ES2385251B1 - Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer. - Google Patents

Abstract

Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.#La invención se refiere a un adenovirus oncolítico que comprende una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma. Este adenovirus se distribuye más eficientemente por la masa tumoral y por consiguiente se aumenta el efecto oncolítico. Inyectando el adenovirus oncolítico de la invención endovenosamente se obtienen regresiones del volumen tumoral. Por lo tanto el adenovirus oncolítico de la presente invención es útil para el tratamiento del cáncer o de un estado pre-maligno del mismo.

Description

ES 2 385 251 Al

Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer

5

La invención está relacionada con el campo de la medicina, más particularmente con el campo de la oncología, y específicamente con la viroterapia.

ESTADO DE LA TÉCNICA

10 15 2O 25 30 35

El tratamiento actual del cáncer se basa principalmente en la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía. Pese a una elevada tasa de curación para el cáncer en estadios tempranos, la mayoría de casos avanzados de cáncer son incurables porque no pueden ser extirpados quirúrgicamente o porque las dosis radio o quimioterapéuticas administradas se ven limitadas por su toxicidad en células normales. Para paliar esta situación se han desarrollado estrategias biotecnológicas que buscan aumentar la potencia y selectividad de los tratamientos oncológicos. Entre ellas, la terapia génica y la viroterapia utilizan virus con propósitos terapéuticos contra el cáncer. En terapia génica el virus se modifica para impedir su replicación y para servir de vehículo o vector de material genético terapéutico. Por el contrario, la viroterapia utiliza virus que se replican y propagan selectivamente en las células tumorales. En viroterapia la célula tumoral muere por el efecto citopático causado por la replicación del virus en su interior más que por el efecto de un gen terapéutico. La replicación preferencial en una célula tumoral se denomina oncotropismo y la lisis del tumor se denomina oncolisis. En un sentido estricto, los virus que se replican selectivamente en tumores se denominan oncolíticos, aunque en un sentido más amplio la palabra oncolítico se puede aplicar a cualquier virus replicativo capaz de lisar células tumorales, aunque sin selectividad. En esta descripción el término oncolítico se utiliza en los dos sentidos. La viroterapia del cáncer es muy anterior a la terapia génica. Las primeras observaciones de curaciones de tumores con virus datan de principios del siglo pasado. Ya en 1912 De Pace obtuvo regresiones tumorales tras inocular el virus de la rabia en carcinomas cervicales. Desde entonces se han inyectado muchos tipos de virus en tumores para su tratamiento. Hay virus que presentan un oncotropismo natural como por ejemplo el parvo virus autónomo, el virus de la estomatitis vesicular y el reovirus. Otros virus se

2

pueden manipular genéticamente para que se repliquen selectivamente en tumores. Por ejemplo el Herpes Simplex virus (HSV) se ha hecho oncotrópico al eliminar el gen de la ribonucleótido reductasa, una actividad enzimática dispensable en células en proliferación activa como las células tumorales. Sin

5 embargo, el adenovirus, por su baja patogenicidad y alta capacidad de infectar células tumorales ha sido el virus más utilizado tanto en viroterapia como en terapia génica del cáncer.

Se han identificado 51 serotipos de adenovirus humanos y clasificado en 6 10 grupos diferenciados del A al F.

El adenovirus humano tipo 5 (Ad5), que pertenece al grupo C, es un virus formado por una cápside proteica icosaédrica que encierra un ADN lineal de 36 kilobases. En adultos la infección con Ad5 suele ser asintomática y en

15 niños causa un resfriado común y conjuntivitis. En general el Ad5 infecta células epiteliales, que en el curso de una infección natural son las células del epitelio bronquial. Entra en la célula por medio de la interacción de la fibra, proteína viral que se extiende a modo de antena desde los doce vértices de la cápside, con una proteína celular implicada en adhesión intercelular

20 llamada Receptor de Coxsackie-Adenovirus (CAR). Cuando el ADN viral llega al interior del núcleo empieza ordenadamente la transcripción de los genes tempranos o "early" (E1 a E4) del virus. Los primeros genes virales que se expresan corresponden a los genes de la región temprana 1A (E1A). E1A se une a la proteína celular Rb para liberar E2F y activar así la transcripción de

2 5 otros genes virales como E2, E3 y E4 y de los genes celulares que activan el ciclo celular. Por otro lado, E1 B se une a p53 para activar el ciclo celular e impedir la apoptosis de la célula infectada. E2 codifica para proteínas de replicación del virus; E3 codifica proteínas que inhiben la respuesta inmune antiviral; E4 codifica para proteínas de transporte de ARN viral. La expresión

30 de los genes tempranos conduce a la replicación del ADN viral, y una vez replicado éste, se activa el promotor tardío principal que conduce a la expresión de un transcrito de ARN mensajero que por corte y empalme diferencial genera todos los ARN que codifican para las proteínas estructurales que forman la cápside. 35 Hay dos aspectos importantes a considerar en relación al diseño de adenovirus oncolíticos: la selectividad y la potencia. Para conseguir

selectividad hacia la célula tumoral se han usado tres estrategias: la eliminación de funciones virales que son necesarias para la replicación en células normales, pero prescindibles en células tumorales; el control de los genes virales que inician la replicación por promotores selectivos de tumor; y

5 la modificación de las proteínas de la cápside viral implicadas en la infección de la célula huésped. Con estas modificaciones genéticas se ha conseguido un nivel de selectividad considerable, con una capacidad replicativa en célula tumoral del orden de 10000 veces superior a la capacidad replicativa en la célula normal. Con respecto a la potencia oncolítica también se han descrito

1o diversas modificaciones genéticas para aumentarla. Estas modificaciones incluyen: a) el aumento de la liberación viral, por ejemplo mediante la eliminación de E1 819K, la sobreexpresión de E3-11.6K (ADP), o la relocalización de la proteína E3/19K en la membrana plasmática; y b) la inserción de un gen terapéutico en el genoma del adenovirus oncolítico para

15 generar un "adenovirus oncolítico armado". En este caso, el gen terapéutico debería mediar la muerte de las células cancerígenas no infectadas mediante la activación de un profármaco con efecto adyacente (es decir, que mata a las células vecinas no infectadas), la activación del sistema inmune contra el tumor, la inducción de la apoptosis, la inhibición de la angiogénesis, o la

2 o eliminación de la matriz extracelular, entre otros. En estos casos, la forma y el tiempo de expresión del gen terapéutico serán críticos en el resultado final de la aproximación terapéutica.

