CN103614416B - 一种携带人穿膜肽p53与GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种含人类穿膜肽p53基因和GM‑CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途。具体地，本发明涉及一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：穿膜肽编码序列、p53基因或其简并序列、2A连接序列，以及GM‑CSF基因或其简并序列。本发明还涉及含有所述重组溶瘤腺病毒载体的重组溶瘤腺病毒。本发明的重组溶瘤腺病毒可高效感染肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞），在肿瘤细胞内特异增殖、裂解肿瘤细胞，并高效表达人穿膜肽p53与GM‑CSF蛋白，促进肿瘤细胞凋亡，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。本发明提供的重组溶瘤腺病毒可用于多种类型恶性肿瘤的治疗。

Description

一种携带人穿膜肽p53与GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途

技术领域

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种含人类穿膜肽p53基因和GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，随着社会经济的发展，肿瘤的主要危险因素不但未得到有效控制，反而愈演愈烈，是其发病率和死亡率持续上升。目前恶性肿瘤的常规治疗难以收到预期的疗效，特别是化疗药物的治疗指数低，毒副作用大。近几年，包括基因治疗在内的生物治疗成为肿瘤临床中不可或缺的一部分。我国的重组腺病毒p53注射液“Ad-p53”已于2004年上市，成为世界上第一个上市的癌症基因治疗药物（Mol Cancer Ther.2008;7:1598）。

腺病毒是基因治疗最常用的病毒载体，据据J Gene Med统计，截至2013年6月，全球共有1902项基因治疗进入临床试验，其中使用腺病毒作为载体的数量最多，达453项，占总数的23.2%。溶瘤腺病毒是经改造能对肿瘤基因表型的缺陷产生特异性杀伤作用及能特异性把肿瘤药物靶向到肿瘤部位的条件增殖型病毒（Biochim Biophys Acta.2008;1785(2):217-31），其本身具有裂解杀伤肿瘤细胞的能力（如我国上市药物H101，又称Onyx-015），又可介导外源基因高效表达，因而是肿瘤基因治疗理想的载体。利用溶瘤腺病毒携带肿瘤治疗基因，可使治疗基因随病毒的复制增殖DNA拷贝数显著增加，显著提高外源基因的表达量，通过溶瘤病毒与治疗基因的双重作用，促进肿瘤细胞的死亡；释放后的子代病毒又可以感染周围肿瘤细胞，通过级联放大效应，大量杀伤肿瘤细胞。同时，溶瘤腺病毒在肿瘤病灶的作用亦 能引起免疫反应，达到局部的抗肿瘤效果，和其他肿瘤的治疗手段也无任何交叉耐药的作用（Methods Mol Med.2004；90:71-90）。

外源基因方面，溶瘤腺病毒可携带的治疗基因包括，抑癌基因、自杀基因、细胞因子、RNA干扰序列等。其中，应用较为成功的包括p53与GM-CSF。p53是一种转录因子，控制着细胞周期的启动，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。p53的功能包括：阻滞细胞周期；促进细胞调亡；维持基因组稳定；抑制肿瘤血管生成等，同时p53能有效增强免疫反应，是一个良好的肿瘤疫苗。我国首个基因治疗上市药物“今又生”（重组人p53注射液）即采用非增殖型腺病毒携带人p53基因。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF），是由活化的T细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞产生的一种蛋白质因子，能诱导巨噬细胞、树突状细胞（Dendritic Cell,DC）的分化成熟，增强免疫反应。多种溶瘤病毒携带GM-CSF基因的基因-溶瘤病毒治疗系统已经进入临床试验，如单纯性疱疹病毒(T-Vec;Amgen公司)，痘苗病毒（Pexa-Vec；Jennerex公司），腺病毒（KH901；康宏制药股份有限公司），均取得非常不错的临床疗效。

p53基因和GM-CSF基因各自的治疗作用已在多种类型恶性肿瘤（例如肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌等）中得到证实，可以参见Cold Spring HarbPerspect Biol.2010;2(9):a001222；Nat Rev Cancer.2009;9(10):749-58；Immunotherapy.2013;5(8):817-9；Immunol Rev.2002;188:147-54。

目前尚需要一种重组溶瘤腺病毒载体和溶瘤腺病毒，其能够同时高效表达人类p53基因和GM-CSF基因，在肿瘤细胞内特异增殖，并有效地杀伤肿瘤细胞。

发明内容

本发明人结果深入的研究和创造性的劳动，得到了一种重组溶瘤 腺病毒载体和重组溶瘤腺病毒。具体地，该腺病毒E1A由人端粒酶逆转录酶启动子控制；E1B区19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失，作为外源基因表达框的插入位点；E1A与外源基因表达框之间插入一段绝缘子序列，避免两个表达框的互相干扰。穿膜肽p53与GM-CSF基因由组成型强启动子（如CMV启动子、CAG启动子）控制，两者通过Furin-2A相连保证翻译后能剪切形成两个独立的蛋白；p53基因前包含一段11R穿膜蛋白序列，以增强病毒对肿瘤细胞的二次感染效率。

