DE4426429A1 - Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf den Import von Virus- Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen zwecks Produktion rekombinanter Viren, insbesondere Retroviren.

Genetische Veränderungen im Hinblick auf eine therapeutische Anwendung erfordern einen leistungsfähigen Gentransfer in primäre Zellen. Als Transportmittel für die Gene wurden u. a. rekombinante Viren, insbesondere Retroviren, vorgeschlagen, die derzeit in mehreren klinischen Studien verwendet werden (Miller, 1993). Retrovirale Vektoren sind rekombinante Retroviren, deren virale Gene teilweise oder zur Gänze durch fremdes genetisches Material ersetzt wurden. Nach einer Infektion von Zellen wird das rekombinante Virusgenom stabil in das Genom der Wirtszelle integriert. Der Gentransfer mittels Retroviren, dessen Vorteile vor allem in einem effizienten Gentransfer in primäre Zellen sowie in der stabilen Integration des Provirus gelegen sind, ist für die Ermöglichung eines stabilen Gentransfers in die meisten sich teilenden primären Zellen recht effizient. Bis heute ist es nur auf diesem Weg möglich, genetisches Material in hämatopoetische Stammzellen einzubringen. Eine Beschränkung dieses Gentransfersystems liegt in der limitierten Verpackungskapazität; aufgrund von Größenbeschränkungen (ca. 6 kb) können retrovirale Vektoren nur cDNAs oder kleine Gene transduzieren. Ein Nachteil ist ferner, daß Titer von infektiösen Partikeln im Vergleich zu DNA-Viren, wie z. B. Adenovirus, für gewöhnlich niedrig sind. Die geringeren Titer sind ein generelles Merkmal von Retroviren; so produzieren Fibroblasten, die mit Moloney-Murine Leukemia Virus (M-MuLV) infiziert wurden, ca. 1-5×10⁷ infektiöse Partikel pro Milliliter Kulturmedium (cfu/ml). Die Titer rekombinanter Retroviren sind meist noch erheblich geringer (1-10×10⁵ cfu/ml) und können oft erst nach mühsamer Klonierung virusproduzierender Zellen erreicht werden. Relativ hohe Titer können von kleinen retroviralen Vektoren, die ein einziges Gen tragen, z. B. N2 (Armentano et al., 1987), erhalten werden, während die Titer im allgemeinen mit zunehmender Vektorgröße abnehmen, z. B. wenn ein zweites Gen transduziert wird. Es wurde beobachtet, daß die Titer häufig mit der Zahl der integrierten Viruskopien korrellieren.

Im Hinblick auf die gentherapeutische Anwendung von rekombinanten Retroviren ist der geringe Titer ein wesentlicher Nachteil, während der Nachteil der limitierten Verpackungskapazität im allgemeinen weniger zum Tragen kommt, weil in den meisten Fällen cDNAs exprimiert werden.

Es wurden bereits einige Versuche unternommen, die retroviralen Titer zu erhöhen. Zunächst wurde gezeigt, daß die Infektion von Verpackungszellen mit einem Virus eines anderen Wirtsspektrums im Vergleich zur Transfektion der Verpackungszellen höhere Titer ergibt (Miller et al., 1993). Diese Steigerung des Titers kann durch die Beobachtung erklärt werden, daß die Expression des retroviralen Genoms nach der Infektion höher ist als nach der Transfektion (Hwang und Gilboa, 1984). Die Co-Kultivierung von zwei Verpackungszellinien, die Viren mit verschiedenem Wirtsspektrum produzieren, kann zu enormen Steigerungen der Effizienz der Virusproduktion als Folge einer deutlichen Zunahme der Kopienzahl von Proviren führen (Bestwick et al., 1988; Bodine et al., 1990; Lynch und Miller, 1993). Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist jedoch die Bildung von replikationskompetenten Helferviren in großen Mengen (Lynch und Miller, 1993).

Die bisher verwendeten Verpackungszellinien sind daher offensichtlich für einen Gentransfer in vivo nicht geeignet. Außerdem ist diese Methode arbeits- und zeitaufwendig, weil die Co-Kultivierung lange dauert und im Anschluß daran noch eine Klonierung der Zellen erforderlich ist. Kürzlich wurde eine neue Verpackungszellinie beschrieben, die von der Ad5- transformierten humanen embryonischen Nierenzellinie 293 abgeleitet ist. Diese Zellinie erlaubt die Bildung von hohen Titern an retroviralen Vektoren nach transienter Transfektion (Pear et al., 1993).