En la última década, se han administrado diferentes adenovirus oncolíticos a

25 pacientes con tumores de cabeza y cuello, tumores de ovario, cáncer colorectal, cáncer pancreático y carcinoma hepatocelular, entre otros. El perfil de seguridad de estos adenovirus en los ensayos clínicos ha sido muy prometedor. Los efectos secundarios detectados, como algunos síntomas parecidos a la gripe y elevaciones transitorias de las transaminasas, fueron

3 o bien tolerados, incluso después de la administración sistémica de altas dosis de virus (cfr. D. Ko et al., "Development of transcriptionally regulated oncolytic adenoviruses", Oncoqene 2005, vol. 24, pp. 7763-74; y T. Reid et al., "lntravascular adenoviral agents in cancer patients: lessons from clinical trials", Cancer gene therapy 2002, vol. 9, pp. 979-86). Aunque la

3 5 administración de los adenovirus recombinantes indujo una supresión parcial del crecimiento tumoral, no se detectó ninguna erradicación completa de los tumores y, después de un corto periodo de tiempo, los tumores volvieron a crecer rápidamente. Estos resultados se debieron probablemente a que los adenovirus inyectados sólo se distribuyeron en una pequeña parte del tumor para alcanzar una respuesta antitumoral restringida, de manera que las células no infectadas con virus siguieron creciendo rápidamente. En un

5 trabajo reciente, se observó que la replicación de adenovirus oncolíticos en tumores xenógrafos humanos persistía hasta los 100 días después de su administración sistémica, aunque esta replicación no se traducía en una erradicación completa del tumor (cfr. H. Sauthoff et al., "lntratumoral spread of wild-type adenovirus is limited after local injection of human xenograft

1 o tumors: virus persists and spreads systemically at late time points", Human gene therapy 2003, vol. 14, pp. 425-33). Esta baja eficacia antitumoral se debe en parte a que el tejido conectivo y la matriz extracelular (ECM) presentes en la célula tumoral impiden la correcta distribución de los adenovirus recombinantes por el tumor.

15 Esta dificultad de los adenovirus oncolíticos de distribuirse eficientemente por la masa tumoral se ha descrito también para otros fármacos anticancerígenos como la doxorubicina, el taxol, la vincristina o el metotrexate. Son muchos los estudios que demuestran la implicación de la ECM en la resistencia de las

20 células tumorales a los fármacos quimioterapéuticos (cfr. BP Toole et al., "Hyaluronan: a constitutiva regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells", Seminars in cancer biology 2008, vol. 18, pp. 244-50). Las células tumorales y las células del estroma producen y ensamblan una matriz de colágenos, proteoglicanos y otras moléculas que dificultan el transporte de

2 5 macro moléculas por el interior del tumor. El ácido hialurónico (HA) es uno de los principales componentes de la EMC implicado en la resistencia de las células tumorales a los fármacos terapéuticos. El HA se encuentra sobreexpresado en una gran variedad de tejidos malignos, y en muchos casos los niveles de HA son un factor pronóstico de progresión tumoral. La

3 o interacción del HA con los receptores CD44 y RHAMM incrementa la supervivencia tumoral y la invasión. Además el HA puede promover las metástasis tumorales mediante la inducción de la adhesión y la migración celular, y la protección frente al sistema inmunológico.

3 5 Por otra parte, la inhibición de las interacciones entre el ácido hialurónico y las células tumorales revierte la resistencia a gran cantidad de fármacos. Diferentes trabajos han indicado que las hialuronidasas (enzimas encargados

de la degradación del HA) aumentan la actividad de diferentes quimioterapias

en pacientes con melanoma, sarcoma de kaposi, cáncer de cabeza y cuello y

metástasis hepáticas de colon. El mecanismo de acción de las hialuronidasas

es aun desconocido, pero por lo general se atribuye a una disminución de las

5

barreras de adhesión celular, una disminución de la presión intersticial y una

mejora en la penetración del fármaco anticancerígeno en el tumor, más que a

sus efectos inhibitorios de las vías de señalización relacionadas con la

supervivencia celular.

1 o

Recientemente se ha descrito que la coadministración de hialuronidasa con

un adenovirus oncolítico mediante inyección intratumoral, reduce la

progresión tumoral (cfr. S. Ganesh et al., "lntratumoral coadministration of

hyaluronidase enzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency in

mestastasic tumor models", Clin Cancer Res 2008, vol. 14, pp. 3933-41 ). En

15

estos estudios los adenovirus oncolíticos se administran en cuatro

inyecciones intratumorales y la hialuronidasa se administra intratumoralmente

en días alternos durante todo el tratamiento. Esta pauta de administración es

poco aplicable a pacientes debido a que la mayoría de los tumores son

inaccesibles para ser administrados intratumoralmente. Tampoco los

20

pacientes con enfermedad diseminada (metástasis) se podrían beneficiar del

tratamiento propuesto por Ganesh y colaboradores.

A pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha, existe todavía la

necesidad de encontrar nuevas aproximaciones terapéuticas que sean

25

eficaces en el tratamiento del cáncer.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado que un adenovirus que se replica y que

3 o

contiene en su genoma adenoviral el gen de la enzima hialuronidasa

insertado, se distribuye más eficientemente por la masa tumoral. La

expresión de la hialuronidasa por parte del adenovirus oncolítico resulta en

una degradación del ácido hialurónico que forma parte de la matriz

extra celular del tumor. La degradación del ácido hialurónico resulta en una

35

disminución de la presión intersticial del tumor y una menor resistencia del

tumor a la distribución del adenovirus, de manera que se mejora la

distribución del virus célula-célula por la masa tumoral. Esta mejor

distribución se traduce en un aumento del efecto oncolítico. Los inventores

han encontrado que inyectando el adenovirus oncolítico de la invención

endovenosamente se obtienen regresiones del volumen tumoral. Por lo tanto

el adenovirus oncolítico de la presente invención es útil para el tratamiento

5

del cáncer. Además, la expresión del gen de la hialuronidasa no afecta a la

replicación viral ni a la citotoxicidad del adenovirus oncolítico.

Como se ha comentado antes, se ha descrito que la coadministración

intratumoral de un adenovirus oncolítico y la hialuronidasa soluble aumenta la

1 o

eficacia antitumoral de un adenovirus oncolítico. Aún así, previamente a esta

invención el gen de la hialuronidasa no ha sido incorporado en ningún

adenovirus oncolítico para el tratamiento del cáncer.

Como se describe en los ejemplos, la administración in vivo intratumoral del

15

adenovirus oncolítico de la invención mejora el efecto antitumoral respecto a

un adenovirus control sin hialuronidasa insertada (ver FIG. 7). Pero cuando

se inyecta el adenovirus oncolítico de la invención endovenosamente (ver

FIG. 8) y, comparándolo con lo que se representa en la figura 2 del artículo

de Ganesh et al. 2, se observa una supresión del crecimiento tumoral mucho

2 o

mayor en el caso del adenovirus de la invención, por lo que el tratamiento de

la invención es más efectivo. Los tumores de los ratones inyectados con el

adenovirus oncolítico de la invención (ICOVIR17) muestran zonas necróticas

muy extensas, zonas con células viables muy reducidas, y grandes y

numerosos focos de replicación viral, en comparación con los tumores

2 5

inyectados con el adenovirus control, ICOVIR15.

Además, con el adenovirus de la invención las dosis administradas son

menores: en Ganesh et al. (supra) se administran cuatro inyecciones

intratumorales de 1 x1 Oe1 O partículas virales, mientras que en la presente

3o

invención se administra una sola dosis endovenosa de 2x1 Oe9 partículas

virales. Esto significa una reducción en la dosis de 20 veces y la ventaja de

que se trata de una única dosis. En su aproximación, Ganesh et al.

administran la hialuronidasa intratumoralmente en días alternos durante todo

el experimento. Además el adenovirus también es administrado

3 5

intratumoralmente al inicio del tratamiento. Esta administración intratumoral

de virus y hialuronidasa es difícilmente aplicable a la clínica debido a que la

mayoría de tumores no son accesibles para una administración intratumoral.