本发明人惊奇地发现，该腺病毒通过肿瘤特异性启动子（人端粒酶逆转录酶启动子）对其增殖必需基因（腺病毒E1A）进行的有效控制及相关片段缺失（E1B区19KDa与55KDa）而具有在肿瘤细胞内选择性增殖能力，特异裂解肿瘤细胞；在肿瘤细胞内同时高效表达穿膜肽p53与GM-CSF蛋白，能直接促进肿瘤细胞凋亡，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。本发明提供的重组溶瘤腺病毒可以多种类型恶性肿瘤的治疗。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含下述外源基因：

穿膜肽编码序列、p53基因（读码框）或其简并序列、2A连接序列，以及GM-CSF基因（读码框）或其简并序列。

具体地，p53基因和GM-CSF基因在同一个表达框内；优选地，p53基因和GM-CSF基因能够各自独立地表达。

根据本发明任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述穿膜肽编码序列、p53基因（读码框）或其简并序列、2A连接序列、GM-CSF基因（读码框）或其简并序列为依次连接。

在本发明的一个实施方案中，穿膜肽编码序列插入到p53基因的起始密码子的后面；即将p53基因的起始密码子移至穿膜肽编码序列的前面。优选地，在穿膜肽编码序列与p53基因读码框（起始密码子ATG已经移至穿膜肽编码序列前面）之间连接编码一个或多个甘氨酸的序 列（优选为GGC）；优选地，所述穿膜肽编码序列－p53基因读码框如SEQ ID NO：4所示。

根据本发明任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体，其可操作地插入或者包含依次连接的下述外源片段：

组成型强启动子、穿膜肽编码序列、p53基因（读码框）或其简并序列、2A连接序列、GM-CSF基因（读码框）或其简并序列、SV40PolyA、第一绝缘子序列。

根据本发明任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体，其特征在于如下的（1）－（13）中的任一项或者多项：

（1）所述穿膜肽编码序列为编码聚精氨酸穿膜肽、单纯性疱疹病毒的VP22蛋白来源穿膜肽、降钙素来源穿膜肽或者艾滋病毒HIV Tat蛋白来源穿膜肽的序列；具体地，为编码11个精氨酸的序列；更具体地，其如SEQ ID NO：9所示；

（2）所述p53基因的序列如SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11所示；

（3）所述连接序列如SEQ ID NO：7所示；

（4）所述GM-CSF基因如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示；

（5）所述穿膜肽编码序列和p53基因之间连接有编码一个或多个甘氨酸的序列；具体地，为GGC；；更具体地，穿膜肽编码序列和p53基因的序列如SEQ ID NO：4所示；

（6）所述组成型强启动子为CMV、CAG、SV40、EF-1α、Ubc或PGK启动子；优选为CMV或CAG启动子；具体地，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；具体地，所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

（7）所述第一绝缘子序列如SEQ ID NO：1所示。

（8）所述外源基因可操作地连接或插入在腺病毒E1b区；

（9）腺病毒E1B区19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失；

（10）腺病毒E1A的启动子为人端粒酶逆转录酶启动子（SEQ ID NO：12）、癌胚抗原启动子、甲胎蛋白启动子、前列腺素特异性抗原 的启动子或缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件启动子；优选为人端粒酶逆转录酶启动子；

（11）腺病毒E1A表达框与外源基因所在表达框的方向相反；

（12）腺病毒E1A表达框与外源基因所在表达框之间包含第二绝缘子序列，所述第二绝缘子序列与第一绝缘子序列相同或者不同；具体地，所述第二绝缘子序列如SEQ ID NO：13所示；

（13）所述腺病毒为C亚属。

本发明的另一方面涉及一种重组腺溶瘤病毒，其中，p53基因和GM-CSF基因能够在同一个表达框内各自独立地表达。

本发明还涉及一种重组腺溶瘤病毒，其含有本发明中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体；具体地，其由本发明中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体在HEK293细胞中重组得到。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明涉及选自如下的重组溶瘤腺病毒：

重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC-V201336；或

重组溶瘤腺病毒SG655-GMP2，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC-V201337。

本发明的再一方面涉及一种分离的核苷酸序列，其为依次连接的如下序列：

穿膜肽编码序列、编码一个或多个甘氨酸的序列、p53基因；

具体地，所述穿膜肽编码序列为11个精氨酸的编码序列；

具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体或者本发明中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备治疗和/预防和/ 或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体或者本发明中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备杀伤肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞的药物中的用途；具体地，所述肿瘤细胞为选自下列肿瘤的细胞：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

发明详述

术语“p53”又称为Tp53，NCBI基因库的官方ID号为7157，是一种转录因子，控制着细胞周期的启动，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。p53的功能包括：阻滞细胞周期；促进细胞调亡；维持基因组稳定；抑制肿瘤血管生成等，同时p53能有效增强免疫反应，是一个良好的肿瘤疫苗。

p53基因（官方名TP53，ID号7157）有多个异构体，分别为NM_000546.5/NP_000537.3（cDNA序列/蛋白序列），NM_001126112.2/NP_001119584.1，NM_001126113.2/NP_001119585.1，NM_001126114.2/NP_001119586.1，NM_001126115.1/NP_001119587.1，NM_001126116.1/NP_001119588.1，NM_001126117.1/NP_001119589.1，NM_001126118.1/NP_001119590.1，NM_001276695.1/NP_001263624.1，NM_001276696.1/NP_001263625.1，NM_001276697.1/NP_001263626.1，NM_001276698.1/NP_001263627.1，NM_001276699.1/NP_001263628.1，NM_001276760.1/NP_001263689.1， NM_001276761.1/NP_001263690.1。

