CN112592901B - 构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方法及其应用 - Google Patents

构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV‑SP‑GSDM‑NT的包装方法及其应用。本发明利用哺乳动物特异启动子SP和sf9昆虫细胞包装oAAV‑SP‑GSDM‑NT，避免了包装过程中具有很强细胞毒性的焦亡蛋白的表达，成功获得了安全，高效，高滴度的oAAV‑SP‑GSDM‑NT，其在体外可使多种肿瘤细胞发生焦亡，具有很好的肿瘤细胞杀伤作用，在体内可用于治疗动物肿瘤模型。oAAV‑SP‑GSDM‑NT与免疫调节剂联合形成治疗肿瘤的组合药剂，在动物肿瘤模型上比单独使用oAAV‑SP‑GSDM‑NT或免疫调节剂都具有更显著的溶瘤效果，说明该肿瘤治疗组合药剂具有很好的肿瘤治疗应用前景。

Description

构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方 法及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方法及其应用。
背景技术
细胞焦亡是一种由成孔蛋白家族gasdermins N段结构域介导的细胞胀大破裂并释放出大量炎症物质的细胞程序化死亡。诱使肿瘤细胞发生焦亡，不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，又可以触发强烈的抗肿瘤免疫反应，与免疫筛查位点PD-1/PD-L1阻断联合应用，可以发挥很好的溶瘤效果。
诱发肿瘤焦亡的方法是运用载体递送成孔蛋白家族gasdermins N段结构域(GSDM-NT)基因至肿瘤细胞内。目前已有的溶瘤病毒载体包装方法在包装时都无法避免目的基因(GSDM-NT)的表达，而GSDM-NT具有很强的细胞毒性，一旦在内部表达连细菌都会发生焦亡，最终无法包装获得表达焦亡蛋白的溶瘤病毒载体。
目前没有表达焦亡蛋白(GSDM-NT)的溶瘤病毒的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方法及其应用，该溶瘤腺相关病毒安全、高效、可用于人体及宠物治疗肿瘤。
为实现上述目的，本发明所设计一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方法，包括以下步骤：
1)扩增特异启动子(Specific Promoters，SP)，构建供体质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP
a.设计扩增引物，从质粒pMD18T-mCBA(包含哺乳动物特异启动子mCBA)或HEK293T细胞基因组(包含哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT)中扩增获得特异启动子SP片段；其中，所述特异启动子SP片段为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；
b.利用分子克隆技术替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP；
2)扩增获得焦亡蛋白基因
从人类或小鼠cDNA文库中扩增获得焦亡蛋白的基因(GSDM-NT)；其中，焦亡蛋白的基因选自人类焦亡蛋白基因和小鼠焦亡蛋白基因；
3)构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒
3.1构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组供体质粒
a.将pFastBac-ITR-SP-eGFP质粒用EcoR I及BamH I进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-mCBA；
b.设计扩增引物，以GSDMN为模板，扩增获得两端含有EcoR I及BamH I酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用EcoR I及BamH I进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-SP连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT；
3.2构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒
提取重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coli DH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落，扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒；
3.3构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒
将含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒；按照感染复数(MOI)＝0.1的比例，将第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-SP-GSDM-NT病毒；使用空斑实验测定第二代病毒滴度，以保证其滴度大于1×108pfu/ml；
4.oAAV-SP-GSDM-NT包装及纯化
扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，以保证其滴度大于1×108pfu/ml；按照每种病毒感染复数(MOI)＝1的比例，接种rBac-SP-GSDM-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞(2×106cells/ml)中，27℃震荡培养72小时后，按照500×g/min转速，离心收取感染的sf9昆虫细胞；按照2×107个细胞每1ml PBS的比例，重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清；后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩，得到溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT，采用荧光定量PCR对oAAV-SP-GSDM-NT滴度进行测定，分装后于-80℃保存。
进一步地，所述步骤1)中所述特异启动子为哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；其中，哺乳动物特异启动子mCBA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-gccgtaatgagacgcacaaactaatatcacaaactggaaatgtctatcaatatatagttgctctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgcatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgacgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctccttcgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggct-3’；
哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
5’-ggcccctccctcgggttaccccacagcctaggccgattcgacctctctccgctggggccctc gctggcgtccctgcaccctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgcg-3’。
再进一步地，所述步骤1)步骤a中所述引物序列为：
扩增mCBA序列的引物：
mCBA-F:5’-ctgcggccgcacgcgtgccgtaatgagacgcacaaac-3’
mCBA-R:5’-ctttgtagtccattcagaattcagccgccggtcacacgccag-3’
扩增hTERT序列的引物：
hTERT-F:5’-ctgcggccgcacgcgtggcccctccctcgggttacc-3’
hTERT-R:5’-ctttgtagtccattcagaattccgcgggggtggccggggccag-3’。
再进一步地，所述步骤2)中，
所述步骤2)中，人类焦亡蛋白基因选自GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT、GSDMD-NT和GSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：3～7所示；具体如下：
GSDMA-NT序列：
