CN111575287B - 一种抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA及其应用 - Google Patents

一种抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA及其应用，属于生物技术领域。所述siRNA序列为2DL3‑1或/和2DL3‑2，其中，2DL3‑1的正义链如SEQ ID NO.9所示，反义链如SEQ ID NO.10所示；2DL3‑2的正义链如SEQ ID NO.11所示，反义链如SEQ ID NO.12所示。本发明的siRNA能明显特异性抑制KIR 2DL3受体表达，可使NK细胞激活，杀伤活性显著增强，能够有效应用于抗病毒和抗肿瘤的防治中。

Description

一种抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种通过抑制NK细胞KIR2DL3受体表达的siRNA技术及其应用。
背景技术
干细胞和免疫细胞是现代医学最热点的前沿技术领域，可以说，现代医学的重大疾病、常见疾病、慢性疾病、衰老与退化性疾病的治疗，没有这两个细胞的参与，将很难有飞跃性的进步。其中免疫细胞是人体免疫学的功能主体，在免疫系统中发挥支柱的作用。自然杀伤细胞(NK细胞)是细胞免疫的重要成员，也是先天免疫的重要组成部分，由于其发挥先天免疫、基础免疫、免疫调节的重要作用，而且在发挥作用时不需要预先活化，所以，在人体免疫系统功能发挥中占有重要一席，在免疫学领域临床应用中得到业界的高度重视。
近年来，NK细胞受到业界的高度重视，在癌症预防、肿瘤免疫治疗、健康管理和抗衰老等方面应用得到青睐。NK细胞发挥先天免疫、基础免疫的重要作用；而且在发挥作用时不需要预先活化，能在病原侵入人体的第一时间及时消灭和清除病原，避免引起疾病；也能在体内不需要预警、指示、动员等过程而直接杀死变异、癌变、衰老退化的细胞，是人体前沿防御、维持内环境稳定、免疫系统协同作战的重要组成部分。由于NK细胞的上述功能角色和作用特点，其能发挥很好的便捷、广谱、非特异作用，但随之出现的缺陷是非特异性、针对性作用相对较弱，尤其是在病毒性疾病、恶性疾病等治疗中，时常表现出作用力不足、疗效不确定等问题。
杀伤免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptors，KIR)是免疫球蛋白样超家族的成员，是NK细胞上的抑制性调节通路，可抑制NK活化和裂解活性。KIR受体是一个家族，有18个成员，分别是KIR 1D、KIR 2DL1-5、KIR 2DS1-5、KIR 3DL1-3、KIR3DS1、假基因xv、x和KIR 2DP1。依据目前国际KIR基因命名方法，KIR基因中的D代表其胞外结构中的Ig样结构，2D、3D代表胞外有2个或3个Ig样结构，L和S代表胞内尾段的长短，置于命名的末尾，后面的数字表示各个不同的成员。研究表明，通过调节KIR受体通路活性，可以提高NK细胞杀伤功能。
现有技术记载KIR受体封闭策略，主要通过抗体技术实现，具有操作方便、封闭效果好的优点。但细胞与抗体的铰链，造成这种策略的应用中容易出现以下缺陷：(1)携带抗体的NK细胞反复输注有一定的免疫副作用，产生异常免疫反应或发热等；(2)铰链抗体的NK细胞已经失去了其自然的特点，进入体内很容易被人体免疫识别为病态细胞而被杀死，或也会诱导身体异常免疫反应。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，并且副作用会很弱，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。
目前，通过KIR受体RNA干扰的技术活化NK细胞的专利只涉及到KIR3DL1的活化，主要用于抗艾滋病的研究中。研究表明，KIR 2DL3基因表达频率在中国人是63.0％，覆盖了多数个体，，KIR 2DL2基因表达频率是47.8％，KIR 2DL3基因表达频率是63.0％，三个基因表达可以覆盖所有中国人，可以通过检测三种KIR受体表达与否和表达强度，选择其中一种KIR基因进行干扰沉默。因此，本研发团队对上述三个基因沉默技术进行研究，以开展针对三个基因分别调控的研究领域应用。
发明内容
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明提供了一种抑制NK细胞KIR2DL3受体表达的siRNA，所述siRNA序列为2DL3-1或/和2DL3-2，其中，2DL3-1的正义链如SEQ ID NO.9所示，反义链如SEQ ID NO.10所示；2DL3-2的正义链如SEQ ID NO.11所示，反义链如SEQ IDNO.12所示。
