CN114350709A

CN114350709A - 一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体

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Publication number: CN114350709A
Application number: CN202111112039.9A
Authority: CN
Inventors: 梁亚龙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体。具体的，本发明涉及一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体，其可实现分泌表达含有固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和肿瘤凋亡蛋白的嵌合蛋白，通过激活体内固有免疫系统、阻断免疫检查点、凋亡蛋白，三者有效结合，在制备治疗或预防不限癌肿的肿瘤药物中的应用。解决目前现有肿瘤免疫疗法产品临床效果差、有效率低、半衰期短、重复给药等问题。

Description

一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体。具体的，本发明涉及一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体，其可实现分泌表达含有固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和肿瘤凋亡蛋白的嵌合蛋白，并在制备治疗或预防不限癌肿的肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症已经成为中国乃至世界的头号致死疾病，2017年中国最新癌症报告显示每年新发癌症病例达429万，也就是说全国每天约1万人确诊癌症，若中国人均预期寿命是85岁，那么每个人的累计患癌风险高达36％。中国现在处于发展中国家，随着现代化的进展，人民的生活和饮食的变化(例如饮酒、抽烟、更多的腌制、便当等)和环境污染以及现代社会快节奏带来的压力，预计未来中国癌症患者更是难以想象。目前各国主要对癌症的治疗手段依然是手术摘除，并加以化疗和放疗，这些常规的治疗方法对早起癌症有一定的效果，但是转移扩散或者中晚期治疗效果欠佳。因此世界范围内都在努力不断的探索新的癌症治疗方法。

一种新的治疗方法引起癌症治疗领域的一场革命-免疫疗法。“免疫疗法”的靶点是正常免疫细胞，目标是激活人体自身的免疫系统来治疗癌症。2013年，施贵宝和默沙东推出的作用于相同靶点PD-1的两个新药物，临床效果显示在所有已有治疗方案都失效的黑色素癌晚期病人(多数癌症已经转移)身上，这两个药物让60％以上的病人肿瘤减小乃至消失了超过2年。但是目前免疫疗法仍然存在致命的缺陷，即有效率低，在临床中，PD-1抑制剂仅对20％的患者有效；患者使用PD-1抗体，逐渐产生免疫原性，体内产生抗PD1抗体，药物失效；而且因其在体内的半衰期很短，临床需要不断的重复给药，不但治疗费用巨大同时也给医疗带来巨大的工作量。

另外一种免疫疗法为，溶瘤病毒相关的免疫疗法，其实早在2003年和2005年，CFDA就批准了两款溶瘤病毒产品上市，包括“今又生”(P53腺病毒注射液)和安柯瑞(重组人5型腺病毒注射液)。但是上述两个产品临床反应效果不佳，疗效也未得到国际同行业的认可。

但是腺病毒是作为溶瘤病毒载体具有一定的优势：具有广谱性，能够感染多种组织或器官；安全性好，尤其是A5型对人无致病；另外不会正和到宿主染色体上，不会导致基因突变。以腺病毒为载体的药物开发主要经历了以下几个阶段：

第一代：腺病毒载体体内不具有复制的能力，E1区间由治疗基因取代，例如P53(“今又生”)等。临床效果并不理想，主要因为第一代对肿瘤细胞感染力较低，对肝脏细胞这有高度的感染力，因此具有中毒反应。

第二代腺病毒是E1A或者E1B被突变，或者他们的启动子被具有肿瘤特异性的启动子取代。因此第二代腺病毒能够在肿瘤中进行DNA复制和繁殖，最终溶解病毒。而肿瘤细胞裂解释放的腺病毒可以感染周围的肿瘤细胞，扩大溶瘤能力和剂量效应，第二代病毒对正常组织也可以感染，但是无自我复制和繁殖能力，对正常组织影响较清。例如，ONYX-015(2005年SFDA批准上市，即”H101”)，但是”H101”上市多年，未得到国际认可。归结第二代主要缺陷是首先对P53正常性的肿瘤基本无效。此外在肿瘤细胞内的自我复制能力仅为野生型的10％(FueyoJ等2000，Oncogen 19：2-12)。

