DE69332978T2

DE69332978T2 - Methode zur inhibition der replikation von hyperproliferativen zellen

Info

Publication number: DE69332978T2
Application number: DE69332978T
Authority: DE
Inventors: M. Steven FRISCH
Original assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; La Jolla Cancer Research Foundation
Current assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; La Jolla Cancer Research Foundation
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1993-10-13
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2013-10-14
Also published as: EP0666929A4; CA2147127A1; DK0666929T3; EP0666929A1; US5516631A; JP3492364B2; PT666929E; EP0666929B1; WO1994009160A1; JPH08504573A; US5866550A; DE69332978D1; ATE240404T1; ES2194849T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Adenovirus ist ein großes DNA-Virus, dessen natürlicher Wirt menschliche Zellen sind. Praktisch jeder Erwachsene hat sich zu irgendeinem Zeitpunkt mit Adenovirus infiziert, wobei die hauptsächliche Auswirkung erkältungsartige Symptome sind. Adenovirus wird rein aufgrund seiner onkogenen Wirkung bei Nagetieren als ein „DNA-Tumorvirus" bezeichnet. Die Expression des Adenovirus-Genoms erfolgt in zwei Stufen. Zuerst werden die frühen Genprodukte exprimiert, welche die E1A- und E1B-Gene kodieren. Diese Produkte sind für die Expression der späten Genprodukte erforderlich. Späte Genprodukte kodieren Proteine, die für die Replikation erforderlich sind, wie auch die viralen Strukturproteine.
Die von dem E1A-Gen von Adenovirus kodierten Proteine sind primär aus zwei Gesichtspunkten untersucht worden. Zunächst sind die 243 Aminosäuren- und 289 Aminosäuren-Formen von E1A (die aufgrund eines alternativen Spleißens der Vorläufer-RNA auftreten, so dass das 243-Aminosäuren-Protein eine Teilmenge des 289 Aminosäuren-Proteins ist) beide Proteine, welche die Transkription regulieren, J. Flint, T. Shenk, Ann. Rev. Gen. 23: 141–161 (1989). Zweitens erleichtern diese Proteine die onkogene Transformation von bestimmten Nagetierzellen durch andere Onkogene, H. E. Ruley, Nature 304: 602–606 (1983), und als solches wird E1A allgemein als ein Onkogen eingestuft. Es wird angenommen, dass die Wechselwirkungen von E1A-Proteinen mit verschiedenen definierten zellulären Proteinen dessen onkogene Wirkungen in Nagetierzellen vermitteln, J. M. Howe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 5883–5887 (1990).
Bei menschlichen Zellen scheint E1A jedoch nicht mit anderen Onkogenen zu kooperieren, um Zelllinien zu transformieren; es ist nur in zwei Fällen über milde tumorerzeugende oder tumorigene Wirkungen berichtet worden. Beispielsweise sind embryonale Nierenzelllinien, F. Graham, J. Smiley, W. Russell, R. Nairn, J. Gen. Virol. 36: 59–72 (1977) und embryonale Retinoblastenzelllinien, P. J. Byrd, K. W. Brown, P. H. Gallimore, Nature 298: 67–71 (1982), die E1A stabil exprimieren, schwach tumorigen, wenn sie Mäusen injiziert werden. Darüber hinaus treten diese Transformanten sehr selten nach einer Cotransfektion von E1A mit einem anderen Onkogen auf.
Es wird angenommen, dass die normalen und transformierten Phänotypen einer Zelle durch ein Gleichgewicht von Aktivitäten, die durch Onkogene und Antionkogene (Tumorsuppressorgene) kodiert werden, aufrechterhalten werden. Das Fehlen von funktionsfähigen Tumorsuppressorgen-Produkten trägt zur Krebsentstehung bei. Im Gegenzug verspricht das Ersetzen oder die Überexpression dieser Produkte, beim Kontrollieren der Tumorzellvermehrung nützlich zu sein. Gegenwärtig ist nur eine begrenzte Anzahl von Tumorsuppressorgenen charakterisiert worden, insbesondere das Retinoblastom-Protein, Huang et al., Science 24: 1563–1566 (1988), und p53, Chen et al., Science 250: 1566–1570 (1990). Wenn sie in Tumorzellen erneut eingeschleust werden, töten diese beiden Genprodukte die Zellen jedoch einfach.
Zwei Berichte in der Literatur behaupten Tumorsuppressor-Wirkungen von E1A, aber diese beiden Wirkungen traten aufgrund von Begleiterscheinungen oder -phänomenen auf, die mit den Vermehrungs-kontrollierenden Wirkungen einer E1A-Expression nicht in Zusammenhang standen. Mit E1A stabil transformierte Ratten-Sarkom-Zellen sind in nackten Ratten weniger tumorigen als ihre nicht-transfizierten Gegenstücke (T. A. Walker, B. A. Wilson, A. M. Lewis, J. L. Cook, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 6491–6495 (1991)). Aus einer Sensibilisierung dieser Zellen für eine Zytolyse durch natürliche Killerzellen resultierte eine verringerte Tumorigenität von E1A-exprimierenden Zellen und diese Zellen waren in Nacktmäusen nach wie vor tumorigen. Der zweite Bericht (D. Yu, K. Scorsone, M. C. Huang Molec. Cell Biol. 11: 1745–1750 (1991)) zeigte, dass E1A ein als neu bekanntes Onkogen daran hinderte, die Mauszelllinie 3T3 zu transformieren. E1A bewerkstelligte dies allein, indem es die Expression von neu auf transkriptionaler Ebene hemmte. Mit einem chimären neu-Gen, das einen E1A-resistenten Genpromotor nutzte, transfizierte 3T3-Zellen wurden nach wie vor sogar in Gegenwart von E1A durch neu transformiert. Die Verwendung von E1A, um die Tumorproliferation in der Weise, die durch die obigen Beobachtungen impliziert wird, zu supprimieren, würde eine E1A-Expression in allen Zellen im Tumor erfordern. Dieses Erfordernis legt der Verwendung von Tumorsuppressorgenen für eine Therapie extreme praktische Beschränkungen auf, da es keine Technologie gibt, um ein gewünschtes Gen in 100 der Zellpopulation einzuschleusen. Im Lichte dieser Nachteile sind Strategien, um die unkontrollierte Replikation von hyperproliferativen Zellen unter Verwendung von Tumorsuppressorgenen zu hemmen, noch nicht bekannt geworden.
