Derivate von IKB, denen Serinphosphorylierungsstellen fehlen (Traenckner, et al., 1995) oder denen Lysinubiquitinierungsstellen fehlen; Glucocorticoid- Rezeptoren; Enzyme wie Katalase, Mangansuperoxiddismutase, Glutathionperoxydase, LIP- Mitglieder der C/EBP-Familie wie LIP oder LAP (Descombes und Schibler, 1991), ADF (Tagaya, et al., 1989)), Gene, die die Apoptose beeinflussen (Mitglieder der Bcl-2- Familie, wie Bcl-2, Adenovirus E1B19K, Mcl-2; BAX; IRF-2; Mitglieder der ICE-Proteasefamilie; Varianten von cJun, wie TAM-67 (Brown, et al., 1991); Adenovirus EIA; p53) und Gene, die für andere therapeutische Proteine kodieren (z. B. Gerinnungsfaktoren wie Faktor VIII oder Ix; Wachstumsfaktoren wie Erythropoetin; das Zystische Fibrose Transmembranregulatorgen (CFTR); Dystrophin und seine Derivate; Globin; der LDL-Rezeptor; Gene, die bei lysosomalen Speicherkrankheiten fehlen, wie β-Glucuronidase; etc.).

Im Hinblick auf die Herstellung von zellulären Tumorvakzinen oder für pharmazeutische Zusammensetzungen, mit denen die Immunantwort auf Tumore verstärkt werden soll, kodiert die Fremd-DNA für immunstimulierende Proteine oder Tumorantigene bzw. Fragmente davon.

Die therapeutisch wirksame DNA kann auch für Antisense- Moleküle kodieren, die in der Zielzelle die Expression von Genen bzw. die Transkription bestimmter RNA- Sequenzen verhindern.

Im Hinblick auf die Anwendung des rekombinanten CELO- Virus-Vektors als Vakzine kodiert die Fremd-DNA für eine oder mehrere Antigene, die im behandelten Individuum eine Immunantwort hervorrufen.

In einer Ausführungsform der Erfindung kodiert die Fremd-DNA für ein Antigen, das von einem Humanpathogen, insbesondere einem Erreger von Infektionskrankheiten, abgeleitet ist.

Epitope, die von rekombinanten CELO-Viren exprimiert werden können, umfassen von beliebigen humanen viralen Pathogenen, wie HIV, Hepatitis A, B, C, Hantavirus, Poliovirus, Influenzavirus, Respiratory Syncytiavirus, Masern-, Mumps-, Rubella-, Papilloma- und vielen anderen Viren abgeleitete Epitope. Zu nicht-viralen Pathogenen zählen Trypanosomen (Verursacher von Schlafkrankheit und Chagas′ Krankheit), Leishmania, Plasmodium Falciparum (Malaria), diverse bakterielle Pathogene, wie die Erreger von Tuberkulose, Lepra, Pseudomonas aeruginosa (Komplikationen in zystischer Fibrose) und viele andere.

Eine Übersicht über Vakzine auf der Grundlage von Mastadenoviren ist in Tabelle 3 gegeben; die dort bespielhaft angeführten Epitope können auch verwendet werden, um in einen Vektor auf der Grundlage des CELO- Virus eingefügt zu werden.

Im Hinblick auf die Anwendung des rekombinanten CELO- Virus-Vektors als Impfstoff im Veterinärbereich, z. B. für Vogel-, insbesondere Geflügelvakzine, kodiert die Fremd-DNA in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform für ein Antigen, abgeleitet von einem Protein eines Erregers von Tierkrankheiten, insbesondere infektiösen Vogelerkrankungen.

Bespiele für Erreger von Vogelerkrankungen sind Avian Infectious Bronchitis Virus (IBV, ein Coronavirus; Jia, et al., 1995; Ignjatovic und McWaters, 1991; Kusters, et al., 1990; Lenstra, et al., 1989; Cavanagh, et al., 1988; Cunningham, 1975), Avian Influenza Virus (Orthomyxovirus Type A; Kodihalli, et al., 1994; Treanor, et al., 1991; Tripathy und Schnitzlein, 1991), Fowlpox-Virus (McMillen, et al., 1994), Avian Infectious Laryngotracheitis Virus (Guo, et al., 1994; Scholz, et al., 1993; Keeler, et al., 1991), Mycoplasma Gallisepticum (Nascimento, et al., 1993), Avian Pasteurella Multocida (Wilson, et al., 1993; Lee, et al., 1991; Hertman, et al., 1980; Hertman, et al., 1979), Avian Reovirus (Ni und Kemp, 1992; Huang, et al., 1987), Marek′s Disease Virus (MDV; Malkinson, et al., 1992; Scott, et al., 1989), Puten-Herpesvirus (HVT, Herpesvirus of Turkeys), Newcastle Disease Virus (NDV; Cosset, et al., 1991; Morrison, et al., 1990), Avian Paramyxovirus Typ 1 (Jestin, et al., 1989), Avipoxvirus Isolate (Schnitzlein, et al., 1988), wie Juncopox, Pigeon Pox, und Feld- (Field) und Vakzinstämme von Vogelpoxviren, Avian Encephalomyelitis Virus (Shafren und Tannock, 1991; Nicholas, et al., 1987; Deshmukh, et al., 1974), Avian Sarcoma Virus, Rotavirus (Estes und Graham, 1985), Avian Reovirus (Haffer, 1984; Gouvea, et al., 1983; Gouvea und Schnitzer, 1982), H7 Influenza- Virus (Fynan, et al., 1993).

Außer DNA-Sequenzen, die für therapeutisch wirksame Genprodukte bzw. für Antigene kodieren, kann die Fremd- DNA für Proteine bzw. Proteinfragmente kodieren, die das Verhalten des CELO-Virus, insbesondere seine Bindungsfähigkeit an die Zellen, im Hinblick auf die Anwendung auf Säugetiere insbesondere an Säugetierzellen, verändern. Beispiele für derartige Proteine sind Faser- oder Pentonbasisproteine von Säugtier- und anderen Adenoviren, Oberflächenproteine anderer Viren, sowie Liganden, die die Fähigkeit haben, an Säugetierzellen zu binden und das CELO-Virus in die Zellen zu transportieren. Zu geeigneten Liganden zählen Transferrin von verschiedenen Säugetierspezies, Lektine, Antikörper bzw. Antikörperfragmente, etc. Dem Fachmann sind derartige Liganden bekannt, weitere Beispiele sind der WO 93/07283 entnehmbar.

Das rekombinante CELO-Virus kann eine oder mehrere Fremd-DNA-Moleküle enthalten, diese können entweder in Tandem oder, entfernt voneinander, in verschiedene Abschnitte der CELO-Virus-Sequenz eingefügt werden.

Die Fremd-DNA steht unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen, geeignete Promotoren sind z. B. der CMV-Immediate Early Promotor/Enhancer, der Rous Sarcoma Virus LTR, der Adenovirus Major Late Promotor, der CELO-Virus Major Late Promotor.