In jüngerer Zeit wurden Gentransfersysteme entwickelt, die auf Mechanismen beruhen, deren sich die Zelle für den Transport von Makromolekülen bedient, z. B. auf dem äußerst leistungsfähigen Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose (Wu und Wu, 1987; EP-A1 0 388 758; WO 91/17773, WO 92/17210 und WO 92/19281). Mit Hilfe dieser Methode, die sich bifunktioneller molekularer Konjugate bedient, die eine DNA-Bindungsdomäne und eine Domäne mit Spezifität für einen Zelloberflächenrezeptor aufweisen, konnten hohe Gentransferraten erzielt werden.

Der Gentransfer auf physiologischem Weg, wie ihn die Rezeptor-vermittelte Endozytose mittels Nukleinsäure- Komplexen darstellt, weist große Vorteile auf (nicht- toxischer Mechanismus des Durchtritts durch die Zellmembran; Möglichkeit der Verabreichung biologisch aktiver Nukleinsäuren, auf repetitiver oder kontinuierlicher Basis; Möglichkeit des zellspezifischen Targeting; Herstellbarkeit der Konjugate in großen Mengen). Eine zusätzliche Verbesserung des Systems wurde durch eine Technik erzielt, die die Fähigkeit von bestimmten Viren und Viruskomponenten ausnützt, Endosomen aufbrechen zu können. Mit Hilfe eines Zusatzes dieser endosomolytischen Mittel konnte eine erhebliche Steigerung der Expressionsraten der in die Zelle importierten Gene erzielt werden. Diese Methode ist im wesentlichen charakterisiert durch einen Transfer großer DNA-Fragmente, den Transfer in hoher Kopienzahl und einen zumeist transienten Gentransfer.

Mit Hilfe dieses Gentransfersystems ist es möglich, auch große DNA-Fragmente (<50 kb) in teilende oder nicht-teilende Zellen, einschließlich primären Zellen, die sich Standardtransfektionsmethoden widersetzen, einzubringen. Wenn auch die bisher untersuchte Genexpression transient, wenn auch lang anhaltend war, konnte bisher in hämatopoetische Stammzellen von Säugetieren oder frühe Vorläuferzellen kein Gentransfer erreicht werden.

Bei der vorliegenden Erfindung wurde von der Überlegung ausgegangen, die Vorteile der beiden Gentransfersysteme, nämlich des auf rekombinanten Viren und des auf rezeptorvermittelter Endozytose beruhenden Systems, zu vereinigen mit dem Ziel, die hohe Transfektionseffizienz des verbesserten Systems auf der Grundlage der rezeptorvermittelten Endozytose, welches endosomolytische Mittel zur Steigerung der heterologen Genexpression einsetzt, auszunützen, um die Titer von viralen, insbesondere retroviralen, Vektoren zu erhöhen.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues effizientes Gentransfersystem bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen, wobei die DNA eine in der Zelle zu exprimierende Sequenz enthält und mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist und wobei man die Zellen mit dem Komplex in Gegenwart eines endosomolytischen Mittels in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA für einen viralen Vektor kodiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die DNA für einen Retrovirus-Vektor (diese DNA wird im folgenden als "Retrovirusvektor-DNA" bezeichnet); die vorliegende Erfindung ist jedoch auch auf andere rekombinante Viren, z. B. Adenoviren anwendbar.

Die im Rahmen der vorliegende Verfahren zum Einführen von DNA in eukaryotische Zellen verwendete Methodik ist bekannt (Wagner et al., 1991a und 1991b; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992a und 1992b; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al., 1993a und 1993b; Curiel et al., 1991; WO 93/07283 und WO 93/07282). Die Anwendung dieser Methodik auf Retrovirusvektor-DNA lieferte Titer, deren Höhe in diesem Ausmaß nicht erwartet werden konnte. Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielbaren Retrovirustiter in Verpackungs- und primären Zellen erreichen außerordentlich hohe Werte: die transfizierten Zellen enthalten überraschenderweise fünf bis zehn und mehr intakte integrierte Provirus-Kopien, was in der Produktion von 30 bis 100fach höheren Titern von infektiösen Vektorpartikeln resultiert. Damit werden 30 bis 100fach höhere Titer an infektiösen Vektorpartikeln erhalten als im Vergleich mit der Kalziumphosphat-Methode oder mittels retroviraler Infektion.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den etablierten Methoden sind vor allem folgende:

• 1) In etablierten Verpackungszellinien werden bereits nach der transienten Transfektion hohe Virustiter erhalten, eine weitere Steigerung der Titer wird nach Selektion auf stabile Integration erreicht. Ferner wird die Produktion von Virus in genetisch nicht veränderten Zellen nach co-Transfektion retroviraler Vektorkonstrukte und Verpackungsfunktionen ermöglicht.
• 2) Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht ferner darin, daß die transfizierten Zellen frei sind von replikationskompetentem Helfervirus oder replizierendem Adenovirus. Die hohen Titer wurden nicht nur für transient transfizierte Zellen erzielt, sondern auch für stabile klonale oder gepoolte Transfektanten. Bemerkenswerterweise waren die Virustiter von gepoolten Populationen oder transfizierten Klonen nicht signifikant geringer als die von isolierten Klonen, was bei Kalziumphosphat- transfizierten Klonen im allgemeinen nicht der Fall ist. Die erhöhten Virustiter waren höchstwahrscheinlich auf multiple integrierte Kopien der transfizierten Plasmide zurückzuführen. Die Infektion von Zielzellen (z. B. NIH3T3) mit Virus, das erhalten wurde von Zellen, die mit Transferrin-Polylysin/Adenovirus, transfiziert worden waren, war nicht unterscheidbar von einer Infektion mit Viren, die aus Zellen stammten, die mit Kalziumphosphat transfiziert worden waren.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die Retrovirusvektor-DNA in Form eines ternären Komplexes einerseits mit einem Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation, z. B. Transferrin-Polylysin, und andererseits mit einem Konjugat aus einem endosomolytischen Mittel und einem Polykation, z. B. Adenovirus-Polylysin, in die Zellen zu befördern. In diesem Fall ist das endosomolytische Mittel ein Adenovirus, das in Form eines mit der DNA komplexierbaren Polylysin-Konjugats und somit im Komplex integriert vorliegt. Bevorzugt wird ein, z. B. mittels physikalisch-chemischen Methoden, inaktiviertes Adenovirus eingesetzt, das an Polylysin über eine Biotin-Streptavidin-Brücke gebunden ist.

Hinsichtlich der Durchführung des Verfahrens, der Auswahl der Komplexpartner für die Retrovirusvektor-DNA (Internalisierungsfaktor, Polykation) und des endosomolytischen Mittels ermöglicht das Verfahren eine große Variabilität; diesbezüglich wird auf die Offenbarung der WO 93/07283 Bezug genommen.

Bezüglich Retrovirusvektoren, von denen eine große Zahl zur Verfügung steht, gibt es keine Beschränkungen; es kommen sämtliche retrovirale Vektoren in Betracht, die zumindest zwei LTRs und ein Verpackungssignal, also die cis-Funktionen besitzen. Die trans-Funktionen, die die Verpackungsfunktionen darstellen, sind gegebenenfalls Teil der retroviralen Sequenz auf einem einzigen Plasmid oder sie befinden sich, in einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere für therapeutische Anwendungen, auf einem getrennten Plasmid, einem sog. "Verpackungsplasmid" (in diesem Fall besteht somit die Retrovirusvektor-DNA aus zwei Plasmiden).

Zu Retrovirus-Vektoren, Verpackungslinien und deren Einsatz für gentherapeutische Anwendungen existiert zahlreiche Literatur; Beispiele für geeignete Retrovirus-Vektoren sowie die Mechanismen der Transduktion von Retroviren werden u. a. in den Übersichtsartikeln von Miller und Rosman, 1989, Morgenstern und Land, 1990, sowie Swain und Coffin, 1992, angegeben.

Verpackungsplasmide enthalten Sequenzen, die für retrovirale Proteine kodieren, jedoch keine retroviralen Regulationseinheiten tragen, wodurch die Bildung replikationskompententer Helferviren vermieden wird. Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Verpackungsplasmide wurden u. a. von Markowitz, 1988, beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur raschen und einfachen Herstellung stabiler Zellinien, die hohe Titer an rekombinantem Retrovirus produzieren. Im Gegensatz zu den Verfahren gemäß Stand der Technik erfordert es keine arbeitsaufwendige Transfektion, anschließende Infektion und Isolierung von Klonen. Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens besteht auch darin, rekombinante Retroviren transient produzieren zu können, welche von den Verpackungszellinien schlecht toleriert werden.