另外一种腺病毒载体是用外源特异性启动子来取代E1A或E1B基因的启动子。利用肿瘤特异性的启动子来调控E1A基因的表达来达成腺病毒溶瘤能力的肿瘤专一性，防止病毒在正常中复制繁殖，提供更好的临床安全性。例如以甲胎蛋白启动子(AFP)来调控E1A基因表达的溶瘤性腺病毒(hallenbeck P，L等1999，HumanGeneTherapy 10：1721-1733)，但是这种病毒也是存在临床效果不显著的问题。

因此，急迫需要开发一种利用充分激活免疫系统的靶向性腺病毒，腺病毒能够溶瘤的同时，激活患者免疫系统来治疗肿瘤。

发明内容

为实现以上目的，本发明构建一种新型经修饰的溶瘤性腺病毒载体。

本发明提供了一种临床上常用的腺病毒载体(Ad)，优选5型腺病毒，通过基因工程构建，该腺病毒载体E1A由端粒酶逆转录酶启动子控制，且E1B去19Kda与55Kda蛋白编码序列删除，作为外源嵌合蛋白表达盒的插入位点；E1A与外源嵌合蛋白表达盒之间插入一段绝缘子序列，避免二者相互干扰。嵌合蛋白表达盒可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白包含固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和肿瘤凋亡蛋白。

我们大量研究发现加入编码免疫刺激细胞因子GM-SCF或IL12或IL15，可以定向诱导“冷”性肿瘤向“热”肿瘤转变，转变后充满T细胞的“热”肿瘤对免疫检查点抑制剂更为敏感，而肿瘤“是冷是热”决定了它能否响应免疫检查点抑制剂。

特别地，我们经过研究发发现同时表达固有免疫刺激因子(例如GM-SCF、IL12、IL15任一一种)和免疫检查点抑制剂(PD1 scFv、TIM3 scFv、LAG3 scFv任一一种)，解决单独免疫检查点抑制剂临床效果差、有效率低的问题，因此本发明通过分泌表达激活固有免疫刺激因子+T淋巴细胞免疫阻断剂抗体组合有效解决免疫疗法临床效果差、有效率低的问题。

依近年来大量的临床经验和发表文献证实如大量实体瘤50％以上和P53有关，包括突变和缺失。P53突变或KRAS基因突变，可能对免疫药物敏感(dong et，al，2017；Miao etal.，2018)。

进一步地，通过本发明制备的一种经修饰的腺病毒，可以实现泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白包含固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和靶向肿瘤凋亡活性蛋白P53。该组合在体内可以实现固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和靶向肿瘤凋亡活性蛋白同时表达，具有更强的协同作用，既可以极大提高免疫疗法的临床有效性、有效率，还可以靶向针对肿瘤细胞促进凋亡，并且对人体无毒无害。

在医学应用方面，免疫疗法(免疫检查点抑制剂)PD1等是行业内公认的神药，但是PD1抗体存在着体内半衰期短，临床上需要不断的重复给药，费用昂贵，患者难以承受，长期用药逐渐产生免疫原性问题，导致PD1无效，这是业内所关心的且不希望其正负面作用共存的一个问题，至今没有解决渠道。

申请人采用一种非致病性修饰的腺病毒载体。通过基因工程技术，申请人实现固有免疫刺激因子(GM-SCF、IL12、IL15)和免疫检查点抑制剂(PD1 scFv、TIM3 scFv、LAG3scFv)-靶向肿瘤凋亡肽嵌合蛋白P53分泌表达。通过静脉注射方式给药，实现该载体具有在肿瘤细胞内选择性增值，特异的裂解肿瘤细胞；在肿瘤细胞内高效表达免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和肿瘤凋亡肽，既可以直接促进肿瘤稀薄啊凋亡，还可以激活固有免疫系统，定向诱导“冷”性肿瘤向“热”肿瘤转变，转变后充满T细胞的“热”肿瘤对免疫检查点抑制剂更为敏感，免疫检查点抑制剂功效进一步增强，极大提高免疫疗法的临床有效性、有效率。

进一步的，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白的核酸序列组合含有信号肽和穿膜肽序列。

进一步的，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白的核酸序列组合含有内含子序列、穿膜肽序列、简并序列、2A连接序列等。

进一步的，给药方式是静脉注射，施药剂量是1×10⁷-5×10¹²vp

这种种经修饰的腺病毒不限癌种，包括肺癌、黑色素癌、头颈部癌、肝癌、淋巴癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌等。