WO 92/10573 betrifft die Suppression des neu-Onkogens wie auch die Suppression einer durch das neu-Onkogen vermittelten Transformation, Tumorentstehung und Metastasierung, wobei Adenovirus-ElA-Genprodukte in betroffene Zellen eingeschleust werden. Frisch et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 9077-9081) betrifft die Umwandlung von bestimmten Krebszell-Typen, die neu nicht überexprimieren, in einen offensichtlich untransformierten Zustand.
Folglich gibt es einen Bedarf, hyperproliferative Zellpopulationen durch kleine Subpopulationen von Zellen, die mit der Fähigkeit ausgestattet sind, deren Vermehrung dominierend zu beeinflussen, zu regulieren. Die Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt zusätzlich damit in Zusammenhang stehende Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Umwandeln einer pathologischen hyperproliferativen menschlichen Zelle in ihren nicht-malignen Phänotyp. Diese Wirkung tritt sogar bei Zellen, die durch andere Onkogene als neu transformiert sind, auf. Das Verfahren umfasst, in eine pathologisch hyperproliferative Zelle eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit Adenovirus-E1A-Aktivität kodiert, unter solchen Bedingungen in vitro einzuschleusen, dass die Nukleinsäure in einige, aber nicht alle der hyperproliferativen Zellen eingeschleust wird, um reverstransformierte Zellen zu bilden; die Zellen unter solchen Bedingungen zu kultivieren, dass das Polypeptid produziert wird, und zuzulassen, dass revers-transformierte Zellen mit pathologisch hyperproliferativen Zellen, die nicht revers-transformiert worden sind, in Kontakt kommen, so dass die Vermehrung der pathologisch hyperproliferativen Zellen gehemmt wird. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung einer ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure für die Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen der Vermehrung von oder zum Revers-Transformieren eines Anteils von pathologisch hyperproliferativen menschlichen Zellen, wobei eine Verabreichung des Arzneimittels eine Hemmung der Vermehrung von benachbarten pathologisch hyperproliferativen Zellen, die die Nukleinsäure nicht enthalten, verursacht. Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung das Fördern der Differenzierung von pathologisch hyperproliferativen Zellen:
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Demonstration, dass E1A in transfizierten Tumorzellen stabil exprimiert werden kann. Immunpräzipitation von E1A- Proteinen aus stabil transfizierten und Ausgangs-Zelllinien. [35S]-Methionin-markierte Proteine aus E1A-exprimierenden Klonen, die von HT1080-Zellen (Bahnen 1–5), HeLa-Zellen (Bahnen 6–8) oder A2058-Zellen (Bahnen 9–11) abgeleitet worden sind, wurden mit anti-E1A-Antikörpern (E) oder Kontroll-Antikörpern (C) immunpräzipitiert. Bahnen: l–5, HT1080, p2AHT2a, plAneo3, plAneo15 bzw. plAneo16: 6–8, HeLa, Medg18 bzw. Medg28: 9–11, A2058, 1A58c8-1 bzw. 1A58c11-1. Die E1A-Proteinspezies entsprechenden Banden sind in Klammern gesetzt.
2. Demonstration, dass E1A-exprimierende Zellen in eine flache Kontakthemmungs-Morphologie umgewandelt werden. Phasenkontrastmikrophotographien von Ausgangs- (obere Reihe), Neomycinresistenz-transfizierten (mittlere Reihe) und E1Aexprimierenden (untere Reihe) menschlichen Tumorzellen. Untere Reihe, Mikrophotographien von HT1080neo^r und E1A-exprimierenden HT1080-Weichagarose-Kolonien.
3. Demonstration, dass eine E1A-Expression einen Verlust von Verankerungs-unabhängiger Vermehrung (Koloniebildung auf Weichagar) bei transfizierten Tumorzellen verursacht. Weichagarose-Koloniebildungsassays von Neomycinresistenz-transfizierten Ausgangs- und E1A-exprimierenden menschlichen Tumorzellen.
4. Demonstration, dass E1A die Tumorigenität von menschlichen Tumorzellen verringert. Tumorigenität von Ausgangstumorzellen (HT1080, A2058 und HeLa) und E1A-Derivaten bei Nacktmäusen.
5. DNA-Sequenz der E1A-kodierenden Sequenzen (cDNA), umfassend die 243 Aminosäuren-Sequenz und die längere 289 Aminosäuren-Sequenz (zusätzliche kodierende Abschnitte zwischen den Nukleinsäuren 427 und 564 gezeigt).
