-
Man
verspricht sich viel von der Gentherapie zur Behandlung zahlreicher
Erkrankungen, für
die es bisweilen keine speziellen Therapien gibt (Friedmann T. Progress
toward human gene therapy. Science 1989; 244: 1275; Verma IM. Gene
therapy. Sci Am 1990; 263: 68; Miller AD. Progress toward human
gene therapy. Blood 1990; 76: 271; Karson, EM. Prospects for gene
therapy. Biol Reprod 1990; 42: 39).
-
Humankrebs
beispielsweise wird oftmals mit einer aberranten Genexpression oder
Mutationen in speziellen Genen in Verbindung gebracht und es ist
möglich,
dass neoplastische Vorgänge
durch Gentherapie verändert
werden können.
Alternativ können
veränderte
Tumorzellen durch Gentherapie zerstört werden, indem man toxische
Gene oder Gene, die sie für
chemotherapeutische Mittel empfindlich machen, einsetzt. Ein weiterer
Ansatz, neoplastische Zellen außer
Gefecht zu setzen, ist das Einsetzen eines Antisense-Onkogens in die
Tumorzellen. Diese Gene werden in der umgekehrten Richtung zum Onkogen
transkribiert. Da die Sequenzen komplementär sind, hybridisieren die mRNAs
und die onkogene Aktivität
fällt ab,
da das Gen nicht translatiert werden kann (Friedmann T. Progress
toward human gene therapy. Science 1989; 244: 1275).
-
Knochenmark
ist ein geeignetes gentherapeutisches Ziel, da es leicht zugänglich und
in vitro manipulierbar ist, und Stammzellen enthält, um den veränderten
Genotyp aufrecht zu erhalten. Die Leber und das zentrale Nervensystem
stellen ebenfalls mögliche
gentherapeutische Ziele dar (Miller AD. Progress toward human gene
therapy. Blood 1990; 76: 271).
-
Die
Gentherapie hat in erster Linie zum Ziel, zusätzliche genetische Elemente
in lebende Zellen einzubringen oder fehlende oder nicht funktionelle
molekulare Elemente in der DNA einer lebenden Zelle zu ersetzen,
um Veränderungen
innerhalb von lebenden Zellen, die im Menschen zu Erkrankungen führen, auf
diese Weise gezielt anzugehen und zu reparieren (Culver et al.,
Lymphocytes as cellular vehicles for gene therapy in mouse and man,
PNAS USA 88: 3155 (1991)).
-
Je
nach der zu behandelnden Erkrankung kann man drei gentherapeutische
Strategien verfolgen. Disfunktionelle Gene kann man ersetzen, zu
funktionellen verändern
oder durch gesunde Gene, die an anderen Stellen innerhalb der Zelle
funktionieren, verstärken.
Von diesen Optionen ist die therapeutische Genverstärkung derzeit
die machbarste. Ein Beispiel für
eine Genverstärkung
ist das Hinzufügen
eines funktionellen Adenosindeaminase-Gens in Zellen eines Patienten
mit schwerer kombinierter Immundefizienz (Friedmann T. Progress
toward human gene therapy. Science 1989; 244: 1275; Verma IM. Gene
therapy. Sci Am 1990; 263: 68; Miller AD. Progress toward human
gene therapy. Blood 1990; 76: 271; Karson, EM. Prospects for gene
therapy. Biol Reprod 1990; 42: 39).
-
Voraussetzung
für die
Gentherapie ist, dass man den Defekt der Erkrankung versteht und
ein normales funktionelles Gen kloniert und charakterisiert hat.
Gene werden mit Hilfe einer Reihe von Verfahren eingebracht.
-
Die
Gentherapie kann beinhalten, dass man Gene auf Zellen in Kultur
transferiert und dann die kultivierten Zellen auf ein Wesen transplantiert
(ex vivo-Ansatz) oder die Gene direkt an ein Wesen abgibt, so dass der
Gentransfer in die Zellen in situ stattfindet (in vivo-Ansatz).
-
Sowohl
für den
in vivo- als auch den ex-vivo-Ansatz hat man virale Vektoren als
Abgabevehikel für
die interessierenden Gene benutzt. Die viralen Genome sind so verändert, dass
sie nicht virulent sind, jedoch bestimmte Zelltypen zu infizieren
vermögen.
Ein Vorteil retroviraler Vektoren ist die Tatsache, dass die eingebrachte
DNA effizient in das Wirtchromosom integriert wird. Das funktionelle
Ersatzgen wird an einer Position innerhalb des viralen Genoms eingesetzt,
so dass es nach Eintritt in das passende Gewebe exprimiert werden kann.
Das Virus wird dann dem Patienten oder den Zielzellen verabreicht,
was die Transformation zum gewünschten
funktionellen Phenotyp gewährleistet.
Ein Nachteil retroviraler Vektoren ist, dass für einen effizienten Gentransfer
eine Vermehrung der Zellen benötigt
wird. Dagegen benötigen
adenovirale Vektoren keine Zellvermehrung, aber die eingebrachte
DNA wird nicht in das Wirtschromosom integriert.
-
Die
rekombinanten viralen Vektoren, adenovirale Vektoren eingeschlossen,
transferieren auf effiziente Weise Gene in somatisches Gewebe; ihre
Anwendung in der klinischen Gentherapie ist allerdings durch immunologische
Faktoren, die zum raschen Verlust der Genexpression und zur Hemmung
eines zweiten Gentransfers führen,
eingeschränkt.
Insbesondere ist die Genexpression transient und hält wegen
einer gegen die transduzierten Zellen gerichteten zellulären Immunantwort
nicht länger
als einige Wochen vor (Y. Yang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci..
USA 91, 4407; Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity
1, 433). Diese Einschränkung
kann umgangen werden, indem man lösliche CTLA4-Moleküle verwendet,
die zu einer Verlängerung
der Genexpression führen.
-
CTLA4
ist ein Oberflächenantigen,
das normalerweise auf T-Zellen zu finden ist. CTLA4 bindet an das B-Zellen
aktivierende Antigen B7. Man hat gezeigt, dass ein lösliches
CTLA4-Molekül,
d.h. CTLA4Ig, die von der Wechselwirkung zwischen T- und B-Zellen abhängenden
Immunantworten hemmt (Linsley et al, J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991);
EP-A-613 944). Berichten zufolge führt die selektive Immunhemmung
rekombinanter adenoviraler Vektoren bei Verwendung von löslichem
CTLA4Ig zu einer nachhaltigen Genexpression (Kay MA et al., Journal
of cellular Biochemistry Supplement NO. 21 A, page 366 (1995)).
Durch die Verwendung löslicher
CTLA4-Moleküle
in der Immuntherapie erhöht
sich die Wahrscheinlichkeit, dass rekombinante virale Vektoren für die humane
Gentherapie brauchbar sein werden, drastisch.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines löslichen
CTLA4-Moleküls
und eines anti-CD40-Liganden zur Herstellung einer therapeutischen
Kombination zur Behandlung von Wesen, die sich einer Gentherapie
unterzogen haben, unterziehen oder unterziehen werden.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung von Zellen,
die mit einem löslichen CTLA4-Molekül und einem
anti-CD40-Liganden in Kontakt gebracht worden sind, zur Herstellung
einer therapeutischen Kombination zur Behandlung von Wesen, die
sich einer Gentherapie unterzogen haben, unterziehen oder unterziehen
werden, wobei die Zellen (a) eine rekombinante Nukleinsäuresequenz
für ein
interessierendes Gen beinhalten und (b) das interessierende Gen
zu exprimieren vermögen.
-
Des
Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren
zur Verlängerung
der Expression eines interessierenden Gens in einer Zelle, wobei
die Zelle (a) eine rekombinante Nukleinsäuresequenz für das interessierende
Gen beinhaltet und (b) das interessierende Gen zu exprimieren vermag,
wobei das Verfahren beinhaltet, dass man die Zelle mit einem löslichen
CTLA4-Molekül
und einem anti-CD40-Liganden in Kontakt bringt.
-
Die
erfindungsgemäße Verwendung
betrifft ein Verfahren zur Verlängerung
der Expression eines interessierenden Gens in einer Zelle. Bei diesem
Verfahren beinhaltet die Zelle eine rekombinante Nukleinsäuresequenz,
die das interessierende Gen kodiert und das interessierende Gen
zu exprimieren vermag. In einem Schritt dieses Verfahrens bringt
man die Zelle mit einem löslichen
CTLA4-Molekül
und einem anti-CD40-Liganden in einer Menge in Kontakt, welche die
Expression des interessierenden Gens in der Zelle wirksam verlängert. Befindet
sich die Zelle in einem Wesen, beinhaltet das Verfahren alternativ
die Verabreichung eines löslichen
CTLA4-Moleküls
und eines anti-CD40-Liganden in einer Menge, welche die Expression
des interessierenden Gens in der Zelle wirksam verlängert.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Behandlung eines Wesens,
das an einer Erkrankung leidet. Dementsprechend beinhaltet wenigstens
eine Zelle des Wesens (a) eine rekombinante Nukleinsäuresequenz für das interessierende
Gen und (b) vermag das von dem interessierenden Gen kodierte Protein
zu exprimieren, welches wiederum die Erkrankung oder die damit verbundenen
Symptome zu lindern vermag. Im Rahmen dieser Behandlung verabreicht
man dem Wesen lösliches
CTLA4 und einen anti-CD40-Liganden in einer Menge, welche die Expression
des interessierenden Gens in dem Wesen bezüglich Menge und Dauer verstärkt.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Die 1A–D sind
Kurvendiagramme, welche die adenoviral vermittelte Genexpression
bei gleichzeitiger Verabreichung von CTLA4Ig zeigen. Jede Kurve
steht für
ein einzelnes Tier.