不拘于理论的限制，在本发明的一个实施方案中，p53基因采用NM_000546.5/NP_000537.3，但为了提高其促进细胞凋亡的活性第72位氨基酸由脯氨酸（Pro，简称P；p53-72P编码序列如SEQ ID NO：10）换为精氨酸（Arg，简称R；p53-72R编码序列如SEQ ID NO：11）（Nat Genet.2003Mar;33(3):357-65.），该位点是p53蛋白的天然单核苷酸多态性位点。

术语“GM-CSF”又称为CSF2，NCBI基因库的官方ID号为1437，是由活化的T细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞产生的一种蛋白质因子，能诱导巨噬细胞、树突状细胞（Dendritic Cell,DC）的分化成熟，增强免疫反应。

hGM-CSF官方名CSF2，ID号1437。

本发明所述穿膜肽p53基因和GM-CSF基因由经改造后的F2A连接，保证两者同时高效表达，并在翻译后剪切形成两个独立的蛋白，且不引入其它无效蛋白序列。术语“2A多肽”是来源于病毒的一个肽段，常用的2A包括F2A（来源于手足口病病毒foot-and-mouth disease virus，FMDV）、P2A（来源于猪捷申病毒porcine teschovirus，PTV）、E2A（来源于马A型鼻病毒equine rhinitis A virus，ERAV）、T2A（来源于明脉扁刺蛾病毒insect Thosea asigna virus，TaV），保守序列为-DVExNPGP-（X为任意氨基酸），可在翻译后自剪切成两个独立的蛋白。

不拘于理论的限制，作为连接序列的Furin-2A本身只有一个翻译后蛋白剪切位点，2A肽段将保留在2A前的蛋白后，增加一段杂序列；改造后的Furin-2A在保持原有剪切位点的前提下，增加一个羧肽酶切割位点，保证2A肽段能从2A前目的蛋白上有效切除，避免引入的2A序列对蛋白功能的影响。

不拘于理论的限制，如果使用IRES连接p53基因和GM-CSF基因，IRES前后两个基因的表达效率不均衡，使得IRES后基因表达效率大幅低于IRES前的基因。

不拘于理论的限制，在外源基因方面，引入1个以上的外源基因，通过多个基因之间的协同作用增强治疗效果，已被证明是提高基因治疗疗效的一个理想途径。目前，多基因表达可通过如下方式实现：1.两个独立的表达框（包括启动子-基因编码序列-polyA加尾信号序列）。这种方法能保证两个基因独立转录与翻译，但由于涉及两套表达框元件，将增大外源序列的片段大小，降低病毒活力甚至无法包装获得病毒颗粒；且如前所述，将两个表达框同时装入同一个病毒载体，需对表达框元件及插入位点分别进行筛选，大幅增加工作量。2.应用内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site,IRES）连接两个基因，使两个基因能共同转录，并翻译成两个蛋白。这种方法的弊端是IRES两端的基因翻译不均衡，IRES后的基因翻译效率相对较低，弱化IRES下游基因的疗效。3.应用2A序列连接两个基因，两个基因共同转录与翻译，翻译后经2A肽段序列自剪切成两个独立的蛋白。这种方法的弊端是，常规2A序列只有一个切点，导致2A前的蛋白额外增加一段2A肽段序列，可能影响2A前蛋白的功能。因此，针对两个以上的外源基因，需考虑病毒载体的包装容量，选择合适的多基因表达策略，并通过实验验证是否能获得理想的效果。最佳状态是在减少外源插入序列的前提下，使外源基因能同时高效表达，且在蛋白质水平上不引入其它杂序列。为实现该目标，需要根据病毒载体与外源基因的特点，进行优化组合，并通过实验验证效果。

术语“穿膜肽”是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞。11R穿膜肽是一种由11个精氨酸串联构成的穿膜肽。

术语“Kozak序列”是存在于真核生物mRNA的一段序列，基本结构为G/ANNATGG（其中ATG为起始密码子），在翻译的起始中有重要作用。

不拘于理论的限制，由于氨基酸R的密码子是CGC，可能导致Kozak序列（G/ANNATGG）不完整，结果表达出来的11R-p53蛋白除 预想中的55KD条带外，还有一个45KD的条带，有些情况下45KD条带含量甚至高于55KD条带。本发明人经过深入的研究很和分析，推测可能是由于起始密码子附近Kozak序列的不完整，导致翻译部分从p53基因内部ATG起始，而这种非全长的p53蛋白，由于功能区段的不全，抗肿瘤活性被大幅削弱。本发明人创造性地在11R穿膜肽与p53基因起始密码子之间增加一个编码甘氨酸的密码子（GGC），有效的避免了该问题的出现（如SEQ ID NO：4）。