6. Struktur eines revers-transformierenden Retrovirus-Konstrukts. Die 243-Aminosäuren-Form E1A (12S-CDNA) wurde mit BstX1 an der Adenovirus-Kartenposition 610 ausgeschnitten und das 5'-Ende wurde mit einem doppelsträngigen Oligonukleotid rekonstruiert, wodurch alle 5'-nicht-kodierenden Sequenzen von E1A entfernt wurden. Das HindIII-Ende dieses Oligonukleotids wurde mit einem stumpfen Ende versehen und das 3'-Ende von E1A wurde mit HpaI (Kartenposition 1575) geschnitten, um die polyA-Additionsstelle zu entfernen. Die resultierende E1A-Sequenz wurde in den Retrovirus-Vektor LNSX (beschrieben in Miller und Rosman, Biotechniques 7: 980–990 (1989)) Subkloniert. Retroviren wurden dann verpackt, wie im Text beschrieben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung resultiert aus der Beobachtung, dass das Adenovirus-ElA-Gen unerwarteterweise den Phänotyp von menschlichen Tumorzellen beeinflusst, so dass deren Kontakthemmungseigenschaften wiederhergestellt werden und deren Differenzierung gefördert wird. Dieser Effekt tritt sogar bei Zellen auf, die durch andere Onkogene als neu transformiert sind. Eine stabile Expression des Adenovirus 5-E1A-Gens verringert die Verankerungs-unabhängige Vermehrung und das tumorigene Potential, fördert die Reorganisation, induziert eine flache Morphologie und stellt die Kontakthemmung bei menschlichen Tumorzelllinien wieder her. Anhand dieser Kriterien wirkt E1A in diesem Human-Kontext als ein Tumorsuppressorgen. Das offensichtliche Paradoxon, das sich anhand der Beobachtungen der Fähigkeit von E1A, Nagetierzellen in Kooperation mit anderen Onkogenen zu transformieren, erweist, legt nahe, dass E1A der Prototyp einer Klasse von vermehrungsregulatorischen Proteinen mit Kontext-spezifischen transformierenden und antionkogenen Aktivitäten sein könnte.
Diese unerwarteten Beobachtungen bilden die Grundlage für diese Erfindung, die in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Revers-Transformieren von pathologisch hyperproliferativen Säugetierzellen bereitstellt. Die Zellen werden mit einer wirksamen Menge von Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodiert, unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass die Nukleinsäure in einige, aber nicht alle der hyperproliferativen Zellen eingeschleust und in diesen exprimiert wird, um revers-transformierte Zellen zu bilden. Diese revers-transformierten Zellen lässt man mit benachbarten hyperproliferativen Zellen, die die Nukleinsäure nicht enthalten, in Kontakt kommen. Als Ergebnis wird die Vermehrung von benachbarten hyperproliferativen Zellen gehemmt.
Durch diese Erfindung wird ein Verfahren zum Umkehren des transformierten Phänotyps von hyperproliferativen Zellen, die sich in pathologischem Gewebe befinden, bereitgestellt, indem isolierte Nukleinsäuren mit E1A-Aktivität beispielsweise mittels retroviraler Vektoren durch Transduktion eingeschleust werden. Transduzierende Vektoren können durch direkte Injektion oder eine andere geeignete Anwendung eingeschleust werden. Solche revers-transformierten Zellen werden die Vermehrung von benachbarten, nicht-transduzierten Zellen anhalten.
Alternativ wird durch diese Erfindung ein Verfahren zum Revers-Transformieren einer Population von pathologisch hyperproliferativen Zellen in einem Subjekt bereitgestellt, welches umfasst, eine geeignete Probe von Zellen von dem Subjekt zu erhalten, die Zellen mit einem geeigneten retroviralen Vektor, der Nukleinsäure enthält, die ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodiert, für eine Zeitspanne für eine Transfektion der Zellen mit der Nukleinsäure in Kontakt zu bringen. Diese Zellen werden dann unter geeigneten Bedingungen kultiviert, so dass die Nukleinsäure exprimiert wird. Die aktiv exprimierenden Zellen werden dann dem Subjekt erneut infundiert.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „hyperproliferativ", wenn er sich auf Zellen bezieht, jene Zellen, welche die Fähigkeit zur autonomen Vermehrung aufweisen, d. h. die unabhängig von normalen regulatorischen Mechanismen existieren und sich reproduzieren, ist aber nicht darauf beschränkt. Hyperproliferative Krankheiten können als pathogen eingestuft werden, d. h. dass sie einen Krankheitszustand charakterisieren oder darstellen, oder sie können als nicht-pathologisch eingestuft werden, d. h. eine Abweichung vom Normalzustand, die aber nicht mit einem Krankheitszustand verbunden ist. „Pathologische hyperproliferative" Zellen treten bei Krankheitszuständen auf, die durch malignes Tumorwachstum gekennzeichnet sind, einschließlich Brustkrebs, Sarkome und andere Neoplasmen, Blastenkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, verschiedene Leukämien und Lymphome, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich kann der Begriff auf solche Leiden oder Zustände, wie Schilddrüsenhyperplasie und gutartige Prostatavergrößerung, angewendet werden. Beispiele von nicht-pathologischen hyperproliferativen Zellen werden beispielsweise in Embryonalgewebe, bei Epithelzellen der Milchgänge während der Entwicklung der Laktation und auch bei Zellen, die mit der Wundreparatur assoziiert sind, gefunden. Pathologische hyperproliferative Zellen zeigen in charakteristischer Weise einen Verlust der Kontakthemmung und eine Abnahme ihrer Fähigkeit, sich selektiv anzuheften, was eine Veränderung bei den Oberflächeneigenschaften der Zelle und einen weiteren Zusammenbruch bei der interzellulären Kommunikation impliziert.
