CN112079905B

CN112079905B - 一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用

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Publication number: CN112079905B
Application number: CN202011000033.8A
Authority: CN
Inventors: 胡娇; 刘秀梵; 李军; 李如梦; 胡增垒; 王晓泉; 顾敏
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112079905A

Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用，将一株基于串联表达H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、M1基因的重组杆状病毒转染昆虫细胞自行组装形成禽流感病毒样颗粒抗原；将本发明所制备的病毒样颗粒抗原用于制备疫苗。本发明制备的疫苗免疫鸡群后能够产生较高滴度的HI抗体、中和抗体和IgY抗体，能够提供针对H7N9亚型高致病性禽流感病毒100%的临床保护，并能有效抑制排毒。本发明不依赖于鸡胚，生产成本低、周期短；仅以低剂量一次免疫就可诱导较强的保护能力。本发明为VLP疫苗的工业化生产提供了基础。

Description

一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)属于A型流感病毒，是一种具有8节段的单股负链的RNA病毒，它可引起一种或多种禽类和其它动物发病和死亡。2013年，H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现，迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰，对公共卫生和家禽养殖造成了重大威胁。在第五波流行中发现，在连接HA1和HA2肽区的裂解位点插入四个碱性氨基酸残基(KRKRTAR/G或KGKRIAR/G)，多个氨基酸的存在证明H7N9 AIV已经从LPAI病毒进化为HPAI病毒，为H7N9的防控带来了更大的困难。

接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。家禽的疫苗接种对于减少家禽的带毒排毒及降低人群对H7N9病毒的暴露风险有重要意义。目前商品化的H7N9禽流感疫苗为灭活疫苗，在疫病防控上起到了较好的作用。但是，传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产，具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外，灭活疫苗只能诱导抗体免疫，而不能诱导细胞免疫。因此，需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗，以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。

病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒，可模拟病毒粒子的天然结构，能激活细胞免疫反应和体液免疫反应，诱导的免疫保护更为全面。利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产VLP疫苗。由于杆状病毒表达系统不依赖鸡胚生产，且能保证禽流感大流行时疫苗的充足供应，具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势，被广泛应用于临床实验中。因此利用杆状病毒表达系统生产流感VLP疫苗具有较大的应用潜力。

发明内容

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供一种禽流感病毒样颗粒抗原的制备方法，包括：

步骤(1)将H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因以串联方式克隆到同一杆状病毒载体，获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒穿梭质粒；所述H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列SEQID NO.1、SEQID NO.2、SEQID NO.3所示；

步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒穿梭质粒；

步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；将成功拯救的重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，获得表达HA、NA、M1蛋白的重组杆状病毒；

步骤(4)将步骤(3)获得的表达HA、NA、M1蛋白的重组杆状病毒以MOI为1感染昆虫细胞，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原。

在一些实施例中，步骤(4)包括：

将表达HA、NA、M1蛋白的重组杆状病毒按照MOI为1感染昆虫细胞，感染72h后收获细胞上清；

将感染细胞上清液经超滤管5000×g离心浓缩得浓缩液；

将浓缩液经30％-60％不同梯度浓度蔗糖溶液进行纯化，收获40％-50％浓度蔗糖间透明条带，110000×g离心脱糖收获离心后的沉淀液，即得。

在一些实施例中，所述昆虫细胞为Sf9细胞；杆状病毒DNA为优化过的DNA，采用flashBAC^TM DNA；所述的杆状病毒载体为pVL1393。

在一些实施例中，步骤(1)包括：

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的HA基因(SEQ ID NO：1)、NA基因(SEQ ID NO：2)和M1基因(SEQ ID NO：3)设计引物，用于基因的扩增；

在HA、NA、M1基因前后分别添加多角体启动子(PpH)SEQID NO.18和转录终止信号(Poly(A))SEQID NO.19，形成三个表达盒，串联在同一个杆状病毒穿梭质粒上，获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒穿梭质粒。

第二方面，提供一种禽流感病毒样颗粒抗原，由所述的禽流感病毒样颗粒抗原的制备方法制备得到。所述的禽流感病毒样颗粒抗原，含有A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质M1蛋白；A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的genebank公开序列号为:PB2(KY751288)、PB1(KY751256)、PA(KY751233)、HA(KY751058)、NP(KY751157)、NA(KY751124)、M(KY751091)、NS(KY751190)。