5’-atgaccatgtttgaaaatgtcacccgggccctggccagacagctaaaccctcgaggggacc tgacaccacttgacagcctcatcgacttcaagcgcttccatcccttctgcctggtgctgaggaagaggaagagcacgctcttctggggggcccggtacgtccgcaccgactacacgctgctggatgtgcttgagcccggcagctcaccttcagacccaacagacactgggaattttggctttaagaatatgctggacacccgagtggagggagatgtggatgtaccaaagacggtgaaggtgaagggaacggcagggctctcgcagaacagcactctggaggtccagacactcagtgtggctcccaaggccctggagaccgtgcaggagaggaagctggcagcagaccacccattcctgaaggagatgcaagatcaaggggagaacctgtatgtggtgatggaggtggtggagacggtgcaggaggtcacactggagcgagccggcaaggcagaggcctgcttctccctccccttcttcgccccattggggctacagggatccataaatcacaaggaggctgtaaccatccccaagggctgcgtcctggcctttcgagtgagacagctgatggtcaaaggcaaagatgagtgggatattccacatatctgcaatgataacatgcaaaccttccctcctggagaaaagtcaggagaggagaaggtcatccttatccaggcatctgatgttgggtga-3’；
GSDMB-NT序列：
5’-atgttcagcgtatttgaggaaatcacaagaattgtagttaaggagatggatgctggaggggatatgattgccgttagaagccttgttgatgctgatagattccgctgcttccatctggtgggggagaagagaactttctttggatgccggcactacacaacaggcctcaccctgatggacattctggacacagatggggacaagtggttagatgaactggattctgggctccaaggtcaaaaggctgagtttcaaattctggataatgtagactcaacgggagagttgatagtgagattacccaaagaaataacaatttcaggcagtttccagggcttccaccatcagaaaatcaagatatcggagaaccggatatcccagcagtatctggctacccttgaaaacaggaagctgaagagggaactacccttttcattccgatcaattaatacgagagaaaacctgtatctggtgacagaaactctggagacggtaaaggaggaaaccctgaaaagcgaccggcaatataaattttggagccagatctctcagggccatctcagctataaacacaagggccaaagggaagtgaccatccccccaaatcgggtcctgagctatcgagtaaagcagcttgtcttccccaacaaggagacgatgaatattcatttcaggggcaaaacaaaatcctttccagaagagaaggatggtgcttcatcctgtttaggaaagtctttgggttcggaggattccagaaacatgaaggagaagttggaggacatggagagtgtcctcaaggacctgacagaggagaagagaaaagattag-3’；
GSDMC-NT序列：
5’-atgccctccatgttggaacgcattagcaaaaatttggtcaaagagattggaagcaaagacctgacacctgtcaaatacctattgagtgccaccaaattacgtcagtttgttatattacgaaagaagaaggattctcgttcatcattttgggaacaatctgactatgttccagttgaattctccctcaatgacatcctggagccaagttcttcagtcctagaaactgttgtgacaggaccgttccacttcagtgacattatgatccagaagcataaggctgacatgggtgtgaatgttggtatagaagtgagtgtgtcaggggaggcctctgtggaccatggatgctccctcgagtttcaaattgttaccatcccatcaccaaacctggaagactttcaaaaaaggaaactgttggatccagagccatcatttctgaaggagtgccggaggagaggggacaacctgtacgtggtgacagaggctgttgaactgatcaacaatactgtgctgtacgatagcagtagtgtgaatattttagggaaaattgctctttggattacctatggcaagggtcaaggccaaggagagagtctcagagtgaagaagaaggcgctgactcttcagaaaggcatggtgatggcttataagagaaagcagctggttatcaaggagaaagccattctcatctcagatgatgatgaacagagaacctttcaagatgagtacgaaatttccgaaatggtaggctactgtgctgcgaggagtgaggggtga-3’；
GSDMD-NT序列：
5’-atggggtcggcctttgagcgggtagtccggagagtggtccaggagctggaccatggtggggagttcatccctgtgaccagcctgcagagctccactggcttccagccctactgcctggtggttaggaagccctcaagctcatggttctggaaaccccgttataagtgtgtcaacctgtctatcaaggacatcctggagccggatgccgcggaaccagacgtgcagcgtggcaggagcttccacttctacgatgccatggatgggcagatacagggcagcgtggagctggcagccccaggacaggcaaagatcgcaggcggggccgctgtgtctgacagctccagcacctcaatgaatgtgtactcgctgagtgtggaccctaacacctggcagactctgctccatgagaggcacctgcggcagccagaacacaaagtcctgcagcagctgcgcagccgcggggacaacgtgtacgtggtgactgaggtgctgcagacacagaaggaggtggaagtcacgcgcacccacaagcgggagggctcgggccggttttccctgcccggagccacgtgcttgcagggtgagggccagggccatctgagccagaagaagacggtcaccatcccctcaggcagcaccctcgcattccgggtggcccagctggttattgactctgacttggacgtccttctcttcccggataagaagcagaggaccttccagccacccgcgacaggccacaagcgttccacgagcgaaggcgcctggccacagctgccctctggcctctccatgatgaggtgcctccacaacttcctgacagattag-3’；
GSDME-NT序列：
5’-atgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaatgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagattga-3’；
小鼠焦亡蛋白基因选自mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT和mGSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：8～10所示；具体如下：
mGSDMA3-NT序列：
5’-atgcctgtgtttgaggatgtcacccgggccctggttagagagctgaaccctcgaggggatct gacacccctagacagcctcatcgacttcaaacactttcgtcccttctgcctggtgctgaggaagaggaagagcacattgttctggggagcccgctatgtgcgcaccgactacactctcctggatttgctggagccgggcagctccccctcagatctgacagacagtggcaactttagctttaagaatatgctggatgtccaagtacagggacttgtggaagtgccaaagacagtgaaggtaaaggggactgcgggtctgtcacaaagcagcacactgga ggtgcagacactcagcgtggctccctcggctctggagaacttgaagaaggagaggaaactgtcagcagaccactcgttcctgaacgagatgaggtatcatgagaagaacctgtatgtggtgatggaggcagtagaagccaagcaggaagttactgtggagcaaactggcaacgcaaatgccatcttctctctccccagcttggctctactgggactacagggatccttgaacaacaacaaggctgtaaccatccccaagggctgtgtcctggcctatcgagtgagactactgagagtctttttgttcaatctttgggatattccgtacatttgcaatgacagcatgcaaaccttccctaagatcaggcgtgtaccttgcagtgccttcatatctcctacccagatgatatctgaagagccagaagaagagaagctcattggggagtga-3’；
