EA044953B1 - Векторы аденовируса собачьих - Google Patents
Векторы аденовируса собачьих Download PDFInfo
- Publication number
- EA044953B1 EA044953B1 EA201990718 EA044953B1 EA 044953 B1 EA044953 B1 EA 044953B1 EA 201990718 EA201990718 EA 201990718 EA 044953 B1 EA044953 B1 EA 044953B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rcadv
- virus
- sequence
- cpv
- seq
- Prior art date
Links
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 title claims description 138
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 119
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 184
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 136
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 107
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 89
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 81
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 81
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 81
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 51
- 241000701089 Equid alphaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 35
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 34
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 34
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 33
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims description 29
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 28
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 28
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 241000701081 Equid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 10
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 9
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 8
- 241000282324 Felis Species 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 claims description 7
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 claims description 7
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 7
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 6
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 101000823719 Nicotiana tabacum Putative uncharacterized protein ycf15 Proteins 0.000 claims 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims 2
- 101710181600 Glycoprotein gp2 Proteins 0.000 claims 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 claims 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims 1
- 101710186352 Probable membrane antigen 3 Proteins 0.000 claims 1
- 101710181078 Probable membrane antigen 75 Proteins 0.000 claims 1
- 102100040307 Protein FAM3B Human genes 0.000 claims 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710178472 Tegument protein Proteins 0.000 claims 1
- 101710134973 Uncharacterized 9.7 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 180
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 134
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 128
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 107
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 106
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 76
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 64
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 58
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 49
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 41
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 36
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 36
- 241000701114 Canine adenovirus 2 Species 0.000 description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 32
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 32
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 28
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 28
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 28
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 24
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 24
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 23
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 23
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 22
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 21
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 21
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 20
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 18
- 241000894007 species Species 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 17
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 17
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Chemical group 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 14
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 13
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 13
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 13
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 12
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 8
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 8
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 8
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 8
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- -1 d3) Species 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 7
- 230000027950 fever generation Effects 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 6
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 6
- 241000606831 Histophilus somni Species 0.000 description 6
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 241000589926 Leptospira interrogans serovar Hardjo Species 0.000 description 6
- 241001518154 Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa Species 0.000 description 6
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 241000266847 Mephitidae Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 6
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 6
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 6
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 6
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 6
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 5
- 241000701922 Bovine parvovirus Species 0.000 description 5
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 5
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 5
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 5
- XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecanoic acid Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 description 4
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 description 4
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 4
- 101150104494 CAV1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 description 4
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 4
- 241000193466 Clostridium septicum Species 0.000 description 4
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- 241001275954 Cortinarius caperatus Species 0.000 description 4
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 4
- 241000709691 Enterovirus E Species 0.000 description 4
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 4
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 4
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 4
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 4
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 4
- 241000588622 Moraxella bovis Species 0.000 description 4
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 4
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 4
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 4
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 241000700587 Alphaherpesvirinae Species 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 241001461743 Deltacoronavirus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 241000186064 Trueperella pyogenes Species 0.000 description 3
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 2
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000223840 Babesia bigemina Species 0.000 description 2
- 241000223838 Babesia bovis Species 0.000 description 2
- 241000120506 Bluetongue virus Species 0.000 description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000712005 Bovine respirovirus 3 Species 0.000 description 2
- 241001148534 Brachyspira Species 0.000 description 2
- 241000589893 Brachyspira hyodysenteriae Species 0.000 description 2
- 241000510930 Brachyspira pilosicoli Species 0.000 description 2
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 2
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 description 2
- 241001453279 Campylobacter fetus subsp. fetus Species 0.000 description 2
- 241001453248 Campylobacter fetus subsp. venerealis Species 0.000 description 2
- 241000701101 Canine adenovirus 1 Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 2
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 241000206044 Clostridium chauvoei Species 0.000 description 2
- 241001656807 Clostridium haemolyticum Species 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241001147667 Dictyocaulus Species 0.000 description 2
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 241000230501 Equine herpesvirus sp. Species 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 241000186811 Erysipelothrix Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000701915 Feline panleukopenia virus Species 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 101710183861 Hexon-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical class CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241001518163 Leptospira interrogans serovar Hardjo-bovis Species 0.000 description 2
- 241001518166 Leptospira interrogans serovar Hardjo-prajitno Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 244000247487 Lophocereus schottii Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001643857 Menangle virus Species 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710116852 Molybdenum cofactor sulfurase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 2
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 2
- 241000006377 Mycoplasma dispar Species 0.000 description 2
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 2
- 241000202938 Mycoplasma hyorhinis Species 0.000 description 2
- 206010028470 Mycoplasma infections Diseases 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- 241001147662 Neospora caninum Species 0.000 description 2
- 241000526636 Nipah henipavirus Species 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000009620 Orthomyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000188845 Porcine adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 description 2
- 241000156302 Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus Species 0.000 description 2
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 2
- 241000711493 Porcine respiratory coronavirus Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 241001533467 Rubulavirus Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241001546666 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000191982 Staphylococcus hyicus Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 2
- 241000194053 Streptococcus porcinus Species 0.000 description 2
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 2
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 description 2
- 241001485053 Suid betaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 2
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 2
- 241001045770 Trichophyton mentagrophytes Species 0.000 description 2
- 241000893966 Trichophyton verrucosum Species 0.000 description 2
- 241001058196 Tritrichomonas foetus Species 0.000 description 2
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 241000701067 Varicellovirus Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 2
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 208000027503 bloody stool Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 2
- 229940038698 brucella melitensis Drugs 0.000 description 2
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC([O-])=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 2
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 2
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 2
- 229940115922 streptococcus uberis Drugs 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 229940055035 trichophyton verrucosum Drugs 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTIXUSNHAKOJBX-UHFFFAOYSA-N 1-(aziridin-1-yl)ethanone Chemical compound CC(=O)N1CC1 OTIXUSNHAKOJBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 12-hydroxyoctadecanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)CCCCCCCCCCC(O)=O ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-2-(prop-2-enoxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)(CO)COCC=C RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxyoctadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 0.000 description 1
- JVTIXNMXDLQEJE-UHFFFAOYSA-N 2-decanoyloxypropyl decanoate 2-octanoyloxypropyl octanoate Chemical compound C(CCCCCCC)(=O)OCC(C)OC(CCCCCCC)=O.C(=O)(CCCCCCCCC)OCC(C)OC(=O)CCCCCCCCC JVTIXNMXDLQEJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241001455214 Acinonyx jubatus Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100407073 Caenorhabditis elegans parp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000824799 Canis lupus dingo Species 0.000 description 1
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000271560 Casuariidae Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241001140928 Clostridium sordelli Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 208000006069 Corneal Opacity Diseases 0.000 description 1
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000006271 Discosoma sp. Species 0.000 description 1
- 241000271559 Dromaiidae Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical class OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 241001670226 Equus caballus x asinus Species 0.000 description 1
- 241000283070 Equus zebra Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 101000792446 Euglena longa Uncharacterized 8.7 kDa protein in rpl22-rpl23 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000002613 Feline Panleukopenia Diseases 0.000 description 1
- 241000725579 Feline coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000287227 Fringillidae Species 0.000 description 1
- 101100447481 Fusarium sp g430 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701046 Gammaherpesvirinae Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000282375 Herpestidae Species 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000802734 Homo sapiens eIF5-mimic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 101001082397 Human adenovirus B serotype 3 Hexon-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101100450591 Human adenovirus B serotype 3 PVIII gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000282596 Hylobatidae Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000701244 Mastadenovirus Species 0.000 description 1
- 241000282346 Meles meles Species 0.000 description 1
- 241001184725 Melogale moschata Species 0.000 description 1
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100353036 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pme-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100442582 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) spe-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 101150068701 PVIII gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193465 Paeniclostridium sordellii Species 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 208000008071 Parvoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010057343 Parvovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710137396 Protein ORF1 Proteins 0.000 description 1
- 101710132845 Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 101710188313 Protein U Proteins 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 101001120093 Pseudoalteromonas phage PM2 Protein P8 Proteins 0.000 description 1
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940124861 Rabies virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M Saccharin sodium Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)[N-]S(=O)(=O)C2=C1 WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100545229 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ZDS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 101710169459 Secreted protein ORF2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000168914 Strepsirrhini Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 241000288942 Tarsiidae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 206010044314 Tracheobronchitis Diseases 0.000 description 1
- 101710132316 Transactivation protein Proteins 0.000 description 1
- 101000768114 Triticum aestivum Uncharacterized protein ycf70 Proteins 0.000 description 1
- 101100167209 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) CHS8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl] (4ar,5r,6as,6br,9s,10s,12ar)-10-[(2r,3r,4s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)CO[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1OC(=O)[C@]12CCC(C)(C)CC1C1=CCC3[C@@]([C@@]1(C[C@H]2O)C)(C)CCC1[C@]3(C)CC[C@@H]([C@@]1(C)C=O)O[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO2)O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)C(=O)NCCCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@](O)(CO)[C@H]1O NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940086737 allyl sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125687 antiparasitic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 231100000269 corneal opacity Toxicity 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 102100035859 eIF5-mimic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000012953 feeding on blood of other organism Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003976 glyceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000011 group IA salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000011997 immunoflourescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N n-decene Chemical class CCCCCCCCC=C AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000002888 oleic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009340 pathogen transmission Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000006675 polyamination Effects 0.000 description 1
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 229940010310 propylene glycol dioleate Drugs 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000001711 protein immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- WBHHMMIMDMUBKC-XLNAKTSKSA-N ricinelaidic acid Chemical compound CCCCCC[C@@H](O)C\C=C\CCCCCCCC(O)=O WBHHMMIMDMUBKC-XLNAKTSKSA-N 0.000 description 1
- FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N ricinoleic acid Natural products CCCCCCC(O[Si](C)(C)C)CC=CCCCCCCCC(=O)OC FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007919 viral pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000008957 viral persistence Effects 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Description
Перечень последовательностей
Изобретение содержит перечень последовательностей согласно Своду федеральных правил 37
C.F.R. 1.821-1.825. Перечень последовательностей, прилагаемый к настоящему изобретению, таким образом, включается путем ссылки в его полном объеме.
Уровень техники A. Область изобретения
Настоящее изобретение касается области вакцин (векторных), в частности, рекомбинантного аденовируса собачьих 2-го типа, в частности, с улучшенными экспрессионными кассетами, пригодными для экспрессии антигенов-мишеней из таких векторных вакцин.
B. Описание существующего уровня техники
Аденовирусы широко исследовались как векторы для рекомбинантных вакцин (см. обзор Вт, Т., S. Salinas, and E.J. Kremer, An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses, 2010. 2(9): p. 213453). Существует немало информации, накопленной об аденовирусах за последние пару десятилетий, в частности, в области генной терапии и разработки вакцин. Несколько особенностей аденовирусов делают их привлекательными в качестве средств переноса генов: (1) структура аденовирусного генома хорошо охарактеризована; (2) большие части вирусных ДНК могут быть замещены инородными последовательностями; (3) рекомбинантные варианты являются относительно стойкими, (4) рекомбинантный вирус может выращиваться с высоким титром; (5) с аденовирусом не связана злокачественность у человека; и (6) применение аттенуированного аденовируса дикого типа в качестве вакцины безопасно.
