CN109715219A - 犬腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CAdV载体疫苗的领域，且尤其涉及适于自所述载体疫苗表达靶抗原的启动子。本发明揭示及主张重组型犬腺病毒、其制备方法、其用途(包括用于免疫学、免疫原性、疫苗或治疗性组合物中，或作为载体用于克隆、复制或表达DNA，及使用所述组合物及载体的方法)、其表达产物，及所述表达产物的用途。另外，本发明揭示及主张经截短的EHV4启动子、含有所述启动子的表达盒，及含有所述启动子或表达盒的重组型病毒及质粒。

Description

犬腺病毒载体
序列表
本申请含有根据37 C.F.R.1.821-1.825的序列表。伴随本申请的该序列表通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及(载体)疫苗的领域，且尤其涉及具体而言具有适于自所述载体疫苗表达靶抗原的改良表达盒的重组型2型犬腺病毒。
背景技术
腺病毒作为重组疫苗的载体业经广泛研究(参见综述Bru,T.,S.Salinas及E.J.Kremer,An update on canine adenovirus type 2and its vectors.Viruses,2010.2(9)：第2134-53页)。过去几十年来，在腺病毒方面、特别是在基因疗法及疫苗研发的领域中累积了大量信息。腺病毒的若干特征使得其作为基因转移工具上具有吸引力：(1)腺病毒基因组的结构经充分表征；(2)大部分病毒DNA可被外来序列取代；(3)重组变体相对稳定；(4)重组型病毒可以高效价生长；(5)人类恶性病与腺病毒皆不相关；及(6)使用减弱的野生型腺病毒作为疫苗较安全。
针对有效载体化CAV-2疫苗的经发表靶标包括猫狂犬病(Hu,R.L.等人，Experimental immunization of cats with a recombinant rabies-canine adenovirusvaccine elicits a long-lasting neutralizing antibody response againstrabies.Vaccine,2007.25(29)：第5301-7页)、狗狂犬病(Hu,R.等人，Prevention ofrabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2encoding the rabies virus glycoprotein.Microbes Infect,2006.8(4)：第1090-7页)、小鼠狂犬病(Li,J.等人，A single immunization with a recombinant canineadenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunityagainst rabies in mice.Virology,2006.356(1-2)：第147-54页)、浣熊狂犬病(Henderson,H.等人，Oral immunization of raccoons and skunks with a canineadenovirus recombinant rabies vaccine.Vac cine,2009.27(51)：第7194-7页)、绵羊狂犬病(Bouet-Cararo,C.等人，Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunization ofsheep.Vaccine,2011.29(6)：第1304-10页)、臭鼬狂犬病(Henderson,H.等人，Oralimmunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinantrabies vaccine.Vaccine,2009.27(51)：第7194-7页)及猪狂犬病(Liu,Y.等人，Efficacyand safety of a live canine adenovirus-vectored rabies virus vaccine inswine.Vaccine,2008.26(42)：第5368-72页)、犬瘟热(Fischer,L.等人，Vaccination ofpuppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccine protectsagainst a canine distemper virus challenge.Vaccine,2002.20(29-30)：第3485-97页)及猫泛白细胞减少症(Yang,S.等人，Complete protection of cats against felinepanleukopenia virus challenge by a recombinant canine adenovirus type2expressing VP2from FPV.Vaccine,2008.26(11)：第1482-7页)。CAV-2亦具有作为经口疫苗的潜能，如通过针对狂犬病经口疫苗接种以下的效能所指示：狗(Zhang,S.等人，Oralvaccination of dogs(Canis familiaris)with baits containing the recombinantrabies-canine adenovirus type-2vaccine confers long-lasting immunity againstrabies.Vaccine,2008.26(3)：第345-50页)、浣熊及臭鼬(Henderson,H.等人，2009，Zhao等人，2014.Experimental Oral Immunization of Ferret Badgers(Melogale moschata)with a Recombinant Canine Adenovirus Vaccine CAV-2-E3Δ-RGP and an AttenuatedRabies Virus SRV9.J.Wildlife Diseases 50(2):374-377)。有趣地，尽管基于可复制型腺病毒的载体存在抵抗载体的被动免疫性，但其已显示效能(Gallichan,W.S.等人，Mucosal immunization with a recombinant adenovirus vector induces local andsystemic immunity and protection from herpes simplex virus.Adv Exp Med Biol,1995.371B：第1581-5页；Lubeck,M.D.等人，Immunogenicity of recombinantadenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees followingintranasal administration.AIDS Res Hum Retroviruses,1994.10(11)：第1443-9页；Wang,Y.等人，The use of an E1-deleted,replication-defective adenovirusrecombinant expressing the rabies virus glycoprotein for early vaccination ofmice against rabies virus.J Virol,1997.71(5)：第3677-8页)，从而表明其可克服母源免疫性(Papp,Z.、L.A.Babiuk及M.E.Baca-Estrada，The effect of pre-existingadenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinantadenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type1.Vaccine,1999.17(7-8)：第933-43页；Babiuk,L.A.及S.K.Tikoo,Adenoviruses as vectors fordelivering vaccines to mucosal surfaces.J Biotechnol,2000.83(1-2)：第105-13页)。此可由Fischer等人(2002)针对犬瘟热来证实。然而，预存抗体可能妨碍经口免疫途径的使用(Wright,N.等人，High prevalence of antibodies against canine adenovirus(CAV)type 2in domestic dog populations in South Africa precludes the use ofCAV-based recombinant rabies vaccines.Vaccine,2013.31(38)：第4177-82页)。
2型犬腺病毒(CAV-2)通常造成不明显至轻度呼吸道感染且被视为常见的广泛感染性气管支气管炎的原因之一(Buonavoglia,C.及V.Martella,Canine respiratoryviruses.Vet Res,2007.38(2)：第355-73页；Tham,K.M.、G.W.Horner及R.Hunter,Isolation and identification of canine adenovirus type-2from the upperrespiratory tract of a dog.N Z Vet J,1998.46(3)：第102-5页)。CAV-2亦与肠炎的发作相关(Hamelin,C.,P.Jouvenne及R.Assaf,Association of a type-2canineadenovirus with an outbreak of diarrheal disease among a large dogcongregation.J Diarrhoeal Dis Res,1985.3(2)：第84-7页；Macartney,L.,H.M.Cavanagh及N.Spibey,Isolation of canine adenovirus-2from the feces of dogswith enteric disease and its unambiguous typing by restriction endonucleasemapping.Res Vet Sci,1988.44(1)：第9-14页)且已在具有神经体征的狗的脑中检测到(Benetka,V.等人，Canine adenovirus type 2infection in four puppies withneurological signs.Vet Rec,2006.158(3)：第91-4页)。已研发出若干种基于CAV2的疫苗且其已在全世界广泛用于仔犬及成年狗的疫苗接种。经改良的活CAV-2疫苗证实可高度有效地降低犬群体中CAV-2的循环(Buonavoglia等人，2007)。经CAV-2疫苗接种的狗发展出对CAV-1及CAV-2二者的免疫性(Appel,M.等人，Pathogenicity of low-virulence strainsof two canine adenovirus types.Am J Vet Res,1973.34(4)：第543-50页；Appel,M.,L.E.Carmichael及D.S.Robson,Canine adenovirus type 2-induced immunity to twocanine adenoviruses in pups with maternal antibody.Am J Vet Res,1975.36(08)：第1199-202页)。使用CAV-2使幼犬对两种犬腺病毒类型免疫已消除了CAV-1疫苗所遇到的安全性相关副作用(Bittle,J.L.、W.A.Grant及F.W.Scott,Canine and felineimmunization guidelines--1982.J Am Vet Med Assoc,1982.181(4)：第332-5页；Curtis,R.及K.C.Barnett,The“blue eye”phenomenon.Vet Rec,1983.112(15)：第347-53页)。CAV2作为疫苗的表观安全性已在狗及其他动物物种(包括人类)中在其30年效用期间因没有疫苗诱导及疫苗相关的并发症而得到充分证实。此外，来自田野血清学调查的结果指示，许多野生动物(狐狸、浣熊、臭鼬及猫鼬)无症状地暴露于CAV2或抗原相关病毒感染(Summer等人，1988)。因此，第2血清型犬腺病毒(CAV2)的疫苗毒株提供可视为衍生基于载体的有效疫苗的疫苗接种候选者(尤其狗)的安全的可复制型、宿主限定型病毒的独特实例。
因此，犬腺病毒具有许多于载体病毒疫苗研发而言理想的特征。除如上文所详述的犬腺病毒安全且有效的使用以外，该犬腺病毒提供重要特征，包括：对疫苗的体液及细胞免疫反应，所述病毒病原体靶标可需要保护；其具有宽泛的潜在宿主范围及组织向性；其是非包膜的，因此较包膜病毒可能更为稳定；其可生长至高效价且存在公认的适当产生方案及分析法；其可用作可复制型及缺陷型病毒；且其可携载相对大量的异源DNA，具体而言当CAdV为“无病毒基因”时，可插入约30kb外源DNA，然而该病毒则必须在辅助病毒存在下才可拯救。
Fisher等人在美国专利第6,090,393号(以引用方式并入本文中)中阐述重组型CAdV2的用途，该重组型CAdV2具有插入基因组的E1、E3和/或右端内的非必需区或部分，右侧ITR与E4转录单元之间的外源DNA。E3区用于生成重组型，乃因此区的一部分经鉴别并非为活体外及活体内感染性病毒形成所必需(例如，基于源自HAV及牛Ad3的数据)且因此可作为插入区来靶向。具有缺失的E1区的腺病毒载体是无法复制的且具有其他挑战且因此不能优选地使用。
Fisher等人进一步揭示源于鼠类巨细胞病毒或人类巨细胞病毒MCMV或HCMV的截短启动子(例如，HCMV-IE或MCMV-IE)的用途。Fisher等人推举hCMV-IE启动子为最先进且有前景的上游调控区，推断出其与组织培养物中重组型蛋白表达的最高程度及最长持久性相关。hCMV-IE启动子亦被视为明显优点，乃因发现其几乎在每种测试细胞系中可操作。启动子(例如HCMV-IE)部分的定靶缺失背后的动力是降低启动子的大小且因此可解决腺病毒的包装限制。Fisher等人特定而言是揭示HCMV-IE中具有91bp大小的活性片段或MCMV-IE中具有466bp大小的活性片段，亦即，约91bp的经截短转录活性HCMV-IE或约466bp的经截短转录活性MCMV-IE。
尽管Fisher等人阐述多种重组型CAdV2载体(例如，编码可操作连接至牛痘病毒H6(vH6)启动子的CDV血凝素(HA)或融合(F)蛋白多核苷酸的表达盒)的构建，但Fisher等人未展示任一所构建CAdV2载体的稳健CDV抗原表达。而是，Fisher‘393专利揭示E3插入位点的一般核苷酸大小限制为稳定表达的变量，未曾观察到和/或解决有助于病毒拯救或经感染细胞中异源蛋白表达的启动子选择的任何可能可变性。在Fisher等人2002(“Vaccinationof puppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccineprotects against a canine distemper virus challenge”Vaccine 20(2002)3485-3497)的后续研究中，其报导两种重组型CAdV2病毒的首次构建及表征，其中CDV HA及F表达盒已插入载体中由hCMV IE启动子的91bp片段驱动的E3区中。其用hAd2TPL进一步替代hCMVIE 5’UTR以促进CAV2复制开始后转基因基因的表达。总的，克隆策略的重点是最小化CDV HA及F cDNA的表达盒的大小。此外，该研究详述由特定插入位点、缺失大小、插入大小及插入定向引起的潜在病毒恢复问题。在该研究中，其能恢复展示正确插入的稳定克隆且能分析免疫后免疫性的诱导。在将编码整个CDV HA及vCA17的rCAdV2的混合物单次鼻内施用血清阴性仔犬之后，观察到在攻击后达成极高的全身性CDV SN效价(>2.0log10)及几乎完全的保护。然而，由于仔犬是经含有HA及F抗原的两种载体的混合物免疫，因此作者无法推断出一或两种载体是否在经免疫狗中表达CDV转基因，其最终亦未展示转基因在个别细胞群体中的稳健表达。
本文所述实验展示在经可复制型rCAdV-2CMV5驱动的转基因表达盒感染的细胞中未观察到在E3基因组基因座处插入的盒的稳健转基因表达，如通过蛋白质的检测(IFA、流式细胞术、斑点印迹)所量测。实际上，本文的实验显示具有含有CMV5启动子的表达盒的rCAdV-2载体无法拯救，因此在经感染细胞中无法量测蛋白质表达。尽管如此，但事实是利用含有那些表达盒的相同转移质粒的活体外瞬时转染展示在蛋白质表达程度方面CMV5启动子活性大于CMVie启动子活性。因此稳健、可再现的转基因表达和/或病毒拯救的不存在使得CMV驱动的表达盒在CAdV2载体中，特别在不发生复制的宿主中的有用性极其可疑。
因此，尽管极其强且非组织特异性的HCMV及MCMV(小鼠巨细胞病毒)IE启动子-增强子可能非常适合于多种研究活动且适合于其中CAdV2复制的靶标物种中的有限有用性，但其不被视为于用于其他物种中的CAdV2载体疫苗的构建而言有效和/或可靠的启动子。业内需要用能在重组型CAdV2病毒的情况下驱动所关注抗原性表位的稳定、稳健、可再现表达的有效启动子来替代CMV启动子以产生用于多种物种中的疫苗。
发明概述
为避免任何所述障碍，本发明提供尤其在载体疫苗的背景下且尤其在CAdV-2载体的背景下用于转基因表达的新颖调控核酸序列/启动子序列。
因此，上述技术问题的解决是通过说明及申请专利范围中所描述的实施方案来达成，且呈不同方面的本发明是根据申请专利范围来实施。
本发明提供用于转基因表达的新颖调控核酸序列/启动子序列、免疫原性组合物、疫苗及相关方法，这些可克服业内的缺陷。
广泛用于在多种载体系统(包括疱疹病毒)中驱动高转基因表达程度的所确立启动子序列是HCMV(Boshart等人，1985；Foecking及Hofstetter 1986)或小鼠巨细胞病毒(MCMV；Dorsch-等人，1985)的即刻早期基因的启动子序列或致癌病毒的强启动子(如猿猴病毒40(SV40)，例如SV40大T抗原启动子及更多(例如，Kim等人，1990))。细胞生物学家认为强启动子优选，乃因其在多种细胞培养系统中自主起作用。在病毒复制的情况下，经感染细胞会通过病毒功能而转型成病毒复制机器。
然而，对于改良的载体疫苗，上述自主强启动子皆不被视为选项；具体而言，CMV源启动子不是重组型CAdV2载体疫苗中转基因表达的有效、可再现的驱动子。
因此，业内需要提供在病毒复制的情况下具有高活性的启动子(如EHV-1β基因及γ基因的那些)。本发明提供源于EHV-4的所公开基因组序列(马疱疹病毒4毒株NS80567，完整基因组，登录AF030027，版本AF030027.1GI:2605950，日期1998年5月21日)的新颖替代启动子序列。所述基因与EHV-1基因的序列相同性在55％至84％的范围内。
本发明提供两种新颖启动子(4pgG600及4pMCP600)及其较短长度的衍生物，其显示在细胞培养物中瞬时转染后或在细胞培养中rCAdV-BAC复制的情况下具有功能。
本发明提供两种新颖启动子：p430及p455，其显示在细胞培养物中rCAdV2复制的情况下具有功能，且对于p455而言，其亦在动物(猪)中具有功能。在病毒复制周期期间，两种新颖启动子的活性程度似乎极其类似，如根据活体外启动子动力学实验所推断。
本发明所提供的新颖启动子序列显示在犬腺病毒(CAdV)载体情况下有效。
如上文所论述，当CMV5启动子序列存在于位于E3区中的表达盒中时，无法达成重组型CAdV的拯救。此似乎具有序列特异性，乃因表达盒的大小尚未超过所观察到的实验基因组大小限制。相反，本发明的新颖EHV-4源启动子序列(例如p430及p455)不仅有利于转基因表达，且亦不干扰病毒拯救的关键步骤，且因此，其相对于先前技术启动子序列是有利的。
发明详述
本发明解决了先前技术固有的问题且使得现有技术有显著进步。
通常，本发明提供重组型犬腺病毒(rCAdV)载体，该载体包含编码至少一个可操作连接至马疱疹病毒-4(EHV4)启动子的异源DNA的表达盒。
本发明另外涉及rCAdV载体，其中马疱疹病毒-4(EHV4)启动子包含4pgG600(SEQID NO.:29)或4pMCP600(SEQ ID NO.:30)或其互补核苷酸序列，或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其中该启动子序列引起异源抗原的表达。
在特定方面中，启动子序列的功能片段或衍生物具有至少80％、85％序列相同性，优选90％、91％、92％、93％、94％序列相同性，更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％序列相同性。
在特定方面中，功能片段是4pgG600(SEQ ID NO.:29)或其互补核苷酸序列的截短形式，优选地序列相同性为关于整个长度至少72％。
在特定方面中，功能片段是4pMCP600(SEQ ID NO.:30)或其互补核苷酸序列的截短形式，优选地序列相同性为关于整个长度至少78％(或更高)。
在另一特定方面中，启动子4pgG600(SEQ ID NO.:29)或4pMCP600(SEQ ID NO.:30)序列的功能片段或衍生物具有550个核苷酸的长度，优选500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430个核苷酸，最优选455或430个核苷酸。
在另一特定方面中，rCAdV载体包含包括4pgG600(SEQ ID NO.:29)的马疱疹病毒-4(EHV4)启动子。
在另一特定方面中，rCAdV载体包含包括4pMCP600(SEQ ID NO.:30)的马疱疹病毒-4(EHV4)启动子。
在另一特定方面中，rCAdV载体包含包括4pG430(SEQ ID NO.:31)的马疱疹病毒-4(EHV4)启动子。
在另一特定方面中，rCAdV载体包含包括gMCP455(SEQ ID NO.:32)的马疱疹病毒-4(EHV4)启动子。
在本发明的特定方面中，rCAdV载体包装为感染性CAdV。
在本发明的再一实施方案中，rCAdV载体包含编码选自由以下组成的群的多肽的异源DNA：所关注所关注表位、生物反应调节剂、生长因子、识别序列、治疗基因及融合蛋白。
在本发明的特定方面中，异源DNA编码所关注抗原性表位。
在本发明的再一实施方案中，所关注抗原性表位是犬或猫病原体的抗原。
在本发明的特定方面中，所关注抗原性表位是源于产食性动物病原体的抗原，更特定而言其中，产食性动物病原体源于猪、牛、马、家禽和/或绵羊动物；且更特定而言，其中产食性动物病原体选自由以下组成的群：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus；BVDV)、副流行性感冒-3病毒(PI-3)、感染性牛鼻气管炎病毒(Infectious BovineRhinotracheitis virus；IBR)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory SyncytialVirus；BRSV)、牛疱疹病毒(Bovine Herpesvirus；BHV)、牛轮状病毒(Bovine Rotavirus；BRV)、牛肠病毒(Bovine Enterovirus；BEV)、牛冠状病毒(Bovine Coronovirus；BCV)、牛狂犬病(Bovine Rabies；BR)、牛细小病毒(Bovine Parvovirus；BPV)、腺病毒星状病毒(Adenovirus Astrovirus)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)(先前称为溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica))、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)(绵羊嗜组织菌(Histophilus ovis)及羔羊嗜血菌(Haemophilus agni))、放线菌属(Actinomyces)(棒状杆菌属(Corynebacterium))、化脓性放线菌(Actinomyces pyogenes)、鹦鹉衣原体(Chlamydia psittaci)、性病胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus venerealis)及胚胎胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus fetus)(先前称为肠道胚胎弯曲杆菌(C fetus intestinalis))、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、波蒙纳钩端螺旋体(Leptospirapomona)及感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体(哈德焦普拉基特诺钩端螺旋体(Leptospira hardjoprajitno)及牛哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo-bovis))、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、猪布氏杆菌(Brucella suis)及马尔他布氏杆菌(Brucella melitensis)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、鹦鹉衣原体、鸣疽梭状芽胞杆菌(Clostridium chauvoei)、败血梭菌(Clostridium septicum)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、牛莫拉菌(Moraxella bovis)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；新港沙门菌(Salmonella newport)、鸟副结核分枝杆菌(Mycobacterium aviumparatuberculosis)、小隐胞子虫(Cryptosporidium parvum)、人隐胞子虫(cryptosporidium hominis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、坏乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、支原体属(Mycoplasmaspp)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)及脲原体属(Ureaplasma spp.)、胚胎三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、沙凯斯维发癣菌(Trichophyton sarkisovii)、犬新孢子虫(Neospora caninum)(先前称为弓形虫(Toxoplasma gondii))、二联巴贝虫(Babesiabigemina)及牛巴贝虫(Babesia bovis)、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)(肺虫病)，及它们的组合。
在本发明的特定方面中，所关注抗原性表位是源于产食性动物病原体的抗原，更特定而言其中，产食性动物病原体源于猪、牛、马、家禽和/或绵羊动物；且更特定而言，其中产食性动物病原体选自由以下组成的群：沙门菌属(Salmonella spp.)，特别是鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)；星状病毒；轮状病毒；传染性胃肠炎病毒；短螺旋体属(Brachyspira spp.)，特别是猪痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)、多毛短螺旋体(B.pilosicoli)；梭菌属(Clostridium spp.)，特别是艰难梭菌(C.difficile)，A型、B型及C型产气荚膜梭菌(C.perfringens)，诺维氏梭菌(C.novyi)、败血梭菌(C.septicum)、破伤风梭菌(C.tetani)；猪肠道小核糖核酸病毒；猪肠道杯状病毒；呼吸道病原体，其包括：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；支气管败血性博德氏菌(Bordetella bronchiseptica)；猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，特别是亚型1、7及14；巴斯德菌属(Pasteurellaspp.)，特别是多杀巴斯德菌(P.multocida)；支原体属，特别是猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)；猪流行性感冒A病毒；PRRS病毒；猪环状病毒；猪细小病毒；伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；猪附红细胞体(Eperythrozoonosissuis)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，特别是鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、牛分枝杆菌(M.bovis)；猪呼吸道冠状病毒；猪冠状病毒，特别是TGEV、PEDV及德尔塔冠状病毒(delta coronavirus)；化脓性隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)；猪腺病毒；经典猪瘟(Classical swine fever)；猪巨细胞病毒；非洲猪瘟(African swine fever)；或其他病原体，其包括大肠杆菌、链球菌属(Streptococcusspp.)，特别是猪链球菌(S.suis)、豚链球菌(S.porcinus)、坏乳链球菌(S.dysgalactiae)，优选类马链球菌亚属(subsp.equisimilis)；猪布氏杆菌，特别是生物变型(biovars)1、2及3；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)，特别是澳洲钩端螺旋体(L.australis)、犬钩端螺旋体(L.canicola)、感冒伤寒性钩端螺旋体(L.grippotyphosa)、波蒙纳钩端螺旋体(L.pomona)、出血黄疸性钩端螺旋体(L.icterohaemorrhagicae)、问号钩端螺旋体(L.interrogans)、塔拉索夫钩端螺旋体(L.tarassovi)、哈德焦钩端螺旋体(L.hardjo)、塞诺钩端螺旋体(L.sejroe)；脑心肌炎病毒；血细胞凝集性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)；西尼罗病毒(West Nile virus)；呼肠孤病毒(Reovirus)；腮腺炎病毒属(Rubulavirus)；梅南高病毒(Menangle virus)；立百病毒(Nipah virus)；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；猪痘病毒；猪疱疹病毒；和猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)，及其组合。
在本发明的另一实施方案中，所关注抗原性表位选自由以下组成的群：麻疹病毒(Morbillivirus)抗原、狂犬病病毒糖蛋白、猫白血病病毒(FeLV)包膜蛋白、免疫缺陷病毒抗原、细小病毒抗原、痘病毒抗原。
本发明进一步涉及包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体及医药或兽医上可接受的载剂或稀释剂的免疫原性或疫苗组合物。
在另一方面中，包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的免疫原性或疫苗组合物适于经口、经皮内、经肌内或经鼻内施用。
本发明进一步涉及产生用于降低与感染相关或由感染造成的一或多种临床体征的发生率或严重性且包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的免疫原性组合物或疫苗的方法，该方法包含以下步骤：(a)将包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的重组rCAdV载体引入宿主细胞中；(b)在适宜条件下培育经感染细胞；(c)收获经感染细胞和/或载体和/或病毒组分；(d)任选纯化步骤(c)的收获物；及(e)将该收获物与医药上可接受的载剂混合。
本发明进一步涉及降低或预防动物中由病原体感染造成的临床体征或疾病或用于治疗或预防动物的病原体感染的方法中的方法，其包含向动物施用治疗有效量的包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的免疫原性组合物或疫苗的步骤。
在上述实施方案的任一方法的特定方面中，免疫原性组合物施用一次。
在上述实施方案的任一方法的特定方面中，免疫原性组合物以两个剂量来施用。
在上述实施方案的任一方法的特定方面中，免疫原性组合物经口、经皮内、经肌内或经鼻内来施用。
在上述实施方案的任一方法的特定方面中，免疫原性组合物针对同源和/或异源病毒攻击进行保护。
本发明进一步涉及使动物对该动物中由病原体造成的临床疾病免疫的方法，其包含向该动物施用包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的免疫原性组合物的步骤，其中该免疫原性组合物或疫苗不会造成感染的临床体征，但能诱导使动物对该病原体的病原形式免疫的免疫反应。
在根据上述方法的本发明的特定方面中，免疫原性组合物是施用一次或另一选择为以两个剂量施用。
在根据上述方法的本发明的特定方面中，免疫原性组合物是经口、经皮内、经肌内或经鼻内施用。
在根据上述方法的本发明的特定方面中，免疫原性组合物针对同源和/或异源病毒攻击进行保护。
本发明进一步涉及用于对动物进行疫苗接种以抵抗动物中与病原体相关或由病原体造成的一或多种临床体征相关的疾病和/或降低该一或多种临床体征的发生率或严重性的试剂盒，该试剂盒包含：(a)能向动物施用包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的疫苗的分配器；及(b)包含上述实施方案中任一者的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体的免疫原性组合物或疫苗，及(c)任选说明书插页。
本发明进一步涉及表达上述实施方案的重组型犬腺病毒2型(rCAdV2)的真核宿主细胞系。
在另一特定方面中，宿主细胞系是选自由以下组成的群的哺乳动物细胞系或昆虫细胞系：PK/WRL细胞系、RK13细胞系、MDBK细胞系、ST细胞系、AI-ST细胞系、VERO细胞系、Sf9细胞系、Sf21、Sf+细胞系、MDCK细胞系和/或其衍生物。
在再一特定方面中，宿主细胞系是表达上述实施方案的重组型2型犬腺病毒(rCAdV2)的原核宿主细胞系。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与归档时熟习本发明所属技术领域者通常所了解含义相同的含义。应明确术语的含义及范围，然而，在有任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何字典或外在定义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语包括复数形式且复数术语包括单数形式。除非另有说明，否则本文所用“或”意指“和/或”。此外，所用术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”及“包括(included)”等其他形式无限制性。本文所提及的所有专利及出版物皆以引用方式并入本文中。