第三方面，提供一种疫苗，包括药学上可以接受的载体和免疫量的权利要求5或6所述的禽流感病毒样颗粒抗原。

所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：水包油包水型佐剂。其中所述的水包油包水型佐剂为Montanide^TMISA系列佐剂，进一步为Montanide^TMISA 71VG佐剂；优选的，疫苗成分比例为抗原：佐剂＝1：2。

在一些实施例中，疫苗的制备方法，包括：是将基于昆虫杆状病毒悬浮培养系统表达H7N9亚型禽流感病毒的HA、NA、M1蛋白的重组杆状病毒感染昆虫细胞，自行组装形成的病毒样颗粒与Montanide^TMISA佐剂混合制备形成；进一步地，该方法包括以下步骤：

1.根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的HA基因(SEQID NO.1)、NA基因(SEQID NO.2)和M1基因(SEQID NO.3)设计引物，PCR扩增目的基因；

2.将步骤一将所述H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因以串联方式克隆到同一杆状病毒载体载体，获得重组杆状病毒穿梭质粒；

3.用重组杆状病毒质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；

4.将成功拯救的重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养；

5.将重组杆状病毒以MOI为1感染昆虫细胞，其中重组病毒可以串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白，72h后离心收上清，即可收获在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒；

6.将感染上清液经超滤管5000xg离心浓缩；将浓缩液经30％-60％不同梯度浓度蔗糖纯化，收获40％-50％浓度蔗糖间透明条带，超速离心脱糖收获沉淀液，利用BCA测定蛋白浓度；

7.将收获的病毒样颗粒抗原以免疫剂量与佐剂1：2混合乳化，制备疫苗。

第三方面，提供所述的禽流感病毒样颗粒抗原或所述的疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。其中，禽流感病毒包括H7N9亚型禽流感病毒。

将制备的疫苗免疫SPF鸡，一次免疫三周内分别采血检测抗体效价。免疫三周后以致死剂量的H7N9高致病性禽流感病毒攻击，观察死亡并检测排毒。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及制备方法，本发明将H7N9 GD15毒株的HA、NA和M1基因串联并克隆至穿梭载体中(pVL1393-NA-M1-HA)。将重组穿梭质粒与优化后的杆状病毒基因组DNA共转染Sf9细胞进行VLP的组装。利用IFA方法鉴定了HA、NA与M1蛋白的表达，并用透射电镜观察到直径约为100nm的流感病毒样颗粒，说明重组杆状病毒拯救成功且能够组装成H7N9 VLP(命名为VLP-2)。将两种构建策略制备的VLP疫苗，VLP-1(基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装的H7N9 VLP疫苗)与VLP-2以及商品化重组禽流感病毒H5+H7三价灭活疫苗进行动物的免疫与攻毒实验。VLP疫苗以15μg剂量肌肉注射4周龄的SPF鸡，第3周平均HI抗体滴度在6log₂以上，商品疫苗和VLP-1疫苗诱导的最高HI抗体均能达到10log₂以上。疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。各疫苗均能诱导中和抗体反应和很高的IgY抗体，且VLP疫苗与灭活疫苗之间无显著差异。免疫后第3周用高致病性H7N9禽流感病毒GD15株以10^6.0EID₅₀的剂量进行攻毒。临床观察14天内，各疫苗免疫组均未出现明显的临床症状且未发生死亡，说明VLP疫苗与商品疫苗均能提供100％的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测，结果显示50％的商品疫苗免疫鸡能检测到排毒，两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30％与40％，与商品化疫苗相比无显著差异。VLP疫苗与商品疫苗免疫鸡的脏器中均未检测到病毒，说明它们均能有效抑制病毒复制。组织病理学实验显示VLP-1疫苗组在H7N9病毒感染后造成的肺脏病变最轻。以上结果说明，基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答，且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显著抑制排毒及病毒在体内的复制，其免疫原性与保护效力与杆状病毒共感染组装的VLP-1疫苗及商品疫苗相当。由于该方法表达VLP操作简便，免疫效力强，为VLP推广到生物反应器系统中大量生产制备疫苗奠定了基础。

附图说明

图1为串联重组质粒构建示意图。

图2是重组质粒DNA的电泳鉴定图。其中Lane 1为PH-HA-PolyA表达盒，Lane 2为PH-M1-PolyA表达盒，Marker1为1.5kb DNA Ladder marker，Marker2为1kb DNA Laddermarker，Lane 3/4为HindIII单酶切pVL-NA-M1-HA-GD15串联质粒电泳图。