Известными из публикаций мишенями для эффективных вакцин на основе векторов CAV-2 являются бешенство котов (Hu, R.L., et al., Experimental immunization of cats with a recombinant rabies-canine adenovirus vaccine elicits a long-lasting neutralizing antibody response against rabies. Vaccine, 2007. 25(29): p. 5301 - 7), собак (Hu, R., et al., Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein. Microbes Infect, 2006. 8(4): p. 1090-7), мышей (Li, J., et al., A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice. Virology. Virology, 2006. 356(1-2): p. 147-54), енотов (Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27(51): p. 7194-7), овец (Bouet-Cararo, C., et al., Canine adenoviruses elicit both humoral and cellmediated immune responses against rabies following immunization of sheep. Vaccine, 2011. 29(6): p. 1304 10), скунсов (Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27(51): p. 7194 - 7) и свиней (Liu, Y., et al., Efficacy and safety of a live canine adenovirus-vectored rabies virus vaccine in swine. Vaccine, 2008. 26(42): p. 5368-72), собачья чума (Fischer, L., et al., Vaccination of puppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccine protects against a canine distemper virus challenge. Vaccine, 2002. 20(29-30): p. 3485-97) и панлейкопения кошачьих (Yang, S., et al., Complete protection of cats against feline panleukopenia virus challenge by a recombinant canine adenovirus type 2 expressing VP2 from FPV. Vaccine, 2008. 26(11): p. 1482-7). CAV-2 также имеет потенциал для применения в качестве пероральной вакцины, на что указывает эффективность при пероральной вакцинации собак (Zhang, S., et al., Oral vaccination of dogs (Canis familiaris) with baits containing the recombinant rabies-canine adenovirus type-2 vaccine confers long-lasting immunity against rabies. Vaccine, 2008. 26(3): p. 345-50), енотов и скунсов от бешенства (Henderson, H., et al., 2009, Zhao et al. 2014. Experimental Oral Immunization of Ferret Badgers (Melogale moschata) with a Recombinant Canine Adenovirus Vaccine CAV-2-E3A-RGP and an Attenuated Rabies Virus SRV9. J. Wildlife Diseases 50(2): 374377.). Интересно, что векторы на основе репликационно-компетентного аденовируса продемонстрировали свою эффективность, несмотря на пассивный иммунитет против вектора (Gallichan, W.S., et al., Mucosal immunization with a recombinant adenovirus vector induces local and systemic immunity and protection from herpes simplex virus. Adv Exp Med Biol, 1995. 371B: p. 1581-5; Lubeck, M.D., et al., Immunogenicity of recombinant adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees following intranasal administration. AIDS Res Hum Retroviruses. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994. 10(11): p. 1443 - 9; Wang, Y., et al., The use of an E1-deleted, replication-defective adenovirus recombinant expressing the rabies virus glycoprotein for early vaccination of mice against rabies virus. J Virol, 1997. 71(5): p. 3677-8)., указывая на то, что они могут преодолевать иммунитет, передающийся с материнской стороны (Рарр, Z., L.A. Babiuk, and M.E. Baca-Estrada, The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine, 1999. 17 (7-8): p. 933-43; Babiuk, L.A. and S.K. Tikoo, Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. J Biotechnol, 2000. 83 (1-2): p. 105-13). Это было подтверждено на примере собачьей чумы в публикации Fischer et al. (2002). Однако уже существующие антитела могут препятствовать применению перорального пути иммунизации (Wright, N., et al., High prevalence of antibodies against canine adenovirus (CAV) type 2 in domestic dog populations in South Africa precludes the use of CAV-based recombinant rabies vaccines. Vaccine, 2013. 31(38): p. 4177-82).
Аденовирус собачьих 2-го типа (CAV-2) обычно вызывает инфекцию дыхательных путей, от незаметной до умеренной, и считается одной из причин обычного распространенного инфекционного трахеобронхита (Buonavoglia, С. and V. Martella, Canine respiratory viruses. Vet Res, 2007. 38(2): p. 355-73;
- 1 044953
Tham, K.M., G.W. Horner, and R. Hunter, Isolation and identification of canine adenovirus type-2 from the upper respiratory tract of a dog. N Z Vet J, 1998. 46(3): p. 102-5). CAV-2 также был связан со случаями энтерита (Hamelin, С, p. Jouvenne, and R. Assaf, Association of a type-2 canine adenovirus with an outbreak of diarrheal disease among a large dog congregation. J Diarrhoeal Dis Res, 1985. 3(2): p. 84-7; Macartney, L., H.M. Cavanagh, and N. Spibey, Isolation of canine adenovirus-2 from the feces of dogs with enteric disease and its unambiguous typing by restriction endonuclease mapping. Res Vet Sci, 1988. 44(1): p. 9-14) и был выявлен d головном мозге собак с неврологическими признаками (Benetka, V., et al., Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec, 2006. 158(3): p. 91-4.). Несколько вакцин на основе CAV2 были разработаны и широко применялись во всем мире для вакцинации щенков и взрослых собак. Модифицированные живые вакцины CAV-2 оказались высокоэффективными в уменьшении циркуляции CAV-2 в популяции собак (Buonavoglia et al., 2007). У собак, вакцинированных CAV-2, вырабатывается иммунитет как к CAV-1, так и к CAV-2 (Appel, M., et al., Pathogenicity of low-virulence strains of two canine adenovirus types. Am J Vet Res, 1973. 34(4): p. 543-50; Appel, M., L.E. Carmichael, and D.S. Robson, Canine adenovirus type 2-induced immunity to two canine adenoviruses in pups with maternal antibody. Am J Vet Res, 1975. 36(08): p. 1199 - 202). Применение CAV-2 для иммунизации щенков против обоих типов аденовируса собачьих устраняло связанные с безопасностью побочные эффекты, которые случались при применении вакцин CAV-1 (Bittle, J.L., W.A. Grant, and F.W. Scott, Canine and feline immunization guidelines--1982. J Am Vet Med Assoc, 1982. 181(4): p. 332 - 5; Curtis, R. and K.C. Barnett, The 'blue eye' phenomenon. Vet Rec, 1983. 112(15): p. 347 - 53). Видимая безопасность CAV2 как вакцины была подтверждена отсутствием вызванных вакциной и связанных с вакциной осложнений у собак и других видов животных, включая человека, на протяжении 30 лет применения. Кроме того, результаты полевых серологических исследований показывают, что многие дикие животные (лисицы, еноты, скунсы и мангусты) бессимптомно подвергаются действию CAV2 или связанной с антигеном вирусной инфекции (Summer et al., 1988). Таким образом, вакцинный штамм аденовируса собачьих 2-го серотипа (CAV2) представляет уникальный пример безопасного способного к репликации, ограниченного хозяином вируса, который рассматривался с точки зрения получения эффективной вакцины-кандидата на основе вектора для вакцинации, в частности, собак.
Таким образом, аденовирус собачьих имеет много идеальных характеристик для разработки векторных вирусных вакцин. Кроме его безопасного и эффективного применения, как подробно описано выше, он обеспечивает важные особенности, включая: гуморальную и клеточную иммунные реакции на вакцину, которые могут требовать вирусные патогены-мишени для защиты; он имеет широкий диапазон потенциальных хозяев и тропизм к ткани; он лишен оболочки и, таким образом, может быть более стойким, чем вирусы в оболочке; он может возрастать до высоких титров, и существуют хорошо отработанные имеющиеся протоколы производства и анализа; он может применяться и как репликационнокомпетентный, и как дефицитный вирус; и он может нести относительно большое количество гетерологических ДНК, в частности, в случае если CAdV является выпотрошенным, может быть вставлено ~ 30 т. о. экзогенной ДНК, однако вирус должен быть спасен в присутствии хелперного вируса.
Fisher et al. в Патенте США № 6,090,393 (включенном в это описание путем ссылки) описывали применение рекомбинантного CAd2, который имеет экзогенную ДНК, вставленную в несущественные участки или части в Е1, Е3 и/или правый конец генома между правым ITR и транскрипционной единицей Е4. Участок Е3 использовали для генерации рекомбинантного вектора, поскольку часть этого участка была распознана как не являющаяся незаменимой, как in vitro, так и in vivo, для образования инфекционного вируса (например, на основе данных, полученных от HAV и Ad3 крупного рогатого скота), а следовательно, определяли как объект для инсерции. Векторы аденовируса, в которых удален участок Е1, не способны к репликации и имеют другие проблемы, а следовательно, являются нежелательными для применения.
Fisher et al. также раскрыли применение усеченных промоторов, полученных от мышиного цитомегаловируса или человеческого цитомегаловируса MCMV или HCMV, например, HCMV-IE или MCMVIE. Промотор hCMV-IE был выбран Fisher et al. как относящийся к существующему уровню техники, и как перспективный выше расположенный регуляторный участок, из чего был сделан вывод, что он связан с самым высоким уровнем и самой длительной стойкостью экспрессии рекомбинантного белка в культуре тканей. Промотор hCMV-IE также считали четким преимуществом, поскольку было выявлено, что он функционирует почти в каждой испытуемой линии клеток. Стимулом к нацеленным делециям частей промотора, такого, как HCMV-IE, было уменьшение размера промотора, а следовательно, преодоление ограничений упаковки аденовирусов. Fisher et al. конкретно раскрывают активный фрагмент HCMV-IE, имеющий размер 91 п. о., или активный фрагмент MCMV-IE, имеющий размер 466 п. о., т.е. усеченный транскрипционно активный HCMV-IE с приблизительно 91 п. о. или усеченный транскрипционно активный MCMV-IE с приблизительно 466 п. о.
Хотя Fisher et al. описывают построение разных рекомбинантных векторов CAd2, например, экспрессионной кассеты, кодирующей полинуклеотид для гемагглютинина (НА) CDV или слитый (F) белок, функционально связанный с промотором вируса вакцины Н6 (v6), Fisher et al. не продемонстрировали стойкой экспрессии антигена CDV из любого из построенных векторов CAd2. Вместо этого в патенте
- 2 044953
Fisher '393 раскрываются общие ограничения размера нуклеотидов в местах инсерции Е3 как сменные для стойкой экспрессии, и при этом не наблюдается и/или не рассматривается разнообразие возможностей в выборе промоторов как фактор, способствующий вирусному спасению или экспрессии гетерологических белков в инфицированных клетках. В дополнительном исследовании Fisher et al. 2002 (Вакцинация щенков, рожденных устойчивыми к заболеванию самками, вакциной на основе аденовируса собачьих защищает от инфицирования вирусом собачьей чумы Vaccine 20 (2002) 3485 - 3497), они сообщали о том, что впервые были построены и охарактеризованы два рекомбинантных вируса CAd2, в которых экспрессионные кассеты CDV НА и F были вставлены в участок Е3 вектора, стимулированного фрагментом с 91 п. о. промотора hCMV IE. Они также заменили hCMVIE 5'UTR на hAd2 TPL для содействия экспрессии трансгенного гена после начала репликации CAV2. Вместе стратегия клонирования была сосредоточена на минимизации размера экспрессионных кассет для кДНК CDV НА и F. Кроме того, в исследовании были детально рассмотрены вопросы потенциального вирусного восстановления из-за специфического места инсерции, размера делеции, размера инсерции и ориентации инсерции. В этом исследовании они смогли восстановить стойкие клоны, демонстрирующие правильную инсерцию, и смогли осуществить анализ на вызывание иммунитета после иммунизации. После единственного интраназального введения смеси rCAd2, кодирующей целый CDV НА и vCA17, серонегативным щенкам, наблюдали очень высокие системные титры CDV SN (>2,0 log10) и почти полную защиту от инфицирования. Однако, поскольку щенков инфицировали смесью двух векторов, которые содержали антигены НА и F, авторы не смогли прийти к выводу, только один или оба вектора экспрессируют трансгены CDV у иммунизированных собак, а также не смогли убедительно продемонстрировать стойкую экспрессию трансгена в отдельных популяциях клеток.
Описанные авторами эксперименты демонстрируют, что стойкая экспрессия трансгена из кассет, вставленных в геномный локус Е3, не наблюдалась в клетках, инфицированных способными к репликации стимулированными CMV5 rCAdV-2 кассетами экспрессии трансгена, согласно измерениям путем выявления белков (IFA, проточная цитометрия, дот-блот анализ). Фактически приведенные авторами эксперименты демонстрируют, что векторы rCAdV-2 с экспрессионными кассетами с CMV5 промотором не могут быть спасены, поэтому экспрессия белка не может быть измерена в инфицированных клетках. И это несмотря на то, что in vitro временные инфекции теми же трансферными плазмидами, которые содержат эти экспрессионные кассеты, продемонстрировали, что активность CMV5 промотора больше, чем активность CMVie промотора относительно уровня экспрессии белка. Таким образом, отсутствие стойкой, воспроизводимой экспрессии трансгена и/или вирусное спасение делает полезность стимулированных CMV экспрессионных кассет в векторе CAd2, в частности, в хозяевах, в которых репликация не происходит, очень сомнительной.