Presumiblemente la coadministración de hialuronidasa soluble y adenovirus no se realizó por vía sistémica pues la probabilidad de que ambos componentes alcancen conjuntamente las células tumorales diseminadas en el organismo es baja.

La presente invención permite la expresión de la hialuronidasa en el sitio y en el momento que se produce la replicación viral. Esta expresión de hialuronidasa mejora la distribución del virus por la masa tumoral y aumenta su potencia antitumoral. Se consigue administrar dosis ajustadas, no tóxicas

1 o para el animal y con una gran eficacia en el tratamiento.

En la presente invención los adenovirus oncolíticos llegan a las células tumorales diana, una vez dentro se replican, se expresan las proteínas de la cápside y al mismo tiempo se expresa la hialuronidasa contenida en el

15 genoma adenoviral. Esta hialuronidasa ha sido modificada para ser liberada al medio extracelular que envuelve las células. En el medio extracelular, la hialuronidasa destruye la matriz y ayuda a que los adenovirus que se han replicado puedan infectar las células tumorales vecinas.

2 o Así, un aspecto de la invención se refiere a un adenovirus oncolítico que comprende una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma.

Tal y como se usa aquí, el término "adenovirus oncolítico" significa un

2 5 adenovirus que es capaz de replicarse o que es competente en replicación en la célula tumoral. En esta descripción adenovirus oncolítico y adenovirus replicativo son sinónimos. Se diferencian de un adenovirus no replicativo porque este último es incapaz de replicarse en la célula diana. Los adenovirus no replicativos son los utilizados en terapia génica como

3 o portadores de genes a las células diana puesto que se busca expresar el gen terapéutico dentro de la célula intacta y no la lisis de la célula. En cambio, la acción terapéutica de los adenovirus oncolíticos se basa precisamente en la capacidad de replicarse y lisar la célula diana, y en particular la célula tumoral que se quiere eliminar.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus oncolítico, junto con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

5 Otro aspecto de la invención se refiere al adenovirus oncolítico de la invención para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al adenovirus oncolítico de la invención para el tratamiento de un cáncer o de un estado pre-maligno del

1 o mismo, en un mamífero incluyendo un humano

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del adenovirus oncolítico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o de un estado pre-maligno del mismo, en un mamífero incluyendo un humano. El

15 tratamiento se basa en la replicación de estos adenovirus oncolíticos en tumores. Alternativamente, este aspecto de la invención se puede formular como un método para el tratamiento en un mamífero incluyendo el hombre, de un cáncer o de un estado pre-maligno del mismo, que comprende la administración a dicho mamífero, de una cantidad efectiva del adenovirus

2 o oncolítico.

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector lanzadera que es capaz de recombinar con un genoma adenoviral, para la construcción del adenovirus oncolítico de la invención. Este vector comprende secuencias

2 5 repetidas terminales invertidas adenovirales ("inverted terminal repeats", ITRs), una secuencia que promueve la expresión de la secuencia que codifica la enzima hialuronidasa, la secuencia que codifica la enzima y una secuencia de poliadenilación.

3 o En una realización particular, el adenovirus oncolítico de la invención es un adenovirus humano, es decir que infecta humanos. Particularmente, el adenovirus humano se selecciona del grupo que consiste en los adenovirus humanos de serotipo 1-51 y derivados de los mismos. Se entiende por "derivado" un adenovirus recombinante híbrido de dos o más serotipos

35 diferentes de adenovirus, p.ej. un adenovirus serotipo 5 con la fibra del adenovirus serotipo 3. En una realización particular de la invención, el adenovirus oncolítico humano es de serotipo 5.

Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido

hialurónico. En el hombre existen 6 genes que codifican para hialuronidasas

con propiedades y localizaciones diferentes. Las isoformas Hyal1 y Hyal2 se

5

encuentran en la mayoría de tejidos, siendo Hyal1 la forma predominante en

el plasma humano. La Hyal3 se localiza en medula ósea y en los testículos,

pero su función no está bien caracterizada. La hialuronidasa PH20 se

encuentra altamente expresada en los testículos y está implicada en el

proceso de fertilización del oocito por parte del espermatozoide. La

1 o

hialuronidasa PH20 se encuentra anclada en la membrana plasmática y en la

membrana acrosomal interna de los espermatozoides y confiere al

espermatozoide la capacidad para penetrar a través de la matriz extracelular

de las células del cumulus (rica en ácido hialurónico) para alcanzar la zona

pelúcida del oocito. Durante la reacción acrosomal, parte de las

15

hialuronidasas ancladas en la membrana del espermatozoide son

procesadas enzimáticamente para dar lugar a una forma soluble de la

proteína que es liberada de la membrana acrosomal. Además, la

hialuronidasa se ha identificado como el factor de dispersión del veneno de

serpientes, arañas, escorpiones y avispas.

20

En una realización particular, la enzima hialuronidasa es una hialuronidasa

testicular de mamífero, y más particularmente, la hialuronidasa testicular

humana. La hialuronidasa testicular humana (GenBank GeneiD: 6677)

también se conoce como SPAM1 o molécula de adhesión del

2 5

espermatozoide 1 ("sperm adhesion molecule 1 "), y PH-20. La proteína de

membrana PH20, es la única enzima de la familia de las hialuronidasas de

mamífero con actividad a pH neutro. El gen que la codifica produce dos

variantes transcripcionales: la variante 1, más larga, que codifica por la

isoforma 1 de la proteína (número de acceso al GenBank NP _0031 08.2) y la

3o

variante 2, que utiliza un splicing alternativo en la región codificante 3'

comparado con la variante 1, que resulta en una isoforma 2 con un extremo

C' terminal más corto (número de acceso al GenBank NP _694859.1 ).

En una realización particular de la invención, la secuencia de la enzima tiene

3 5

eliminada la secuencia correspondiente al dominio carboxiterminal de unión a

membrana para que la enzima sea soluble (ver FIG. 2). La eliminación de

este dominio carboxiterminal resulta en la secreción de la hialuronidasa al

medio extracelular. Así, se ha obtenido un adenovirus oncolítico que expresa una hialuronidasa secretada con actividad enzimática a pH neutro. En una realización particular, la secuencia que se inserta en el genoma adenoviral es una que codifica la SEQ ID NO: 2. En una realización más particular, la

5 secuencia que se inserta es la SEO ID NO: 1.

En otra realización, la secuencia de la enzima está insertada en el adenovirus oncolítico después de la secuencia de nucleótidos de la fibra adenoviral.

1 o En otra realización particular, la expresión de la enzima está controlada por un promotor operativo en células animales. Particularmente, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor del citomegalovirus, el promotor principal tardío del adenovirus, el promotor SV40, el promotor de la timidin quinasa del herpes simplex virus, el promotor RSV, el promotor EF1

15 alfa, el promotor de la beta-actina, el promotor de la IL-2 humana, el promotor de la IL-4 humana, el promotor de IFN, el promotor de E2F y el promotor humano GM-CSF. El promotor que regula la expresión de la enzima puede estar en el adenovirus de manera natural como es el caso del promotor principal tardío del adenovirus (ver FIG. 1 (a), MLP, "major late promotor"). El

2 o promotor también puede insertarse junto con la secuencia que codifica la enzima. En una realización preferida, el promotor es el promotor principal tardío del adenovirus.