所述绝缘子序列的作用是使两个表达框互不干扰。

不拘于理论的限制，本发明所述穿膜肽p53基因和GM-CSF基因受组成型强启动子（如CMV、SV40、EF-1α、Ubc、PGK、嵌合启动子CAG）的控制，该顺式作用元件插入抗肿瘤基因序列的转录起始位点与翻译起始位点之间，保证该基因蛋白在病毒感染的肿瘤内部高效表达，发挥生物学活性。加尾序列插入基因核苷酸序列的翻译终止密码子之后，该顺式作用元件可保证转录后的RNA能准确加polyA，形成成熟mRNA。

本发明所述腺病毒增殖必需基因E1A受一种肿瘤特异性启动子—人端粒酶逆转录酶启动子控制，保证E1A在肿瘤细胞内特异表达，控制病毒在肿瘤细胞内特异增殖。术语“E1A”是腺病毒感染细胞后最早表达的基因，能激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的转录，启动病毒的复制。同时，ElA可以通过抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF-κB的活性、提高免疫细胞的杀伤效应、增强转移抑制基因nm23的表达等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。

本发明所述腺病毒ElB-55KDa、ElB-19KDa基因全缺失。术语“ElB-55Kda”是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中复制时的非必需的蛋白，ElB-55KDa编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。术语“ElB-19Kda”与凋亡抑制基因Bcl-2同源，编码的ElB-19KDa 蛋白能够结合Bax或/和Bak，启动下游的凋亡抑制程序；ElB-19KDa还可以破坏Fas介导的凋亡过程，保护感染的细胞免受TNF-α介导的杀伤作用。因而，ElB-19KDa蛋白功能的丧失，不但能够促进肿瘤细胞凋亡通路的恢复，而且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使该溶瘤腺病毒治疗肿瘤的特异性更好，效能更强。

腺病毒E1b19KDa与55KDa蛋白及其编码序列可详见2型腺病毒全基因组序列的注释（登录号AC_000007.1）。

不拘于理论的限制，在病毒载体方面，腺病毒基因组具有高度集约的特点，一段DNA序列往往发挥多种功能，如作为多顺反子编码多种蛋白（例如，腺病毒E1A基因同时编码E1A9S，12S，13S，6KDa，26KDa，32KDa），既编码蛋白又作为顺式元件（如启动子）等等形式，引入一段或多段基因组序列的改造（如删除/突变/增加）可能破坏病毒基因组的完整性，使病毒失去活力；其次，病毒的生命周期受严格调控，相关基因需顺次表达，如腺病毒进入细胞后，首先表达E1A蛋白，E1A随后激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的转录，启动病毒的复制，两个区段基因组的同时改造，可能引起病毒复制过程中相关元件的调控紊乱，出现病毒颗粒无活力，或外源基因无法有效表达的现象。因而，为保证获得具有正常活力的病毒颗粒，且外源基因能有效表达，需根据外源基因的不同，通过实验对外源表达框的核心元件（如启动子、polyA加尾信号序列等）进行优化组合；与此同时，通过实验筛选合适的外源基因表达框插入位点。

不拘于理论的限制，在腺病毒血清型选择方面，人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属（A-F），它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史各不相同。基因治疗常用的人的2型（Ad2）及5型（Ad5）腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95%的同源性。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。C亚群腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体（coxsackie/adenovirus receptor，CAR）。但是，在某些肿瘤细胞（如膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤等）表面，CAR是低表达甚至不表达的。由于以腺病毒为载体的基因治疗中CAR介导的腺病毒进入靶细胞是基因转移中的限速步骤，并且转染效率与细胞表面CAR表达水平有关。低水平表达的CAR无疑是制约腺病毒转导效率的主要原因，即表现出细胞对C亚群腺病毒载体的抗性作用（J Virol.2002;76:1892;Cancer Res.2001;61:2953;Clin Cancer Res.2001;7:120;Gene Therapy.2001;8:969;Prostate.2005;64:401;Gene Ther.2005;12:1696）。然而，由于C亚群腺病毒载体已被成功应用于临床治疗，广泛进入临床试验，其安全性已在人体中经过广泛测试，作为载体安全性最高。而其它亚群腺病毒，虽然能提高对CAR低表达细胞的感染效率，但其安全性并未在人体中被广泛测试，具有潜在的安全性风险。因而，最佳状态是在保留C亚型腺病毒外壳纤毛的前提下，通过其它方式提高病毒对肿瘤细胞的感染效率。为实现该目的，需引入其它策略，并通过实验验证效果。

本发明的病毒能够在肿瘤细胞内复制。

不拘于理论的限制，另外，如果采用复制缺陷型腺病毒，病毒感染肿瘤细胞后，只能瞬时表达外源基因，外源DNA拷贝数不会随着病毒的复制而扩增，表达强度不够（GM-CSF的表达量约为100－200pg/ml）。并且因为病毒不会复制，无法直接裂解肿瘤细胞，不能有效释放肿瘤细胞的抗原，从而激活机体免疫反应。