Итак, хотя чрезвычайно мощные и нетканеспецифичные IE промоторы-энхансеры HCMV и MCMV (цитомегаловирусов мышей) могут быть пригодными для разных исследований и для ограниченной пригодности в видах-мишенях, в которых реплицируется CAd2, они не рассматривались как эффективные и/или надежные промоторы для построения векторных вакцин CAd2 для применения в других видах. Необходима была замена промоторов CMV на эффективные промоторы, которые способны стимулировать стойкую, надежную, воспроизводимую экспрессию нужных антигенных эпитопов в контексте рекомбинантного вируса CAd2 для производства вакцин для применения в разных видах.
Краткое описание изобретения
С целью избежания любых подобных препятствий настоящее изобретение обеспечивает новые регуляторные нуклеиновокислотные последовательности/промоторные последовательности для экспрессии трансгена, в частности, в контексте векторных вакцин, в частности, в контексте вектора CAdV-2.
Таким образом, решение вышеописанной технической проблемы достигается благодаря описанию и вариантам осуществления, охарактеризованным в формуле изобретения, и изобретение в его разных аспектах осуществляется согласно формуле изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает новые регуляторные нуклеиновокислотные последовательности/промоторные последовательности для экспрессии трансгена, иммуногенные композиции, вакцины и связанные с ними способы, позволяющие преодолевать недостатки существующего уровня техники.
Традиционные промоторные последовательности, широко применяющиеся для стимуляции высокого уровня экспрессии трансгена в разных векторных системах, включая герпесвирусы, являются промоторными последовательностями предранних генов HCMV (Boshart et al., 1985; Foecking and Hofstetter 1986) или цитомегаловирусов мышей (MCMV; Dorsch-Hasler et al., 1985), или сильных промоторов онкогенных вирусов, таких, как обезьяний вирус 40 (SV40), например, промотор большого Т-Антигена SV40, и многие другие (например, Kim et al., 1990). Таким сильным промоторам специалистами в области клеток отдавалось предпочтение, поскольку они функционируют автономно в разных системах культур клеток. В контексте вирусной репликации инфицированная клетка трансформируется вирусными функциями в механизм репликации вирусов.
Однако для улучшения векторных вакцин ни один из описанных выше автономных сильных промоторов не рассматривается как подходящий выбор; в частности, производные от CMV промоторы не были эффективными, воспроизводимыми стимуляторами экспрессии трансгена у рекомбинантных векторных
- 3 044953 вакцин CAd2.
Таким образом, существует потребность в обеспечении промоторов с высокой активностью в контексте вирусной репликации, таких, как промоторы β- и γ-генов, EHV-1. Настоящее изобретение обеспечивает новые альтернативные промоторные последовательности, производные от известной из публикации геномной последовательности EHV-4 (лошадиный герпесвирус 4, штамм NS80567, полный геном, номер доступа AF030027, версия AF030027.1 GL2605950, дата 21 мая 1998 г.). Идентичность последовательностей генов с генами EHV-1 составляет от 55 до 84%.
Настоящее изобретение обеспечивает два новых промотора: 4pg600 и 4рМСР600 и их производные меньшей длины, которые продемонстрировали свою функциональность после временной инфекции в культурах клеток или на фоне репликации rCAdV-BAC в культурах клеток.
Настоящее изобретение обеспечивает два новых промотора: р430 и р455, которые продемонстрировали свою функциональность на фоне репликации rCAd2 в культурах клеток, а для р455 - также в организме животных (свиней). Уровень активности двух новых промоторов во время цикла вирусной репликации оказывается очень похожим, как можно сделать вывод из in vitro кинетических экспериментов промоторов.
Новые промоторные последовательности, которые обеспечиваются настоящим изобретением, демонстрируют свою эффективность на фоне вектора аденовируса собачьих (CAdV).
Как обсуждалось выше, спасение рекомбинантного CAdV не достигалось, когда промоторная последовательность CMV5 присутствовала в экспрессионных кассетах, расположенных в участке ЕЗ. В этом проявляется специфичность к последовательности, поскольку размер экспрессионных кассет не превышает наблюдаемых ограничений размера экспериментального генома. В отличие от этого, новые производные от EHV-4 промоторные последовательности согласно настоящему изобретению, такие как р430 и р455, не только способствуют экспрессии трансгена, но и не вмешиваются в ключевой этап вирусного спасения и, таким образом, имеют преимущества перед промоторными последовательностями существующего уровня техники.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение решает проблемы, характерные для существующего уровня техники, и обеспечивает явный прогресс в существующем уровне техники.
В целом настоящее изобретение обеспечивает вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV), включающий экспрессионную кассету, кодирующую по крайней мере одну гетерологическую ДНК, функционально связанную с промотором герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных.
Настоящее изобретение также касается вектора rCAdV, в котором промотор герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных включает 4pg600 (SEQ ID NO.: 29) или 4рМСР600 (SEQ ID NO.: 30) либо их комплементарные нуклеотидные последовательности, или их функциональный фрагмент, или функциональную производную, или комплементарные нуклеотидные последовательности, причем вышеупомянутая промоторная последовательность ведет к экспрессии гетерологического антигена.
В конкретном аспекте функциональный фрагмент или производная промоторной последовательности имеет по крайней мере 80, 85% идентичности последовательностей, в предпочтительном варианте 90, 91, 92, 93, 94% идентичности последовательностей, в более предпочтительном варианте - 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% идентичности последовательностей.
В конкретном аспекте функциональный фрагмент является усечением 4pg600 (SEQ ID NO.: 29) или его комплементарной нуклеотидной последовательностью, в предпочтительном варианте идентичность последовательностей составляет по крайней мере 72% по всей длине.
В конкретном аспекте функциональный фрагмент является усечением 4рМСР600 (SEQ ID NO.: 30) или его комплементарной нуклеотидной последовательностью, в предпочтительном варианте идентичность последовательностей составляет по крайней мере 78% по всей длине (или больше).
В еще одном конкретном аспекте последовательность функционального фрагмента или производной промоторов 4pg600 (SEQ ID NO.: 29) или 4рМСР600 (SEQ ID NO.: 30) имеет длину 550 нуклеотидов, в предпочтительном варианте 500, 490, 480, 470, 460, 455, 450, 445, 440, 435, 434, 433, 432, 431, 430 нуклеотидов, в наиболее предпочтительном варианте - 455 или 430 нуклеотидов.
В еще одном конкретном аспекте вектор rCAdV включает промотор герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных, включающий 4pg600 (SEQ ID NO.: 29).
В еще одном конкретном аспекте вектор rCAdV включает промотор герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных, включающий 4рМСР600 (SEQ ID NO.: 30).
В еще одном конкретном аспекте вектор rCAdV включает промотор герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных, включающий 4р430 (SEQ ID NO.: 31).
В еще одном конкретном аспекте вектор rCAdV включает промотор герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных, включающий gMCP455 (SEQ ID NO.: 32).
В конкретном аспекте изобретения вектор rCAdV упакован как инфекционный CAdV.
В другом варианте осуществления изобретения вектор rCAdV включает гетерологическую ДНК, кодирующую полипептид, выбранный из группы, к которой относятся нужный эпитоп, модулятор биологического ответа, фактор роста, последовательность распознавания, терапевтический ген и слитый
- 4 044953 белок.
В конкретном аспекте изобретения гетерологическая ДНК кодирует нужный антигенный эпитоп.
В другом варианте осуществления изобретения нужный антигенный эпитоп является антигеном патогена собачьих или кошачьих.
В конкретном аспекте изобретения нужный антигенный эпитоп является антигеном, производным от патогена предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного, конкретнее - патоген предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного взят из организма свиньи, крупного рогатого скота, лошади, домашней птицы и/или овцы; конкретнее, патоген предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного выбран из группы, к которой относятся: вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV), вирус парагриппа-3 (PI-3), вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), респираторносинцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), герпесвирус крупного рогатого скота (BHV), ротавирус крупного рогатого скота (BRV), энтеровирус крупного рогатого скота (BEV), коронавирус крупного рогатого скота (BCV), бешенство крупного рогатого скота (BR), парвовирус крупного рогатого скота (ВР), аденовирус астровирус, Mannheimia haemolytica (старое название Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus (Histophilus ovis и Haemophilus agni), актиномицет (Corynebacterium), пиогенный актиномицет, Chlamydia psittaci, Campylobacter fetus venerealis и Campylobacter fetus fetus (старое название С fetus intestinalis), Leptospira interrogans, Leptospira hardjo, Leptospira Pomona и Leptospira grippotyphosa, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo (Leptospira hardjoprajitno и Leptospira hardjo-bovis), Brucella abortus, Brucella suis и Brucella melitensis, Listeria monocytogenes, Chlamydia psittaci, Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Moraxella bovis, виды Klebsiella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium; Salmonella newport, Mycobacterium avium paratuberculosis, Cryptsporidium parvum, Cryptsporidium hominis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, виды Mycoplasma, Mycoplasma dispar и виды Ureaplasma, Tritrichomonas foetus, Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton sarkisovii, Neospora caninum (старое название Toxoplasma gondii), Babesia bigemina и Babesia bovis, Dictyocaulus viviparous (легочная нематода) и их комбинации.
В конкретном аспекте изобретения нужный антигенный эпитоп является антигеном, производным от патогена предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного, конкретнее - патоген предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного взят из организма свиньи, крупного рогатого скота, лошади, домашней птицы и/или овец; еще конкретнее - патоген предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного выбран из группы, к которой относятся: виды Salmonella, в частности, S. typhimurium S. choleraesuis; астровирусы; ротавирус; вирус трансмиссивного гастроэнтерита; виды Brachyspira, в частности, В. hyodysenteriae, В. pilosicoli; виды Clostridium spp., в частности, С. difficile, С. perfringens типов А, В и С, С. novyi, С. septicum, С. tetani; кишечные пиконавирусы свиней; кишечные калицивирусы свиней; респираторные патогены, к которым относятся: Actinobacillus pleuropneumonia; Bordetella bronchiseptica; Erysipelothrix rhsiopathiae; Haemophilus parasuis, в частности, подтипов 1, 7 и 14; Pasteurella spp., в частности, р. multocida; виды Mycoplasma spp., в частности, М. hyopneumoniae, M. hyorhinis; вирус свиного гриппа А; вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS); цирковирус свиней; парвовирус свиней; вирус псевдобешенства; Eperythrozoonosis suis, виды Mycobacterium., в частности, М. avium, M. intracellulare, M. bovis; респираторный коронавирус свиней; коронавирус свиней, в частности, вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) и дельтакоронавирус; Arcanobacterium pyogenes; аденовирус свиней; классическая чума свиней; цитомегаловирусы свиней; африканская чума свиней; или другие патогены, к которым относятся Escherichia coli, виды Streptococcus, в частности, S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, в предпочтительном варианте подвид equisimilis; Brucella suis, в частности, биовары 1, 2 и 3; виды Leptospira, в частности, L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe; вирус энцефаломиокардита; вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита; вирус японского энцефалита; вирус лихорадки Западного Нила; реовирус; рубулавирус; вирус Менангле; вирус Нипах; вирус везикулярного стоматита; вирус везикулярной экзантемы свиней; поксвирус свиней; вирус герпеса свиней; и Staphylococcus hyicus, и их комбинации.
В еще одном варианте осуществления изобретения нужный антигенный эпитоп выбран из группы, к которой относятся антиген Morbillivirus, гликопротеин бешенства, белок оболочки вируса лейкоза кошачьих (FeLV), антиген вируса иммунодефицита, антиген парвовируса, антиген поксвируса.
Настоящее изобретение также касается иммуногенной или вакцинной композиции, включающей вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления и приемлемый с фармацевтической или ветеринарной точки зрения носитель или разбавитель.
В другом аспекте иммуногенные или вакцинные композиции, включающие вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления, при- 5 044953 годны для перорального, чрескожного, внутримышечного или интраназального применения.
Настоящее изобретение также касается способа изготовления иммуногенной композиции или вакцины, включающей вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления, для снижения частоты или тяжести одного или нескольких клинических признаков, связанных с инфекцией или вызванных ею, который включает такие этапы: (а) введение в клетку-хозяина вектора рекомбинантного rCAdV, который включает вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления; (б) культивирование инфицированных клеток в подходящих условиях; (в) сбор инфицированных клеток и/или компонентов вектора и/или вируса; (г) необязательный сбор собранных клеток из этапа (в); и (д) смешивание вышеупомянутых собранных клеток с фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также касается способа уменьшения или избежания клинических признаков или болезни, вызванной инфицированием животных патогеном, или применения согласно способу лечения или профилактики инфицирования животных патогеном, который включает этап введения животным терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции вакцины, включающей вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления.