Die Eignung des CELO-Virus für die Herstellung von Vektoren sowie die Vorteile dieser Vektoren und ihrer Anwendungen beruhen insbesondere auf folgenden Eigenschaften des CELO-Virus:

• i) Sicherheit: Das CELO-Virus repliziert natürlicherweise nicht in Säugetierzellen. Daher können Vektoren auf der Grundlage dieses Virus in Menschen verwendet werden, ohne daß die Gefahr besteht, daß eine anschließende Infektion mit einem Wildtyp- Humanadenovirus den Vektor komplementieren und die Replikation ermöglichen könnte. Dies stellt einen Vorteil gegenüber den derzeit verwendeten Ad2- und Ad5-Vektoren dar.
• ii) Erhöhte Verpackungskapazität: Das CELO-Virus-Genom ist ca. 44 kb lang, im Vergleich zu den 36 kb des Ad5-Genoms. Beide Viren haben vergleichbare Virion- Ausmaße, so daß mit einem CELO-Virus-Vektor die Möglichkeit besteht, das bei Ad5 vorhandene strikte Verpackungslimit von 35 kb zu erweitern. Aufgrund der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Sequenzierung wurden DNA-verpackende Kernproteine des CELO-Virus identifiziert, und es wurden auffallende Unterschiede zu Ad2 festgestellt, die für die erhöhte Verpackungskapazität verantwortlich sein könnten. Es existieren ca. 13 kb an den beiden Enden des CELO-Virus, die nicht für Strukturproteine (z. B. Kapsidkomponenten) oder für Proteine, die direkt für die Virusreplikation benötigt werden (z. B. DNA-Polymerase) kodieren dürften. Für die Herstellung von Vektoren können diese Sequenzen auf dem CELO-Virus-Genom entfernt und, falls erforderlich, durch komplementierende Zellinien ersetzt werden. Von diesen Sequenzen ist anzunehmen, daß sie für die Immunfunktionen oder die apoptotischen Funktionen (z. B. GAM-1) der Wirtszelle kodieren oder daß sie an der Aktivierung der Wirtszelle für die Virusreplikation beteiligt sind (Gegenspieler zu den E1-, E3- und E4- Regionen von Ad2). Dabei handelt es sich um die Gentypen, die entweder für das Viruswachstum in der Zellkultur entbehrlich sind, wie die E3-Gene von Ad2 (Wold and Gooding, 1991; Gooding, 1992), oder die leicht aus dem Virus entfernt und von einer komplementierenden Zellinie exprimiert werden können, wie die E1-Region in 293-Zellen (Graham, et al, 1977) und die E4-Region in W162-Zellen (Weinberg und Ketner, 1983).
• iii) Stabilität: Das CELO-Virion ist bemerkenswert stabil. Die Infektivität und die Fähigkeit, DNA zu transportieren, überdauern eine Behandlung bei 60°C während 30 min. Vergleichweise verliert Ad5 zwei Zehnerpotenzen an Infektivität bei 48°C und ist bei 52°C komplett inaktiviert. Vermutlich entwickelte das CELO- Virus seine Hitzestabilität nicht natürlicherweise, die Hitzestabilität dürfte vielmehr auf eine Reaktion auf einen anderen Typ von selektivem Druck auf das Virion hinweisen. Die natürliche Route der CELO-Virus-Infektion ist eine fäkal-orale, welche erfordert, daß das Virion den Kontakt mit einer in chemischer Hinsicht rauhen Umwelt mit extremen pH-Werten sowie mit Proteasen überleben kann. Für besondere Anwendungen in der Gentherapie wäre ein noch widerstandsfähigeres Virus erwünscht, das z. B. im Verdauungstrakt oder in der Lunge eines Patienten mit zystischer Fibrose überleben würde.
• iv) Zielgerichtete Anwendung: Das CELO-Virus bindet von sich aus nur schwach an Säugetierzellen und erfordert für einen effizienten Eintritt in die Zelle den Zusatz eines Liganden (Transferrin oder Lectin; Cotten, et al., 1993). Daher können rekombinante CELO-Virionen in menschliche Zellen nicht eindringen, woraus sich folgende Anwendungsmöglichkeiten ergeben:
  Das Virus kann, wie oben angegeben, genetisch verändert werden, um an seiner Oberfläche Liganden exprimieren, die einen zielgerichteten Transport ermöglichen, wie z. B. spezifische Peptide, oder Fasern und/oder Pentonbasen von humanen Adenoviren.
  Eine weitere Möglichkeit besteht in der chemischen Modifikation des Virus, um daran spezifische Liganden wie Transferrin zu koppeln, wie z. B. in der WO 94/24299 vorgeschlagen, ferner kann das Virus biotinyliert (WO 93/07283) und über Streptavidin an biotinylierte Liganden, wie Weizenkeimagglutinin oder andere Lectine (WO 93/07283) gebunden werden. CELO-Virus-Vektoren weisen somit nicht die Nachteile humaner Adenoviren auf, die zwar eine gute Bindungsfähigkeit an menschliche Zellen aufweisen, jedoch für eine spezifische, zielgerichteten, durch den Liganden vermittelten Anwendung maskiert werden müssen.
• v) Anwendbarkeit für Vakzine: Das CELO-Virus ist selten mit Erkrankungen in Vögeln verbunden, was darauf hinweist, daß es eine starke protektive Immunantwort in Vogelwirten hervorruft. Der CELO-Virus-Vektor kann auf einfache Weise für die Expression neuer Vakzinepitope angepaßt werden.

Im Hinblick auf die Entfernung von Regionen der CELO- Virus-DNA wurde aus den beim Mastadenovirus gewonnenen Erkenntnissen gefolgert, daß bei Entfernung der zentralen Abschnitte des CELO-Genoms diese Abschnitte in trans, z. B. von einer Verpackungszellinie, zur Verfügung gestellt werden müssen. Diese Beschränkung beruht auf der großen Menge von Virionbestandteilen, die für den Zusammenbau des Virus notwendig sind, sowie der Notwendigkeit, eine Zellinie herzustellen, die die entsprechenden Mengen dieser Proteine ohne Toxizität produzieren kann.

Die bisher in dieser Hinsicht erfolgreicheren Ansätze bei Mastadenoviren bestanden im Herstellen von Zellinien, die regulatorische Proteine (E1-, E4- Regionen) oder enzymatische Proteine (DNA-Polymerase, DNA-Bindungsprotein) exprimieren, weil diese Proteine während einer produktiven Virusinfektion nicht in großen Mengen benötigt werden.