附图说明

附图1构建的经修饰的腺病毒的表达盒结构示意图

附图2构建的对照AVV的表达盒结构示意图

附图3 Adyb301 GM-CSF表达含量的测定

附图4 Adyb302表达IL-12蛋白的能力的测定

附图5 Adyb303表达IL-15蛋白的能力的检测

附图6 Adyb301、Adyb302、Adyb303、Adyb105在不同MOI下感染Hela299(宫颈癌细胞)的细胞活力测定。

具体实施方式

实施例1：经修饰的腺相关病毒(Ad)的构建

本发明提供了一种经修饰的重组腺病毒(Ad)，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白包含免疫固有因子和免疫检查点抑制剂和靶向肿瘤凋亡活性肽，并构建了能够实现三种嵌合肽和或嵌合蛋白分泌表达的重组腺病毒。具体构建方法表现为：

1)构建依次含有CMV启动子、kozak序列、第一嵌合肽或嵌合蛋白、Furin-2A拼接序列、第二嵌合肽/嵌合蛋白、Furin-2A拼接序列、第三嵌合肽/嵌合蛋白、TKpA序列的表达盒。在表达盒的上游加入-BgIII-XbaI-酶切位点，在表达盒的下游加入-HindIII-BgIII-酶切位点。以嵌合分泌表达GM-CSF、p53、PD1scFv三种蛋白的重组腺病毒(Adyb301)为例，其表达盒的构成见图1。

2)人工合成依次含有人端粒酶启动子、E1A、TKpA的序列，序列上游插入XbaI酶切位点，序列下游插入BgIII酶切位点。

3)pYBshuttle是一个腺病毒穿梭质粒，缺失E1A区、E1B区55kDa和19kDa、E3区的序列。用限制性内切酶BgIII和XbaI将pYBshuette线性化，然后将用内切酶BgIII和XbaI处理过的含有人端粒酶启动子、E1A、TKpA的人工序列用T4连接酶反向链接插入到pYBshuttle中，标记为pYBshuttle-301b.

4)用pYBshuttle-301b用限制性内切酶BgIII线性化，插入表达盒。得到pYBshuttle-301c.将pYBshuttle-301c扩增纯化，然后与骨架质粒pBHGΔE1E3共转染至HEK293细胞，在其体内进行同源重组，获得重组溶瘤腺病毒Adyb301。根据表达盒的不同，在本发明中构建了3个经修饰的重组腺病毒，分别是：Adyb301(嵌合表达GM-CSF，p53，PD1scFv)，Adyb302(嵌合表达IL-12，p53，PD1scFv)，Adyb303(嵌合表达IL-15，p53，PD1scFv)。其表达盒的构成详见附图1。

并构建了9个对照重组腺病毒Adyb101，Adyb201，Adyb202，Adyb105，Adyb103，Adyb102，Adyb104，Adyb203，Adyb204。其表达盒的详细构成见图2.

Furin-2A是2A自剪多肽元件(2A self cleavage peptide)的一种。作为拼接序列，2A肽段中，以口蹄疫病毒(FMDV)2A(F2A)研究最为透彻，其自剪切效率高、上下两个基因表达平衡性好且结构短小(20-22个氨基酸)，是载体构建过程中很好的连接工具。2A肽的保守序列为末位为-NPGP，剪切位置在G和P之间。在F2A前面加入一个Furin蛋白酶酶切位点RAKR，再加入一个-GSG-可以加强2A肽的剪切能力，还能去除2A自剪切后残留在前面蛋白羧基端的序列。因此本发明在拼接序列的选择中优选Furin-2A。

实施例2：Adyb301病毒的包装和纯化

本发明的一个实施例中，以Adyb301病毒的包装，制备，纯化为例详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

(1)HEK293A细胞培养

细胞采用含10％FBS的DMEM高糖培养基在37摄氏度、5％CO2培养箱中培养，采用75cm2的细胞培养瓶。细胞生长至90％汇合时进行，传代弃去培养基，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，在37℃消化3min左右，注意在显微镜下观察细胞，当细胞皱缩，变圆时，加入9ml含10％FBS的DMEM培养基，吹打成单细胞悬液进行细胞计数，按1∶3的比例进行传代。