根据本发明实施例的第二方面，本发明提供了一种重组腺病毒，包含上述的抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA。
根据本发明实施例的第三方面，本发明提供了一种上述的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
S1、合成含上述siRNA序列的DNA单链，退火形成带有粘性末端的双链片段；
S2、将目标基因克隆到pShuttle-H1穿梭载体中，经与pAd-Easy骨架载体共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建包含目的基因的重组腺病毒质粒；
S3、将重组腺病毒质粒由PacI酶切后，经脂质体介导，转染293细胞，包装后获得重组腺病毒。
根据本发明实施例的第四方面，本发明提供上述的重组腺病毒在制备抗病毒和抗肿瘤药物中的应用。
本发明实施例具有如下优点：
本发明的siRNA能明显特异性抑制KIR 2DL3受体表达，可使NK细胞激活，杀伤活性显著增强，能够有效应用于抗病毒和抗肿瘤的防治中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为pShuttle-H1穿梭质粒结构示意图；
图2为PCR鉴定结果；
图3为pShuttle-H1-D1-1的测序结果与目的片段对照；
图4-1为2～20号重组质粒电泳图，图4-2为1～4号重组质粒电泳图；
图5为重组腺病毒质粒PacI鉴定结果；
图6为基因组DNA鉴定结果；
图7为氯化铯梯度离心示意图；
图8为荧光标记的含有目的siRNA片断的病毒质粒转染NK细胞的情况；
图9为目标基因RNA干扰后24小时结果，NK细胞对靶细胞的杀伤作用变化；
图10为目标基因RNA干扰后48小时结果，NK细胞对靶细胞的杀伤作用变化。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。
实施例1
抑制NK细胞KIR受体(2DL1、2DL2、2DL3)表达的siRNA的设计步骤：
(1)在互联网上通过NCBI、DDBJ、BMBL三个基因数据库，检索NK细胞KIR 2DL1、KIR2DL2、KIR 2DL3基因序列，获得靶向mRNA或cDNA序列，在cDNA转录区+50～+100以后的下游序列设计siRNA序列。
(2)将选择的siRNA序列进行GEN-BAND BALST查询，确保所选siRNA编码不与其它基因序列同源。
先针对NK细胞KIR 2DL1、2DL2、2DL3三个受体分别设计了若干候选序列，再进行对比优选，最后每个受体确定了两条最优序列进入后续实验。
抑制NK细胞KIR 2DL1受体表达的siRNA包括2DL1-1和2DL1-2两条序列：
2DL1-1(靶位点为267碱基)：正义链为5’CUUCUCCAUCAGUCGGUU3’(SEQ ID NO.1)，反义链为5’CAUGCGACUGAUGGAGUU3’(SEQ ID NO.2)。
2DL1-2(靶位点为250碱基)：正义链为5’AGUCAAGUGACCCACUUU3’(SEQ ID NO.3)，反义链为5’AGCAGUGGGUCACUUUUU3’(SEQ ID NO.4)。
抑制NK细胞KIR 2DL2受体表达的siRNA包括2DL2-1和2DL2-2两条序列：
2DL2-1(靶位点为202碱基)：正义链为5’GGGAAGUUUAAGGACUUU3’(SEQ ID NO.5)，反义链为5’AAGUGUCCUUAAACUCUU3’(SEQ ID NO.6)。
2DL2-2(靶位点为258碱基)：正义链为5’AGCCAACUUCUCCAUUUU3’(SEQ ID NO.7)，反义链为5’ACCGAUGGAGAAGUUUUU3’(SEQ ID NO.8)。
抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA包括2DL3-1和2DL3-2两条序列：
2DL3-1(靶位点为857碱基)：正义链为5’UGCUGUUGUAAUGGAAUU3’(SEQ ID NO.9)，反义链为5’UUGGUCCAUUACAACAUU3’(SEQ ID NO.10)。