除非另外指示，否则本发明的实践将采用熟习此项技术者熟知的病毒学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学的习用技术。所述技术全面阐释于文献中。例如参见，Sambrook、Fritsch及Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第I卷、第II卷及第III卷，第二版(1989)；DNA Cloning,第I卷及第II卷(D.N.Glover编辑1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins编辑1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986)；Perbal,B.,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；连载，Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Protein purification methods–a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal编辑，IRL Press，Oxford University Press)；及Handbook ofExperimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编辑1986,BlackwellScientific Publications)。
在详细阐述本发明之前，应理解，本发明并不限于特定DNA、多肽序列或制程参数，因此当然可变化。亦应了解，本文所用的术语仅是出于阐述本发明的特定实施方案的目的，而并非意欲具有限制性。必须指出，除非上下文另有明确指示，否则如本说明书及随附申请专利范围中所用的单数形式“一(a，an)”及“该”包括复数个指示物。因此，例如，所提及的“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物，所提及的“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物，及诸如此类。
分子生物学定义
术语“载体”如业内已知是指多核苷酸构建体，通常为用于将遗传物质传递至宿主细胞的质粒或细菌人工染色体或减弱活病毒载体。载体可为(例如)细菌、病毒、噬菌体、细菌人工染色体、粘粒或质粒。如本文所用载体可由DNA或RNA构成或含有DNA或RNA。在一些实施方案中，载体由DNA构成。在一些实施方案中，载体是感染性病毒。此一病毒载体含有病毒基因组，该病毒基因组是以下列方式来处理：该病毒载体携载外来基因，该外来基因在细胞培养物中或在宿主动物中在该病毒载体的复制中皆无功能。根据本发明的特定方面，载体可用于多个方面，例如仅传递遗传物质，用于转染宿主细胞或生物体，用作疫苗(例如DNA疫苗)或用于基因表达目的。基因表达是阐述如通过称为基因的特定多核苷酸序列所指导在细胞中生物合成蛋白质的术语。在特定方面中，载体可为“表达载体”，其是当存在于适当环境中时能指导由载体携载的一或多个基因编码的蛋白质的表达的载体。
载体及制备和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可通过揭示于以下中的方法或以与所述方法类似的方式来达成：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virusvectors to vaccination:An update,”PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,”PNAS USA 93:11341-11348,1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编者),Methods in MolecularBiology 39,“Baculovirus Expression Protocols”(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology,1983年12月,第3卷,第12期,第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector,”Molecular and Cellular Biology 1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号；EP专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function of herpes simplex virusgenes:A primer for genetic engineering of novel vectors,”PNAS USA 93:11307-11312,1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineeredherpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,”PNASUSA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors forgene delivery to B lymphocytes”,PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,”PNAS USA93:11371-11377,1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；1996年7月3日提出申请的容许的美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus ascloning vectors,”Seminars in Virology(第3卷)第237-52页,1993；Ballay等人EMBOJournal,第4卷，第3861-65页,Graham,Tibtech 8,85-87,4月,1990；Prevec等人，J.GenVirol.70,42434；PCTWO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccinesencoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,inducesprotective immunity in animal models of herpes simplex virus-2disease”,PNASUSA 93:11414-11420,1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号以及第WO90/11092号、第WO93/19183号、第WO94/21797号、第WO95/11307号、第WO95/20660号；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry(尤其关于DNA表达载体)。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology第9卷，第271-283页(1997)(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文所引用的其他文件。
术语“病毒载体”阐述通过重组型DNA技术处理的经遗传修饰病毒，使得其进入宿主细胞产生特定生物活性，例如由载体携载的转基因的表达。在特定方面中，转基因是抗原。在靶细胞、组织或生物体中，病毒载体可或可不为可复制型的。
病毒载体的生成可使用业内熟知的任何适宜遗传改造技术来实现，所述遗传改造技术包括(但不限于)限制内核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化、DNA测序、在细胞培养物中转染的标准技术，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1989))或K.Maramorosch及H.Koprowski(Methods in Virology，第VIII卷，Academic Press Inc.London,UK(2014))中所阐述。
病毒载体可纳入来自任何已知生物体的基因组的序列。所述序列可以其天然形式纳入或可以任一方式经修饰以获得期望活性。举例而言，所述序列可包含插入、缺失或取代。另外，序列可经“密码子优化”以通过增加所关注基因的翻译效率来改良活生物体中的蛋白质表达。举例而言，所关注基因可突变(或重新合成)以改变用于编码特定氨基酸的密码子，而不改变蛋白质本身的氨基酸序列。稀有密码子可由宿主生物体基因中更丰富的密码子替代。优化所关注基因中的密码子可为增加宿主细胞背景中基因的功能和/或表达的最好方式。
病毒载体可包括两种或更多种所关注蛋白的编码区。举例而言，病毒载体可包括第一所关注蛋白的编码区及第二所关注蛋白的编码区。第一所关注蛋白及第二所关注蛋白可相同或不同。在一些实施方案中，病毒载体可包括第三或第四所关注蛋白的编码区。第三及第四所关注蛋白可相同或不同。由一种病毒载体编码的两种或更多种所关注蛋白的总长度可变化。举例而言，两种或更多种蛋白的总长度可为至少约200个氨基酸。至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。
优选病毒载体包括犬腺病毒CAdV2载体。
根据本发明的特定方面，术语“病毒载体”或另一选择为“病毒构建体”是指源于病毒的重组型病毒构建体，该病毒选自腺病毒科(Adenoviridae，AdV)，例如CAdV-1及CAdV-2(犬腺病毒)(参见van Regenmortel,M.H.V.,Fauquet,C.M.,Bishop,D.H.L.,Carstens,E.B.,Estes,M.K.,Lemon,S.M.,Maniloff,J.,Mayo,M.A.,McGeoch,D.J.,Pringle,C.R.及Wickner,R.B.(2000).Virus taxonomy.Seventh report of the InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses.Academic Press,San Diego.第1162页)。
术语“病毒载体”及“病毒构建体”可互换使用。
如本文所用术语“构建体”是指人工生成的重组型核酸，例如质粒、BAC或重组型病毒。
术语“质粒”是指独立于细菌染色体在细菌宿主细胞内复制的细胞质DNA。在本发明的特定方面中，术语“质粒”和/或“转移质粒”和/或“转移片段”是指可用于构建(例如)用于插入病毒载体中的表达盒的重组型DNA技术的要素。在另一特定方面中，术语“质粒”可用于指定适用于DNA疫苗接种目的的质粒。
如本文所用术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任一核酸。
如本文所用术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“RNA序列”或“DNA序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分且指基因组或合成来源的DNA或RNA，该DNA或RNA可为单链或双链且代表有义链或反义链。序列可为非编码序列、编码序列或二者的混合物。本发明的核酸序列可使用熟习此项技术者熟知的标准技术来制备。
术语“核酸”及“多核苷酸”亦特定地包括由除5种生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。
术语“调控核酸”、“调控组件”及“表达控制组件”可互换使用且是指可影响特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的表达的核酸分子。所述术语广泛用于且涵盖促进或调控转录的所有组件，包括启动子、启动子序列、RNA聚合酶及转录因子的基本相互作用所需要的核心组件、上游组件、增强子及反应组件。原核生物中的实例性调控组件包括启动子、操纵子序列及核糖体结合位点。用于真核细胞中的调控组件可包括(但不限于)转录及翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入位点(IRES)、小核糖核酸病毒科2A序列及诸如此类，其提供和/或调控宿主细胞中编码序列的表达和/或所编码多肽的产生。
“内部核糖体进入位点”或“IRES”阐述独立于IRES的基因5′在功能上促进翻译起始且容许两个顺反子(开放阅读框)自动物细胞中的单一转录物翻译的序列。IRES提供独立核糖体进入位点用于紧邻其下游的开放阅读框的翻译。与可为多顺反子(亦即，编码自mRNA依序翻译的若干不同多肽)的细菌mRNA不同，动物细胞的大多数mRNA为单顺反子且编码仅一种多肽的合成。在真核细胞中的多顺反子转录的情况下，翻译可自最5′翻译起始位点开始，在第一终止密码子处终止，且转录物可自核糖体释放，从而仅翻译mRNA中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有可操作连接至转录物中的第二或后续开放阅读框的IRES的多顺反子转录物容许依序翻译该下游开放阅读框以产生由同一转录物编码的两种或更多种多肽。IRES可具有不同长度且可来自多种来源，例如脑心肌炎病毒(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒、FMDV或脊髓灰白质炎病毒(PV)或C型肝炎病毒(HCV)。多种IRES序列及其在载体构建中的使用已有所阐述且为业内所熟知。下游编码序列可在将不负面影响下游基因的表达的任一距离可操作连接至IRES的3′端。IRES与下游基因起点之间的最优选或可允许距离可通过改变距离并量测随距离变化的表达容易地测定。
术语“2a”或“2a肽”意指短寡肽序列，其阐述为2a及“2a样”，其用作能通过定义为核糖体跳跃的过程来调介蛋白质之间的共翻译裂解的接头。所述2a及“2a样”序列(来自小核糖核酸病毒科及其他病毒或细胞序列)可用于将多个基因序列串联成单一基因，从而确保其在同一细胞内的共表达(参见Luke及Ryan，2013)。
如本文所用术语“启动子”或“启动子序列”意指可以结合RNA聚合酶且指导基因的转录作用的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5'非编码区，其靠近基因的转录开始位点。位在启动子内具有起始转录作用功能的序列组件通常以共有核苷酸序列为特征。启动子的实例包括(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及动物(例如哺乳动物(包括马、猪、牛及人类)、鸟或昆虫)的启动子。启动子可为可诱导的、可抑制的和/或组成性的。可诱导启动子因应培养条件的某一改变(例如温度改变)而在其控制下起始增加的自DNA的转录程度(Ptashne,2014)。熟习此项技术者熟知的启动子的实例是(例如)SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延伸因子α启动子、杆状病毒多角体启动子。
如本文在本发明的情况下所用术语启动子尤其是指功能片段，例如4pgG600(SEQID NO.:29)或其互补核苷酸序列的截短形式，优选序列相同性为关于整个长度(至少)72％(或更高)。此外，如本文在本发明的情况下所用术语启动子尤其是指功能片段，例如4pMCP600(SEQ ID NO.:30)或其互补核苷酸序列的截短形式，优选地序列相同性为关于整个长度(至少)78％(或更高)。最优选地“启动子”是指p430(SEQ ID NO.:31)或p455(SEQ IDNO.:32)。术语“p430”、“gG 430”及“430”在整个说明书、图、序列表等中可同义且互换使用。术语“p455”、“MCP 455”及“455”在整个说明书、图、序列表等中可同义且互换使用。
EHV-4启动子优选为经截短的转录活性启动子，其包含经病毒提供的反式活化蛋白反式活化的区及衍生出经截短转录活性启动子的全长启动子的最小启动子区。出于此说明书的目的，“启动子”是由对应于最小启动子的DNA序列及上游调节序列的组合所构成；“最小启动子”是由CAP位点加TATA盒构成(用于基本转录程度(未调控的转录程度)的最小序列)；且“上游调节序列”是由上游组件和/或增强子序列构成。此外，术语“经截短”意指并全长启动子并未完全存在，亦即，已去除全长启动子的某一部分。优选实施方案中的经截短启动子源于马疱疹病毒-4(EHV-4基因组，其在本文中称作4pgG600(SEQ ID NO.:29)、4pMCP600(SEQ ID NO.:30))，经截短启动子是分别源于全长序列的pgG430(SEQ ID NO.:31)或gMCP455(SEQ ID NO.:32)。
启动子可经截短使得大小自全长启动子基于碱基对降低5％、10％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％且甚至高达90％；分别例如马4pgG600(SEQ IDNO.:29)、4pMCP600(SEQ ID NO.:30)。实际上，本发明的经截短启动子可基本上由被由插入经截短启动子的病毒或系统提供的反式活化蛋白反式活化的截短内的任一区组成，且因此该经截短启动子是最小启动子。
本发明的经截短“转录活性”或“胜任(competent)”启动子是指源于马疱疹病毒4基因组的经截短转录活性真核疱疹病毒启动子：EHV-4gG430(SEQ ID NO.:31)及gMCP455(SEQ ID NO.:32)启动子。“活性”(或“胜任”)，经截短转录活性激活子应展现全长激活子的至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的转录活性。核苷酸或全长启动子的部分或区的缺失可自本文的教示进行，而无需过多实验，以除所例示的那些以外生成活性片段。
可用于实践本发明的启动子因此可包括全长启动子的衍生物和/或子片段，所述衍生物和/或子片段维持足够的启动子活性且因此可用作启动子，且其可有利地具有实质上类似于衍生出衍生物或子片段的实际或全长启动子的启动子活性。如本文所用术语“衍生物”或“子片段”是指具有诸如截短和/或取代/缺失等修饰，使得启动子序列具有在与野生型启动子相比时实质上等效的功能的核酸序列。所述衍生物或子片段包括具有较少可有意为的(如通过定点诱变)或可自发的修饰的核酸序列。术语“衍生物”进一步涵盖相对于序列的缺失、添加及取代，只要启动子保留“转录活性”或“胜任”以驱动(例如)编码所关注抗原的可操作连接多肽的表达即可。
术语“增强子”表示在顺式位置作用于启动子的活性且因此刺激功能链接至此启动子的基因或编码序列的转录的多核苷酸序列。与启动子不同，增强子的效应独立于位置及定向，且因此其可位于转录单元的前方或后方，于内含子内或甚至于编码区内。增强子可位于转录单元的邻近区域中且可距启动子相当大的距离。亦可与启动子具有物理及功能重迭。熟习此项技术者将意识到来自多种来源的多种增强子(且保存在数据库(例如基因库)中，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子)，所述增强子可用作独立组件或在多核苷酸序列内克隆的组件(例如保存在ATCC处或来自商业及个别来源)。多种启动子序列亦含有增强子序列，例如通常使用的CMV启动子。人类CMV增强子是迄今所鉴别的最强增强子之一。可诱导增强子的一个实例是金属硫蛋白增强子，该金属硫蛋白增强子可通过糖皮质激素或重金属来刺激。
术语“互补核苷酸序列”阐述多核苷酸(例如DNA或RNA)的两条配对链中的一条链。互补链的核苷酸序列映出其配对链的核苷酸序列，使得对于每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或尿嘧啶(对于RNA))，对于每一鸟嘌呤而言含有胞嘧啶，且反的亦然。例如5’-GCATAC-3’的互补核苷酸序列为3’-CGTATG-5’或3’-CGUAUG-5’(对于RNA)。
本文所用术语“基因”、“所关注基因”具有相同含义且是指编码所关注产物的任一长度的多核苷酸序列。基因可在编码序列之前(5′非编码或非翻译序列)及之后(3′非编码或非翻译序列)进一步包含调节序列。所选序列可为全长或经截短、融合或加标签基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段。通常应了解，编码多肽或RNA的基因组DNA可包括非编码区(即内含子)，所述非编码区是自成熟信使RNA(mRNA)剪接且因此不存在于编码同一多肽或RNA的cDNA中。其可为天然序列(亦即天然形式)，或可突变，或包含源于不同来源的序列或以其他方式修饰(若期望)。所述修饰包括密码子优化以使所选宿主细胞中的密码子使用优化或加标签。此外，其可包括去除或添加顺式作用位点，例如(隐蔽)剪接供体、接受体位点及分支点，多腺苷酸化信号、TATA盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、用于转录因子或其他调节因子的结合位点、限制酶位点等以得到少量但非限制的实例。所选序列可编码分泌型、细胞质、细胞核、膜结合型或细胞表面多肽。
通过定义，“表位”是具有免疫学活性的抗原决定子，其意为在施用至宿主时其能诱发体液(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫反应。这些是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列。抗体特异性地结合多肽上的特定抗原表位。表位的特定非限制性实例包括多肽中的四肽至五肽序列、多糖中的三糖苷至五糖苷序列。在动物中，大多数抗原将同时呈现若干或甚至许多的抗原决定子。此多肽亦可有资格作为免疫原性多肽且可如下进一步阐述来鉴别表位。
“所关注表位”可为兽医病原体或毒素的抗原，或来自兽医病原体或毒素的抗原，或引发关于病原体的反应的另一抗原或毒素，或来自引发关于病原体的反应的另一抗原或毒素，例如，非限制性实例：副粘病毒(Paramyxovirus)抗原，例如犬瘟热病毒(CDV)抗原(例如HA或F)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)抗原、牛副流行性感冒病毒3(bPIV3)；狂犬病病毒糖蛋白，例如，狂犬病病毒糖蛋白G；禽流行性感冒抗原，例如，火鸡流行性感冒HA、鸡/Pennsylvania/1/83流行性感冒抗原，例如核蛋白(NP)；牛白血病病毒抗原，例如，gp51,30包膜；新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)抗原，例如，HN或F；猫白血病病毒抗原(FeLV)，例如，FeLV包膜蛋白；疱疹病毒糖蛋白，例如，来自猫疱疹病毒、马疱疹病毒、牛疱疹病毒、伪狂犬病病毒或犬疱疹病毒(犬疱疹病毒糖蛋白gB、gC或gD)的糖蛋白；黄病毒抗原，例如，西尼罗病毒(West Nile virus)或蜱传脑炎病毒抗原；免疫缺陷病毒抗原，例如，猫免疫缺陷病毒(FIV)抗原；细小病毒抗原，例如犬细小病毒VP2抗原；马流行性感冒抗原；马立克氏病(Marek's Disease)病毒抗原；痘病毒抗原，例如，鸡痘病毒抗原；感染性华氏囊病病毒抗原，例如，VP2、VP3、VP4；冠状病毒抗原，例如来自猪冠状病毒(TGEV、PEDV及德尔塔冠状SPIKE Ags)、犬和/或猫、家禽(例如感染性支气管炎病毒(IBV))；或瘟疫病毒属抗原，例如，牛病毒性腹泻病毒抗原。
如本文所用术语“所关注核苷酸序列”或“所关注序列”系较所关注基因更一般的术语，乃因其不一定包含基因但可包含基因或其他遗传信息的组件或部分，例如ori(复制起点)。所关注核苷酸序列可为任何DNA或RNA序列，与其包含编码序列抑或不包含编码序列无关。
“开放阅读框”或“ORF”是指一段包含翻译开始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)及终止密码子且可潜在地翻译为多肽序列的核酸序列(DNA或RNA)。
术语“转录”阐述细胞中mRNA的生物合成。
如本文所用术语“表达”是指宿主细胞内核酸序列的转录和/或翻译。根据本发明的特定方面，术语“表达”是指宿主细胞内异源和/或外源核酸序列的转录和/或翻译。宿主细胞中期望产物的表达程度可基于存在于细胞中的相应RNA或mRNA的量或由所选序列编码的期望多肽的量来测定。举例而言，自所选序列转录的mRNA可通过Northern印迹(Northernblot)杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA的原位杂交或通过RTqPCR(反转录，随后定量PCR)来量化。自所选序列的蛋白质表达可通过多种方法来量化，例如ELISA、蛋白印迹法、放射免疫分析、免疫沈淀、分析蛋白质的生物活性或蛋白质的免疫染色随后FACS分析。
术语“表达盒”或“转录单元”或“表达单元”定义载体、构建体或多核苷酸序列内含有一或多个欲转录基因的区，其中编码所转录基因的核苷酸序列以及含有含于表达盒内的调控组件的多核苷酸序列彼此可操作连接。其是自激活子转录且转录是通过至少一个多腺苷酸化信号终止。在一个特定方面中，其是自一个单一启动子转录。因此，不同基因至少转录连接。自每一转录单元(多顺反子转录单元)可转录及表达一种以上蛋白质或产物。每一转录单元将包含该单元内所含有的任一所选序列的转录及翻译所需要的调控组件。且每一转录单元可含有相同或不同的调控组件。举例而言，每一转录单元可含有相同终止子，IRES组件或内含子可用于功能连接转录单元内的基因。载体或多核苷酸序列可含有一个以上转录单元。
术语“增加的表达”、“增加的效价或生产力”或“改良的表达或生产力”意指通过与适宜对照相比(例如由cDNA编码的蛋白质对照由含有内含子的基因编码的蛋白质)，引入宿主细胞中的异源和/或外源序列(例如编码治疗性蛋白质的基因)的表达、合成或分泌增加。若本发明的细胞系根据本文所阐述的本发明方法来培育，且若此细胞的特异性生产力或效价具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍的增加，则存在增加的效价或生产力。若本发明的细胞系根据本文所阐述的本发明方法来培育，且若此细胞的特异性生产力或效价具有至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍的增加，则亦存在增加的效价或生产力。若本发明细胞系根据本文所阐述的本发明方法来培育，且若此细胞的特异性生产力或效价具有至少1.2倍至5倍、优选1.5倍至5倍、更优选2倍至5倍、尤佳3倍至5倍的增加，则亦存在特别增加的效价或生产力。“增加的表达”亦可意指更多的细胞实际表达所关注基因/序列。例如，表达可意指，在表达或具有可检测转基因表达的回收细胞数方面，相对于由另一启动子实现的表达，本发明的新颖启动子增加。增加的表达亦可意指基于每个细胞可检测mRNA和/或蛋白质的含量的增加。
增加的表达、效价或生产力可通过使用本发明的异源载体获得。此可与其他方法(例如FACS辅助选择含有一或多种荧光蛋白(例如GFP)或细胞表面标记物作为另一可选标记物的重组型宿主细胞)组合。亦可使用获得增加的表达的其他方法及不同方法的组合，所述方法是基于(例如)用于处理染色质结构的顺式-活性组件(例如LCR、UCOE、EASE、隔离子、S/MAR、STAR组件)的使用，基于(人工)转录因子的使用，用天然或合成试剂处理细胞以上调内源或异源和/或外源基因表达，改良mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)，改良mRNA翻译的起始，通过使用游离型质粒(基于使用病毒序列作为复制起点，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)来增加基因剂量，使用扩增促进序列或基于DNA多联体的活体外扩增系统。
用于量测“增加的表达”的分析是基于LC-MS/MS的蛋白质量测，例如多反应监测(MRM)；基于抗体的检测方法，例如蛋白印迹(Western blot)、斑点印迹或免疫扩散、流式细胞术；及间接免疫荧光(IFA)，及通过血细胞凝集分析对生物活性的量测。
“启动子活性”是通过在各别启动子的控制下量化所转录mRNA来间接量测。mRNA是相对于内源标准通过RTqPCR来量化。
术语“病毒效价”是每体积病毒制备物传染单位的量度。病毒效价是生物程序的终点且定义为平行实施的某一比例的测试在其下显示效应的稀释度(Reed及Muench,1938)。特定而言，组织培养物感染剂量50/毫升(TCID50/ml)给出用病毒制备物的稀释物平行接种的细胞培养物的数量的50％经感染的稀释物。
“转录调控组件”通常包含位于欲表达基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点及多腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”是指构建体中对应于纳入初级转录物(亦即mRNA前体)中的第一核酸的核酸。转录起始位点可与启动子序列重迭。
“终止信号”或“终止子”或“多腺苷酸化信号”或“polyA”或“转录终止位点”或“转录终止组件”是导致在真核mRNA的3'末端的特定位点处的裂解及在经裂解3'末端处约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列(polyA尾)的转录后纳入，且因此导致RNA聚合酶终止转录的信号序列。多腺苷酸化信号包含在裂解位点上游约10-30个核苷酸的序列AATAAA及位于下游的序列。已知多种多腺苷酸化组件，例如tk polyA、SV40晚期及早期polyA、BGH polyA(阐述于(例如)美国专利第5,122,458号中)或仓鼠生长激素polyA。
“翻译调控组件”包含针对欲表达的每一个别多肽的翻译起始位点(AUG)、终止密码子及polyA信号。在一些构建体中可包括内部核糖体进入位点(IRES)。为优化表达，可适当地去除、添加或改变欲表达的核酸序列的5'-和/或3'-未翻译区，以消除任何潜在额外不适当的替代翻译起始密码子或可在转录或翻译层面干扰或降低表达的其他序列。可将共有核糖体结合位点(Kozak序列)插入紧接开始密码子的上游以增强翻译及因此表达。增加此核糖体结合位点周围的A/U含量可促进更有效的核糖体结合。
通过定义，插入在宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由其编码的各别蛋白质或RNA在来自不同(病毒)物种时称作相对于宿主细胞的“外源”、“外源序列”、“外源基因”、“外源编码序列”。因此，就CAdV载体而言，本发明的基于EHV-4的启动子是外源的。因此，任何所关注非犬序列或基因(例如非犬抗原)是根据本发明的特定方面的所关注外源序列或基因或抗原。
通过定义，插入在宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由其编码的各别蛋白或RNA称为相对于宿主细胞的“异源”、“异源序列”、“异源基因”、“异源编码序列”、“转基因”或“异源蛋白”。即使欲引入的序列或欲引入的基因与宿主细胞的内源序列或内源基因相同，此亦适用。如本文关于所关注序列或基因(例如抗原)所使用，术语“异源”意味着该所关注序列或基因、特定而言该抗原是自其天然物种背景表达出来。
术语“非天然”意指在此背景下并非天然存在的任何所关注序列或基因(例如抗原)，例如来自不同物种的杂交序列或所关注序列或基因(例如抗原)，或由人工突变、插入、缺失或诸如此类引起的不为天然产物的所关注序列或基因(例如抗原)。
术语“重组”在本发明的整个说明书中可与术语“非天然”、“异源”及“外源”互换使用。因此，“重组”蛋白是自异源或外源多核苷酸序列表达的蛋白质。术语如关于病毒所使用的重组意指通过人工处理病毒基因组而产生的病毒。包含异源或外源序列(例如外源抗原编码序列)的病毒是重组型病毒。术语重组型病毒及术语非天然病毒可互换使用。
因此，术语“异源载体”意指包含异源或外源多核苷酸序列的载体。术语“重组载体”意指包含异源或重组多核苷酸序列的载体。
如本文所用术语“可操作连接”用于阐述调控组件与基因或其编码区之间的链接。通常，基因表达是在一或多个调控组件的控制下进行，例如(但不限于)组成性或可诱导启动子、组织特异性调控组件及增强子。认为基因或编码区“可操作连接至(operably linkedto或operatively linked to)”调控组件或与调控组件“可操作结合”，意味着该基因或编码区受调控组件的控制或影响。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。
此外，在本阐述的范围内，术语“功能连接(functional linking或functionallylinked)”或“可操作连接”意味着两个或更多个核酸序列或序列组件是以允许其以其预期方式起作用的方式经定位。举例而言，若启动子/增强子或终止子能在顺式位置控制或调节所连接基因序列的转录，则其是功能连接至编码基因序列。通常但不一定，功能连接的DNA序列是邻接的，且在必要时联结两个多肽编码区或在分泌信号肽的情形下是邻接的且在阅读框中。然而，尽管可操作连接的启动子通常位于上游或可操作连接的终止子通常位于编码序列的下游，但不一定与该编码序列邻接。增强子并非必须邻接，只要其增加编码序列的转录即可。为此，其可位于编码序列的上游或下游且甚至可相距某一距离。若多腺苷酸化位点位于编码序列的3′末端，则多腺苷酸化位点可操作连接至编码序列，使得转录经由编码序列继续进行至多腺苷酸化信号中。连接是通过业内已知的重组方法来实现，例如通过在适宜限制位点或钝端处连接或通过使用融合PCR方法实现。若不存在适宜限制位点，则可根据习用实践使用合成寡核苷酸接头或适配体。
因此，术语启动子序列的“功能片段或衍生物“意指，片段或衍生物仍实现启动子活性。如何评价启动子活性的功能分析为熟习此项技术者熟知(Bustin,S.2000.Absolutequantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chainreaction assays.Journal of Molecular Endocrinology 25(2):169-193；Nolan,T.Rebecca E Hands,R.E.及Bustin S.A.2006.Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols1:1559-1582)。此一功能分析的实例性实施方案包括(例如)启动子动力学实验。将感染携载表达盒(其中启动子或其片段引导报告基因转基因的转录)的载体病毒的细胞培育不同时间。自在感染后不同时间收集的试样制备总RNA。在通过DNAse I消化破坏污染DNA之后，RNA发生逆转录。在添加反转录酶(RT)下处理一个复制试样，在不添加RT下处理第二复制物以便展示污染DNA自RNA制备物的成功去除。纯化所得cDNA且使用其作为习用PCR中的模板。仅在添加RT下处理的试样应产生PCR产物。然后可将所述cDNA用于利用报导基因转基因的引物的qPCR及利用病毒载体的必需基因(内部标准基因，其转录提供感染及复制的效率的内部标准)的引物的qPCR。使用内部标准基因的qPCR值归一化不同构建体与感染后时间之间的报导基因的qPCR值。此容许诠释不同启动子及其片段的启动子活性。
如本文所用“序列同源性”是指测定两个序列的相关性的方法。为测定序列同源性，最佳地比对两个或更多个序列，且视需要引入空位。然而，与“序列相同性”相反，在测定序列同源性时，保守氨基酸取代可视为匹配。换言之，为获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中的85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含另一氨基酸或核苷酸的保守取代，或可将占参考序列中的总氨基酸残基或核苷酸(不包括保守取代)的最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的数量的氨基酸或核苷酸插入参考序列中。优选地，同系物序列包含至少50、甚至更优选地100、甚至更优选地250、甚至更优选地500个核苷酸的延伸体。