Ausgehend von der Analyse der bekannten CELO-Gene werden die Abschnitte des Genoms von nt ca. 12.000 bis ca. 33.000, die für Strukturkomponenten des Virus kodieren, vorzugsweise nicht unterbrochen. Die Region von ca. nt 5.000 bis ca. 12.000 kodiert für die E2-Gene IVa2 (ein viraler Transkriptionsfaktor), die virale DNA- Polymerase (POL) und das terminale Virusprotein (Viral Terminal Protein; pTP). Diese Gene sind für die Funktion von Mastadenoviren essentiell; sie dürften demnach auch für das CELO-Virus essentiell sein. Es sind jedoch grundsätzlich auch Deletionen solch essentieller Gene möglich, sofern sie in trans, z. B. von einer Verpackungslinie, produziert werden können. Es wurde z. B. eine Verpackungszellinie hergestellt, die Ad5-DNA-Polymerase produziert, womit die Deletion dieses Gens aus dem Virusgenom ermöglicht wurde. Auf ähnliche Weise kann bei der Konstruktion von CELO-Virus-Vektoren vorgegangen werden, indem Abschnitte oder die gesamte Region von nt 5.000 bis 12.000 aus dem CELO-Virus entfernt und die entsprechenden Funktionen in trans von einer Verpackungszellinie beigesteuert werden.

Eine weitere mögliche Einschränkung besteht hinsichtlich des vermutlichen Major Late Promotor, der vorläufig der Region bei ca. nt 7.000 zugeordnet wurde (TATA-Box bei nt 7.488). In den Mastadenoviren ist dieser Promotor wesentlich, um die späte Genexpression zu treiben. Daher muß jede Änderung in der Region bei nt 7.000 des CELO- Genoms in einer Weise vorgenommen werden, die die Promotorfunktion dieser Region erhält.

In Tabelle 4 sind die Sequenzelemente des CELO-Virus- Genoms aufgelistet und im Hinblick auf ihre Deletion und/oder Mutation bei der Herstellung von CELO-Virus- Vektoren in verschiedene Kategorien eingeteilt (in Tab. 4 bedeuten L1, L2, etc. "Late Message 1, 2, etc., entsprechend der bei Mastadenoviren üblichen Bezeichnung):
Zur Kategorie 1 zählen Sequenzelemente, die in cis benötigt werden und daher nicht in trans von einer komplementierenden Zellinie oder von einem komplementierenden Plasmid zur Verfügung gestellt werden können. Diese Abschnitte sind erforderlich und daher auf dem erfindungsgemäßen CELO-Virus vorhanden es sind der linke und rechte terminale Repeat sowie das Verpackungssignal.

Sequenzen der Kategorie 2 kodieren für Proteine, die für die Virionproduktion in großen Mengen benötigt werden. Diese Proteine können gegebenenfalls von einem Gen, das in einer komplementierenden Zellinien oder auf einem komplementierenden Plasmid enthalten ist, produziert werden. Weitere Sequenzen der Kategorie 2 sind der Major Late Promotor, die Tripartite Leader-Sequenz, ferner die Splice Acceptor Sites (SA) oder die Polyadenylierungsstellen (poly A Sites) von Genen, die essentiell sind und nicht in trans zur Verfügung gestellt werden können.

Grundsätzlich muß beachtet werden, daß bei Modifikationen der CELO-Virus-DNA, die an Grenzen von Genen vorgenommen werden, gegebenenfalls vorhandene Steuerungssignale, z. B. PolyA-Stellen, möglichst nicht unterbrochen bzw. anderswie beeinträchtigt werden.

Die auf dem CELO-Virus deletierten bzw. nicht­ funktionellen Gene können in trans, z. B. von komplementierenden Zellinien, bereitgestellt werden.

Komplementierende Zellinien ("Helferzellen") können auf literaturbekannte Weise, analog wie Helferzellen, die Funktionen von Säugetieradenoviren komplementieren, hergestellt werden. Dazu wird das relevante CELO-Virus- Gen auf einem Plasmid, vorzugsweise in Kombination mit einem selektierbaren Marker, in Zellen eingeführt, die die Replikation von CELO-Virus erlauben, vorzugsweise in immortalisierte Zellinien wie LMH (Kawaguchi, et al., 1987) oder immortalisierte Wachtelzellinien, wie z. B. von Guilhot et al. 1993, beschieben.

Statt die im Vektor deletierten Regionen des CELO-Virus durch eine Zellinie zur Verfügung zu stellen, können die Deletionen auch durch eine auf einem Plasmid enthaltene Kopie des betreffenden Gens komplementiert werden. Dafür kann z. B. die in der WO 96/03517 verwendete Methode angewendet werden, wobei ein eine Deletion enthaltender CELO-Virus-Vektor als Bestandteil eines Transfektionskomplexes, enthaltend ein Konjugat aus Polylysin und einem UV/Psoralen-inaktivierten Adenovirus und gegebenenfalls Transferrin-Polylysin, in embryonische Hühnernierenzellen oder -leberzellen, embryonische oder immortalisierte Wachtelzellen, z. B. Leber- oder Nierenzellen, eingebracht wird und wobei in dem Transfektionskomplex außerdem ein Plasmid enthalten ist, das eine Kopie des Gens trägt, das dem CELO-Virus- Vektor fehlt. Die Kombination von Genen, die auf dem Vektor enthalten sind, und Genen, die das Plasmid trägt, resultiert in einem normalen Virus-Replikationszyklus.

(Ähnliche Ansätze wurden bei Mastadenovirussystemen verwendet, um E1-defiziente (Goldsmith, et al., 1994) bzw. E4-defiziente (Scaria, et al., 1995) Adenoviren zu komplementieren.

Eine weitere Möglichkeit, die dem CELO-Virus fehlenden Gene zu ersetzen, besteht in der Verwendung von Helferviren.

Zu CELO-Virus-Genen der Kategorie 3 zählen die Sequenzen auf den Abschnitten A, B und C. Dabei handelt es sich um Sequenzen, die für ein Protein oder ein RNA-Molekül kodieren, das für die Wechselwirkung mit der Wirtszellmaschinerie oder mit dem Wirtsimmunsystem erforderlich ist. Diese Proteine sollten in niedrigeren Konzentrationen erforderlich oder für die Kultivierung des Virus in der Gewebekultur entbehrlich sein.

Bevorzugt werden somit in den erfindungsgemäßen CELO- Virus-Vektoren die Gene der Kategorie 3 durch das interessierende Gen ersetzt; erforderlichenfalls können komplementierende Zellinien oder Plasmide bzw. Helferviren hergestellt werden, die die entsprechenden Genprodukte produzieren.