El adenovirus replicativo de la invención puede tener modificaciones en su

2 5 secuencia genómica que le confieran una replicación selectiva en células tumorales. En una realización particular esto se consigue con la incorporación de un promotor específico de tejido o un promotor específico de tumor, donde dicho promotor controla la expresión de uno o más genes del grupo E1 a, E1 b, E2 y E4. Particularmente el promotor se selecciona del grupo que

30 consiste en el promotor de E2F, el promotor de la telomerasa hTERT, el promotor de la tirosinasa, el promotor del antígeno específico de próstata (PSA), el promotor de la alfa-fetoproteína, el promotor de la COX-2, así como promotores artificiales formados por varios sitios de unión a factores de transcripción como sitios de unión para el factor inducible por hipoxia (HIF-1 ),

3 5 el factor de transcripción Ets, el factor citotóxico tumoral (tcf), el factor de transcripción E2F o el factor de transcripción Sp1. Preferiblemente el promotor controla la expresión de E1 a.

Otra modificación para conseguir replicación selectiva en tumores es la

eliminación de funciones tempranas de E1A que bloquean la vía de

retinoblastoma (RB). Otros genes virales que interaccionan directamente con

5

pRB como E4 y E4orf6/7 respectivamente, son candidatos a ser eliminados

para conseguir replicación selectiva en células tumorales. Como se ilustra en

los ejemplos, el adenovirus oncolítico ICOVIR17 se caracteriza por contener

simultáneamente el gen de la hialuronidasa, la eliminación ~24 que afecta a

la interacción de E1 a con pRB, la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1

10

y un sitio de unión a Sp1 en el promotor endógeno de E1a para controlar la

expresión de E1a, y finalmente, la inserción del péptido RGD en la fibra

adenoviral para aumentar la infectividad del virus. El ICOVIR17 es una

realización preferida de la invención.

15

Otra modificación descrita para conseguir replicación selectiva en tumores es

la eliminación de los genes adenovirales que codifican los ARN asociados al

virus (VA-RNAs). Estos RNAs bloquean la actividad antiviral del interferón y

su eliminación resulta en adenovirus sensibles a ser inhibidos por interferón.

Puesto que las células tumorales se caracterizan por truncar la vía de

2 o

interferón dichos adenovirus se replican normalmente en tumores. Así, en

otra realización particular, la replicación selectiva en tumores se consigue con

mutaciones en uno o más genes del grupo E1a, E1b, E4 y VA-RNAs del

adenovirus. Preferiblemente las mutaciones son en E1 a.

2 5

Estas dos estrategias para conseguir la replicación selectiva en tumores no

son excluyentes entre sí.

En otra realización de la invención, el adenovirus tiene modificaciones en su

cápside para aumentar su infectividad o dirigirlo a un receptor presente en

3o

una célula tumoral. En una realización más preferida las proteínas de la

cápside adenoviral se han modificado genéticamente para incluir ligandos

que aumentan la infectividad o que dirigen el virus a un receptor en la célula

tumoral. Dirigir el adenovirus al tumor también se puede conseguir con

ligandos bifuncionales que unen al virus por un lado y al receptor tumoral por

3 5

otro. Por otro lado, para aumentar la persistencia del adenovirus en sangre y

con ello aumentar las posibilidades de alcanzar nódulos tumorales

diseminados, la cápside puede cubrirse con polímeros como el

polietilenglicol.

En otra realización particular, el adenovirus comprende una secuencia que

5

optimiza la traducción proteica de la secuencia que codifica la hialuronidasa.

En otra realización particular, el adenovirus comprende una secuencia que

promueve la expresión de la secuencia que codifica la hialuronidasa. Más

particularmente, esta secuencia se selecciona del grupo que consiste en una

1o

secuencia de corte y empalme que permite el procesamiento del RNA, una

secuencia IRES ("interna! ribosome entry site"), y la secuencia 2A de

picornavirus.

En otra realización particular, el adenovirus oncolítico a su vez comprende

15

otros genes insertados en su genoma usados comúnmente en el campo de

terapia génica del cáncer para aumentar la citotoxicidad de los adenovirus

oncolíticos sobre células tumorales. Algunos de ellos son el gen de la timidina

quinasa, el de la citosina deaminasa, genes proapoptóticos,

inmunoestimuladores, supresores tumorales o activadores de prodrogas.

20

Estas modificaciones en el genoma del adenovirus no son excluyentes entre

ellas. Existen varios métodos para manipular el genoma adenoviral. Los

métodos de construcción de adenovirus modificados genéticamente están

bien establecidos en el campo de la terapia génica y la viroterapia con

2 5

adenovirus. El método más comúnmente utilizado se basa en construir

primero la modificación genética deseada en un plásmido que contiene la

región adenoviral a modificar, para después realizar una recombinación

homóloga en bacterias con un plásmido que contiene el resto del genoma

viral.

30

El adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa objeto de la presente

invención se propaga y amplifica en líneas celulares normalmente utilizadas

en el campo de la terapia génica y viroterapia como las líneas HEK-293 y

A549. El método preferido de propagación es por infección de una línea

3 5

celular permisiva a la replicación del adenovirus. La línea de adenocarcinoma

pulmonar A549 es un ejemplo de línea con tales características. La

propagación se realiza por ejemplo del siguiente modo: Las células A549 se

crecen sobre placas de cultivo celular de plástico y se infectan usando 100 partículas virales por célula. Dos días después el efecto citopático que refleja la producción de virus se observa como un arracimamiento de las células. Las células se recogen y se almacenan en tubos. Después de una

5 centrifugación a 1000 g durante 5 minutos, el precipitado celular se congela y descongela tres veces para romper las células. El extracto celular resultante se centrifuga a 1000 g durante 5 minutos y el sobrenadante con virus se carga encima de un gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 1 hora a 35000 g. La banda de virus obtenida del gradiente se carga de nuevo

1o sobre otro gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 16 horas a 35000 g. La banda de virus se recoge y se dializa frente a PBS-1 O% glicerol. El virus dializado se alicuota y almacena a -80 °C. La cuantificación del número de partículas y unidades formadoras de placa se realiza siguiendo protocolos estándar. El tampón fosfato salino (PBS) con glicerol al 5% es una

15 formulación estándar para el almacenamiento de adenovirus. Sin embargo se han descrito nuevas formulaciones que mejoran la estabilidad del virus. Los métodos de purificación del adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa para su utilización en el tratamiento del cáncer son los mismos que los descritos para otros adenovirus y vectores adenovirales utilizados en

2o viroterapia y terapia génica del cáncer.

El adenovirus oncolítico de la presente invención puede ser administrado a un mamífero, preferiblemente un humano. El propósito de la administración del adenovirus oncolítico es terapéutico, incluyendo, pero no limitándose a,

2 5 melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de colon y cáncer de pulmón. También se contempla la administración del adenovirus oncolítico en estadios pre-malignos de un tumor.

Se entiende que el adenovirus oncolítico se administra en una forma

3o farmacéutica mente aceptable. Los expertos en la materia pueden asegurarse de la dosis apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis debe ser una cantidad efectiva del adenovirus oncolítico para que produzca una reducción del tumor en el individuo tratado. La administración puede ser directa del virus al tumor, en la cavidad donde se localiza el tumor,

3 5 en la vascularura del tumor, alrededor del tumor, o por la inyección endovenosa sistémica en el paciente. Preferiblemente, la administración es sistémica.