-
Die 2A–C sind
Kurvendiagramme, welche die Ergebnisse von Milzproliferationsassays
zeigen.
-
Die 3 ist eine fotographische Darstellung,
in der inflammatorische Leberzellen immunhistochemisch gezeigt sind.
-
GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
DEFINITION
-
Die
folgenden Wörter
oder Umschreibungen werden in dieser Anmeldung mit den angegebenen
Bedeutungen verwendet.
-
Ein „interessierendes
Gen" meint hier
ein beliebiges DNA- oder RNA-Molekül, das eine Protein- oder Nukleinsäuresequenz
kodiert.
-
Eine „nicht-CTLA4-Proteinsequenz" meint hier ein beliebiges
Molekül,
das nicht an B7 bindet und nicht in die Bindung von CTLA4 an sein
Zielantigen B7 eingreift.
-
Die „extrazelluläre Domäne von CTLA4" steht hier für einen
beliebigen Abschnitt von CTLA4, der das B7-Antigen erkennt und daran
bindet. Eine extrazelluläre
Domäne
von CTLA4 ist beispielsweise in Linsley et al., J. Exp. Med. 173:
721–730
(1991); Linsley et al. "Immunosuppression
in vivo by a soluble form of the CTLA4 cell activation molecule" Science (1992) 257(5071)
792–795
beschrieben.
-
„Lösliches
CTLA4" meint hier
zirkulierendes CTLA4, das an B7 zu binden vermag. Hierzu gehören beispielsweise
die extrazelluläre
Domäne
von CTLA4 oder die mit einem biologisch oder chemisch aktiven Molekül (genetisch
oder chemisch) fusionierte extrazelluläre Domäne von CTLA4, wie CTLA4Ig, CTLA4-env-gp120,
CTLA4-p97, CTLA4-ova, und CTLA4-E7, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
-
„Gentherapie" meint hier ein Verfahren
zur Korrektur einer Erkrankung durch genetische Manipulation.
-
Ein „viraler
Vektor" ist hier
ein Träger
für ein
Nukleinsäuremolekül, in den
(1) ein interessierende Gen insertiert werden kann, um es in eine
Wirtszelle einzubringen, wo es exprimiert wird, und (2) der von
einem Virus abstammt.
-
Die
folgende Beschreibung wird gegeben, damit die Erfindung in ihrer
vollständigen
Tragweite verstanden wird.
-
ERFINDUNGSGEMÄSSE VERWENDUNGEN
UND VERFAHREN
-
Die
Erfindung beruht auf dem Fund, dass eine wirksame Mengen lösliches
CTLA4 und anti-CD40-Ligand die Expression eines interessierenden
Gens in einer Zelle verstärkt,
indem es eine verlängerte
und andauernde Genexpression gewährleistet.
Einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung zufolge ist das interessierende Gen Teil einer rekombinanten
Nukleinsäuresequenz,
z.B. eines rekombinanten viralen Vektors. Rekombinante virale Vektoren
sind hier beschrieben.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung bewirkt man die Verstärkung der Genexpression dadurch,
dass man die Zelle mit so viel von dem löslichen CTLA4-Molekül und anti-CD40-Liganden
in Kontakt bringt, dass eine Immunantwort gehemmt wird. Alternativ
bewirkt man die Verstärkung
der Genexpression dadurch, dass man einem Wesen so viel von einem
löslichen
CTLA4 und anti-CD40-Ligand verabreicht, dass eine Immunantwort gehemmt
wird, wodurch eine persistierende virale Genexpression ohne eine
langfristige Immunsuppression erreicht wird. Die Kombination eines
löslichen
CTLA-Moleküls
und eines anti-CD40-Liganden (MR1) verlängert die Genexpression und
lässt einen
zweiten Gentransfer zu. Ein anti-CD40-Ligand ist ein beliebiges Molekül, das den
CD40-Liganden erkennt und bindet, z.B. ein Antikörper (monoklonaler Antikörper, polyklonaler
Antikörper,
chimärer
Antikörper,
humanisierter Antikörper,
oder Fragmente davon) oder ein rekombinantes bindendes Protein,
z.B. ein Fusionsprotein.
-
Lösliche CTLA4-Moleküle können während der
Gentherapie, vor der Gentherapie oder nach der Gentherapie verabreicht
werden. Des Weiteren ist die Verabreichung von löslichem CLTA4 selbst im Anschluss
an aufeinanderfolgende Verabreichungen von Genen über in vivo-
oder ex vivo-Ansätze
brauchbar. Die Verwendung löslicher CLTA4-Moleküle kann
eine erfolgreiche zweite Genexpression im Anschluss an eine zweite
Verabreichung eines interessierenden Gens über in vivo- oder ex vivo-Ansätze zulassen;
dies wäre
normalerweise wegen einer Immunantwort nicht möglich.
-
Lösliches
CTLA4 kann oral, transdermal, intravenös, intramuskulär oder subkutan
verabreicht werden. Alternativ kann CTLA4 zusammen mit dem interessierenden
Gen in einen viralen Vektor insertiert und koexprimiert werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Verwendungen
sind bei der Behandlung eines Wesens, das an defekten, erkrankten
oder geschädigten
Zellen leiden, brauchbar. Insbesondere kann die Verwendung von löslichem CTLA4
in Patienten, die an einer Erkrankung leiden, Gentherapien verstärken (US-Patent
Nr. 5,399,346 vom 21. März
1995). In Folge der verstärkten
Genexpression steigen die Erfolgsaussichten der Gentherapie und das
an einer Erkrankung leidende Wesen wird wirksamer behandelt als
ohne lösliches
CTLA4 vor, nach und/oder während
der Gentherapie zu verwenden.
-
Einer
Ausführungsform
der Erfindung zufolge muss wenigstens eine Zelle des Wesens rekombinante DNA
für ein
interessierendes Gen beinhalten. Des Weiteren muss die Zelle das
von diesem interessierenden Gen kodierte Protein zu exprimieren
vermögen,
so dass die Erkrankung oder die damit verbundenen Symptome gelindert
werden.
-
Im
Rahmen der praktischen Durchführung
der Erfindung kann das Wesen ein tierisches Wesen sein, z.B. ein
Mensch, ein Hund, eine Katze, ein Schaf, ein Pferd, ein Fisch, ein
Vogel, ein Schwein oder eine Kuh.
-
Derzeit
verwenden mehrere Gruppen die Gentherapie zur Krebsbehandlung (Friedmann
T. Progress toward human gene therapy. Science 1989; 244: 1275–1281; Roth
JA, Mukhopadhyay T, Tainsky MA, et al. Molecular approaches to prevention
and therapy of aerodigestive tract cancers. Review article. Monogr
Natl Cancer Inst 1992; 13: 15–21;
Mukhopadhyay T, Tainsky M, Cavender AC, Roth JA. Specific inhibition
of K-ras expression and tumorigenicity of lung cancer cells by antisense
RNA. Cancer Res 1991; 51: 1744–1748).
-
Forscher
haben Protokolle zur Behandlung experimenteller Hirntumoren entwickelt,
wobei Zellen, die retrovirale Partikel produzieren, die das Herpes-Thymidinkinase
(TK)-Gen tragen, in Hirntumoren direkt injiziert werden (Culver
KW, Ram Z, Wallbridge S, et al. In vivo gene transfer with retroviral
vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors,
Cellular Immunology Section, National Cancer Institute, National
Institutes of Health, Bethesda, MD. Science 1992; 256: 1550–1552).
Das Einbringen des TK-Gens in die Tumorzellen macht sie für den Wirkstoff
Gancyclovir empfindlich. Die Verwendung von löslichem CTLA4 kann die Expression
des TK-Gens verstärken.
-
Die
erfindungsgemäßen Verwendungen
betreffen des Weiteren die Behandlung defekter, erkrankter oder
geschädigter
Zellen in einem Wesen, wobei man den Vektor Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA
oder Ad/RSV CTLA4Ig(hu)-BPA in Zellen insertiert, so dass die Zellen
das von dem interessierenden Gen kodierte Protein zusammen mit CTLA4-Molekülen in ausreichender
Menge produzieren, damit sich die defekten, erkrankten oder geschädigten Zellen
im zentralen Nervensystem bessern.
-
Die
erfindungsgemäßen Verwendungen
betreffen des Weiteren die Behandlung defekter, erkrankter oder
geschädigter
Zellen in einem Wesen, wobei man Spenderzellen auf das Wesen transplantiert.
Im Rahmen der Ausführung
der Erfindung sind die Spenderzellen genetisch modifiziert. Insbesondere
werden solche Spenderzellen mit dem Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA oder
Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA insertiert, so dass die Spenderzellen das
von dem interessierenden Gen kodierte Protein zusammen mit den löslichen
CTLA4-Molekülen
in ausreichender Menge produzieren, damit sich die defekten, erkrankten
oder geschädigten
Zellen in dem zentralen Nervensystem bessern.