业内已知的“序列相同性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参考序列与拟与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。通过在将序列最佳地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性，如通过序列串之间的匹配所测定。在该比对时，基于逐个位置来确定序列相同性，举例而言，若在一个位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则所述序列在该位置处“相同”。然后将所述位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可易于通过已知方法来计算，包括(但不限于)阐述于以下文献中的那些：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教示内容以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。所述程序的实例包括(但不限于)GCG程序包装(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIHBethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示内容以引用方式并入本文中)。所述程序最佳地使用默认空位权重比对序列以便在给定序列与参考序列之间产生最高序列相同性程度。作为阐释，对于多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％“序列相同性”的核苷酸序列而言，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，只是给定多核苷酸序列可包括最多15、优选地最多10、甚至更优选地最多5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高15％、优选地10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或参考序列中全部核苷酸中最高15％、优选地10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地5％、4％、3％、2％、1％、0.1％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的所述突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于多肽具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定氨基酸序列而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同，只是给定多肽序列可包含最高15、优选地最高10、9、8、7、6、甚至更优选地最高5、4、3、2、1个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言之，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定多肽序列，参考序列中最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可将占参考序列中的总氨基酸残基数的最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％的数量的氨基酸插入参考序列中。参考序列的所述改变可发生在参考氨基酸序列的胺氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列相同性时，并不包括保守取代作为匹配。
术语“序列相同性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。出于本发明目的，在本文中应明确，为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分比，出于最佳对比目的对比所述序列(举例而言，可将空位引入第一氨基酸或核酸的序列中以用于与第二氨基或核酸序列进行最优选对比)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。在第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则所述分子在该位置相同。两个序列之间的相同性％是所述序列所共享的相同位置数的函数(亦即，相同性％＝相同位置数/总位置(亦即重迭位置)数×100)。优选地，两个序列具有相同长度。
可在两个所比较序列的整个长度中或在两个序列的片段中实施序列比较。通常，在两个所比较序列的全长中实施比较。然而，可在(例如)20、50、100或更多个邻接氨基酸残基的区中实施序列相同性。
熟习此项技术者应知晓，实际上可利用若干不同计算机程序来测定两个序列之间的同源性。举例而言，两个序列之间的序列比较及相同性百分比的测定可使用数学算法来实现。在优选实施方案中，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法(其已纳入Accelrys GCG软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/处获得)中的GAP程序中)、使用Blosum62矩阵或PAM250矩阵及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6)来测定两个氨基酸或核酸序列之间的百分比相同性。熟习此项技术者应了解，所有所述不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时两个序列的整体百分比相同性并不显著改变。
可进一步使用本发明的蛋白质序列及核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。所述检索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN及BLASTP程序(2.0版)来实施。BLAST蛋白质检索可使用BLASTP程序、评分＝50、字长＝3来实施，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。25(17):3389-3402。为获得用于比较目的的空位化比对，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中利用空位化BLAST。在利用BLAST及空位化BLAST程序时，可使用各别程序(例如，XBLAST及NBLAST)的默认参数。参见国家生物技术信息中心的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
EHV-1、EHV-4及CAdV/重组型载体技术定义
术语“马科动物”或“马”(“equine”或“equin”)意指或属马科动物科，其包括马、驴及斑马，优选地马。另外，术语“马科动物”或“马”(“equine”或“equin”)亦涵盖马科的成员的杂种(例如骡子、駃騠等)。
“疱疹病毒”或“疱疹病毒载体”是指疱疹病毒目疱疹病毒科中的物种。
术语“马疱疹病毒载体”或“马疱疹病毒”意指影响马的疱疹病毒科的成员。迄今为止，已经鉴别了八种不同物种的马疱疹病毒，其中五种属亚科α疱疹病毒(alphaherpesvirinae)亚科且三种属丙型疱疹病毒亚科(gammaherpesvirinae)。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015年发布EC 47,London,UK，2015年7月；电子邮件批准2016(MSL#30)
术语“EHV-1”意指马疱疹病毒1，即疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科属中亚属水痘病毒属(Varicellovirus)的成员。EHV-1的非限制性参考序列可为(例如)野生型EHV-1毒株ab4(基因库登录号AY665713.1)或RacH(Hübert,P.H.,Birkenmaier,S.,Rziha,H.-J.及Osterrieder,N.(1996),Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1(EHV-1)Strain RacH During Attenuation.Journal of Veterinary Medicine,系列B,43:1–14)。
术语EHV-4意指马疱疹病毒4，即疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科属中亚属水痘病毒属的成员。
术语“CAdV”、“CAV”、“CAV-1”或“CAV-2”分别意指1型或2型犬腺病毒，腺病毒科中哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)的成员。然而，根据最新分类法(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015年发布EC 47,London,UK,2015年7月；电子邮件批准2016(MSL编号30)，术语犬腺病毒(CAdV)现涵盖两个物种CAV-2及CAV-1。
“重组型CAdV载体”或“rCAdV”和/或“rCAdV载体”或“rCAdV”或“rCAdV2”是指包含至少一个编码(例如)转基因表达标记物(例如绿色荧光蛋白)的外源表达盒(即含有与启动子、增强子及其他适宜调控组件可操作链接的编码序列)且在优选实施方案中至少一个“所关注基因”和/或“所关注表位”的犬腺病毒。
可通过熟习病毒学及分子生物学领域者已知的标准方法来产生rCAdV载体。然而，为有利于CAdV基因组的处理及载体的产生，本发明亦提供细菌穿梭载体，在一个非限制性实例中，含有编码CAdV基因组的核酸的pBR322质粒。另外，细菌人工染色体(“BAC”)亦可有利于细菌系统中CAdV的处理。
疫苗定义
“免疫原性或免疫组合物”是指包括至少一种抗原或其免疫原性部分的物质的组合物，其在宿主中引发细胞或抗体调介的对组合物的免疫反应的免疫学反应。
本文所用术语“抗原”在业内已众所周知，且包括具有免疫原性的物质(亦即免疫原)以及诱导免疫学不反应性或无反应性(亦即身体的防御机制对外来物质无反应)的物质。如本文所用术语“抗原”欲指含有或包含表位的全长蛋白质以及其肽片段。
如本文所用“免疫原性组合物”可指多肽或蛋白，例如引发本文所述免疫学反应的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指蛋白质或多肽的片段或截短和/或取代形式，其包括一或多个表位且由此引发本文所阐述的免疫学反应。一般而言，所述截短和/或取代的形式或片段将包含来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。所述片段可使用任一数量的业内熟知的表位定位技术来鉴别。例如参见Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris编辑，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。举例而言，线性表位可通过在固体载体上同时合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)且使肽与抗体反应同时肽仍附接至载体来测定。所述技术已为业内知晓及阐述，例如参见美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，通过(例如)x射线结晶学及二维核磁共振且通过测定氨基酸的空间构形来容易地鉴别构象表位。参见Epitope Mapping Protocols(见上文)。该定义内亦包括合成抗原，例如多表位、侧接表位及其他重组或合成源抗原。例如参见Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；及Gardner等人，(1998)12thWorld AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日至7月3日。(其教示及内容皆以引用方式并入本文中。)
本发明再进一步提供含有重组型CAdV病毒或载体及医药上可接受的载剂或稀释剂的“免疫原性组合物”或“疫苗组合物”。含有重组型CAdV病毒或载体(或其表达产物)的免疫原性组合物引发免疫学反应--局部或全身性。该反应可能(但不必需)具有保护性。疫苗组合物引发局部或全身性保护反应。因此，术语“免疫原性组合物”包括“疫苗组合物”(在两个前述术语可为保护性组合物时)。
如本文所用术语“疫苗”是指包含至少一种在动物中诱导免疫学反应的免疫学活性组分且可能但不一定包含一或多种增强活性组分的免疫学活性的额外组分的医药组合物。疫苗可另外包含医药组合物的其他典型组分。通过区别，疫苗的免疫学活性组分可包含呈其原始形式的完整病毒颗粒或所谓经修饰活疫苗(MLV)中的减毒颗粒或通过适当方法在所谓杀死的疫苗(KV)中灭活的颗粒。在另一形式中，疫苗的免疫学活性组分可包含生物体的适当组件(亚单位疫苗)，其中所述组件是通过以下方式生成：通过破坏整个颗粒或含有所述颗粒的生长培养物及任选随后的纯化步骤以产生期望结构，或通过合成方法，包括使用基于(例如)细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的适宜系统的适当处理加上任选随后的分离及纯化程序，或通过使用适宜医药组合物直接纳入遗传物质来诱导需要疫苗的动物中的合成过程(多核苷酸疫苗接种)。疫苗可包含一种或同时一种以上的上述组件。如在本发明的特定方面中所使用，“疫苗”是指活疫苗或活病毒，亦称为重组型疫苗。在本发明的另一特定方面中，“疫苗”是指包括病毒样颗粒(VLP)的灭活或杀死的病毒。因此，疫苗可为亚单位疫苗或杀死的(KV)或灭活疫苗。
“动物”意指哺乳动物、人类、鸟及诸如此类。动物可选自由以下组成的群：马类(例如，马(horse)、斑马、驴)、犬(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、猫(例如，狮、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物及其他猫(包括猎豹及山猫))、羊(例如，绵羊)、牛族(例如，牛、母牛、水牛)、猪(小猪)、禽(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀类、雀鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋及鹤鸵)、灵长类动物(例如，原猴、眼镜猴、猴、长臂猿、人猿)及鱼。术语“动物”亦包括所有发育阶段的个别动物，包括胚胎及胎儿阶段。术语“产食性动物”意指用于人类消费的非犬动物，例如牛、猪、马、家禽、绵羊、鱼及诸如此类，优选产食性动物意指猪及牛，最优选猪。
非犬伴侣动物的实例包括猫物种。
为施用至非犬动物，重组型CAdV提供在无产生性复制下表达的优点。犬腺病毒的复制限于犬物种且文献中未报导在任何非犬物种(包括人)中造成产生性感染的CAdV2。此宿主限制为病毒传递至其他物种提供固有的安全性障壁且使得在兽医应用中跨物种使用基于CAdV2的疫苗载体成为有吸引力的提议。因此，本发明包含通过在宿主中施用或接种重组型CAdV2病毒或载体来扩增或表达蛋白质的方法，其中宿主不为犬或不为重组型病毒或载体的天然宿主，和/或在无产生性复制和/或具有有限复制周期下存在表达。
为施用至犬动物，由于在狗中使用CAdV及尤其CAdV2作为牛痘毒株，故本发明提供用于引入其他所关注表位(例如，犬病原体或毒素的抗原)的方式。在rCAdV2载体中编码的其他所关注表位的表达藉此提供通过用牛痘重组型CAdV2对狗或小狗进行接种来引发对那些所关注表位以及犬腺病毒的活体内反应的方式。其他所关注表位可为犬病原体(除腺病毒以外)的抗原，来自犬病原体(除腺病毒以外)的抗原(在狗或小狗中引发对犬病原体(除腺病毒以外)的反应的另一抗原)，或来自在狗或小狗中引发对犬病原体(除腺病毒以外)的反应的另一抗原。
因此，本发明提供重组型CAdV2可含有编码来自犬病原体实例：狂犬病病毒、犬疱疹病毒、犬瘟热病毒、犬小病毒等的任一抗原的所关注表位的异源DNA。本发明的实施方案包括含有编码一种以上蛋白质(例如，编码两种或更多种表位(例如犬病原体的抗原))的外源DNA的CAdV重组型。本发明亦设想含有CAdV重组型与其他抗原的组合的组合物。
为施用至非犬动物，本发明提供引入所关注表位的方式，其中，所关注抗原性表位是源于诸如选自以下牛病原体的那些的产食性动物病原体的抗原：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus；BVDV)、副流行性感冒-3病毒(PI-3)、感染性牛鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus；IBR)、牛呼吸道合胞病毒(BovineRespiratory Syncytial Virus；BRSV)、牛疱疹病毒(Bovine Herpesvirus；BHV)、牛轮状病毒(Bovine Rotavirus；BRV)、牛肠病毒(Bovine Enterovirus；BEV)、牛冠状病毒(BovineCoronovirus；BCV)、牛狂犬病(Bovine Rabies；BR)、牛细小病毒(Bovine Parvovirus；BPV)、腺病毒星状病毒(Adenovirus Astrovirus)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)(先前称为溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica))、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)(绵羊嗜组织菌(Histophilus ovis)及羔羊嗜血菌(Haemophilus agni))、放线菌属(Actinomyces)(棒状杆菌属(Corynebacterium))、化脓性放线菌(Actinomyces pyogenes)、鹦鹉衣原体(Chlamydia psittaci)、性病胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus venerealis)及胚胎胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus fetus)(先前称为肠道胚胎弯曲杆菌(C fetusintestinalis))、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)及感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体(哈德焦普拉基特诺钩端螺旋体(Leptospira hardjoprajitno)及牛哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo-bovis))、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、猪布氏杆菌(Brucella suis)及马尔他布氏杆菌(Brucella melitensis)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、鹦鹉衣原体、鸣疽梭状芽胞杆菌(Clostridiumchauvoei)、败血梭菌(Clostridium septicum)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、牛莫拉菌(Moraxellabovis)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；新港沙门菌(Salmonella newport)、鸟副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)、小隐胞子虫(Cryptosporidiumparvum)、人隐胞子虫(cryptosporidium hominis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、坏乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、支原体属(Mycoplasma spp)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)及脲原体属(Ureaplasmaspp.)、胚胎三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)、疣状发癣菌(Trichophytonverrucosum)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、沙凯斯维发癣菌(Trichophytonsarkisovii)、犬新孢子虫(Neospora caninum)(先前称为弓形虫(Toxoplasma gondii))、二联巴贝虫(Babesia bigemina)及牛巴贝虫(Babesia bovis)、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)(肺虫病)，及它们的组合。为施用至非犬动物，本发明提供引入所关注表位的方式，其中所关注抗原性表位是源于产食性动物病原体的抗原，例如选自猪病原体的群的那些：沙门菌属(Salmonella spp.)，特别是鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)；星状病毒；轮状病毒；传染性胃肠炎病毒；短螺旋体属(Brachyspira spp.)，特别是猪痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)、多毛短螺旋体(B.pilosicoli)；梭菌属(Clostridium spp.)，特别是艰难梭菌(C.difficile)，A型、B型及C型产气荚膜梭菌(C.perfringens)，诺维氏梭菌(C.novyi)、败血梭菌(C.septicum)、破伤风梭菌(C.tetani)；猪肠道小核糖核酸病毒；猪肠道杯状病毒；呼吸道病原体，其包括：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；支气管败血性博德氏菌(Bordetella bronchiseptica)；猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，特别是亚型1、7及14；巴斯德菌属(Pasteurellaspp.)，特别是多杀巴斯德菌(P.multocida)；支原体属，特别是猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)；猪流行性感冒A病毒；PRRS病毒；猪环状病毒；猪细小病毒；伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；猪附红细胞体(Eperythrozoonosissuis)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，特别是鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、牛分枝杆菌(M.bovis)；猪呼吸道冠状病毒；猪冠状病毒，特别是TGEV、PEDV及德尔塔冠状病毒(delta coronavirus)；化脓性隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)；猪腺病毒；经典猪瘟(Classical swine fever)；猪巨细胞病毒；非洲猪瘟(African swine fever)；或其他病原体，其包括大肠杆菌、链球菌属(Streptococcusspp.)，特别是猪链球菌(S.suis)、豚链球菌(S.porcinus)、坏乳链球菌(S.dysgalactiae)，优选类马链球菌亚属(subsp.equisimilis)；猪布氏杆菌，特别是生物变型(biovars)1、2及3；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)，特别是澳洲钩端螺旋体(L.australis)、犬钩端螺旋体(L.canicola)、感冒伤寒性钩端螺旋体(L.grippotyphosa)、波蒙纳钩端螺旋体(L.pomona)、出血黄疸性钩端螺旋体(L.icterohaemorrhagicae)、问号钩端螺旋体(L.interrogans)、塔拉索夫钩端螺旋体(L.tarassovi)、哈德焦钩端螺旋体(L.hardjo)、塞诺钩端螺旋体(L.sejroe)；脑心肌炎病毒；血细胞凝集性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)；西尼罗病毒(West Nile virus)；呼肠孤病毒(Reovirus)；腮腺炎病毒属(Rubulavirus)；梅南高病毒(Menangle virus)；立百病毒(Nipah virus)；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；猪痘病毒；猪疱疹病毒；和猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)，及其组合。
术语“DNA疫苗接种”或“多核苷酸疫苗接种”意指使用适宜医药组合物直接接种遗传物质。
灭活的各种物理及化学方法为业内已知。术语“灭活”是指先前有毒或无毒的病毒或细菌经辐照(紫外线(UV)、X射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理使该病毒或细菌灭活或杀死该病毒，同时保留其免疫原性。适宜失活剂包括β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-次乙亚胺、戊二醛、臭氧及福尔马林(formalin)(甲醛)。
对于通过福尔马林或甲醛灭活，通常将甲醛与水及甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇可防止灭活过程中的降解或交叉反应。一个实施方案使用约0.1％至1％的37％甲醛溶液来将病毒或细菌灭活。至关重要的是，调节福尔马林的量以确保材料灭活，但不会多至发生高剂量的副效应。
更具体而言，术语“灭活”在病毒的情况下意味着病毒在活体内或活体外无法复制，且分别地，术语“灭活”在细菌的情况下意味着细菌在活体内或活体外无法再生。举例而言，术语“灭活”可指已经在活体外繁殖且然后使用化学或物理方式将其灭活以使其不再能够复制的病毒。在另一实例中，术语“灭活”可指细菌已繁殖且然后使用化学或物理方式进行灭活，从而产生细菌、细菌的片段或组分的悬浮液(例如产生可用作疫苗组分的细菌)。
如本文所用，术语“灭活”、“杀死的”或“KV”可互换使用。
术语“活疫苗”是指包含活的生物体或可复制型病毒或病毒载体的疫苗。
“医药组合物”基本上由一或多种能够改变其所施用的生物体或生物体中或上面存活的生物体的生理学(例如免疫学)功能的成分组成。该术语包括(但不限于)抗生素或抗寄生虫剂以及通常用于实现某些其他目的(例如但不限于处理性状、无菌性、稳定性、经肠或非经肠途径(例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、皮内或其他适宜途径)施用组合物的可行性、施用后耐受性或受控释放性质)的其他成分。此一医药组合物的一个非限制性实例仅仅是用于展示目的给出，可如下所述来制备：将经感染细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(BSA))混合且随后将混合物通过其他方法进行冻干或去水。在疫苗接种之前，然后将混合物在水溶液(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、基于铝的佐剂)中再水化。
对于基于重组型病毒载体的疫苗，施用途径可有利地为SC、IM、TD或ID。此施用可通过带针注射器或利用无针仪器进行。本发明的实施方案可经口、经鼻骨间、经肛门、经阴道、经口、经胃内、非经肠、经皮下、经皮内、经肌内或经静脉内施用。本发明组合物的实例包括用于经孔施用(例如，经口、经鼻、经肛门、经引导、经口、经胃内等施用)的液体制剂，例如悬浮液、糖浆或酏剂；及用于非经肠、经皮下、经皮内、经肌内或经静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，例如无菌悬浮液或乳液。在所述组合物中，可将重组型CAdV2和/或抗原与适宜载剂、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖或诸如此类)混合。亦可将所述组合物冻干。所述组合物可含有辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、矫味剂、颜料及诸如此类，此端视施用途径及期望制剂而定。
在一个方面中，本发明涉及疫苗策略，该疫苗策略是基于“初免-加强”施用方案，其中初免-施用及加强-施用利用包含医药或兽医上可接受的赋形剂、稀释剂、佐剂或媒剂及本发明重组型CAdV的组合物。
初免-加强方案包含使用至少一种公用抗原和/或其变体或片段的至少一次初免施用及至少一次加强施用。初免施用中所用疫苗的性质与用作稍后加强疫苗的那些可能不同。应进一步注意初免施用及加强施用可包含本发明的重组型CAdV。初免施用可包含一或多次施用。类似地，加强施用可包含一或多次施用。
本发明的另一方面涉及用于根据本发明进行初免-加强疫苗接种的试剂盒。该试剂盒可包含至少两个小瓶：第一小瓶，其含有用于根据本发明进行初免疫苗接种的疫苗，及第二小瓶，其含有用于根据本发明进行加强疫苗接种的疫苗。该试剂盒可有利地含有其他用于进行其他初免疫苗接种或其他加强疫苗接种的第一或第二小瓶。
在一个实施方案中，该试剂盒可包含两个小瓶，一个含有用于根据本发明进行初免疫苗接种的基于质粒的疫苗，另一小瓶含有用于根据本发明进行加强疫苗接种的基于重组型病毒载体的疫苗。
如本文中所使用，“医药上或兽医上可接受的载剂”包括任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及诸如此类。在一些优选实施方案及尤其包括冻干的免疫原性组合物的那些中，用于本发明的稳定剂包含用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂素，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。具体而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(EuropeanPharmacopea)型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(具体而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更具体而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，具体而言异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子表面活性剂，特定而言是以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其任选经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory andPractical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley andSons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。实例性佐剂是由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press,1995的第147页上阐述的SPT乳液及同一本书第183页上阐述的乳液MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。所述化合物以术语卡波姆(carbomer)为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述与具有至少3个、优选地不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的所述丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团替代。优选基团是含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯是不饱和基团。不饱和基团可自身含有其他取代基，例如甲基。以名称(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品尤其适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选是使用971P。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，尤其是共聚物EMA(Monsanto)，其是马来酸酐与乙烯的共聚物。所述聚合物在水中的溶解产生酸性溶液，其将被中和、优选地中和至生理pH以产生将引入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
其他适宜佐剂包括(但不限于)尤其RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽或其天然或重组细胞介素或其类似物或内源细胞介素释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量、优选地以每剂量约100μg至约10mg的量、更优选地以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选地以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量及最优选地以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选为约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，仍更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“分离”意指自其天然状态由“人工”改变，亦即若其在自然界中存在，则其已经改变或自其初始环境中取出，或两者兼而有的。举例而言，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”，但自其天然状态的共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文所用的术语。
“减毒”意指降低病原体的毒性。在本发明中，“减毒”与“无毒”同义。在本发明中，减毒病毒是毒性已降低从而不会引起感染的临床体征但能够在目标哺乳动物中诱导免疫反应者，但亦可指与感染非减毒病毒或病原体且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比在感染减毒病毒、尤其所主张的CAdV病毒载体的动物中临床体征的发生率或严重程度有所降低。在此上下文中，术语“降低(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比降低至少10％、优选地25％、甚至更优选地50％、再更优选地60％、甚至更优选地70％、再更优选地80％、甚至更优选地90％且最优选地100％。因此，减毒的无毒病原体(例如所主张的减毒的病毒载体、尤其所主张的CAdV病毒载体)适于产生经修饰的活疫苗(MLV)或经修饰的活免疫原性组合物。
在本文中，“有效剂量”意指(但不限于)引起或能够引发免疫反应且使得施用抗原的动物减少临床症状的量。
如本文中所使用，术语“有效量”在组合物的情况中意指能够诱导免疫反应且降低或减轻动物中疾病的感染或事件的发生率或严重程度的免疫原性组合物的量。特别地，有效量是指每剂量的菌落形成单位(CFU)。或者，在疗法的情况中，术语“有效量”是指足以减轻或改善疾病或病症或其一或多种症状的严重程度或持续时间、防止疾病或病症进展、引起疾病或病症消退、防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作或进展，或增强或改良另一疗法或治疗剂的预防或治疗的量。
“免疫反应”或“免疫学反应”意指(但不限于)对所关注的(免疫原性)组合物或疫苗发生细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，免疫或免疫学反应包括(但不限于)以下效应中的一或多者：产生或活化特异性针对所关注组合物或疫苗中所包含的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫学(记忆)反应，从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低。该保护将通过症状数量的减少、症状严重程度的降低或无与病原体感染相关的一或多种症状、病毒血症发作的延迟、病毒持久性降低、整体病毒负荷降低和/或病毒排出降低来证明。因此，本发明亦提供一种在宿主脊椎动物中“诱导免疫学反应”的方法，该方法包含向宿主施用包含重组型CAdV病毒或载体及医药上可接受的载剂或稀释剂的免疫原性或疫苗组合物。
“抵抗疾病”、“保护性免疫性”、“功能免疫性”、“临床症状的减少”、“诱导免疫学反应”、“中和抗体的诱导/产生和/或血清转化”及类似片语意指抵抗抗原的抗体产生，和/或通过施用本发明的一或多种治疗性组合物或其组合而产生的针对疾病或病况的部分或完全反应，其导致较已暴露于疾病或感染的未经免疫个体所预计更不有害的效应。亦即，在接种疫苗的个体中，感染的有害效应的严重程度减轻。在接种疫苗的个体中，感染可经降低、减缓或可能完全预防。在本文中，若意指完全预防感染，则对其进行具体陈述。若未陈述完全预防，则该术语包括部分预防。