Außer für die Herstellung von Verpackungszellinien mit hohem Titer kann das Verfahren bevorzugt angewendet werden, um retrovirale Vektoren auch in nicht- verpackenden Zellen herzustellen. Dafür kommt die Ausführungsform der Erfindung zur Anwendung, bei der "Verpackungsplasmide" mit der die übrigen Virussequenzen enthaltenden Retrovirusvektor-DNA co- transfiziert werden. In diesem Fall besteht also die Retrovirus-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden, von denen eines die für die Verpackungsfunktionen und eines die für die übrigen Virusproteine kodierenden Sequenzen sowie die in der Zelle zu exprimierende DNA enthält.

Für diese Anwendung kommt der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders zum Tragen, daß zwei Plasmide gemeinsam in die Zelle transportiert werden können, nachdem sie als Mischung in einem definierten Mengenverhältnis, vorzugsweise 3 : 1 bis 1 : 3, mit den übrigen Transfektionskomponenten, z. B. mit Polylysin-Transferrin und mit Adenovirus-Polylysin- Konjugaten, komplexiert wurden. Es können somit ein Retrovirus-Vektorplasmid, das die in der Zelle zu exprimierende, insbesondere gentherapeutisch wirksame Sequenz trägt, und ein Verpackungsplasmid koordiniert in die Zelle gebracht werden, wobei das Mengenverhältnis variiert und im Hinblick auf die angestrebte Expressionseffizienz optimiert werden kann. Das optimale Mengenverhältnis wird mittels empirischer Versuche ermittelt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf Transfektionskomplexe, enthaltend DNA, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie ein endosomolytisch wirkendes Mittel, wobei die DNA für einen Retrovirusvektor kodierende Sequenzen enthält. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform

Die vorliegende Erfindung findet insbesondere im Rahmen der Gentherapie Anwendung.

Beispiele für im Rahmen der somatischen Gentherapie anwendbare Gene, die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung als Bestandteil von Retrovirus-Vektor-DNAin die Zelle eingeschleust werden können, sind Faktor VIII (Hämophilie A), (siehe z. B. Wood et al., 1984), Faktor IX (Hämophilie B), (siehe z. B. Kurachi et al., 1982), Adenosindeaminase (SCID), (siehe z. B. Valerio et al., 1984), α-1 Antitrypsin (Lungenemphysem), (siehe z. B. Ciliberto et al., 1985) oder das "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene" (siehe z. B. Riordan et al., 1989). Diese Beispiele stellen keinerlei Beschränkung dar.

Eines der Probleme bei der Verwendung rekombinanter Retroviren in der Gentherapie liegt darin, daß Retroviren im Organismus rasch abgebaut werden und somit oft nicht an die Zielzellen gelangen. Ein effizienter Gentransfer kann daher mit den nach herkömmlichen Methoden hergestellten retroviralen Vektoren nur dann erreicht werden, wenn diese direkt am Zielorgan appliziert werden oder sogar eine Perfusion des betreffenden Organs, z. B. der Leber, vorgenommen wird. Dieser Aufwand kann vermieden werden, wenn für die Transfektion Überstände mit hohem Retrovirus-Titer verwendet werden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro (unter Verwendung von Verpackungszellinien oder, bei Zellen ohne Verpackungsfunktion, mittels Co-Transduktion von Verpackungsfunktionen enthaltenden Vektoren) hergestellt wurden.

Die Ausführungsform der Erfindung, bei der Zellen ohne Verpackungsfunktion zusammen mit einem Verpackungsplasmid eingesetzt werden, bietet den Vorteil, daß sie auf autologe Zellen angewendet werden kann, wodurch diese Anwendung vor allem für einen Gentransfer mittels Retroviren in situ von Interesse ist. Für einen Gentransfer in situ kommen insbesondere zwei alternative Anwendungsformen in Betracht:

• 1) Dem Organismus werden Zellen, z. B. Fibroblasten, hämatopoetische Zellen, Myoblasten, Hepatozyten oder Knochenmarksstromazellen, entnommen und diese primären Zellen ex vivo transfiziert. Die so erhaltenen vektorproduzierenden Zellen werden danach in den Organismus rückverpflanzt, um an der Implantationsstelle über einen längeren Zeitraum eine große Menge an Vektormaterial zu produzieren, was zu einer in situ Transduktion proliferierender Zellen in der Umgebung führt. Der Hauptvorteil einer solchen Anwendung liegt darin, daß die kontinuierliche Produktion des Vektors in situ die Transduktion von Zellen mit geringen Teilungsraten, wie Stammzellen und Zellen, die zum physiologischen Zellumsatz beitragen, ermöglicht.
• 2) Die Transduktion der Zielzellen mit dem Retrovirus- Vektor wird direkt in vivo vorgenommen, indem erfindungsgemäßen Transfektionskomplexe, enthaltend Retrovirusvektor-DNA, als Bestandteil lokal appliziert wird. Damit können terminal differenzierte Zielzellen, wie Blutzellen, Bronchien- oder Darmepithelzellen, Keratinozyten oder Brustdrüsenzellen erreicht werden.