mGSDMD-NT序列：
5’-atgccatcggcctttgagaaagtggtcaagaatgtgatcaaggaggtaagcggcagcagag gcgatctcattccggtggacagcctgcggaactccaccagcttcaggccctactgccttctgaacaggaaattttcaagctcaaggttctggaaaccccgttattcatgtgtcaacctgtcaatcaaggacatcctggagcccagtgctccagaaccagaaccggagtgttttggctccttcaaagtctctgatgtcgtcgatgggaacattcagggcagagtgatgttgtcaggcatgggagaagggaaaatttctggtggggctgcagtgtctgacagttccagtgcctccatgaatgtgtgtatactgcgtgtgactcagaagacctgggagaccatgcagcatgaaaggcaccttcagcagcctgagaacaaaatcctgcaacagcttcggagtcgtggggatgacctgtttgtggtgaccgaggtgctgcagacaaaggaggaagtgcagatcactgaggtccacagccaagagggctcaggccagtttacgctgcctggggctttatgcttgaagggtgaaggcaagggccaccaaagccggaagaagatggtgaccattcctgcaggcagcatcctggcattccgagtggcccaactgcttattggctctaaatgggatatccttctcgtctcagatgagaaacagaggacctttgagccctcctcaggtgacagaaaagcagtgggccagaggcaccatggcctcaatgtgcttgctgcgctttgttccatcggaaagcagctcagtctcctgtcagattag-3’；
mGSDME-NT序列：
5’-atgtttgccaaagcaactcgaaattttcttaaagaagttgatgctggaggagacctgatttcagtctcacacttgaacgactctgacaagctgcaacttctaagtctggtgaccaaaaagaagagatactggtgctggcagagacccaagtaccagattttatctgccaccctggaagatgtactcacagaagggcactgtctcagtccagtggttgtggagtcagacttcgtgaaatacgagagcaagtgtgagaaccataagagcggggctattgggacagtcgtggggaaggtcaagctgaacgttggtggcaaaggcgtggtggagagtcactcttcgtttggaaccctgaggaagcaggaggtggacgtgcagcagctcatccaggatgccgtcaagagaacagttaatatggacaacctggtacttcagcaggtgctagagagcaggaacgaggtcctgtgtgtgctgacgcagaagatcatgaccacgcagaagtgcgtgatttctgagcatgtgcagtcggaggagacgtgtggaggcatggtggggatccagaccaagactatacaggtgtcagcaacggaggatgggacggtcaccacggacac caatgtagtgctggagatccctgctgccaccaccattgcctatggcatcatggagctgtttgtgaaacaagatggccagtttgaattctgcctcctccaagggaaacatggtggcttcgagcatgagaggaaactagactctgtctacttggaccccctggcctacagagagttcgcctttctggacatgctggattag-3’。
再进一步地，所述步骤3)第3.1的b中，GSDM-NT扩增引物为：
GSDMA-NT的引物：
GSDMA-NT-F：5’-ctgaattcatgaccatgtttgaaaatgtcac-3’；
GSDMA-NT-R：5’-gaggatcctcacccaacatcagatgcctg-3’；
GSDMB-NT的引物：
GSDMB-NT-F：5’-ctgaattcatgttcagcgtatttgaggaaatc-3’；
GSDMB-NT-R：5’-gaggatccctaatcttttctcttctcctc-3’；
GSDMC-NT的引物：
GSDMC-NT-F：5’-ctgaattcatgccctccatgttggaacgc-3’；
GSDMC-NT-R：5’-gaggatcctcacccctcactcctcgcag-3’；
GSDMD-NT的引物：
GSDMD-NT-F：5’-ctgaattcatggggtcggcctttgagcg-3’；
GSDMD-NT-R：5’-gaggatccctaatctgtcaggaagttgtg-3’；
GSDME-NT的引物：
GSDME-NT-F：5’-ctgaattcatgtttgccaaagcaaccag-3’；
GSDME-NT-R：5’-gaggatcctcaatctggcatgtctatg-3’；
mGSDMA3-NT的引物：
mGSDMA3-NT-F：5’-ctgaattcatgcctgtgtttgaggatgtcac-3’；
mGSDMA3-NT-R：5’-gaggatcctcactccccaatgagcttctc-3’；
mGSDMD-NT的引物：
mGSDMD-NT-F：5’-ctgaattcatgccatcggcctttgagaaag-3’；
mGSDMD-NT-R：5’-gaggatccctaatctgacaggagactgagc-3’；
mGSDME-NT的引物：
mGSDME-NT-F：5’-ctgaattcatgtttgccaaagcaactcg-3’；
mGSDME-NT-R：5’-gaggatccctaatccagcatgtccagaaaggc-3’；
本发明还提供了一种上述方法获得的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT在制备治疗肿瘤的药品中的应用。
进一步地，所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌或宫颈癌。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的组合药剂，包括有效量的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT、免疫调节剂和辅料；其中，所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌或宫颈癌。
进一步地，免疫调节剂为程序性细胞死亡受体1(Programmed cell Death-1,PD-1)分子阻断剂或程序性细胞死亡配体1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)分子阻断剂或PD-L1抗体或PD-1抗体。
再进一步地，所述免疫调节剂为PD-L1分子阻断剂。
再进一步地，所述肿瘤为乳腺癌。
本发明的原理：
腺相关病毒是一种已被应用于临床基因治疗的载体，具有很好的安全性，且其可以通过杆状病毒/sf9昆虫细胞包装获得，所以可以选用哺乳动物特异启动子或哺乳动物肿瘤细胞特异启动子来避免GSDM-NT基因在sf9昆虫细胞的表达，从而最终包装出可用于人类肿瘤治疗的表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP。
本发明的有益效果：
本发明选用特异启动子SP(哺乳动物特异启动子mCBA或哺乳动物肿瘤特异启动子hTERT)，利用腺相关病毒的杆状病毒/sf9昆虫细胞包装系统，避免了焦亡蛋白基因在包装时的毒性，成功获得了表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT。该溶瘤病毒可在细胞水平上高效杀伤宫颈癌Hela细胞、肝癌Hep3B细胞、乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞等肿瘤细胞。该溶瘤病毒在活体水平上也可以治疗原位大鼠脑胶质瘤模型，和原位小鼠乳腺癌模型。同时该溶瘤病毒与PD-L1阻断剂联合能起到很好的溶瘤效果。该溶瘤病毒安全，高效，可用于肿瘤治疗。
附图说明
图1为哺乳动物特异启动子mCBA在昆虫细胞sf9中不表达；
图2为pFastBac-ITR-mCBA-eGFP质粒图谱；
图3为pFastBac-ITR-mCBA-GSDMD-NT质粒图谱；
图4为oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染导致肿瘤细胞发生焦亡；
图5为oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染肿瘤细胞后的细胞死亡率；