Los protocolos para usar los virus descritos en la presente invención en el tratamiento del cáncer siguen los mismos procedimientos que los usados en los campos de viroterapia con adenovirus y terapia génica con adenovirus.

5 Existe una amplia experiencia en el uso de adenovirus no oncolíticos y oncolíticos en el campo de la terapia génica. Existen numerosas publicaciones de tratamiento de células tumorales en cultivo, en modelos animales y en ensayos clínicos con pacientes. Para el tratamiento de células en cultivos in vitro el adenovirus purificado en cualquiera de las formulaciones

1 o descritas más arriba se añade al medio de cultivo para la infección de las células tumorales. Para tratar tumores en modelos animales o en pacientes humanos el adenovirus se puede administrar loco-regionalmente por inyección en el tumor o en una cavidad corporal donde se localiza el tumor, o bien sistémicamente por inyección en el torrente sanguíneo.

15 El adenovirus oncolítico de la invención puede administrarse solo o en una composición con transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. El experto en el tema adaptará la composición dependiendo del modo particular de administración. Las composiciones pueden comprender el

2o adenovirus oncolítico como único agente contra el tumor, o en combinación con otro agente terapéutico como un fármaco quimioterapéutico o un vector con un gen terapéutico insertado. También puede combinarse la terapia con el adenovirus oncolítico con radioterapia.

2 5 A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los comúnmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la

3 o palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de

35 ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 (a) muestra la estructura de adenovirus oncolíticos caracterizados

por contener y expresar el gen de la hialuronidasa PH20. El adenovirus

5

AdwtRGD-PH20 contiene el gen de la proteína PH20 inserido detrás del gen

de la fibra adenoviral. La expresión del gen de la proteína PH20 está

regulada por el promotor principal tardío (MLP) del adenovirus mediante la

inserción de la secuencia de corte y empalme lila del adenovirus (SA) delante

del gen de la proteína PH20. La traducción proteica de dicho gen está

1 o

optimizada gracias a la introducción de la secuencia kozac (K) justo antes de

la secuencia de inicio de la traducción. Los adenovirus ICOVIR15 e

ICOVIR17 son adenovirus de replicación selectiva en tumores. Se

caracterizan por contener 4 sitios de unión a E2F y un sitio de unión a Sp1 en

el promotor endógeno de E1 a. Además, ICOVIR17, contiene el gen de la

15

hialuronidasa PH20 del mismo modo que el adenovirus salvaje AdwtRGD

PH20.

La FIG. 1 (b) muestra la secuencia incorporada en el adenovirus Adil24RGD

sustituyendo su secuencia del nucleótido 419 al 422. Esta incorporación se

2 o

realiza para insertar cuatro sitios de unión a los factores E2F-1 y un sitio de

unión al factor Sp1. La secuencias subralladas como "nt 385-419" y "nt 422

461) corresponden a las salvajes de Adil24RGD.

La FIG. 1 (e) muestra el casete completo integrado en los genomas de

25

ICOVIR17 y AdwtRGD-PH20 respecto a los genomas de ICOVIR15 y

AdwtRGD (SEQ ID NO: 4). Se indica la secuencia aceptara de splicing lila, la

secuencia Kozac y la secuencia de poliadenilación (poiA). La secuencia

codificante para la proteína PH20 va de la secuencia kozac a la secuencia de

poliadenilación.

30

La FIG. 2 muestra la secuencia aminoacídica de la proteína PH20 (SEQ ID

NO: 2) y representación gráfica hidropática según el algoritmo de Kyte-

Doolittle. La proteína PH20 es una proteína de membrana presente en la

membrana plasmática y acrosomal de los espermatozoides. (a) La secuencia

3 5

aminoacídica muestra la secuencia hidrofóbica responsable del anclaje de la

proteína en la membrana (secuencia señalada con subrayado). En la

presente invención, la proteína PH20 expresada por los virus, presenta una

cola hidrofóbica eliminada. El punto de corte se muestra dentro de un círculo. De ésta forma, la proteína PH20 es secretada al medio extracelular. (b) Representación gráfica hidropática de los últimos 100 aminoácidos de la proteína PH20 según Kyte-Doolittle. Con una flecha se indica el inicio de la

5 cola hidrofóbica que ha sido eliminada.

La FIG. 3 es una demostración de que los adenovirus oncolíticos que contienen el gen de la hialuronidasa PH20 expresan una proteína soluble que presenta actividad hialuronidasa. Para demostrar que la proteína PH20

1 o expresada por los adenovirus oncolíticos es liberada al medio extracelular y presenta actividad hialuronidasa, las células A549 fueron infectadas con los adenovirus AdwtRGD, AdwtRGD-PH20, ICOVIR15 e ICOVIR17. Después de 48 horas, el sobrenadante se recogió, se concentró y se incubó toda la noche con una solución de ácido hialurónico. Los productos de degradación del

15 ácido hialurónico (oligosacáridos formados por un número variable de unidades de disacáridos) fueron analizados mediante una electroforesis en un gel de poliacrilamida. Los geles muestran como las muestras de ácido hialurónico incubadas con los sobrenadantes de los virus que expresan la hialuronidasa PH20 han sido digeridas dando lugar a oligosacaridos de

2o diferentes tamaños. Las muestras incubadas con los sobrenadantes de los adenovirus controles (AdwtRGD e ICOVIR15) presentan el ácido hialurónico sin digerir.

La FIG. 4 es una demostración de que la inserción y expresión del gen de la

2 5 hialuronidasa PH20 no interfiere en la replicación viral de un adenovirus de replicación selectiva de tumor. Se infectaron células de las líneas A549 (a) y SKMel28 (b) con los adenovirus oncolíticos ICOVIR15 e ICOVIR17 (que se diferencia de ICOVIR15 por contener el gen de la PH20) y se midió la cantidad de virus de los extractos celulares (virus total, eje de las x, en TU/mi)

30 a diferentes tiempos (eje de las y, en horas post-infección). Las gráficas muestran como las cinéticas de producción viral son idénticas para los dos virus, demostrando que la inserción y expresión del gen de la hialuronidasa PH20, en el adenovirus ICOVIR17, no afecta a la replicación viral.

3 5 La FIG. 5 muestra la eficacia oncolítica in vitro de un adenovirus oncolítico que contiene y expresa el gen de la hialuronidasa PH20. La capacidad oncolítica de un adenovirus que expresa la hialuronidasa PH20 (ICOVIR17) se comparó con la de un virus oncolítico similar pero sin el gen de la hialuronidasa PH20 (ICOVIR15) en dos líneas tumorales que expresan gran cantidad de ácido hialurónico in vitro, las SKMel28 (a) y las PC3 (b). El efecto citopático (CPE) que el virus induce se mide como una disminución de la

5 cantidad de proteína en una monocapa celular infectada (método BCA). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 1 0000 células por pocillo. Al día siguiente las células se infectaron con diluciones seriadas de virus. Las células infectadas se incubaron durante 5 días, se lavaron con PBS y se medió la cantidad de proteína restante en el pocillo. Los resultados muestran

1o que in vitro, la expresión de la hialuronidasa PH20 no mejora la capacidad oncolítica del adenovirus, siendo las curvas de citotoxicidad idénticas para los dos virus. Se representa el % de supervivencia celular vs. TU/células.