(2)病毒包装

将HEK293A细胞进行细胞传代，然后在37℃，5％CO2培养箱中培养，当细胞生长至60％-70％汇合时，进行转染。采用双质粒转染系统，将穿梭质粒pYBshuttle-301c和骨架质粒pPE3一同转染至HEK293细胞，具体为将pYBshuttle-301c和骨架质粒pPE3，按摩尔质量比1∶2，总质粒量400ug每瓶进行转染。

将400ug质粒和超纯水及2.5mol/L CaCl2在15ml离心管中混匀，然后逐滴加入2XBBS(50mmol/L BES，280mol/L NaCl，1.5mmol/L Na2HPO4，pH6.95)，边加入边尽力吹打以形成较小的钙磷颗粒。加完后在室温下孵育20min。

取出细胞，吸去培养基，用PBS清洗一次，然后将磷酸钙-DNA溶液均匀加入细胞生长至60％-70％汇合的HEK293A细胞中，并在37℃，5％CO2培养箱中继续培养，6h后，将细胞用PBS清洗一次，更换成DMEM培养基，继续培养。每三天更换一次培养基，约7-15天出现病毒空斑纹。当约90％被感染的细胞变圆并且部分漂浮，用培养基轻轻吹打将细胞脱离，然后将细胞和上清转移至15ml离心管中，在-80℃和37℃间反复冻融三次，然后4℃，3200g离心10min，除去上清，然后将剩下的细胞直接加入生长至60％-70％汇合的HEK293A细胞中，继续培养。

当约90％被感染的细胞变圆并且部分漂浮，用培养基轻轻吹打将细胞脱离，收集细胞和上清至15ml离心管中，然后4℃，3200g离心10min，除去上清。将细胞用pH8.0、10mmol/L Tris重悬。在-80℃保存。

(3)腺病毒的纯化

使用PEG8000沉淀-CsCl梯度离心-透析联用法对腺病毒进行纯化。

取出-80℃保存的细胞悬液，25℃水浴溶解，然后4℃、7000g离心10min，收集上清。每100ml上清加入50ml 20％PEG8000溶液(20％PEG8000，2.5M NaCl)，轻摇混匀后在冰上放置2h使病毒沉淀。将上述混合物在4℃ 7000g离心20min，弃去上清。将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20mM Tris-HCl，PH8.0)(溶液配置见下表)，病毒液应呈粉红色。

取一个新的50ml离心管，小心加入2ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液(溶剂为20mMTris-HCl，PH8.0)，然后再缓慢加入3ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液(溶剂为20mM Tris-HCl，PH8.0)，最后加入5ml的粉红色病毒悬浮液。使用26，000rpm，4℃离心2小时。

小心取出离心管，用注射器收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中。透析缓冲液为5％蔗糖，0.01M Tris-HCl，PH8.2mM MgCl2，4℃搅拌过夜，透析后收集病毒，测定病毒滴度。

使用PBS重悬病毒沉淀，并于-80℃保存。

(5)病毒滴度的测定(Q-PCR法)

取20ul浓缩病毒液，加入1ul RNAse-free DNAse，混匀，37℃水浴反应30min。然后4℃，12000rpm/min，离心10min，取10ul上清到1.5ml EP管中。加入90ul Dilution Buffer(1mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA，150mM NaCl)，混匀，37℃水浴30min。将EP管自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h，去除病毒的蛋白质外壳。然后100℃沸水浴10min，自然冷却至室温。然后进行Q-PCR检测滴度。

获得共表达人GM-CSF、PD1svFc、p53的重组腺相关病毒Adyb301，滴度达10X109pfu/L.

实施例3：Adyb301病毒表达GM-CSF蛋白的能力的检测

对实施例1中所述的图1中的全部表达盒进行包装和纯化，以下仅以图1中b表达盒所示的AAV2-GM-CSF-PD1scFv-P53(N15)重组腺相关病毒的包装和纯化为例，说明本发明中涉及到的重组腺相关病毒的包装和纯化。

(1)AAV293细胞培养

细胞采用含10％FBS的DMEM高糖培养基在37摄氏度、5％CO₂培养箱中培养，采用75cm²的细胞培养瓶。细胞生长至90％汇合时进行，传代弃去培养基，加入1mL0.25％胰蛋白酶，在37℃消化3min左右，注意在显微镜下观察细胞，当细胞皱缩，变圆时，加入9ml含10％FBS的DMEM培养基，吹打成单细胞悬液进行细胞计数，按1∶3的比例进行传代。