In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren das interessierende Gen anstelle eines der Fasergene. Das CELO-Virus hat zwei Faserproteine (Laver, et al., 1971; Gelderblom und Maichle-Lauppe, 1982; Li, et al., 1984a) . Es ist anzunehmen, daß eine der Fasern des CELO-Virus nicht für den Zusammenbau des Virions und die Infektivität erforderlich ist. Diese Annahme wird gestützt durch elektronenmikroskopische Beobachtungen, daß die längere Faser (Faser 1) mit der Pentonbasis entlang der Seite des Komplexes assoziieren dürfte, während die kürzere Faser (Faser 2) aus der Mitte der Pentonbasis herausragt, ähnlich wie die Penton/Faserkomplexe bei den Mastadenoviren (Hess, et al., 1995). In Adenoviren mit nur einer einzigen Faser ist das Fasermolekül für den Zusammenbau des Virus erforderlich; in Abwesenheit von Faser werden keine stabilen reifen Viren gebildet. Das CELO-Virion dürfte daher Faser 2 für die Stabilität und als Liganden benötigen, während Faser 1 nur Ligandenfunktion hat. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Richtigkeit der Annahme, daß von den zwei Fasergenen des CELO-Virus das Fasergen 1 überflüssig ist und durch das interessierenden Gen ersetzt werden kann, bestätigt, indem das Faser 1-Gen entfernt und durch eine Luciferaseexpressionseinheit ersetzt wurde.

Andere Beispiele sind Insertionen in der Region A und/oder B. Die Insertionen können vorgenommen werden, indem natürlicherweise in der CELO-Virus-DNA in diesen Abschnitten vorkommende Restriktionsenzymschnittstellen benutzt werden, z. B. die in Abschnitt B vorkommende FseI-Schnittstelle bei Position 35.693; die Insertion kann in diese Schnittstelle direkt, bzw. über diese Schnittstelle hinweg oder in der Nähe dieser Schnittstelle vorgenommen werden, oder diese Schnittstelle wird benutzt, um Rekombination in der Nachbarschaft die erleichtern. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, mittels herkömmlicher Methoden der rekombinanten DNA-Technik künstliche Restriktionsenzymschnittstellen einzufügen.

Für die Herstellung von rekombinantem CELO-Virus wird bevorzugt so vorgegangen, daß man ein kleines Fragment aus der relevanten Region von CELO-Virus, in die das Fremdgen eingesetzt werden soll, auf einem bakteriellen Plasmid subkloniert, um zu erreichen, daß Restriktionsstellen, die auf dem CELO-Virus-Genom mehrmals vorkommen, auf dem Plasmid nur einmal vorkommen. Diese Restriktionsstellen werden verwendet, um eine Region aus dem kleinen Fragment zu entfernen. Für die Herstellung des CELO-Virus-Vektors wird diese Region durch Fremd-DNA ersetzt. Die Fremd-DNA kann lediglich aus einem Linker mit einer nur einmal vorkommen Restriktionsstelle bestehen, oder aus einer für ein Protein oder für ein Antigen kodierenden Sequenz. Die Sequenz kann auch für Reportergen mit einer nur einmal vorkommenden Restriktionsstelle kodieren. Dadurch wird die weitere Manipulation des CELO-Virus erleichtert, indem die Fremd-DNA, kodierend für ein therapeutisch wirksames Genprodukt oder für ein Antigen, in diese Restriktionsstelle inseriert wird, gleichzeitig ermöglicht das Reportergen eine rasche Information über die Effizienz des Vektors, indem das Plasmid in Zellen eingebracht wird und die Expression des Reportergens verfolgt wird.

Figurenübersicht

Fig. 1A Vergleich der genomischen Organisation von Ad2/5 mit dem CELO-Virus;

Fig. 1B Restriktionskarte des CELO-Virus-Genoms;

Fig. 2A und 2B Pulsed Field gelelektrophoretische Analyse der Genomgröße von Adenoviren;

Fig. 2C Charakterisierung von Plasmid-klonierten Kopien des CELO-Virus-Genoms mittels Restriktionsendonukleasen;

Fig. 3 Dot Matrix-Analyse der DNA-Sequenzhomologie zwischen CELO-Virus und Ad2;

Fig. 4 Aminosäuresequenzen von Protein VII und pX von verschiedenen Mastadenoviren im Vergleich mit CELO- Virus und den Kernproteinen Core 2 und Core 1;

Fig. 5 DNA-Sequenz des CELO-Virus-Genoms;

Fig. 6 Konstruktion eines Plasmids, das das CELO-Genom in seiner gesamten Länge enthält;

Fig. 7 Herstellung eines CELO-Vektors von einer auf einem Plasmid enthaltenen Kopie des CELO-Virus-Genoms.

In den Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet:

a) Virus und Virus-DNA

Ein Plaque-gereinigtes Isolat von CELO-Virus (FAV-1, Phelps-Stamm), das als Ausgangsmaterial für die DNA sowohl für die direkte Sequenzierung als auch für die Bildung bakterieller Plasmidklone verwendet wurde, wurde in 9 Tage alten pathogenfreien Hühnerembryos gezüchtet, wie von Cotten, et al., 1993, beschrieben. Die FAV-1- Isolate OTE (Kawamura, et al., 1963) und Indiana C (Calnek und Cowen, 1975; Cowen, et al., 1978) wurden in Hühnerembryonierenzellen gezüchtet. Das Virus wurde aus der Allantoisflüssigkeit oder aus infizierten Embryonierenzellen mittels Auftrennung in CsCl- Gradienten gereinigt, wie von Laver, et al., 1971, und Cotten, et al., 1993, beschrieben. Virus-DNA wurde durch Behandlung der gereinigten Virionen mit Proteinase K (0.1 mg/ml) und SDS (0.2%) bei 56°C, 45 min lang, und anschließender Gleichgewichtszentrifugation der DNA in einem CsCl-Gradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid isoliert. Nach dem zweiten Gradienten wurde das Ethidiumbromid durch Extraktion mit CsCl-gesättigtem Isopropanol entfernt und die Virus-DNA ausgiebig gegen 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8 dialysiert.

b) Hühnerembryonierenzellen

Die Nieren von 14 Tage alten Hühnerembryos wurden gesammelt, in PBS gewaschen und mit Pankreastrypsin (2.5 mg/ml in PBS) bei 37°C verdaut. Die dispergierten Zellen wurden mit einem gleichen Volumen fötalem Kälberserum gemischt, die Zellen durch Zentrifugation gewonnen, einmal mit FCK-Medium gewaschen und in demselben Medium wieder aufgenommen. (Das FCK-Medium ist Medium 199 mit Earle′s Salzen (Sigma M2154), ergänzt mit 10% Tryptosephosphat (Sigma T8159), mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 µg/ml Streptomycin, 100 IU/ml Penicillin.) Die Zellen wurden in 175 cm² Gewebekulturflaschen ausplattiert (2 Embryonieren pro Flasche), bei 37°C/5% CO2 aufbewahrt und 24 bis 48 h später infiziert. Die Zellen wurden mit ca. 1.000 Viruspartikeln pro Zelle infiziert und 3 bis 4 Tage nach der Infektion, wenn der zytopathische Effekt vollständig war, geerntet.