Ein Beispiel für eine lokale in vivo Applikation ist die direkte Injektion der Gentransferkomplexe ins Leberparenchym oder ins Gallengangsystem mit dem Ziel, die retroviralen Vektoren und Verpackungsplasmide ins Gallengangepithel zu bringen, um einen in situ Gentransfer in Vorläuferzellen zu erreichen.

Ein weiteres Beispiel für eine gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Komplexe ist die Einführung des humanen β-Interferongens in die Brustdrüse, wobei eine direkte in vivo Transduktion ins Brustdrüsenepithel erfolgen kann.

Figurenübersicht

Fig. 1 Durchflußzytometrie-Analyse der HERc- Expression.

Fig. 2 Analyse von genomischer DNA.

In den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anders angegeben, folgende Materialien und Methoden verwendet:

a) Verwendete Zellen

Maushepatozyten BNL CL.2 (ATCC No. TIB 73); Zellen der Verpackungszellinie GP+E86, beschrieben von Markowitz et al., 1988, NIH3T3 (TK-)-Zellen.

b) Herstellung von rekombinanten Retroviren

Die retroviralen Vektoren, die den normalen humanen EGF-Rezeptor (HERc), c-kit oder tsp53 exprimieren, waren vom Vektor LXSN, beschrieben von Miller und Rosman, 1989, abgeleitet. Das Plasmid LXSN-HERc wurde hergestellt, indem ein 3.9 kb XhoI-Fragment, erhalten vom Plasmid NTK-HERc (von Rüden und Wagner, 1988), in die XhoI-Stelle von pLXSN inseriert wurde. Das LXSN- tsp53-Virus wurde erhalten, indem die für die p53va1135-Mutante (Gottlieb et al., 1993) kodierende cDNA in die EcoRI-Stelle von pLXSN inseriert wurde. Der Vektor pLXSN-Kit wurde von Alexander et al., 1991, beschrieben; das Plasmid pLSXN-tsb53 wurde von Gottlieb et al., 1993, beschrieben. Das Plasmid pMOV9.2 wurde von Harbers et al., 1981, beschrieben. Die Titer der rekombinanten Viren wurden bestimmt, indem NIH3T3 (TK-)-Zellen (105 Zellen pro 6 cm Schale 2 h lang infiziert wurden und anschließend mit G418 (Gibco, 1 mg/ml) selektioniert wurde, wobei als Medium IMDM (Iscoves modifiziertes Dulbeccos Medium (Gibco) und 10% FCS verwendet wurde.

c) Transfektion von Zellen

Die Transfektionen mit Transferrin- Polylysin/Adenovirus-DNA-Komplexen (im folgenden als "Adenovirus-Transferrinfektion" bezeichnet) wurde im wesentlichen durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen: die Transfektionskomplexe wurden in einem dreistufigen Verfahren hergestellt. Im ersten Schritt wurden 8×10⁹ Partikel biotinyliertes, Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl312 mit Streptavidin-modifiziertem Polylysin 290 modifiziert, indem in einem Gesamtvolumen von 200 µl HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Dann wurden 6 µg DNA in 150 µl HBS hinzugegeben, gründlich durchmischt und während einer Inkubationszeit von 30 min an das Polylysin-modifizierte Adenovirus binden gelassen. Abschließend wurden 5.4 µg Polylysin- modifiziertes Transferrin in 150 µl HBS zu der Mischung gegeben, um ebenfalls an die DNA zu binden. Nach 30 min wurden die Komplexe mit 1.5 ml Kulturmedium (für GP+E86-Zellen: IMDM, enthaltend 5% FCS, 50 µM P-Mercaptoethanol und Antibiotika; für die Maushepatozyten BNL CL.2: Hochglukose-DMEM, enthaltend FCS und Antibiotika) verdünnt und auf 3×10⁵ Zellen pro 6 cm Kulturschale 4 h lang bei 37°C einwirken gelassen. Daraufhin wurde das Medium durch frisches Kulturmedium ersetzt. 48 h nach der Transfektion wurden die Überstände auf Bildung rekombinanter Retroviren untersucht. Die Effizienz der Transfektion wurde verfolgt anhand der β-Galaktosidase-Expression in Zellen, die parallel mit einem β-Galaktosidase- Reportergen transfiziert worden waren, wobei vorgegangen wurde, wie von Zatloukal et al., 1992, beschrieben. Die Transfektion von GP+ES6-Zellen lieferte 39% β-Galaktosidase-exprimierende Zellen; von den transfizierten BNL CL.2-Zellen waren 10% der Zellen positiv.