-
Die
Erfindung betrifft ebenfalls ein in vitro-Verfahren zur Verlängerung
der Expression eines interessierenden Gens in einer Zelle, wobei
die Zelle (a) eine rekombinante Nukleinsäuresequenz für das interessierende
Gen beinhaltet und (b) das von dem interessierenden Gen kodierte
Protein zu exprimieren vermag. Die Zusammensetzung beinhaltet eine
pharmazeutisch wirksame Menge von Ad/RSV- CTLA4Ig(mu)-BPA und einen verträglichen
Träger.
Alternativ beinhaltet die Zusammensetzung eine pharmazeutisch wirksame
Menge von Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA
und einen verträglichen
Träger.
-
ZELLEN
-
Die
Zellen, die das interessierende Gen beinhalten, können beliebige
eurkaryotische Zellen wie epitheliale Zellen und konnektive Zellen
sein. Epitheliale Zellen finden sich auf jeder Oberfläche des
tierischen Körpers
und selbst auf inneren Flächen
wie der inneren Wand eines Blutgefäßes oder des Magens. Zu konnektiven
Zellen gehören
Zellen, die Knochengewebe, Knorpelgewebe und Blut ausmachen, d.h.
sowohl weiße als
auch rote Blutzellen. Die Zelle beinhaltet rekombinante kodierende
DNA und vermag das interessierende Gen in vitro und in vivo zu exprimieren.
-
Die
Zelle kann eine tierische Zelle sein, z.B. eine Zelle von einem
Menschen, einem Hund, einer Katze, einem Schaf, einem Pferd, einem
Fisch, einem Vogel, einem Schwein oder einer Kuh.
-
Die
Spenderzellen können
produzierende Zellen sein. Des Weiteren können die Spenderzellen autologe
oder heterologe Zellen sein.
-
EINBRINGEN
FREMDER GENE IN ZELLEN
-
Es
stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung DNA oder RNA in Zellen
einzubringen. Im Allgemeinen beinhaltet die Gentherapie, dass man
(1) Gene auf Zellen in Kultur überträgt und dann
die kultivierten Zellen auf ein Wesen transplantiert (ex vivo-Ansatz)
oder (2) die Gene direkt an ein Wesen abgibt, um das Gen in situ
in die Zellen zu transferieren (in vivo-Ansatz).
-
Beispielsweise
kann man in einem rekombinanten viralen Vektor das interessierende
Gen direkt in eine Zelle einsetzen. Andere Insertionsverfahren sind
möglich.
-
In
ex vivo-Techniken kann man beispielsweise das Gen in eine Zelle
einsetzen, indem man eine beliebige Vorgehensweise zum Gentransfer
verwendet, z.B. die Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion, die Verwendung
von DNA-komplexierten Polykationen oder Lipiden, die Einkapselung
von DNA in Lipidvesikel oder Erythrozytenhüllen, oder das Einwirken von
hochfrequenten Starkstromschlägen
(d.h. die Elektroporation). Man hat DNA auch durch direkte Mikroinjektion
oder durch Verwendung von Wolframmikroprojektilen mit hoher Geschwindigkeit
eingebracht. Mit diesen Techniken kann man viele Kopien von DNA
in das Genom integrieren, wenngleich die Effizienz der Integration
mit der Technik, den unterschiedlichen Genen und unterschiedlichen
Zelltypen breit variiert.
-
Man
hat neuere Techniken entwickelt, wobei man virale Vektoren verwendet,
um DNA in Säugerzellen einzubringen.
Diese Zellen besitzen das Potenzial, sämtliche dem Virus ausgesetzte
Zellen zu infizieren. Bei der Entwicklung von Techniken zur Verwendung
viraler Vektoren war es notwendig, Vektoren zu entwickeln, die in
die Zielzelle stabil aufgenommen wurden ohne sie zu beschädigen.
-
Zu
geeigneten viralen Vektoren gehören
Papovaviren, Simian-Virus 40, Polyomavirus, Adenoviren, murine und
aviane Retroviren. Virale Vektoren können viele Zelltypen infizieren.
-
VEKTOREN
-
Verglichen
mit Vektoren, die nicht über
Rezeptor-vermittelte Ereignisse in Zellen eintreten, sind virale Vektoren
wegen ihrer Effizienz bevorzugt. Zu geeigneten viralen Vektoren
gehört
beispielsweise ein retroviraler Vektor, ein adenoviraler Vektor,
ein Pockenvirus-Vektor, ein Herpesvirus-Vektor oder ein Tollwutvirus-Vektor,
ohne jedoch hierauf beschränkt
zu sein.
-
Der
gewählte
virale Vektor sollte folgenden Kriterien genügen: 1) der Vektor muss die
interessierenden Zellen infizieren können und somit müssen virale
Vektoren mit einem passenden Wirtsspektrum gewählt werden; 2) das transferierte
Gen sollte in der Lage sein, für
längere
Zeit in einer Zelle zu bleiben und exprimiert zu werden; und 3)
der Vektor sollte für
den Wirt sicher sein und eine geringe Zelltransformation verursachen.
Retrovirale Vektoren und Adenoviren bieten ein effizientes, brauchbares
und gegenwärtig
am besten charakterisiertes Mittel, fremde Gene effizient in Säugerzellen
einzubringen und zu exprimieren. Diese Vektoren besitzen ein sehr
breites Wirts- und Zelltypenspektrum, exprimieren stabil und effizient.
Die Sicherheit dieser Vektoren wurde von vielen Forschungsgruppen
belegt. Tatsächlich
gibt es viele klinische Versuche.
-
Zu
weiteren viralen Vektoren, die man zwecks Korrektur von Erkrankungen
für den
Gentransfer in Zellen verwenden kann, gehören der Herpesvirus, Papovaviren
wie JC, SV40, Polyoma; der Epstein-Barr-Virus (EBV); Papillomaviren,
z.B. Rinderpapillomavirus vom Typ I (BPV); der Poliovirus und andere
Viren für
Mensch und Tier.
-
Adenoviren
besitzen eine Reihe von Eigenschaften, die sie als Klonierungsvehikel
attraktiv machen (Bachettis et al.: Transfer of gene for thymidine
kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.
PNAS USA 1977 74: 1590; Berkner, K. L.: Development of adenovirus
vectors for expression of heterologous genes. Biotechniques, 1988
6: 616; Ghosh-Choudhury G, et al., Human adenovirus cloning vectors based
on infectious bacterial plasmids. Gene 1986; 50: 161; Hag-Ahmand Y, et al.,
Development of a helper-independent human adenovirus vector and
its use in the transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.
J Virol 1986; 57: 257; Rosenfeld M, et al., Adenovirus-mediated
transfer of a recombinant α1-antitrypsin gene
to the lung epithelium in vivo. Science 1991; 252: 431).
-
Beispielsweise
besitzen Adenoviren ein Genom mittlerer Größe, das im Zellkern repliziert;
viele Serotypen sind klinisch unbedenklich; adenovirale Genome scheinen
trotz Insertion von fremden Genen stabil zu sein; fremde Gene scheinen
ohne Verlust oder Umlagerung erhalten zu bleiben; und Adenoviren
können
als transiente Expressionsvektoren auf hohem Niveau mit einer Expressionsdauer
von Wochen bis einigen Monaten verwendet werden. Ausgiebige biochemische
und genetische Untersuchungen legen nahe, dass es möglich ist,
bis zu 7–7,5
kb heterologer Sequenzen gegen native adenovirale Sequenzen auszutauschen
und dabei lebensfähige,
konditionierte, Helfer-unabhängige
Vektoren zu erzeugen (Kaufman R. J.; identification of the component
necessary for adenovirus translational control and their utilization
in cDNA expression vectors. PNAS USA 1985 82: 689). Beispielhaft
stellt die vorliegende Erfindung adenovirale Vektoren mit den Bezeichnungen
Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA und Ad/RSVCTLA4Ig(hu)-BPA zur Verfügung.
-
AAV
ist ein kleiner humaner Parvovirus mit einem einzelsträngigen DNA-Genom
von etwa 5 kb. Dieser Virus kann als integrierter Provirus in mehreren
humanen Zelltypen vermehrt werden. AAV-Vektoren weisen mehrere Vorteile
für die
humane Gentherapie auf. Sie sind für Humanzellen trophisch, können jedoch
auch andere Säugerzellen
infizieren; (2) mit AAV ist in Menschen oder anderen Tieren keine
Erkrankung in Zusammenhang gebracht worden; (3) integrierte AAV-Genome
scheinen in ihren Wirtszellen stabil zu sein; (4) es gibt keinen
Anhaltspunkt, das die Integration von AAV die Expression von Wirtsgenen
oder -promotoren verändert oder
ihre Umlagerung begünstigt;
(5) eingebrachte Gene können
aus der Wirtszelle herausgeholt werden, indem man mit einem Helfer-Virus,
z.B. einem Adenovirus, infiziert, um nur Beispiele zu nennen.