图6为oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染肿瘤细胞后的细胞存活率；
图7为oAAV-mCBA-GSDMD-NT治疗原位胶质瘤大鼠模型；
图中，图7A为实验时间轴，图7B为体重监测数据，图7C为脑组织照片；
图8为oAAV-mCBA-GSDMD-NT治疗原位乳腺癌小鼠模型，
；
图中，图8A为实验时间轴，图8B为肿瘤体积监测数据，图8C为肿瘤及脾脏照片；
图9为oAAV-mCBA-GSDMD-NT和PD-L1抑制剂联合治疗原位乳腺癌小鼠模型；
图中，图9A为肿瘤大小照片，图9B为肿瘤重量；
图10为pFastBac-ITR-hTERT-eGFP质粒图谱；
图11为pFastBac-ITR-hTERT-GSDME-NT质粒图谱；
图12为oAAV-hTERT-GSDME-NT感染导致肿瘤细胞发生焦亡；
图13为oAAV-hTERT-GSDME-NT感染肿瘤细胞后的细胞死亡率；
图14为oAAV-hTERT-GSDME-NT感染肿瘤细胞后的细胞存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
筛选哺乳动物特异启动子mCBA
1.利用分子克隆技术，从质粒pMD18T-mCBA中扩增获得哺乳动物特异启动子mCBA片段，从质粒pCAGGS中扩增获得启动子CAG片段，用mCBA片段和CAG片段替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-mCBA-eGFP和pFastBac-ITR-CAG-eGFP；
2.将pFastBac-ITR-CMV-eGFP，pFastBac-ITR-mCBA-eGFP和pFastBac-ITR-CAG-eGFP分别转染sf9昆虫细胞，48小时后用绿色荧光蛋白观察eGFP表达情况(图1)；
结果表明：哺乳动物特异启动子mCBA在sf9昆虫细胞不启动，可用于后续利用杆状病毒/sf9昆虫细胞包装系统包装表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒。
实施例2
构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDMD-NT的方法，包括以下步骤：
1.扩增哺乳动物特异启动子mCBA，构建供体质粒pFastBac-ITR-CBA-eGFP
a.设计扩增引物，从质粒pMD18T-mCBA(包含哺乳动物特异启动子mCBA)中扩增获得哺乳动物特异启动子mCBA片段；
b.利用分子克隆技术，用哺乳动物特异启动子mCBA片段替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-mCBA-eGFP(图2)。
2.扩增获得GSDMD-NT基因
从人类cDNA文库中扩增获得GSDMD-NT基因，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：6所示：
5’-atggggtcggcctttgagcgggtagtccggagagtggtccaggagctggaccatggtggg gagttcatccctgtgaccagcctgcagagctccactggcttccagccctactgcctggtggttaggaagccctcaagctcatggttctggaaaccccgttataagtgtgtcaacctgtctatcaaggacatcctggagccggatgccgcggaaccagacgtgcagcgtggcaggagcttccacttctacgatgccatggatgggcagatacagggcagcgtggagctggcagccccaggacaggcaaagatcgcaggcggggccgctgtgtctgacagctccagcacctcaatgaatgtgtactcgctgagtgtggaccctaacacctggcagactctgctccatgagaggcacctgcggcagccagaacacaaagtcctgcagcagctgcgcagccgcggggacaacgtgtacgtggtgactgaggtgctgcagacacagaaggaggtggaagtcacgcgcacccacaagcgggagggctcgggccggttttccctgcccggagccacgtgcttgcagggtgagggccagggccatctgagccagaagaagacggtcaccatcccctcaggcagcaccctcgcattccgggtggcccagctggttattgactctgacttggacgtccttctcttcccggataagaagcagaggaccttccagccacccgcgacaggccacaagcgttccacgagcgaaggcgcctggccacagctgccctctggcctctccatgatgaggtgcctccacaacttcctgacagattag-3’；
3.构建含有ITR-mCBA-GSDMD-NT的重组杆状病毒
3.1构建含有ITR-mCBA-GSDMD-NT的重组供体质粒
将pFastBac-ITR-mCBA-eGFP质粒用EcoR I及BamH I进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-mCBA；利用GSDMD-NT扩增引物，GSDMD-NT-F：5’-ctgaattcatggggtcggcctttgagcg-3’，
GSDMD-NT-R：5’-gaggatccctaatctgtcaggaagttgtg-3’；
以GSDMD-NT为模板，扩增获得两端含有EcoR I及BamH I酶切位点序列的GSDMD-NT基因片段，用EcoR I及BamH I进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-mCBA连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒FastBac-ITR-mCBA-GSDMD-NT(图3)。
3.2构建含有ITR-mCBA-GSDMD-NT的重组杆状病毒质粒
提取重组供体质粒pFastBac-ITR-mCBA-GSDMD-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coli DH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落。扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-mCBA-GSDMD-NT的重组杆状病毒质粒。
3.3构建含有ITR-mCBA-GSDMD-NT的重组杆状病毒
将含有ITR-mCBA-GSDMD-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-mCBA-GSDMD-NT病毒；按照感染复数(MOI)＝0.1的比例，将第一代
rBac-mCBA-GSDMD-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-mCBA-GSDMD-NT病毒；使用空斑实验测定第二代病毒滴度，以保证其滴度大于1×108pfu/ml。
4.oAAV-SP-GSDMD-NT包装及纯化
扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，以保证其滴度大于1×108pfu/ml。按照每种病毒感染复数(MOI)＝1的比例，接种rBac-mCBA-GSDMD-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞(2×106cells/ml)中，27℃震荡培养72小时后，按照500×g/min转速，离心收取感染的sf9昆虫细胞。按照2×107个细胞每1ml PBS的比例，重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清。后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩。采用荧光定量PCR对oAAV--mCBA-GSDMD-NT滴度进行测定，分装后于-80℃保存。
根据实际情况，利用上述方法可以从人类cDNA文库中分别扩增获得GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT和GSDME-NT；从小鼠cDNA文库中分别扩增获得mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT和mGSDME-NT(它们的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4～10所示)；任意选用上述一个序列代入上述方法中，包装得到溶瘤相关腺相关病毒oAAV-mCBA-GSDM-NT。
实施例3
上述oAAV-mCBA-GSDMD-NT在细胞水平上可以杀伤肝癌Hep3B细胞、乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞
使用oAAV-mCBA-GSDMD-NT分别感染肝癌Hep3B细胞、乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞。72小时后，加入碘化丙啶(Propidium Iodide)和膜联蛋白V-APC(Annexin V-APC)检测oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染导致肿瘤细胞的焦亡情况，结果显示oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染可以导致肝癌Hep3B细胞、乳腺癌4T1细胞和胶质瘤C6细胞发生焦亡(图4)。
另外，在oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染肿瘤细胞72小时后，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒和ATP检测试剂盒分别检测细胞死亡率及存活率，结果显示相对于对照组，oAAV-mCBA-GSDMD-NT感染组的肿瘤细胞死亡率更高(图5)，存活率更低(图6)。
以上数据说明oAAV-mCBA-GSDMD-NT在细胞水平具有很好的溶瘤效果。
实施例4
上述oAAV-mCBA-GSDMD-NT治疗原位脑胶质瘤大鼠模型
利用脑立体定位仪，在180-220g体重的雄性Wirstar大鼠的左侧纹状体内注射1×106个C6细胞，构建原位脑胶质瘤大鼠模型。在瘤接种后第5天，瘤内注射10微升oAAV-mCBA-GSDMD-NT(1×1012病毒粒子/毫升)或PBS，随后监测大鼠体重。结果显示(图7)，与对照组比，溶瘤病毒治疗组体重维持稳定，且在建模第27天起有显著上升趋势；后期取脑切片发现，实验组肿瘤接种部位有溶瘤后形成的空洞。说明oAAV-mCBA-GSDMD-NT可以用于治疗脑胶质瘤。
实施例5
上述oAAV-mCBA-GSDMD-NT治疗原位乳腺癌小鼠模型
在8周龄的雌性Balb/c小鼠的右侧第四对乳房脂肪垫内注射1×106个4T1细胞，构建原位乳腺癌小鼠模型。在瘤接种后第5天，瘤内注射10微升oAAV-mCBA-GSDMD-NT(1×1012病毒粒子/毫升)或PBS，随后监测肿瘤大小。结果显示(图8)，与对照组相比，溶瘤病毒治疗组肿瘤体积较小，且脾肿大情况较对照组小。说明oAAV-mCBA-GSDMD-NT可以用于治疗乳腺癌。
实施例6
治疗肿瘤的组合药剂1治疗原位乳腺癌小鼠模型
治疗肿瘤的组合药剂1为oAAV-mCBA-GSDMD-NT和PD-L1分子阻断剂联合药剂，在8周龄的雌性Balb/c小鼠的右侧第四对乳房脂肪垫内注射1×106个4T1-luc细胞，构建原位乳腺癌小鼠模型。在瘤接种后第6天，瘤内注射10微升oAAV-mCBA-GSDMD-NT或PBS。在瘤接种后第14天，对PD-L1分子阻断剂单独治疗组，oAAV-mCBA-GSDMD-NT和PD-L1分子阻断剂联合治疗组进行连续7天腹腔注射PD-L1分子阻断剂。
结果表明oAAV-mCBA-GSDMD-NT和PD-L1分子阻断剂联合治疗组肿瘤更小(图9)，可显著抑制肿瘤生长。说明治疗肿瘤的组合药剂1有很好的肿瘤治疗效果。
实施例7
构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-hTERT-GSDME-NT的方法，包括以下步骤：
1.扩增哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT，构建供体质粒pFastBac-ITR-hTERT-eGFP
a.设计扩增引物，从HEK 293T细胞基因组(包含哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT)中扩增获得哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT；
b.利用分子克隆技术，用哺乳动物肿瘤细胞特异启动子hTERT片段替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-hTERT-eGFP(图10)。
2.扩增获得GSDME-NT基因
从人类cDNA文库中扩增获得GSDME-NT基因，其核苷酸序列依次如核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示：
5’-atgtttgccaaagcaaccaggaattttcttagagaagttgatgctgatggtgacctgattgcagtatcaaatctgaa tgactctgataagttacagcttctaagtctggtgacaaaaaagaagagattctggtgctggcagagacccaagtaccagtttttatccctcacccttggcgatgtactcatagaagaccaatttccgagtccagtggtcgtggagtcggactttgtgaaatacgagggcaagtttgcaaaccacgtgagtggaaccctggagactgcactggggaaggtcaagctgaacctggggggcagcagccgcgtagagagccagtcttcatttggaaccctgaggaagcaggaggtggatttgcagcagctcatcagagactctgccgagagaacaataaatctgagaaaccctgtgctccagcaggtgctggaaggaaggaatgaggtcctgtgcgttttgacacagaagatcacgacgatgcagaagtgtgtgatctctgagcacatgcaggtcgaggagaagtgtggtggcatcgtgggcatccagaccaagacggtgcaggtgtcagcgacggaggatgggaatgtcaccaaggactccaacgtggtgctggagatcccagctgccaccaccattgcctacggtgtcattgagttatacgtgaaactggacggccagttcgagttctgccttctccgagggaagcaaggtggcttcgagaacaagaagagaattgactctgtctacctggaccccctggtctttcgagagtttgcattcatagacatgccagattga-3’；
3.构建含有ITR-hTERT-GSDME-NT的重组杆状病毒
3.1构建含有ITR-hTERT-GSDME-NT的重组供体质粒
将pFastBac-ITR-hTERT-eGFP质粒用EcoR I及BamH I进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-hTERT；利用GSDME-NT扩增引物，GSDME-NT-F：5’-ctgaattcatgtttgccaaagcaaccag-3’；
GSDME-NT-R：5’-gaggatcctcaatctggcatgtctatg-3’；
以GSDME-NT为模板，扩增获得两端含有EcoR I及BamH I酶切位点序列的GSDME-NT基因片段，用EcoR I及BamH I进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-hTERT连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒pFastBac-ITR-hTERT-GSDME-NT(图11)。
3.2构建含有ITR-hTERT-GSDME-NT的重组杆状病毒质粒
提取重组供体质粒pFastBac-ITR-hTERT-GSDME-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coli DH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落。扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-hTERT-GSDME-NT的重组杆状病毒质粒。
3.3构建含有ITR-hTERT-GSDME-NT的重组杆状病毒
将含有ITR-hTERT-GSDME-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-hTERT-GSDME-NT病毒；按照感染复数(MOI)＝0.1的比例，将第一代rBac-hTERT-GSDME-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-hTERT-GSDME-NT病毒；使用空斑实验测定第二代病毒滴度，以保证其滴度大于1×108pfu/ml。
4.oAAV-hTERT-GSDME-NT包装及纯化
扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，以保证其滴度大于1×108pfu/ml。按照每种病毒感染复数(MOI)＝1的比例，接种rBac-hTERT-GSDME-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞(2×106cells/ml)中，27℃震荡培养72小时后，按照500×g/min转速，离心收取感染的sf9昆虫细胞。按照2×107个细胞每1ml PBS的比例，重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，4℃，10000g离心10min后收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶至终浓度为50U/mL，混匀，于37℃水浴锅中孵育1h，4℃，10000g离心10min，收集上清。后利用碘克沙醇密度梯度离心进行进一步纯化；纯化后用采用100kD蛋白超滤管进行超滤浓缩。采用荧光定量PCR对oAAV-hTERT-GSDME-NT滴度进行测定，分装后于-80℃保存。