Die Transfektion von GP+E86-Zellen mittels Kalziumphosphat erfolgte nach Standardprotokoll.

d) Durchflußzytometrie-Analyse

Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), ergänzt mit FCS und 0.05% Natriumazid (Waschpuffer), gewaschen, bevor sie 30 min lang mit dem monoklonalen Antikörper R1 (Waterfield et al., 1982), der die extrazelluläre Domäne des humanen EGF-Rezeptors erkennt, inkubiert wurden. Als sekundärer Antikörper wurden Fluorescein-markierte F(ab′)2-Fragmente von Ziegen-anti-Maus-IgG (Dianova) verwendet. Die lebenden Zellen wurden mittels eines Becton-Dickinson FACScan Analyzers analysiert.

e) Bestimmung des Virustiters

NIH3T3 (TK-) Fibroblasten wurden nach Standardprotokollen infiziert und auf die Expression des transduzierten Neo^R Gens selektiert: 1×10⁵ NIH3T3 wurden mit 1 ml Überstand von Kulturen produzierenden Zellen für 1 bis 2 h inkubiert. Die Überstände wurden zuvor in Kulturmedium (IMDM + 10% FCS) verdünnt. Nach der Infektion wurde das virushaltige Medium gegen virusfreies Medium ausgetauscht und die Zellen dann für 24 bis 30 h kultiviert. Zwecks Selektion der infizierten Zellen wurde dann G418 (1 mg/ml) dem Medium zugesetzt. Nach ca. 10 Tagen wurde die Zahl der G418 resistenten Kolonien gezählt und der Virustiter berechnet (Anzahl der Kolonien multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor ergibt die Zahl infektiöser Partikel pro ml Kulturüberstand cfu/ml).

f) DNA-Analyse

Genomische DNA wurde aus 3×10⁶ Zellen präpariert (Sambrook et al., 1989) und 10 µg mit den jeweils geeigneten Endonukleasen verdaut. Die geschnittene DNA wurde auf Agarosegelen aufgetrennt und anschließend auf Nylonmembranen aufgebracht. Die Blots wurden mit ³²P-markierten cDNA-Sonden hybridisiert. Um die intakte Integration von Provirus zu bestimmen, wurde die DNA mit Asp718 gespalten, welches einmal innerhalb der proviralen LTRs schneidet, wobei ein diagnostisches DNA-Fragment freigesetzt wird. Der Verdau mit HindIII, welches einmal im Provirusgenom schneidet, liefert Restriktionsfragmente, die charakteristisch sind für jede Integrationsstelle. Die Blots wurden mit einer neo-spezifischen Sonde analysiert.

Beispiel 1 a) Herstellung von hohen Titern an retroviralen LXSN- HERc-Vektoren nach rezeptorvermittelter, durch Adenovirus verstärkte Transfektion

Die für den retroviralen Vektor pLXSN-HERc kodierende DNA wurde in Zellen der Verpackungszellinie GP+E86 transfiziert, und zwar einerseits mittels Kalziumphosphat-Copräzipitationsmethode, andererseits mittels Adenovirus-Transferrinfektion. Die Freisetzung des infektiösen LXSN-HERc wurde 24 und 28 h nach der Transfektion oder nach einwöchiger Selektion auf G418 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt: wie erwartet, konnten in den transient mit Kalziumphosphat transfizierten Zellen nur geringe Virustiter (im Bereich von 10³ infektiösen Einheiten pro ml (cfu/ml)) nachgewiesen werden. In der gepoolten Population von G418 resistenten Klonen stiegen die Titer signifikant auf ca. 10⁵ cfu/ml an. Stark erhöhte Titer wurden von den Zellen erhalten, die mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfiziert worden waren: 24 und 48 h nach der Transfektion wurden Titer von 2×10⁵ cfu/ml erhalten (Tabelle I), nach der G418- Selektion nahmen die Titer um das 20 bis 50fache bis auf 1×10⁷ cfu/ml zu (Tabellen I, III und IV). Als nächstes wurde die Effizienz der Virusproduktion von klonalen Verpackungszellinien, die entweder mittels Adenovirus-Transferrinfektion, Kalziumphosphat oder retroviralem Gentransfer erzeugt waren, verglichen. (Die Zellen wurden transfiziert, wie in der Tabelle angegeben, oder nach Behandlung mit Tunicamycin mit rekombinantem Virus, welches aus einem Pool von G418- resistenten Kolonien (Tabelle I) stammte, infiziert.) Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten einen noch ausgeprägteren Unterschied (30fach) in Populationen von gepoolten Kolonien (Tabelle II). In keinem dieser Klone konnten replikationskompetente Helferviren nachgewiesen werden.