Die Sequenz von E1A ist in 5 (SEQ ID NOS. 1–4) angegeben. Das Genprodukt von E1A hat die Fähigkeit; wenn es in einer malignen Zelle exprimiert wird, den Phänotyp derart umzuwandeln, dass die resultierende Zelle in der Lage ist, die Vermehrung von benachbarten Tumorzellen zu hemmen. Eine solche Fähigkeit wird hier als E1A-Aktivität bezeichnet. Die Erfin dung erstreckt sich auf E1A, dessen funktionale Untereinheiten und Fragmente und Modifikationen an der nativen Sequenz, bei denen ETA-Aktivität erhalten bleibt.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „Nukleinsäure" DNA, RNA oder cDNA. Ein „Polypeptid mit E1A-Aktivität" umfasst eine jegliche Aminosäuresequenz mit der biologischen Aktivität des Adenovirus-E1A-Genprodukts. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist diese Aminosäuresequenz das Polypeptidprodukt des Adenovirus-ElA-Gens mit 243 Aminosäuren, wie in 5 (SEQ ID NOS. 1 und 2) angegeben. Funktionale Äquivalente des Polypeptids mit 243 Aminosäuren sind Polypeptide, die ebenfalls spezifisch die Förderung der Kontakthemmung, wie hier ermöglicht, bewirken können.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Einschleusen" ein jegliches Verfahren zum Insertieren eines exogenen Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle und umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Transduktion, Transfektion, Mikroinjektion und virale Infektion von Wirtszellen. Verfahren zum Ausführen dieser Prozeduren sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Nukleinsäure in die Zelle eingeschleust, indem eine Zelle mit einem retroviralen Vektor, der die Nukleinsäure enthält, unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, dass die Nukleinsäure in die Zelle insertiert wird. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Virus ein Retrovirus, das zur Replikation nicht in der Lage ist (Replikations-inkompetent). Ein Retrovirus, das zur Replikation nicht in der Lage ist, ist als ein Virus definiert, das nicht die Fähigkeit aufweist, virale Proteine zu produzieren, was eine Verbreitung des Vektors in den infizierten Wirtszellen ausschließt. Beispiele von solchen Vektoren, die für die praktische. Ausführung dieser Erfindung nützlich sind, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und für diese leicht verfügbar.
Isolierte Nukleinsäuren, die im Rahmen dieser Erfindung nützlich sind, sind jene, die ein Polypeptid kodieren, welches funktional äquivalent zu einem von der E1A-Region des Adenovirus-Genoms kodierten Polypeptid ist. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die isolierte Nukleinsäure die Adenovirus-E1A-Region. Diese Region wird durch die Fachleute auf diesem Gebiet so definiert, dass sie von Nukleotid 560 bis Nukleotid 1542 geht.
Diese Erfindung stellt auch eine neue Form der Krebstherapie bereit. Zuvor waren Antikrebs-Gene oder -Arzneimittel, die darauf ausgerichtet waren, Tumorzellen zu töten, nur wirksam, Tumore auszurotten, wenn 100% der Zellen dem Arzneimittel ausgesetzt werden und dazu veranlasst werden, das Gen zu exprimieren. Diese konsistente oder vollständige Exposition wird in vivo selten, wenn überhaupt einmal erreicht. Maligne Zellen, die transfiziert worden sind, so dass sie die isolierten Nukleinsäuren dieser Erfindung exprimieren, können die Vermehrung von benachbarten Tumorzellen dominant verhindern. Folglich kann durch Umwandeln eines kleinen Bruchteils der malignen Zellen der Tumor wirksam ausgerottet oder gehemmt werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.
BEISPIEL I
Material und Methoden
Stabile E1A-exprimierende Zelllinien aus A2058-Melanom- und HT1080-Fibrosarkomzellen wurden konstruiert unter Verwendung des Plasmids plAneo, wie in Frisch et al., Oncogene 5: 75–83 (1990), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. E1A-exprimierende HeLa-Zellen, wie in Brunet und Berk, Mol. Cell. Biol. 8: 4799–4807 (1988) beschrieben, wurden von L. Brunet und A. Berk (University of California, Los Angeles) erhalten. Mit HT1080neo^r und A2058neo^r bezeichnete Zellen resultierten aus einer Transfektion mit Bluescript-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA), das das frühe Enhancer-unterstützte aph-Gen des Simian-Virus 40 enthielt (das Resistenz gegenüber G418 kodiert).
Zellen wurden zu 4 × 10⁴ (A2058 und Derivate), 3 × 10⁴ (HeLa und Derivate) oder 2 × 10⁵ (HT1080 und Derivate) Zellenpro 60 mm-Platte, wie in Freedman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 4435–4439 (1972) und Tucker et al., Cancer Res. 37: 1571-1579 (1977) beschrieben, ausplattiert und nach einer 14- bis 17-tägigen Inkubation mit p-Iodmitrotetrazoliumviolett (0,5 mg/ml) 16 h angefärbt.
Zellen wurden 4 bis 5 Wochen alten athymischen Nacktmäusen (Harian-Sprague-Dawley) in 0,25 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in der angegebenen Zellzahl injiziert. Pro Zelllinie erhielten neun Mäuse eine Injektion und die Tumore wurden nach den angegebenen Inkubationszeiten präpariert.