而本发明人构建的病毒感染细胞后GM-CSF的表达量可达到100ng/ml甚至200ng/ml以上（高效表达）。

本发明所述重组溶瘤腺病毒可高效感染并杀伤肿瘤干细胞。

本发明所述腺病毒可用于杀伤肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞）。术语“肿瘤干细胞”为肿瘤组织中能无限自我更新，并分化为异质性肿瘤细胞群体的一部分肿瘤细胞亚群，是恶性肿瘤起始、耐药、转移等生物行为的根源。

术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

有益效果：

本发明提供包含人类穿膜肽p53基因和GM-CSF基因的重组溶瘤腺病毒及其用途，该病毒能在肿瘤细胞内特异增殖，使治疗基因随病毒的复制增殖DNA拷贝数显著增加，显著提高p53基因和GM-CSF基因的表达量，通过溶瘤病毒与治疗基因的双重作用，促进肿瘤细胞的死亡；释放后的子代病毒又可以通过11R穿膜肽序列的介导，高效感染周围肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞），通过级联放大效应，大量杀伤肿瘤细胞；与此同时，病毒裂解肿瘤细胞的反应以及肿瘤部位p53与GM-CSF蛋白表达量的提高，能增加免疫反应，进一步提高治疗作用。本基因-溶瘤腺病毒药物适应于人类绝大多数类型恶性肿瘤的治疗。

具体地，本发明：

1）利用条件增殖型腺病毒同时高效表达人类p53基因和GM-CSF基因（两者的治疗作用已在多种类型恶性肿瘤被证实），直接促进肿瘤细胞凋亡，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用；

2）利用经改造后的Furin-2A连接p53基因和GM-CSF基因，保证两者同时高效表达，并在翻译后形成两个独立的蛋白，且不引入其它无效蛋白序列；

3）在p53基因前增加一段11R穿膜肽编码序列，在不改变病毒外壳的前提下，提高病毒对肿瘤细胞的二次感染效率；

4）利用人端粒酶逆转录酶启动子控制E1A的表达，缺失E1B19KDa与55KDa基因，保证病毒在肿瘤细胞内特异增殖，并增加病毒的包装容量；

5）腺病毒E1A表达框与外源插入的p53-GM-CSF表达框方向相反，并在两者中间加入一段绝缘子序列，减少两个表达框的相互干扰， 提高病毒进入细胞后的增殖效率（与E1A表达框相关）与外源基因的表达效率（与p53-GM-CSF表达框相关）。

本发明提供的重组溶瘤腺病毒可以高效感染并杀伤肿瘤干细胞。

本发明提供的重组溶瘤腺病毒可以用于多种类型恶性肿瘤的基因治疗。

在本发明中，如果没有特别说明，p53基因是指p53基因读码框；GM-CSF基因是指GM-CSF基因读码框。具体地，所述p53基因和GM-CSF基因是人源的或者鼠源（例如小鼠）的；优选为人源的。

附图简述

图1：11R-p53-2A-GM-CSF表达框的模式图。

图2：病毒SG655-GMP穿梭载体P74-Tp-GMP的载体图谱。

图3：病毒SG655-GMP1和SG655-GMP2感染293细胞后表达p53的Western blotting检测图。空白，未感染病毒的293细胞；1，2，3，4分别代表不同的病毒克隆；CMV启动子，感染CMV启动子控制病毒SG655-GMP1；CAG启动子，感染CAG启动子控制病毒SG655-GMP2；Ad-p53，感染Ad-p53病毒。

图4：病毒SG655-GMP1和SG655-GMP2感染293细胞后表达GM-CSF的检测图。A,标准曲线；B，不同克隆（1＃－4＃）病毒SG655-GMP1（CMV启动子控制）或SG655-GMP2（CAG启动子控制）感染293细胞后表达hGM-CSF的定量检测。

图5：SG655-GMP1在肝癌细胞SMMC-7721与正常肝细胞L-02中的增殖情况图。

图6：病毒SG655-EGFP及SG655-11R-EGFP感染SMMC-7721细胞3天后的荧光图（×200）。A,SG655-EGFP；B,SG655-11R-EGFP。

图7：病毒SG655-EGFP及SG655-11R-EGFP感染Hep3B来源肿瘤干细胞3天后的荧光图（×200）。A,SG655-EGFP。左图荧光，右图白光；B,SG655-11R-EGFP。左图荧光，右图白光。

图8：SG655-GMP2抑制肿瘤干细胞体外增殖的曲线图。

图9：SG655-GMP1对肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤活性图。

图10：SG655-mGMP抑制SMMC-7721移植瘤体内生长的曲线图。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

1.重组人腺病毒SG655-GMP1Human Recombinant Adenovirus SG655-GMP1，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：V201336，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，430072。

2.重组人腺病毒SG655-GMP2Human Recombinant Adenovirus SG655-GMP2，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：V201337，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，430072。

发明详述

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例 1 ：重组腺病毒 SG655-hGMP1 、 SG655-mGMP 、 SG655-hGMP2 的构建