(2)病毒包装

将AAV293细胞进行细胞传代，然后在37℃，5％CO₂培养箱中培养，当细胞生长至60％-70％汇合时，进行转染。采用三质粒转染系统，将pAAV-mcs-GM-CSF-PD1scFv-P53(N15)和pAAV-RC和pHelper一同转染至AAV-293细胞，具体为将pAAV-mcs-GM-CSF-PD1scFv-P53(N15)和pAAV-RC和pHelper，按摩尔质量比1∶1∶1，总质粒量400ug每瓶进行转染。

将400ug质粒和超纯水及2.5mol/L CaCl₂在15ml离心管中混匀，然后逐滴加入2XBBS(50mmol/L BES，280mol/L NaCl，1.5mmol/L Na₂HPO₄，pH6.95)，边加入边尽力吹打以形成较小的钙磷颗粒。加完后在室温下孵育20min。

取出细胞，吸去培养基，用PBS清洗一次，然后将磷酸钙-DNA溶液均匀加入细胞生长至60％-70％汇合的AAV-293细胞中，并在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，18h后，更换成DMEM培养基，继续培养。72h后将培养基转移至15ml离心管中，用PBS清洗一次细胞，再加入少量PBS，用细胞刮板刮取瓶中的293细胞。如不立刻使用，将此细胞悬液转移至冻存管中，在-80℃保存。

(3)收获

将感染了病毒的AVV293细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中，1500g/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬。将细胞悬浮液在液氮和37℃水浴中反复转移，冻融四次，每次凝固和解冻约10min。每次融解后振荡混匀。

(4)病毒浓缩

将反复冻融的细胞然后在4℃，8000g离心15min，取上清至新的15ml离心管中。将之前的培养基上清也进行4℃，8000g离心15min，将两次离心的上清转移到同一个离心管中，混匀。用0.45um滤器过滤除杂质。加入1/2体积的1M NaCl，10％PEG8000溶液，混合均匀，4度过夜。

将过夜的上清溶液进行离心，12,000rpm，4℃，2h。然后弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌。加入核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟。用0.22um过滤头过滤，取滤出液，得到浓缩的AAV病毒。

(5)病毒滴度的测定(Q-PCR法)

取20ul浓缩病毒液，加入1ul RNAse-free DNAse，混匀，37℃水浴反应30min。然后4℃，12 000rpm/min，离心10min，取10ul上清到1.5ml EP管中。加入90ul Dilution Buffer(1mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA，150mM NaCl)，混匀，37℃水浴30min。将EP管自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h，去除病毒的蛋白质外壳。然后100℃沸水浴10min，自然冷却至室温。然后进行Q-PCR检测滴度。

获得共表达人GM-CSF、PD1svFc、p53(N15)的重组腺相关病毒AAV2-GM-CSF-PD1scFv-P53(N15)，滴度达10X10⁹pfu/L.

实施例4：Adyb302病毒表达IL-12蛋白的能力的检测

Adyb302感染HEK293细胞后，分别在12h，24h，48h，96h取细胞上清，用ELISA法检测细胞上清液中IL-12蛋白的含量。结果见图：

实施例5：Adyb303病毒表达IL-15蛋白的能力的检测

Adyb303感染HEK293细胞后，分别在12h，24h，48h，96h取细胞上清，用ELISA法检测细胞上清液中IL-15蛋白的含量。结果见图：

实施例6：修饰的重组腺病毒对不同类型肿瘤细胞杀伤活性的检测

1)将Hela299(宫颈癌细胞)按5x10³/孔接种至96孔培养皿中，接种24h后，将Adyb301、Adyb302、Adyb303、Adyb105进行稀释，分别以0、0.1、0.5、5、1、5、10、100、1000pfu/cell感染Hela299细胞(即0、0.1、0.5、5、1、5、10、100、1000MOI)，病毒作用2h后弃去含有病毒的培养液，换回正常培养液继续培养，5天后通过MTT法检测Ad1、AD2、AD3、Ad-p53对细胞的烧伤作用。在酶标仪中读取OD570，参考波长630nm。做8个复孔，独立重复三次。结果见图，在0.1MOIAdyb301、Adyb302、Adyb303、Adyb105对Hela299(宫颈癌细胞)均没有太高的杀伤作用。随着MOI的增加，从10MOI开始，Adyb301、Adyb302、Adyb303对Hela299(宫颈癌细胞)有明显的杀伤作用(细胞活性在20％左右)，并在1000MOI时，达到了95％左右的杀伤能力(细胞活性小与5％)。Adyb105在1000MOI时，对Hela299(宫颈癌细胞)也仅有60％的杀伤能力。表达三个分泌肽的Adyb301、Adyb302、Adyb303对Hela299(宫颈癌细胞)的杀伤作用相近，并远高于仅表达P53的Adyb105。