在本文中，“临床体征的发生率和/或严重程度的降低”或“临床症状的减少”意指(但不限于)与野生型感染相比，减少组中感染个体的数量、减少或消除展现感染的临床体征的个体的数量或降低一或多名个体中存在的任何临床体征的严重程度。举例而言，其应指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或疟疾的症状的任何临床体征减少。优选地，与未接受组合物且被感染的个体相比，接受本发明的治疗性组合物的一或多名个体的所述临床体征降低至少10％。更优选地，接受本发明组合物的个体的临床体征减少至少20％、优选地至少30％、更优选地至少40％且甚至更优选地至少50％。
术语“增加的保护”在本文中意指(但不限于)相对于未经疫苗接种的个体对照组，经疫苗接种的个体组的一或多种与由传染原感染有关的临床症状在统计学上显著减轻。术语“临床症状的统计学显著减轻”意指(但不限于)经疫苗接种的个体组的至少一种临床症状的发生频率较在攻击传染原后未经疫苗接种的对照组中低至少10％、优选地20％、更优选地30％、甚至更优选地50％且甚至更优选地70％。
“长效保护”应指持续至少3周、但更优选地至少3个月、再更优选地至少6个月的改良的效能。在牲畜的情形下，最优选地，长效保护应持续直至动物出售用于肉类的平均年龄。
术语由病毒诱导的“病毒血症的降低”意指(但不限于)进入动物血流的病毒的降低，其中与未接受本发明组合物且可变得感染的动物相比，在接受该组合物的动物的血清中病毒血症程度(亦即病毒DNA或RNA拷贝的数量/mL血清或形成群落的噬斑的数量/分升血清)降低至少50％。更优选地，接受本发明组合物的动物的病毒血症程度降低至少90％、优选地至少99.9％、更优选地至少99.99％且甚至更优选地至少99.999％。
如本文所用术语“病毒血症”具体地应理解为其中病毒颗粒在动物、具体而言哺乳动物、鸟或昆虫的血流中再生且循环的病况。
“安全性”是指在疫苗接种后，在经疫苗接种的动物中不存在不良后果，包括(但不限于)：基于细菌的疫苗潜在地逆转成有毒、临床上显著的副效应，例如持久性、全身性疾病或在疫苗施用位点不可接受的发炎。
本文所用的术语“疫苗接种(vaccination或vaccinating)”或其变化形式意指(但不限于)包括施用本发明的免疫原性组合物的过程，在施用至动物时，其引发或能够引发(直接或间接)该动物的免疫反应。
在本发明的上下文中，“死亡率”是指由感染引起的死亡，且包括感染如此严重以致于将动物安乐死以防止痛苦并为其生命提供人道结局的情况。
调配物
施用组合物的个体优选为动物，包括(但不限于)牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠及大鼠，最优选地哺乳动物是猪。
本发明的调配物包含有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。疫苗包含有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。调配物应适合施用方式。
免疫原性组合物(若需要)亦可含有极少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或粉剂。口服调配物可包括标准载剂，例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
优选施用途径包括(但不限于)鼻内、经口、皮内及肌内。期望在饮用水中、最优选以单一剂量施用。熟习此项技术者将认识到，本发明组合物亦可以一个、两个或更多个剂量通过其他施用途径来施用。举例而言，所述其他途径包括皮下、皮内、腹膜内、皮内，且根据治疗的期望持续时间及有效性，本发明组合物可以(例如)每日计一次或若干次、亦间歇地以不同剂量(例如约103至108TCID50(参见上述病毒效价))施用若干天、若干周或若干月。在本发明的特定方面中，剂量为约103至108TCID50，尤其对于活病毒/活疫苗而言。
若期望，所述组合物可存在于可含有一或多个含有活性成分的单位剂型的包装或分配器装置中。包装可包含(例如)金属或塑料箔，例如泡罩包。包装或分配器装置可伴以施用、优选施用至哺乳动物、尤其猪的说明书。与所述容器相关的可为呈由调控医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的通知，该通知反映该机构对针对人类施用的制造、使用或销售的批准。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分且包括在内以进一步展示本发明的某些方面。通过与本文所呈现特定实施方案的详细阐述组合参考所述图式中的一或多者可更好地了解本发明。
图1.CAdV2感染性克隆的生成示意图。(A)合成编码具有介入性独特限制位点的病毒基因组的5’及3’端的DNA片段并将其克隆至pBR322大肠杆菌(E.coli)穿梭载体中。将PmeI限制内核酸酶位点(箭头)在ITR的5’及3’末端改造至构建体中以有利于CAdV-2基因组自pBR322载体主链切除。(B)经由在BJ5183REC+大肠杆菌中同源重组将dsDNA CAdV-2基因组克隆至载体上。(C)成功的HR-重组rCAdV-2感染性克隆。ITR＝反向末端重复。
图2.CAdV-2的E3区的组织示意图。
图3.线性化感染性克隆DNA与靶向E3的CAdV-2转移片段之间的同源重组的示意性阐释。
图4.CAdV-2主链中的BIVI生成的E3-缺失(ΔE3A及ΔE3B)转移片段的示意图。
图5.BIVI生成的E3-缺失的示意图。A)具有剩余ORF1及2个DNA的总组合大小的E3ORF及每一者的量的示意图。B)指示留在ΔE3A及ΔE3B构形中的E3ORF1及ORF2DNA的总量的CAdV-2基因组的示意图。在“A”缺失(ΔE3A)中，除E3ORF1的前186个核苷酸及ORF2的后301个核苷酸以外的所有核苷酸皆缺失，而对于E3“B”缺失(ΔE3B)，保留了E3ORF1的186个核苷酸及ORF2的83个核苷酸。
图6.表达盒的E3缺失及插入
图7.启动子强度的分析是通过量化自表达构建体瞬时表达的CPV VP2表达(如在经转染MDCK细胞中通过IFA所检测)来实施。图A：显示经由CMVie或CMV5启动子驱动的CPVVP2表达质粒转染的MDCK细胞的CPV IFA。图B：经由如所指示的CMVie、CAG或CMV5启动子驱动的CPV VP2表达质粒转染的MDCK细胞的CPV VP2ELISA的直方图。图C：经由如所指示的CMVie或CMV5启动子驱动的CPV VP2表达质粒转染的CPV VP2阳性MDCK细胞的MolecularDevices ImageXpress MicroXL量化的直方图。
图8：CAV-2MCS-1-5主链中的CMVie EGFP SV40polyA表达盒的示意图。插入是在ΔE3B ORF2中，其中除E3ORF1的前186个核苷酸及ORF2的后82个核苷酸以外的所有核苷酸皆缺失。在EGFP基因之后为SV40polyA信号。ITR＝反向末端重复。
图9：CAV-2主链中的CMVie CPV VP2(n)SV40polyA表达盒的示意图。插入是在ΔE3B ORF2中，其中除E3ORF1的前186个核苷酸及ORF2的后82个核苷酸以外的所有核苷酸皆缺失。在VP2(n)基因之后为SV40poly A信号。
图10：自经感染细胞及上清液纯化的rCAV-2DNA的PCR分析。使用PCR来证实来自经分离病毒DNA的rCAV2ΔE3B/CMVie CPV VP2中CMVie CPV VP2(n)转基因表达盒的存在。图A，pCAV-2对照病毒；图B，1号克隆；图C，2号克隆。图D，利用CMVie CPV VP2(n)转移质粒的对照反应。M为1Kb+DNA条带。图E.转基因表达盒特异性PCR反应的预计结果。反应1及2利用特异性针对CAV-2H-A P VIII、U-外显子及CVP VP2的引物；反应3、4及5利用特异性针对CPVVP2的引物(参见图E)。反应7(针对CAdV-2的阳性反应)使用CAV-2特异性H-A P VIII及U-外显子引物。
图11.rCAV-2感染的MDCK细胞的流式细胞分析。图A至图F是存在于单一细胞中的信号的直方图。用携载BRSV F(co)(图B及图E)的rCAV-2对照病毒感染悬浮液MDCK细胞或用携载CPV VP2(co)(图C及图F)表达盒的rCAV-2感染，且在感染后72h经FITC偶联的抗CPVVP2(图A、图B及图C)或FITC偶联的抗CAV2(图D、图E及图F)抗体染色。图G是图A-F中所显示结果的概要及量化。
图12.CAdV-2主链中的CMVie BRSV F(co)BGH polyA表达盒的示意图。在BRSV F(co)基因之后为BGH poly A信号。
图13.CAdV-2主链中的CMVie RabGP BGH polyA表达盒的示意图。在RabGP基因之后为BGH poly A信号。
图14A-14C.rCAV-2RabGP P2病毒感染的E1B-MDCK细胞的CAdV-2特异性IFA。经感染E1B-MDCK细胞的CAdV-2IFA是在感染后60h的细胞上使用直接偶联至异硫氰酸荧光黄(FITC)的抗CAdV-2抗体及小鼠抗RabG单克隆抗体及FITC偶联的山羊抗小鼠抗体来实施。
图15：CAdV2CMVie CPV VP2感染的AI-ST 2015细胞的流式细胞分析：感染后72h
图16：利用新颖EHV-4启动子的rCAdV-2：经感染AI-ST 2015细胞的流式细胞分析：感染后48h
图17A-17B：利用新颖EHV-4启动子的rCAdV-2：经感染MDCK细胞中CPV VP2蛋白质表达的斑点印迹分析。1°＝1/50a-CPV-FITC mAb(VMRD)；2°＝1/1.000山羊抗小鼠IgG-过氧化酶(JIR)。(A)原始斑点印迹数据。(B)自斑点印迹生成的半定量数据：为进行量化，使用ImageJ软件(Burger,W.,Burge,M.J.(编辑),2008.Digital Image Processing:Analgorithmic introduction using Java.Springer-Verlag,New York)分析斑点印迹。反转影像色彩以扣除背景并记录每一斑点的积分密度。值是指配为+及–指定，如下所示：“++++”＝>800000，“+++”＝500000至800000，“++”＝300000至499999，“+”＝120000至299999，“+/-”＝80000至119999且“-”＝<80000。图18：经rCAdV-2p455RabG感染的细胞中的RabG检测：表达是在<1％的经原始rCAdV-2CMVie RabG感染的细胞中检测。
图18.由经rCAdV-2感染性克隆感染的AI-ST 2015细胞表达的RabG蛋白的流式细胞分析的概要。
图19A：经rCAdV-2p430及p455(分别表示为gG430及MCP455)RabG感染的细胞中的CPV VP2的检测。
FIG 19B：经rCAdV-2p455(表示为MCP455)RabG感染的细胞中的RabG的检测。
FIG 19C：经rCAdV-2p455(表示为MCP455)RabG感染的细胞中的CAdV-2及RabG二者的检测。
序列综述：
在本发明中特此详述并揭示以下序列：
表1：
实施例
本发明包括以下实例以展示本发明的优选实施方案。熟习此项技术者应了解，以下实例中所揭示的技术代表本发明者发现在实践本发明中运行良好的技术，且因此可认为构成本发明实践的优选模式。然而，熟习此项技术者借助于本揭示内容应了解，可对所揭示特定实施方案作出多种改变且仍获得相同或类似结果，此并不背离本发明的精神及范围。
实施例1：CAdV病毒分离
CAdV2病毒最初是自患有喉气管炎的狗的咽喉拭子分离且是在美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection；ATCC)MDCK细胞系CCL-34中作为第一次传代获得。在获取之后使病毒传代8次，且对第8次传代进行等分且将其指定为种原病毒原(MasterSeed Virus)。储备CAdV-2种原病毒是Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.以参考基准CAdV-2、MSV批号001-dil、F:11-24-98下产生。储备CAdV-2种原病毒与Toronto毒株(基因库登录号U77082.1)密切相关。CAdV-2是以犬疫苗自Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc.购得。
感染性克隆DNA是整个CAdV-2基因组，该基因组经克隆至pBR322低拷贝大肠杆菌穿梭载体中。采用同源重组方法(Kremer,E.J.等人，Canine adenovirus vectors:analternative for adenovirus-mediated gene transfer.J Virol,2000.74(1)：第505-12页)来构建感染性克隆DNA。自储备CAdV-2MLV纯化CAdV-2DNA并将其在BJ5183大肠杆菌中与含有与CAdV-2反向末端重复同源的DNA的基于pBR322的载体重组。
图1是代表完整感染性克隆DNA，马-达二氏犬肾(Madine Darby canine kidney；MDCK)细胞经以线性化感染性克隆DNA转染后可拯救CAdV-2。
实施例2：E3缺失的插入CADV克隆的生成
已成功地利用CAdV-2作为载体病毒疫苗用于动物。已知CAdV-2的E3结构域为非必需的(在组织培养物中病毒复制皆不需要E3开放阅读框(open reading frames；ORF)(Fisher等人2002))，且以插入异源DNA而言是为合理性的靶标。
其中转基因定位至E3结构域的基于CAdV-2的有效疫苗的实例包括犬瘟热病毒(Fisher等人2002)、猫泛白细胞减少症病毒(Yang等人2008)及猫(Hu等人，2007)、狗(Hu等人，2006)、小鼠(Li等人，2006)、浣熊、猪(Lui等人，2008)、臭鼬(Henderson等人，2009)及绵羊(Bouet-Cararo等人，2011)的狂犬病病毒。
图2是CAdV-2的E3区的组织的示意图。4146bp NruI(bp 23932)/SalI(bp 28078)限制内核酸酶片段是利用显示为H-A蛋白VIII、ORF 1、ORF2及U外显子的开放阅读框(ORF)来阐释。对于此DNA片段显示了选择性限制内核酸酶位点(NruI、DraIII、SspI及SalI)的位置且编号是相对于CAdV-2的密切相关的Toronto毒株(基因库登录号U77082.1)。
如Fischer等人(2002)所述，E3区的基因组组织在不同腺病毒之间仅宽松性地保守(Linne,T.,Differences in the E3regions of the canine adenovirus type 1andtype 2.Virus Res,1992.23(1-2):第119-33页)，且因此，CAdV2E3区非必需基因座的精确限制无法自其他病毒中的E3插入位点转位。在第一构建体中，来自E3的整个ORF 1及ORF2DNA区段经缺失以最大化转基因插入物的大小，然而感染性克隆DNA未能有利于rCAdV-2的拯救。发现此策略无意中缺失了延伸至5’E3侧翼DNA中的E3ORF 1(不同阅读框)中的六联体相关蛋白VIII基因(H-A-PVIII)的最后五个密码子(包括终止密码子)，从而产生具有实质3’延伸的H-A PVIII基因(产生具有5个氨基酸缺失但随后实质c末端添加的H-APVIII)。
因此，重新设计了转移质粒，使得5’及3’E3侧接DNA含有E3ORF1的前183bp及ORF2的后47bp，发现这些对于rCAdV-2拯救是足够的。
实施例3：用于生成RCADV-2感染性克隆DNA的同源重组
使用Rec+BJ5183大肠杆菌中在线性化CAdV-2感染性克隆DNA与靶向E3的CAdV-2转移质粒/片段之间的同源重组(基于文献中由Chartier等人(1996)及Kremer等人(2000)所阐述的方法)来生成具有定位至E3结构域的转基因表达盒的rCAdV-2。如图3中所阐释，在E3结构域中含有独特限制位点的感染性克隆与含有在转基因表达盒的5’及3’的约500bp的CAdV-2侧接DNA的转移片段重组，以a)将转基因表达盒靶向E3区且b)有效地缺失E3的所选部分。
自使用转基因特异性PCR筛选鉴别的经扩增BJ5183克隆分离DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳来解析所述DNA以证实其在23.1Kb下或>23.1Kb的迁移(成功HR产生约35kb的DNA物质，该DNA物质在0.7％琼脂糖凝胶上作为超螺旋DNA类似于23.1kb标记物迁移)。然后在Stbl2或XL-10Gold大肠杆菌中转化并扩增所述DNA用于更大规模的纯化及使用，以在哺乳动物细胞中生成rCAdV-2。
图3是NruI/SalI线性化感染性克隆DNA(天然CAdV-2序列)与涵盖上述E3缺失及位于E3的剩余部分间的一或多个独特限制位点(指定MCS用于多克隆位点)的靶向E3的CAdV-2转移片段之间的同源重组的示意性阐释。感染性克隆DNA分别与左侧及右侧反向末端重复LITR及RITR邻接。
实施例4：ΔE3rCAdV-2感染性克隆DNA的生成
E3缺失的rCAdV-2：ΔE3A及ΔE3B
使用重迭延伸PCR来生成编码所选E3缺失及5’及3’侧接序列的约500个碱基的靶向E3的CAdV-2转移片段，以有利于BJ5183大肠杆菌中的靶向同源重组(HR)(参见示意图图4及图5)。如图5A及B中所显示，在“A”缺失(ΔE3A)中，除E3ORF1的前186个核苷酸及ORF2的后301个核苷酸以外的所有核苷酸皆缺失，而对于E3“B”缺失(ΔE3B)，保留了E3ORF1的186个核苷酸及ORF2的83个核苷酸(对于5’及3’侧翼参见SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。
具有ΔE3A及ΔE3B缺失的感染性克隆自经转染MDCK及E1B-MDCK细胞成功地拯救，显示特定的E3缺失支持病毒拯救。由于ΔE3B构形涵盖较大E3缺失，故其成为生成向前移动的携载转基因表达盒的rCAdV-2的选择的设计。此较大缺失指示几乎所有的E3区(例如，约82％的E3区)皆可缺失而不会不利地影响病毒拯救。
实施例5：构建具有CMV启动子的E3缺失/插入表达盒的
HCMV-IE及CMV5启动子的生成：
通过如先前所阐述的PCR使用引物对hCMV-IE 5’F(SEQ.ID NO:5)(5'-TTATTAATAGTAATCAATTACGGGG-3')/hCMV-IE 3’R(SEQ.ID NO:6)(5'-GCCACCGTACACGCCTACCGCCC-3')及BAC DNA EHV-gG(10ng)(作为模板)来实施人类巨细胞病毒立即早期启动子(hCMV-IE)(SEQ ID NO:3)的3'末端的扩增。随后将所得DNA片段克隆至pCRTMBluntII载体(ThermoFisher Scientific)中并通过利用限制酶Kpn-1及BamH-1消化进行切除，并进一步克隆至基于pUC18的质粒穿梭载体中，用于进一步处理及构建CAdV转移质粒。使用分别具有5’-3’Spe-1及BamH-1限制位点的基因合成产物来合成人类CMV5启动子(SEQ ID NO:4)，并将其克隆至pUC57大肠杆菌穿梭载体中用于进一步处理及构建CAdV转移质粒。
CMVIE及CMV5启动子活性的比较：
文献中的报导已显示与CMVie启动子相比，来自由CMV5启动子驱动的哺乳动物转基因表达盒的蛋白质表达更加稳健。CMV5启动子与CMVie启动子的不同的处在于其在CMVie转录开始位点的下游含有编码具有由剪接供体及受体位点框入的腺病毒主要晚期增强子的5型人类腺病毒(HuAd5)腺病毒三联前导序列的约560bp DNA(Massie等人，1995,Improved adenovirus vector provides herpes simplex virus ribonucleotidereductase R1 and R2 subunits very efficiently.Nature Biotechnology 13:602-608)。CMV5启动子的使用显示显著增加293细胞中的蛋白质表达(Massie等人，1998,Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirus vector with atetracycline-regulatable expression cassette.Journal of Virology 72(3):2289-2296)。
与所述报导相同，通过瞬时转染含有CPV VP2的表达质粒自由CMVie或CMV5驱动的盒的蛋白质表达的直接比较，展示与CMVie启动子相比，自由CMV5驱动的哺乳动物转基因表达盒的蛋白质表达更加稳健。如图7中所显示，通过量化通过自表达构建体瞬时表达的CPVVP2表达(如在经转染MDCK细胞中通过IFA所检测)来实施启动子强度的分析。在图A中：显示经由CMVie或CMV5启动子驱动的CPV VP2表达质粒转染的MDCK细胞的CPV IFA。图B：是经由CMVie或CMV5启动子驱动的CPV VP2表达质粒转染的MDCK细胞的CPV VP2ELISA的直方图。图C：是经由如所指示的CMVie或CMV5启动子驱动的CPV VP2表达质粒转染的CPV VP2阳性MDCK细胞的Molecular Devices ImageXpress MicroXL量化的直方图。结果指示，CMV5启动子可指导转基因的稳健表达，且自CMV5的表达在光学密度IFA及FITC阳性MDCK细胞的相对数量二者方面大于CMVie启动子。因此，选择CMV5启动子来驱动CAdV-2表达盒的转录。然而，含有CMV5启动子的rCAdV-2感染性克隆皆未引起rCAdV-2的拯救。
如表2中所显示，尽管CMV5驱动VP2转基因的稳健瞬时表达，但含有CMV5启动子的rCAdV-2感染性克隆皆未引起rCAdV-2的拯救。
为直接解决CMV5启动子序列是否可干扰rCAdV-2拯救，将含有CMV5启动子、多克隆位点(MCS)及猿猴病毒40(SV40)多腺苷酸化(polyA)序列的DNA片段整合至CAdV-2基因组的E3区中。克隆至ΔE3B中的DNA的所有组分(DNA中将CMV5与CMVie区分开的约560bp(及MCS)除外)皆为先前拯救的rCAdV-2病毒的一部分。对拯救的尝试是不成功的，此强烈表明CMV5启动子干扰rCAdV-2的拯救。为支持此结论，设计交互实验，其中使用同源重组来用基于CMVie的“可拯救”表达盒替代此感染性克隆中的CMV5MCS SV40polyA区。
含有插入CAdV2基因组的ΔE3B区中的CMV-IE-EGF表达盒的rCAdV-2ΔE3B/CMVieEGFP的生成：
生成携载增强型绿色荧光蛋白(EGFP,Clontech)表达盒(2.6kb(SEQ ID NO.:7,CMVie EGFP))的rCAdV-2以有利于病毒拯救的评价并活体内评估所选细胞系及物种中的向性。简言之，使用靶向ΔE3B的CAdV-2CMVie EGFP转移片段(CMVie驱动的EGFP ORF，之后为侧接有在ORF1的位置183处结束(5’)且在CAdV-2E3ORF2的位置82处开始(3’)的约500bpCAdV-2DNA的SV40多腺苷酸化序列)进行同源重组以生成rCAdV-2ΔE3B/CMVie EGFP。通过检测约35kb的DNA物质来评估成功的HR事件。实施PCR群落筛选来鉴别含有转基因表达盒(正向P SEQ ID NO.:8；反向P SEQ ID NO.9)的克隆。通过琼脂糖凝胶电泳对阳性克隆进行可视化，其中阳性克隆具有对应于EFG转基因盒的约0.7kb PCR产物。另外，通过使用MiSeq测序仪、NextEr_XT库制备方法及NexGene软件(Softgenetic；版本2.3)及软件(Genecodes；版本5.1)进行序列分析来证实适当的转基因插入及序列。
rCAdV-2GFP的成功Pme-1消化产生两种物质：约32.7kb(rCAdV-2基因组)及约2.7kb(PBR322片段)。使用2000转染试剂(ThermoFisherScientific)达成MDCK及E1B-MDCK细胞的转染。自经转染的MDCK及E1B-MDCK细胞成功地拯救了rCAdV-2ΔE3B/CMVie EGFP感染性克隆，如在经转染细胞中通过经由荧光的GFP信号所指示。自经转染细胞上清液/溶解物收获病毒并使其经受三个接续冷冻-解冻周期(-70℃/37℃)，过滤灭菌，且然后在MDCK及E1B-MDCK二者上传代。然后经由荧光显微术针对感染依赖性EGFF信号观察到经感染细胞(未显示数据)。
将CMVIE EGFP SV40polyA转基因表达盒成功地克隆至CAdV2的ΔE3B结构域中。成功地拯救了重组型病毒，且通过感染后的荧光显微镜分析可检测到EGFP。
自携载CMV5启动子的rCAdV-2ΔE3B不可拯救的感染性克隆生成及拯救具有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的rCAdV-2ΔE3B：
为支持CMV5启动子抑制rCAdV-2拯救的结论(参见上文“使用CMV5启动子进行转基因表达”部分)，实施交互实验，其中使用同源重组来利用基于CMVie的“可拯救”表达盒替代MCS-1感染性克隆中的CMV5MCS SV40polyA区。简言之，使用上文的靶向E3的CAdV-2CMVieEGFP转基因转移片段进行同源重组，以自感染性克隆MCS-1-5(MCS-1-5含有CMV5启动子、小的多克隆位点(MCS)及SV40多腺苷酸化序列)生成ΔE3B rCAdV-2。经由电穿孔将经纯化的约2.6Kb的EGFP转移片段及源于MCS-1-5的线性化rCAV-2感染性克隆DNA共转化至BJ5183大肠杆菌细胞中，然后在具有50μg/mL卡本西林(Carbenicillin)的LB-琼脂板上选择所述大肠杆菌细胞。实施PCR群落筛选来鉴别含有转基因表达盒的克隆。成功的同源重组产生约35Kb的DNA物质，该DNA物质作为超螺旋DNA在0.7％琼脂糖凝胶上与23.1Kb的标记物DNA物质一起或较其稍快的运行。通过琼脂糖凝胶电泳对阳性克隆进行可视化(图4)，CAV-2MCS-1-5主链感染性克隆DNA中的CMVie EGFP SV40polyA表达盒的示意图阐释于图8中。
使用2000CD及3000将PmeI所消化的rCAV-2MCS-1-5EGFP病毒转染至MDCK细胞及E1B-MDCK细胞中。源于rCAdV-2MCS-1-5感染性克隆DNA的rCAdV-2ΔE3B/CMVie EGFP感染性克隆成功地有利于rCAdV-2自经转染E1B-MDCK细胞的拯救，如在经转染细胞中通过经由荧光的GFP信号所指示(未显示数据)。如在附录VI(背景)中所假设，携载源于CAdV-2MCS-1主链的EGFP表达盒的rCAdV-2的拯救进一步支持rCAdV-2拯救的抑制具有CMV5依赖性而且此是局限于CMV5中的560bp huAd5DNA序列的结论。
含有插入CAdV2基因组的ΔE3B区中的CMV-IE-VP2表达盒的rCAdV-2ΔE3B/CMVieCPV VP2(天然)的生成：
生成携载犬小病毒(CPV)VP2基因的rCAdV-2。简言之，与上文类似，使用含有CMVie驱动的CPV VP2ORF(SEQ ID NO.:10)的靶向ΔE3的CAdV-2转移片段进行同源重组来生成含有VP2表达盒的ΔE3B rCAdV-2(参见图9)。通过PCR筛选来检测含有成功转基因整合的克隆，其中通过琼脂糖凝胶电泳对1.7kb PCR产物进行可视化。通过使用MiSeq测序仪、NextEr_XT库制备方法及NexGene软件(Softgenetic；版本2.3)及软件(Genecodes；版本5.1)进行序列分析来证实适当的转基因插入及序列。
rCAdV-2GFP的成功Pme-1消化产生两种物质：约32.7kb(rCAdV-2基因组)及约2.7kb(PBR322片段)。自经转染MDCK及E1B-MDCK细胞成功地拯救了rCAdV-2ΔE3B/CMVieCPV VP2感染性克隆，如通过CAdV-2IFA所检测(未显示数据)。尽管经感染细胞中的CPV VP2蛋白质表达不成功，如通过针对VP2蛋白染色的免疫荧光抗体的缺乏所检测，但通过PCR在经纯化病毒基因组中检测到转基因表达盒的存在。
使用自经感染细胞及上清液纯化的rCAV-2DNA的PCR分析来证实rCAV2ΔE3B/CMVie CPV VP2克隆中CMVie CPV VP2(n)转基因表达盒的存在(图10)。图A，pCAV-2对照病毒；图B，1号克隆；图C，2号克隆。图D，与CMVie CPV VP2(n)转移质粒的对照反应。M为1Kb+DNA条带。图E.转基因表达盒特异性PCR反应的预计结果。反应1及2利用特异性针对CAV-2H-A P VIII、U-外显子(SEQ ID NO.:11,SEQ ID NO.:12)及CVP VP2(SEQ ID NO.:13,SEQ IDNO.:14)的引物；反应3、4及5利用特异性针对CPV VP2(参见图E)(SEQ ID NO.:15-20)的引物。反应7(针对CAdV-2的阳性反应)使用CAV-2特异性H-A P VIII及U-外显子引物(SEQ IDNO.:21,SEQ ID NO.:22)。
因此，尽管CMVIE CPV VP2(n)SV40polyA转基因表达盒成功地克隆至CAdV2的ΔE3B结构域中，成功地拯救了重组型病毒，且证实了VP2序列的存在，但未检测到VP2蛋白质表达。
含有插入CAdV2基因组的ΔE3B区中的CMV-IE-VP2表达盒的rCAdV-2ΔE3B/CMVieCPV VP2(密码子优化)的生成：
通过重迭延伸PCR生成靶向E3的CAdV-2CMVie CPV VP2密码子优化的(co)转基因转移片段(CMVie-驱动CPV VP2ORF(co)，之后为侧接有在ORF1(5’)的位置183处结束且在CAdV-2E3ORF2(3’)的位置82处开始的约500bp CAdV-2DNA的牛生长激素(BGH)多腺苷酸化序列)(SEQ.ID NO.:23)，并将其克隆至TOPO载体中用于存档及扩增。该构建体用于同源重组以生成ΔE3B rCAdV-2。
通过PCR筛选检测含有成功转基因整合的克隆，其中通过琼脂糖凝胶电泳对2.3kbPCR产物进行可视化。通过使用MiSeq测序仪、NextEr_XT库制备方法及NexGene软件(Softgenetic；版本2.3)及软件(Genecodes；版本5.1)进行序列分析来证实适当的转基因插入及序列。
自经转染的MDCK及E1B-MDCK细胞成功地拯救了rCAdV-2ΔE3B/CMVie CPV VP2(co)感染性克隆，如通过在P1感染的细胞上使用直接偶联至异硫氰酸荧光黄(FITC)的抗CAdV-2抗体实施的CAdV-2IFA所展示(未显示数据)。为证实拯救病毒编码CMVie CPV VP2(co)转基因表达盒，纯化P2病毒rCAdV-2及P5CAdV-2基因组。使用特异性针对CAdV-2基因组(六联体相关蛋白VIII(H-A P VIII)及U-外显子)的区的引物的提取DNA的PCR分析，采用CMVie启动子及CPV VP2(未显示数据)。PCR分析产生适当大小的PCR产物，指示经纯化P2病毒基因组编码CMVie CPV VP2(co)转基因表达盒。
采用使用抵抗CAdV2及CPV VP2的抗体的CMVie CPV VP2(co)rCAdV感染的细胞的流式细胞术分析来证实经感染MDCK细胞的表达。简言之，利用rCAdV-2及对照rCAdV-2以12孔格式感染悬浮液MDCK细胞并培育72h(37℃，5.0％CO2，以125rpm，在增湿培育器中)。然后收集细胞，用PBS洗涤，且然后使用CYTOFIX/CYTOPERMTM固定/渗透化试剂盒(BDBiosciences，目录号554714)，用CYTOFIXTM固定溶液处理，随后用CYTOPERMTM渗透化溶液洗涤两次。然后将细胞与FITC偶联的抗CAdV-2或抗CPV VP2抗体(分别为抗CAV2抗体：VMRD，目录号CJ-F-CAV-50X，及抗CPV VP2抗体：VMRD，目录号CJ-F-CPV 50X)一起培育，用CYTOPERMTM洗涤2次，并通过流式细胞术使用BD Biosciences FACSCANTOTM流式细胞术系统进行分析。
图11显示来自CMVie CPV VP2(co)rCAdV感染的MDCK细胞的流式细胞分析的结果。图A至图F是存在于单一细胞中的信号的直方图。用携载BRSV F(co)(图B及图E)的rCAdV-2对照病毒感染悬浮液MDCK细胞或用携载CPV VP2(co)(图C及图F)表达盒的rCAV-2感染，且在感染后72h用FITC偶联的抗CPV VP2(图A、图B及图C)或FITC偶联的抗CAV2(图D、图E及图F)抗体染色。图G是图11中所观察结果的概要及量化。用抗CAV-2染色的结果显示大多数rCAV2-BRSV F(co)感染或rCAV2-CPV VP2(co)感染的(图1，分别图E及图F)MDCK细胞表达CAdV2蛋白，而未感染细胞(图1，图D)对于CAdV-2为有效地负性。用抗CPV VP2抗体染色(图1，图A、图B及图C)显示仅rCAV2-CPV VP2感染的MDCK细胞(图C)表达CPV VP2蛋白，但在利用抗CPV VP2抗体的未感染细胞及rCAV2-BRSV F感染的细胞中观察到一些背景信号(分别图A及图B)。
因此，CMVie CPV VP2密码子优化的(co)转基因表达盒成功地克隆至CAdV2的ΔE3B结构域中。自经转染MDCK细胞拯救了重组型病毒，且在经纯化病毒基因组中检测到转基因表达盒。在经感染细胞中检测到CPV VP2mRNA(未显示数据)，且通过流式细胞分析证实了经感染细胞中CPV VP2的蛋白质表达，此与天然VP2表达盒相反。
具有插入CAdV2基因组的ΔE3B区中的密码子优化的牛呼吸道融合病毒融合蛋白质表达盒的rCAdV-2ΔE3B的生成：
简言之，使用含有CMVie驱动的CPV牛呼吸道融合病毒(BRSV)融合(F)蛋白ORF、之后侧接有在ORF1(5’)的位置183结束且在CAdV-2E3ORF2(3’)的位置82开始的约500bpCAdV-2DNA的BGH多腺苷酸化序列的靶向E3的CAdV-2转移片段进行同源重组以生成ΔE3BrCAdV-2.(SEQ ID NO.:27)。将BRSV F基因的天然(n)型式及密码子优化的(co)型式二者克隆至CAdV-2载体背景中，并成功地拯救了携载转基因的两种型式的病毒。然而，仅BRSV F(co)基因用于下游应用。
自MDCK细胞成功地拯救了rCAdV-2ΔE3B/CMVie BRSV F(CO)感染性克隆，如通过经病毒上清液/细胞溶解物感染的细胞的CPE所指示。在经纯化病毒基因组中检测到转基因表达盒的存在。自P3rCAV2-BRSV F(co)病毒提取DNA且使用其作为模板进行PCR分析，以检测病毒基因组中BRSV F(co)基因的存在。对转基因进行测序以证实基因序列。
通过流式细胞分析证实经感染细胞中BRSV F的表达(参见图11)。
具有插入CAdV2基因组的ΔE3B区中的狂犬病病毒糖蛋白(n)表达盒的rCAdV-2ΔE3B的生成：
简言之，使用含有CMVie驱动的巴氏毒株狂犬病病毒糖蛋白(Pasteur StrainRabies glycoprotein)(RabGP)ORF、之后侧接有在ORF1(5’)的位置183结束且在CAdV-2E3ORF2(3’)的位置82开始的约500bp CAdV-2DNA的BGH多腺苷酸化序列的靶向E3的CAdV-2转移片段进行同源重组以生成ΔE3B rCAdV-2.(SEQ ID NO.:25)(参见图13)。自基于浣熊痘的狂犬病疫苗(rRCNV-狂犬病G2疫苗，批号D015-054-)来PCR扩增天然巴氏狂犬病G基因。经扩增RabGP DNA的预计大小为约1.6Kb。
然后将RabGP片段连接至pUC18-B-Bf1b-CO片段中并将其转化至TOP10大肠杆菌中。使用RabGP特异性引物实施针对RabGP DNA的PCR群落筛选(未显示数据)。
用PmeI消化DNA以释放转移片段(约3.45Kb)且用ScaI切割载体主链以有利于转移片段的鉴别。经由电穿孔将经纯化的约3.45Kb PmeI CMVie RabGP(n)转基因(表达盒)转移片段及线性化rCAV-2感染性克隆DNA共转化至BJ5183大肠杆菌细胞中，然后在具有50μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin)的LB-琼脂板上选择所述大肠杆菌细胞。实施PCR群落筛选以鉴别含有转基因表达盒的克隆且通过琼脂糖凝胶电泳进行可视化(未显示数据)。
使用2000CD将PmeI消化的HR克隆DNA转染至E1B-MDCK细胞中。自经转染E1B-MDCK细胞成功地拯救了rCAdV-2ΔE3B/CMVie RabGP感染性克隆，如通过图14中所显示的CAdV-2IFA所指示，通过抗RabG及CAdV-2免疫荧光二者，使用直接偶联至异硫氰酸荧光黄(FITC)的抗CAdV-2抗体的rCAV-2RabGP P2病毒感染的EIB-MDCK细胞的CAdV-2IFA证实了rCAdV-2拯救(图B及图C，感染后48小时及72小时)。
如在图14、图B及图C中通过荧光(CAV-2+及RabG+)细胞所指示，经rCAV-2RabGP E2及E3病毒感染的E1B-MDCK细胞表达狂犬病G。然而，RabG+细胞数似乎显著小于CAdV-2+细胞。