1.合成一段人工第一绝缘子（具体序列如SEQ ID NO：1所示），并在其上游引入多克隆位点（BglII-XbaI-EcoRI-BamHI-SalI-NheI-HindIII-SpeI），在其下游引入酶切位点（EcoRV-BglII），委托上海捷瑞生物公司合成，装入载体 片段pCA13载体（BglII）位点之间，构建获得的载体命名为pCA16。pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是一个腺病毒穿梭载体，含有5型腺病毒左臂序列（bp22-5790），缺失E1区342至3523bp片段，可用于克隆外源基因并与包含腺病毒右臂的载体包装成腺病毒载体。

2.分别按SEQ ID NO：2所示CMV启动子序列、SEQ ID NO：3所示CAG启动子序列，委托上海捷瑞生物公司合成CMV启动子与CAG启动子，装入pCA16载体中，构建成功载体分别命名为pCA19与pCA20。

3.根据人11R穿膜肽p53基因（SEQ ID NO：4所示）、人GM-CSF基因（简称hGM-CSF，SEQ ID NO：5）、小鼠GM-CSF基因（简称mGM-CSF，SEQ ID NO：6）、Furin-2A编码序列（SEQ ID NO：7），分别合成11R-p53-F2A-hGM-CSF（简称hGMP，见图1）与11R-p53-F2A-mGM-CSF，两端引入酶切位点（EcoRI+SalI），委托上海捷瑞生物公司全基因合成，分别装入pCA19与pCA20载体中，构建成功载体，分别命名为pCA19-hGMP，pCA19-mGMP，pCA20-hGMP。

4.按SEQ ID NO：8所示序列合成一段DNA长序列，该序列依次包含5型腺病毒原E1A启动子前的一段序列、第二绝缘子、人端粒酶逆转录酶启动子、E1A编码序列、E1A polyA加尾信号序列，两端包含酶切位点EcoRI与BglII，该片段经EcoRI与BglII双酶切后连接到经EcoRI与BglII双酶切后的pXC.1载体（购于加拿大Microbix Biosystem Inc），构建获得的载体命名为p74-Tp，该载体用人端粒酶逆转录酶启动子替换了腺病毒原来E1A启动子，并删除了E1b55KDa与19KDa编码区序列。

5.质粒pCA19-hGMP、pCA19-mGMP、pCA20-hGMP分别经（BglII）酶切后，回收mCMV-hGMP-SV40PolyA-绝缘子、mCMV-mGMP-SV40PolyA-绝缘子、CAG-hGMP-SV40PolyA-绝缘子表达框片段，将整个表达框装入经同样酶切后的载体片段p74-Tp （BglII）中，选择反向连接的阳性克隆子，构建成功载体分别命名为p74-Tp-GMP1（载体图谱如图2所示）、p74-Tp-mGMP、p74-Tp-GMP2。

6.将纯化获得的p74-Tp-GMP1、p74-Tp-GMP2、p74-Tp-mGMP，分别与含有腺病毒基因组右臂的骨架质粒pPE3（购于加拿大Microbix Biosystem Inc），通过Lipofectamine（购于Invitrogen公司）共转染至HEK293细胞（购于美国标准生物品收藏中心，ATCC）内重组，获得重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1（保藏号CCTCC-V201336）、SG655-GMP2（保藏号CCTCC-V201337）、SG655-mGMP。

实施例 2 ：重组腺病毒 SG655-GMP1 与 SG655-GMP2 的外源基因表达活性鉴定

1.HEK293细胞（购于美国标准生物品收藏中心，ATCC）按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5%CO₂培养，第二天换无血清液体1ml，然后按MOI=5分别加入重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1与SG655-GMP2，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5%胎牛血清的培养液培养，培养48小时后，裂解细胞收集样品，Western Blotting实验检测p53蛋白的表达。结果发现，与对照病毒（Ad-p53）类似，重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1与SG655-GMP2能在HEK293细胞中表达大小约为55KDa的11R-P53融合蛋白，具体如图3所示。

2.分别取重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1、SG655-GMP2的各个病毒克隆上清，稀释一定倍数后用人GM-CSF ELISA MAX Deluxe检测试剂盒（购于Biolegend公司）检测该病毒各克隆在HEK293细胞中hGM-CSF蛋白的表达。结果发现，重组溶瘤腺病毒SG655-hGMP各个克隆均能在HEK293细胞中表达hGM-CSF蛋白，并且表达量较高，具体如图4（A－B）所示。

实施例 3 ：重组溶瘤腺病毒 SG655-GMP1 在体外培养的肿瘤细胞内增殖实验

正常细胞株L-02(购于中国科学院生化与细胞研究所)和肝癌细胞株（SMMC-7721，购于中国科学院生化与细胞研究所）分别按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5%CO₂培养，第二天换无血清液体1ml，然后按MOI=5加入重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5%胎牛血清的培养液培养，分别在0小时、48小时、96小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)。以0小时病毒滴度为参照，算出病毒在48小时、96小时的增殖倍数。结果发现SG655-GMP1在肝癌细胞中随着时间呈几何倍数增殖，具有良好的增殖能力，而在正常细胞株L-02中的增殖倍数很低，具体如图5所示。