图3是利用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的结果图。其中A、B、C依次为rBac-HA-NA-M1-GD15的HA、NA、M1蛋白的鉴定，D为阴性对照孔。

图4是提取重组杆状病毒DNA，利用PCR扩增目的基因进行鉴定。其中Lane1～3分别为GD15禽流感病毒HA(1683bp)、NA(1398bp)、M1(759bp)，M为200bp DNA Ladder marker。

图5为禽流感病毒样颗粒的透射电镜图。

图6为疫苗免疫后的抗体水平的检测情况：A图为免疫后三周内的HI抗体变化；B图为免疫第三周的血清与2013-2018年的H7N9毒株交叉反应的结果；C和D图是检测免疫第三周的血清的中和抗体与IgY抗体结果图。

图7为以H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD15攻毒后临床观察14天各组SPF鸡的存活情况。

图8为以H7N9禽流感病毒GD15攻毒后各组SPF鸡喉头与泄殖腔的排毒定量检测结果。

图9攻H7N9高致病性禽流感病毒GD15毒后第3、5天各组SPF鸡的心脏、盲肠、脾脏、肺脏的排毒定量结果。

图10攻H7N9高致病性禽流感病毒GD15毒后第3、5天各组鸡的肺脏组织病理变化结果图(HE染色)。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明作进一步详细的描述。若无特别说明，本发明所述的实验方法，均为常规方法；所述的生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1：重组穿梭质粒的构建

本实验中使用的H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(以下简称GD15株)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存并提供。该毒株已在genebank上公开了序列，序列号为:PB2(KY751288)、PB1(KY751256)、PA(KY751233)、HA(KY751058)、NP(KY751157)、NA(KY751124)、M(KY751091)、NS(KY751190)。根据禽流感病毒H7N9 GD15株HA、NA、M1基因的核酸序列设计引物，用于基因的扩增。对于构建中所用的引物，均用Primer Premier 5.0软件进行设计，并由上海生物工程技术有限公司合成。引物信息如表1所示。

表1扩增目的基因的引物信息

注：GCCACC(粗体)为Kozak序列；下划直线为酶切位点。

串联表达构建重组质粒是指携带多个基因的单个载体构建。流感蛋白在多角体启动子(PpH)(SEQID NO.18)调控下在昆虫细胞中表达。Poly(A)(SEQID NO.19)为pEGFP-c1上的转录终止信号。在每一个表达盒的目的基因上前后添加启动子和终止信号。这大大地增加了各基因的表达效率。将包含HA、NA和M1的三个表达盒串联构建在pVL1393载体上。最终形成重组质粒pVL-NA-M1-HA-GD15。H7N9流感病毒的NA、HA和M1质粒构建顺序如图1所示。

经PCR技术分别扩增H7N9禽流感病毒GD15株的HA、M1基因，成功构建了两个单独的表达盒(图2A中明亮条带)，Blunt-PpH-HA-PloyA(101+1683+229＝2013bp)和Blunt-PpH-M1-PloyA(101+759+229＝1089bp)。利用同源重组的方式将NA插入至PEGFP-c1载体上，利用PCR扩增得到第三个表达盒Blunt-NA-PloyA。最后通过酶切位点串联构建在pVL1393载体上，形成pVL-NA-M1-HA-GD15串联质粒。通过SnapGene软件分析序列，发现重组质粒上有5个HindIII酶切位点。将质粒用HindIII单酶切后得到5个片段(图2B)。说明三个表达盒成功串联在pVL1393载体上。

实施例2：重组杆状病毒的拯救

将重组穿梭质粒pVL-NA-HA-M1-GD15和优化过的杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9细胞，简要流程如下：

1)在六孔细胞板中加入Sf9细胞，1×10⁶/孔，将细胞板水平静置于27℃培养箱中，培养1h，同时准备转染样品；

2)准备DNA转染复合物：将重组穿梭质粒分别稀释至浓度为100ng/μL备用；将转染试剂温热至室温并轻轻混匀；准备两个无菌EP管，分别加入100μL无血清培养基；其中一管加入5μL(100ng)flashBAC^TMDNA，轻弹EP管混合均匀；加入5μL(500ng)转移载体质粒，轻弹管子混合均匀，再加入4μL的转染试剂轻弹EP管混合均匀，瞬离沉淀；在另一管中依次加入5μL(500ng)转移载体质粒与4μL的转染试剂，轻弹EP管混合均匀，瞬离沉淀，作为对照；在室温下孵育15-20min使其形成转染复合物；