b) Expression des HERc-Gens

In Übereinstimmung mit dem erhöhten Virustiter in den mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfizierten Zellen war auch die Oberflächenexpression von HERc drastisch erhöht. Durchflußzytometrieanalyse zeigte im Vergleich zu Kalziumphosphat-transfizierten Zellen eine signifikante Zunahme der Fluoreszenz, jedoch konnte, wie erwartet, in Zellen, die mit Virus, erhalten aus den jeweiligen Verpackungszellen, infiziert worden waren, kein Unterschied in der HERc-Expression beobachtet werden. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1A zeigt die Expression von humanem EGF-R (HERc) auf der Oberfläche von transfizierten klonalen GP+E86-Zellen nach G418 Selektion. Fig. 1B zeigt die Expression von HERc auf infizierten NIH3T3 TK-Zellen. Alle Zellen, die mit dem monoklonalen Maus-Antikörper R1 (Waterfield et al., 1982), der spezifisch den extrazellulären Teil des EGF-R-Proteins erkennt, und mit Fluorescein-markierten F(ab′)₂-Fragmenten von Ziegen-anti-Maus-IgG behandelt worden waren, waren gefärbt. Viable Zellen wurden unter Verwendung eines Becton-Dickinson FACScan-Analysators analysiert.

Beispiel 2 Co-Transfektion von Vektor und Verpackungsfunktionen

Um zu testen, ob die von den GP+E86-Zellen zur Verfügung gestellten Verpackungsfunktionen in Mengen synthetisiert werden, die eine maximale Virusproduktion erlauben, wurde ein Plasmid co-transfiziert, das zusätzliche Verpackungsfunktionen exprimiert. Dazu wurde das Plasmid pMOV9.2 verwendet, das ein voll ständiges Molony-Maus-Leukämievirus (M-MuLV) enthält. Durchschnittlich wurde nur eine schwache Zunahme (3fach) in den Virustitern beobachtet, wobei jedoch die Häufigkeit von Klonen mit hohem Titer (<10⁷ cfu/ml) signifikant zunahm (Tabelle III).

Beispiel 3 Herstellung von hohen Titern an weiteren retroviralen Vektoren

Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die beobachtete Zunahme an Virustiter auf ein einzelnes retrovirales Vektorkonstrukt beschränkt ist, wurden zwei weitere, vom Vektor LSXN abgeleitete retrovirale Vektoren getestet. Der Vektor LXSN-Kit exprimiert den von c-kit kodierten Rezeptor, das zweite Konstrukt LXSN-tsp53 exprimiert eine temperatursensitive Mutante des Tumorsuppressorgens p53. Wie aus Tabelle IV ersichtlich ist, waren die Virustiter der Adenovirus- Transferrinfektion-transfizierten Zellen einheitlich 40 bis 100fach höher als die in Zellen, die mit Kalziumphosphat transfiziert worden waren.

Beispiel 4 Virusproduktion in anderen als Verpackungszellen

Um die Möglichkeit zu testen, retrovirale Vektoren von anderen als Verpackungszellen zu erhalten, wurde das Plasmid pLXSN-HERc zusammen mit dem Plasmid pMOV9.2 (je 3 µg) in BML CL.2 Hepatozyten co-transfiziert. Wie Tabelle V zeigt, lieferten ca. 50% der isolierten Klone einen Virustiter, der beinahe ebenso hoch war wie der der GP+E86 Producer-Zellen, und zeigten hohe Expressionswerte für HERc auf der Zelloberfläche. Da ein full-length M-MuLV-Virus in diesem Experiment co-transfiziert wurde, setzten diese Zellen auch replikationskompetentes Helfervirus frei.