В конкретном аспекте согласно любому из способов вышеупомянутых вариантов осуществления иммуногенную композицию вводят одноразово.
В конкретном аспекте согласно любому из способов вышеупомянутых вариантов осуществления иммуногенную композицию вводят двумя дозами.
В конкретном аспекте согласно любому из способов вышеупомянутых вариантов осуществления иммуногенную композицию вводят перорально, чрескожно, внутримышечно или интраназально.
В конкретном аспекте согласно любому из способов вышеупомянутых вариантов осуществления иммуногенная композиция защищает от гомологической и/или гетерологической вирусной провокации.
Настоящее изобретение также касается способа иммунизации животных против клинической болезни, вызванной патогеном у вышеупомянутого животного, который включает этап введения животным иммуногенной композиции, включающей вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления, из-за чего иммуногенная композиция или вакцина не может вызвать клинические признаки инфекции, но способна вызвать иммунную реакцию, которая иммунизирует животных от патогенных форм вышеупомянутого патогена.
В конкретном аспекте изобретения согласно вышеупомянутому способу иммуногенную композицию вводят одноразово или, в альтернативном варианте, двумя дозами.
В конкретном аспекте изобретения согласно вышеупомянутому способу иммуногенную композицию вводят перорально, чрескожно, внутримышечно или интраназально.
В конкретном аспекте изобретения согласно вышеупомянутому способу иммуногенная композиция защищает от гомологической и/или гетерологической вирусной провокации.
Настоящее изобретение также касается комплекта для вакцинации животных от болезни, связанной с одним или несколькими клиническими признаками, и/или уменьшением частоты или тяжести одного или нескольких клинических признаков, связанных с патогеном или вызванных патогенном, у животного, включающий: (а) дозатор, способный вводить животным вакцину, включающую вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления; и (б) иммуногенную композицию или вакцину, включающую вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV) согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления, и (в) необязательно лист-вкладыш с инструкцией.
Настоящее изобретение также касается линии эукариотных клеток-хозяев, которые экспрессируют рекомбинантный аденовирус собачьих 2-го типа (rCAd2) согласно вышеупомянутым вариантам осуществления.
В другом конкретном аспекте линия клеток-хозяев является линией клеток млекопитающих или линией клеток насекомых, выбранной из группы, к которой относятся линия клеток K/WRL, линия клеток RK13, линия клеток MDBK, линия клеток ST, линия клеток AI-ST, линия клеток VERO, линия клеток Sf9, линия клеток Sf21, Sf plus, линия клеток MDCK и/или их производные.
В еще одном конкретном аспекте линия клеток-хозяев является линией прокариотных клетокхозяев, экспрессирующих рекомбинантный аденовирус собачьих 2-го типа (rCAd2) согласно вышеупомянутым вариантам осуществления.
Определения.
Если нет иного, определения, употребленные авторами технические и научные термины имеют значения в общепринятом на время подачи заявки понимании среди специалистов в области, к которой относится изобретение. Значение и объем терминов должны быть четкими; однако в случае любой скрытой неоднозначности предусмотренные авторами определения имеют преимущество над любыми словарными или общими определениями. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе также охватывают форму множественного числа, а термины во множественном числе охватывают форму единственного числа. В контексте данного описания употребление или означает и/или, если
- 6 044953 не указано иное. Кроме того, употребление термина включая, а также других форм, таких как включает и включенный, не является ограничивающим. Все упомянутые авторами патенты и публикации включены в настоящее описание путем ссылки.
В практике настоящего изобретения задействованы, если не указано иное, традиционные технологии вирологии, молекулярной биологии, микробиологии, технология рекомбинантных ДНК, белковая химия и иммунология, которые относятся к сфере компетенции специалистов. Такие технологии полностью объясняются в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989);
DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, В., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); и Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and С. С Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
Перед ознакомлением с детальным описанием настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными ДНК, полипептидными последовательностями или параметрами процесса, поскольку они, конечно, могут быть разными. Также следует понимать, что употребленная авторами терминология имеет целью только описание конкретных вариантов осуществления изобретения и не является ограничивающей. Следует отметить, что употребленные в данном описании и сопроводительной формуле изобретения формы единственного числа также охватывают форму множественного числа, если контекст четко не требует иного. Таким образом, например, ссылки на антиген включает смесь двух или большего количества антигенов, а ссылка на вспомогательное вещество включает смеси из двух или большего количества вспомогательных веществ и т.п.
Определения молекулярной биологии.
Термин вектор, известный специалистам в данной области, означает полинуклеотидную последовательность, обычно плазмиду или бактериальную искусственную хромосому либо аттенуированные живые вирусные векторы, которые применяют для передачи генетического материала в клетку-хозяина. Векторами могут быть, например, бактерии, вирусы, фаги, бактериальные искусственные хромосомы, космиды или плазмиды. Вектор в контексте данного описания может состоять из ДНК или РНК или может содержать их. В некоторых вариантах осуществления вектор состоит из ДНК. В некоторых вариантах осуществления вектор является инфекционным вирусом. Такой вирусный вектор содержит вирусный геном, который был подвергнут манипуляции таким образом, что он включает чужеродный ген, который не выполняет функции в репликации вирусного вектора, ни в культуре клеток, ни в организме животного-хозяина. Согласно конкретным аспектам данного изобретения, вектор может применяться в разных аспектах, таких, как простой перенос генетического материала, для трансфекции клеток-хозяев или организмов, для применения в качестве вакцин, например, ДНК-вакцин, или с целью экспрессии генов. Экспрессия гена является термином, описывающим биосинтез белка в клетке, который направляется специфической полинуклеотидной последовательностью, называющейся геном. В конкретном аспекте вектор может быть экспрессионным вектором, являющийся вектором, способным направлять экспрессию белка, который кодируется одним или несколькими генами, которые несет этот вектор, когда он присутствует в соответствующей среде.
Векторы и способы получения и/или применения векторов (или рекомбинантов) для экспрессии могут быть аналогичными способам, которые раскрываются в патентах США №№ 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, публикациях РСТ WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, PNAS USA 93: 11349 - 11353, October 1996; Moss, Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety, PNAS USA 93: 11341 -11348, October 1996; Smith et al., Патенте США № 4,745,051 (рекомбинантный бакуловирус); Richardson, С. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, Baculovirus Expression Protocols (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156 - 2165; Pennock et al., Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0 370 573; Заявке США № 920,197, поданной 16 октября 1986 г.; Патентной публикации ЕР № 265785; Патенте США № 4,769,331 (рекомбинантный герпесвирус); Roizman, The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors, PNAS USA 93: 11307 - 11312, October 1996; Andreansky et al., The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors, PNAS USA 93: 11313 - 11318, October 1996; Robertson et al., Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to В lymphocytes, PNAS USA 93: 11334 -11340, October 1996; Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications, PNAS USA 93: 11371 - 11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; патентах США №№ 5,591,439, 5,552,143; WO 98/00166; акцептованных заявках США с серийными номерами
- 7 044953
08/675,556, и 08/675,566, обе из которых поданы 3 июля 1996 г. (рекомбинантный аденовирус); Grunhaus et al., 1992, Adenovirus as cloning vectors, Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237 - 52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861 - 65, Graham, Tibtech 8, 85 - 87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Feigner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550 - 2561, Science, 259: 1745 - 49, 1993; и McClements et al., Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease, PNAS USA 93: 11414 - 11420, October 1996; и патентах США №№ 5,591,639, 5,589,466 и 5,580,859, а также WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660; публикациях Tang et al., Nature, и Furth et al., Analytical Biochemistry, которые касаются векторов экспрессии ДНК, и др. См. также WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736 - 739, 1998 (лентивирусная система экспрессии); Sanford et al., U.S. Pat. No. 4,945,050; Fischbach et al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271 283 (1997), (векторные системы ДНК); Szoka et al., патенте США № 4,394,448 (способ вставки ДНК в живые клетки); McCormick et al., патенте США № 5,677,178 (применение цитопатических вирусов); и патенте США № 5,928,913 (векторы для доставки генов); а также других приведенных авторами документах.
Термин вирусный вектор описывает генетически модифицированный вирус, который был подвергнут манипуляции с применением технологии рекомбинантных ДНК таким образом, что в результате его введения в клетку-хозяина обеспечивается специфическая биологическая активность, например, экспрессия трансгена, который переносится вектором. В конкретном аспекте трансгеном является антиген. Вирусный вектор может быть или не быть репликационно-компетентным в клетке-мишени, ткани или организме.
Генерацию вирусного вектора осуществляют, применяя любые подходящие технологии генной инженерии, известные специалистам в данной области, включая, кроме прочего, стандартные технологии расщепления рестрикционной эндонуклеазы, лигирования, трансформации, очищения плазмид, секвенирования ДНК, трансфекции в культурах клеток, например, как описано в публикациях Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) или К. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014)).
Вирусный вектор может включать последовательности из генома любого известного организма. Последовательности могут быть включены в их естественной форме или могут быть модифицированы любым способом для получения нужной активности. Например, последовательности могут включать вставки, делеции или замещения. Кроме того, последовательности могут быть кодоноптимизированными для улучшения экспрессии белка в живом организме путем повышения трансляционной эффективности нужного гена. Например, нужный ген может быть мутирован (или синтезирован de novo) для изменения кодонов, применяющихся для кодирования конкретных аминокислот, без изменения аминокислотной последовательности самого белка. Редкие кодоны могут быть заменены кодонами, которые более многочисленны в организме-хозяине. Оптимизация кодонов в нужном гене может быть самым лучшим способом повышения функциональности и/или экспрессии гена в окружении клеткихозяина.
Вирусный вектор может включать кодирующие участки для двух или большего количества нужных белков. Например, вирусный вектор может включать кодирующий участок для первого нужного белка и кодирующий участок второго нужного белка. Первый нужный белок и второй нужный белок могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор может включать кодирующий(е) участок(и) для третьего или четвертого нужного белка. Третий и четвертый нужный белок может быть таким же или другим. Общая длина двух или большего количества нужных белков, кодирующихся одним вирусным вектором, может быть разной. Например, общая длина двух или большего количества белков может составлять по крайней мере приблизительно 200 аминокислот. По крайней мере приблизительно 250 аминокислот, по крайней мере приблизительно 300 аминокислот, по крайней мере приблизительно 350 аминокислот, по крайней мере приблизительно 400 аминокислот, по крайней мере приблизительно 450 аминокислот, по крайней мере приблизительно 500 аминокислот, по крайней мере приблизительно 550 аминокислот, по крайней мере приблизительно 600 аминокислот, по крайней мере приблизительно 650 аминокислот, по крайней мере приблизительно 700 аминокислот, по крайней мере приблизительно 750 аминокислот, по крайней мере приблизительно 800 аминокислот или больше.
Предпочтительными вирусными векторами являются аденовирусные векторы собачьих CAd2.
Согласно конкретным аспектам настоящего изобретения, термин вирусный вектор или вирусная конструкция означает рекомбинантную вирусную конструкцию, которая происходит от вируса, выбранного из семейства Adenoviridae (Ad), такого, как CAdV-1 и CAdV-2 (аденовирус собачьих), (см. van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, СМ., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S.M., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeoch, D.J., Pringle, C.R. and Wickner, R.B. (2000). Virus taxonomy. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego. 1162 pp).
Термины вирусный вектор и вирусная конструкция могут употребляться взаимозаменяемо.
Термин конструкция в контексте данного описания означает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, такую как плазмида, ВАС, или рекомбинантный вирус, который был искусственно сгенерирован.
- 8 044953
Термин плазмида касается цитоплазматической ДНК, реплицированной независимо от бактериальной хромосомы в бактериальной клетке-хозяине. В конкретном аспекте данного изобретения термин плазмида и/или трансферная плазмида и/или трансферный фрагмент касается элемента технологии рекомбинантной ДНК, которую применяют для построения, например, экспрессионной кассеты для вставки в вирусный вектор. В другом конкретном аспекте термин плазмида может употребляться для указания на плазмиду, которую применяют с целью ДНК-вакцинации.