表2.BIVI生成的rCAdV-2感染性克隆的概要.
N/A＝不适用。
NT＝未测试。
*＝仅用转染所观察到的表达
如表2中所概述，已自经转染MDCK或E1B-MDCK细胞生成许多不会有利于rCAdV-2的拯救的基于ΔE3B的感染性克隆。这些包括CPV VP2及含有由CMV5启动子驱动的转基因表达盒的狂犬病G，含有狂犬病病毒糖蛋白G且其中核苷酸序列经密码子优化的克隆(与SAD P5/88毒株具有76％相同性)，及含有hMGFP(绿色)(Promega)及MCherry(红色)(Clontech)荧光蛋白报导基因构建体的克隆(未显示数据)。
如在相当大小的插入物之间比较的此可变性不仅仅反映密码子优化，乃因天然序列及密码子优化的序列二者有利于携载BRSV F及CPV VP2的rCAdV-2的拯救(参见上文表2)。实际上，携载天然hMGFP及MCherry ORF的rCAdV-2感染性克隆亦不有利于rCAdV-2拯救(未显示数据)。综上所述，这些数据表明在CAdV-2载体平台的情况下使用CMV启动子是不可预知的，且启动子的选择是表达盒构建的重要考虑因素，乃因其可能显著地影响rCAdV-2克隆的拯救。
实施例6：具有EHV4启动子的表达盒
新颖马衍生启动子的鉴别及构建：
鉴别并分离来自4型马疱疹病毒(EHV4)的新颖异源马启动子。两种启动子为人所关注；(1)在ORF70处的编码糖蛋白G(gG)的600bp的EHV-4gG启动子(4pgG600)(SEQ ID NO.:29)；及(2)在ORF42处的编码主要衣壳蛋白(MCP)的600个碱基对的EHV-4MCP启动子(4pMCP600)(SEQ ID NO.:30)。糖蛋白G基因(orf70)在复制周期中的早期及晚期时间期间具有活性(Colle等人1995，Drummer等人1998)。主要衣壳蛋白是病毒颗粒最丰富的组分之一，且为新合成的病毒DNA准备好进行包装之后立即在细胞核中组装衣壳所需。因此，其启动子预计在病毒复制周期的早期及晚期期间具有活性。由于对CAdV主链的大小限制较敏感，故将EHV-4启动子序列截短至其原始长度的约75％。具体而言，将600bp 4pgG600启动子截短至430bp以生成启动子片段p430(SEQ ID NO.:31)，并将600bp 4pMCP600启动子截短至455bp以生成启动子片段p455(SEQ ID NO.:32)。
rCAdV-2疫苗病毒感染的细胞生成病毒样颗粒(VLP)可为犬腺病毒(CAdV-2)疫苗效能的关键因素。尽管如上文所详述可拯救含有CMVie驱动的CPV VP2表达盒的rCAdV-2，但使用习用CMVie启动子无法达成rCAdV-2CMVie CPV VP2感染的细胞中的实质VP2表达(用于VLP生成)。另外，无法拯救含有CMV5启动子的rCAdV-2VP2病毒。因此，感兴趣的是使用能驱动所关注抗原的稳健、稳定、可再现表达且具有上文所鉴别特征的新颖启动子。
含有EHV-4 P CPV VP2(co)的CAdV-2转移质粒的BamHI的生成：KpnI/EHV-4 P DNA的生成：
分别使用以下寡核苷酸对梯度PCR扩增EHV-4启动子片段gG430及MCP455：
gG430F：TTTAAAGGTACCTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACC(SEQ ID NO.:33)；
gG430R：AAATTTGGATCCAACTGCAGCTTATCACAGCTTTACAGGTGG(SEQ ID NO.:34)
MCP455F：TTTAAAGGTACCACTGGTGGTAGCATATACTACCTTTATTTATACGC(SEQ ID NO.:35)；
MCP455R：AAATTTGGATCCGATCCTATGGTAGCGGTAAAACACCG(SEQ ID NO.:36)。
预计所扩增gG430及MCP455DNA的大小分别为454bp及479bp。
通过用CMVie启动子基于BamHI/KpnI的交换为EHV-4启动子，使用用于ΔE3B处的成功整合及rCAV-2的拯救的先前制备的CAdV-2转移质粒(如上文所详述)作为含有EHV-4启动子的CPV VP2转移质粒的基础。
使用两种不同的密码子优化的CPV VP2序列(指定为“去剪接”(SEQ ID NO.:37)及“Gen0.95”(SEQ ID NO.:38))来制备含有由CMVie驱动的表达盒的CAdV-2转移质粒。Gen0.95是使用Codon Adaptation Index(CAI)0.95自Genscript获得的密码子优化的CPVVP2序列。用剪接位点查找算法(2013/2014人类剪接查找器-由Ghadi设计；InsermUMR_S910-Aix Marseille Université,27Boulevard Jean Moulin,13385MarseilleCedex 05)对Gen0.95的分析表明存在43个潜在剪接供体位点。制备89个核苷酸变化(5.07％序列变化，相对于Gen0.95)以消除40个基于犬物种不改变氨基酸序列或生成最不有利密码子的剪接供体位点。
经由电穿孔将含有两个上文VP2序列的经纯化的约3.5Kb PmeI EHV-4P CPV VP2(co)转移片段及线性化rCAV-2感染性克隆DNA共转化至BJ5183大肠杆菌细胞中用于同源重组。在具有50μg/mL氨苄青霉素的LB-琼脂板上选择完整克隆。通过PCR筛选、选择及扩增来鉴别具有适当整合大小及定向的克隆。
pCAV-2感染性克隆的成功PmeI消化产生约33.5Kb(pCAV-2基因组)及约2.7(pBR322片段)Kb的DNA物质。使用3000将PmeI消化的感染性克隆转染至E1B-MDCK及MDCK细胞中。自经转染的细胞上清液/溶解物收获第1代(P1)至第7代(P7)病毒(命名为pCAV2ΔE3B/pgG430-VP2(去剪接)(SEQ ID NO.:39)、pCAV2ΔE3B/gG430-VP2(Gen 0.95)(SEQ ID NO.:40)或pCAV2ΔE3B/p455-VP2(Gen0.95)(SEQ ID NO.:41))，使其经受三个接续冷冻-解冻周期(-70℃/37℃)，过滤灭菌，且然后在E1B-MDCK细胞上传代。
用所选rCAdV-2感染AI-ST细胞进行针对CAdV-2及CPV VP2蛋白质表达的免疫荧光分析(IFA)。在感染后72h，用CYTOFIX/CYTOPERMTM固定/渗透化试剂盒(BD Biosciences，目录号554714)固定细胞，用CYTOFIXTM固定溶液处理，之后用CYTOPERMTM渗透化溶液洗涤两次。然后用FITC偶联的抗CAdV-2或抗CPV VP2抗体(分别为抗CAdV2抗体(mAb)：VMRD，目录号CJ-F-CAV-50X，及抗CPV VP2抗体：VMRD，目录号CJ-F-CPV 50X)培育细胞，用CYTOPERMTM洗涤2次并通过流式细胞术使用BD Biosciences FACSCANTOTM流式细胞术系统进行分析。
通过IFA容易可视化CAdV-2及CPV VP2蛋白，且在相当大一部分经携载CPV VP2的两种不同核苷酸变体的rCAdV-2感染的AI-ST 2015细胞中通过FC进行检测(Despl及Gen0.95，在感染后48h及72h)。在组织培养上清液/溶解物(在冷冻/解冻后)中通过斑点印迹鉴别实质CPV VP2蛋白(且极可能反映经组装VLP的存在)。
图19中的结果显示通过经感染AI-ST细胞的IFA(而非在经编码非相关BRSV转基因的rCAdV-2感染的细胞中)容易可视化CAV-2及CPV VP2蛋白，从而指示自由gG430及MCP455EHV-4启动子驱动的去剪接序列变体及Gen0.95CPV VP2(co)序列变体的稳健CPVVP2表达(参见图19A)。在小于3％的经原始rCAdV-2CMVie CPV VP2感染的细胞中检测到CPVVP2表达(参见图15)，从而指示可成功地拯救携载由新颖EHV4衍生启动子p430及p455驱动的CPV VP2表达盒的rCAdV-2。令人惊讶的是，如与病毒拯救不成功的在ΔE3B位置利用CMV5启动子序列的CAdV载体相比，在14％至36％的经感染细胞中检测到由gG430及MCP455EHV-4启动子驱动的CPV VP2表达(参见图16)。
实施斑点印迹分析以分析经感染细胞中的转基因表达。简言之，用PBS连续稀释来自经感染AI ST(对于rEHV-1)及E1B MDCK(对于rCAdV-2)细胞的经澄清(6000×g,5min)组织培养上清液/溶解物(冷冻/解冻)，之后将其添加至仪器中，并经由吸入将其吸附至PVDF。后续步骤为30分钟暴露于存于TBST中5.0％BioRad印渍级封阻剂，1.0h暴露于1°抗体，用TBST洗涤三次，及1.0h暴露于过氧化酶偶联的2°抗体(抗小鼠及抗猪，JacksonImmunoResearch)，及经由TMB可视化。为进行量化，使用ImageJ软件(Burger,W.,Burge,M.J.(编辑),2008.Digital Image Processing:An algorithmic introduction usingJava.Springer-Verlag,New York)分析斑点印迹。反转影像色彩以扣除背景且记录每一斑点的积分密度。值是指配为+及–指定，如下所示：“++++”＝>800000，“+++”＝500000至800000，“++”＝300000至499999，“+”＝120000至299999，“+/-”＝80000至119999且“-”＝<80000。
如在图17中看出，在来自由编码CPV VP2的EHV-4启动子驱动的表达盒的rCAdV-2感染的细胞的组织培养上清液/溶解物中观察到强CPV VP2蛋白信号，而在来自经编码非相关表达盒的rCAdV-2感染的细胞的试样中未检测到信号。这些结果显示在组织培养上清液中鉴别出实质CPV VP2蛋白。这些结果极可能反映经组装CPV VP2VLP的存在。此与原始rCAdV-2CMVie CPV VP2是相反的，在原始rCAdV-2CMVie CPV VP2中斑点印迹分析显示CMVie驱动的CPV VP2信号处于背景位准或低于背景位准且与来自阴性对照的上清液/溶解物(CAdV-2、rCAdV-2CMVie BRSV F感染的细胞及来自未感染细胞的细胞培养上清液/溶解物)相当。
如在图17中所显示，在上清液中可识别出VP2蛋白，且因此，预计其呈免疫原性所需要的构形。重要的是，如上文所论述，在转基因由CMV5启动子序列所驱动的克隆中未达成重组型CAdV-2的拯救。因此，本发明的新颖EHV-4衍生启动子序列(例如p430及p455)不仅有利于转基因表达，且亦支持病毒拯救的关键步骤。
含有EHV-4启动子CPV RabG(n)的CAdV-2转移质粒的生成：
使用本发明的新颖EHV-4衍生的p455启动子生成第二CAdV-2构建体。由于使用习用CMVie启动子未观察到经感染细胞的表达，故选择了rCAdV-2RabG(n)。
此实验的目的是通过量测rCAdV-2p455RabG(n)感染的AI-ST 2015细胞中EHV-4启动子驱动的RabG蛋白质表达来证实新颖EHV-4启动子在具有第二转基因RabG(膜蛋白)的rCAdV-2的情况下的活性。
如上文所论述自经拯救rCAV-2CMVie RabG(n)(SEQ ID NO.:25)分离RabG(n)序列。利用BamHI及SalI(分别5’及3’)限制内核酸酶切除包括在紧邻ATG START密码子5’的Kozak序列的1596bp RabG(n)序列，并将其连接至具有gG430启动子及MCP455启动子的BamHI/SalI切割的rCAdV转移片段中，然后将所述转移片段转化至TOP10大肠杆菌中。
经由电穿孔将经纯化的约3.3Kb PmeI EHV-4P RabG(n)转移片段及线性化rCAV-2感染性克隆DNA共转化至BJ5183大肠杆菌细胞中用于同源重组。在具有50μg/mL卡本西林的LB-琼脂板上选择完整克隆。实施PCR群落筛选以鉴别EHV-4pG430/RabG(n)(SEQ ID NO.:42)及EHV-4p455/RabG(n)(SEQ ID NO.:43)克隆。利用特异性针对RabG DNA的引物筛选克隆且经由琼脂糖凝胶电泳进行可视化。预计DNA为1501bp。
使用3000将PmeI消化的感染性克隆转染至E1B-MDCK及MDCK细胞中。自经转染的细胞上清液/溶解物收获第1至7代(P1-P7)病毒(命名为pCAV2ΔEB3/gG430或MCP455RabG(n))，使其经受三个接续冷冻-解冻周期(-70℃/37℃)，过滤灭菌，且然后在E1B-MDCK细胞上传代。
使用IFA及流式细胞术来评价rCAdV-2感染的AI-ST 2015细胞中EHV-4启动子驱动的RabG的表达。用抗CAdV-2FITC偶联的猪多克隆抗体(VMRD)探测CAdV-2蛋白表达。用小鼠单克隆抗体(Novus)探测RabG蛋白表达。通过IFA容易可视化CAdV-2及RabG蛋白且在经携载RabG(n)的rCAdV-2感染的AI-ST2015细胞中通过FC进行检测(在感染后72h)。
图18中的结果指示，通过流式细胞分析在由所选rCAdV-2及rEHV-1感染的AI-ST2015细胞中容易检测到CAV-2及RabG蛋白。这些结果展示由MCP455EHV-4启动子驱动的RabG的实质表达。相反，尽管在经rCAdV-2p455RabG感染的细胞中容易检测到RabG(参见图19B及C)，但在<2.0％的经原始rCAdV-2CMVie RabG感染的细胞中检测到表达(参见图18)。
总的，gG430及MCP455RabG(n)SV40polyA转基因表达盒成功地克隆至CAdV-2的ΔE3B结构域中。自经转染E1B-MDCK细胞拯救了重组型病毒，如在病毒感染的细胞中通过CPE所指示。通过IFA及流式细胞术证实了经感染的AI-ST 2015及BIVI 2011MDCK细胞中通过rCAdV-2的RabG转基因的MCP455启动子驱动的表达。
实施例7：包含rCAdV-CMV/CPV VP2的医药组合物(疫苗)的制备：
犬小病毒(CPV)是高度感染性病毒，其可端视毒力、宿主及环境因素而造成高发病率及死亡率。在过去30年里，针对狗使用利用MLV及杀死的病毒疫苗的有效疫苗程序已大大降低了死亡率。CPV是具有形成衣壳的两种结构蛋白(VP1及VP2)的非包膜单链DNA病毒。已知VP2与病毒病原性及宿主免疫反应相关，且因此为用于在重组型CAdV2系统中纳入及表达的选择靶标。
此研究的目标是与MLV组合疫苗相比，对实验rCAV2-CPV VP2疫苗的效能实施初步评估。MLV组合含有2型犬腺病毒(CAV2)、犬瘟热病毒(CDV)及犬小病毒(CPV)，所述病毒是以在所确立最小免疫剂量与如在目前产物中针对每一特定抗原确立的每一部分的释放剂量之间的量进行掺和。
在此研究中，将rCAV2-CPV VP2以两个相隔3周的剂量的方案施用6至7周龄仔犬，以便确定CAdV-CPV VP2载体疫苗是否提供抵抗CPV攻击的保护。目前，由于MLV疫苗是针对CPV及ICH加以保护的黄金标准，故将测试组与施用含有CPV、CDV及CAdV2的MLV疫苗combo的两个剂量(相隔3周)的方案的6-7周龄仔犬组进行比较。此组视为阳性对照组。第三组是施用PBS的两个剂量(相隔3周)的方案作为攻击对照。在第二次疫苗接种后约3周用CPV-2b攻击狗以便评估效能。
将测试疫苗以在2个剂量(相隔3周)的方案中给出的1ml皮下剂量施用十二(12)只6周2天至7周2天龄的健康CAV2-血清阴性及CPV-血清阴性犬。将该十二(12)只动物分成2个测试组，如下所示：第1组–rCAV2-CPV VP2，以8.0log/ml；第2组–MLV组合(CAV2,CDV,CPV)。
将磷酸盐缓冲盐水(PBS)以在2个相隔3周的剂量的方案中给出的1ml皮下剂量施用六(6)只6周2天至7周2天龄的健康CAV2血清阴性及CPV血清阴性犬的组。认为此组为第3组，且其用作该研究的攻击对照。在22DPV2用强毒CPV-2b经口鼻攻击第1组至第3组中的所有动物。分析攻击后的临床病例数据(临床体征、发烧、淋巴细胞减少症、白细胞减少症及粪便中CPV的检测)。
疫苗调配：
用0.01M PBS将rCAV2-CPV VP2组织培养储备液稀释至下文所阐述的目标剂量。未使用佐剂。调配MLV阳性对照并用SGGK稳定剂冻干，其中combo中的每一抗原高于产品线的最小免疫剂量。疫苗的目标剂量如下所示：
表3：
攻击材料：
在攻击当天，通过在36±2℃水浴中手动搅动小瓶使经冷冻CPV-2b攻击材料的三个小瓶快速解冻。然后在细胞培养基中将该材料1:10稀释至期望浓度。在制备及攻击程序期间的所有时间，攻击接种物皆保持在冰上。
疫苗抗原滴定：CAV2-CPV VP2
简言之，制备疫苗的10倍连续稀释液。在以2.0×105个细胞/ml种植有马丁-达比犬肾(Madin-Darby Canine Kidney，MDCK)细胞的96孔板中，将每一稀释液以100微升/孔添加至5个孔中的每一者中。每一疫苗实施5个重复。将所述板在36±1℃及5±0.5％CO2下培育4±1天。在培育时段之后，固定所述板，仅针对载体进行染色并读取。使用里德及明奇法(Reed and Muench method)计算50％终点的效价。
阳性对照(CPV-CDV-CAdV2)
简言之，制备疫苗的10倍连续稀释液。在种植有适当浓度细胞(CPV–MDCK，以2×105个细胞/ml，CDV–VERO，以2×105个细胞/ml，CAV2–MDCK，以2×105个细胞/ml)的96孔板中，将每一稀释液以100微升/孔添加至5个孔中的每一者中。每一抗原部分实施5个重复。将所述板在36±1℃及5±0.5％CO2下培育3-6天。在培育时段之后，固定所述板，用直接FA偶联物进行染色，并读取。使用里德及明奇法计算50％终点的效价。
血清
在0DPV1开始，每周自每只狗收集至多10mL全血用于血清。特定时间点包括以下：0DPV1、7DPV1、14DPV1、21DPV1/0DPV2、7DPV2及14DPV2。使血液凝结，以1,000-1,300×g进行离心以分离血清并将其分配成至少2个等份试样。将血清储存在-20℃或更冷下直至评估抗体效价为止。
使用血清中和(SN)分析实施血清学分析。使用SN分析来量测针对CAV2、CPV-2b及CPV-2c的血清抗体效价。
简言之，对于CAdV2血清学，将热灭活血清的连续稀释液与等体积的病毒悬浮液(50至300FAID50)混合。将血清病毒混合物在36±1℃下培育1小时。然后用MDCK细胞(2×105个细胞/ml，以0.1ml/孔)对96孔微量滴定板进行接种。将板在增湿的5+0.5％CO2培育器中在36±1℃下培育5±1天。用冷丙酮将板固定15±5分钟并通过特异性免疫荧光检测病毒。通过免疫荧光未检测到病毒指示SN抗体的存在。为测定SN抗体效价，使用里德及明奇法计算50％中和终点。
表4–CAV2SN GMT值
简言之，对于CPV-2b血清学，将热灭活血清的连续稀释液与等体积的病毒悬浮液(50至300FAID50)混合。将血清病毒混合物在36±1℃下培育1小时。然后将狗肾(DKFD-00)细胞(2.5×105个细胞/ml，以0.1ml/孔)添加至96孔微量滴定板的所有孔中。将板在增湿的5±0.5％CO2培育器中在36±1℃下培育6±1天。用冷丙酮将板固定15±5分钟并通过特异性免疫荧光检测病毒。通过免疫荧光未检测到病毒指示SN抗体的存在。为测定SN抗体效价，使用里德及明奇法计算50％中和终点。
表5–CPV-2b SN GMT值
简言之，对于CPV-2c血清学，将热灭活血清的连续稀释液与等体积的病毒悬浮液(50至300FAID50)混合。将血清-病毒混合物在36±1℃下培育1小时。然后用MDCK细胞(7×104个细胞/ml，以0.1ml/孔)对96孔微量滴定板进行接种。将板在增湿的5+0.5％CO2培育器中在36±1℃下培育5±1天。用冷丙酮将板固定15±5分钟并通过特异性免疫荧光检测病毒。通过免疫荧光未检测到病毒指示SN抗体的存在。为测定SN抗体效价，使用里德及明奇法计算50％中和终点。
表6–CPV-2c SN GMT值
当针对CAdV2、CPV-2b及CPV-2c抗体彼此相比时，关于3个组注意到不同的抗体反应。
与MLV组相比，CAdV2-CPV VP2组在7DPV1展现远远更强的CAdV2抗体反应，然而，截止至14DPV1，各组的GMT值是类似的。截止至21DPV1，两个组的抗体效价减弱，此时对动物进行加强。在加强之后，两个组的抗体含量激增且然后逐渐趋平，其中CAdV2-CPV VP2组以较MLV组更高的效价趋平。在整个研究过程中，阴性对照组针对CAdV2抗体保持阴性。
与2个疫苗接种组的CAdV2抗体反应相反，CAdV2-CPV VP2组的CPV抗体反应在第二次疫苗接种前是极小的，在该第二次疫苗接种时CPV抗体效价在7DPV2激增且然后趋平直至用CPV攻击为止。在攻击CAdV2-CPV VP2组之后，抗体反应再次激增。MLV疫苗对第一次疫苗接种有充分反应，且另外对第二次疫苗接种有反应。在第二次疫苗接种后MLV组中的CPV抗体含量趋平且在研究的攻击阶段期间未显示显著增加。阴性对照动物在整个疫苗接种阶段中对CPV抗体保持阴性，直至在攻击时间后第一次出血为止，在该第一次出血时所述阴性对照动物展现显著CPV抗体效价。
临床观察：
观察所有动物且在-2DPC、-1DPC及0DPC每日量取直肠温度用于基线，精确至0.1度(华氏温度(Fahrenheit))。在攻击后，每日监测动物长达14天，其中获取直肠温度及临床体征的观察。动物笼未经清洁，直至在完成观察的那一天为止。
CPV的临床体征包括(但不限于)以下：(1)带血粪便–含有至少10％血液的特定粪便，通常与腹泻和/或粘液相关；粪便通常为深红色且具有独特的强烈铁味；(2)粘液样粪便–含有至少10％粘液的特定粪便可与腹泻相关，且可或可不含血液。粘液样粪便可或可不具有质地和/或形式；(3)腹泻–水样、无质地，扁平糊状；(4)若直肠温度≥103.4°F且高于基线温度至少1华氏度，则指示发热。若温度为99.5°F或更低且低于基线温度至少1华氏度，则指示体温过低。
在0DPC、7DPC及14DPC将所有狗称重(精确至0.1公斤(kg))，用于测定攻击后的重量损失/增加。在体重记录上收集所有重量。
对于临床体征，单次出现CPV感染的任何典型临床体征(包括在攻击后的腹泻、粪便中的粘液或粪便中的血液)定义动物为临床体征阳性。亦注意到厌食、抑郁症/嗜睡及存在呕吐可用作用于评价动物为小病毒感染阳性的支持性准则。
在此研究中在2DPC，18只动物中的四(4)只展现腹泻或呕吐。所述临床表达在3至4DPC的典型CPV发作范围之外且可能是由攻击期间所使用的禁食和/或麻醉程序引起。其不被视为CPV感染的体征。
rCAdV2-CPV VP2组(第1组)显示在10DPC之前无感染体征，其中6只动物中的1只展现带血、粘液性粪便达1天。应注意，该组中的1只动物在2DPC显示呕吐体征，如先前所述此在CPV发作范围之外，且因此不被视为感染的体征。
在MLV组(第2组)中，6只动物中的2只在5及7DPC展现临床体征，其中注意到12号狗在7DPC具有粘液性粪便且13号狗在5及7DPC具有腹泻。亦应注意到此组中的3只动物在2DPC显示呕吐或腹泻的体征，如先前所陈述此在CPV发作范围之外，且因此不被视为感染的体征。
阴性对照组(第3组)中的所有狗在4DPC开始皆展现一系列中度至严重临床体征(腹泻、粘液样粪便、脱水、呕吐、厌食、带血粪便)且推断出在11DPC有4只动物死于CPV(3只在7DPC且1只在8DPC)。
发烧：对于发烧，在攻击后单次出现发烧(直肠温度≥103.4°F且高于攻击前基线至少1度)将动物归类为阳性。
rCAdV2-CPV VP2测试组(第1组)的6只动物中的3只展现1次发烧；1只在9DPC及2只在12DPC。MLV组(第2组)中的6只动物皆未展现发烧。在阴性对照组(第3组)中，6只动物中的3只在4DPC至5DPC的范围内显示至少1次发烧(1只动物显示2次)。6只动物中的2只在7DPC展现体温过低。
重量：为测定重量损失/增加，以每周为基础，通过扣除先前周的重量来评价每一个别动物的重量。
rCAdV2-CPV VP2测试组(第1组)及MLV测试组(第2组)中的动物在7或14DPC皆未展现重量损失。阴性对照组(第3组)中的所有动物在7DPC皆展现在0.1公斤至0.8公斤范围内的重量损失。第3组中在14DPC继续测试的动物经历自7DPC的增重。
淋巴细胞减少症：对于淋巴细胞减少症，在攻击后单次出现淋巴细胞减少症(攻击前基线的≥50％损失)将犬归类为阳性。在此研究中，rCAdV2-CPV VP2测试组(第1组)包括6只动物中的3只具有至少1次淋巴细胞减少症，在9DPC至12DPC的范围内发作。MLV组(第2组)未展现淋巴细胞减少症的体征。阴性对照组(第3组)中的所有动物皆具有至少1次淋巴细胞减少症，其中在4DPC发作。
白细胞减少症：对于白细胞减少症，在攻击后单次出现白细胞减少症(攻击前基线的≥50％损失)将犬归类为阳性。在此研究中，rCAdV2-CPV VP2测试组(第1组)及MLV组(第2组)未展现白细胞减少症的体征。阴性对照组(第3组)包括6只动物中的5只具有至少1次白细胞减少症，其中在6DPC发作。
自粪便试样分离病毒：对于CPV粪便病毒分离，在攻击后在粪便中单次检测到CPV病毒将犬归类为阳性。将≤1.5Log10FAID50/ml的CPV粪便病毒效价记录为CPV粪便病毒分离阴性。将>1.5Log10FAID50/ml的所有其他记录效价皆归类为CPV粪便病毒检测阳性。
在此研究中，rCAdV2-CPV VP2组(第1组)所包括6只动物中的4只在8DPC与14DPC之间开始展现至少1天的病毒脱落。MLV组(第2组)未脱落可检测量的活病毒。阴性对照组中的所有动物在3DPC或4DPC开始且持续至9DPC皆在粪便中脱落可检测量的病毒。
结果的概述：
总而言之，在0DPV1及21DPV1用1.0ml以下疫苗对6周2天至7周2天龄的犬进行疫苗接种：(第1组)rCAdV2-CPV VP2＝8.0log/ml；(第2组)MLV Combo-CAdV2/CDV/CPV＝4.7/2.6/3.9log/ml；(第3组).PBS对照。在22DPV2用强毒CPV-2b经口鼻攻击所有经疫苗接种的犬。
当在2个剂量的方案中以8.0log/剂量给予时，rCAdV2-CPV VP2测试疫苗未满足效能准则。三(3)只狗展现发热、粪便中CPV的脱落及淋巴细胞减少症，且1只狗展现犬小病毒的确定性临床体征。第四只狗仅展现CPV的脱落。疫苗在约10DPC之前似乎提供初始保护，与阴性对照相比该疫苗延迟了感染的临床体征的发作。报告一只疫苗接种者的角膜不明原因地完全混浊。
实施例8：包含rCAdV-EHV-4p430/RabG(N)的医药组合物(疫苗)的制备：
包含rCAdV-EHV-4p430/RabG(N)疫苗的医药组合物(疫苗)的制备：
疫苗调配：
用0.01M PBS将rCAdV-EHV-4pp430/RabG(N)组织培养储备液稀释至目标剂量。未使用佐剂。
用rCAdV-EHV-4 P430/RabG(N)对猪进行接种且评价血清学反应：
研究设计：经疫苗接种仔猪及对照组的年龄为4-8周龄，投药(单一/两个剂量)是以2ml/剂量经肌内进行。
为研究rCAdV-EHV-4P(GG430)RABG(N)C1作为载体疫苗在年幼仔猪中的性质，在疫苗接种-血清学研究中测试rCAdV-EHV-4P(GG430)RABG(N)C1。
详细地，在研究日0天及21天用rCAdV-EHV-4p430/RabG(N)C1以6.7log的剂量对仔猪疫苗接种两次(两次性疫苗接种，2×rCAdV)。未经疫苗接种的组用作阴性对照。
血清学：用于量测疫苗接种后血清转化的分析
在来自经rCAdV-2p430RabG疫苗疫苗接种一次或两次的动物的血清中测试疫苗接种后对CAdV-2中和抗体的诱导。经疫苗接种的动物显示针对CAdV2的可检测的病毒中和(VN)效价，而来自未经疫苗接种的组的血清没有可检测的CAdV-2中和抗体含量(表2.)。由堪萨斯州立大学(Kansas State University)的狂犬病实验室在血清上实施的快速荧光灶抑制测试(RFFIT)显示在12只经疫苗接种动物中的3只中可检测到RFFIT效价，且在量测狂犬病中和抗体的对照组中未检测到RFFIT效价。亦测试了通过ELISA进行的总狂犬病抗体测试以及CAdV病毒脱落。
表7.
所述结果证实本发明的EHV-4启动子在CAdV载体中的效用(通过展示所关注转基因的有效表达(通过表达评估多少比例的疫苗病毒导致所关注转基因在经感染细胞中表达))，以及病毒拯救，及转基因在经疫苗接种动物中的免疫原性。利用具有由CMV启动子驱动的表达盒的CAdV载体甚至无法评估表达。根据本发明，本文中所揭示及主张的所有组合物及方法皆可在无需过多实验的情形下进行及执行。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施方案予以阐述，但熟习此项技术者应明了，可改变所述组合物及方法及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，此并不背离本发明的概念、精神及范围。更特定而言，应明了，某些在化学及生理上均相关的试剂可替代本文所述试剂同时可达成相同或类似结果。熟习此项技术者显而易见的所有所述类似替代物及修改皆被视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明精神、范围及概念内。
参考文献
以下参考文献在其提供对本文所阐述的那些补充的实例性程序或其他细节的程度上以引用方式特定地并入本文中。
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cgcaggaggc gtgggcacct accagtttgt gcgcgaattt gtgccagagg tataccttaa 240
ccctttttca ggaccaccgg acacctttcc tgatcagttc attcctaact acgacattgt 300
aaccaactct gtcgatggct atgactgagg agagcatgga ccaggtggag gtgaactgcc 360
tgtgtgctca gcatgcccaa acctgcacgc gccctcgctg ctttgcaaag gagggtttat 420
gtgctaactg gttttacaac ccagcacttg cctttgaagg gtttgatatt ccagactctt 480
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accctcagcc ttctaatggg actaaacaac aaaaatcagg cccatgtagc ttgtcaaata 780
aacttaccta atttttgcta agacgtctgg gtcctgcgtt tctatgtcca ccaaagtccc 840
ctcttcccag ctttggtact tccacttgtg cgcgcgagcc agcttgcgga tgtgcttgaa 900
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ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 300
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 360
ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 420
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 480
ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 540
gtggc 545
<210> 4
<211> 1110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE FROM HUMAN CMV PROMOTER AND AD5 LEADER
<400> 4
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 300
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 360
ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 420
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 480
ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 540
gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 600
catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 660
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 720
acctgagcca gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 780
cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 840
ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgagc cggcggatgg 900
tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 960
gcgggcatga cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1020
acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1080
acaggtgtcc actcccaggt ccaagtataa 1110
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 5
ttattaatag taatcaatta cgggg 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 6
gccaccgtac acgcctaccg ccc 23
<210> 7
<211> 1570
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID CMVie EGFP EXPRESSION
CASSETTE
<400> 7
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 300
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 360
ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 420
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 480
ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 540
gtggcggatc cgccgccacc atgggccgcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc 600
accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 660
gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 720
accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 780
cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 840
cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 900
cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 960
gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 1020
aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 1080
cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 1140
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 1200
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 1260
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taagtcgact atttcgagta cctctagggc 1320