La FIG. 6 es una demostración in vivo de la capacidad antitumoral de un

15 adenovirus oncolítico que expresa la hialuronidasa PH20. Se inocularon células de melanoma humano (SKMel28) en cada flanco posterior de ratones atímicos de la cepa Balb/c. Una vez los tumores alcanzaron una media de 150 mm3 , fueron inyectados con PBS o 1x10e8 unidades de transducción de AdwtRGD-PH20 (10 tumores/grupo). (a) La gráfica muestra la media del

20 crecimiento de los tumores (en%) de cada grupo respecto al día Oen función del tiempo post-administración (en días). El resultado demuestra que un adenovirus oncolítico que expresa el gen de la hialuronidasa PH20 presenta una elevada capacidad antitumoral, significativamente distinta al grupo control (PBS), p<0.00001. El 100% de los tumores inyectados con el

25 AdwtRGD-PH20 regresaron entre un 10-50 % a día 27 post-inyección, frente a un O% de regresión en el grupo inyectado con PBS. (b) La cantidad de ácido hialurónico de los tumores inyectados con PBS o AdwtRGD-PH20 fue analizado al final del experimento por inmunohistoquímica. Las fotografías muestran que los tumores inyectados con el AdwtRGD-PH20 presentan una

3 o cantidad de ácido hialurónico inferior a los tumores controles.

La FIG. 7 muestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 mejora el efecto antitumoral de un adenovirus oncolítico después de su administración intratumoral. Se inocularon células de melanoma humano (SKMel28) en cada

3 5 flanco posterior de ratones atímicos de la cepa Balb/c. Una vez los tumores alcanzaron una media de 130 mm3 , los tumores fueron inyectados con PBS o 1x10e8 unidades de transducción de ICOVIR15 e ICOVIR17 (10 tumores/grupo) en una única dosis. (a) La gráfica muestra la media del crecimiento de los tumores (en%) de cada grupo respecto al día Oen función del tiempo post-administración (en días). El adenovirus oncolítico que expresa la hialuronidasa PH20 (ICOVIR17) presenta un mejor efecto

5 antitumoral que el adenovirus control que no expresa dicha hialuronidasa (ICOVIR15). (b) Después de 42 días de tratamiento, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron extraídos y pesados. La tabla muestra un resumen de los valores de volumen tumoral, porcentaje de crecimiento tumoral y peso de los tumores al final del experimento. Los tumores

1o inyectados con ICOVIR17 presentan un peso tumoral significativamente inferior a los tumores inyectados con ICOVIR15 (* p<0.05) y a los tumores inyectados con PBS (# p<0.05). A diferencia de los resultados obtenidos in vitro, donde los virus pueden difundir sin dificultad por la monocapa de células, los resultados in vivo demuestran que en el interior de un tumor,

15 donde la matriz extracelular dificulta la correcta distribución del virus, la expresión de la hialuronidasa PH20 incrementa la potencia antitumoral de un adenovirus oncolítico.

La FIG. 8 muestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 mejora el efecto

2o antitumoral de un adenovirus oncolítico después de su administración sistémica. Se inocularon células de melanoma humano (SKMel28) en cada flanco posterior de ratones atímicos de la cepa Balb/c. Una vez los tumores alcanzaron una media de 100 mm3 , los ratones fueron inyectados con PBS ó 5x10e10 partículas físicas de ICOVIR15 e ICOVIR17 (ICOVIR15 armado con

25 PH20)(8-10 tumores/grupo) por vía endovenosa. (a) La gráfica muestra la media del crecimiento de los tumores (en%) de cada grupo respecto al día O en función del tiempo post-administración (en días). El resultado demuestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 resulta en un aumento de la potencia oncolítica del adenovirus, siendo la supresión del crecimiento

3 o tumoral inducida por ICOVIR17 significativamente mejor a la del grupo control (ICOVIR15), * p<0.00001. (b) Las fotografías muestran la distribución de los adenovirus ICOVIR15 e ICOVIR17 por las masas tumorales, extraídas al final del experimento (día 48). Los tumores de los ratones inyectados con el adenovirus oncolítico ICOVIR17 muestran zonas necróticas muy extensas

35 (flecha gruesa), zonas con células viables muy reducidas (v), y grandes y numerosos focos de replicación viral (zonas con fluorescencia verde

indicadas con flechas delgadas) en comparación con los tumores inyectados

con el adenovirus control, ICOVIR15.

EJEMPLOS

5

Construcción de los adenovirus oncolíticos

Se construyeron dos adenovirus oncolíticos que contenían el gen de la

hialuronidasa PH20, el adenovirus AdwtRGD-PH20 y el adenovirus

10

ICOVIR17.

El cONA de la hialuronidasa PH20 se obtuvo mediante la amplificación por

PCR de los diferentes exones de la proteína a partir del genoma de la línea

celular A549 y la posterior unión de estos exones con oligonucleótidos

15

específicos que contienen la diana del enzima de restricción Mfel. El

fragmento resultante se digirió con Mfel y se clonó por ligación en el plásmido

lanzadera, pNKFiberRGD (que contiene la secuencia de la fibra adenoviral

modificada con RGD), para dar lugar al plásmido pNKFiberPH20. El cONA

correspondiente a la proteína PH20 clonada en el plásmido pNKFiberPH20

2 o

se muestra en la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 muestra los nucleótidos

codificantes para la proteína PH20 (isoforma con número de acceso al

GenBank NP _694859.1) desde su inicio de transcripción (ATG) hasta la

posición 1467. La secuencia nucleotídica de la región 1468 a la 1527 codifica

para la cola hidrofóbica de la proteína, responsable de su anclaje a la

2 5

membrana. Dicha secuencia ha sido eliminada y no se muestra en la

secuencia. Después del nucleótido 1468 se ha añadido el codón de parada

de la traducción T AA.

Construcción del adenovirus AdwtRGD-PH20: Para generar el adenovirus

30

AdwtRGD-PH20, el gen de la fibra adenoviral del plásmido pVK50cau (que

contiene la secuencia completa del Ad5 con una diana Swal en la fibra) fue

reemplazado por recombinación homóloga en levaduras por el gen de la fibra

seguido del gen de la hialuronidasa PH20 del plásmido pNKFiberPH20

digerido con Noti/Kpnl.

35

El adenovirus AdwtRGD-PH20, caracterizado por expresar el gen de la

hialuronidasa PH20 bajo el control del promotor principal tardío, y contener el

tripéptido RGD en la fibra adenoviral, se generó por digestión con Pacl del plásmido pAdwtRGD-PH20 y transfección en células HEK293. El adenovirus AdwtRGD, previamente descrito, se caracteriza por contener el tripéptido RGD en la fibra adenoviral (cfr. M. Majem et al., "Control of E1A under an

5 E2F-1 promoter insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD", Cancer gene therapy 2006, vol. 13, pp. 696-705). El AdwtRGD se construyó mediante digestión del plásmido pVK503 que contiene el genoma de Ad5 completo con la fibra modificada RGD (cfr. l. Dmitriev et al., "An adenovirus vector with genetically

1 o modified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism",

J. Vi rol. 1998, vol. 72, pp. 9706-13) con Pacl y posterior transfección de células 293.

15 Construcción del adenovirus ICOVIR17: Para generar este adenovirus se usó el plásmido adenoviral piCOVIR17. Para generar este plásmido, el gen de la fibra adenoviral del plásmido piCOVIR15 fue reemplazado por recombinación homóloga en levaduras por el gen de la fibra seguido del gen de la hialuronidasa PH20 del plásmido pAdwtRGD-PH20 digerido con Spei/Pacl.