В контексте данного описания термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид являются взаимозаменяемыми и касаются любой нуклеиновой кислоты.
Термин нуклеиновая кислота, нуклеиновокислотная последовательность, нуклеотидная последовательность, полинуклеотид, полинуклеотидная последовательность, последовательность РНК или последовательность ДНК в контексте данного описания касается олигонуклеотида, нуклеотида или полинуклеотида и их фрагментов и частей, а также ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и представлять смысловую или антисмысловую нить. Последовательность может быть некодирующей последовательностью, кодирующей последовательностью или их смесью. Нуклеиновокислотные последовательности согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением стандартных технологий, общеизвестных среди специалистов в данной области.
Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид также конкретно охватывают нуклеиновые кислоты, состоящие из основ, отличных от пяти основ, которые встречаются в природе (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).
Термины регуляторная нуклеиновая кислота, регуляторный элемент и элемент контроля экспрессии употребляются взаимозаменяемо и касаются молекул нуклеиновых кислот, которые могут влиять на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности, в частности, организмахозяина. Эти термины широко применяются и охватывают все элементы, которые способствуют транскрипции или регулируют ее, включая промоторы, промоторные последовательности, ключевые элементы, требующиеся для фундаментального взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, активирующие элементы, энхансеры и элементы ответа. Типичными регуляторными элементами в прокариотах являются промоторы, операторные последовательности и участки связывания рибосом. Регуляторные элементы, применяющиеся в эукариотных клетках, могут включать, кроме прочих, транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности, такие, как промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы разрушения белка, внутренние участки посадки рибосом (IRES), пикорнавиридальные последовательности 2А и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности и/или продуцирование кодированного полипептида в клетке-хозяине.
Внутренний участок посадки рибосомы или IRES описывает последовательность, которая функционально способствует инициации трансляции независимо от гена 5' от IRES и из единого транскрипта в животной клетке. IRES обеспечивает независимый участок посадки рибосомы для трансляции открытого участка считывания непосредственно после него. В отличие от бактериальной мРНК, которая может быть полицистронной, т.е., может кодировать несколько разных полипептидов, которые последовательно транслируются из мРНК, большинство мРНК животных клеток являются моноцистронными и кодируют синтез только одного полипептида. При полицистронном транскрипте в эукариотной клетке трансляция начинается от крайнего с 5' конца сайта инициации трансляции, заканчивается на первом стоп-кодоне, и транскрипт должен быть освобожден от рибосомы, что в результате ведет к трансляции только первого кодированного полипептида в мРНК. В эукариотной клетке полицистронный транскрипт, который имеет IRES, функционально связанный со вторым или следующим открытым участком считывания в транскрипте, обеспечивает возможность последовательной трансляции этого расположенного дальше открытого участка считывания для образования двух или большего количества полипептидов, которые кодируются одним транскриптом. IRES может иметь разную длину и может происходить из разных источников, например, вируса энцефаломиокардита (EMCV), пикорнавирусов (например, вируса ящура, FMDV или полиовируса (PV) или вируса гепатита С (HCV). Разные последовательности IRES и их применение в построении вектора были описаны и являются общеизвестными среди специалистов в данной области. Расположенная дальше кодирующая последовательность функционально связана с 3' концом IRES на любом расстоянии, которое не влияет отрицательно на расположенный дальше ген. Оптимальное или допустимое расстояние между IRES и началом расположенного дальше гена может быть легко определено путем изменения расстояния и измерения экспрессии в зависимости от расстояния.
Термин2а или 2а пептид означает, что короткие олигопептидные последовательности, описанные как 2а и 2а-видные, служат как линкеры, которые способны опосредствовать котрансляционное расщепление между белками с применением процесса, который определяется как рибосомное перескакивание. Такие 2а и 2а-видные последовательности (из Picornaviridae и других вирусов или клеточных последовательностей) могут применяться для соединения многих генных последовательностей в единый ген, обеспечивая их коэкспрессию в пределах одной клетки (см. Luke and Ryan, 2013).
В контексте данного описания термин промотор или промоторная последовательность означает
- 9 044953 нуклеотидную последовательность, которая обеспечивает возможность связывания РНК-полимеразы и направляет транскрипцию гена. Как правило, промотор располагается в 5' некодирующем участке гена, приближенном к сайту начала транскрипции гена. Элементы последовательности в пределах промоторов, выполняющих функцию инициации транскрипции, часто характеризуются консенсусными нуклеотидными последовательностями. Примерами промоторов, кроме прочих, являются промоторы из бактерий, дрожжей, растений, вирусов и животных, таких, как млекопитающие (включая коней, свиней, крупный рогатый скот и людей), птицы или насекомые. Промотор может быть индуцибельным, репрессированным и/или конститутивным. Индуцибельные промоторы инициируют повышенный уровень транскрипции из ДНК под их контролем в ответ на определенное изменение в условиях культивирования, такое, как изменение температуры (Ptashne, 2014). Примерами промоторов, общеизвестных среди специалистов в данной области, являются, например, SV40 большой Т, HCMV и MCMV немедленно-ранний ген 1, промотор человеческого фактора элонгации альфа, промотор полиэдра бакуловируса.
В контексте настоящего изобретения термин промотор, в частности, касается функционального фрагмента, например, усечения 4pgG600 (SEQ ID NO. 29), или его комплементарной нуклеотидной последовательности, причем в предпочтительном варианте идентичность последовательностей составляет (по крайней мере) 72% по всей длине (или больше). Кроме того, в контексте настоящего изобретения термин промотор, в частности, касается функционального фрагмента, например, усечения 4рМСР600 (SEQ ID No. 30), или его комплементарной нуклеотидной последовательности, причем в предпочтительном варианте идентичность последовательностей составляет (по крайней мере) 78% по всей длине (или больше). В наиболее предпочтительном варианте промотор означает р430 (SEQ ID NO.: 31) или р455 (SEQ ID NO.: 32). Термины р430, gG 430 и 430 являются синонимичными и употребляются взаимозаменяемо по всему описанию, на фигурах, в перечне последовательностей и т.п. Термины р455, МСР 455 и 455 являются синонимичными и употребляются взаимозаменяемо по всему описанию, на фигурах, в перечне последовательностей и т.п.
Промоторы EHV-4 в предпочтительном варианте означают усеченный транскрипционно активный промотор, включающий участок, трансактивированный трансактивирующим белком, который обеспечивается вирусом и минимальным промоторным участком промотора полной длины, от которого происходит усеченный транскрипционно активный промотор. С точки зрения данного описания промотор состоит из ассоциации последовательностей ДНК, соответствующих минимальной промоторной и активирующей регуляторной последовательностям; минимальный промотор состоит из САР-сайта плюс ТАТА-бокса (минимальные последовательности для базового уровня транскрипции; нерегулируемого уровня транскрипции); и активирующие регуляторные последовательности состоят из расположенного(ых) выше элемента(ов) и/или энхансерной(ых) последовательности (последовательностей). Кроме того, термин усеченный указывает на то, что промотор полной длины не полностью присутствует, т.е., определенная часть промотора полной длины удалена. Усеченные промоторы в предпочтительных вариантах осуществления происходят от герпесвируса-4 коней (геном EHV-4, который в этом описании указывается как 4pgG600 (SEQ ID NO.: 29), 4рМСР600 (SEQ ID NO.: 30), усеченными промоторами являются pgG430 (SEQ ID NO.: 31) или gMCP455 (SEQ ID NO.: 32), которые происходят от соответствующих последовательностей полной длины.
Промотор может быть усечен таким образом, чтобы обеспечивалось 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 55, 60, 65, 70, 75, 80% и даже до 90% уменьшения размера относительно промотора полной длины по количеству пар основ; например, в лошадиных 4pgG600 (SEQ ID NO.: 29), 4pMCP600 (SEQ ID NO.: 30), соответственно. Действительно, усеченный промотор согласно изобретению может состоять по сути из любого участка в пределах усечения, трансактивируемого трансактивирующим белком, который обеспечивается вирусом или системой, в который вставляется усеченный промотор, и, таким образом, является минимальным промотором.
Усеченный транскрипционно активный или компетентный промотор согласно настоящему изобретению означает усеченные транскрипционно активные эукариотные промоторы герпесвируса, происходящие от генома лошадиного герпесвируса 4: промоторы EHV-4 gG430 (SEQ ID NO.: 31) и gMCP455 (SEQ ID NO.: 32). Активный (или компетентный) усеченный транскрипционно активный промотор должен демонстрировать по крайней мере 80%, в предпочтительном варианте по крайней мере 85%, в более предпочтительном варианте - по крайней мере 90%, и в наиболее предпочтительном варианте - по крайней мере 95% транскрипционной активности промотора полной длины. Делеция нуклеотидов или частей или участков промотора полной длины может осуществляться на основе представленных в данном описании идей, без лишних экспериментов, для генерации активных фрагментов дополнительно к приведенным в примерах.
Таким образом, промотор, который применяют для практического осуществления изобретения, может включать производные и/или субфрагменты промотора полной длины, которые сохраняют достаточную активность промотора, а следовательно, функционируют как промотор, и их преимущество состоит в том, что они имеют промоторную активность, которая по существу похожа на активность действующего промотора или промотора полной длины, от которого происходят производная или субфрагмент. В контексте данного описания термин производная или субфрагмент означают нуклеиновокислотную
- 10 044953 последовательность, имеющую модификации, такие, как усечения и/или замещения/делеции, таким образом, чтобы промоторная последовательность выполняла по существу эквивалентную функцию по сравнению с промотором дикого типа. Эти производные или субфрагменты включают нуклеиновокислотные последовательности, имеющие незначительные модификации, которые могут быть намеренными, как при сайт-специфическом мутагенезе, или спонтанными. Термин производные также предусматривает делеции, добавления и замещения в последовательности, при условии, что промотор остается транскрипционно активным или компетентным для запуска экспрессии функционально связанного полипептида, кодирующего, например, нужный антиген.
Термин энхансер означает полинуклеотидную последовательность, которая в cis-позиции влияет на активность промотора и, таким образом, стимулирует транскрипцию гена или кодирующей последовательности, которая функционально соединена с этим промотором. В отличие от промоторов, влияние энхансеров не зависит от позиции и ориентации, и они, таким образом, могут быть расположены перед транскрипционной единицей или за ней, в пределах интрона или даже в пределах кодирующего участка. Энхансер может быть расположен как в непосредственной близости к транскрипционной единице, так и на значительном расстоянии от промотора. Также возможно физическое и функциональное частичное перекрытие с промотором. Специалистам в данной области известно много энхансеров из разных источников (которые депонируются в банках данных, таких, как GenBank, например, энхансеры SV40, энхансеры CMV, энхансер полиомы, энхансеры аденовируса), имеющиеся как независимые элементы или элементы, клонированные в пределах полинуклеотидных последовательностей (например, депонированных в АТСС, или из коммерческих и частных источников). Много промоторных последовательностей также содержат энхансерные последовательности, такие, как часто применяемый промотор CMV. Энхансер CMV человека является одним из самых сильных до сих пор идентифицированных энхансеров. Одним из примеров индуцибельного энхансера является энхансер металлотионеина, который может быть стимулирован глюкокортикоидами или тяжелыми металлами.
Термин комплементарные нуклеотидные последовательности описывает одну нить из двух спаренных нитей полинуклеотидов, таких, как ДНК или РНК. Нуклеотидная последовательность комплементарной нити является зеркальным отражением нуклеотидной последовательности ее спаренной нити, таким образом, что для каждого аденозина она содержит тимин (или урацил для РНК), для каждого гуанина - цитозин, и наоборот. Комплементарной нуклеотидной последовательностью, например, 5'GCATAC-3' является 3'-CGTATG-5' или для РНК 3'-CGUAUG-5'.