2)分别将Hela299(宫颈癌细胞)，Eca-109(食管癌细胞)，A549(肺癌细胞)，MCF7(乳腺癌细胞)，GBC-SD(胆囊癌细胞)，Caco-2(结肠腺癌细胞)，U251(胶质癌细胞)，PC-3(前列腺癌细胞)，HCT 116(结肠癌细胞)，SiHa(子宫颈癌细胞)，MG-63(骨肉瘤细胞)，A3T(淋巴细胞白血病细胞)细胞按5x10³/孔接种至96孔培养皿中，接种24h后，将Adyb301进行稀释，以100倍MOI(Mulitiplicity of infection病毒数量与细胞数量之比)感染上述肿瘤细胞2h，然后弃去病毒残液，换回正常培养基继续培养，5天后，通过MTT法检测AAV2-GM-CSF-PD1scFv-P53(N15)对各种细胞的杀伤作用。在酶标仪中读取OD570，参考波长630nm。做8个复孔，独立重复三次。

杀伤率＝1-[(测试孔平均OD值-试剂空白组平均OD值)/(阴性孔平均OD值-试剂空白组平均OD值)]，计算IC₅₀值(MOI IC₅₀)。

使用同样的方法检测Adyb302、Adyb303对上述肿瘤细胞的杀伤活力，结果见下表：

说明分泌表达三种嵌合蛋白的Adyb301、Adyb302、Adyb303对大部分的肿瘤细胞均有很好的杀伤作用，其杀伤能力基本在80％以上，对个别肿瘤细胞的杀伤能力能达到96％以上。

Adyb301、Adyb302、Adyb303均可分泌表达p53蛋白，能够很好的作用于p53突变的如MCF7，SiHa细胞。同时也能很好的作用于非p53突变的Caco-2、PC-3、HCT 116、MG-63细胞。

实施例7：Adyb301病毒裸鼠体内实验：

1)将处于对数期的U251肿瘤细胞，接种至BALB/c裸鼠内，检测本发明中构建的Adyb301、Adyb101、Adyb104、Adyb202对移植瘤生长的抑制作用，结果见附图7B。其具体操作如下：

取对数生长期U251细胞用生理盐水稀释至1×10⁸/mL，100uL/只注射于裸鼠侧腹部近腋下部位的皮下。持续观察裸鼠的情况，约5周后，接种区域的皮下出现米粒大小的硬结。将裸鼠随机分成11组，每组5只。用含2×10⁸pfu病毒量的100uL重组腺病毒病毒液在瘤内多点注射，隔日一次，共5次；空白对照组以生理盐水代替重组病毒注射，100uL×5次。在注射前以及注射后第3、6、9、12、15、18、21、24d测量瘤体生长情况，游标卡尺测量瘤体大小，以“a×b2×0.5”公式计算瘤体体积(a：最大径，b：最小径)。

附图7B显示这4种修饰的腺相关病毒均能减小肿瘤的体积，分泌表达GM-CSF、p53、PD1scFv的Adyb301减少肿瘤体积的效果最好，分泌表达GM-CSF和PD1scFv的Adyb202的效果次之，分泌表达GM-CSF的Adyb101和分泌表达PD1scFv的Adyb104的效果更弱一些。

2)将处于对数期的U251癌细胞用胰酶进行消化，制成浓度为2.0*10⁶/mL的细胞悬液，采用腹腔注射的方式接种至3-5周鼠龄的BALB/c裸鼠体内，注射体积为200μL。小鼠注射U251细胞21天后出现腹水瘤，成瘤率为90％，成瘤后病情发展较为缓慢，腹水瘤形成后的生存时间为26～38天。