Beispiel 5 Stabile Integration multipler Vektorkopien

In diesem Beispiel wurde eine genomische DNA-Analyse durchgeführt (Sambrook), um zu bestimmen, ob das transfizierte Plasmid in das Wirtszellgenom integriert worden war und ob die Zahlen von integrierten Plasmidkopien mit der Zunahme der Titer korreliert. Die Southern Blot Analyse der DNA von Zellen, die mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfiziert worden waren, zeigte mindestens zwei und bis zu mehr als zehn Integrationsstellen, während die mit Kalziumphosphat transfizierten Klone im allgemeinen nur ein bis zwei Kopien enthielten (Fig. 2A). Die Zahl der integrierten Kopien korrelierte gut mit den Virustitern (vgl. Tabelle IV).

In den transfizierten BNL CL.2 Zellen (Fig. 2B) war die Zahl der integrierten Plasmide im allgemeinen im Vergleich zu den GP+E86-Zellen niedriger, korrelierte aber ebenfalls mit den Virustitern. Restriktionsverdau der genomischen DNA mit einem Enzym, das einmal in den LTRs schneidet, bestätigte die Integrität des integrierten retroviralen Konstrukts. Nur ein BNL CL.2 Klon (Nr. 6), der mehr als zehn integrierte Kopien enthielt, wies zwei falsch angeordnete (rearrangierte) Vektoren auf (Fig. 2B). Abschließend wurden die Blots mit Adenovirus-spezifischen Sonden rehybridisiert, um festzustellen, ob auch Adenovirussequenzen in das Genom der Zellen, die mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfiziert worden waren, integriert hatten. Es konnten keine Adenovirussequenzen nachgewiesen werden, was auch mittels PCR-Analyse gesondert bestätigt wurde. Fig. 2A zeigt die Southern Analyse der genomischen DNA aus Zellen, die mit den in der Figur angegebenen Plasmiden transfiziert worden waren. Als Restriktionsenzym wurde HindIII verwendet, welches die provirale DNA einmal schneidet und somit Fragmente liefert, die für eine einzelne Integrationsstelle charakteristisch sind (Fig. 2C). Fig. 2B zeigt die Analyse transfizierter BNL CL.2 Zellen, geschnitten entweder mit HindIII oder mit Asp718, welches einmal in jedem proviralen LTR schneidet und somit Fragmente liefert, die einen Hinweis für die Intaktheit der proviralen Integration sind (Fig. 2C). In allen Versuchen wurde vektorspezifische DNA mittels Hybridisierung mit einer ³²P-markierten Neo-Sonde nachgewiesen. Außerdem zeigte ein CPE-Assay, daß replizierendes Adenovirus, das sich aus nicht- integrierter Adenovirus-DNA entwickeln hätte können, in retroviralen Überständen nicht nachweisbar war.

Tabelle I

Tabelle II

Tabelle III

Tabelle IV

Tabelle V

Literatur

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Claims (11)

1. Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen, wobei die DNA eine in der Zelle zu exprimierende Sequenz enthält und mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, und wobei man die Zellen mit dem Komplex in Gegenwart eines endosomolytischen Mittels in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA für einen viralen Vektor kodiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein Retrovirus-Vektor ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Retrovirus-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden besteht, wobei das erste die für die Verpackungsfunktionen und das zweite die für die übrigen Virusproteine kodierenden Sequenzen sowie die in der Zelle zu exprimierende DNA enthält.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor- DNA einerseits mit einem Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation und andererseits mit einem Konjugat aus einem endosomolytischen Mittel und einem Polykation komplexiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Retrovirus-Vektor-DNA mit einem Transferrin-Polylysin- und mit einem Adenovirus- Polylysin-Konjugat komplexiert ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen primäre Zellen sind.

7. Transfektionskomplex, enthaltend eine in einer eukaryotischen Zelle zu exprimierende DNA, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie ein endosomolytisch wirkendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA für einen viralen Vektor kodiert.

8. Transfektionskomplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein Retrovirus-Vektor ist.

9. Transfektionskomplex nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA mit einem Transferrin-Polylysin- und mit einem Adenovirus- Polylysin-Konjugat komplexiert ist.

10. Transfektionskomplex nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Retrovirus-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden besteht, wobei das erste die für die Verpackungsfunktionen und das zweite die für die übrigen Virusproteine kodierenden Sequenzen sowie die in der Zelle zu exprimierende DNA enthält.

11. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Zelle zu exprimierende DNA eine gentherapeutisch wirksame DNA ist.