Термины ген, нужный ген в контексте данного описания имеют одинаковое значение и касаются полинуклеотидной последовательности любой длины, кодирующей нужный продукт. Ген может включать регуляторные последовательности до (5' некодирующие или нетранслированные последовательности) и после (3' некодирующие или нетранслированные последовательности) кодирующей последовательности. Выбранная последовательность может быть последовательностью полной длины или усеченной, слитым или меченным геном и может представлять собой кДНК, геномную ДНК или фрагмент ДНК. В целом считается, что геномная ДНК, кодирующая полипептид или РНК, может включать некодирующие участки (т.е. интроны), которые сплайсированы из естественной матричной РНК (мРНК), а следовательно, не присутствуют в кДНК, которая кодирует такой же полипептид или РНК. Она может быть нативной последовательностью, т.е. естественной(ыми) формой(ами), или может быть мутированной, или может включать последовательности, взятые из разных источников или иным образом модифицированные в случае необходимости. Эти модификации включают оптимизацию кодонов для оптимизации использования кодонов в выбранной клетке-хозяине или мечение. Кроме того, они могут включать удаление или добавление действующих в cis-позиции сайтов, таких, как сайт (криптический) донора сплайсинга, акцептора сплайсинга, и точки ветвления, сигналы полиаденилирования, ТАТА-боксы, chiсайты, сайты посадки рибосом, последовательности повторов, вторичные структуры (например, структуры петля-на-стебле), сайты связывания для факторов транскрипции или других регуляторных факторов, сайты рестрикционных ферментов и т.п., которые являются всего несколькими неограничительными примерами. Выбранная последовательность может кодировать секретированный, цитоплазматический, ядерный, мембраносвязанный полипептид или полипептид клеточной поверхности.
По определению, эпитоп является антигенной детерминантой, которая иммунологически активна в том смысле, что после введения в организм хозяина она способна вызвать иммунную реакцию гуморального (В-клетки) и/или клеточного типа (Т-клетки). Они являются конкретными химическими группами или пептидными последовательностями на молекуле, которые антигенны. Антитело специфически связывается с конкретным антигенным эпитопом на полипептиде. Конкретными неограничительными примерами эпитопа являются тетра- - пентапептидная последовательность в полипептиде, трипентагликозидная последовательность в полисахариде. У животных большинство антигенов представляют несколько или даже много антигенных детерминант одновременно. Такой полипептид также может быть квалифицирован как иммуногенный полипептид, и эпитоп может быть идентифицирован, как описывается дальше.
Нужный эпитоп может быть антигеном ветеринарного патогена или токсина либо может быть производным от антигена ветеринарного патогена или токсина, или другим антигеном или токсином,
- 11 044953 который вызывает реакцию относительно патогена, или производным от другого антигена или токсина, который вызывает реакцию относительно патогена, и его неограничительными примерами могут быть: антиген парамиксовируса, например, антиген вируса собачьей чумы (CDV), например, НА или F, антиген респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота (BRSV), вирус 3 парагриппа крупного рогатого скота (bPIV3); гликопротеин бешенства, например, гликопротеин бешенства G; антиген птичьего гриппа, например, НА гриппа индюков, антиген гриппа Chicken/Pennsylvania/1/83, такой, как нуклеопротеин (NP); антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, например, оболочка gp51,30; антиген вируса псевдочумы птиц (NDV), например, HN или F; антиген вируса лейкоза кошачьих (FeLV), например, белок оболочки FeLV; гликопротеин герпесвируса, например, гликопротеин герпесвируса кошачьих, герпесвируса коней, герпесвируса крупного рогатого скота, вируса псевдобешенства или герпесвируса собачьих (гликопротеин герпесвируса собачьих gB, gC или gD); антиген флавивируса, например, антиген вируса лихорадки Западного Нила или антиген вируса клещевого энцефалита; антиген вируса иммунодефицита, например, антиген вируса иммунодефицита кошачьих (FIV); антиген парвовируса, например, антиген парвовируса VP2 собачьих; антиген лошадиного гриппа; антиген вируса болезни Марека; антиген поксвируса, например, антиген вируса оспы птиц; антиген вируса инфекционного бурсита, например, VP2, VP3, VP4; антиген коронавируса, например, из коронавируса свиней (TGEV, вируса эпидемической диареи свиней (PEDV) и SPIKE Ag дельта-коронавируса), собачьих и/или кошачьих, домашней птицы (например, вируса инфекционного бронхита (IBV)); или антигена пестивируса например, антигена вируса диареи крупного рогатого скота.
Термин нужная нуклеотидная последовательность или нужная последовательность в контексте данного описания является более общим термином, чем нужный ген, поскольку она не обязательно включает ген, а может включать элементы или части гена либо другую генетическую информацию, например, ori (точку начала репликации). Нужная нуклеотидная последовательность может быть любой последовательностью ДНК или РНК, независимо от того, включает ли она кодирующую последовательность.
Открытый участок считывания или ORF касается длины нуклеиновокислотной последовательности, ДНК или РНК, которая включает сигнал запуска трансляции или инициирующий кодон, такой, как ATG или AUG, и терминирующий кодон, и потенциально может быть транслирована в полипептидную последовательность.
Термин транскрипция описывает биосинтез мРНК в клетке.
Термин экспрессия в контексте данного описания означает транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновокислотной последовательности в клетке-хозяине. Согласно конкретным аспектам данного изобретения, термин экспрессия касается транскрипции и/или трансляции гетерологической и/или экзогенной нуклеиновокислотной последовательности в клетке-хозяине. Уровень экспрессии нужного продукта в клетке-хозяине может определяться на основе количества соответствующей РНК или мРНК, присутствующей в клетке, или количества нужного полипептида, который кодируется выбранной последовательностью. Например, количество мРНК, транскрибированной из выбранной последовательности, определяют путем гибридизации с применением нозерн-блоттинга, защиты РНК рибонуклеазы, in situ гибридизации с клеточной РНК или путем RTqPCR (обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР). Белки, экспрессированные из выбранной последовательности, подсчитывают разными способами, например, путем ELISA, вестерн-блоттинга, путем радиоиммунных анализов, путем иммунопреципитации, путем анализа на биологическую активность белка или путем иммунной окраски белка с последующим FACS анализом.
Термин экспрессионная кассета либо транскрипционная единица или экспрессионная единица определяет участок в векторе, конструкте или полинуклеотидной последовательности, который содержит один или несколько генов, подлежащих транскрипции, причем нуклеотидные последовательности, кодирующие транскрибированный(е) ген(ы), а также полинуклеотидные последовательности, которые содержат регуляторные элементы, содержащиеся в экспрессионной кассете, являются функционально связанными друг с другом. Они транскрибируются из промотора, и транскрипция прерывается по крайней мере одним сигналом полиаденилирования. В одном конкретном аспекте они транскрибируются из одного единственного промотора. В результате разные гены являются по крайней мере транскрипционно связанными. Из каждой транскрипционной единицы (мультицистронной транскрипционной единицы) могут быть транскрибированы и экспрессированы несколько белков или продуктов. Каждая транскрипционная единица должна включать регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции любой из выбранных последовательностей, которые содержатся в единице. И каждая транскрипционная единица может содержать одинаковые или разные регуляторные элементы. Например, каждая транскрипционная единица может содержать такой же терминатор, элемент IRES или интроны могут использоваться для функционального связывания генов в пределах транскрипционной единицы. Векторная или полинуклеотидная последовательность может содержать больше одной транскрипционной единицы.
Под термином повышенная экспрессия, повышенный титр или производительность либо улучшенная экспрессия или производительность следует понимать повышение экспрессии, синтеза или секреции гетерологической и/или экзогенной последовательности, введенной в клетку-хозяина, напри
- 12 044953 мер, гена, кодирующего терапевтический белок, путем сравнения с подходящим контролем, например, белком, кодируемым кДНК по сравнению с белком, кодируемым геном, содержащим интрон. Существует повышенный титр или производительность, если клетку согласно изобретению культивируют с применением описанного авторами способа согласно изобретению, и если эта клетка имеет по крайней мере 1,2-кратное, 1,5-кратное, двукратное, трехкратное, четырехкратное или пятикратное увеличение удельной производительности или титра. Также существует повышенный титр или производительность, если клетку согласно изобретению культивируют с применением описанного авторами способа согласно изобретению, и если эта клетка имеет по крайней мере 1,2-кратное или по крайней мере 1,5-кратное или по крайней мере двукратное или по крайней мере трехкратное увеличение удельной производительности или титра. Также, в частности, существует повышенный титр или производительность, если клетку согласно изобретению культивируют с применением описанного авторами способа согласно изобретению, и если эта клетка имеет по крайней мере от 1,2-кратного до пятикратного, в предпочтительном варианте от 1,5-кратного до пятикратного, в более предпочтительном варианте - от двукратного до пятикратного, в наиболее предпочтительном варианте - от трехкратного до пятикратного увеличения удельной производительности или титра. Повышенная экспрессия также может означать, что большее количество клеток фактически экспрессирует нужный ген / последовательность. Например, экспрессия может означать, что новые промоторы согласно данному изобретению обеспечивают повышенную экспрессию относительно экспрессии, которая осуществляется другим промотором, относительно количества полученных клеток, которые экспрессируют или имеют поддающуюся обнаружению экспрессию трансгена. Повышенная экспрессия также может означать повышение уровня мРНК и/или белка, который обнаруживается на поклеточной основе.
Повышенной экспрессии, титра или производительности достигают путем применения гетерологического вектора согласно изобретению. Этот способ может объединяться с другими подходами, такими, как осуществляемый с помощью FACS отбор рекомбинантных клеток-хозяев, которые содержат, как дополнительный селектированный маркер, один или несколько флуоресцентных белков (например, GFP) или маркер поверхности клеток. Также могут применяться другие способы достижения повышенной экспрессии и комбинация разных способов, которые основываются, например, на применении cisактивных элементов для манипулирования структурой хроматина (например, LCR, UCOE, EASE, изоляторы, элементы S/MAR, STAR), на применении (искусственных) факторов транскрипции, обработки клеток естественными или синтетическими средствами повышающей регуляции экспрессии эндогенного или гетерологического и/или экзогенного гена, улучшении стойкости (периода полужизни) мРНК или белка, улучшении инициации трансляции мРНК, повышении дозы гена путем применения эписомных плазмид (на основе применения вирусных последовательностей как источников репликации, например, SV40, полиомы, аденовируса, EBV или BPV), применении способствующих амплификации последовательностей или систем in vitro амплификации на основе конкатемеров ДНК.
Анализ для измерения повышенной экспрессии представляет собой измерение белков на основе LC-MS/MS, например, мониторинг множественных реакций (MRM); способы выявления на основе антител, такие, как вестерн-блоттинг, дот-блот-анализ или иммунодифузия, проточная цитометрия; и косвенную иммунофлуоресценцию (IFA), и измерение биологической активности путем реакции гемагглютинации.
Промоторную активность измеряют косвенно путем количественного определения мРНК, транскрибированной под контролем соответствующего промотора. МРНК подсчитывают с помощью RTqPCR относительно эндогенного стандарта.
Термин титр вируса является мерой инфекционных единиц на единицу объема вирусного препарата. Титр вируса является конечной точкой биологической процедуры и определяется как разбавление, при котором определенная пропорция испытаний, осуществляющихся параллельно, демонстрируют эффект (Рида и Менча, 1938). В частности, инфекционная доза тканевой культуры пятьдесят на миллилитр (TCID50/мл) дает разбавление вирусного препарата, при котором 50% количества культур клеток, инокулированных параллельно с этим разбавлением, являются инфицированными.
Регулирующие транскрипцию элементы обычно включают промотор перед последовательностью гена, которая подлежит экспрессии, сайты инициации и терминации транскрипции, а также сигнал полиаденилирования.
Термин сайт инициации транскрипции касается нуклеиновой кислоты в последовательности, которая соответствует первой нуклеиновой кислоте, включенной в первичный транскрипт, т.е., прекурсор мРНК. Сайт инициации транскрипции может частично накладываться на промоторные последовательности.
Сигнал терминации или терминатор либо сигнал полиаденилирования или polyA, или сайт терминации транскрипции, или элемент терминации транскрипции является сигнальной последовательностью, которая вызывает расщепление в конкретном сайте на 3' конце эукариотной мРНК и посттранскрипционную инкорпорацию последовательности с приблизительно 100-200 адениновых нуклеотидов (хвост polyA) на расщепленном 3' конце и, таким образом, вызывает терминацию транскрипции РНК-полимеразой. Сигнал полиаденилирования включает последовательность ААТААА с приблизи- 13 044953 тельно 10-30 нуклеотидов перед сайтом расщепления и последовательность, расположенную после него.