3)细胞培养1h后，去除培养液，沿孔壁缓缓加入1mL无血清培养基，轻轻洗细胞单层两次；

4)加入转染复合物，27℃孵育16-24h；

5)去除转染复合物，每孔加入2mL含5％血清的新鲜培养基，继续培养4天(从共转染开始5天)；

6)转染后继续培养5天，收集细胞培养上清3000rpm离心10min，即可收获第1代重组杆状病毒rBac-GD15-HA-NA-M1。将收获的细胞上清分装，避光保存，短期保存在4℃，长期保存在-70℃。

实施例3：重组杆状病毒的鉴定

1重组杆状病毒基因组中外源基因的PCR鉴定

1.1重组病毒DNA的提取

重组杆状病毒DNA的提取按照全式金病毒提取试剂盒说明书进行：

1)Poly A Carrier RNA与Binding Buffer 1：50混匀，称为MIX A；

2)每个样品取200μL上清，加入200μL BB5与20μL蛋白酶K，涡旋混匀；

3)56℃孵育15min，加入250μL无水乙醇，涡旋震荡混匀后放置室温15min；

4)装好吸附柱，将混合液转移至柱内，12000rpm离心1min，弃去下层液体；

5)加入500μL WB5，12000rpm离心1min，弃去滤液，重复一次该步骤；

6)12000rpm离心1min，弃去下层收集管，换为1.5mL Eppendorf管；

7)在柱内加入30μL Elution Buffer，室温放置1min，12000rpm离心1min洗脱核酸后弃柱。

1.2 PCR扩增外源基因

提取重组杆状病毒的基因组DNA，分别用HA、NA、M1的引物进行PCR扩增和凝胶电泳鉴定。结果显示，在拯救的重组杆状病毒的基因组中，PCR扩增分别得到了分子量大小为1700、1400、800bp的条带(图4)，测序结果证实扩增的条带对应HA、NA与M1基因，说明基因组中含有H7N9 HA、NA与M1外源基因。测序结果表明目的片段基因无突变。

2间接免疫荧光检测目的蛋白表达

转染5天后收集细胞，进行间接免疫荧光(IFA)，简要流程为：

1)将六孔板内液体吸尽，每孔加入500μL冷甲醇固定液(-20℃预冷)，轻拿平放于4℃冰箱固定10min；

2)将固定液弃去，用PBS洗细胞板3遍，左右晃动5min，弃去孔内液体；

3)加入1:1000稀释的一抗，37℃孵育1h；

4)重复步骤2)；

5)加入1:1000稀释的二抗，37℃孵育45min，PBS洗3遍，每遍5min；

6)重复步骤2)；

7)荧光显微镜下观察，发现用HA、NA、M1蛋白的特异性抗体均可以检测到到特异性荧光，而只转染穿梭载体的Sf9细胞无特异性荧光产生(图3)。

3重组杆状病毒的空斑纯化

将收获的转染上清感染六孔板的Sf9细胞中，进行连续三轮的空斑实验纯化重组杆状病毒，获得第4代重组杆状病毒(rBac-GD15-p4-HA-NA-M1)。

4重组杆状病毒的遗传稳定性鉴定

Sf9细胞接种至250mL容量的摇瓶中，10⁶cells/mL，培养体积为80mL。将重组杆状病毒均以MOI＝0.01的感染复数接种Sf9悬浮细胞，进行病毒传代扩增。每代病毒均进行外源蛋白表达的鉴定、病毒TCID₅₀的测定以及HA检测。其中第5代(p5)为挑取的单个空斑首次在悬浮细胞中扩增，因此p5代病毒的滴度普遍较低(表2)。而随着杆状病毒在悬浮的昆虫细胞的传代，HA效价不断提高，TCID₅₀跟单表达重组杆状病毒一样有上升的趋势(表2)。