根据实际情况，利用上述方法可以从人类cDNA文库中分别扩增获得GSDMA-NT、GSDMB-NT、GSDMC-NT和GSDMD-NT；从小鼠cDNA文库中分别扩增获得mGSDMA3-NT、mGSDMD-NT和mGSDME-NT(它们其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4～10所示)，任意选用上述一个序列代入上述方法中，包装得到溶瘤相关腺相关病毒oAAV-hTERT-GSDM-NT。
实施例8
上述oAAV-hTERT-GSDME-NT在细胞水平上可以杀伤宫颈癌Hela细胞
使用oAAV-hTERT-GSDME-NT感染宫颈癌Hela细胞。72小时后，加入碘化丙啶(Propidium Iodide)和膜联蛋白V-APC(Annexin V-APC)检测oAAV-hTERT-GSDME-NT感染导致肿瘤细胞的焦亡情况，结果显示oAAV-hTERT-GSDME-NT感染可以导致宫颈癌Hela细胞(图12)
另外，在oAAV-hTERT-GSDME-NT感染肿瘤细胞72小时后，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒和ATP检测试剂盒分别检测细胞死亡率及存活率，结果显示相对于对照组，oAAV-hTERT-GSDME-NT感染组的肿瘤细胞死亡率更高(图13)，存活率更低(图14)。
以上数据说明oAAV-hTERT-GSDME-NT在细胞水平具有很好的溶瘤效果。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的包装方法及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1019
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)
<400> 1
gccgtaatga gacgcacaaa ctaatatcac aaactggaaa tgtctatcaa tatatagttg 60
ctctagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt 120
ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 180
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 240
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 300
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 360
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 420
taccatgcat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 480
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 540
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 600
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 660
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 720
cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 780
tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc ttcgggctgt 840
aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag 900
gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggctgtccgc ggggggacgg 960
ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggct 1019
<210> 2
<211> 454
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
ggcccctccc tcgggttacc ccacagccta ggccgattcg acctctctcc gctggggccc 60
tcgctggcgt ccctgcaccc tgggagcgcg agcggcgcgc gggcggggaa gcgcggccca 120
gacccccggg tccgcccgga gcagctgcgc tgtcggggcc aggccgggct cccagtggat 180
tcgcgggcac agacgcccag gaccgcgctt cccacgtggc ggagggactg gggacccggg 240
cacccgtcct gccccttcac cttccagctc cgcctcctcc gcgcggaccc cgccccgtcc 300
cgacccctcc cgggtccccg gcccagcccc ctccgggccc tcccagcccc tccccttcct 360
ttccgcggcc ccgccctctc ctcgcggcgc gagtttcagg cagcgctgcg tcctgctgcg 420
cacgtgggaa gccctggccc cggccacccc cgcg 454
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
atgaccatgt ttgaaaatgt cacccgggcc ctggccagac agctaaaccc tcgaggggac 60
ctgacaccac ttgacagcct catcgacttc aagcgcttcc atcccttctg cctggtgctg 120
aggaagagga agagcacgct cttctggggg gcccggtacg tccgcaccga ctacacgctg 180
ctggatgtgc ttgagcccgg cagctcacct tcagacccaa cagacactgg gaattttggc 240
tttaagaata tgctggacac ccgagtggag ggagatgtgg atgtaccaaa gacggtgaag 300
gtgaagggaa cggcagggct ctcgcagaac agcactctgg aggtccagac actcagtgtg 360
gctcccaagg ccctggagac cgtgcaggag aggaagctgg cagcagacca cccattcctg 420
aaggagatgc aagatcaagg ggagaacctg tatgtggtga tggaggtggt ggagacggtg 480
caggaggtca cactggagcg agccggcaag gcagaggcct gcttctccct ccccttcttc 540
gccccattgg ggctacaggg atccataaat cacaaggagg ctgtaaccat ccccaagggc 600
tgcgtcctgg cctttcgagt gagacagctg atggtcaaag gcaaagatga gtgggatatt 660
ccacatatct gcaatgataa catgcaaacc ttccctcctg gagaaaagtc aggagaggag 720
aaggtcatcc ttatccaggc atctgatgtt gggtga 756
<210> 4
<211> 828
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
atgttcagcg tatttgagga aatcacaaga attgtagtta aggagatgga tgctggaggg 60
gatatgattg ccgttagaag ccttgttgat gctgatagat tccgctgctt ccatctggtg 120
ggggagaaga gaactttctt tggatgccgg cactacacaa caggcctcac cctgatggac 180
attctggaca cagatgggga caagtggtta gatgaactgg attctgggct ccaaggtcaa 240
aaggctgagt ttcaaattct ggataatgta gactcaacgg gagagttgat agtgagatta 300
cccaaagaaa taacaatttc aggcagtttc cagggcttcc accatcagaa aatcaagata 360
tcggagaacc ggatatccca gcagtatctg gctacccttg aaaacaggaa gctgaagagg 420
gaactaccct tttcattccg atcaattaat acgagagaaa acctgtatct ggtgacagaa 480