c) Pulsed Field Elektrophorese

Aliquots von gereinigter Adenovirus-DNA (10-20 ng) wurden auf ein 1% Agarose-Gel (BioRad, PFC-Agarose) geladen und unter Verwendung eines BioRad CHEF Mapper Pulsed Field Elektrophoresesystems (Fig. E-Modus) 24 h lang in 0.5 × TBE, gekühlt auf 14°C, aufgetrennt. Die Schaltzeit, sowohl in Vorwärts- als auch Rückwärtsrichtung, wurde logarithmisch von 0.22 sec auf 0.92 sec mit einem Ramp-Faktor von 0.357 (21%) verändert. Der Vorwärts-Spannungsgradient war 9 V/cm (300 V), der Rückwärts-Spannungsgradient war 6 V/cm (200 V). Nach dem Lauf wurde das Gel 25 min in 0.5 µg/ml Ethidiumbromidlösung in Wasser gefärbt und anschließend 1 h lang entfärbt, bevor das DNA-Muster durch UV- Beleuchtung sichtbar gemacht wurde.

d) Sequenziermethoden, Datenanalyse

Für die Sequenzierung wurden EcoR1- und HindIII- Restriktionsfragmente von CELO-Virus-DNA in pBlueScript SK(⁺) kloniert. Drei der EcoR1-Klone, enthaltend die EcoR1-Fragmente C, D und E (vgl. Fig. 1B), und fünf der HindIII-Klone, enthaltend die HindIII-Fragmente F, A, G, B und E (vgl. Fig. 1B), wurden für die Herstellung von Deletionen in einer Richtung unter Verwendung von Exonuklease III ausgewählt (in Fig. 1B sind die Spaltstellen für die Restriktionsenzyme EcoR1, HindIII, BamHI und BglII angegeben; die alphabetische Bezeichnung der EcoR1- und HindIII-Fragmente - aufgrund ihrer relativen Größen - ist ebenfalls angegeben). Diese Deletionsklone wurden unter Verwendung des Taq Dyedeoxy Terminator Systems mit dem automatischen Sequenzierapparat ABI 373 nach Vorschrift des Herstellers sequenziert. Die Sequenzanalyse der terminalen 2.000 bp am linken und der 1.000 bp am rechten Ende des CELO-Virus-Genoms, die Sequenzierung zum Schließen der Lücken zwischen den Fragmenten EcoR1 C/HindIII G und den Fragmenten HindIII B/EcoR1 D sowie das Sequenzieren zwecks Bestätigung der Sequenz an verschiedenen Stellen des Genoms wurden durch direkte Sequenzierung der viralen DNA vorgenommen. Alle Sequenzdaten sind das Ergebnis von mindestens drei Sequenzreaktionen. Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung der Programme SeqEd (ABI) und SeqMan (Lasergene) zusammengeführt. Die Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des Programms GCG der Universität von Wisconsin durchgeführt.

Beispiel 1 Herstellung eines rekombinanten bakteriellen Plasmidklons des CELO-Virus-Genoms a) Herstellung eines Plasmidvektors mit geringer Kopienzahl für die Klonierung des CELO-Virus

Dafür wurde der bakterielle Vektor pBR327 (ATCC Nr. 37516) gewählt, weil er in bakteriellen Wirtsstämmen bei einigermaßen geringer Kopienzahl behalten wird (statt diesem Plasmid könnte jedes andere Plasmid mit geringer Kopienzahl, wie pBR322, gleichermaßen verwendet werden) Wesentlich war es, eine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle auf dem Vektor zu schaffen, die in der CELO-Virus-Sequenz nicht aufscheint. Wie im folgenden beschrieben, muß die Virus-Sequenz aus den Plasmidvektorsequenzen herausgeschnitten werden, um eine produktive Infektion zu injizieren, daher müssen Restriktionsstellen, die die CELO-Sequenz flankieren (die jedoch innerhalb der CELO-Sequenz nicht vorhanden sind) in den Vektor eingebaut werden. In den durchgeführten Versuchen wurde das Restriktionsenzym SpeI gewählt; statt dessen können jedoch andere Enzyme, die keine Erkennungsstellen in der CELO-Sequenz haben, wie AscI, PacI und SfiI, verwendet werden.

Das Plasmid p327SpeI wurde hergestellt, indem ein SpeI- Linker (New England Biolabs) in die Klenow-behandelte EcoR1-Stelle von pBR327 ligiert wurde, wodurch die EcoR1-Stelle zerstört und eine nur einmal vorkommende SpeI-Stelle geschaffen wurde.

b) Klonierung der Enden von CELO

Es wurden die beiden terminalen HindIII-Fragmente kloniert. Dazu wurde CsCl-gereinigte genomische CELO-DNA mit HindIII verdaut und auf einem niedrigschmelzenden Agarosegel (0.7% niedrigschmelzende Agarose in TAE) aufgetrennt. Das 1601 bp linke Endfragment und das 959 bp rechte Endfragment wurden aus dem Gel geschnitten, und jedes Gelfragment wurde in 300 µl 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.4 suspendiert und 10 min auf 70°C erhitzt, um die Agarose zu schmelzen. Die terminalen Peptide wurden durch Zusatz von NaOH auf 0.3 N und Erhitzen auf 37°C während 90 min entfernt (Hay, et al., 1984). Die Lösungen wurden dann auf Raumtemperatur abgekühlt, dann wurden Tris pH 7.4 (auf 0.1 M) und HCl (auf 0.3 M) zugesetzt, um die NaOH zu neutralisieren. Die Fragmente wurden 20 min auf 56°C erhitzt und langsam (1 h lang) auf Raumtemperatur abgekühlt, um das Reannealing zu erleichtern. Dann wurde die DNA über eine Qiaquick-Säule gereinigt und 4 h lang bei 16°C unter Verwendung einer Pharmacia T4-Ligasereaktion (New England Biolabs) an einen SpeI-Linker (New England Biolabs) ligiert. Die Ligase wurde durch 10 minütiges Erhitzen auf 70°C inaktiviert, überschüssiger Linker wurde entfernt (und ein zu SpeI komplementärer Überhang gebildet) durch zweistündiges Verdauen mit Restriktionsendonuklease SpeI. Die DNA- Fragmente wurden wiederum mittels Qiaquick Säulenchromatographie gereinigt und an mittels SpeI/HindIII/Kälber-alkalische-Phosphatase behandeltes p327SpeI ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in den Bakterienstamm DH5alpha transformiert, und es wurden Plasmidklone identifiziert, die entweder das 1601 bp linke Endfragment oder das 959 bp rechte Endfragment (beide freigesetzt mittels SpeI/HindIII-Verdau) trugen. Um die terminalen 300 bp beider Fragmente zu bestätigen, wurde eine DNA-Sequenzanalyse durchgeführt.

c) Klonierung beider CELO-Enden auf dem selben Plasmid

Das 1601 bp linke End- und das 959 bp rechte Endfragment wurden aus ihren Vektoren durch einen HindIII/SpeI- Verdau herausgeschnitten, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Qiaquick-Chromatographie gereinigt. Die beiden Fragmente wurden in ungefähr äquimolaren Mengen gemischt und unter Verwendung der Pharmacia T4-Ligasereaktion 30 min lang ligiert. Ein Aliquot von SpeI/CIP-behandeltem p327Spel wurde beigegeben und die Ligation 4 h lang fortgesetzt. Die Ligationsmischung wurde in DH5alpha transformiert, und es wurden Plasmidklone identifiziert, die das korrekte Doppelinsert trugen (pWü#1 und pWü#3).