Konfluente Kulturen von Zelllinien (die 2 × 10⁶ Zellen enthielten) wurden in 35 mm-Vertiefungen 5 h mit 1,48·10⁷ s^–1 [0,4 mCi (1 Ci = 37 GBq)] [³⁵S] -Methionin (Tran³⁵S-label, ICN) in Methionin-freiem Dulbecco's Modified Eagle's (DME)-Medium, das 5% (Vol./Vol.) dialysiertes fötales Kälberserum enthielt, markiert. Die Zellen wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 1,0 ml RIPA-1 [50 mM Tris-HCl, pH 7,5/0,1% Nonidet P-40/250 mM NaCl/Aprotinin (10 μg/ml) Leupeptin (5 μg/ml) 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid/5 mM EDTA/Sojabohnentrypsininhibitor (10 μg/ml)] abgeschabt., Nach Zugabe von Kälberserumalbumin bis zu 0,5 mg/ml wurden die Lysate mit 100 μl einer 50%-igen (Gew./Vol.) Protein A- Sepharose^® (Pharmacia)-Aufschlämmung (hergestellt in RIPA-1, das 0,5, mg/ml Rinderserumalbumin enthält) durch Mischen bei 4°C für 30 min und Zentrifugieren für 10 min bei 14000 Upm in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge vorabsorbiert und 0,5 ml-Proben wurden dann mit 1,5 μg monoklonalem anti-E1A-Antikörper M73 (12) oder Kontrollantikörper [anti-fos-Ab-1 (Oncogene Sciences, Mineola, NY)] 2 h bei 0°C inkubiert. Dann wurden 25 μl der 50%-igen Protein A-Sepharose^®-Aufschlämmung zugesetzt und die Röhrchen 20 min bei 4°C gemischt, gefolgt von einer 2-minütigen Zentrifugation und fünf 0,5 ml-Wäschen mit RIPA-1.
Die Pellets wurden dann in 60 μl Probenpuffer resuspendiert und mittels SDS/PAGE analysiert.
BEISPIEL II
Reverse Transformation von malignen Zellen
Die Expression des E1A-Gens wurde auf RNA-Ebene durch Northern-Blot-Analyse dokumentiert, wie in Frisch et al., Oncogene 5: 75–83 (1990) und Brunet und Berk, Mol. Cell. Biol. 8: 4799-807 (1988) beschrieben, und in der vorliegenden Studie wurde die Proteinexpression durch Immunpräzipitation mit E1Aspezifischen monoklonalen Antikörpern dokumentiert (1). Auf dem Gel wurden mehrere Spezies von E1A-Protein detektiert.
In jedem Falle sind die E1A-transfizierten Zellen relativ flach und „epitheloid" verglichen mit den jeweiligen Ausgangszelllinien oder Linien, die mit dem aph-Gen allein transfiziert worden sind (2A). Diese morphologischen Veränderungen stimmen überein mit der oftmals berichteten Beobachtung, dass transformierte Zellen dazu neigen, stärker brechend (refraktil) und weniger Substrat-anhaftend als normale Zellen zu sein, wie in Edelman und Yahara, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 2047–2051 (1976) beschrieben. Die veränderte Morphologie wurde zu dem Zeitpunkt beobachtet, an dem die Kolonien auf den G418-Selektionsplatten erstmals identifiziert wurden, was na helegt, dass sekundäre stochastische Veränderungen im Genom für eine Induktion des veränderten Phänotyps nicht erforderlich sind.
TABELLE 1 Tumorigenität von Ausgangs-Tumorzellen (HT1080, A2058 und He-La) und E1A-Derivaten bei Nacktmäusen
Die Tumorigenität von Zellen in vivo korreliert im allgemeinen mit deren Fähigkeit, Verankerungs-unabhängige Kolonien zu bilden (Shin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 4435–4439 (1972) und Tucker et al., Cancer Res. 37: 1571–1579 (1977). Um auf Verankerungs-unabhängige Vermehrung zu testen, wurden Zelllinien in Weichagarose in einer festgelegten Anzahl von Zellen ausplattiert und hinsichtlich Kolonienbildung überwacht. Während die Ausgangs-Tumorzelllinien in Weichagarose Kolonien bildeten (= 1% Effizienz), bildeten E1A exprimierende Klone, die von diesen Zelllinien abgeleitet waren, keine Kolonien (Figur 3). Tatsächlich enthüllte eine mikroskopische Untersuchung, dass die E1A exprimierenden Klone eine Kolonien bildung auf Weichagarose sogar nicht einmal initiierten, was eine Wirkung auf die Vermehrungsrate ausschließt. Der Kolonien-supprimierende Phänotyp wurde unter 15 unabhängigen HT1080-Klonen, die mit dem aph-Gen allein transfiziert und hinsichtlich G418-Resistenz selektiert worden waren, niemals beobachtet; diese Ergebnisse zeigen, dass die Weichagarose-Kolonien-Suppression eine Wirkung des E1A-Gens und nicht des Selektionsprozesses war. Diese Beobachtungen zeigen, dass eine E1A-Expression die menschlichen Tumorzellen in einen Phänotyp umwandeln kann, der für eine Vermehrung Verankerungs-abhängig ist.
Um zu untersuchen, ob eine E1A-Expression die menschlichen Tumorzelllinien in vivo nicht-tumorigen machte, wurden sie subkutan athymischen Nacktmäusen injiziert und hinsichtlich Tumorbildung überwacht (4). Die Ausgangszelllinien bildeten große Tumore mit Inkubationszeiten von 15–17 Tagen. Im Gegensatz dazu produzierten die E1A exprimierenden A2058- und HT1080-Zellen nicht nachweisbare oder sehr kleine Tumore. E1A unterdrückt die Tumorigenität bei den HeLa-Zellen nur teilweise (4-fach), möglicherweise da die Transkription ausgehend von dem Glucocorticoid-abhängigen Maus-Mammatumorvirus-Promotor, der das E1A-Gen steuerte, in der subkutanen Umgebung beeinträchtigt war.
Um des weiteren die Möglichkeit auszuschließen, dass E1A einfach Vermehrungsraten verlangsamte, so dass Weichagar-Kolonien und Tumore nach kurzen Zeitspannen nicht nachweisbar gemacht würden, wurden Vermehrungskurven konstruiert. E1A beeinflusste die Vermehrungsrate von subkonfluenten Tumorzellen nicht wesentlich.