实施例 4 ：重组溶瘤腺病毒 SG655-11R-EGFP 对肿瘤细胞感染效率分析（荧光检测）

重组溶瘤腺病毒对特定细胞的感染效率与病毒本身的构造（除外源序列外的其它元件）有关，而与所携带的p53基因、GM-CSF基因无关，为直观地考察11R穿膜肽提高重组溶瘤腺病毒对肿瘤细胞（包括肿瘤干细胞）的感染效率，利用携带EGFP报告基因、具有与SG655-GMP相同病毒构造的重组溶瘤SG655-EGFP与SG655-11R-EGFP来完成实验。其构建流程如下：

1.根据绿色荧光蛋白EGFP基因（SEQ ID NO：7所示）、11R穿膜肽编码序列，分别合成EGFP与11R-EGFP，两端引入酶切位点（EcoRI+SalI），委托上海捷瑞生物公司全基因合成，装入载体片段pCA19中，构建成功载体，分别命名为pCA19-EGFP与pCA19-11R-EGFP。

2.质粒pCA19-EGFP与pCA19-11R-EGFP分别经（BglII）酶切后，回收的mCMV-EGFP-SV40PolyA-绝缘子与mCMV-11R-EGFP-SV40PolyA-绝缘子的表达框片段，将整个表达框 装入经同样酶切后的载体片段p74-Tp（BglII）中，选择反向连接的阳性克隆子，构建成功载体分别命名为p74-Tp-EGFP与p74-Tp-11R-EGFP。

3.将纯化获得的p74-Tp-EGFP与p74-Tp-11R-EGFP，分别与含有腺病毒基因组右臂的骨架质粒pPE3（购于加拿大Microbix Biosystem Inc），通过Lipofectamine（购于Invitrogen公司）共转染至HEK293细胞（购于美国标准生物品收藏中心，ATCC）内重组，获得重组溶瘤腺病毒SG655-EGFP、SG655-11R-EGFP。

人肝癌细胞SMMC-7721按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5%CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按MOI=5加入重组溶瘤腺病毒SG655-EGFP及SG655-11R-EGFP，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5%胎牛血清的培养液培养，培养48小时后，荧光显微镜观察两个溶瘤腺病毒感染SMMC-7721情况。结果发现，病毒感染细胞48小时后，两种溶瘤腺病毒均能在SMMC-7721细胞中增殖，但SG655-11R-EGFP对SMMC-7721细胞后EGFP表达率及表达强度均高于SG655-EGFP感染后的细胞，说明SG655-11R-EGFP的二次感染效率明显高于SG655-EGFP，具体如图6（A－B）所示。

实施例 5 ：重组溶瘤腺病毒 SG655-11R-EGFP 对肿瘤干细胞的感染效率分析（荧光检测）

人肝癌细胞株Hep3B按2×10⁵/孔铺板，待细胞贴壁后换成无血清肝癌干细胞培养体系（含Neurobasal-A Medium+DMEM/F12各50%，B-27Supplement Minus Vitamin A1%，GlutaMAX-I1%，BSA0.4%，EGF20ng/ml，FGF-1020ng/ml，IGF-120ng/ml，Heparin4μg/ml，b-硫氢基乙醇0.1mM，MEM Non-Essential Amino Acids Solution1%），置于37℃孵箱5%CO2培养，3天后可见悬浮生长的Hep3B细胞来源的肿瘤干细胞球Hep3B-C。

待悬浮细胞球长到一定程度，用移液管轻轻吹打细胞，收集到离 心管中，1200rpm离心2min，加入Accutase消化酶重悬细胞，计数后按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，1天后按MOI=10的比例分别加入重组溶瘤腺病毒SG655-EGFP与SG655-11R-EGFP。培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，换新鲜肝癌干细胞培养基。48小时后，荧光显微镜观察两个溶瘤腺病毒感染Hep3B-C的情况。结果发现，SG655-11R-EGFP病毒感染细胞48小时后，EGFP表达率及表达强度均高于SG655-EGFP感染后的细胞，表明11R穿膜肽能有效提高溶瘤腺病毒对肿瘤干细胞的二次感染效率，具体如图7（A－B）所示。

实施例 6 ：重组溶瘤腺病毒 SG655-GMP1 在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验

肝癌细胞株SMMC-7721按1×10⁴细胞/孔铺在96孔板中，在37℃孵箱5%CO₂培养，第二天按不同MOI值梯度加入重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1及携带人p53基因的非增殖型对照病毒Ad-p53（购于深圳市赛百诺基因技术有限公司），每个MOI值设置3个重复，培养7天后，应用MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，购于SIGMA公司）法检测细胞生长曲线。结果发现，SG655-GMP1对肝癌细胞具有良好的杀伤能力，杀伤活性明显高于Ad-p53，具体如图8所示。

实施例 7 ：重组溶瘤腺病毒 SG655-GMP2 对肿瘤干细胞的生长抑制实验

人肝癌干细胞Hep3B-C消化计数后铺96孔板，每孔1×10⁴个细胞，以MOI=10比例感染病毒SG655-GMP2，设空白对照（不加病毒），每组设4个复孔，分别于24小时、48小时及72小时加CCK-8试剂，450nm测吸光值，画细胞生长曲线图。结果发现，携带治疗基因的溶瘤腺病毒感染肿瘤干细胞后能对肿瘤干细胞的生长起到明显的抑制作用，具体如图9所示。