Die zweite HindIII-Stelle wurde entfernt durch Spalten von pWü#3 mit ClaI und BamHI, Behandlung mit Klenow- Enzym, Religieren, Transformieren von DH5alpha und Auswahl eines Klons, dem das ClaI/BamHI (das eine HindIII-Stelle enthalten hatte). Das erhaltene Plasmid der Bezeichnung pWü-H35 enthielt nun eine einzige HindIII-Stelle zwischen dem linken und dem rechten CELO- Endfragment.

d) Klonierung des gesamten CELO-Genoms

Das in c) erhaltene Plasmid pWü-H35 wurde mit HindIII und CIP behandelt und auf einem niedrig schmelzenden Agarosegel, gefolgt von Qiaquick-Chromatographie, gereinigt. Der linearisierte Vektor pWü-H35 wurde mit 0.3 µg gereinigter CELO-Virus-DNA gemischt, dann wurden der DNA-Mischung auf Eis 30 µl elektrokompetenter Bakterienstamm JC8679 (Gillen, et al., 1974; Oliner, et al., 1993) beigegeben. Zehn Minuten später wurde die Mischung in eine BioRad Elektroporationskammer und mit einer elektrischen Ladung von 2.4 kV gepulst (BioRad Gene Pulser; Oliner, et al., 1993). Die Bakterien wurden dann auf LB Ampicillinplatten plattiert und die ampicillinresistenten Kolonien auf ihren Plasmidgehalt untersucht. Die Rekombination zwischen den terminalen CELO-Sequenzen auf pWü-H35 und den Enden der genomischen CELO-DNA stellt die Zirkularität des linearisierten Plasmids wieder her und erlaubt das Wachstum auf Ampicillin. Ein Plasmid, das das CELO-Genom in seiner gesamten Länge (full length) enthält, wurde identifiziert, und dieses pCELO7 bezeichnete Plasmid für die anschließenden Untersuchungen verwendet. In Fig. 2C ist die Charakterisierung von Plasmid-klonierten Kopien des CELO-Virus-Genoms dargestellt. Plasmid DNA von Klonen der Bezeichnung pCELO7, 8, 9 und 13 oder DNA, isoliert von gereinigtem CELO-Virus, wurde entweder mit BglII (Spuren 2-6) oder HindIII (Spuren 7-11) verdaut und auf einem 0.6% Agarosegel aufgetrennt, und die DNA wurde mittels Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Der Molekulargewichtsmarker (Spuren 1 und 12) war Bakteriophagen λ-DNA, geschnitten mit HindIII und EcoR1. Die Größen einiger Molekulargewichtsfragmente (in Basenpaaren) sind rechts in der Figur angegeben. Bei jedem Enzym sind die beiden CELO-Endfragmente, die während des Klonierens an das bakterielle Plasmid gebunden werden (und die daher nach Restriktionsverdau nicht freigesetzt werden) links in der Figur angegeben (in Basenpaaren). Dies sind die Fragmente mit 5832 und 5102 bp mit BglII, bzw. 1601 und 959 mit HindIII.

Die Konstruktion von pCELO7 ist in Fig. 6 dargestellt.

e) Initiierung einer CELO-Virus-Infektion von einem klonierten CELO-Genom

pCELO7 wurde mit SpeI (welches an den Stellen spaltet, die die Adenovirus-Termini flankieren) gespalten, mit Phenol/Chloroform extrahiert und über eine HBS- äquilibrierte Gelfiltrationssäule (Pharmacia Nick Säule) geschickt, um Verunreinigungen zu entfernen. Die gespaltene DNA wurde dann in Streptavidin- Polylysin/Transferrin-Polylysin/Biotin-Adenovirus (UV/Psoralen-inaktiviert) eingebaut, wie in der WO 93/07283 beschrieben. Komplexe, enthaltend 0.5 µg SpeI-gespaltenes pCELO7 plus 5.5 µg Carrier-DNA (pSP65; Boehringer Mannheim), wurden verwendet, um primäre embryonische Hühnernierenzellen zu transfizieren (die Komplexe enthielten 4 mg DNA pro 180 cm² Flasche, enthaltend ca. 3 × 106 Zellen), und die Zellen wurden auf den durch die Virusreplikation verursachten zytopathischen Effekt untersucht. Fünf Tage nach der Transfektion, als sich die meisten der transfizierten Zellen abgerundet und von der Plattenoberfläche gelöst hatten, wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen, und das CELO-Virus wurde gereinigt, wie von Cotten, et al., 1993, beschrieben. Die Virusausbeute vom Plasmid­ klonierten CELO-Virus ist vergleichbar mit den Ausbeuten, die bei Verwendung von reiner CELO-Virus-DNA (gereinigt aus Virionen) erhalten werden.

Beispiel 2 Herstellung einer CELO-Mutante, der am rechten Ende die Sequenzen von nt 35.870 bis 42.373 fehlen

Es gibt keine identifizierbaren viralen Strukturgene jenseits der zwei Fasergene, mit der L5-Polyadenylierungsstelle bei Position 31771. (Es gibt ein kryptisches VA-Gen bei Position 39.841 bis 39.751.) Es wurde daher untersucht, ob die Sequenzen zwischen ca. 32.000 und dem rechten ITR für das Wachstum des Virus in Zellkultur notwendig sind. Dafür wurde eine Häufung von sieben AseI-Stellen bei den Positionen 35.870, 36.173, 38.685. 38.692, 39.015, 42.348 und 42.373 ausgenutzt, die sonst nirgends im CELO-Virus-Genom vorkommt. pCELO7 wurde mit AseI verdaut, religiert, und ein Plasmid, dem die inneren AseI-Fragmente fehlen, wurde identifiziert und als pALMCELO_35870-42373 bezeichnet. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, daß der Plasmidvektor ebenfalls eine AseI-Stelle hat; diese befindet sich jedoch im Ampicillinresistenzgen, und die Selektion auf Ampicillinresistenz erfordert, daß alle positiven Kolonien zumindest die beiden Fragmente haben, die die rechten und linken Hälften des amp-Gens tragen.