2DL3-2(靶位点为902碱基)：正义链为5’CAGGGAGGACUCUGAAUU3’(SEQ ID NO.11)，反义链为5’UUCAUCAGAGUCCUCGUU3’(SEQ ID NO.12)。
实施例2
(一)合成含siRNA序列的DNA单链
采用化学合成法合成含siRNA序列的DNA单链，包括DNA正链和DNA反链，DNA正链对应于siRNA序列的正义链，DNA反链对应于siRNA序列的反义链。具体地，
含有抑制NK细胞KIR 2DL1受体表达的siRNA序列的DNA单链：
D1-1：
正链为5’TCGACCCCTTCTCCATCAGTCGCATGTTCAAGAGACATGCGACTTTTTTGGAAA3’(SEQID NO.13)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAACTTCTCCATCAGTCGCATGTCTCTTGAACATGCGACTGATGGG3’(SEQ ID NO.14)。
D1-2：
正链为5’TCGACCCAGTCAAGTGACCCACTGCTTTCAAGAGAAGCAGTGGGTTTTTGGAAA3’(SEQID NO.15)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAAAGTCAAGTGACCCACTGCTTCTCTTGAAAGCAGTGGGTCACGG3’(SEQ ID NO.16)。
含有抑制NK细胞KIR 2DL2受体表达的siRNA序列的DNA单链：
D2-1：
正链为5’TCGACCCGGGAAGTTTAAGGACACTTTTCAAGAGAAAGTGTCCTTTTTTGGAAA3’(SEQID NO.17)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAAGGGAAGTTTAAGGACACTTTCTCTTGAAAAGTGTCCTTAAGG3’(SEQ ID NO.18)。
D2-2：
正链为5’TCGACCCAGCCAACTTCTCCATCGGTTTCAAGAGAACCGATTTTTTTGGAAA3’(SEQ IDNO.19)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAATGCTGTTGTAATGGACCAATCTCTTGAATTGGTCCATTACAACAG3’(SEQ ID NO.20)。
含有抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA序列的DNA单链：
D3-1：
正链为5’TCGACCCTGCTGTTGTAATGGACCA ATTCAAGAGATTGGTCCATATTTTTGGAAA3’(SEQ ID NO.21)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAATGCTGTTGTAATGGACCAATCTCTTGAATTGGTCCATTACAAGG3’(SEQ ID NO.22)。
D3-2：
正链为5’TCGACCCCAGGGAGGACTCTGATGAATTCAAGAGATTCATCAGATTTTTGGAAA3’(SEQID NO.23)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAACAGGGAGGACTCTGATGAATCTCTTGAATTCATCAGAGTCCTCG3’(SEQ ID NO.24)。
同时设计不针对任何NK细胞KIR基因的无关对照：
正链为5’TCGACCCTCTCGTATGTAGTGGCCTGTTCAAGAGACAGGCCACTATTTTTGGAAA3’(SEQID NO.25)，
反链为5’GATCTTTCCAAAAATCTCGTATGTAGTGGCCTGTCTCTTGAACAGGCCACTAGG3’(SEQID NO.26)。
上述相对应的DNA正链和反链退火形成带有粘性末端的双链片段D1-1、D1-2、D2-1、D2-2、D3-1、D3-3和无关对照。
(二)重组穿梭质粒的构建及鉴定
1、pShuttle-H1的SalI和BglII双酶切
酶切体系：10×H Buffer：5.0μl，SalI：1.0μl，BglII：1.0μl，pShuttle-H1：25.0μl，无菌水：18.0μl，反应条件：37℃孵箱孵育2h。
2、酶切产物回收
酶切产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，电泳时间充分，然后采用TIANGEN琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段：