Die Möglichkeit, dass die Tumorsuppression durch die Fähigkeit von E1A, bestimmte Zellen hinsichtlich einer Lyse durch Tumornekrosefaktor α zu sensibilisieren, verstärkt worden sein könn te, wurde ebenfalls in Betracht gezogen. Dies war jedoch unwahrscheinlich, da ⁵¹Cr-markierte p2AHT2a-Zellen bei 500 Einheiten/ml Tumornekrosefaktor α – einer Dosis, die hoch genug ist, um nahezu 100% von empfindlichen Nagetierzellen zu töten – nur 18% mehr Lyse ergaben als die HT1080-Ausgangszellen.
Dies ist das erste Mal, dass die phänotypischen Wirkungen von E1A in menschlichen Zellen beschrieben worden sind. Die Experimente, über die hier berichtet wird, zeigen, dass E1A drei unterschiedliche Typen von menschlichen Tumorzellen in einen phänotypisch nicht-transformierten Zustand umwandelt. Paradoxerweise besteht eine hervortretende phänotypische Wirkung von Adenovirus-E1A in einer Kollaboration mit dem ras-Onkogen, um primäre Nagetierzellen zu transformieren. Da sich spezielle Nagetierzelltypen als durch E1A antionkogen beeinflusst erweisen können, wäre es voreilig, diese Diskrepanz allein Speziesunterschieden zuzuschreiben, besonders da über die Wirkungen der E1A-Expression bei spontan transformierten Nagetierzelllinien nicht berichtet worden ist.
BEISPIEL III
Hemmung der Tumorzellvermehrung durch Kontakthemmung
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Hemmung der unkontrollierten Replikation von menschlichen Tumorzellen durch Kontakthemmung mit Zellen, die durch eine E1A-Expression revers-transformiert sind.
Die Konstruktion von viralen E1A-Expressionsvektoren erfolgte durch Subklonieren von cDNAs, welche die E1A-Proteine von 243 Aminosäuren (SEQ ID NOS. 1 und 2) oder 289 Aminosäuren (SEQ ID NOS. 3 und 4) von Adenovirus Typ 5 kodierten, in die retroviralen Vektoren: LNCX, LNSX (Für Vektorbeschreibungen siehe Miller und Rosman, Biotechniques 7: 980–990 (1989); Einzelhei ten der Plasmidkonstruktionen sind in der Legende zu 6 angegeben). 10 μg dieser Plasmid-DNAs wurden durch Transfektion wie in Beispiel II in die ecotrope Verpackungszelllinie gpE86 (die in Hygromycin/Mycophenolsäure-Selektionsmedium gehalten wurde) eingeschleust. 48 h nach der Transfektion wurden unselektierte Virus-Stammlösungen hergestellt, indem konditioniertes Medium gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und eingefroren wurde. Diese viralen Stammlösungen wurden verwendet, um die amphotrope Verpackungszelllinie gpEam12 (Zellen erhältlich von der ATCC) in 35 mm-Vertiefungen durch 12-stündige Inkubation in DME/10% fötales Kälberserum, das 4 μg/ml Polybren enthält, zu infizieren. 24 h nach der Infektion wurden die Zellen in Verhältnissen zwischen 1 : 100 und 1 : 300 aufgeteilt und infizierte Zellen wurden in 500 μg/ml G418 3 Wochen selektiert. Virus-produzierende Zelllinien wurden in 35 mm-Vertiefungen vermehrt und für jede Linie wurde konditioniertes, Virus enthaltendes Medium hergestellt. Virus-Stammlösungen wurden ausgehend von Produzentenzelllinien, die entweder E1A mit 243 Aminosäuren oder E1A mit 289 Aminosäuren in den Vektoren LNCX und LNSX (die die Transkription unter Ver-wendung von internen CMV- bzw. frühen SV40-Enhancern fördern) enthielten, hergestellt.
Diese Stammlösungen wurden verwendet, um die menschliche Fibrosarkom-Linie HT1080 zu infizieren, indem 0,4 ml Virusstammlösung mit einer 35 mm-Vertiefung von HT1080-Zellen 8 h in Polybren enthaltendem Medium inkubiert wurde; infizierte Zellen wurden in verschiedenen Verhältnissen 24 h nach der Infektion aufgeteilt und entweder G418-resistente Klone oder gemischte Populationen von infizierten Zellen wurden weiter analysiert.
Die Ergebnisse waren wie folgt. In Kulturen, die mit einigen der Virus-Stammlösungen infiziert worden waren, wurde, verglichen mit den nicht-infizierten Kontrollen, keine morphologische Veränderung beobachtet. Ein Western-Blotting zeigte, dass diese infizierten Kulturen hinsichtlich einer E1A-Expression negativ waren, möglicherweise als Ergebnis einer Umlagerung von retroviralen DNA-Sequenzen in den Produzentenzelllinien.
Mit einer der Virus-Stammlösungen, die die 243 Aminosäuren-Form von E1A in dem LNSX-Vektor kodierte (speziell 4/LNSX8), wurden im wesentlichen 100 der Zellen in eine Morphologie, die jener von E1A-transfizierten Zellen sehr stark ähnelte, überführt (siehe 2). Nach einer länger andauernden Inkubation behielten diese Zellen ihre epitheloide Morphologie bei und vermehrten sich nicht über das Monolayer-Stadium hinaus, was eine Kontakthemmung der Vermehrung nahelegt. Diese Zellen exprimierten eine Menge an E1A-Protein pro Zelle, die vergleichbar war mit den Konzentrationen, die bei Calciumphosphat-transfizierten Zelllinien festgestellt wurden, aber das gesamte E1A war, wie erwartet, die 243 Aminosäuren-Form.