cgcttcgagc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 1380
agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 1440
taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg 1500
gggagatgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt aaaatcgaat 1560
ctagatcctc 1570
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 8
gggcgaggag ctgttcacc 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 9
ccggcggcgg tcacgaactc c 21
<210> 10
<211> 3636
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID CMVie CPV VP2 (n)
EXPRESSION CASSETTE
<400> 10
ccacgtggtt taaacctccc aaataggtat aaaaagccca gtgctggctg gcacgggcat 60
tcagcttagc gaagacatcc ccagcgcctc ctggatcagg cccgacggca tattccagct 120
aggagggggg tctcgctcgt ccttcagccc aacgcaagca ttcctcaccc tgcaacaggc 180
atcctcgacg ccgcgcgcag gaggcgtggg cacctaccag tttgtgcgcg aatttgtgcc 240
agaggtatac cttaaccctt tttcaggacc accggacacc tttcctgatc agttcattcc 300
taactacgac attgtaacca actctgtcga tggctatgac tgaggagagc atggaccagg 360
tggaggtgaa ctgcctgtgt gctcagcatg cccaaacctg cacgcgccct cgctgctttg 420
caaaggaggg tttatgtgct aactggtttt acaacccagc acttgccttt gaagggtttg 480
atattccaga ctcttaccaa gagggacacg gtgtggtacc tagttattaa tagtaatcaa 540
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 600
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 660
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 720
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 780
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 840
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 900
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 960
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 1020
acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtggcgg atccgccgcc 1080
accatgagtg atggagcagt tcaaccagac ggtggtcaac ctgctgtcag aaatgaaaga 1140
gctacaggat ctgggaacgg gtctggaggc gggggtggtg gtggttctgg gggtgtgggg 1200
atttctacgg gtactttcaa taatcagacg gaatttaaat ttttggaaaa cggatgggtg 1260
gaaatcacag caaactcaag cagacttgta catttaaata tgccagaaag tgaaaattat 1320
agaagagtgg ttgtaaataa tttggataaa actgcagtta acggaaacat ggctttagat 1380
gatactcatg cacaaattgt aacaccttgg tcattggttg atgcaaatgc ttggggagtt 1440
tggtttaatc caggagattg gcaactaatt gttaatacta tgagtgagtt gcatttagtt 1500
agttttgaac aagaaatttt taatgttgtt ttaaagactg tttcagaatc tgctactcag 1560
ccaccaacta aagtttataa taatgattta actgcatcat tgatggttgc attagatagt 1620
aataatacta tgccatttac tccagcagct atgagatctg agacattggg tttttatcca 1680
tggaaaccaa ccataccaac tccatggaga tattattttc aatgggatag aacattaata 1740
ccatctcata ctggaactag tggcacacca acaaatatat accatggtac agatccagat 1800
gatgttcaat tttatactat tgaaaattct gtgccagtac acttactaag aacaggtgat 1860
gaatttgcta caggaacatt tttttttgat tgtaaaccat gtagactaac acatacatgg 1920
caaacaaata gagcattggg cttaccacca tttctaaatt ctttgcctca agctgaagga 1980
ggtactaact ttggttatat aggagttcaa caagataaaa gacgtggtgt aactcaaatg 2040
ggaaaaacaa actatattac tgaagctact attatgagac cagctgaggt tggttatagt 2100
gcaccatatt attcttttga ggcgtctaca caagggccat ttaaaacacc tattgcagca 2160
ggacgggggg gagcgcaaac agatgaaaat caaggagcag atggtaatcc aagatatgca 2220
tttggtagac aacatggtca aaaaactacc acaacaggag aaacacctga gagatttaca 2280
tatatagcac atcaagatac aggaagatat ccagaaggag attggattca aaatattaac 2340
tttaaccttc ctgtaacaga tgataatgta ttgctaccaa cagatccaat tggaggtaaa 2400
acaggaatta actatactaa tatatttaat acttatggtc ctttaactgc attaaataat 2460
gtaccaccag tttatccaaa tggtcaaatt tgggataaag aatttgatac tgacttaaaa 2520
ccaagacttc atgtaaatgc accatttgtt tgtcaaaata attgtcctgg tcaattattt 2580
gtaaaagttg cgcctaattt aacaaatgaa tatgatcctg atgcatctgc taatatgtca 2640
agaattgtaa cttactcaga tttttggtgg aaaggtaaat tagtatttaa agctaaacta 2700
agagcctctc atacttggaa tccaattcaa caaatgagta ttaatgtaga taaccaattt 2760
aactatgtac caagtaatat tggaggtatg gaaattgtat ttgaaagatc tcaactagca 2820
cctagaaaat tatattaagt cgactatttc gagtacctct agggccgctt cgagcagaca 2880
tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 2940
ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 3000
aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg 3060
ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat cgaatctaga tcctccttaa 3120
gacaccctca gccttctaat gggactaaac aacaaaaatc aggcccatgt agcttgtcaa 3180
ataaacttac ctaatttttg ctaagacgtc tgggtcctgc gtttctatgt ccaccaaagt 3240
cccctcttcc cagctttggt acttccactt gtgcgcgcga gccagcttgc ggatgtgctt 3300
gaaagataat gtggtctctc ccaacagctt cccgttcacc agcaccaggg ccatgaagcg 3360
gacacgaaga gctctacctg caaattatga ccctgtatat ccatacgacg cccccgggtc 3420
ttccacacaa cccccttttt ttaataacaa gcaaggtctc actgagtcac ccccaggaac 3480
cctggctgtc aatgtttccc ctccactaac cttttctacg ttaggtgcca ttaaactttc 3540
cacaggtccc ggactcaccc tcaacgaggg caagttacaa gccagcttag ggcccggcct 3600
catcacaaat accgagggcc aaatcactgt tggttt 3636
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 11
tgatcagttc attcctaact acgacatt 28
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 12
ttgctatcta atgcaaccat ca 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 13
aatgcaccat ttgtttgtca 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 14
gggaagctgt tgggagagac c 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 15
aatgcttggg gagtttggt 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 16
ttgtgtagac gcctcaaaag 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 17
aatgcttggg gagtttggt 19
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 18
tgcatcagga tcatattcat tt 22
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 19
aactcaaatg ggaaatacaa act 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 20
tgcatcagga tcatattcat tt 22
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 21
tgatcagttc attcctaact acgacatt 28
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 22
gggaagctgt tgggagagac c 21
<210> 23
<211> 2563
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID CMVie CPV VP2 (co)
EXPRESSION CASSETTE
<400> 23
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 300
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 360
ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 420
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 480
ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 540
gtggcggatc cgccgccacc atgtctgatg gcgccgtgca gcctgatggc ggacagcctg 600
ctgtgcggaa tgagagagcc accggcagcg gcaatggatc tggcggaggc ggcggagggg 660
gaagtggcgg agtgggaatt agcaccggca ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc 720
tggaaaacgg ctgggtggaa atcaccgcca acagcagcag actggtgcac ctgaacatgc 780
ccgagagcga gaactaccgg cgggtggtcg tgaacaacct ggacaagacc gccgtgaacg 840
gcaacatggc cctggacgat acccacgccc agatcgtgac accctggtcc ctggtggatg 900
ccaatgcctg gggcgtgtgg ttcaaccccg gcgactggca gctgatcgtg aacaccatga 960
gcgagctgca cctggtgtcc ttcgagcagg aaatcttcaa cgtggtgctg aaaaccgtgt 1020
ccgagagcgc cacacagccc cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcctccctga 1080
tggtggctct ggacagcaac aacaccatgc ccttcacccc tgccgccatg cggagcgaga 1140
cactgggctt ctacccctgg aagcccacca tccctacccc ctggcggtac tacttccagt 1200
gggacagaac cctgatcccc agccacacag gcaccagcgg cacccctacc aacatctacc 1260
acggcaccga ccccgacgac gtgcagttct acaccatcga gaacagcgtg cccgtgcatc 1320
tgctgagaac cggcgacgag ttcgccacag gcacattctt tttcgactgc aaaccctgcc 1380
ggctgaccca cacctggcag accaatagag ccctgggcct gcccccattc ctgaacagtc 1440
tgcctcaggc cgagggcggc accaactttg gctatatcgg cgtgcagcag gacaagcgga 1500
gaggcgtgac acagatgggc aagaccaact acatcaccga ggccacaatc atgcggcctg 1560
ccgaagtggg ctacagcgcc ccctactaca gcttcgaggc cagcacccag ggccccttca 1620
agacacctat tgccgccgga agaggcggag cccagaccga tgagaatcag ggcgccgacg 1680
gcaaccccag atacgccttt ggcagacagc acggccagaa aaccaccacc accggcgaga 1740
cacccgagcg gttcacctat atcgcccacc aggacaccgg cagatacccc gagggcgact 1800
ggattcagaa catcaacttc aacctgcccg tgaccgacga caacgtgctg ctgcccacag 1860
atcccatcgg cggcaagacc ggcatcaact acaccaatat cttcaacacc tacggccctc 1920
tgaccgccct gaacaacgtg ccccccgtgt accccaacgg acagatctgg gacaaagagt 1980
tcgacaccga cctgaagccc cggctgcatg tgaacgcccc tttcgtgtgc cagaacaact 2040
gccctggcca gctgtttgtg aaggtggccc ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg 2100
ccagcgccaa catgagccgg atcgtgacct acagcgactt ctggtggaag ggcaagctgg 2160
tgttcaaggc caagctgcgg gcctctcaca cctggaaccc catccagcag atgagcatca 2220
acgtggacaa ccagttcaac tacgtgccca gcaacatcgg cggaatggaa atcgtgttcg 2280
agcggtccca gctggccccc agaaagctgt actaatctag agggccctat tctatagtgt 2340
cacctaaatg ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 2400
gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 2460
tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 2520
ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag aca 2563
<210> 24
<211> 584
<212> PRT
<213> canine parvovirus
<400> 24
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Lys Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Gly Ala Asp Gly Asn Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asp Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Glu Ile Val Phe Glu Arg Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 25
<211> 2418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID CMVie RabGP (n)
EXPRESSION CASSETTE
<400> 25
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 60
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 120
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 180
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 300
gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 360
ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 420
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 480
ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 540
gtggcggatc cgccgccacc atggtaccgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc 600
tggtttttcc attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc 660
cctggagccc gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg 720
aaggatgcac caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatctcag 780
ccataaaaat gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta 840
acttcgttgg ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg 900
catgtagagc cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac 960
acaatccgta ccctgactac cactggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg 1020
ttatcatatc tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg 1080
tcttccctgg cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc 1140
acgattacac catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta 1200
ccaatagtag agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa 1260
gaggcctata taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctcggac 1320
ttagacttat ggatggaaca tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc 1380
ctcccggtca gttgatcaat ttgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg 1440
tagaggagtt ggtcaagaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacca 1500
ccaagtcagt aagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa 1560
aagcatatac catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtca 1620
gaacttggaa tgagatcatc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc 1680
ctcatgtaaa cggggtattt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa 1740
tcccagagat gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggta tcctcggtta 1800
tcccccttat gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caagaacggt gacgaggctg 1860
aggattttgt tgaagttcac cttcccgatg tgcacgaacg gatctcagga gttgacttgg 1920
gtctcccgaa ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt 1980
tgataatttt cctgatgaca tgctggagaa gagtcaatcg atcggaacct acacaacaca 2040
atctcagagg gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt 2100
catgggaatc atacaagagc gggggtgaga ccggactgtg agtcgactat ttcgagtacc 2160
tctagggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 2220
tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 2280
aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 2340
ggttcagggg gagatgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa 2400
aatcgaatct agatcctc 2418
<210> 26
<211> 526
<212> PRT
<213> Rabies virus
<400> 26
Met Val Pro Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe
1 5 10 15
Pro Leu Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu
20 25 30
Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn
35 40 45
Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr
50 55 60
Met Glu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe
65 70 75 80
Thr Cys Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val
85 90 95
Gly Tyr Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro
100 105 110
Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg
115 120 125
Tyr Glu Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg
130 135 140
Thr Val Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val
145 150 155 160
Ala Asp Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro
165 170 175
Gly Gly Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr
180 185 190
Asn His Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met
195 200 205
Ser Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly
210 215 220
Ser Glu Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu
225 230 235 240
Lys Gly Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu
245 250 255
Met Asp Gly Thr Trp Val Ser Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp
260 265 270
Cys Pro Pro Gly Gln Leu Ile Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu
275 280 285
Ile Glu His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys
290 295 300
Leu Asp Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg
305 310 315 320
Arg Leu Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr
325 330 335
Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser
340 345 350
Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val
355 360 365
Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile
370 375 380
Ile Leu Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser
385 390 395 400
Leu Leu Gln Gln His Met Glu Leu Leu Val Ser Ser Val Ile Pro Leu
405 410 415
Met His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu
420 425 430
Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Glu Arg Ile
435 440 445
Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu
450 455 460
Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr
465 470 475 480
Cys Trp Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg
485 490 495
Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile
500 505 510
Ser Ser Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu
515 520 525
<210> 27
<211> 3546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID CMVie BRSV F (co)
EXPRESSION CASSETTE
<400> 27
tcagcttagc gaagacatcc ccagcgcctc ctggatcagg cccgacggca tattccagct 60
aggagggggg tctcgctcgt ccttcagccc aacgcaagca ttcctcaccc tgcaacaggc 120
atcctcgacg ccgcgcgcag gaggcgtggg cacctaccag tttgtgcgcg aatttgtgcc 180
agaggtatac cttaaccctt tttcaggacc accggacacc tttcctgatc agttcattcc 240
taactacgac attgtaacca actctgtcga tggctatgac tgaggagagc atggaccagg 300
tggaggtgaa ctgcctgtgt gctcagcatg cccaaacctg cacgcgccct cgctgctttg 360
caaaggaggg tttatgtgct aactggtttt acaacccagc acttgccttt gaagggtttg 420
atattccaga ctcttaccaa gagggacacg gtgtggtacc tagttattaa tagtaatcaa 480
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 540
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 600
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 660
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 720
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 780
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 840
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 900
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 960
acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtggcgg atccgccgcc 1020
accatggcca ccaccgccat gaggatgatc atcagcatca tcttcatcag cacctacgtg 1080
acccacatca ccctgtgcca gaacatcacc gaggaattct accagagcac ctgtagcgcc 1140
gtgtccaggg gctacctgag cgccctgaga accggctggt acaccagcgt ggtgacaatc 1200
gagctgagca agatccagaa aaacgtgtgc aacagcaccg acagcaaagt gaagctgatc 1260
aagcaagaac tgggccgcta caacaacgcc gtgattgaac tgcagagcct gatgcagaac 1320
gagcccgcca gcttcagcag ggccaagagg ggcatccccg agctgatcca ctaccccaga 1380
aacagcacca agaggttcta cggcctgatg ggcaagaaga ggaagcgcag attcctgggc 1440
ttcctgctgg gcatcggcag cgccatcgct tctggcgtgg ccgtgtctaa ggtgctgcac 1500