表2 H7N9 VLP的滴度

实施例4：VLP的收获与鉴定

1 VLP的收获

拯救成功后的rBac-GD15-HA-NA-M1经连续三轮空斑纯化后，感染摇瓶悬浮Sf9细胞扩大培养。连续增殖两代后，将rBac-GD15-p6-HA-NA-M1以MOI＝1的感染复数感染Sf9细胞。72h后收获上清，3000rpm离心后即得到高病毒滴度的VLP。获细胞培养上清，3000rpm离心10min去除细胞碎片，4℃短暂保存。

2 VLP的超滤

根据H7N9 VLP的大小，选择了配有Ultracel-50滤膜的Amicon Ultra-15离心式过滤器进行VLP浓缩：

1)将最多15mL的VLP上清液样品添加到

Ultra过滤器装置中；

2)将带盖超滤离心管放入离心机转子中，以最大5000×g的转速离心约15-60min；

3)直至过滤器内剩余2mL浓缩液，离心管底部可见透明液体。打开超滤管盖，轻轻取出过滤器，用200μL移液枪缓慢顺着边缘插入，枪头轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，回收过滤器内的浓缩样品。

3 VLP的超离

将超滤后的液体加入离心管内，110000×g，4℃离心2h。用少量STE溶液将离心后沉淀重悬，其蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒进行测定。

4电镜观察

将收集的样品滴加到碳涂层铜网上吸附，在室温下温育5min。用吸水纸轻轻吸去铜网上的多余液体，干燥后用1％的磷钨酸负染样品，并在室温下孵育2min。再用吸水纸缓慢吸弃铜网上多余的磷钨酸，室温晾干，在透射电子显微镜下进行观察。可以观察到直径为100nm左右的有囊膜的颗粒，颗粒表面有纤突，内部无遗传物质(图5)。充分说明将多个基因共同构建在pVL1393穿梭载体上共转染Sf9细胞，能成功自行组装成有囊膜的H7N9 VLP。

实施例5：疫苗的制备

抗原的蛋白浓度均用BCA蛋白定量试剂盒进行测定。将收获的VLP按照抗原与Montanide^TMISA 71VG佐剂以1:2的比例混合。在匀浆机上以6000r/min充分乳化。乳化至混合液呈乳白色均匀的乳剂，并进行剂型检验，用滴管吸取少量样品滴入自来水中，呈不扩散的油包水外观。

实施例6：疫苗免疫实验

1疫苗免疫

疫苗接种前，抽检部分SPF鸡进行H7N9 HI抗体的检测。

将59只4周龄SPF鸡随机分成5组，采用10(PBS组5只)+6的模式分组。分组与免疫剂量情况见表3。其中串联构建HA、NA、M1质粒共转染组命名为VLP-2组，单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒共感染组命名为VLP-1组。采用肌肉注射的方式免疫。商品化重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re2株)组(简称商品疫苗组)按照说明书，每只SPF鸡接种0.3mL；PBS组每只SPF鸡接种0.3mL无菌PBS。

表3动物免疫实验分组

2抗体水平测定

免疫组及对照组的鸡分别在免疫后第2、3周进行翅静脉采血，37℃放置1h后4000rpm离心分离血清。4℃短暂保存，-20℃储存。利用血凝抑制实验测定(HI、病毒中和(SN)与IgY抗体滴度)进行抗体检测，其中四单位抗原选用A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(H7N9)病毒进行配制。我们发现，第2周串联VLP-2疫苗仍有部分血清效价低于4log₂，第3周的各疫苗免疫组平均抗体滴度比第2周增长约2log₂，其中商品化疫苗诱导的抗体平均滴度最高，且商品化疫苗组和VLP-1疫苗组诱导的最高抗体均能达到10log₂以上(图6A)。交叉-HI试验显示，所有疫苗免疫鸡的血清与2013-2018年的H7N9病毒的交叉反应性均较好(图6B)。串联表达VLP-2疫苗组诱导抗体能力弱于商品化疫苗组和表达构建共感染VLP-1疫苗组，在与H7N9不同毒株的交叉血凝实验结果更确认了这一点。中和试验的结果显示(图6C)，各疫苗免疫鸡的血清针对H7N9 GD15株均具有中和活性，其中商品化疫苗的SN滴度最高，VLP-1疫苗组的SN抗体滴度比VLP-2疫苗组高，这与HI结果相符。此外，用ELISA方法测定血清中与HA蛋白具有结合性的IgY抗体滴度发现各疫苗组均可以诱导较高IgY抗体，且滴度都在2560以上(图6D)。这些结果说明H7N9 VLP疫苗免疫鸡时，能诱导较好的抗体应答。