Bei anderen Virus-Stammlösungen wurde eine Mischung von „transformierte Morphologie"- und „E1A-Morphologie"-Klonen nach einer G418-Selektion festgestellt. Nach einer längeren Inkubation wurde festgestellt, dass diese Kulturen sich in signifikanter Weise schließlich (2–3 Wochen nach der Infektion) in nahezu 100 „E1A-Morphologie", d. h. epitheloide, kontaktgehemmte Zellen umwandeln.
Das letztgenannte Phänomen zeigt, dass E1A exprimierende Zellen eine Kontakthemmung aufeinander ausüben. Sie bewirken auch eine Kontakthemmung gegenüber Tumorzellen. Mit dieser Beobachtung stimmt überein, dass die Tumorzellen, wie erwartet, nicht in der Lage sind, Kontakthemmungssignale „auszusenden", aber in der Lage sind, diese zu „empfangen" und auf diese zu reagieren. Diese differenzierten Signalisierungsreaktionen erzeugen schließlich das Ergebnis, das in dem vorangegangenen Abschnitt beschrieben worden ist. Folglich kann eine Kontakthem- mung innerhalb einer Population von hyperproliferativen Zellen erzielt werden, indem E1A in einem Anteil der Zellen und nicht innerhalb der gesamten Population exprimiert wird.
Der konzeptmäßige Fortschritt, der bedeutende Weiterungen für die Krebstherapie in sich trägt, ist, wie folgt. Gene oder Arzneimittel., die zielgerichtet Tumorzellen töten sollen, sind nur wirksam, Tumore auszurotten, wenn 100 der Zellen dem Arzneimittel ausgesetzt werden oder dazu veranlasst werden, das Gen zu exprimieren. Dieser Zustand wird in vivo selten, wenn überhaupt einmal erreicht. E1A exprimierende Zellen können die Vermehrung von benachbarten Tumorzellen dominant verhindern; so wird das Veranlassen, dass ein kleiner Anteil der Zellen in einem Tumor E1A exprimiert, zur Ausrottung des Tumors (führen). Eine Abgabe von E1A durch retrovirale Vektoren wird diese. Wirkung erzielen. E1A ist unter den Tumorsuppressorgenen, die gegenwärtig charakterisiert sind, einzigartig, indem es die Lebensfähigkeit der Zellen, in die es eingeschleust wird, bewahrt, und diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um Tumorwachstum auszurotten.
BEISPIEL IV
Wirkung von E1A auf die Differenzierung
Ein Retrovirus, welches das 243 Aminosäuren-Wildtyp-ElA-Gen trägt, wurde, wie folgt, konstruiert. Das BstXI- und partielle PstI-Fragment aus dem Plasmid 12Swt (Moran et al., Mol. Cell. Biol. 6: 3470–3480 (1986)) (das die Adenovirus-Kartenpositionen 610–1835 enthielt) wurde mit einem synthetischen Oligonukleotid, das die Adenovirus-Kartenpositionen 555–610 (mit einem synthetischen 5'-HindIII-Ende) enthielt, und Bluescript, der mit HindIII und PstI geschnitten worden war, auf „three-way"-Weise ligiert. Dies erzeugte ein Plasmid, das die vollständige 243 Aminosäuren kodierende Sequenz ohne jegliche stromaufwärts liegende Sequenzen aus Adenovirus enthielt. Ein HindIII-HpaI-Fragment (555–1575) aus diesem Plasmid (das keine 3'-Polyade nylierungssequenzen aus E1A enthielt) wurde dann mittels Klenow-Enzym mit stumpfen Enden versehen und in die StuI-Stelle des Retrovirus-Vektors LNSX (Miller und Rosman, a. a. O.), welches in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, subkloniert. Die Verpackungszelllinie gpE86 wurde vorübergehend (transient) mit diesem Plasmid infiziert und die resultierende Virus-Stammlösung verwendet, um die amphotrope Verpackungszelllinie gpEam12 zu infizieren. G418 (500 μg/ml)resistente Produzentenzelllinien wurden durch Western-Blotting auf die Fähigkeit, infizierten HT1080-Zellen eine E1A-Expression zu verleihen, gescreent.
H4, ein homogener Subklon von H88T1080-Fibrosarkom-Zellen, wurden durch 8-stündige Infektion mit Virusüberstand in Kultivierungsmedium, das 4 μg/ml Polybren enthielt, dazu gebracht, das Adenovirus-5-Gen zu exprimieren. 24 h nach der Infektion wurden die Zellen erneut ausplattiert und 2 bis 3 Wochen in Gegenwart von 500 μg/ml G418 selektiert. Kolonien wurden gepickt, vermehrt und hinsichtlich einer E1A-Expression durch Western-Blotting unter Verwendung des Antikörpers M73 (Oncogene Science) gescreent.
Andere Tumorzelllin en wurden auf ähnliche Weise dazu gebracht, E1A zu exprimieren. Phasenkontrastmikroskopie enthüllte, das HT1080-Zellen (ATCC-Aufnahmenummer CCL121), A2058-Melanomzellen, Saos2-Osteosarkomzellen und normale Fibroblasten allesamt nach Einschleusung und Expression des E1A-Gens eine Epithelzellen-artige Morphologie annahmen.
An den E1A exprimierenden H4-Zellen wurde eine Elektronenmikroskopie ausgeführt und es wurde festgestellt, dass sie Epithelzellen-spezifische Verbindungsstrukturen, wie enge Verbindungen (tight junctions) und Desmosome, enthalten.