(1)酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带(约7000bp)切下，置于1.5mlEP管中；
(2)加入300μl PN/100μg凝胶，置于50～60℃水浴孵育10min，其间不断地混匀，使其充分溶解；
(3)将其转移至已置于收集管中CB3柱中，静置1min；
(4)12000rpm×1min离心，弃去收集管中的液体；
(5)加入700μl的洗涤液PW，12000rpm×1min离心，弃去收集管中的液体；
(6)加入500μl的洗涤液PW，12000rpm×1min离心，弃去收集管中的液体；
(7)12000rpm×2min离心，将CB3柱置于一灭菌的1.5ml EP管中，在CB3柱中加入30ul无菌水(加在膜中央)；
(8)室温静置5min后，10700rpm×1min离心，将得到的产物置于-20℃保存，待用。
3、无关对照、D1-1、D1-2、D2-1、D2-2、D3-1、D3-2与回收酶切产物连接
连接体系：10×Ligase Buffer：1.0μl，Ligase：0.5μl，无关对照/D1-1/D1-2/D2-1/D2-2/D3-1/D3-2：0.5μl，回收酶切产物：4.0μl，无菌水：4.0μl，反应条件：24℃水浴放置1h。
4、连接产物转化DH5a感受态细胞
(1)将5μl的连接产物与100μl感受态细胞混匀后置于冰上放置30min；
(2)取出后，42℃水浴热击90s；
(3)冰上放置3～5min；
(4)加入600μl的LB培养基，于37℃×200rpm摇床振摇放置40min；
(5)取出400μl涂布于Kana+LB平板上，于37℃孵箱培养过夜。
5、克隆挑取及质粒提取、纯化
(1)挑取单个菌落，接种于5ml的Kana+LB液体培养基中，37℃×250rpm摇床振摇过夜；
(2)提取各管的质粒(TIANGEN)
(2-1)将培养液收集于5ml的离心管中，8000rpm×10min离心，收集菌液；
(2-2)用250μl的溶液P1重悬菌体，并将菌体转移至1.5ml的EP管中；
(2-3)加入250μl的裂解液P2，将EP管温和地上下颠倒6～8次；
(2-4)加入350μl的中和液P3，将EP管温和地上下颠倒6～8次，然后于12000rpm×10min离心；
(2-5)将上清转移至CB1柱中(置于收集管中)，12000rpm×1min离心；
(2-6)弃去收集管中的液体，向CB1柱中加入700μl的洗涤液PW，12000rpm×1min离心；
(2-7)弃去收集管中的液体，向CB1柱中加入500μl的洗涤液PW，12000rpm×1min离心；
(2-8)弃去收集管中的液体，12000rpm×2min离心；
(2-9)将CB1柱置于一灭菌的EP管中，向柱中央加入50μl的灭菌水，室温放置5min；
(2-10)10700rpm×1min离心，收集产物；
(3)将提取的质粒进行电泳，均有质粒条带出现，初步鉴定为阳性克隆。
6、质粒的PCR鉴定
设计PCR引物P1、P2，分别位于插入片段的两侧，然后通过pShuttle-H1作为对照，进行PCR扩增。
P1：5’CTgggAAATCACCATAAACg3’
P2：5’CTgCAAAACAgATACAAAACTACA3’
PCR反应体系：
提取的质粒：0.5μl，引物P1：0.5μl，引物P2：0.5μl，2×PCR mix：10μl，无菌水：8.5μl。温度循环程序：95℃加热2min；95℃加热30s，60℃加热30s；72℃加热30s；其中95℃至72℃共29个循环；72℃加热10min；22℃加热1min；
扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，结果参见图2，其中，1～6分别为1～6号克隆PCR扩增产物，N为pShuttle-H1扩增产物的无关对照，D为DL2000Marker，结果表明1、2、3、4、5、6号克隆鉴定正确。
7、将鉴定正确的克隆送往北京奥科生物技术有限公司进行测序，测序结果与目的片段相符(以pShuttle-H1-D1-1为例，结果如图3所示)，结果表明，我们成功获得重组穿梭质粒：pShuttle-H1-control(无关对照)、pShuttle-H1-D1-1、pShuttle-H1-D1-2、pShuttle-H1-D2-1、pShuttle-H1-D2-2、pShuttle-H1-D3-1、pShuttle-H1-D3-2。