实施例7：疫苗攻毒保护实验

在免疫3周后，用H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD15株进行攻毒保护试验，攻毒剂量为10^6.0EID₅₀，以滴鼻、点眼的方式进行病毒接种。每天观察鸡的临床症状与死亡情况，共观察2周。结果显示PBS对照组鸡出现禽流感典型症状，且在攻毒后5天内全部死亡。而免疫疫苗组在14天观察期内，未出现任何感染流感病毒临床症状，且未发生死亡(图7)；结果说明，H7N9 VLP疫苗与商用疫苗均能提供针对高致病性H7N9流感病毒攻击的完全保护。

表4试验鸡攻毒后的排毒情况

注：dpi:days post infection.

攻毒后的第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒测定。结果显示，3种疫苗免疫组在H7N9 HPAIV攻击后均可有效抑制试验鸡的排毒。在第3天，商品化疫苗攻毒后能检测到30％排毒率，高于VLP疫苗组；第5天，共感染VLP-1疫苗组未检测到排毒。50％的商品化疫苗的免疫鸡能检测到排毒，两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30％与40％(表4)，经统计学方法分析，各疫苗免疫组在抑制排毒方面无显著差异。排毒定量结果显示，各时间点病毒含量均在检测线以下(图8)。组织病毒载量测定显示，各免疫组均能有效抑制病毒在SPF鸡的心脏、脾脏、肺脏和盲肠组织中的复制(图9)。对照组中除第3天在脾脏中未检测到病毒外，其他组织均能检测到病毒。而肺脏病理切片观察发现，对照组出现较严重的支气管或肺房扩张(黑三角)和出血(空三角)，所有疫苗免疫鸡的肺脏仅观察到轻微的病理变化。按照病变严重程度排序，第3d为PBS>商品化疫苗>VLP-2>VLP-1(图10A)，第5d的病变程度为PBS>VLP-2>商品化疫苗>VLP-1(图10B)。说明H7N9 VLP疫苗能显著抑制H7N9攻毒后的排毒与病毒在体内的复制，且能够抑制病毒导致的肺脏组织病理变化。

图6-图10结果充分说明，基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答，且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显著抑制排毒及病毒在体内的复制，且能够抑制病毒导致的肺脏组织变化。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但并非是对本发明的实施方式的限定。本领域普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明创造构思的前提下，以本发明为基础做出的任何修改、等同替换和改进等，都属于本发明的要求保护范围之列。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种禽流感病毒样颗粒抗原、疫苗及其制备方法和应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 1

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgatctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcggccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaaccc atgggattca catacaatgg aataagaact 420

aatggggtga ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagataa tgctacattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540

agagaaagcc cagctataat agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tctttcgtac cgagtccagg agcaagacca caagttaatg gtcaatctgg aagaattgac 720

tttcattggc taatactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatggtg gagggacaat aataagtaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc 1020

ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080

tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140

caatcggcaa ttaatcaaat aacagggaaa ttaaaccggc ttatagcaaa aaccaaccaa 1200

caattcaagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260

aattggacca gagattctat aacagaagta tggtcataca atgctgaact cttggtggca 1320

atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380

gtgaaaagac agctgagaga aaatgctgaa gaagatggca cgggttgctt tgaaatattt 1440

cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagaaaa 1500

tacagagaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560

tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620

gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtaaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 1398

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 2

atgaatccaa accagaagat tctatgcact tcagccactg ctatcacaat aggcgcaatc 60

acagtactca ttggaatagc aaacctagga ttgaacatag gactgcatct aaaatcgggc 120

tgcaattgct cacgctcaca acctgaaaca accaacacaa gccaaacaat aataaacaac 180

tattataatg aaacaaacat caccaacatc caaatggaag aaagaacaag caggaatttc 240

aataacttaa ctaaagggct ctgtactata aattcatggc acatatatgg gaaagacaat 300

gcagtaagaa ttggagaaag ctcggatgtt ttagtcacaa gagaacccta tgtttcatgc 360

gacccagatg aatgcaggtt ctatgctctc agccaaggaa caacaatcag agggaaacac 420

tcaaacggaa caatacacga taggtcccag tatcgcgccc tgataagctg gccactatca 480

tcaccgccca cagtgtacaa cagcagggtg gaatgcatcg ggtggtcaag tactagttgc 540

catgatggca aatccagaat gtcaatatgt atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 600