-
HSV-1-Vektorsysteme
erleichtern das Einbringen von nahezu jedem beliebigen Gen in nicht
mitotische Zellen (Geller et al. an efficient deletion mutant packaging
system for a defective herpes simplex virus vectors: Potential applications
to human gene therapy and neuronal physiology. PNAS USA, 1990 87:
8950).
-
Ein
weiterer Vektor für
den Gentransfer in Säugern
ist der auf dem Rinderpapillomavirus basierende Vektor (Sarver N,
et al., Bovine papilloma virus DNA: A novel eukaryotic cloning vector.
Mol Cell Biol 1981; 1: 486) Vektoren auf Basis des Pockenvirus und
weiterer Pockenviren stellen ein Gentransfersystem für Säuger zur
Verfügung.
Der Pockenvirus ist ein Virus mit großer doppelsträngiger DNA
und einer Genomgröße von 120 Kilodalton
(kd) (Panicali D, et al., Construction of poxvirus as cloning vectors:
Insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus
into the DNA of infectious vaccine virus. Proc Natl Acad Sci USA
1982; 79: 4927; Smith et al. infectious vaccinia virus recombinants
that express hepatitis B virus surface antigens. Nature, 1983 302:
490.) Retroviren setzen virale Gene effizient in Wirtszellen ein
(Guild B, et al., Development of retrovirus vectors useful for expressing
genes in cultured murine embryonic cells and hematopoietic cells
in vivo. J Virol 1988; 62: 795; Hock RA, et al., Retrovirus mediated
transfer and expression of drug resistance genes in human hemopoietic
progenitor cells. Nature 1986; 320: 275; Kriegler M. Gene transfer
and expression. A laboratory manual. New York: Stockton Press, 1990:
1242; Gilboa E, Eglitis MA, Kantoff PW, et al. Transfer and expression
of cloned genes using retroviral vectors. Biotechniques 1986; 4:
504–512;
Eglitis AM, Anderson WF. Retroviral vectors for introduction of
genes into mammalian cells. Biotechniques 1988; 6: 608–614; Adam
MA, Miller AD. Identification of a signal in a murine retrovirus
that is sufficient for packaging of nonretroviral RNA into virions.
J Virol 1988; 62: 3802–3806;
Armentano D, Yu SF, Kantoff PW, et al. Effect of internal viral
sequences on the utility of retroviral vectors. J Virol 1987; 61:
1647–1650;
Bender MA, Palmer TD, Gelinas RE, et al. Evidence that the packaging
signal of Moloney murine leukemia virus extends into the gag region.
J Virol 1987; 61: 1639–1646;
Danos O, Mulligan RC. Safe and efficient generation of recombinant
retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges. Proc Natl
Acad Sci USA 1988; 85: 6460–6464;
Markowitz D, Goff S, Bank A. Construction and use of a safe and
efficient amphotropic packaging cell line. Virol 1989; 167: 400–406; Miller
AD, Buttimore C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to
avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell
Biol 1986; 6: 2895–2902;
Miller AD, Trauber DR, Buttimore C. Factors involved in the production
of helper virus-free retrovirus vectors. Somatic Cell Mol Genet
1986; 12: 175–183;
Miller AD, Rosman GJ. Improved retroviral vectors for gene transfer
and expression. Biotechniques 1989; 7: 980–986).
-
INTERESSIERENDES
GEN
-
Das
interessierende Gen kann ein beliebiges interessierendes Gen sein.
Zu den Genprodukten des interessierenden Gens gehören Proteine
oder Nukleinsäuresequenzen,
z.B. Sense- oder Antisense-Moleküle.
-
Beispielsweise
kann das interessierende Gen ein Protein kodieren, das ausgewählt ist
unter Cytokinen, Enzymen, Antibiotika, Toxinen, Antimetaboliten
und Vorstufen davon. Zu geeigneten Cytokinen gehören Interferone, GM-CSF Interleukine,
Tumornekrosefaktor (TNF) (Wong G, et al., Human GM-CSF: Molecular
cloning of the complementary DNA and purification of the natural
and recombinant proteins.
-
Science
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-
Zu
Wachstumsfaktoren gehören
der transformierende Wachstumsfaktor α (TGFα) und β (TGFβ), der Fibroblastenwachstumsfaktor
(FGF), der von Blutplättchen
stammende Wachstumsfaktor (PDGF), der epidermale Wachstumsfaktor
(EGF), der insulinartige Wachstumsfaktor (IGF), Cytokin-Kolonie
stimulierende Faktoren (Shimane M, et al., Molecular cloning and
characterization of G-CSF induced gene cDNA. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 1994 Feb 28, 199(1): 26–32; Kay AB, et al., Messenger
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-
Zu
geeigneten Enzymen gehören
die Thymidinkinase (TK), Xanthinguaninphosphoribosyltransferase (GPT)
aus E. coli oder E. coli-Cytosindeaminase
(CD), oder die Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT).
-
Zu
geeigneten Onkogenen und Tumorsuppressorgenen gehören neu,
EGF, ras (einschließlich
H-, K-, and N-ras), p53, Retinoblastom-Tumorsuppressorgen (Rb),
Wilm's Tumorgenprodukt,
Phosphotyrosinphosphatase (PTPase), und nm23. Zu geeigneten Toxinen
gehören
Pseudomonas Exotoxin A und S; Diphtheria-Toxin (DT); E. coli-LT-Toxine,
Shiga-Toxin, Shiga-artige Toxine (SLT-1, -2), Ricin, Abrin, Supporin
und Gelonin.
-
DOSIERUNGEN LÖSLICHER
CTLA4-MOLEKÜLE
-
Die
wirksamste Verabreichungsart und der wirksamste Dosierungsplan für die erfindungsgemäßen Moleküle hängt von
der Lage des zu behandelnden Gewebes oder der zu behandelnden Erkrankung,
der Schwere und dem Verlauf der medizinischen Störung, der Gesundheit des Wesens
und dessen Ansprechen auf die Behandlung sowie der Beurteilung des
behandelnden Arztes ab. Dementsprechend sollten die Dosierungen
der Moleküle
auf das Individuum eingestellt werden.
-
Die
Wechselbeziehungen von Dosierungen für Tiere verschiedener Größe und Art
sowie Menschen auf Basis der Oberfläche in mg/m2 ist
von Freireich, E. J., et al. Cancer Chemother., Rep. 50 (4): 219–244 (1966)
beschrieben worden. Man kann den Dosierungsplan einstellen, um die
das Tumorzellwachstum hemmende und unterdrückende Antwort zu optimieren,
beispielsweise kann man Dosen teilen und auf Tagesbasis verabreichen
oder die Dosis je nach Situation angemessen reduzieren (z.B. beispielsweise
kann man mehrere geteilte Dosen täglich verabreichen oder angemessen
reduzieren, je nach der speziellen therapeutischen Situation).
-
Im
Rahmen der Ausführung
der Erfindung kann eine wirksame Menge zur Behandlung eines Wesens sich
zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg/kg Körpergewicht des Wesens bewegen.
Die wirksame Menge kann ebenfalls eine Menge zwischen etwa 1 und
etwa 10 mg/kg Körpergewicht
des Wesens sein.
-
Es
ist klar, dass die zur Heilung benötigte Dosis der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
bei Optimierung des Plans weiter reduziert werden kann.
-
LÖSLICHE CTLA4-MOLEKÜLE
-
Zu
löslichem
CTLA4 gehören
beispielsweise CTLA4Ig, ein beliebiger funktioneller Abschnitt aus
einem CTLA4-Molekül,
der das auf aktivierten B-Zellen exprimierte B7-Antigen bindet. Das funktionelle CTLA4-Molekül beinhaltet
beispielsweise die in SEQ ID NO: 14 gezeigten, mit Alanin an Position
1 beginnenden und mit Asparagin an Position 187 endenden 187 Aminosäuren. Alternativ
beinhaltet das funktionelle CTLA4-Molekül die in SEQ ID NO: 13 bezeigten,
mit Alanin an Position 1 beginnenden und mit Asparagin an Position
125 endenden 125 Aminosäuren
der Aminosäuresequenz
der extrazellulären
Domäne
des CTLA4-Proteins.
-
Das
funktionelle CTLA4-Molekül
kann an eine nicht-CTLA4-Proteinsequenz angefügt werden, z.B. an einen Abschnitt
eines Immunglobulinmoleküls.
Zu löslichen
CTLA4- Molekülen gehören beispielsweise
ein lösliches
CTLA4-p97-Molekül;
ein lösliches
CTLA4-env-gp120-Molekül;
ein lösliches
CTLA4-E7-Molekül
und ein lösliches
CTLA4-ova-Molekül.
-
Einer
Ausführungsform
zur Folge ist das lösliche
CTLA4-Molekül
CTLA4Ig mit der Aminosäuresequenz,
die dem bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville,
Maryland, unter den Vorschriften des Budapester Vertrags vom 31.
Mai 1991 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 68629 hinterlegte CTLA4Ig-Fusionsprotein entspricht.
-
VORTEILE DER ERFINDUNG:
-
Die
Gentherapie ist eine neue Form der molekularen Medizin, die in diesem
und dem nächsten
Jahrhundert auf die menschliche Gesundheit starken Einfluss haben
wird. Die Gentherapie stellt eine Möglichkeit zur Verfügung, vererbte
Genstörungen
wie zystische Fibrose, Hämophilie,
familiäre
Hypercholesterolämie, Krebs,
AIDS, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und infektiöse Erkrankungen
zu korrigieren.