Es wurde auch eine Immunfluoreszenz an Aceton-fixierten Zellen, die auf Glasdeckgläschen kultiviert worden waren, ausgeführt. Nach der Reaktion mit dem anti-Desmoplakin-Antikörper NW6 (K. Green, Northwestern University), wurden Zellen mit Rhodamin-markiertem Anti-Maus-Antikörper umgesetzt und in einem Axiovert-Fluoreszenzmikroskop von Zeiss untersucht. Es wurden in den E1A exprimierenden Derivaten von H4-Zellen mit dem Antikörper markierte Strukturen, die den Desmosomen von authentischen Epithelzellen sehr stark ähnelten, beobachtet, nicht aber in H4-Ausgangszellen.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die offenbarten Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird es für die Fachleute auf diesem Gebiet ersichtlich sein, dass die speziellen, detailliert erläuterten Experimente die Erfindung nur veranschaulichen. Es sollte sich verstehen, dass verschiedene Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne vom Geist der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Hemmen der Vermehrung einer Population von pathologisch hyperproliferativen menschlichen Zellen in vitro, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen von pathologisch hyperproliferativen Zellen mit Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodiert, unter solchen Bedingungen, dass die Nukleinsäure in einige, aber nicht alle der hyperproliferativen Zellen eingeschleust wird, um revers-transformierte Zellen zu bilden; (b) Zulassen, dass revers-transformierte Zellen mit pathologisch hyperproliferativen Zellen in der Population, die nicht revers-transformiert worden sind, in Kontakt kommen, so dass die Vermehrung der Population von pathologisch hyperproliferativen Zellen gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) wenigstens einige der pathologisch hyperproliferativen Zellen mit der Nukleinsäure in Kontakt gebracht werden.
Verfahren zur Förderung der Differenzierung einer pathologisch hyperproliferativen menschlichen Zelle in vitro, umfassend das Inkontaktbringen der pathologisch hyperproliferativen Zelle mit Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodiert, unter solchen Bedingungen, dass die Nukleinsäure in die pathologisch hyperproliferative Zelle eingeschleust und das Polypeptid in der pathologisch hyperproliferativen Zelle exprimiert wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die isolierte Nukleinsäure Adenovirus-E1A-Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die pathologisch hyperproliferative Zelle eine maligne Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die klonale Population von pathologisch hyperproliferativen Zellen ein maligner Tumor ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die isolierte Nukleinsäure in die Zelle eingeschleust wird, indem die Zelle mit einem geeigneten retroviralen Vektor, der die isolierte Nukleinsäuresequenz enthält, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei die pathologisch hyperproliferativen menschlichen Zellen aus der aus Sarkom-, Melanom-, Lymphom-, Blasenkrebs-, Kolonkrebs-, Lungenkrebs- und Brustkrebszellen bestehenden Gruppe ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Sarkom aus der aus Fibrosarkom und Osteosarkom bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, wobei das Polypeptid mit E1A-Aktivität das Polypeptidprodukt des Adenovirus-E1A-Gens mit 243 Aminosäuren, wie in 5a–c gezeigt, ist.
Verwendung einer ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure für die Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Differenzierung einer pathologisch hyperproliferativen menschlichen Zelle.
Verwendung einer ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure für die Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen der Vermehrung eines Anteils von pathologisch hy perproliferativen menschlichen Zellen, wobei eine Verabreichung des Arzneimittels eine Hemmung der hyperproliferativen Vermehrung von benachbarten pathologisch hyperproliferativen Zellen, die die Nukleinsäure nicht enthalten, verursacht.
Verwendung einer ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure für die Herstellung eines Arzneimittels zum Revers-Transformieren eines Anteils von pathologisch hyperproliferat ven menschlichen Zellen, wobei eine Verabreichung des Arzneimittels eine Hemmung der Vermehrung von benachbarten pathologisch hyperproliferativen Zellen, die die Nukleinsäure nicht enthalten, verursacht.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 13, wobei die Nukleinsäure Adenovirus-E1A-Polypeptid kodiert.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 14, wobei die pathologisch hyperproliferative Zelle eine maligne Zelle ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 15, wobei das Arzneimittel einen geeigneten retroviralen Vektor, der die isolierte Nukleinsäuresequenz enthält, für das Einschleusen der isolierten Nukleinsäure in die Zelle umfasst.
Verwendung nach den Ansprüchen ll bis 16, wobei die pathologisch hyperproliferat ven menschlichen Zellen aus der aus Sarkom-, Melanom-, Lymphom-, Blasenkrebs-, Kolonkrebs-, Lungenkrebs- und Brustkrebszellen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Sarkom aus der aus Fibrosarkom und Osteosarkom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 18, wobei das Polypeptid mit E1A-Aktivität das Polypeptidprodukt des Adenovirus-E1A-Gens mit 243 Aminosäuren, wie in 5a–c gezeigt, ist.
Verwendung von revers-transformierten Zellen, die erhält- lich sind durch Inkontaktbringen von pathologisch hyperproliferativen Zellen mit Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodiert, unter Bedingungen, so dass die Nukleinsäure in die Zellen eingeschleust wird, um revers-transformierte Zellen zu bilden, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Hemmen der Vermehrung einer klonalen Population von pathologisch hyperproliferativen menschlichen Zellen, die die Nukleinsäure nicht enthalten.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Nukleinsäure Adenovirus-E1A-Polypeptid kodiert.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polypeptid mit E1A-Aktivität das Polypeptidprodukt des Adenovirus-ElA-Gens mit 243 Aminosäuren, wie in 5a–c gezeigt, ist.