(三)重组腺病毒质粒构建及鉴定
1、PmeI酶切重组穿梭质粒，并进行去磷酸化处理
酶切体系：重组穿梭质粒(pShuttle-H1-control(无关对照)、pShuttle-H1-D1-1、pShuttle-H1-D1-2、pShuttle-H1-D2-1、pShuttle-H1-D2-2、pShuttle-H1-D3-1、pShuttle-H1-D3-2)：30μl，Buffer4：5μl，BSA：5μl，PmeI：2μl，无菌水：8μl，反应条件：37℃孵箱孵育4h；
2、将酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收(操作方法同前)；
3、将割胶回收产物进行去磷酸化处理
反应体系：回收产物：20μl，去磷酸化酶：1.0μl，磷酸化酶Buffer：3.0μl，无菌水：6.0μl，反应条件：37℃孵箱孵育1h；灭活处理：65℃孵育5min；
4、取去磷酸化处理的酶切产物5μl电转化含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞进行同源重组；
5、挑取克隆、提取质粒后，进行0.6％琼脂糖凝胶电泳，以重组穿梭质粒为对照，观察质粒重组情况，结果如图4-1所示，其中，1为pShuttle-H1-D1-1质粒，2～5分别为pShuttle-H1-D1-1重组腺病毒质粒1～4号克隆，6～9为pShuttle-H1-D1-2重组腺病毒质粒1～4号克隆，10～13为pShuttle-H1-D2-1重组腺病毒质粒1～4号克隆；14～17为pShuttle-H1-D3-1重组腺病毒质粒的1～4号克隆，18～20为pShuttle-H1-control重组腺病毒质粒的1～3号克隆；H为DL2000 Marker。图4-2中，1为pShuttle-H1-D2-2重组腺病毒质粒克隆，3为pShuttle-H1-D3-2重组腺病毒质粒克隆，2、4分别为其它克隆作为参照，5为DL2000Marker。初步结果表明图4-1的2、3、4、5、7、8、9、10、12、13、14、16、18、19和图4-2的1、3为重组成功的克隆，初步确定获得Ad-pShuttle-H1-D1-1、Ad-pShuttle-H1-D1-2、Ad-pShuttle-H1-D2-1、Ad-pShuttle-H1-D2-2、Ad-pShuttle-H1-D3-1、Ad-pShuttle-H1-D3-2、Ad-pShuttle-H1-control。
6、选取部分初步鉴定正确的重组腺病毒质粒，进行PacI酶切鉴定，结果如图5所示，其中1为pShuttle-H1-D1-1重组腺病毒质粒1号克隆，2为pShuttle-H1-D1-2的2号克隆，3为pShuttle-H1-D2-1重组腺病毒质粒1号克隆，4为pShuttle-H1-D3-1重组腺病毒质粒的1号克隆，5为pShuttle-H1-control重组腺病毒质粒的1号克隆，H为λ-HindIII Marker。表明所挑取的克隆均为目的克隆，可用于下一步的实验；
7、重新利用一对一的引物扩增在重组腺病毒Ad-pshuttle-H1-D1-1、Ad-pshuttle-H1-D1-2、Ad-pshuttle-H1-D2-1、Ad-pshuttle-H1-D3-1、Ad-pshuttle-H1-control的相应序列的PCR扩增结果，C为正常293细胞基因组DNA，D为DL2000Marker。结果见图6。结果表明上述五个腺病毒含有的KIR siRNA序列被一一成功扩增，说明插入序列正确。
(四)重组腺病毒的构建与鉴定
1、腺病毒包装：将包装病毒的293细胞在6cm培养皿中培养，培养基为DMEM培养基，达到50％-70％融合，加入2μg重组腺病毒质粒转染，6小时后换成新鲜培养基；
2、病毒收集：病毒收集前观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，一般在病毒转染后10-21天形成空斑。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验；
3、病毒扩增：第二天，将培养基中病毒加入新鲜293细胞培养基中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩；
4、病毒纯化：病毒纯化采用PEG8000沉淀-CsCI密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如下：