-
Rekombinante
virale Vektoren stellen attraktive Vehikel für die Gentherapie dar, da sie
Gene effizient in somatische Gewebe transferieren. Vor der vorliegenden
Erfindung war ihre Verwendung in der klinischen Gentherapie allerdings
eingeschränkt,
da die transgene Expression mit der Zeit transient wurde. Umging
man die transiente Expression durch eine zweite oder weitere Verabreichung
des Virus, führte
dies außerdem
zu einem erheblich verminderten Gentransfer.
-
Die
vorliegende Erfindung basiert auf dem Fund, dass die Verabreichung
von löslichem
CTLA4Ig und anti-CD40-Ligand vor, nach oder während des in vivo- oder ex
vivo-Gentransfers in Zellen zu einer nachhaltigen Genexpression
durch den rekombinanten viralen Vektor in dem Wesen ohne langfristige
Immunsuppression führt.
-
Die
folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden
Erfindung und helfen dem Fachmann bei ihrer Ausführung und Anwendung. Die Beispiele
sollen die Tragweite der Erfindung in keiner Weise einschränken.
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BEISPIEL 1
-
Mit
diesem Experiment bestimmte man, dass die Verwendung von löslichen
CTLA4Ig-Molekülen
zu einer verlängerten
Genexpression nach einem adenoviral vermittelten Gentransfer führte.
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Sämtliche
Tierstudien wurden im Einklang mit den von der University of Washington
bestimmten institutionellen Richtlinien durchgeführt. Sämtliche Tiere wurden in speziellen
pathogenfreien Behausungen gehalten (SPF für „Pathogen Free Facilities").
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Man
injizierte Mäusen
(z.B. C3H/HeJ-Mäusen)
per Infusion über
die Schwanzvene rekombinanten Adenovirus, der in DMEM-Medium (Hyclone)
auf 100 μl
verdünnt
war. Vorausgehende Studien haben gezeigt, dass 80% bis 90% Hepatocyten
mit dieser adenoviralen Dosis transduziert werden (Q. Li, M. A.
Kay, M. Finegold, L. D. Stratford-Perricaudet, S. L. C. Woo (1993) Human
Gene Therapy 4, 403).
-
Man
verdünnte
murines muCTLA4Ig oder L6 (Plazebo) in pyrogenfreier physiologischer
Kochsalzlösung
und verabreichte es in 200 bis 400 μl mittels intraperitonealer
Injektion. Man gewann Blutproben mit der Retroorbitaltechnik. Die
Tiere wurden durch Genickbruch geopfert.
-
Konstruktion,
Produktion und Reinigung des rekombinanten E1-defizienten Ad5-Vektors (Ad/RSVhAAT)
erfolgten wie beschrieben (Kay et al. Hepatology 21: 815–819 (1995)).
Man verwendete eine einzige rekombinante Viruspräparation für L6-Kontrollen und für muCTLA4Ig-Versuchstiere.
Wie beschrieben (D. Barr et al. (1995) Gene Therapy 2: 151–155), stellte
man fest, dass in sämtlichen
Viruspräparation
kontaminierender Wildtyp-Virus nicht vorhanden war.
-
Man
gab C3H/HeJ-Mäusen
per Infusion Ad/RSVhAAT, einen Adenovirus, der in transduzierten
Hepatozyten die Expression von humanem alpha-1-Antitrypsin steuert,
und behandelte entweder mit muCTLA4Ig oder L6 (einem monoklonalen
Kontrollantikörper).
-
Man
bestimmte die Nachhaltigkeit der Genexpression in einzelnen Tieren,
indem man regelmäßig humanes
alpha-1-Antitrypsin (hAAT) im Serum quantifizierte.
-
Sechzehn
weibliche C3H/HeJ-Mäuse
im Alter von 6 bis 8 Wochen erhielten per Infusion über die Schwanzvene
an Tag 0 5 × 109 pfu Ad/RSVhAAT-Adenovirus (1).
Die Tiere bekamen an Tag 2 (n = 4, gefüllte Kreise) oder an den Tagen
0, 2, 10 (n = 4, offene Kreise) 200 μg murines CTLA4Ig (intraperitoneal).
Kontrolltiere bekamen an Tag 2 (n = 4) (gefüllte Quadrate) oder an den
Tagen 0, 2, 10 (offene Quadrate) (n = 4) (Darstellungen A und C)
entsprechende Mengen eines Kontrollantikörpers (L6).
-
Die
Darstellung B und D in 1 entsprachen
Wiederholungsexperimenten. Man gab zehn Mäusen an Tag 0 per Infusion
Ad/RSVhAAT-Adenovirus. An den Tagen 0, 2, 10 bekamen die Tiere entweder
lösliches CTLA4Ig
(n = 5, offene Kreise) oder L6 (n = 5, offene Quadrate). Man analysierte
Serumproben regelmäßig auf
(A) hAAT, (B) hAAT (Kay et al. 1995, supra) oder (C) CTLA4Ig, (D)
CTLA4Ig by ELISA. Jede Kurve steht für ein einzelnes Tier. Die ELISA-Assays
führte
man für
jede Messung wenigstens zweifach durch.
-
Murine
CTLA4Ig-Serumkonzentrationen bestimmte man mit einem ELISA-Assay.
Man beschichtete 96-Well-Immunolon-2-Platten mit humanem B7-1-Ig
(50 ng in 50 μl
Bicarbonatpuffer pH 9,6). In die gewaschenen und blockierten Wells
gab man verdünnte
Serumproben oder verdünnten
muCTLA4Ig-Standard. Im Anschluss an das Binden und Waschen inkubierte
man 50 μl
(1/5000-Verdünnung)
von Meerrettichperoxidase-markiertem anti-Maus-IgG2a-Ziegenantikörper (Southern
Biotechnology, Birmingham, AL) eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem
man gewaschen hatte, wies man die Meerrettichperoxidase nach, indem
man 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Sigma) verwendete.
Man stoppte die Reaktion, wozu man 50 μl 1 N Schwefelsäure verwendete.
Man nahm die Extinktion bei 450 nm (Referenz 630 nm) auf, wozu man
ein Mikrotiterplatten-Auslesegeräte
(Biorad) verwendete und bestimmte Konzentrationen, wozu man eine
lineare Regression der Standardkurve verwendete. Die Sensitivität betrug
0,1 ng/ml.
-
2 zeigt die Resultate des Milzproliferationsassays
an den Tagen 4 (2, Darstellung A),
11 (2, Darstellung B) oder 18 (2, Darstellung C) nach Verabreichung von
Ad/RSVhAAT; man isolierte die Splenozyten durch hypotonische Lyse
und kultivierte wie beschrieben in 96-Well-Platten mit flachen Böden (D. B.
Lewis et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 89).
-
In
den 2A–C
inkubierte man die Zellen bei einer Konzentration von 3 × 106/ml mit verschiedenen Konzentrationen von
UV-inaktiviertem Ad/RSVhAAT, wie angegeben. Man gewann die Überstände für Lymphokinassays
nach 72 Stunden oder pulste die Zellen mit 3H-Thymidin
und gewann sie 24 Stunden später,
um die Proliferation zu bestimmen.
-
Im
Rahmen von Lymphokinassays bestimmt man murines Interferon-γ mit ELISA,
wobei man die monoklonalen Antikörper
R46A2 und XMG1.2 als Einfang- beziehungsweise
Nachweisreagenzien verwendet. Murines IL-4 bestimmte man mit ELISA,
wobei man monoklonale Antikörperpaare
von Pharmingen verwendete. Man verwendete rekombinantes murines
IFV-γ und
IL-4 in jedem Assay als Standards.
-
In 3 gab man den Tieren 5 × 109 pfu Ad/RSChAAT an Tag 0 per Infusion. Man
behandelte die Tiere an den Tagen 0, 2, 10 entweder mit L6 (Darstellungen
b und e) oder mit muCTLA4Ig (Darstellungen c und f). Die Leber von
Normaltieren verarbeitete man parallel (Darstellungen a und d).
Die gefrorenen Leberschnitte von den an Tag 18 geopferten Tieren
inkubierte man mit anti-CD3- (Darstellungen a–c) oder anti-CD8-Antikörpern (Darstellungen
d–f).
Man färbte
mit gegen Hamsterantikörper
(Darstellungen a–c)
oder gegen Rattenantikörper
(Darstellung d–f)
gerichtetem Konjugat aus Meerrettichperoxidase und Ziegenantikörper. Die
Vergrößerung war
50-fach.
-
An
Lebergewebe, das in OCT gefroren und geschnitten war, führte man
eine immunhistochemische Färbung
durch. Man verwendete die folgenden Antikörper: CD3-Biotin (1452C11,
Pharmingen, San Diego, CA), CD4 (GK1.5, American Type Culture Collection
(ATCC)), CD8 (53-6.7 ATCC), NK (Kaninchen-anti-asialoGM1, Dako),
anti-Klasse I-Biotin (anti-H2Kk, 11-4.1
Pharmigen), anti-Klasse II-Biotin (anti-I-Ek 14.4-45, ATCC).