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agaacacagg aatctgaatg tgtatgccac aacggcgtat gcccagtagt gttcaccgat 720

gggcctgcca ctggacctgc agacacaaga atatactatt ttaaagaggg gaaaatattg 780

aaatgggagt ctctgactgg aactgctaag catattgaag aatgctcatg ttacgggaaa 840

cgaacaggga ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900

cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgtccttaca 960

gacagtcccc gaccgaatga cccaaacata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat 1020

aataacaatg gagtcaaggg attctcatac ctggatgggg ataacacttg gctagggagg 1080

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<211> 759

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 3

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aaagccgaga tcgcgcagag acttgaggat gtttttgcag ggaagaacgc agatctcgag 120

gctctcatgg agtggataaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180

gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acggtttgtc 240

caaaacgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acaaggcagt taaattatac 300

aagaaactga agagggaaat gacatttcat ggagcaaagg aagtttcact cagttactca 360

actggtgcgc ttgccagctg catgggtctc atatacaaca ggatggggac agtaactgca 420

gaaggggctc ttggattggt atgtgccact tgtgagcaga tcgctgacgc acaacatcgg 480

tcccacaggc agatggcaac tactaccaac ccactaatta ggcatgagaa tagaatggta 540

ctagccagta ctacggctaa ggctatggag cagatggctg gatcaagtga acaggcagcg 600

gaagccatgg aagtcgcaag ccaggctagg caaatggtgc aggctatgag aacagtcggg 660

actcacccta actccagtac aggtctaaag gatgatctta ttgaaaattt gcaggcctac 720

cagaaccgga tgggagtgca actgcagcgg ttcaagtga 759

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> PRT

<400> 4

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<210> 5

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<212> DNA

<213> PRT

<400> 5

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<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> PRT

<400> 6

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<210> 7

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> PRT

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> PRT

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<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> PRT

<400> 14

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<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> PRT

<400> 15

gttatctaga tccggtttag aggaagtact ctattttagc cccg 44

<210> 16

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<212> DNA

<213> PRT

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<210> 17

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<212> DNA

<213> PRT

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attctagata agatacattg atgagtttgg acaaac 36

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<213> PRT

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agttgctgat atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt 60

tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa a 101

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<213> PRT

<400> 19

tgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 60

acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 120

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 180

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatctta 229

Claims

1.一种禽流感病毒样颗粒抗原的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(1)将H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因以串联方式克隆到同一杆状病毒载体，获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒穿梭质粒；所述H7N9亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因分别由序列SEQ ID NO .1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3所示；包括：根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016的HA基因SEQ ID NO：1、NA基因SEQ IDNO：2和M1基因SEQ ID NO：3设计引物，用于基因的扩增；在HA、NA、M1基因前后分别添加多角体启动子PpH SEQ ID NO .18和转录终止信号Poly(A) SEQ ID NO .19，形成三个表达盒，串联在同一个杆状病毒穿梭质粒pVL1393上，获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒穿梭质粒pVL-NA-M1-HA-GD15；

步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；将成功拯救的重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，获得表达HA、NA、M1蛋白的重组杆状病毒；其中，杆状病毒DNA为优化过的DNA，采用flashBAC^TM DNA；

2.根据权利要求1所述的禽流感病毒样颗粒抗原的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括：

将感染细胞上清液经超滤管5000×g离心浓缩得浓缩液；

将浓缩液经30%-60%不同梯度浓度蔗糖溶液进行纯化，收获40%-50%浓度蔗糖间透明条带，110000×g离心脱糖收获离心后的沉淀液，即得。

3.根据权利要求1或2所述禽流感病毒样颗粒抗原的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

4.一种禽流感病毒样颗粒抗原，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述的禽流感病毒样颗粒抗原的制备方法制备得到。

5.一种疫苗，其特征在于，包括药学上可以接受的载体和免疫量的权利要求4所述的禽流感病毒样颗粒抗原。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：水包油包水型佐剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，其中所述的水包油包水型佐剂为Montanide™ISA系列佐剂，为Montanide™ISA 71 VG佐剂；

和/或，疫苗成分比例为抗原：佐剂=1：2。

8.权利要求4所述的禽流感病毒样颗粒抗原或权利要求5-7任一项所述的疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。