(1)融化：提前1天将病毒从-80℃冰箱取出，室温水浴融化，收集全部细胞裂解物，7000×g 4℃离心10min，弃细胞碎片，收集上清液；
(2)PEG8000沉淀：每100ml上清加入50ml PEG8000(20％PEG8000，2.5M NaCI)，冰上放置1h使病毒沉淀(可适当延长时间)。7000×g 4℃离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCI溶液中(溶剂为20Mm Tris-HCI，PH8.0)，病毒液呈分红色，1～6的病毒密度离心图示结果见图7；
(3)CsCI梯度离心：CsCI梯度的制备方法如下，加入2ml密度为1.40g/ml的CsCI溶液(溶剂同上)，然后在缓慢加入3ml密度为1.30g/ml的CsCI溶液，再加入5ml的病毒悬浮液，使用Beckman SW28转子，26000rpm，4℃离心2小时；
(4)收集病毒：用注射器收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中；
(5)透析：在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml 1MTris-HCI，PH8.0，2ml 1M MgCl2定容至1L)中，4℃搅拌过夜，中间需要更换一次透析液，收集病毒，测定病毒滴度；
(6)重悬：500μl重悬病毒沉淀，一周内使用则置4℃保存，如需要长时间爱女存放需放置于-80℃保存。
5、测定腺病毒滴度
空斑是病毒诱导的细胞裂解形成的点状物，可以通过显微镜和肉眼观察。空斑形成单位(PFU)是单位体积的病毒形成的空斑数，是代表有活性的病毒粒子的浓度单位。
PFU测定方法：293细胞铺于60mm培养皿，24h后细胞密度接近100％后加入不同稀释度的病毒，37℃感染4-8小时，铺8ml低熔点胶(10％FBS，1.25％Agarose)。培养9-11天后对空斑进行计数来计算病毒滴度。
6、病毒转染细胞效率观察
体外实验研究，转染靶细胞，利用EGFP荧光标记显示，观察转染效率，结果见图8，其中，图8-1、8-2、8-3、8-4、8-5、8-6分别为6种病毒转染靶细胞的效率观察。结果表明转化系统稳定、有效，一次转染达到90％以上的高效转化。
实施例3
(一)K562细胞培养
K562细胞用RPMI-1640培养基培养，在细胞培养过程中，经常加入5％-20％的胎牛血清；初次接种细胞1×106个细胞/瓶。
1、当细胞铺满整个平皿(100mm)后，吸弃旧培养液，10ml PBS洗一遍；
2、0.25％胰酶(预热20分钟左右)2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落(或在显微镜下观察细胞之间分离)，立刻加5ml(RPMI-1640+10％FBS)终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞；
3、离心1000rpm*5min，弃上清，加RPMI-1640+10％FBS轻柔吹打；
4、将细胞悬液1：4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(RPMI-1640+10％FBS)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。
(二)siRNA抑制NK细胞KIR 2DL1受体表达实验
1、外周血采集：30ml，肝素抗凝
2、培养瓶铺板
(1)将辅助激活剂(30ml)置于37℃水浴复温10min，轻轻混匀；
(2)将激活剂(2ml)置于37℃水浴复温10min，轻轻混匀；
(3)225cm2培养瓶加入激活剂2ml，辅助激活剂30ml，混匀。封闭培养瓶；将其置入4℃冰箱，过夜即可使用，可储存2周(建议时间长于24小时)；
3、细胞因子配制
细胞培养前，取出IL-2(100万单位/支)和IL-15(100μg/支)，分别加入NK细胞优势扩增培养基1ml和2ml，轻轻混匀，置入4℃冰箱，2周内可使用；
4、单个核细胞分离、血浆采集和处理
(1)开启水浴箱，调整温度至56℃，以备灭火补体用；
(2)常规无菌采集外周血30ml，肝素抗凝；
(3)分离单个核细胞前，将已预铺板的培养瓶放置在37℃恒温箱内；
(4)使用NK扩增培养基稀释外周血1倍，将上述液体缓慢加入到Ficoll-Hypaque液上，密度梯度离心，离心(800g，25-30min)；