Um die weiteren Manipulationen des Virus mit dem fehlenden linken Ende des Genoms zu vereinfachen, wurde pALMCELO_35870-42373 mit AseI (welches einmal im Ampicillinresistenzgen des Plasmids und einmal bei Position 35.870 schneidet) verdaut und an ein Linker- Oligonukleotid TACCCTTAATTAAGGG ligiert, welches für eine Schnittstelle für die Restriktions-Endonuklease PacI sowie für Enden, die komplementär den beim AseI- Verdau gebildeten sind, kodiert. Religierung, gefolgt von Selektion auf Ampicillinresistenz, identifizierte Plasmide, die das Oligonukleotid nicht an der AseI- Stelle des Ampicillinresistenzgens integrierten. Restriktionsverdau identifizierte ein Plasmid, das eine PacI-Stelle an der früheren AseI-Stelle von CELO bei Position 35.870 trug. Dieses Plasmid wurde als pALMCELO_35870-42373P bezeichnet.

Beispiel 3 Herstellung eines CELO-Virus-Vektors, in dem ein Fasergen fehlt, das durch ein interessierendes Gen ersetzt wird

Die CELO-Fasergene sind auf einem HindIII-Fragment, das sich von nt 27.060 bis 33.920 erstreckt (das HindIII B- Fragment, vgl. die Restriktionskarte in Fig. 1B), enthalten. Auf diesem Fragment, erstreckt sich die für Faser 1 kodierende Sequenz von nt 1.054 bis 3.435. Das 5H3-Fragment wurde mit BglII (das bei nt 1.168 schneidet) und HpaI (das bei 3.440 schneidet) verdaut, das BglII-Ende wurde mit Klenow-Enzym aufgefüllt und an ein stumpfes CMV/Luciferase/β-Globin- Spalt/Polyadenylierungssignal-Fragment aus dem Plasmid pCMVL (Plank et al., 1992) ligiert, um das Plasmid p5H_28227-30502(luc) zu bilden, dem beinahe die ganze Faser 1-Sequenz fehlt, die durch eine Luciferaseexpressionseinheit ersetzt ist.

Die relevanten Restriktionsschnittstellen in CELO sind folgende:

Die Modifikationen, die auf p5H_28227-30502(luc) vorgenommen worden waren, wurden auf folgende Weise in das gesamte CELO-Genom eingeführt: Das CELO/Luciferase/CELO-Fragment wurde aus p5H_28227-30502(luc) als HindIII-Fragment herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit dem 26kbXbaI-Fragment (CELO-Nukleotide 1988-28608) und den terminalen HpaI-Fragmenten, abgeleitet von pCELO7 (erhalten durch Schneiden mit hpaI, enthaltend das linke Ende des CELO-Virus und pBR327-Sequenzen, definiert durch die HpaI-Stellen) rekombiniert. Die drei DNA- Fragmente (ca. je 50 ng) wurden in Wasser gemischt und in JC8679-Zellen elektroporiert, wie oben beschrieben.

Beispiel 4 Einführung eines Reportergens (Luciferase) in das CELO- Genom

i) Herstellung eines linken Endfragments, enthaltend ein CMV-Luciferasekonstruktur
Das EcoRI-Fragment der Bezeichnung 7R1 (Nukleotide von Position 79 bis 8877) wurde in ein pSP65-Derivat der Bezeichnung pAAALM (beschrieben in der WO 95/33062) kloniert. Das Plasmid wurde in den DAM-Methylase­ negativen Bakterienstamm JM110 transformiert, um eine Spaltung der ClaI-Stellen in dem Fragment zu ermöglichen. Das Plasmid wurde gereinigt, mit ClaI (bei Position 1083) und NcoI (bei Position 4334) geschnitten, mit Klenow-Enzym behandelt, um die überhängenden Enden aufzufüllen, und an ein stumpfes CMV/Luciferase/β- Globin-Spalt/Polyadenylierungssignal (Plank et al., 1992) ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde p7R1_1083-4334Luc bezeichnet.
ii) Rekombination des Luciferase-Linkes-Ende-Fragments in eine komplette (full length) CELO-Sequenz
Das Plasmid p7R1_1083-4334Luc wurde gespalten mit Eco47 III, welches bei den CELO-Nukleotiden 937, 1292, 2300 und 8406 (die Stellen bei Nukleotid 1292 und 2300 fehlen in p7R1_1083-4334Luc) spaltet, um ein großes Fragment, enthaltend die Sequenz CELOnt937-1083/CMVLucPA/CELOnt4334-8406, freizusetzen. Dieses Fragment wurde in pCELO7 rekombiniert. pCELO7 wurde an der einzigen PmeI-Stelle bei CELO nt7433 gespalten und ausgiebig mit Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert. Das linearisierte pCELO7 wurde mit einem ca. 3- bis 5fachen molaren Überschuß von CELOnt937-1083/CMVLucPA/CELOnt4334-8406 gemischt. Die Mischung wurde in den Bakterienstamm JC8679 elektroporiert, und ampicillinresistente Kolonien wurden auf Plasmide untersucht, die die gewünschte rekombinante DNA enthalten. Das richtige Plasmid wurde identifiziert, mittels Restriktionsenzymanalyse charakterisiert und pCELOLucI bezeichnet.
iii) Ein Luciferase exprimierendes CELO-Virus wurde hergestellt, indem pCELOLucI in primäre embryonische Hühnernierenzellen transfiziert wurde, wie oben beschrieben.

Beispiel 5 Herstellung eines CELO-Vektors von einer auf einem Plasmid enthaltenen Kopie des CELO-Virus-Genoms

Die Region zwischen der DraIII-Stelle (ursprünglich bei nt 34.426 im CELO-Virus-Genom enthalten) und der XhoI- Stelle (ursprünglich bei nt 36.648 im CELO-Virus-Genom enthalten) wurden aus dem Plasmid pAALMH3, welches das HindIII-Fragment von nt 33.920 bis nt 38.738, kloniert in pAALM, enthält, entfernt. Dann wurde mit T4-DNA- Polymerase behandelt, um stumpfe Enden herzustellen, und mit dem CMV/Luciferase/β-Globin-Fragment (vgl. Beispiel 4) ligiert. Damit wurde das Plasmid p7H3Δ 34426-36648 Luc erhalten. Das CELO/Luciferase/CELO- Fragment wurde auf einem Hind3-Fragment herausgeschnitten und in das CELO-Genom von pCELO7 mittels Rekombination über die nur einmal vorkommende FseI-Stelle bei Position 35.694 inseriert. Dies ergab das Plasmid pCELOA 34426-36648Luc. Verdau mit SpeI und Transfektion in embryonale Hühnernierenzellen ergaben ein Virus CELOA 34426-36648Luc. Im Anschluß wurden weitere Insertionen, die die Luciferasesequenz durch andere interessierende Gene ersetzen, durchgeführt, indem die mit der Luciferasesequenz eingeführte, nur einmal vorkommende PacI-Stelle benutzt wurde.