ctggaaggcg aagtgaacaa gatcaagaac gccctgctga gcaccaacaa ggctgtggtg 1560
tccctgagca acggcgtgtc cgtgctgacc agcaaggtgc tggatctgaa gaactacatc 1620
gacaaaaagc tgctgcccaa ggtcaacaac cacgactgca ggatcagcaa catcgagaca 1680
gtgatcgagt tccagcagaa gaacaacagg ctgctggaaa tcgcccgcga gttcagcgtg 1740
aacgccggca tcaccacccc cctgagcacc tacatgctga ccaacagcga gctgctgagc 1800
ctgatcaacg acatgcccat caccaacgac cagaaaaagc tgatgagcag caacgtgcag 1860
atcgtgcgcc agcagagcta cagcatcatg agcgtggtga aagaagaagt cattgcctac 1920
gtcgtgcagc tgcccatcta cggcgtgatc gacaccccct gctggaaggt gcacaccagc 1980
cctctgtgca caaccgacaa caaagagggc agcaacatct gcctgaccag gaccgacagg 2040
ggctggtact gcgacaacgc cggctccgtg tcattctttc cacaagccga aacatgcaag 2100
gtgcagagca acagggtgtt ctgcgacacc atgaacagcc tgaccctgcc caccgacgtg 2160
aacctgtgca acaccgatat cttcaacacc aaatacgatt gcaagatcat gacctccaag 2220
accgacatca gcagcagcgt gatcaccagc atcggcgcca tcgtgtcctg ctacggcaag 2280
accaagtgca ccgccagcaa caagaacagg ggcatcatca agaccttcag caacggctgc 2340
gactacgtgt ccaacaaggg cgtggacacc gtgtccgtgg gcaacaccct gtactacgtg 2400
aacaagctgg aaggcaaggc cctgtacatc aagggcgagc ccatcatcaa ctactacgac 2460
cccctggtgt tccccagcga cgagttcgac gcctctatcg ctcaggtcaa cgccaagatc 2520
aaccagagcc tggccttcat caggcgcagc gacgagctgc tgcacagcgt ggacgtgggc 2580
aagtccacca tcaacgtggt gatcacaacc atcatcatcg tgatcgtggt ggtgatcctg 2640
atgctgatcg ccgtgggcct gctgttctac tgcaagacaa ggtccacccc catcatgctg 2700
ggcaaggacc agctgagcgg catcaacaac ctgagcttct ctaaataagt cgactatttc 2760
gagtacctct agggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa 2820
ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt 2880
tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta 2940
tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat 3000
gtggtaaaat cgaatctaga tcctccttaa gacaccctca gccttctaat gggactaaac 3060
aacaaaaatc aggcccatgt agcttgtcaa ataaacttac ctaatttttg ctaagacgtc 3120
tgggtcctgc gtttctatgt ccaccaaagt cccctcttcc cagctttggt acttccactt 3180
gtgcgcgcga gccagcttgc ggatgtgctt gaaagataat gtggtctctc ccaacagctt 3240
cccgttcacc agcaccaggg ccatgaagcg gacacgaaga gctctacctg caaattatga 3300
ccctgtatat ccatacgacg cccccgggtc ttccacacaa cccccttttt ttaataacaa 3360
gcaaggtctc actgagtcac ccccaggaac cctggctgtc aatgtttccc ctccactaac 3420
cttttctacg ttaggtgcca ttaaactttc cacaggtccc ggactcaccc tcaacgaggg 3480
caagttacaa gccagcttag ggcccggcct catcacaaat accgagggcc aaatcactgt 3540
tggttt 3546
<210> 28
<211> 574
<212> PRT
<213> Bovine respiratory syncytial virus
<400> 28
Met Ala Thr Thr Ala Met Arg Met Ile Ile Ser Ile Ile Phe Ile Ser
1 5 10 15
Thr Tyr Val Thr His Ile Thr Leu Cys Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Leu Ser Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Val Thr Ile Glu Leu Ser Lys Ile
50 55 60
Gln Lys Asn Val Cys Asn Ser Thr Asp Ser Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Gly Arg Tyr Asn Asn Ala Val Ile Glu Leu Gln Ser Leu
85 90 95
Met Gln Asn Glu Pro Ala Ser Phe Ser Arg Ala Lys Arg Gly Ile Pro
100 105 110
Glu Leu Ile His Tyr Pro Arg Asn Ser Thr Lys Arg Phe Tyr Gly Leu
115 120 125
Met Gly Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Ile
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Lys Leu Leu Pro Lys Val Asn
195 200 205
Asn His Asp Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Ala Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Ile Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Val Val Lys Glu Glu Val Ile Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Val His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asp Asn Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Thr Asp Val Asn Leu Cys Asn Thr
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Thr Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Ile Gly Ala Ile Val Ser Cys
405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly
450 455 460
Lys Ala Leu Tyr Ile Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro
465 470 475 480
Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ala Gln Val Asn
485 490 495
Ala Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu
500 505 510
Leu His Ser Val Asp Val Gly Lys Ser Thr Ile Asn Val Val Ile Thr
515 520 525
Thr Ile Ile Ile Val Ile Val Val Val Ile Leu Met Leu Ile Ala Val
530 535 540
Gly Leu Leu Phe Tyr Cys Lys Thr Arg Ser Thr Pro Ile Met Leu Gly
545 550 555 560
Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Leu Ser Phe Ser Lys
565 570
<210> 29
<211> 600
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 29
gcagactttg gagcagcaca atttccggtt gtggacccca tggaccttgg tttggctggt 60
accgtggaaa ctaacgctcc ggaagttttg gccagagcaa aatacaattc gaaggtagac 120
atatggagcg ccggaatagt tctgtttgaa atgctcgcat atccatcaac tctatttgag 180
gacccgccga gtaccccaca agagtatgta aaaagctgtc attctcaact actgagaata 240
atatcaaagc taaagataaa ccctgaggag tttccacggg aaccagagtc taggctcgtg 300
cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta tccttgcttc 360
cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct agcgttcaat 420
gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat gaatctgtag 480
gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag ttgtactact 540
taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata agctgcagtt 600
<210> 30
<211> 600
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 30
agctggggga gtttgtacta tagtgtatta catgcggctt gcaataactg cctggtttat 60
gtttcgcaac attcaagcag acatgctacc gctaaacact ttgcaacaat tttttattgg 120
gtgtttggcc tttggtagaa ctgtcgcgtt tttggtggta gcatatacta ccttatttat 180
acgctccgag ctgtttttca gcatgctagc acccaacgcc gagcgagagt atataactcc 240
catcattgcc cacaagctta tgccacttat tagcgtccgc tctgccgttt gcttagtcat 300
aatatctacc gccgtttacg cagcagacgc tatctgcgac acaattggat ttgcgatacc 360
gcgcatgtgg atgtgtattt taatgagatc aacctccatg aagcgtaact agggggcctc 420
ccactgaggc actaccggct tagcagctga ctaacacagt ataaaacgtg agaagaaatc 480
agtctcatgc gccattagcg ctaggctagt tagcgtggag gaccggagcg ctaccgccag 540
cagtttcatc cgcctggtta cgggtttgtt aacacctacc ggtgttttac cgctaccata 600
<210> 31
<211> 442
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 31
ggtacctcta tttgaggacc cgccgagtac cccacaagag tatgtaaaaa gctgtcattc 60
tcaactactg agaataatat caaagctaaa gataaaccct gaggagtttc cacgggaacc 120
agagtctagg ctcgtgcgcg gatacatcga atacgccagc ctagagcgta agccacatac 180
gcgctatcct tgcttccagc gcgtgaacct acacattgac ggggaatttt tgatccataa 240
aatgctagcg ttcaatgctg cgatgcgccc atccgcagaa gagttgttgt cctacccaat 300
gtttatgaat ctgtaggatg actaacagat ttggggtgga gacggcgtgg gcgatactgt 360
ataaagttgt actacttacc agcccagtca gtgtgctgta gtgccaccac ctgtaaagct 420
gtgataagct gcagttggat cc 442
<210> 32
<211> 467
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 32
ggtaccactg gtggtagcat atactacctt atttatacgc tccgagctgt ttttcagcat 60
gctagcaccc aacgccgagc gagagtatat aactcccatc attgcccaca agcttatgcc 120
acttattagc gtccgctctg ccgtttgctt agtcataata tctaccgccg tttacgcagc 180
agacgctatc tgcgacacaa ttggatttgc gataccgcgc atgtggatgt gtattttaat 240
gagatcaacc tccatgaagc gtaactaggg ggcctcccac tgaggcacta ccggcttagc 300
agctgactaa cacagtataa aacgtgagaa gaaatcagtc tcatgcgcca ttagcgctag 360
gctagttagc gtggaggacc ggagcgctac cgccagcagt ttcatccgcc tggttacggg 420
tttgttaaca cctaccggtg ttttaccgct accataggat cggatcc 467
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 33
tttaaaggta cctctatttg aggacccgcc gagtacc 37
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 34
aaatttggat ccaactgcag cttatcacag ctttacaggt gg 42
<210> 35
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 35
tttaaaggta ccactggtgg tagcatatac tacctttatt tatacgc 47
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 36
aaatttggat ccgatcctat ggtagcggta aaacaccg 38
<210> 37
<211> 1776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CPV VP2 Despliced ORF with BamHI and SalI Restriction
Endonuclease Sites
<400> 37
ggatccgccg ccaccatgtc tgatggcgcc gtgcagcctg atggcggaca gcctgccgtc 60
cggaatgaga gagccaccgg cagcggcaat ggatctggcg gaggcggcgg aggcggaagt 120
ggcggcgtcg gcattagcac cggcaccttc aacaaccaga ccgagttcaa gttcctggaa 180
aacggctggg tcgagatcac cgccaacagc agcagactcg tgcacctgaa catgcccgag 240
agcgagaact accggcgcgt cgtcgtgaac aacctggaca agaccgctgt caacggcaac 300
atggccctgg acgataccca cgcccagatt gtcacacctt ggagcctcgt ggatgccaat 360
gcctgggggg tgtggtttaa ccccggcgac tggcagctca ttgtcaacac catgagcgag 420
ctgcacctcg tctccttcga gcaggaaatc ttcaacgtcg tgctgaaaac tgtctccgag 480
agcgccacac agccccccac caaagtgtac aacaacgacc tgaccgcctc cctgatggtc 540
gccctggaca gcaacaacac catgcccttc acccctgccg ccatgcggag cgagacactg 600
ggcttctacc cctggaagcc caccatccct accccctggc ggtactactt tcaatgggac 660
agaaccctga tccccagcca cacaggcacc agcggcaccc ctaccaacat ctaccacggc 720
accgaccccg acgacgtgca gttctacacc atcgagaaca gcgtgcccgt gcatctgctg 780
agaaccggcg acgaatttgc cacaggcaca ttctttttcg actgcaaacc ctgccggctg 840
acccacacct ggcagaccaa tagagccctg ggcctgcccc cattcctgaa ctccctgcct 900
caggccgagg gcggcaccaa ctttggctat atcggcgtgc agcaggacaa gcggagagga 960
gtcacacaga tgggcaagac caactacatc accgaggcca caatcatgcg gcctgccgaa 1020
gtcggataca gcgcccccta ctacagcttc gaggccagca cccagggccc cttcaagaca 1080
cctattgccg ccggaagagg cggagcccag accgatgaga atcagggcgc cgacggcaac 1140
cccagatacg cctttggcag acagcacggc cagaaaacca ccaccaccgg cgagacaccc 1200
gaacgcttca cctatatcgc ccaccaggac accggcagat accccgaggg cgactggatt 1260
cagaacatca acttcaacct gcctgtcacc gacgacaacg tgctgctgcc cacagatccc 1320
atcggcggca agaccggcat caactacacc aatatcttca acacctacgg ccctctgacc 1380
gccctgaaca acgtgccccc cgtgtacccc aacggacaga tctgggacaa ggaattcgac 1440
accgacctga agccccggct gcacgtcaac gcccctttcg tctgccagaa caactgccct 1500
ggccaactct tcgtcaaagt ggcccccaac ctgaccaatg aatatgaccc tgacgccagc 1560
gccaacatga gccggattgt cacctacagc gacttttggt ggaagggaaa actcgtgttc 1620
aaggccaagc tgcgggcctc tcacacctgg aaccccatcc agcaaatgag catcaacgtg 1680
gacaaccagt tcaactacgt gcccagcaac atcggcggaa tggaaattgt cttcgaacgc 1740
tcccagctgg cccccagaaa gctgtactaa gtcgac 1776
<210> 38
<211> 1776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CPV VP2 Gen0.95 ORF with BamHI and SalI Restriction Endonuclease
Sites
<400> 38
ggatccgccg ccaccatgtc tgatggcgcc gtgcagcctg atggcggaca gcctgctgtg 60
cggaatgaga gagccaccgg cagcggcaat ggatctggcg gaggcggcgg agggggaagt 120
ggcggagtgg gaattagcac cggcaccttc aacaaccaga ccgagttcaa gttcctggaa 180
aacggctggg tggaaatcac cgccaacagc agcagactgg tgcacctgaa catgcccgag 240
agcgagaact accggcgggt ggtcgtgaac aacctggaca agaccgccgt gaacggcaac 300
atggccctgg acgataccca cgcccagatc gtgacaccct ggtccctggt ggatgccaat 360
gcctggggcg tgtggttcaa ccccggcgac tggcagctga tcgtgaacac catgagcgag 420
ctgcacctgg tgtccttcga gcaggaaatc ttcaacgtgg tgctgaaaac cgtgtccgag 480
agcgccacac agccccccac caaggtgtac aacaacgacc tgaccgcctc cctgatggtg 540
gctctggaca gcaacaacac catgcccttc acccctgccg ccatgcggag cgagacactg 600
ggcttctacc cctggaagcc caccatccct accccctggc ggtactactt ccagtgggac 660
agaaccctga tccccagcca cacaggcacc agcggcaccc ctaccaacat ctaccacggc 720
accgaccccg acgacgtgca gttctacacc atcgagaaca gcgtgcccgt gcatctgctg 780
agaaccggcg acgagttcgc taccggaaca ttcttcttcg actgcaaacc ctgccggctg 840
acccacacct ggcagaccaa tagagccctg ggcctgcccc ccttcctgaa ctctctgcct 900
caggctgagg gcggcaccaa cttcggctac atcggcgtgc agcaggacaa gcggagaggc 960
gtgacccaga tgggcaaaac caactacatc accgaggcca caatcatgcg gcctgccgaa 1020
gtgggctaca gcgcccccta ctacagcttc gaggccagca cccagggccc cttcaagaca 1080
cctattgccg ccggaagagg cggagcccag accgatgaga atcagggagc tgacggcaac 1140
cccagatacg cctttggcag acagcacggc cagaaaacca ccaccaccgg cgagacaccc 1200
gagcggttca cctacattgc ccaccaggac accggcagat accccgaggg cgattggatt 1260
cagaacatca acttcaacct gcccgtgacc gacgacaacg tgctgctgcc cacagatccc 1320
atcggcggca agaccggcat caactacacc aatatcttca acacctacgg ccctctgacc 1380
gccctgaaca acgtgccccc agtgtacccc aacggccaga tttgggacaa agagttcgac 1440
accgacctga agccccggct gcatgtgaac gcccctttcg tgtgccagaa caactgccct 1500
ggccagctgt ttgtgaaggt ggcccccaac ctgaccaacg agtacgaccc tgacgccagc 1560
gccaacatga gccggatcgt gacctacagc gacttctggt ggaagggcaa gctggtgttc 1620
aaggccaagc tgcgggcctc tcacacctgg aaccccatcc agcagatgag catcaacgtg 1680
gacaaccagt tcaactacgt gcccagcaac atcggcggaa tggaaatcgt gtttgagaga 1740
tcccagctgg cccccagaaa gctgtactga gtcgac 1776
<210> 39
<211> 1776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID EHV-4 p430 CPV VP2
(Despliced )EXPRESSION CASSETTE
<400> 39
ggatccgccg ccaccatgtc tgatggcgcc gtgcagcctg atggcggaca gcctgccgtc 60
cggaatgaga gagccaccgg cagcggcaat ggatctggcg gaggcggcgg aggcggaagt 120
ggcggcgtcg gcattagcac cggcaccttc aacaaccaga ccgagttcaa gttcctggaa 180
aacggctggg tcgagatcac cgccaacagc agcagactcg tgcacctgaa catgcccgag 240
agcgagaact accggcgcgt cgtcgtgaac aacctggaca agaccgctgt caacggcaac 300
atggccctgg acgataccca cgcccagatt gtcacacctt ggagcctcgt ggatgccaat 360
gcctgggggg tgtggtttaa ccccggcgac tggcagctca ttgtcaacac catgagcgag 420
ctgcacctcg tctccttcga gcaggaaatc ttcaacgtcg tgctgaaaac tgtctccgag 480
agcgccacac agccccccac caaagtgtac aacaacgacc tgaccgcctc cctgatggtc 540
gccctggaca gcaacaacac catgcccttc acccctgccg ccatgcggag cgagacactg 600
ggcttctacc cctggaagcc caccatccct accccctggc ggtactactt tcaatgggac 660
agaaccctga tccccagcca cacaggcacc agcggcaccc ctaccaacat ctaccacggc 720
accgaccccg acgacgtgca gttctacacc atcgagaaca gcgtgcccgt gcatctgctg 780
agaaccggcg acgaatttgc cacaggcaca ttctttttcg actgcaaacc ctgccggctg 840
acccacacct ggcagaccaa tagagccctg ggcctgcccc cattcctgaa ctccctgcct 900
caggccgagg gcggcaccaa ctttggctat atcggcgtgc agcaggacaa gcggagagga 960
gtcacacaga tgggcaagac caactacatc accgaggcca caatcatgcg gcctgccgaa 1020
gtcggataca gcgcccccta ctacagcttc gaggccagca cccagggccc cttcaagaca 1080
cctattgccg ccggaagagg cggagcccag accgatgaga atcagggcgc cgacggcaac 1140
cccagatacg cctttggcag acagcacggc cagaaaacca ccaccaccgg cgagacaccc 1200
gaacgcttca cctatatcgc ccaccaggac accggcagat accccgaggg cgactggatt 1260
cagaacatca acttcaacct gcctgtcacc gacgacaacg tgctgctgcc cacagatccc 1320
atcggcggca agaccggcat caactacacc aatatcttca acacctacgg ccctctgacc 1380
gccctgaaca acgtgccccc cgtgtacccc aacggacaga tctgggacaa ggaattcgac 1440
accgacctga agccccggct gcacgtcaac gcccctttcg tctgccagaa caactgccct 1500
ggccaactct tcgtcaaagt ggcccccaac ctgaccaatg aatatgaccc tgacgccagc 1560
gccaacatga gccggattgt cacctacagc gacttttggt ggaagggaaa actcgtgttc 1620
aaggccaagc tgcgggcctc tcacacctgg aaccccatcc agcaaatgag catcaacgtg 1680
gacaaccagt tcaactacgt gcccagcaac atcggcggaa tggaaattgt cttcgaacgc 1740
tcccagctgg cccccagaaa gctgtactaa gtcgac 1776
<210> 40
<211> 1776
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID EHV-4 p430 CPV VP2 (Gen
0.95) EXPRESSION CASSETTE
<400> 40
ggatccgccg ccaccatgtc tgatggcgcc gtgcagcctg atggcggaca gcctgctgtg 60
cggaatgaga gagccaccgg cagcggcaat ggatctggcg gaggcggcgg agggggaagt 120
ggcggagtgg gaattagcac cggcaccttc aacaaccaga ccgagttcaa gttcctggaa 180
aacggctggg tggaaatcac cgccaacagc agcagactgg tgcacctgaa catgcccgag 240
agcgagaact accggcgggt ggtcgtgaac aacctggaca agaccgccgt gaacggcaac 300
atggccctgg acgataccca cgcccagatc gtgacaccct ggtccctggt ggatgccaat 360
gcctggggcg tgtggttcaa ccccggcgac tggcagctga tcgtgaacac catgagcgag 420
ctgcacctgg tgtccttcga gcaggaaatc ttcaacgtgg tgctgaaaac cgtgtccgag 480
agcgccacac agccccccac caaggtgtac aacaacgacc tgaccgcctc cctgatggtg 540
gctctggaca gcaacaacac catgcccttc acccctgccg ccatgcggag cgagacactg 600
ggcttctacc cctggaagcc caccatccct accccctggc ggtactactt ccagtgggac 660
agaaccctga tccccagcca cacaggcacc agcggcaccc ctaccaacat ctaccacggc 720
accgaccccg acgacgtgca gttctacacc atcgagaaca gcgtgcccgt gcatctgctg 780
agaaccggcg acgagttcgc taccggaaca ttcttcttcg actgcaaacc ctgccggctg 840
acccacacct ggcagaccaa tagagccctg ggcctgcccc ccttcctgaa ctctctgcct 900
caggctgagg gcggcaccaa cttcggctac atcggcgtgc agcaggacaa gcggagaggc 960
gtgacccaga tgggcaaaac caactacatc accgaggcca caatcatgcg gcctgccgaa 1020
gtgggctaca gcgcccccta ctacagcttc gaggccagca cccagggccc cttcaagaca 1080
cctattgccg ccggaagagg cggagcccag accgatgaga atcagggagc tgacggcaac 1140
cccagatacg cctttggcag acagcacggc cagaaaacca ccaccaccgg cgagacaccc 1200
gagcggttca cctacattgc ccaccaggac accggcagat accccgaggg cgattggatt 1260
cagaacatca acttcaacct gcccgtgacc gacgacaacg tgctgctgcc cacagatccc 1320
atcggcggca agaccggcat caactacacc aatatcttca acacctacgg ccctctgacc 1380
gccctgaaca acgtgccccc agtgtacccc aacggccaga tttgggacaa agagttcgac 1440
accgacctga agccccggct gcatgtgaac gcccctttcg tgtgccagaa caactgccct 1500