(5)轻轻取出离心管，吸取上层稀释的血浆，56℃，30分钟灭活补体后，离心(3000g，10min)去除血小板；
(6)收取单个核细胞层，生理盐水充分混匀。离心洗涤(500g，15min)；
注：如果在洗涤的生理盐水中加入0.38％枸橼酸纳，可减轻血小板的混杂现象。
(7)生理盐水悬浮细胞沉淀，再次离心洗涤(500g，8-10min)；
(8)使用NK细胞扩增培养基悬浮细胞。取10μl细胞悬液，加入白细胞稀释液(或3％冰醋酸)90μl，混匀后计细胞数；
5、细胞培养
(1)取出已经预铺板且置入37℃孵育的培养瓶，吸净稀释的激活剂，不需要洗涤；
(2)根据细胞计数结果，将细胞终浓度调整为1.5-2×106个/ml。单个核细胞悬液中加入IL-2、IL-15和自体血浆。IL-2、IL-15为1：1000(IL-2或IL-15：补液培养基体积)添加(以下补加的IL-2、IL-15用量皆为1：1000)；自体血浆浓度为2.5-5％；
(3)将细胞悬液加入到已经预铺板的培养瓶中，置入37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。次日，观察是否有污染现象；如无，继续培养至96小时；
(4)继续培养，每三天补液一次。补充新鲜培养基，总量为50-100ml/瓶，含2.5％血浆、IL-2和IL-15；
(5)培养第14天，每瓶加入100μl重组腺病毒，分别得到siRNA干扰目标基因NK细胞；
(三)NK细胞杀伤活性检测
靶细胞为K562肿瘤细胞，效应细胞为RNA干扰的NK细胞，效靶比例为20：1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔(E+T)，效应细胞对照孔(E)和靶细胞对照孔(T)，每组设3个复孔，于培养的24、48h收集细胞，采用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞仪检测K562细胞的CFSE/PI染色情况。结果见图9和图10，其中，a代表无干扰NK对照，b代表D3-1干扰RNA，c代表D3-2干扰RNA。
结果显示，经转染后24小时检测，杀伤效果已经达到高峰，比未活化NK杀伤效果提高了107.5％(2DL3-1)和74.2％(2DL3-2)；48小时检测，比未活化NK杀伤效果提高了40.9％(2DL3-1)和52.0％(2DL3-2)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 秦皇岛赛伯元生物技术有限公司
<120> 一种抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA及其应用
<130> 202003
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> Artificial Sequence
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cuucuccauc agucgguu 18
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Claims (3)

1.一种包含抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA的重组腺病毒，其特征在于，所述siRNA序列为2DL3-1或/和2DL3-2，其中，2DL3-1的正义链如SEQ ID NO.9所示，反义链如SEQID NO.10所示；2DL3-2的正义链如SEQ ID NO.11所示，反义链如SEQ ID NO.12所示。
2.权利要求1所述重组腺病毒在制备抗病毒和抗肿瘤药物中的应用。
3.一种权利要求1所述的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、合成含权利要求1所述的siRNA序列的DNA单链，退火形成带有粘性末端的双链片段；
S2、将目标基因克隆到pShuttle-H1穿梭载体中，经与pAd-Easy骨架载体共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183 内进行同源重组，构建包含目的基因的重组腺病毒质粒；
S3、将重组腺病毒质粒由PacI酶切后，经脂质体介导，转染293细胞，包装后获得重组腺病毒。
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