20 El adenovirus ICOVIR15, proviene del adenovirus Ad~24RGD que se caracteriza por contener la eliminación ~24 en la secuencia codificante para la proteína E1 a. Esta eliminación afecta a la interacción de E1 a con pRB. Ad~24RGD también tiene la inserción del péptido RGD en la fibra adenoviral

2 5 para aumentar la infectividad del virus. Estas dos modificaciones se describen en K. Suzuki et al., "A conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency", Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6. A partir de Ad~24RGD, se realizará la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Sp1 en el promotor

30 endógeno de E1a para controlar la expresión de E1a. Así se obtiene ICOVIR15. Esta inserción se realizó mediante sustitución de la secuencia 419-422 del genoma por la secuencia con los 4 sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Sp1, de manera que la secuencia final es la que figura en la SEQ ID NO: 3 y la FIG. 1 (b). Para realizarlo se creó un sitio único de corte

35 BsiWI por mutagénesis dirigida en el promotor E1A del pEndK/Spe (cfr. J.E. Carette et al., "Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer ce lis", Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7). El sitio de unión a Sp1 se introdujo en el plásmido pEndK/Spe con el sitio BsiWI mediante la ligación de dicho plásmido digerido con BsiWI con los oligonucleótidos Sp1F (5'-GTACGTCGACCACAAACCCC GCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3' SEQ ID NO: 5) y Sp1R (5'

5 GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGGTCG AC-3' SEQ ID NO: 6) emparejados entre sí. Los sitios de unión a E2F se introdujeron mediante la unión de los oligonucleótidos E2FF2 (5'-GTACGTCG GCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTG GTTCGAA-3' SEQ ID NO: 7) y E2FR2 (5'-GTACTTCGAACCACTTTTACGCG

1o CCAAA TCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCCGAC-3' SEQ ID NO: 8) emparejados entre sí, para crear el plásmido pEndK415Sp1 E2F2. A continuación se introdujo por recombinación homóloga en levaduras la secuencia CAU, que contiene los elementos necesarios para la replicación del plásmido en levaduras (un -ºentrómero, la secuencia de recombinación

15 autónoma ARS y el marcador de selección URS3, para crear el plásmido pEndK415Sp1 E2F2CAU. Finalmente, se realizó una recombinación homóloga en levaduras del plásmido pEndK415Sp1 E2F2CAU digerido con Kpnl con el genoma adenoviral del adenovirus Adl124RGD para construir el piCOVIR15cau. ICOVIR15 se obtuvo por transfección de la digestión Pacl del

20 piCOVIR15cau a células HEK293.

El virus ICOVIR17, que contiene las mismas modificaciones que ICOVIR15, más la inserción del gen de la hialuronidasa detrás del gen de la fibra adenoviral, se generó por digestión con Pacl del plásmido piCOVIR17 y

2 5 transfección en células HEK293. La estructura correcta de los geno mas de AdwtRGD-PH20 e ICOVIR17 se verificó por restricción con Hindlll. Adicionalmente se secuenció la región del gen PH20 con oligonucleótidos específicos.

30 El casete completo integrado en los genomas de ICOVIR17 y AdwtRGDPH20 respecto a los genomas de ICOVIR15 y AdwtRGD se representa en la FIG. 1 (e) y en la SEQ ID NO: 4: La secuencia codificante para la proteína PH20 va de la secuencia kozac a la secuencia de poliadenilación.

3 5 Expresión de una proteína soluble con actividad hialuronidasa por un adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa PH20 Para demostrar que un adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa PH20 expresa una proteína soluble con actividad hialuronidasa se procedió a infectar cultivos celulares de la línea A549 con los virus AdwtRGD, AdwtRGDPH20, ICOVIR15 e ICOVIR17 usando una multiplicidad de infección que

5 permitía más del 80% de infección (20 M.OI). Después de 24 h postinfección, el medio de infección se retiró y se añadió medio fresco. Después de 24 h más, el medio fresco (o sobrenadante) se recogió y se concentró por filtración en una columna de Amicon Ultra-4 (Millipore, Billerica, USA), según las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes concentrados se

10 incubaron toda la noche a 37 oc con una solución de ácido hialurónico (1.5 mg/ml) en un tampón fosfato (pH=6) que contenía 0.1 M NaCI y 0.05 % BSA. El ácido hialurónico digerido se analizó mediante una electroforesis en un gel de poliacrilamida al15% (cfr. M. lkegami-Kawai et al., "Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its

15 application to assay of hyaluronidase activity", Analytical biochemistry 2002, vol. 311, pp. 157-65). Los oligosacáridos resultantes de la digestión del ácido hialurónico se fijaron en la matriz del gel mediante un baño de 30 min en una solución de azul alcian. Finalmente, los oligosacáridos fueron teñidos con nitrato de plata. El resultado se muestra en la FIG. 3. Se demuestra que los

2 o sobrenadantes de las células infectadas con los adenovirus que contienen el gen de la hialuronidasa PH20 (AdwtRGD-PH20 e ICOVIR17) contienen una proteína soluble capaz de digerir el ácido hialurónico (un polisacárido de elevado peso molecular) en oligosacáridos de 5 a más de 50 unidades repetidas de disacáridos.

25 Ausencia de efectos en la replicación viral y en la citotoxicidad in vitro del adenovirus oncolítico que expresa el gen de la hialuronidasa PH20

Para comprobar que la inserción del gen de la hialuronidasa PH20 no

3o afectaba a la replicación viral, se infectaron células de las líneas tumorales A549 y SKMel-28 con los adenovirus oncolíticos ICOVIR15 e ICOVIR17. Después de 4 h post-infección, el medio se retiró y se añadió medio fresco. Los extractos celulares totales se recogieron a diferentes tiempos postinfección y se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación para

35 liberar el virus. La cantidad de virus en el extracto celular se determinó por infección en HEK293 y tinción anti-hexón (cfr. M. Majem supra). El resultado se muestra en la FIG. 4. La inserción del gen de la hialuronidasa PH20 no afecta a la replicación del adenovirus ICOVIR17, siendo ésta idéntica a la del adenovirus control.

Para demostrar el efecto de la expresión de la hialuronidasa PH20 en la

5 citotoxicidad de un adenovirus oncolítico in vitro, se infectaron células de las líneas tumorales PC3 y SKMel-28 con diluciones seriadas de los virus ICOVIR15 e ICOVIR17. Cinco y seis días post-infección, respectivamente, se evaluó espectrofotométricamente la cantidad de proteína como reflejo de la supervivencia celular. Los resultados se muestran en la FIG. 5. La capacidad

1o lítica de ICOVIR17 en las dos líneas tumorales es la misma que la de ICOVIR15, indicando que la expresión de la hialuronidasa PH20 no aporta ninguna ventaja in vitro.