actctggaga cggtaaagga ggaaaccctg aaaagcgacc ggcaatataa attttggagc 540
cagatctctc agggccatct cagctataaa cacaagggcc aaagggaagt gaccatcccc 600
ccaaatcggg tcctgagcta tcgagtaaag cagcttgtct tccccaacaa ggagacgatg 660
aatattcatt tcaggggcaa aacaaaatcc tttccagaag agaaggatgg tgcttcatcc 720
tgtttaggaa agtctttggg ttcggaggat tccagaaaca tgaaggagaa gttggaggac 780
atggagagtg tcctcaagga cctgacagag gagaagagaa aagattag 828
<210> 5
<211> 774
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
atgccctcca tgttggaacg cattagcaaa aatttggtca aagagattgg aagcaaagac 60
ctgacacctg tcaaatacct attgagtgcc accaaattac gtcagtttgt tatattacga 120
aagaagaagg attctcgttc atcattttgg gaacaatctg actatgttcc agttgaattc 180
tccctcaatg acatcctgga gccaagttct tcagtcctag aaactgttgt gacaggaccg 240
ttccacttca gtgacattat gatccagaag cataaggctg acatgggtgt gaatgttggt 300
atagaagtga gtgtgtcagg ggaggcctct gtggaccatg gatgctccct cgagtttcaa 360
attgttacca tcccatcacc aaacctggaa gactttcaaa aaaggaaact gttggatcca 420
gagccatcat ttctgaagga gtgccggagg agaggggaca acctgtacgt ggtgacagag 480
gctgttgaac tgatcaacaa tactgtgctg tacgatagca gtagtgtgaa tattttaggg 540
aaaattgctc tttggattac ctatggcaag ggtcaaggcc aaggagagag tctcagagtg 600
aagaagaagg cgctgactct tcagaaaggc atggtgatgg cttataagag aaagcagctg 660
gttatcaagg agaaagccat tctcatctca gatgatgatg aacagagaac ctttcaagat 720
gagtacgaaa tttccgaaat ggtaggctac tgtgctgcga ggagtgaggg gtga 774
<210> 6
<211> 828
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
atggggtcgg cctttgagcg ggtagtccgg agagtggtcc aggagctgga ccatggtggg 60
gagttcatcc ctgtgaccag cctgcagagc tccactggct tccagcccta ctgcctggtg 120
gttaggaagc cctcaagctc atggttctgg aaaccccgtt ataagtgtgt caacctgtct 180
atcaaggaca tcctggagcc ggatgccgcg gaaccagacg tgcagcgtgg caggagcttc 240
cacttctacg atgccatgga tgggcagata cagggcagcg tggagctggc agccccagga 300
caggcaaaga tcgcaggcgg ggccgctgtg tctgacagct ccagcacctc aatgaatgtg 360
tactcgctga gtgtggaccc taacacctgg cagactctgc tccatgagag gcacctgcgg 420
cagccagaac acaaagtcct gcagcagctg cgcagccgcg gggacaacgt gtacgtggtg 480
actgaggtgc tgcagacaca gaaggaggtg gaagtcacgc gcacccacaa gcgggagggc 540
tcgggccggt tttccctgcc cggagccacg tgcttgcagg gtgagggcca gggccatctg 600
agccagaaga agacggtcac catcccctca ggcagcaccc tcgcattccg ggtggcccag 660
ctggttattg actctgactt ggacgtcctt ctcttcccgg ataagaagca gaggaccttc 720
cagccacccg cgacaggcca caagcgttcc acgagcgaag gcgcctggcc acagctgccc 780
tctggcctct ccatgatgag gtgcctccac aacttcctga cagattag 828
<210> 7
<211> 813
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
atgtttgcca aagcaaccag gaattttctt agagaagttg atgctgatgg tgacctgatt 60
gcagtatcaa atctgaatga ctctgataag ttacagcttc taagtctggt gacaaaaaag 120
aagagattct ggtgctggca gagacccaag taccagtttt tatccctcac ccttggcgat 180
gtactcatag aagaccaatt tccgagtcca gtggtcgtgg agtcggactt tgtgaaatac 240
gagggcaagt ttgcaaacca cgtgagtgga accctggaga ctgcactggg gaaggtcaag 300
ctgaacctgg ggggcagcag ccgcgtagag agccagtctt catttggaac cctgaggaag 360
caggaggtgg atttgcagca gctcatcaga gactctgccg agagaacaat aaatctgaga 420
aaccctgtgc tccagcaggt gctggaagga aggaatgagg tcctgtgcgt tttgacacag 480
aagatcacga cgatgcagaa gtgtgtgatc tctgagcaca tgcaggtcga ggagaagtgt 540
ggtggcatcg tgggcatcca gaccaagacg gtgcaggtgt cagcgacgga ggatgggaat 600
gtcaccaagg actccaacgt ggtgctggag atcccagctg ccaccaccat tgcctacggt 660
gtcattgagt tatacgtgaa actggacggc cagttcgagt tctgccttct ccgagggaag 720
caaggtggct tcgagaacaa gaagagaatt gactctgtct acctggaccc cctggtcttt 780
cgagagtttg cattcataga catgccagat tga 813
<210> 8
<211> 789
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
atgcctgtgt ttgaggatgt cacccgggcc ctggttagag agctgaaccc tcgaggggat 60
ctgacacccc tagacagcct catcgacttc aaacactttc gtcccttctg cctggtgctg 120
aggaagagga agagcacatt gttctgggga gcccgctatg tgcgcaccga ctacactctc 180
ctggatttgc tggagccggg cagctccccc tcagatctga cagacagtgg caactttagc 240
tttaagaata tgctggatgt ccaagtacag ggacttgtgg aagtgccaaa gacagtgaag 300
gtaaagggga ctgcgggtct gtcacaaagc agcacactgg aggtgcagac actcagcgtg 360
gctccctcgg ctctggagaa cttgaagaag gagaggaaac tgtcagcaga ccactcgttc 420
ctgaacgaga tgaggtatca tgagaagaac ctgtatgtgg tgatggaggc agtagaagcc 480