Известны разные элементы полиаденилирования, такие, как tk polyA, SV40 поздний и ранний polyA,
BGH polyA (описанные, например, в патенте США № 5,122,458) или polyA гормона роста хомяка (публикация WO 2010010107).
Элементы регуляции трансляции включают сайт инициации трансляции (AUG), стоп-кодон и сигнал polyA для каждого отдельного полипептида, который должен быть экспрессирован. Внутренний участок посадки рибосомы (IRES) может быть включен в некоторые последовательности. С целью оптимизации экспрессии могут быть целесообразными удаление, добавление и или изменение 5'- и/или 3'нетранслированных участков нуклеиновокислотной последовательности, которая должна быть экспрессирована, для удаления любых потенциально нежелательных дополнительных альтернативных кодонов инициации трансляции или других последовательностей, которые могут влиять на экспрессию или снижать ее, на уровне транскрипции или трансляции. Консенсусные участки связывания рибосом (последовательность Козак) могут быть вставлены непосредственно перед старт-кодоном для усиления трансляции, а следовательно, экспрессии. Повышенное содержание A/U вокруг этого сайта связывания рибосом способствует более эффективному связыванию рибосом.
По определению, каждая полинуклеотидная последовательность или каждый ген, вставленный в клетку-хозяина, и соответствующий белок или РНК, которые таким образом кодируются, указываются как экзогенная, экзогенная последовательность, экзогенный ген, экзогенная кодирующая последовательность относительно клетки-хозяина, если они происходят из других (вирусных) видов. Соответственно, промоторы на основе EHV-4 согласно данному изобретению являются экзогенными с учетом вектора CAdV. Таким образом, любые взятые не из организма собаки последовательность или нужный ген, например, взятый не из организма собаки антиген, являются экзогенными последовательностью или нужным геном или антигеном согласно конкретному аспекту настоящего изобретения.
По определению, каждая полинуклеотидная последовательность или каждый ген, вставленный в клетку-хозяина, и соответствующий белок или РНК, кодируемые таким образом, указываются как гетерологическая, гетерологическая последовательность, гетерологический ген, гетерологическая кодирующая последовательность, трансген или гетерологический белок относительно клетки-хозяина. Это касается даже случаев, когда последовательность, которая должна быть вставлена, или ген, который должен быть вставлен, являются идентичными эндогенной последовательности или эндогенному гену клетки-хозяина. В контексте данного описания относительно последовательности или нужного гена, такого, как антиген, термин гетерологический означает, что вышеупомянутая последовательность или нужный ген, в частности, вышеупомянутый антиген, экспрессируются из среды их естественного вида.
Термин неестественная означает любую последовательность или нужный ген, такой, как антиген, который не встречается в этой среде в природе, например, гибридную последовательность или последовательность либо нужный ген, такой, как антиген, из других видов, или последовательность или нужный ген, такой, как антиген, которые не являются естественным продуктом из-за искусственной мутации, вставки, делеции и т.п.
Термин рекомбинантный употребляется взаимозаменяемо с терминами неестественный, гетерологический и экзогенный по всему тексту описания настоящего изобретения. Таким образом, рекомбинантный белок является белком, который экспрессируется из гетерологической или экзогенной полинуклеотидной последовательности. Термин рекомбинантный, употребленный в контексте вируса, означает вирус, полученный путем искусственной манипуляции с вирусным геномом. Вирус, включающий гетерологическую или экзогенную последовательность, такую, как экзогенная кодирующая антиген последовательность, является рекомбинантным вирусом. Термин рекомбинантный вирус и термин неестественный вирус употребляются взаимозаменяемо.
Таким образом, термин гетерологический вектор означает вектор, включающий гетерологическую или экзогенную полинуклеотидную последовательность. Термин рекомбинантный вектор означает вектор, включающий гетерологическую или рекомбинантную полинуклеотидную последовательность.
В контексте данного описания термин функционально связанный употребляется для описания связи между регуляторными элементами и геном или его кодирующим участком. Как правило, экспрессия гена находится под контролем одного или нескольких регуляторных элементов, включая, кроме прочих, конститутивные или индуцибельные промоторы, тканеспецифические регуляторные элементы и энхансеры. Ген или кодирующий участок считаются функционально связанными или функционально соединенными либо функционально ассоциированными с регуляторными элементами в том смысле, что ген или кодирующий участок находятся под контролем или влиянием регуляторного элемента. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если промотор выполняет транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.
Кроме того, в контексте данного описания термины функциональное связывание, функционально связанный или функционально соединенный означают, что две или больше нуклеиновокислотных последовательностей или элементов последовательности располагаются таким образом, что это позволяет им функционировать предусмотренным способом. Например, промотор / энхансер или терминатор является функционально связанным с кодирующей генной последовательностью, если он может контро- 14 044953 лировать или модулировать транскрипцию связанной генной последовательности в cis-позиции. Обычно, но не обязательно, последовательности ДНК, которые являются функционально связанными, являются смежными и, если необходимо соединить два кодирующих участка полипептида или в случае сигнального пептида секреции, смежными и находятся в рамке считывания. Однако хотя функционально связанный промотор в целом располагается перед кодирующей последовательностью, а функционально связанный терминатор обычно располагается после нее, он не обязательно должен быть смежным с ней. Энхансеры не обязательно должны быть смежными, если они повышают транскрипцию кодирующей последовательности. Для этого они могут быть расположены перед кодирующей последовательностью или после нее и даже на определенном расстоянии. Сайт полиаденилирования является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он располагается на 3' конце кодирующей последовательности, таким образом, что транскрипция происходит через кодирующую последовательность в сигнал полиаденилирования. Связывание осуществляется рекомбинантными способами, известными специалистам в данной области, например, путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции или тупых концах или путем применения методологии ПЦР. Могут применяться синтетические олигонуклеотидные линкеры или адаптеры согласно традиционной практике, если подходящие сайты рестрикции отсутствуют.
Соответственно, термин функциональный фрагмент или производная промоторной последовательности означает, что фрагмент или производная сохраняет свою промоторную активность. Функциональные анализы способов оценки промоторной активности хорошо известны специалистам в данной области (Bustin, S. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25(2): 169-193; Nolan, T. Rebecca E Hands, R.E., and Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582). Типичный вариант осуществления такого функционального анализа включает, например, кинетический эксперимент с промотором. Клетки, инфицированные векторными вирусами, которые несут экспрессионные кассеты, в которых промотор или его фрагмент направляет транскрипцию репортерного трансгена, инкубируют в течение разного времени. Полную РНК приготавливают из образцов, собранных в разное время после инфицирования. После разрушения загрязняющей ДНК путем расщепления ДНКазой I РНК подвергается обратной транскрипции. Одну копию образца обрабатывают с добавлением обратной транскриптазы (RT), вторую копию обрабатывают без добавления RT с целью демонстрации успешного удаления загрязняющей ДНК из препарата РНК. Полученную в результате кДНК очищают и применяют как матрицу при традиционной ПЦР. Только образцы, обработанные с добавлением RT, производят продукт ПЦР. Эти кДНК потом могут применяться для кПЛР с праймерами для репортерного трансгена и параллельно с праймерами для неизменного гена вирусного вектора (внутреннего стандартного гена), транскрипция которого обеспечивает внутренний стандарт для эффективности инфекции и репликации. Значения кПЛР репортера нормализуются между разными конструкциями и временами после инфицирования с использованием значений кПЛР внутреннего стандартного гена. Это обеспечивает возможность интерпретации промоторной активности разных промоторов и их фрагментов.
Гомология последовательностей в контексте данного описания означает способ определения родственности двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или больше последовательностей оптимально выравнивают и в случае необходимости вводят гэпы. Однако, в отличие от идентичности последовательностей, консервативные аминокислотные замещения учитываются как соответствие при определении гомологии последовательностей. Иными словами, для получения полипептида или полинуклеотида, имеющего 95% гомологии последовательностей с контрольной последовательностью, 85%, в предпочтительном варианте 90, 91, 92, 93, 94%, в более предпочтительном варианте - 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности должны совпадать или включать консервативное замещение другой аминокислотой или нуклеотидом, или определенное количество аминокислот или нуклеотидов до 15%, в предпочтительном варианте до 10, 9, 8, 7, 6%, в более предпочтительном варианте - до 5, 4, 3, 2, 1, 0,1% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые не включают консервативные замещения, в контрольной последовательности могут быть вставлены в контрольную последовательность. В предпочтительном варианте гомологическая последовательность включает по крайней мере фрагмент из 50, в еще более предпочтительном варианте - из 100, в еще более предпочтительном варианте - из 250, в еще более предпочтительном варианте - из 500 нуклеотидов.
Идентичность последовательностей в принятом в данной области понимании касается связи между двумя или больше полипептидными последовательностями либо двумя или больше полинуклеотидными последовательностями, т.е., контрольной последовательностью и данной последовательностью, которая должна сравниваться с контрольной последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с контрольной последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для достижения высшей степени сходства последовательностей, которая определяется по совпадению между нитями таких последовательностей. После такого выравнивания идентичность последовательностей подтверждается на основе сопоставления позиций, например, последовательности являются идентичными в конкретной позиции, если в этой позиции
- 15 044953 нуклеотиды или аминокислотные остатки являются идентичными. Общее количество таких идентичных позиций после этого делят на общее количество нуклеотидов или остатков в контрольной последовательности для получения процента идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей может быть легко рассчитана известными способами, включая, кроме прочих, описанные в публикациях Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); и Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), содержание которых включено в данное описание путем ссылки. Предпочтительные способы определения идентичности последовательности разработаны для получения самого большого совпадения между испытанными последовательностями. Способы определения идентичности последовательностей систематизированы в общедоступных компьютерных программах, которые определяют идентичность последовательностей между данными последовательностями. Примерами таких программ являются, кроме прочих, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 - 410 (1990). Программа BLASTX является общедоступной от NCBI и из других источников (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403 - 410 (1990), содержание которых включено в данное описание путем ссылки). Эти программы оптимально выравнивают последовательности, используя штрафы за делецию по умолчанию с целью обеспечения высочайшего уровня идентичности последовательностей между данной и контрольной последовательностями. Для иллюстрации, для полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, которая имеет, например, по крайней мере 85%, в предпочтительном варианте 90, 91, 92, 93, 94%, в еще более предпочтительном варианте - 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% идентичности последовательностей с контрольной нуклеотидной последовательностью, предусматривается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична контрольной последовательности, за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать до 15, в предпочтительном варианте - до 10, в еще более предпочтительном варианте - до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной нуклеотидной последовательности. Иными словами, в полинуклеотиде, имеющем нуклеотидную последовательность, которая имеет по крайней мере 85%, в предпочтительном варианте 90, 91, 92, 93, 94%, в еще более предпочтительном варианте - 95, 96, 97, 98, 99, 99,9% идентичности относительно контрольной нуклеотидной последовательности, до 15%, в предпочтительном варианте 10, 9, 8, 7, 6%, в еще более предпочтительном варианте - 5, 4, 3, 2, 1, 0,1% нуклеотидов в контрольной последовательности могут быть делетированы или замещены другим нуклеотидом, или определенное количество нуклеотидов до 15%, в предпочтительном варианте 10, 9, 8, 7, 6, в еще более предпочтительном варианте - 5, 4, 3, 2, 1, 0,1% от общего количества нуклеотидов в контрольной последовательности может быть вставлено в контрольную последовательность. Эти мутации контрольной последовательности могут встречаться в 5' или 3' конечных позициях контрольной нуклеотидной последовательности или и любом месте между этими конечными позициями, вставке или отдельно среди нуклеотидов в контрольной последовательности, или в одной или нескольких смежных группах в пределах контрольной последовательности. Аналогичным образом для полипептида, имеющего данную аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере, например, 85%, в предпочтительном варианте 90, 91, 92, 93, 94%, в еще более предпочтительном варианте - 95, 96, 97, 98, 99% идентичности последовательностей с контрольной аминокислотной последовательностью, предусматривается, что данная аминокислотная последовательность полипептида идентична контрольной последовательности, за исключением того, что данная полипептидная последовательность может включать до 15, в предпочтительном варианте до 10, 9, 8, 7, 6, в еще более предпочтительном варианте - до 5, 4, 3, 2, 1 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот контрольной аминокислотной последовательности. Иными словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая имеет по крайней мере 85%, в предпочтительном варианте 90, 91, 92, 93, 94%, в еще более предпочтительном варианте - 95, 96, 97, 98, 99% идентичности последовательностей с контрольной аминокислотной последовательностью, до 15%, в предпочтительном варианте до 10, 9, 8, 7%, в еще более предпочтительном варианте - до 5, 4, 3, 2, 1% аминокислотных остатков в контрольной последовательности могут быть делетированы или замещены другой аминокислотой, или определенное количество аминокислот до 15%, в предпочтительном варианте до 10, 9, 8, 7%, в еще более предпочтительном варианте - до 5, 4, 3, 2, 1% от общего количества аминокислотных остатков в контрольной последовательности может быть вставлено в контрольную последовательность. Эти изменения контрольной последовательности могут происходить в амино- или карбокси-конечных позициях контрольной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими конечными позициями, вставке или отдельно среди остатков в контрольной последовательности, или в одной или нескольких смежных группах в пределах контрольной последовательности. В предпочтительном варианте позиции остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными замещениями. Однако консервативные замещения не включаются как совпадение при определении идентично
- 16 044953 сти последовательностей.