Fig. 7 zeigt die in diesem Beispiel angewendete Klonierungstrategie in allgemeiner Form: Ein kleines CELO-Fragment wird in ein Plasmid (enthaltend Restriktionsstelle C) subkloniert; die Restriktionsstellen A und B, die in diesem Plasmid nun nur einmal vorkommen, werden verwendet, um die Sequenz durch Fremd-DNA zu ersetzen. Als nächster Schritt wird das gesamte Fragment, enthaltend die Fremd-DNA zwischen CELO-Sequenzen, aus dem Plasmid herausgeschnitten und mit dem Plasmid, das die gesamte CELO-DNA enthält und das mit einem Restriktionsenzym (D)geschnitten wurde, das die CELO-DNA nur einmal spaltet, gemischt. Mit diesem Gemisch werden Bakterien (z. B. vom Stamm JC8679; Oliner et al., 1993; oder einem anderen Bakterienstamm mit ähnlicher Fähigkeit zur Rekombination) transformiert; Rekombination liefert das gewünschte Plasmid, enthaltend die Fremd-DNA als Insert im CELO- Virus-Genom.

Beispiel 6 Herstellung einer Wachtelzellinie, die die 7R1- Deletionen und/oder die 9R1-Deletionen in CELO komplementiert

Die Plasmide pX7R1 und pX9R1 (beschrieben in der WO 95/33062) wurden mittels Transferrinfektion, wie in der WO 93/07283 beschrieben, in primäre embryonische Wachtelnieren- oder -leberzellen eingebracht. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und bei 1/5 der ursprünglichen Dichte ausgesät. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich mit FCK-Medium nachgefüttert. Klonale Linien wurden expandiert, und Klone, die entweder das 7R1-, das 9R1-Plasmid oder beide Plasmide trugen, wurden mittels PCR-Analyse identifiziert. Die RNA-Expression von den integrierten Plasmiden wurde mittels Northern Analyse bestimmt.

Tabelle 1

CELO-Virus-Sequenzen, veröffentlicht oder aus Datenbanken

Tabelle 2A

Organisation des CELO-Virus-Genoms

Tabelle 2B

Nicht zugeordnete offene Leserahmen, größer als 99 Aminosäurereste

Tabelle 3

Rekombinante Adenovirusvakzine

Tabelle 4

Charakteristika des CELO-Virus-Genoms

Literaturliste

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Claims (26)

1. CELO-Virus, erhältlich durch in-vitro-Manipulation von genomischer CELO-Virus-DNA.

2. CELO-Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es durch in-vitro-Manipulation einer Plasmid­ klonierten CELO-Virus-DNA erhältlich ist.

3. CELO-Virus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es den linken und rechten invertierten terminalen Repeat sowie das Verpackungssignal enthält und in davon verschiedenen Regionen der CELO-Virus-DNA Modifikationen in Form von Insertionen und/oder Deletionen und/oder Mutationen aufweist.

4. CELO-Virus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es Modifikationen aufweist, die auf einem Abschnitt der CELO-Virus-DNA liegen, der die Nukleotide von ca. 201-ca. 5.000 umfaßt und/oder auf einem Abschnitt, der die Nukleotide von ca. 31.800-ca. 43.734 umfaßt und/oder auf einem Abschnitt, der die Nukleotide von ca. 28.114-30.495 umfaßt.

5. CELO-Virus-DNA, enthalten auf einem Plasmid, das in Bakterien oder Hefe replizierbar ist und nach Einbringen in Zellen, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Plasmid, das ein der CELO-Virus gegebenenfalls fehlendes, für die Entstehung reifer Viruspartikel erforderliches Gen komplementiert, Viruspartikel liefert.

6. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 3, 4 oder 5, enthaltend Fremd-DNA.

7. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 6, enthaltend als Fremd-DNA eine für ein therapeutisch wirksames Protein kodierende DNA.

8. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 7, enthaltend als Fremd-DNA eine für ein immunstimulierendes Protein kodierende DNA.

9. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 8, enthaltend eine für ein Zytokin kodierende DNA.

10. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 6, enthaltend als Fremd-DNA eine DNA, kodierend für ein Tumorantigen oder ein Fragment davon.

11. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 6, enthaltend als Fremd-DNA eine DNA, kodierend für ein von einem Humanpathogen abgeleitetes Antigen.

12. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 6, enthaltend als Fremd-DNA eine DNA, kodierend für ein von einem Tierpathogen abgeleitetes Antigen.

13. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 12, enthaltend als Fremd-DNA eine DNA, kodierend für ein von einem Vogelpathogen abgeleitetes Antigen.

14. CELO-Virus oder CELO-Virus-DNA nach Anspruch 6, enthaltend als Fremd-DNA eine DNA, kodierend für einen Liganden für Säugetierzellen.

15. CELO-Virus-DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Fremd-DNA in der FseI-Schnittstelle bei Position 35.693 bzw. über diese Schnittstelle hinweg oder in der Nähe dieser Schnittstelle enthält.

16. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter CELO- Virus-DNA nach einem der Ansprüche 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man ein CELO-Virus-DNA-Fragment, enthaltend zwei Restriktionsstellen, in ein bakterielles Plasmid kloniert, daß man zwischen diese auf dem Plasmid nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen die Fremd-DNA inseriert, daß man das die Fremd-DNA enthaltende Fragment aus dem Plasmid herausschneidet und mit einem Plasmid mischt, das die gesamte CELO-Virus-DNA enthält und das an einer nur einmal vorkommenden Restriktionsschnittstelle geschnitten wurde, und daß man mit diesem Gemisch von DNA-Molekülen Bakterien transformiert und die Bakterien züchtet, wobei durch Rekombination der DNA-Moleküle ein Plasmid erhalten wird, das die gesamte CELO-Virus-DNA mit der Fremd- DNA als Insert enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA ein Reportergen ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen eine Restriktionsschnittstelle aufweist, in welche in einem zusätzlichen Schritt eine in einem der Ansprüche 7 bis 10 definierte Fremd-DNA inseriert wird.

19. Verfahren zur Herstellung von CELO-Virus nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem nach Anspruch 10 erhaltenen Plasmid, gegebenenfalls gemeinsam mit einem Plasmid, das ein der CELO-Virus gegebenenfalls fehlendes, für die Entstehung reifer Viruspartikel erforderliches Gen komplementiert, Vogelzellen transformiert und die Zellen kultiviert, wobei CELO-Viruspartikel erhalten werden.

20. Helferzellen, enthaltend, in ihrem Genom integriert, CELO-Virusgene.

21. Helferzellen nach Anspruch 20, daß die Zellen Vogelzellen sind.

22. Arzneimittel zur Anwendung in der Gentherapie, enthaltend ein CELO-Virus nach Anspruch 7.

23. Vakzine gegen Infektionskrankheiten des Menschen, enthaltend ein CELO-Virus nach Anspruch 11.

24. Vakzine gegen Infektionskrankheiten von Tieren, enthaltend ein CELO-Virus nach Anspruch 12.

25. Vakzine gegen Infektionskrankheiten von Vögeln, enthaltend ein CELO-Virus nach Anspruch 13.

26. CELO-Virus nach Anspruch 8, 9 oder 10 für die Herstellung von Krebsvakzinen.