将3-5周鼠龄的BALB/c裸鼠随机分为3组，每组20只，分别是对照组(PBS)，治疗组1.Adyb301治疗组2.Adyb101治疗组3.Adyb104，治疗组4.Adyb202。在裸鼠接种U251癌细胞出现腹水瘤后，腹腔内注射病毒，注射量为4*10⁵pfu/只；如附图7A对照组中20支小鼠从第26天开始陆续死亡，38天时已经全部死亡。治疗组1中的20支小鼠7-10天后腹水消失，20支小鼠中有18只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组2中的20支小鼠中有9只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组3中的20支有5只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组4中的20支小鼠中有12只存活.显示Adyb301的治疗效果要明显优于Adyb101、Adyb104、Adyb202。Adyb202治疗效果优于Adyb101、Adyb104。

实施例8：Adyb302病毒裸鼠体内实验：

1)将处于对数期的GBC-SD癌细胞，接种至BALB/c裸鼠内，检测本发明中构建的Adyb302、Adyb102、Adyb104、Adyb203对移植瘤生长的抑制作用，结果见附图7D。其具体操作如下：

取对数生长期GBC-SD细胞用生理盐水稀释至1X10⁸/mL，100uL/只注射于裸鼠侧腹部近腋下部位的皮下。持续观察裸鼠的情况，约5周后，接种区域的皮下出现米粒大小的硬结。将裸鼠随机分成11组，每组5只。用含2X10⁸pfu病毒量的100uL重组腺病毒病毒液在瘤内多点注射，隔日一次，共5次；空白对照组以生理盐水代替重组病毒注射，100uLX5次。在注射前以及注射后第7、14、21、28、35、42、49、测量瘤体生长情况，游标卡尺测量瘤体大小，以“axb2x0.5”公式计算瘤体体积(a：最大径，b：最小径)。

附图7D显示这4种修饰的腺相关病毒均能减小肿瘤的体积，分泌表达IL-12、p53、PD1scFv的Adyb302减少肿瘤体积的效果最好，分泌表达IL-12和PD1scFv的Adyb203的效果次之，分泌表达IL-12的Adyb102和分泌表达PD1scFv的Adyb104的效果更弱一些。

2)将处于对数期的GBC-SD癌细胞用胰酶进行消化，制成浓度为2.0*10⁶/mL的细胞悬液，采用腹腔注射的方式接种至3-5周鼠龄的BALB/c裸鼠体内，注射体积为200μL。小鼠注射GBC-SD细胞21天后出现腹水瘤，成瘤率为90％，成瘤后病情发展较为缓慢，腹水瘤形成后的生存时间为30～43天。

将3-5周鼠龄的BALB/c裸鼠随机分为3组，每组20只，分别是对照组(PBS)，治疗组1.Adyb302治疗组2.Adyb102治疗组3.Adyb104，治疗组4.Adyb203。在裸鼠接种GBC-SD癌细胞出现腹水瘤后，腹腔内注射病毒，注射量为4*10⁵pfu/只；如附图7C对照组中20支小鼠从第30天开始陆续死亡，43天时已经全部死亡。治疗组1中的20支小鼠7-10天后腹水消失，20支小鼠中有19只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组2中的20支小鼠中有2只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组3中的20支有6只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组4中的20支小鼠中有13只存活.显示Adyb302的治疗效果要明显优于Adyb102、Adyb104、Adyb203。Adyb203治疗效果优于Adyb102、Adyb104。

实施例9：Adyb303病毒裸鼠体内实验：

1)将处于对数期的Caco-2癌细胞，接种至BALB/c裸鼠内，检测本发明中构建的Adyb303、Adyb103、Adyb104、Adyb204对移植瘤生长的抑制作用，结果见附图7F。其具体操作如下：

取对数生长期Caco-2细胞用生理盐水稀释至1X10⁸/mL，100uL/只注射于裸鼠侧腹部近腋下部位的皮下。持续观察裸鼠的情况，约5周后，接种区域的皮下出现米粒大小的硬结。将裸鼠随机分成11组，每组5只。用含2X10⁸pfu病毒量的100uL重组腺病毒病毒液在瘤内多点注射，隔日一次，共5次；空白对照组以生理盐水代替重组病毒注射，100uLX5次。在注射前以及注射后第3、6、9、12、15、18、21、24d测量瘤体生长情况，游标卡尺测量瘤体大小，以“axb2x0.5”公式计算瘤体体积(a：最大径，b：最小径)。