aagcaggaag ttactgtgga gcaaactggc aacgcaaatg ccatcttctc tctccccagc 540
ttggctctac tgggactaca gggatccttg aacaacaaca aggctgtaac catccccaag 600
ggctgtgtcc tggcctatcg agtgagacta ctgagagtct ttttgttcaa tctttgggat 660
attccgtaca tttgcaatga cagcatgcaa accttcccta agatcaggcg tgtaccttgc 720
agtgccttca tatctcctac ccagatgata tctgaagagc cagaagaaga gaagctcatt 780
ggggagtga 789
<210> 9
<211> 831
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
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ggcgatctca ttccggtgga cagcctgcgg aactccacca gcttcaggcc ctactgcctt 120
ctgaacagga aattttcaag ctcaaggttc tggaaacccc gttattcatg tgtcaacctg 180
tcaatcaagg acatcctgga gcccagtgct ccagaaccag aaccggagtg ttttggctcc 240
ttcaaagtct ctgatgtcgt cgatgggaac attcagggca gagtgatgtt gtcaggcatg 300
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<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
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gtactcacag aagggcactg tctcagtcca gtggttgtgg agtcagactt cgtgaaatac 240
gagagcaagt gtgagaacca taagagcggg gctattggga cagtcgtggg gaaggtcaag 300
ctgaacgttg gtggcaaagg cgtggtggag agtcactctt cgtttggaac cctgaggaag 360
caggaggtgg acgtgcagca gctcatccag gatgccgtca agagaacagt taatatggac 420
aacctggtac ttcagcaggt gctagagagc aggaacgagg tcctgtgtgt gctgacgcag 480
aagatcatga ccacgcagaa gtgcgtgatt tctgagcatg tgcagtcgga ggagacgtgt 540
ggaggcatgg tggggatcca gaccaagact atacaggtgt cagcaacgga ggatgggacg 600
gtcaccacgg acaccaatgt agtgctggag atccctgctg ccaccaccat tgcctatggc 660
atcatggagc tgtttgtgaa acaagatggc cagtttgaat tctgcctcct ccaagggaaa 720
catggtggct tcgagcatga gaggaaacta gactctgtct acttggaccc cctggcctac 780
agagagttcg cctttctgga catgctggat tag 813

Claims (5)

1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)扩增特异启动子，构建供体质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP
a.设计扩增引物，从质粒pMD18T-mCBA；所述特异启动子为哺乳动物特异启动子mCBA；其中，哺乳动物特异启动子mCBA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中，扩增mCBA序列的引物：
mCBA-F:5’-ctgcggccgcacgcgtgccgtaatgagacgcacaaac-3’
mCBA-R:5’-ctttgtagtccattcagaattcagccgccggtcacacgccag-3’；
b.利用分子克隆技术替换质粒pFastBac-ITR-CMV-eGFP中的启动子CMV片段，获得质粒pFastBac-ITR-SP-eGFP；
2)扩增获得焦亡蛋白基因
扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因为GSDMD-NT或GSDME-NT；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：6～7所示；
3)构建含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒
a.将pFastBac-ITR-SP-eGFP质粒用EcoR I及BamH I进行双酶切，回收载体片段FastBac-ITR-mCBA；
b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有EcoR I及BamHI酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用EcoR I及BamH I进行双酶切回收后与载体片段FastBac-ITR-SP连接后转化DH5α感受态，送测序鉴定，获得重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT；其中，GSDM-NT扩增引物为：
GSDMD-NT的引物：
GSDMD-NT-F：5’-ctgaattcatggggtcggcctttgagcg-3’；
GSDMD-NT-R：5’-gaggatccctaatctgtcaggaagttgtg-3’；
GSDME-NT的引物：
GSDME-NT-F：5’-ctgaattcatgtttgccaaagcaaccag-3’；
GSDME-NT-R：5’-gaggatcctcaatctggcatgtctatg-3’；
c.提取重组供体质粒pFastBac-ITR-SP-GSDM-NT，转化入含有杆状病毒基因组的E.coli DH10B中，通过蓝白斑及抗性筛选后获得阳性菌落，扩大培养阳性菌落，提取含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒；
d.将含有ITR-SP-GSDM-NT的重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，4-5天后收取上清，收获第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒；将第一代rBac-SP-GSDM-NT病毒感染sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，收获高滴度第二代rBac-SP-GSDM-NT病毒；
4)oAAV-SP-GSDM-NT包装及纯化
扩增辅助杆状病毒rBac-AAV/helper，接种rBac-SP-GSDM-NT和rBac-AAV/helper至sf9昆虫细胞中，27℃震荡培养72小时后，离心收取感染的sf9昆虫细胞；重悬sf9昆虫细胞后，液氮/37℃水浴反复冻融四次，离心收集含重组腺相关病毒上清，向上清中加入核酸酶混匀，水浴锅中孵育，离心收集上清；进一步纯化、超滤浓缩，得到溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT。
2.一种权利要求1所述方法获得的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT在制备治疗肿瘤的药品中的应用，其特征在于：所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌或宫颈癌。
3.一种治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：包括有效量的权利要求1所述的方法制备的溶瘤腺相关病毒oAAV-SP-GSDM-NT、免疫调节剂和辅料，其中，所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌或宫颈癌。
4.根据权利要求3所述的用于治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：免疫调节剂为程序性细胞死亡受体1分子阻断剂或程序性细胞死亡配体1分子阻断剂或PD-L1抗体或PD-1抗体。
5.根据权利要求4所述用于治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：所述免疫调节剂为PD-L1分子阻断剂。
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