ggccagctgt ttgtgaaggt ggcccccaac ctgaccaacg agtacgaccc tgacgccagc 1560
gccaacatga gccggatcgt gacctacagc gacttctggt ggaagggcaa gctggtgttc 1620
aaggccaagc tgcgggcctc tcacacctgg aaccccatcc agcagatgag catcaacgtg 1680
gacaaccagt tcaactacgt gcccagcaac atcggcggaa tggaaatcgt gtttgagaga 1740
tcccagctgg cccccagaaa gctgtactga gtcgac 1776
<210> 41
<211> 2502
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID EHV-4 pp455 CPV VP2
(Gen0.95) EXPRESSION CASSETTE
<400> 41
actggtggta gcatatacta ccttatttat acgctccgag ctgtttttca gcatgctagc 60
acccaacgcc gagcgagagt atataactcc catcattgcc cacaagctta tgccacttat 120
tagcgtccgc tctgccgttt gcttagtcat aatatctacc gccgtttacg cagcagacgc 180
tatctgcgac acaattggat ttgcgatacc gcgcatgtgg atgtgtattt taatgagatc 240
aacctccatg aagcgtaact agggggcctc ccactgaggc actaccggct tagcagctga 300
ctaacacagt ataaaacgtg agaagaaatc agtctcatgc gccattagcg ctaggctagt 360
tagcgtggag gaccggagcg ctaccgccag cagtttcatc cgcctggtta cgggtttgtt 420
aacacctacc ggtgttttac cgctaccata ggatcggatc cgccgccacc atgtctgatg 480
gcgccgtgca gcctgatggc ggacagcctg ctgtgcggaa tgagagagcc accggcagcg 540
gcaatggatc tggcggaggc ggcggagggg gaagtggcgg agtgggaatt agcaccggca 600
ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc tggaaaacgg ctgggtggaa atcaccgcca 660
acagcagcag actggtgcac ctgaacatgc ccgagagcga gaactaccgg cgggtggtcg 720
tgaacaacct ggacaagacc gccgtgaacg gcaacatggc cctggacgat acccacgccc 780
agatcgtgac accctggtcc ctggtggatg ccaatgcctg gggcgtgtgg ttcaaccccg 840
gcgactggca gctgatcgtg aacaccatga gcgagctgca cctggtgtcc ttcgagcagg 900
aaatcttcaa cgtggtgctg aaaaccgtgt ccgagagcgc cacacagccc cccaccaagg 960
tgtacaacaa cgacctgacc gcctccctga tggtggctct ggacagcaac aacaccatgc 1020
ccttcacccc tgccgccatg cggagcgaga cactgggctt ctacccctgg aagcccacca 1080
tccctacccc ctggcggtac tacttccagt gggacagaac cctgatcccc agccacacag 1140
gcaccagcgg cacccctacc aacatctacc acggcaccga ccccgacgac gtgcagttct 1200
acaccatcga gaacagcgtg cccgtgcatc tgctgagaac cggcgacgag ttcgctaccg 1260
gaacattctt cttcgactgc aaaccctgcc ggctgaccca cacctggcag accaatagag 1320
ccctgggcct gccccccttc ctgaactctc tgcctcaggc tgagggcggc accaacttcg 1380
gctacatcgg cgtgcagcag gacaagcgga gaggcgtgac ccagatgggc aaaaccaact 1440
acatcaccga ggccacaatc atgcggcctg ccgaagtggg ctacagcgcc ccctactaca 1500
gcttcgaggc cagcacccag ggccccttca agacacctat tgccgccgga agaggcggag 1560
cccagaccga tgagaatcag ggagctgacg gcaaccccag atacgccttt ggcagacagc 1620
acggccagaa aaccaccacc accggcgaga cacccgagcg gttcacctac attgcccacc 1680
aggacaccgg cagatacccc gagggcgatt ggattcagaa catcaacttc aacctgcccg 1740
tgaccgacga caacgtgctg ctgcccacag atcccatcgg cggcaagacc ggcatcaact 1800
acaccaatat cttcaacacc tacggccctc tgaccgccct gaacaacgtg cccccagtgt 1860
accccaacgg ccagatttgg gacaaagagt tcgacaccga cctgaagccc cggctgcatg 1920
tgaacgcccc tttcgtgtgc cagaacaact gccctggcca gctgtttgtg aaggtggccc 1980
ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg ccagcgccaa catgagccgg atcgtgacct 2040
acagcgactt ctggtggaag ggcaagctgg tgttcaaggc caagctgcgg gcctctcaca 2100
cctggaaccc catccagcag atgagcatca acgtggacaa ccagttcaac tacgtgccca 2160
gcaacatcgg cggaatggaa atcgtgtttg agagatccca gctggccccc agaaagctgt 2220
actgagtcga ctatttcgag tacctctagg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 2280
tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 2340
ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 2400
caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggagatg tgggaggttt tttaaagcaa 2460
gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga atctagatcc tc 2502
<210> 42
<211> 2304
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID EHV-4 p430 RabG (n)
EXPRESSION CASSETTE
<400> 42
ctctatttga ggacccgccg agtaccccac aagagtatgt aaaaagctgt cattctcaac 60
tactgagaat aatatcaaag ctaaagataa accctgagga gtttccacgg gaaccagagt 120
ctaggctcgt gcgcggatac atcgaatacg ccagcctaga gcgtaagcca catacgcgct 180
atccttgctt ccagcgcgtg aacctacaca ttgacgggga atttttgatc cataaaatgc 240
tagcgttcaa tgctgcgatg cgcccatccg cagaagagtt gttgtcctac ccaatgttta 300
tgaatctgta ggatgactaa cagatttggg gtggagacgg cgtgggcgat actgtataaa 360
gttgtactac ttaccagccc agtcagtgtg ctgtagtgcc accacctgta aagctgtgat 420
aagctgcagt tggatccgcc gccaccatgg taccggttcc tcaggctctc ctgtttgtac 480
cccttctggt ttttccattg tgttttggga aattccctat ttacacgata ccagacaagc 540
ttggtccctg gagcccgatt gacatacatc acctcagctg cccaaacaat ttggtagtgg 600
aggacgaagg atgcaccaac ctgtcagggt tctcctacat ggaacttaaa gttggataca 660
tctcagccat aaaaatgaac gggttcactt gcacaggcgt tgtgacggag gctgaaacct 720
acactaactt cgttggttat gtcacaacca cgttcaaaag aaagcatttc cgcccaacac 780
cagatgcatg tagagccgcg tacaactgga agatggccgg tgaccccaga tatgaagagt 840
ctctacacaa tccgtaccct gactaccact ggcttcgaac tgtaaaaacc accaaggagt 900
ctctcgttat catatctcca agtgtggcag atttggaccc atatgacaga tcccttcact 960
cgagggtctt ccctggcggg aagtgctcag gagtagcggt gtcttctacc tactgctcca 1020
ctaaccacga ttacaccatt tggatgcccg agaatccgag actagggatg tcttgtgaca 1080
tttttaccaa tagtagaggg aagagagcat ccaaagggag tgagacttgc ggctttgtag 1140
atgaaagagg cctatataag tctttaaaag gagcatgcaa actcaagtta tgtggagttc 1200
tcggacttag acttatggat ggaacatggg tctcgatgca aacatcaaat gaaaccaaat 1260
ggtgccctcc cggtcagttg atcaatttgc acgactttcg ctcagacgaa attgagcacc 1320
ttgttgtaga ggagttggtc aagaagagag aggagtgtct ggatgcacta gagtccatca 1380
tgaccaccaa gtcagtaagt ttcagacgtc tcagtcattt aagaaaactt gtccctgggt 1440
ttggaaaagc atataccata ttcaacaaga ccttgatgga agccgatgct cactacaagt 1500
cagtcagaac ttggaatgag atcatccctt caaaagggtg tttaagagtt ggggggaggt 1560
gtcatcctca tgtaaacggg gtatttttca atggtataat attaggacct gacggcaatg 1620
tcttaatccc agagatgcaa tcatccctcc tccagcaaca tatggagttg ttggtatcct 1680
cggttatccc ccttatgcac cccctggcag acccgtctac cgttttcaag aacggtgacg 1740
aggctgagga ttttgttgaa gttcaccttc ccgatgtgca cgaacggatc tcaggagttg 1800
acttgggtct cccgaactgg gggaagtatg tattactgag tgcaggggcc ctgactgcct 1860
tgatgttgat aattttcctg atgacatgct ggagaagagt caatcgatcg gaacctacac 1920
aacacaatct cagagggaca gggagggagg tgtcagtcac tccccaaagc gggaagatca 1980
tatcttcatg ggaatcatac aagagcgggg gtgagaccgg actgtgagtc gactatttcg 2040
agtacctcta gggccgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 2100
cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 2160
atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 2220
gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 2280
tggtaaaatc gaatctagat cctc 2304
<210> 43
<211> 2328
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NUCLEOTIDE SEQUENCE OF TRANSFER PLASMID EHV-4 p455 RabG (n)EXPRESSION CASSETTE
<400> 43
actggtggta gcatatacta ccttatttat acgctccgag ctgtttttca gcatgctagc 60
acccaacgcc gagcgagagt atataactcc catcattgcc cacaagctta tgccacttat 120
tagcgtccgc tctgccgttt gcttagtcat aatatctacc gccgtttacg cagcagacgc 180
tatctgcgac acaattggat ttgcgatacc gcgcatgtgg atgtgtattt taatgagatc 240
aacctccatg aagcgtaact agggggcctc ccactgaggc actaccggct tagcagctga 300
ctaacacagt ataaaacgtg agaagaaatc agtctcatgc gccattagcg ctaggctagt 360
tagcgtggag gaccggagcg ctaccgccag cagtttcatc cgcctggtta cgggtttgtt 420
aacacctacc ggtgttttac cgctaccata ggatcggatc cgccgccacc atggtaccgg 480
ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc attgtgtttt gggaaattcc 540
ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagccc gattgacata catcacctca 600
gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac caacctgtca gggttctcct 660
acatggaact taaagttgga tacatctcag ccataaaaat gaacgggttc acttgcacag 720
gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg ttatgtcaca accacgttca 780
aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc cgcgtacaac tggaagatgg 840
ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta ccctgactac cactggcttc 900
gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc tccaagtgtg gcagatttgg 960
acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctgg cgggaagtgc tcaggagtag 1020
cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac catttggatg cccgagaatc 1080
cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag agggaagaga gcatccaaag 1140
ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata taagtcttta aaaggagcat 1200
gcaaactcaa gttatgtgga gttctcggac ttagacttat ggatggaaca tgggtctcga 1260
tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccggtca gttgatcaat ttgcacgact 1320
ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt ggtcaagaag agagaggagt 1380
gtctggatgc actagagtcc atcatgacca ccaagtcagt aagtttcaga cgtctcagtc 1440
atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac catattcaac aagaccttga 1500
tggaagccga tgctcactac aagtcagtca gaacttggaa tgagatcatc ccttcaaaag 1560
ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtaaa cggggtattt ttcaatggta 1620
taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat gcaatcatcc ctcctccagc 1680
aacatatgga gttgttggta tcctcggtta tcccccttat gcaccccctg gcagacccgt 1740
ctaccgtttt caagaacggt gacgaggctg aggattttgt tgaagttcac cttcccgatg 1800
tgcacgaacg gatctcagga gttgacttgg gtctcccgaa ctgggggaag tatgtattac 1860
tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt cctgatgaca tgctggagaa 1920
gagtcaatcg atcggaacct acacaacaca atctcagagg gacagggagg gaggtgtcag 1980
tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc atacaagagc gggggtgaga 2040
ccggactgtg agtcgactat ttcgagtacc tctagggccg cttcgagcag acatgataag 2100
atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg 2160
tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa 2220
caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg aggtttttta 2280
aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtaa aatcgaatct agatcctc 2328
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 44
ctggttttac aacccagcac ttgc 24
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 45
gactcctctc cgcttgtcct gc 22
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 46
ctggttttac aacccagcac ttgc 24
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 47
cgatgtagcc gaagttggtg cc 22

Claims (36)

1.一种重组型犬腺病毒(rCAdV)载体，其包含编码可操作连接至马疱疹病毒-4(EHV4)启动子的至少一个异源DNA的表达盒。
2.如权利要求1的rCAdV载体，其中该马疱疹病毒-4(EHV4)启动子包含4pgG600(SEQ IDNO.:29)或4pMCP600(SEQ ID NO.:30)或其互补核苷酸序列，或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其中该启动子序列导致异源抗原的表达。
3.如权利要求2的rCAdV载体，其中该启动子序列的功能片段或衍生物具有至少80％、85％序列相同性，优选90％、91％、92％、93％、94％序列相同性，更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％序列相同性。
4.如权利要求2的rCAdV载体，其中该功能片段是4pgG600(SEQ ID NO.:29)的截短或其互补核苷酸序列，优选地序列相同性为整个长度上的至少72％。
5.如权利要求2的rCAdV载体，其中该功能片段是4pMCP600(SEQ ID NO.:30)的截短或其互补核苷酸序列，优选地序列相同性为整个长度上的至少78％(或更高)。
6.如权利要求2的rCAdV载体，其中该启动子序列的功能片段或衍生物具有550个核苷酸，优选500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430个核苷酸，最优选455或430个核苷酸的长度。
7.如权利要求1的rCAdV载体，其中该马疱疹病毒-4(EHV4)启动子包含4pgG600(SEQ IDNO.:29)。
8.如权利要求1的rCAdV载体，其中该马疱疹病毒-4(EHV4)启动子包含4pMCP600(SEQID NO.:30)。
9.如权利要求1的rCAdV载体，其中该马疱疹病毒-4(EHV4)启动子包含G430(SEQ IDNO.:31)。
10.如权利要求1的rCAdV载体，其中该马疱疹病毒-4(EHV4)启动子包含gMCP455(SEQID NO.:32)。
11.如权利要求1的rCAdV载体，其被包装成感染性CAdV。
12.如权利要求1的rCAdV载体，其中该异源DNA编码选自由以下组成的群的多肽：所关注的表位、生物反应调节剂、生长因子、识别序列、治疗基因及融合蛋白。
13.如权利要求12的rCAdV载体，其中该异源DNA编码所关注的抗原性表位。
14.如权利要求13的rCAdV载体，其中该所关注的抗原性表位是犬或猫病原体的抗原。
15.如权利要求13的rCAdV载体，其中该所关注的抗原性表位是源于产食性动物病原体的抗原。
16.如权利要求14的rCAdV载体，其中该所关注的抗原性表位选自由以下组成的群：麻疹病毒(Morbillivirus)抗原、狂犬病病毒糖蛋白、猫白血病病毒(FeLV)包膜蛋白、免疫缺陷病毒抗原、细小病毒抗原、痘病毒抗原。
17.如权利要求15的rCAdV载体，其中该产食性动物病原体是源于猪、牛、马、家禽和/或羊动物。
18.如权利要求17的rCAdV载体，其中该产食性动物病原体选自由以下组成的群：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus；BVDV)、副流行性感冒-3病毒(PI-3)、感染性牛鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus；IBR)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus；BRSV)、牛疱疹病毒(Bovine Herpesvirus；BHV)、牛轮状病毒(Bovine Rotavirus；BRV)、牛肠病毒(Bovine Enterovirus；BEV)、牛冠状病毒(Bovine Coronovirus；BCV)、牛狂犬病(Bovine Rabies；BR)、牛细小病毒(BovineParvovirus；BPV)、腺病毒星状病毒(Adenovirus Astrovirus)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)(先前称为溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica))、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)(绵羊嗜组织菌(Histophilus ovis)及羔羊嗜血菌(Haemophilus agni))、放线菌属(Actinomyces)(棒状杆菌属(Corynebacterium))、化脓性放线菌(Actinomyces pyogenes)、鹦鹉衣原体(Chlamydia psittaci)、性病胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus venerealis)及胚胎胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus fetus)(先前称为肠道胚胎弯曲杆菌(Cfetusintestinalis))、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)及感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体(哈德焦普拉基特诺钩端螺旋体(Leptospira hardjoprajitno)及牛哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo-bovis))、流产布氏杆菌(Brucella abortus)、猪布氏杆菌(Brucella suis)及马尔他布氏杆菌(Brucella melitensis)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、鹦鹉衣原体、鸣疽梭状芽胞杆菌(Clostridiumchauvoei)、败血梭菌(Clostridium septicum)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、牛莫拉菌(Moraxellabovis)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；新港沙门菌(Salmonella newport)、鸟副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)、小隐胞子虫(Cryptosporidiumparvum)、人隐胞子虫(cryptosporidium hominis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、坏乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、支原体属(Mycoplasma spp)、殊异支原体(Mycoplasma dispar)及脲原体属(Ureaplasmaspp.)、胚胎三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)、疣状发癣菌(Trichophytonverrucosum)、须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、沙凯斯维发癣菌(Trichophytonsarkisovii)、犬新孢子虫(Neospora caninum)(先前称为弓形虫(Toxoplasma gondii))、二联巴贝虫(Babesia bigemina)及牛巴贝虫(Babesia bovis)、胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)(肺虫病)，及它们的组合。
19.如权利要求17的rCAdV载体，其中该产食性动物病原体选自由以下组成的群：沙门菌属(Salmonella spp.)，特别是鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)；星状病毒；轮状病毒；传染性胃肠炎病毒；短螺旋体属(Brachyspiraspp.)，特别是猪痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)、多毛短螺旋体(B.pilosicoli)；梭菌属(Clostridium spp.)，特别是艰难梭菌(C.difficile)，A型、B型及C型产气荚膜梭菌(C.perfringens)，诺维氏梭菌(C.novyi)、败血梭菌(C.septicum)、破伤风梭菌(C.tetani)；猪肠道小核糖核酸病毒；猪肠道杯状病毒；呼吸道病原体，其包括：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；支气管败血性博德氏菌(Bordetellabronchiseptica)；猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，特别是亚型1、7及14；巴斯德菌属(Pasteurella spp.)，特别是多杀巴斯德菌(P.multocida)；支原体属，特别是猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)；猪流行性感冒A病毒；PRRS病毒；猪环状病毒；猪细小病毒；伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)；猪附红细胞体(Eperythrozoonosis suis)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)，特别是鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、牛分枝杆菌(M.bovis)；猪呼吸道冠状病毒；猪冠状病毒，特别是TGEV、PEDV及德尔塔冠状病毒(delta coronavirus)；化脓性隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)；猪腺病毒；经典猪瘟(Classical swine fever)；猪巨细胞病毒；非洲猪瘟(African swine fever)；或其他病原体，其包括大肠杆菌、链球菌属(Streptococcusspp.)，特别是猪链球菌(S.suis)、豚链球菌(S.porcinus)、坏乳链球菌(S.dysgalactiae)，优选类马链球菌亚属(subsp.equisimilis)；猪布氏杆菌，特别是生物变型(biovars)1、2及3；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)，特别是澳洲钩端螺旋体(L.australis)、犬钩端螺旋体(L.canicola)、感冒伤寒性钩端螺旋体(L.grippotyphosa)、波蒙纳钩端螺旋体(L.pomona)、出血黄疸性钩端螺旋体(L.icterohaemorrhagicae)、问号钩端螺旋体(L.interrogans)、塔拉索夫钩端螺旋体(L.tarassovi)、哈德焦钩端螺旋体(L.hardjo)、塞诺钩端螺旋体(L.sejroe)；脑心肌炎病毒；血细胞凝集性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)；西尼罗病毒(West Nile virus)；呼肠孤病毒(Reovirus)；腮腺炎病毒属(Rubulavirus)；梅南高病毒(Menangle virus)；立百病毒(Nipah virus)；水疱性口炎病毒；猪水疱疹病毒；猪痘病毒；猪疱疹病毒；和猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)，及其组合。
20.一种免疫原性或疫苗组合物，其包含如权利要求1至19的重组型犬腺病毒(rCAdV)载体及医药或兽医上可接受的载剂或稀释剂。
21.如权利要求20的免疫原性或疫苗组合物，其中该载剂适于经口、经皮内、经肌内或经鼻内施用。
22.一种制备用于降低与感染相关或由感染造成的一或多种临床体征的发病率或严重性的免疫原性组合物或疫苗的方法，其包含以下步骤：
a.将如权利要求1至19的重组rCAdV载体引入宿主细胞中；
b.在适宜条件下培育经感染细胞；
c.收获经感染细胞和/或载体和/或病毒组分；
d.任选纯化步骤(c)的收获物；和
e.将该收获物与医药上可接受的载剂混合。
23.一种减轻或预防动物中由病原体的感染造成的临床体征或疾病或用于预防或治疗动物中的病原体感染的方法，其包含向所述动物施用治疗有效量的权利要求20的免疫原性组合物或疫苗，优选用于。
24.如权利要求23的方法，其中该免疫原性组合物施用一次。
25.如权利要求23的方法，其中该免疫原性组合物以两个剂量施用。
26.如权利要求23的方法，其中该免疫原性组合物经口、经皮内、经肌内或经鼻内施用。
27.如权利要求23的方法，其中该免疫原性合物保护免于同源和/或异源病毒攻击。
28.一种使动物免疫对抗该动物由病原体造成的临床疾病的方法，所述方法包括向所述动物施用如权利要求20的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物或疫苗不会造成感染的临床体征，但能诱导免疫反应，使该动物免疫对抗该病原体的病原形式。
29.如权利要求28的方法，其中该免疫原性组合物施用一次。
30.如权利要求29的方法，其中该免疫原性组合物以两个剂量施用。
31.如权利要求28的方法，其中该免疫原性组合物经口、经皮内、经肌内或经鼻内施用。
32.如权利要求28的方法，其中该免疫原性合物保护免于同源和/或异源病毒攻击。
33.一种用于对动物进行疫苗接种以在动物中抵抗与病原体相关的疾病和/或降低一或多种与病原体相关或由病原体造成的临床体征的发病率或严重性的试剂盒，其包含：
a.可向该动物施用疫苗的分配器；和
b.如权利要求20的免疫原性组合物或疫苗，和
c.任选的说明书插页。
34.一种真核宿主细胞系，其表达如权利要求1至19的重组型2型犬腺病毒(rCAdV2)。
35.如权利要求34的真核宿主细胞系，其中该宿主细胞系是选自由以下组成的群的哺乳动物细胞系或昆虫细胞系：PK/WRL细胞系、RK13细胞系、MDBK细胞系、ST细胞系、AI-ST细胞系、VERO细胞系、Sf9细胞系、Sf21、Sf+细胞系、MDCK细胞系，和/或其衍生物。
36.一种原核宿主细胞系，其表达如权利要求1至19的重组型2型犬腺病毒(rCAdV2)。
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