附图7F显示这4种修饰的腺相关病毒均能减小肿瘤的体积，分泌表达IL-15、p53、PD1scFv的Adyb303减少肿瘤体积的效果最好，分泌表达IL-15和PD1scFv的Adyb203的效果次之，分泌表达IL-15的Adyb102和分泌表达PD1scFv的Adyb104的效果更弱一些。

2)将处于对数期的Caco-2癌细胞用胰酶进行消化，制成浓度为2.0*10⁶/mL的细胞悬液，采用腹腔注射的方式接种至3-5周鼠龄的BALB/c裸鼠体内，注射体积为200μL。小鼠注射Caco-2细胞21天后出现腹水瘤，成瘤率为90％，成瘤后病情发展较为缓慢，腹水瘤形成后的生存时间为25～37天。

将3-5周鼠龄的BALB/c裸鼠随机分为3组，每组20只，分别是对照组(PBS)，治疗组1.Adyb303治疗组2.Adyb103治疗组3.Adyb104，治疗组4.Adyb204。在裸鼠接种Caco-2癌细胞出现腹水瘤后，腹腔内注射病毒，注射量为4*10⁵pfu/只；结果如附图7E所示，对照组中20支小鼠从第25天开始陆续死亡，37天时已经全部死亡。治疗组1中的20支小鼠7-10天后腹水消失，20支小鼠中有18只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组2中的20支小鼠中有7只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组3中的20支有6只存活，生存期超过100天且无腹水瘤复发。治疗组4中的20支小鼠中有13只存活.显示Adyb303的治疗效果要明显优于Adyb103、Adyb104、Adyb204。Adyb204治疗效果优于Adyb103、Adyb104。

实施例9：修饰的腺病毒临床实施例

患者信息：男，72岁，右下肺癌转移纵膈淋巴结转移腰椎转移癌TNM分期：T4N2M1a

治疗方案：施用Adyb301(GM-SCF-P53-PD1scFv)，静脉注射1*10¹¹vp。

效果：一周后，腹癌胚抗原及糖链抗原125明显下降，癌胚抗原下降60％。糖链抗原125下降60％，病人自觉症状及生存状态明显好转。

Claims

1.一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白。

2.根据权力要求1所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的Ad优选5型腺病毒，经删除E1B19K与55K编码序列。

3.根据权力要求1-2所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白包含固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和肿瘤凋亡蛋白。

4.根据权力要求3所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的一种可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白中，用于固有免疫细胞的激活因子，选自白细胞介素、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)中的任意一种；

优选的，所述的白细胞介素为IL12或IL15。

5.根据权力要求4所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的一种可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白中，免疫检查点抑制剂，选自PD1、TIM3、LAG3中的任意一种单链抗体。

6.根据权力要求5所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的免疫检查点抑制剂优选为，PD1 scFv、TIM3 scFv、LAG3 scFv中的任意一种；

进一步优选的，所述的免疫检查点抑制剂为PD1 scFv。

7.根据权力要求3所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的一种可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白中，肿瘤凋亡蛋白是P53。

8.根据权力要求1所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其中所述经修饰的腺病毒载体包含可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白的核酸序列组合。

9.根据权力要求8所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其中所述经修饰的腺病毒载体包含可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白的核酸序列组合可操作地连接或插入再腺病毒载体E1B区。

10.根据权力要求8所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白的核酸序列组合，可以编码固有免疫刺激因子和免疫检查点抑制剂和肿瘤凋亡蛋白。

11.根据权力要求8-9所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白的核酸序列组合，包括可以编码固有免疫刺激因子GM-CSF或IL12或IL15和免疫检查点抑制剂PD1scFv或TIM3 scFv或LAG3 scFv中的任意一种和肿瘤凋亡蛋白P53。

12.根据权力要求8-9所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白的核酸序列组合含有信号肽和穿膜肽序列。

13.根据权力要求1-3所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，所述的可实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白的核酸序列组合含有内含子序列。

14.根据权力要求1-13所述的任一一种经修饰的腺病毒载体，其特征在于，所述的任一实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合肽或嵌合蛋白的核酸序列和/或任一实现分泌表达抗肿瘤细胞的嵌合蛋白和/或任一载体和/或任一病毒在制备治疗或预防不限癌种的肿瘤药物种的应用。