Man wies biotinylierte Antikörper
mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugaten
in geeigneter Weise nach. Entsprechende irrelevante Ratten- oder
Kaninchenantikörper
verwendete man als Kontrollen für nichtspezifisches
Färben.
Das Bewertungssystem für
die Entzündung
der Pfortader basierte auf dem von R. G. Knodell et al., (1981)
Hepatology 1,431 beschriebenen.
-
Man
verwendete acht Normaltiere als Kontrollen und bewertete sie mit
0. Die experimentellen Gruppen bewertete man auf Basis der Färbung unter
Verwendung einer Skala von 0 bis 4 im Vergleich zu den Normaltieren,
was einem von anderen zur Einstufung einer Entzündung der Pfortader verwendeten
Bewertungssystem entsprach (Yang et al. (1994) Immunity, supra).
Für jeden
Leberschnitt ist das Mittel aus zwei Bewertungen angegeben.
-
Zwei
Mäuse #14
und #23, wiesen vermutlich auf Grund einer unzureichenden Infusion
des Ad/RSVhAAT-Virus weniger als 50 ng/ml Serum-hAAT auf. Die Ziffern
in Klammern stehen für
das Mittel ohne die Tiere 14 und 23 (NA = nicht verfügbar). Die
verwendeten Tiere waren die in 2 gezeigten
und hier beschriebenen.
-
In
Tieren, die CTLA4Ig bekamen, war die Genexpression im Vergleich
zu den Kontrollen sehr stark ausgedehnt (1A–D). Sämtliche
der L6-Kontrolltiere (n = 8) wiesen zwischen den Wochen 2 und 7
(1A) nach Verabreichung des Adenovirus eine mehr
als 100-fache Abnahme der Serum-hAAT-Konzentration auf Werte auf,
die sich nicht von dem Hintergrund unterschieden; diese Daten ähneln denjenigen,
die man in einer vorangegangenen Untersuchung sah (D. Barr, supra).
Sämtliche
der mit muCTLA4Ig behandelten Tiere hielten (n = 8) die hAAT-Expression
für wenigstens
14 Wochen auf hohem Niveau und 6 von 8 Mäusen exprimierten hAAT für mehr als
5 Monate – der
Dauer des Experiments – auf
hohem Niveau (1A). Es gab keinen Unterschied
bezüglich
der hAAT-Nachhaltigkeit in Mäusen,
denen man 1 oder 3 Dosen von jeweils 200 μg muCTLA4Ig verabreichte.
-
Eine
zweite Reihe von Experimenten, die in 1B dargestellt
sind, ergab ähnliche
Ergebnisse. Erstaunlicherweise ähnelte
die Dauer die Adenovirus-vermittelten Genexpression derjenigen,
die man in vorangegangenen Untersuchungen in kongenen C3H-scid-Mäusen, die
keine antigenspezifische Immunität
besitzen, gesehen hatte (D. Barr, supra) sowie der Dauer der Adenovirus-transduzierten
Beta-Galactosidase-Expression,
die man in T-Zell-defizienten Nacktmäusen beobachtet hatte (Y. Yang,
H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1, 433; J. F. Englehardt,
X. Ye, B. Doranz, J. M. Wilson (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91, 6196).
-
Die
langfristige Adenovirus-vermittelte Genexpression war nicht das
Ergebnis einer nachhaltigen Immunsuppression. Über einen Zeitraum von 40 bis
70 Tagen fielen die Serumkonzentrationen von muCTLA4Ig dramatisch
von etwa 100 μg/ml
auf weniger als 10 ng/ml (1C und
D) ab. Eine erfolgreiche Immunsuppression mittels CTLA4Ig ist mit
Serumkonzentrationen von mehr als 1 μg/ml verbunden.
-
Die
mit muCTLA4Ig behandelten Tiere vermochten eine Immunantwort gegen
ein anderes Antigen aufzubauen. Um dies zu bestimmten, regte man
die mit muCTLA4Ig und L6 behandelten Tiere mit einem Neoantigen,
dem Bakteriophagen ΦX
174, 10 Wochen nach der ersten Adenovirus-Infusion an (S. Nonoyama,
F. O. Smith, I. D. Bernstein, H. D. Ochs (1993) J. Immunol. 150,
3817).
-
Der
Bakteriophage ΦX174
wurde angezogen, gewonnen und gereinigt, wie in Nonoyama et al.
supra beschrieben. 10 und 14 Wochen nach Adenovirus-Transduktion infudierte
man intravenös
2,5 × 108 pfu in 200 μl. Phagen neutralisierende Antikörpertiter
bestimmte man wöchentlich über einen
Zeitraum von insgesamt 8 Wochen nach der ersten Phageninfusion,
wie beschrieben. Die Titer drückte
man als Kv oder Geschwindigkeit der Phageninaktivierung über die
Zeit aus. In mit muCTLA4Ig und L6 behandelten Mäusen betrug die mittlere Kv
zwei Wochen nach der ersten Phageninfusion 2,2 (Bereich von 2,0
bis 14) beziehungsweise 3,9 (Bereich von 1,5 bis 33). Zwei Wochen
nach der zweiten Phageninfusion betrug die mittlere Kv 49 für mit muCTLA4Ig behandelte
Tiere (Bereich von 3,6 bis 1043) und 98 für mit L6 behandelte Tiere (Bereich
von 15 bis 1469). Zu diesem Zeitpunkt variierte der prozentuale
Anteil von IgG-Antikörper
in mit muCTLA4Ig behandelten Mäusen zwischen
70% und 100% und in mit L6 behandelten Tieren zwischen 50% und 100%.
-
Für die effiziente
Produktion von Antikörpern – Amplifikation
und IgM-zu-IgG-Isotypenswitch
eingeschlossen – als
Antwort auf den Bakteriophagen ΦX174
wird die Hilfe von T-Zellen benötigt
(S. Nonoyama et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1097). Da T-Zell-abhängige B-Zell-Antworten
durch CTLA4Ig blockiert werden, stellt dies ein sensitives Maß für restliches
muCTLA4Ig zur Verfügung.
(B. K. Finck, P. S. Linsley, and D. Wofsy (1994) Science 265, 1225;
P. S. Linsley und J. A. Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11,
191).
-
Sämtliche
der mit muCTLA4Ig und L6 behandelten Tiere produzierten als Antwort
auf die erste und zweite Immunisierung mit dem Bakteriophagen Φ174 normale
Mengen von neutralisierenden IgM- und IgG-Antikörpern, ein Hinweis auf die
Abwesenheit von biologisch aktivem muCTLA4Ig (S. Nonoyama, F. O. Smith,
I. D. Bernstein, H. D. Ochs (1993) J. Immunol. 150, 3817).
-
Die
langfristige Nachhaltigkeit der hAAT-Genexpression von Tieren, die
mit muCTLA4Ig behandelt worden waren, ist ein Hinweis darauf, dass
die Hemmung der kostimulatorischen Aktivierung von T-Zellen für die Hemmung
der gegen virale Antigene gerichteten zellulären Immunität verantwortlich war. Um zu
bestimmen, ob die immunologische Erkennung von Adenovirusantigenen
durch T-Zellen mit der CTLA4Ig-Therapie gehemmt wurde, führte man
Milzzellenproliferationsassys in Tieren durch, die mit Ad/RSVhAAT
transduziert und mit muCTLA4Ig oder L6 behandelt worden waren.
-
11
oder 18 Tage nach Infusion des Adenovirus wurden die Mäuse geopfert
und man stimulierte isolierte Splenozyten mit verschiedenen Konzentrationen
von Ad/RSVhAAT. Bei 72 Stunden bestimmte man die Zellproliferation
von Adenovirus-geprimten
T-Zellen mittels 3H-Thymidinaufnahme (2).
An Tag 4 lag in jeder Gruppe ein minimaler 3H-Thymidineinbau vor.
-
An
den Tagen 11 und 18 wies man eine dosisabhängigen, durch Antigen induzierte
Splenozytenproliferation in mit L6 behandelten Kontrollen nach,
die jedoch in CTLA4Ig behandelten Tieren fehlte oder deutlich niedriger
war (2B und C). Die Antworten in mit mucCTLA4Ig behandelten
Mäusen ähnelten
denjenigen, die man in unbehandelten Tieren, denen man kein Adenovirus
gab, beobachtete.
-
Die
Beeinträchtigung
der Antwort in mit muCTLA4Ig behandelten Mäusen war spezifisch, da die
Proliferation als Antwort auf eine anti-CD3-Stimulierung in mit muCTLA4Ig
behandelten, mit L6 behandelten und unbehandelten Kontrollmäusen ähnlich war.
-
Yang
et al. fanden, dass die Immunantwort auf Hepatozyten, die mit adenoviralen
Vektoren transduziert waren, die Charakteristika einer Lymphokinantwort
vom Typ 1 oder TH1 aufwiesen, dass nämlich Interferon-γ und IL-2,
jedoch nicht IL-4 von Antigen-stimulierten Splenozyten produziert
wurden (Y. Yang, H. C. J. Ertl, J. M. Wilson (1994) Immunity 1,
433). Die vorläufigen
Daten stimmen mit diesem darin überein,
dass Interferon-γ in
Ad/RSVhAAT-stimulierten Kulturen aus 5 der 9 mit L6 behandelten
Mäuse induziert
war (> 20 ng/ml), wohingegen
man IL-4 nicht nachweisen konnte (< 50
pg/ml). Weder Interferon-γ noch
IL-4 war in Antigen-stimulierten
Kulturen aus muCTLA4Ig-Mäusen
oder unbehandelten Kontrollmäusen
induziert.