Utilización del adenovirus que se replica y que contiene el gen de la 15 hialuronidasa PH20 para tratar eficazmente tumores

Se realizó un experimento in vivo con ratones atímicos de la cepa Balb/c que contenían tumores SKMel-28. Un total de 5 x 106 células tumorales de la línea SKMel-28 se inyectaron subcutáneamente en cada flanco posterior del

20 ratón. Después de 21 días los ratones con tumores formados (que alcanzan 150 mm3) se distribuyeron en los distintos grupos experimentales (n=1 Opor grupo). Los tumores del grupo control recibieron una única inyección intratumoral de tampón salino (20 !JI). Los ratones del grupo tratado con AdwtRGD-PH20 recibieron una inyeccion intratumoral (20 !JI) de 1 x1 08

25 unidades de transducción del virus por tumor (equivalente a 2x1 09 partículas virales ó vp). Los tumores se midieron cada dos o tres días con un pie de rey y su volumen se estimó según la fórmula: V (mm3)= A (mm) x 82 (mm2) x rr/6, en donde A es la longitud mayor o longitudinal, y B es la longitud transversal. La FIG. 6 muestra el porcentaje de crecimiento tumoral respecto al inicio del

30 tratamiento (día 0). Los resultados se presentan como media± S.E. La existencia de diferencias significativas entre los resultados se calculó usando un ensayo no paramétrico de datos no apareados de Mann-Whitney. Las curvas de crecimiento se compararon usando un análisis de la variancia. Los resultados se consideraron significativos si p<0.05. El tratamiento de los

3 5 tumores con el adenovirus AdwtRGD-PH20 dio lugar a una regresión tumoral en el 100 % de los tumores tratados. El % de crecimiento tumoral fue significativamente menor al grupo control des de los primeros días postinyección. El análisis de los tumores al final del experimento reveló una disminución en la cantidad de ácido hialurónico contenido la matriz extracelular de los tumores inyectados con el AdwtRGD-PH20.

5 En otro experimento el tratamiento se realizó por inyección intratumoral de ICOVIR15 e ICOVIR17. Se implantaron tumores de la línea celular de melanoma humana SKMel-28 en ratones atímicos Balb C nu/nu, y una vez establecidos fueron tratados por administración intratumoral de PBS o 1 x1 08 unidades de transducción de los virus ICOVIR15 e ICOVIR17 (equivalente a

10 2x109 partículas virales ó vp). Los resultados se muestran en la FIG. 7. El tratamiento con ICOVIR17 demostró actividad oncolítica que resultó en una supresión del crecimiento tumoral significativamente distinta al grupo control (PBS), p<0.05. Al final del experimento los tumores fueron extraídos y pesados. La tabla de la FIG. 7 muestra las medias de volumen tumoral,

15 porcentaje de crecimiento tumoral y peso de los tumores al finalizar el experimento. El peso de los tumores inyectados con ICOVIR17 es significativamente inferior al de los tumores tratados con los grupos controles, PBS (# p<0.05) y ICOVIR15 (* p<0.05).

2o En otro experimento el tratamiento se realizó por inyección sistémica de ICOVIR15 e ICOVIR17. Se implantaron tumores de la línea celular de melanoma humana SKMel-28 en ratones atímicos Balb C nu/nu, y una vez establecidos fueron tratados por administración en la vena de la cola con PBS o 5x1010 partículas físicas de los virus ICOVIR15 e ICOVIR17. Los

25 resultados se muestran en la FIG. 8. El tratamiento con ICOVIR17 demostró actividad oncolítica que resultó en una supresión del crecimiento tumoral significativamente distinta a los grupos controles, PBS (# p<0.0001) y ICOVIR15 (* p<0.00001 ). Al finalizar el experimento, los tumores fueron extraídos y congelados en OCT. Las diferentes secciones de los tumores

3 o congelados en OCT se trataron con una anticuerpo a-hexon (proteína de la cápside del adenovirus) y se contratiñeron con 4',6'-diaminidino-2-fenilindol. La actividad antitumoral de ICOVIR17 correlaciona con la replicación del adenovirus a nivel intratumoral, evaluada en los tumores obtenidos a día 48 post-inyección. Los tumores tratados con ICOVIR17 presentan grandes

35 zonas necróticas, una mejor distribución viral, y menos zonas de células viables que los tumores inyectados con ICOVIR15.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Adenovirus oncolítico que comprende una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma.

2. 2.

   Adenovirus oncolítico según la reivindicación 1, donde el adenovirus es un adenovirus humano.

3. 3.

   Adenovirus oncolítico según la reivindicación 2, donde el adenovirus

   1 o humano se selecciona del grupo que consiste en los adenovirus humanos de serotipo 1-51 y derivados de los mismos.

4. 4.

   Adenovirus oncolítico según la reivindicación 3, donde el adenovirus humano es de serotipo 5.

5. 5.

   Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la enzima hialuronidasa es una hialuronidasa testicular de mamífero.

6. 6. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 5, donde la enzima 2 o hialuronidasa es la hialuronidasa testicular humana.
7. 7. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la secuencia de la enzima tiene eliminada la secuencia correspondiente al dominio de unión a membrana para que la enzima sea soluble.
8. 8. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la secuencia de la enzima está insertada en el adenovirus oncolítico después de la secuencia de nucleótidos de la fibra adenoviral.

   3 o 9. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la expresión de la enzima está controlada por un promotor operativo en células animales.

   1O. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 9, donde el promotor se

   3 5 selecciona del grupo que consiste en el promotor del citomegalovirus, el promotor principal tardío del adenovirus, el promotor SV40, el promotor de la timidin quinasa del herpes simplex virus, el promotor RSV, el promotor EF1

   alfa, el promotor de la beta-actina, el promotor de la IL-2 humana, el promotor de la IL-4 humana, el promotor de IFN, el promotor de E2F y el promotor humano GM-CSF.

   5

   11. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el adenovirus comprende un promotor específico de tejido o de tumor, donde dicho promotor controla la expresión de uno o más genes del grupo E1a, E1b, E2 y E4, para conseguir replicación selectiva en tumores.

   1 o 15

   12. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 11, donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de E2F, el promotor de la telomerasa hTERT, el promotor de la tirosinasa, el promotor del antígeno específico de próstata, el promotor de la alfa-fetoproteína, el promotor de la COX-2. 13. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el adenovirus tiene mutaciones en uno o más genes del grupo E1 a, E1b, E4 y VA-RNAs, para conseguir replicación selectiva en tumores.

   2 o

   14. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el adenovirus tiene modificaciones en su cápside para aumentar su infectividad o dirigirlo a un receptor presente en una célula tumoral.

   2 5

   15. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el adenovirus comprende una secuencia que optimiza la traducción proteica de la secuencia que codifica la hialuronidasa.

   3 o

   16. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde el adenovirus comprende una secuencia que promueve la expresión de la secuencia que codifica la hialuronidasa.

   35

   17. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 16, donde la secuencia que promueve la expresión se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de corte y empalme que permite el procesamiento del RNA, una secuencia IRES y la secuencia 2A de picornavirus.

9. 18.

   Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el adenovirus comprende uno o más genes insertados en su genoma.

10. 19.

    Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus oncolítico definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-18, junto con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

11. 20.

    Uso del adenovirus oncolítico definido en cualquiera de las

    1o reivindicaciones 1-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o de un estado pre-maligno del mismo, en un mamífero incluyendo un humano.