实施例 8 ：重组溶瘤腺病毒 SG655-mGMP 动物实验

由于物种差异，人类GM-CSF基因对小鼠DC细胞与巨噬细胞无刺激活性。为研究该病毒的体内功能，本发明同时构建了携带小鼠GM-CSF基因的实验性溶瘤病毒SG655-mGMP。本发明领域的技术人员所知晓，人类GM-CSF基因对人类DC细胞与巨噬细胞的具有良好的刺激活性。因而，对于GM-CSF这个基因而言，SG655-mGMP在小鼠体内的功能，可以直接反映SG655-hGMP1和SG655-hGMP2在人体内的功能。

第一步：4～6周龄BALB/C裸鼠50只，平均重量22～27g，由上海中科院实验动物培育中心提供，清洁级动物实验室饲养。

第二步：体外培育人肝癌细胞SMMC-7721，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25%胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁷个/ml。

第三步：于裸鼠右肋背部皮下接种SMMC-7721细胞，0.1ml/只。接种三周左右后，可见接种部位皮下长出米粒大小硬结，移植瘤模型建成。待瘤体直径生长至7-9mm时开始治疗。挑选40只皮下肿瘤生长至7-9mm的SMMC-7721移植瘤进行治疗，将裸鼠随机分分为4组。给药途径为直接瘤内多点注射。

第四步：每日观察小鼠的生活状态并定期测量肿瘤的体积，定期测量一次肿瘤的最长径(A)及其垂直径(B)，按公式(A×B²)/2计算肿瘤的体积，观察不同剂量组的疗效。

实验设置单独携带p53基因的非增殖腺病毒Ad-p53（购于深圳市赛百诺基因技术有限公司），不携带任何基因的增殖型腺病毒Onyx-015(购于上海三维生物技术有限公司)。结果发现，SG655-mGMP治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有显著统计学差异（p<0.05），说明基因-溶瘤腺病毒SG655-mGMP对肝癌动物模型有很强的抗肿瘤 作用，能明显抑制肿瘤的生长发展（见图10）。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (16)

1.一种重组溶瘤腺病毒载体，

其可操作地插入或者包含依次连接的下述外源基因：

组成型强启动子、穿膜肽编码序列、p53基因或其简并序列、2A连接序列、GM-CSF基因或其简并序列、SV40PolyA、第一绝缘子序列；

其中，

所述穿膜肽编码序列为编码聚精氨酸穿膜肽的序列，

所述穿膜肽编码序列插入到p53基因的起始密码子的后面，并且

所述穿膜肽编码序列和p53基因起始密码子之间连接有编码一个甘氨酸的序列；

所述外源基因可操作地连接或插入在腺病毒E1B区；

腺病毒E1B区19KDa与55KDa蛋白编码序列缺失；

腺病毒E1A的启动子为人端粒酶逆转录酶启动子；

其中，编码一个甘氨酸、穿膜肽和p53基因的序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体，其特征在于如下的(1)－(7)中的任一项或者多项：

(1)所述连接序列如SEQ ID NO：7所示；

(2)所述GM-CSF基因如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示；

(3)所述组成型强启动子为CMV、CAG、SV40、EF-1α、Ubc或PGK启动子；

(4)所述第一绝缘子序列如SEQ ID NO：1所示；

(5)腺病毒E1A表达框与外源基因所在表达框的方向相反；

(6)腺病毒E1A表达框与外源基因所在表达框之间包含第二绝缘子序列，所述第二绝缘子序列与第一绝缘子序列相同或者不同；

(7)所述腺病毒为C亚属。

3.根据权利要求1或2所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述组成型强启动子为CMV或CAG启动子。

4.根据权利要求3所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求3所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求2所述的重组溶瘤腺病毒载体，其中，所述第二绝缘子序列如SEQ ID NO：13所示。

7.一种重组腺溶瘤病毒，其含有权利要求1至6中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体。

8.根据权利要求7所述的重组腺溶瘤病毒，其由权利要求1至6中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体在HEK293细胞中重组得到。

9.选自如下的重组溶瘤腺病毒：

重组溶瘤腺病毒SG655-GMP1，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-V201336；或

重组溶瘤腺病毒SG655-GMP2，其于2013年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-V201337。

10.一种分离的核苷酸序列，其为依次连接的如下序列：

编码一个甘氨酸的序列、穿膜肽编码序列、p53基因；并且

所述的分离的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：4所示。

11.权利要求1至6中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体或者权利要求7至9中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备治疗和/或预防癌症或者抗肿瘤的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述治疗为辅助治疗。

13.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

14.权利要求1至6中任一项所述的重组溶瘤腺病毒载体或者权利要求7至9中任一项所述的重组溶瘤腺病毒在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述肿瘤细胞为肿瘤干细胞。

16.根据权利要求14所述的用途，其中，所述肿瘤细胞为选自下列肿瘤的细胞：

肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。