-
In Übereinstimmung
mit den Ergebnissen der in vitro-Assays war die T-Zellantwort auf
Adenovirus-transduzierte Hepatozyten erheblich schwächer. In
parallel zu den Lymphozytenproliferationsuntersuchungen durchgeführten Assays
untersuchte man Leberschnitte aus normalen Kontrolltieren und aus
Mäusen,
denen 4, 11 und 18 Tage früher
Ad/RSVhATT verabreicht worden war.
-
Um
die Art des zellulären
Infiltrats zu bestimmen, setzte man die Schnitte mit einem monoklonalen
Antikörper
gegen CD3, der sämtliche
T-Zellen nachweist, mit monoklonalen Antikörpern gegen die CD4- und CD8-T-Zelluntergruppen,
MHC-Klasse I und
-Klasse II und mit einem polyclonalen Antiserum gegen NK-Zellen um.
-
Repräsentative
mit den Antikörpern
gegen CD3 und CD8 reagierende Schnitte sind in 3 gezeigt und
alle Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Nach 4 Tagen gab
es in jeder Gruppe wenig oder kein zelluläres Infiltrat. Nach 11 und
18 Tagen gab es in den L6-Tieren allerdings ein robustes (primär periportales) Infiltrat
von T-Zellen, jedoch in Mäusen,
die muCTLA4Ig erhalten hatten, wenig oder kein Infiltrat.
-
Die
T-Zellen stammten vornehmlich aus der CD8-Untergruppe. In der mit
muCTLA4Ig behandelten Gruppe war die Induktion der MHC-Klasse II-Expression
im Vergleich zu der mit L6 behandelten Gruppe ebenfalls vermindert,
allerdings variierten die Ergebnisse mehr als für die T-Zellmarker. In jeder
Gruppe gab es wenig NK-Zellinfiltrat. Die mit Adenovirus transduzierten
Tiere wiesen unabhängig
davon, ob sie CTLA4Ig oder L6 erhalten hatten, eine zunehmende hepatozelluläre Färbung für MHC-Klasse
I auf.
-
Während man
annimmt, dass die zelluläre
Immunität
die Dauer der Adenovirus-transduzierten
Genexpression einschränkt,
nimmt man an, dass die Antikörper
vermittelte humorale Immunität
eine zweite adenovirale Transduktion einschränkt (Y. Yang et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407; Y. Yang, H. C. J. Ertl, J.
M. Wilson (1994) Immunity 1, 433; T. G. Smith et al. (1993) Nature
Genetics 5, 397; Barr et al. supra).
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Bestimmte
man die Antikörperproduktion
in den in 1A gezeigten Mäusen, fand
man, dass muCTLA4Ig die Produktion von Antikörpern gegen den adenoviralen
Vektor behinderte aber nicht vollkommen unterdrückte.
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Wie
in Tabelle 2 gezeigt ist, entwickelten sämtliche der mit L6 behandelten
Tiere 4 Wochen nach der Infusion neutralisierende Antikörper gegen
den Adenovirus, während
die Antwort in mit muCTLA4Ig behandelten Mäusen verzögert und abgeschwächt war.
Nichtsdestotrotz entwickelten 2 von den mit CTLA4Ig behandelten
Mäusen
etwa 10 Wochen nach Infusion neutralisierende Titer von 16 oder
mehr und lediglich 2 der Mäuse entwickelten
keinerlei nachweisbaren neutralisierenden Antikörper.
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Aus
den in den 1A und C untersuchten Mäusen bestimmte
man die gegen den Adenovirus gerichteten neutralisierenden und isotypspezifischen
Antikörper.
Die neutralisierenden Antikörper
und IgG2a-Titer sind als die mittleren reziproken (1/x) Titer angegeben.
Der Bereich für
jede Gruppe ist in Klammern angegeben (nd = nicht bestimmt).
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Messungen
der neutralisierenden Antikörpertiter
waren im Vergleich zu D. Barr, supra modifiziert. Kurzum, man verteilte
5 × 104 293-Zellen auf 96-Well-Platten. Durch 40-minütiges Erwärmen bei
55°C inaktivierte
man die Serumproben und vermischte 100 μl (4-fache) Verdünnungen
von Serum (geringste Verdünnung
war 1/16) in DMEM/1% fötales
Kälberserum
eine Stunde bei 37°C
mit 10 μl
Ad.RSVβgal
(3 × 105 pfu). Man überschichtete die 293-Zellen
60 Minuten mit dem Gemisch, bevor man das Virusgemisch durch frisches Medium
ersetzte. 16 bis 24 Stunden später
färbte
man die Zellen mit β-Gal
an und definierte den Titer als diejenige Verdünnung, welche die Färbung von
293-Zellen zu 75% hemmte. Diesem Kriterium zufolge besaßen sämtliche
der L6-Kontrollen, die Adenovirus bekommen hatten, neutralisierende
Titer von wenigstens 1/32, während
lediglich 2 der mit muCLTA4Ig behandelten Mäuse neutralisierende Titer
aufwiesen, die wenigstens 1/16 betrugen. Das Serum von 2 mit muCTLA4Ig
behandelten Tieren zeigte bei einer 1/16-Verdünnung
keine Hemmung der β-Gal-Färbung, während das
Serum aus 4 dieser Tiere bei einer 1/16-Serumverdünnung eine Hemmung
der β-Gal-Färbung von
weniger als 75% zeigte, ein Hinweis auf einen geringen Titer an
Adenovirus-neutralisierenden
Antikörpern.
Man bestimmte IgM-, IgG1- und IgG2a-Antikörper, indem man die Wells von Mikrotiterplatten
(Dynatech Immunolon) mit der optimalen Menge (50 ng/Well) von UV-inaktiviertem
Ad/RSVhAAT in Carbonatpuffer (pH 9,6) beschichtete. Nach dem Blockieren
der Platten inkubierte man sie nacheinander mit Serumproben (verdünnt von
1:100 auf 1:6400 für
IgG1 und IgG2a, verdünnt
von 1:100 auf 1:800 für IgM)
und wies sie dann mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziegenantikörpern gegen
murines IgG1, IgG2a (Southern Biotechnology) oder IgM (Tago) nach.
Als Titer definierte man die niedrigste Verdünnung, die eine optische Dichte
von mehr als 0,100 (IgG1 und IgG2a) oder von mehr als 0,050 (IgM)
oberhalb von derjenigen, die man mit Serum aus unbehandelten Kontrollen
erhielt, ergab.
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Nahezu
sämtliche
der in Woche 6 und 10 mit dem Isotyp-spezifischen ELISA nachgewiesenen
Virus-spezifischen Antikörper
waren vom IgG2a-Isotyp. Jeder von den 8 mit L6 behandelten Mäusen entwickelte hohe
IgG2a-Antikörpertiter.
In den mit muCTLA4Ig behandelten Mäusen war die IgG2a-Antwort
erheblich geringer, wenngleich 6 von 8 Mäusen letztendlich nachweisbare
Antikörpertiter
von ≥ 100
entwickelten. An den 6- und 10-Wochenproben wies man nach, dass
eine mit L6 behandelte Maus messbare Antikörper vom IgG1-Isotyp (1:400)
und eine mit muCTLA4Ig behandelte Maus messbare IgM-Antikörper (1:400)
aufwies. Die Dominanz des IgG2a-Isotyps steht in Einklang mit einer
T-Zell-Lymphokin-Antwort vom Typ I oder TH1, da solche T-Zellen
Interferon-γ produzieren,
welches die Produktion dieses Isotyps begünstigt und dabei die IgG1-Produktion
hemmt, während
das von T-Zellen vom Typ II oder TH2 produzierte IL4 das Gegenteil
bewirkt (W. A. Paul and W. E. Seder (1994) Cell 76, 241; L. Nguyen,
D. M. Knipe and R. W. Finberg (1994) J. Immunol. 152, 478); diese
Ergebnisse stehen in Einklang mit den oben angegebenen Ergebnisse
zu den Lymphokinen.
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Das
Vorherrschen von IgG2a-Antikörpern
in beiden Mäusegruppen,
wenn auch in wesentlich geringerer Menge in der mit muCTLA4Ig behandelten
Gruppe, ist ein Hinweis darauf, dass dieser Wirkstoff die Art der sich
entwickelnden humoralen Immunantwort merkbar abschwächte aber
nicht veränderte.
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Um
zu bestimmen, ob die niedrigen Antikörperspiegel mit in muCTLA4Ig
behandelten Mäusen
ausreichten, um die Genexpression mit einem zweiten adenoviralen
Vektor zu stören,
wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, dass dem in 1 gezeigten ähnelte. Neun Wochen nach der
ersten Verabreichung von Ad/RSVhAAT (als muCTLA4Ig nicht mehr nachweisbar
war) erhielten die Tiere eine Infusion von Ad.RSVcFIX, der den caninen
Faktor IX exprimierte (M. A. Kay, et al. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci.. USA 91, 2353), mit oder ohne eine zweite Behandlung von muCTLA4Ig.
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Keine
von den Mäusen
exprimierte den caninen Faktor IX. Dies spiegelt wahrscheinlich
die Neutralisation des adenoviralen Vektors durch niedrige Antikörperspiegel
in den mit muCTLA4Ig behandelten Mäuse wider, trotz der andauernden
Expression des ersten Genprodukts, hAAT.
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Die
Ergebnisse aus dieser Untersuchung sind ein Hinweis darauf, dass
die kurzzeitige Verabreichung von muCTLA4Ig etwa zum Zeitpunkt der
systemischen Vektorverabreichung zu einer nachhaltigen Adenovirus-vermittelten
Genexpression führt.
Die vorübergehende
Immunsuppression durch muCTLA4Ig schwächte die T-Zellinfiltration in die Leber, dem wichtigsten
Zielorgan in vivo und die in vitro ausgetesteten antigeninduzierten
T-Zellantworten ab. Wahrscheinlich stehen diese Wirkungen auf die
T-Zellreaktivität
in kausalem Zusammenhang mit der langfristigen Nachhaltigkeit von
Adenovirus-transduzierten Hepatozyten, im Gegensatz zu der in Kontrollen
beobachteten immunvermittelten Clearance.
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Dies
ist der erste Bericht über
eine substantive therapeutische Verstärkung der Adenovirus-vermittelten
Genexpression in vivo. Diese Ergebnisse stehen in deutlichem Gegensatz
zu der minimalen Verstärkung der
Adenovirus-vermittelten Genexpression aus der Leber, die man mit
kontinuierlicher täglicher
Verabreichung von Cyclosporin A erreichte (J. F. Englehardt, X.
Ye, B. Doranz, J. M. Wilson (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,
6196).
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Die
Ergebnisse zeigen enge Parallelen zu denjenigen Resultaten, die
man mit einem nachhaltigen genetischen Defekt in der T-Zell- oder
T- und B-Zellfunktion auf Grund der nude-, scid- oder RAG2-Mutationen erreichte
(Yang et al. (1994) PNAS; Yang et al. (1994) Immunity; Barr et al.,
supra), welche wie die mit muCTLA4Ig behandelten Mäuse das
transduzierte Gen mehr als 5 bis 6 Monate, den Beobachtungszeiträumen, weiter
exprimierten. Erstaunlich ist, dass die transiente Art der für die langfristige
Adenovirus-vermittelte Genexpression benötigten durch muCTLA4Ig induzierten
Immunsuppression im Gegensatz steht zu der durch die genetischen
Defekte zur Verfügung
gestellten kontinuierlichen Immunsuppression und andeutet, dass
eine nachhaltige Genexpression ohne eine langfristige Immunsuppression
und die daraus resultierenden Nebenwirkungen erreicht werden kann.
Obwohl die Hemmung ausreichte, um zu einer langfristigen Expression
des transduzierten Gens zu führen,
war eine zweite Gentransduktion nicht möglich.
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Wahrscheinlich
spiegelt dies die effiziente Neutralisierung des zweiten Vektors
durch niedrige Spiegel verbleibender zirkulierender neutralisierender
Antikörper
wider. Weitere Therapien auf immunologischer Grundlage, möglicherweise
in Kombination mit weniger antigenen adenoviralen Vektoren (Englehardt
et al., supra) könnten
für die
Entwicklung einer wahren Antigentoleranz erforderlich sein, was
eine wiederholte systemische Verabreichung von Adenoviren zulassen
sollte.
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Unter
normalen Bedingungen ist die Leber ein Gewebe im Ruhezustand und
es ist nicht möglich,
exakt vorher zu sagen, wie lang das nichtchromosomale, nicht integrierte
adenovirale Genom in Hepatozyten oder anderen Geweben in Abwesenheit
einer Zerstörung
durch das Immunsystem bestehen bleiben wird. Untersuchungen, welche
die Nachhaltigkeit der Adenovirus-vermittelten Genexpression in
immundefizienten Tieren mit immunkompetenten Tieren unter Immuntherapie
wie der hier beschriebenen vergleichen, werden bei der Bestimmung
der vom Immunsystem bezüglich
der Dauer der Genexpression vorgegebenen Beschränkungen im Vergleich zu Mechanismen
nicht immuner Art des Genomumsatzes hilfreich sein. Die Ergebnisse
der Untersuchung stellen einen wichtigen Schritt hin zur Verwendung
von Adenoviren für
die langfristige Genexpression in vivo dar und werden bei der Entwicklung
zukünftiger
klinischer Versuche im Bereich der Gentherapie nützlich sein.
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BEISPIEL 2
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Herstellung von CTLA4Ig-Adenoviren:
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Man
stellte die Konstrukte Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA und Ad/RSV-CTLA4Ig(hu)-BPA durch direktionelles
Klonieren von genrein gereinigten humanen und murinen HindIII/XbaI-Fragmenten
in die HindIII/XbaI-Stellen zwischen den RSV (Rous sarcoma virus
LTR)-Promoter und BPA (Rinderpolyadenylierungssignal) des linksendigen
adenoviralen Plasmids Ad/RSV-BPA (von PXCJL.1 abstammend) her. Man
transfizierte dann jeden dieser beiden linksendigen adenoviralen
Plasmide mit dem rechtsendigen adenoviralen Plasmid pBHG10, wobei
man ein Standardprotokoll zur Kalziumphosphattransfektion verwendete
und gewann den rekombinanten Adenovirus nach 14 bis 18 Tagen. Der
Adenovirus wurde dann Plaque-gereinigt und man expandierte und reinigte über zwei
Cäsiumchlorid-Gradienten
diejenigen Klone, von denen man mittels ELISA-Assay feststellte,
dass sie das humane und murine CTLA4Ig-Protein exprimierten.
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Man
stellte die bicistronischen linksendigen HAAT (humanes alpha-1-Antitrypsin-Protein) und humanes
und murines CTLA4Ig beinhaltenden Vektoren her, indem man die gereinigten,
mit T4-DNA-Polymerase polierten, humanen und murinen CTLA4Ig-HindIII/XbaI-Fragmente
in die einzige SmaI-Stelle zwischen der internen Ribosombindungssequenz
des Poliovirus (POLIO) und BPA in den RSV-HAAT-POLIO (SMAI)-BPA enthaltenden pKS-Plasmid
klonierte. Man verdaute diejenigen Rekombinanten, von denen man
feststellte, dass sie die CTLA4-Fragmente in passender Richtung
enthielten, mit XhoI und klonierte das gereinigte RSV-HAAT-BPA-CTLA4Ig-BPA-Fragment
in die einzige XhoI-Stelle in den linksendigen adenoviralen Plasmid pXCJL.1
(gleiches Gerüst
wie der linksendige Ad/RSV-Plasmid).
Die rekombinanten Viren wurden wie oben gewonnen.
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Man
injizierte 4 × 109 pfu des rekombinanten Adenovirus Ad/RSV-CTLA4Ig(mu)-BPA
in die Schwanzvenen von C3H-Mäusen
und produzierte maximale Serumspiegel von 2369, 2168 und 1762 ng/ml
Plasma 3 Wochen nach Injektion. Man injizierte den Ad/RSV CTLA4Ig(hu)-BPA-Adenovirus
in mehrere C3H-Mäuse
und bewertete die CTLA4Ig/hu)-Plasmaspiegel.
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BEISPIEL 3
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Die
gegen den adenoviralen Vektor gerichtete humorale Immunität wird durch
die Verabreichung von CTLA4Ig geschwächt aber nicht eliminiert.
Man verwendete daher CTLA4Ig mit anti-CD40-Ligand (MR1), um die
Genexpression zu verlängern
und einen zweiten Gentransfer zuzulassen.
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Die
Tiere bekamen an Tag 0 Adenovirus (Ad/RSV-hAAT, 5 × 109 pfu), an den Tagen 0, 2, 10 CTLA4Ig (200 μg) und an
den Tagen 0, 2, 4 und 6 MR1 (250 μg).
Man verdünnte
L6 (Plazebo) und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung und
verabreichte 200–400 μl intraperitoneal.
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Sämtliche
der Tiere wiesen eine nachhaltige Genexpression auf. Innerhalb von
2 bis 6 Wochen ging die Genexpression der L6-Kontrollen allesamt
auf 0 zurück.
Die Hälfte
der Tiere wies keine nachweisbaren neutralisierenden Antikörper auf.
In ähnlicher
Weise konnte die Hälfte
der Tiere ein zweites Mal mit einem rekombinanten adenoviralen Vektor
(Ad.RSV-cFIX) transduziert werden. Die kombinierte MR1/CTLA4Ig-Therapie
besitzt daher das Potenzial, die Genexpression zu verlängern und
einen zweiten Gentransfer zuzulassen. Letzteres ist das Ergebnis
einer Blockade der humoralen Immunität.
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Die
in Tabelle 3 zur Verfügung
gestellten Daten zeigen, dass zumindest mit der Hälfte der
Tiere man in der Lage ist, eine zweite Dosis Virus zu verabreichen
und einen erfolgreichen adenoviralen Gentransfer zu bekommen.
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