Термины идентичность последовательностей или процент идентичности употребляются в данном описании взаимозаменяемо. С точки зрения настоящего изобретения предусмотрено, что с целью определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновокислотных последовательностей последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, гэпы могут быть введены в последовательность первой аминокислоты или нуклеиновой кислоты для оптимального сопоставления со второй аминокислотной или нуклеиновокислотной последовательностью). Потом сравнивают аминокислотные или нуклеотидные остатки в соответствующих аминокислотных или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занимается такой же аминокислотой или нуклеотидным остатком, как в соответствующей позиции во второй последовательности, молекулы в этой позиции считаются идентичными. Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от количества идентичных позиций, являющихся общими между последовательностями (т.е.% идентичности = количество идентичных позиций/ общее количество позиций (т.е., позиции, которые частично перекрываются) х 100). В предпочтительном варианте две последовательности имеют одинаковую длину.
Сравнение последовательностей осуществляют по всей длине двух сравниваемых последовательностей или по фрагменту двух последовательностей. Обычно сравнение осуществляют по полной длине двух сравниваемых последовательностей. Однако идентичность последовательностей может осуществляться на участке, который включает, например, двадцать, пятьдесят, сто или больше смежных аминокислотных остатков.
Специалистам в данной области техники известно, что существует несколько разных компьютерных программ для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с применением математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеиновокислотными последовательностями определяют, применяя алгоритм Нидлмана-Вунша (J. Mol. Biol. (48): 444 - 453 (1970)), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения Accelrys GCG (http://www.accelrys.com/products/gcg/), с использованием матрицы Blosum 62 или матрицы РАМ250 и штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области техники станет понятно, что все эти разные параметры дают несколько отличные результаты, но общий процент идентичности двух последовательностей не подвергается значительным изменениям при применении разных алгоритмов.
Белковые последовательности или нуклеиновокислотные последовательности согласно настоящему изобретению также могут применяться как искомые последовательности для осуществления поиска в открытых базах данных, например, для распознавания представителей семейства или родственных последовательностей. Такие поиски осуществляют, применяя программы BLASTN и BLASTP (версия 2.0) согласно Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 10. Поиск белков BLAST осуществляют с помощью программы BLASTP, счет = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологических молекулам белков согласно изобретению. Для получения выравнивания с пробелами с целью сравнения применяют программу Gapped BLAST, как описано в публикации Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389 - 3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTP и BLASTN). См. стартовую страницу Национального центра биотехнологической информации http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
EHV-1, EHV-4, & CAdV / определение технологии рекомбинантного вектора.
Термин непарнокопитные или лошадиный означает принадлежность к семейству Equidae, которое включает коней, ослов и зебр, в предпочтительном варианте коней. Кроме того, термин непарнокопитные или лошадиный также охватывает гибриды семейства Equidae (например, мулов, лошаков и т.п.).
Вирус герпеса или вектор вируса герпеса касается видов семейства Herpesviridae ряда Herpesvirales.
Термин вектор вируса герпеса непарнокопитных или вирус герпеса непарнокопитных означает представителя семейства Herpesviridae, поражающего коней. На данное время идентифицировано восемь разных видов герпесвирусов непарнокопитных, пять из которых относятся к подсемейству alphaherpesvirinae и три к gammaherpesvirinae.
(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30).
Термин EHV-1 означает герпесвирус 1 непарнокопитных, который относится к подроду Varicellovirus рода Alphaherpesvirinae семейства Herpesviridae. Неограничительным примером контрольной последовательности для EHV-1 может быть, например, штамм дикого типа EHV-1 ab4 (номер доступа в Genbank AY665713.1) или RacH (Hubert, p. H., Birkenmaier, S., Rziha, H.-J. and Osterrieder, N. (1996), Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1 (EHV-1) Strain RacH During Attenuation. Journal of Veterinary
- 17 044953
Medicine, Series B, 43: 1 - 14.).
Термин EHV-4 означает герпесвирус 4 непарнокопитных, который относится к подроду Varicellovirus рода Alphaherpesvirinae семейства Herpesviridae.
Термин CAdV, CAV, CAV-1 или CAV-2 означает аденовирус собачьих 1-го типа или 2-го типа, соответственно, который относится к роду Mastadenovirus семейства Adenoviridae. Однако, согласно более новой таксономии (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30), термин аденовирус собачьих (CAdV) теперь охватывает оба вида CAV-2 и CAV-1.
Рекомбинантный вектор CAdV или rCAdV и/или вектор rCAdV либо rCAdV или rCAd2V касается аденовируса собачьих, который включает по крайней мере одну экзогенную экспрессионную кассету (т.е. включает кодирующие последовательности в функциональном соединении с промоторами, энхансерами и другими подходящими регуляторными элементами), например, кодирующую маркер экспрессии трансгена (такой, как зеленый флуоресцентный белок), и в предпочтительных вариантах осуществления по крайней мере один нужный ген и/или нужный эпитоп.
Вектор rCAdV может быть получен стандартными способами, известными специалистам в области вирологии и молекулярной биологии. Однако для способствования манипуляции с геномом CAdV и изготовлению вектора изобретение также обеспечивает бактериальный челночный вектор, в одном неограничительном примере плазмиду thepBR322, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую геном CadV. Кроме того, бактериальная искусственная хромосома (ВАС) также может способствовать манипуляции CAdV в бактериальной системе.
Определение вакцин.
Иммуногенная или иммунологическая композиция означает композицию вещества, включающую по крайней мере один антиген или его иммуногенную часть, которая обеспечивает иммунологическую реакцию в организме хозяина клеточной или опосредуемой антителом иммунной реакции на композицию.
Употребленный авторами термин антиген хорошо понятен специалистам в данной области техники и включает вещества, являющиеся иммуногенными, т.е., являющиеся иммуногенами, а также вещества, вызывающие иммунологическую невосприимчивость или анергию, т.е., отсутствие реакций со стороны защитных механизмов организма на посторонние вещества. В контексте данного описания термин антиген означает белки полной длины, а также их пептидные фрагменты, которые содержат или включают эпитоп.
Иммуногенная композиция в контексте данного описания может означать полипептид или белок, такой, как, например, поверхностный белок вируса, который обеспечивает иммунологическую реакцию, как описывается авторами. Термин иммуногенный фрагмент или иммуногенная часть означает фрагмент или усеченную и/или замещенную форму белка или полипептида, которая включает один или несколько эпитопов и, таким образом, обеспечивает описанную авторами иммунологическую реакцию. В целом такие усеченные и/или замещенные формы или фрагменты включают по крайней мере шесть смежных аминокислот из белка полной длины. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с применением любых из многочисленных технологий картирования эпитопа, которые общеизвестны среди специалистов в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут определяться путем одновременного синтезирования большого количества пептидов на твердых основах, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и реакции пептидов с антителами, пока пептиды остаются прикрепленными к основам. Такие технологии известны в данной области техники и описываются, например, в Патенте США № 4,708,871; публикациях Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 -4002; и Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-15. Подобным образом конформационные эпитопы могут быть легко идентифицированы путем определения пространственной конформации аминокислоты, например, путем рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См. Epitope Mapping Protocols выше. Синтетические антигены также охватываются данным определением, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. См., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777 2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157: 3242 - 3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol, and Cell Biol. 75: 402 - 408; и Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998 (идеи и содержание всех этих источников включены в данное описание путем ссылки).
Изобретение также обеспечивает иммуногенную композицию или композицию вакцины, содержащую рекомбинантный вирус CAdV или вектор и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантный вирус CAdV или вектор (или продукт его экспрессии), обеспечивает иммунологический ответ - местный или системный. Ответ может, но не обязательно, быть защитным. Композиция вакцины обеспечивает местный или системный защитный ответ. Соответствующим образом, термин иммуногенная композиция включает композицию вакцины (поскольку два предыдущие термина могут означать защитные композиции).
Термин вакцина в контексте данного описания касается фармацевтической композиции, вклю- 18 044953 чающей по крайней мере один иммунологически активный компонент, который вызывает иммунологический ответ у животных, и, возможно, хотя и не обязательно, один или несколько дополнительных компонентов, которые повышают иммунологическую активность действующего компонента. Кроме того, вакцина также может включать другие компоненты, типичные для фармацевтических композиций. Для различения, иммунологически активный компонент вакцины может включать полные вирусные частицы, или в их первоначальной форме, или как аттенуированные частицы в так называемой ослабленной живой вакцине (MLV), или частицы, инактивированные соответствующими способами в так называемой убитой вакцине (KV). В другой форме иммунологически активный компонент вакцины может включать соответствующие элементы организмов (субъединичные вакцины), причем эти элементы генерируются или путем разрушения целой частицы, или культур роста, содержащих такие частицы, с необязательными этапами последующей очистки, которые обеспечивают на выходе нужную(и) структуру(и), или с помощью синтетических процессов, включающих соответствующую манипуляцию путем применения подходящей системы, например, на основе бактерий, насекомых, млекопитающих или других видов, плюс, необязательно, последующие процедуры изоляции и очистки, или путем вызывания синтетических процессов в организме животного, нуждающегося в вакцине, путем прямого включения генетического материала с применением подходящих фармацевтических композиций (вакцинация полинуклеотидом). Вакцина может включать один или одновременно несколько описанных выше элементов. Употребленный в конкретных аспектах настоящего изобретения термин вакцина касается живой вакцины или живого вируса, которые также называются рекомбинантной вакциной. В другом конкретном аспекте настоящего изобретения вакцина означает инактивированный или убитый вирус, включая вирусоподобные частицы (VLP). Таким образом, вакцина может быть субъединичной вакциной или убитой (KV) или инактивированной вакциной.
Под животным следует понимать млекопитающих, человека, птиц и т.п. Животное может быть выбрано из группы, к которой относятся лошадиные (например, конь, зебра, осел), собачьи (например, собаки, волки, лисицы, койоты, шакалы), кошачьи (например, львы, тигры, домашние коты, дикие коты, другие большие коты и другие кошачьи, включая гепарда и рысь), овечьи (например, овцы), крупный рогатый скот (например, коровы, буйволы), свиные (свинья), птицы (например, куры, утки, гуси, индюки, перепелки, фазаны, попугаи, зяблики, ястребы, вороны, страусы, эму и казуары), приматы (например, полуобезьяны, долгопяты, макаки, гиббоны, человекоподобные обезьяны) и рыбы. Термин животное также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональную и фетальную стадии. Термин предназначенное для получения пищевых продуктов сельскохозяйственное животное означает несобачьих животных, которых используют для человеческого потребления, таких, как крупный рогатый скот, свиньи, кони, домашняя птица, овцы, рыба и т.п., в предпочтительном варианте предназначенное для получения пищевых продуктов сельскохозяйственное животное означает свинью и скот, в наиболее предпочтительном варианте - свинью.
Примеры домашних животных включают виды кошачьих.
С точки зрения введения несобачьим животным рекомбинантный CadV обеспечивает преимущество экспрессии без продуктивной репликации. Репликация аденовируса собачьих ограничивается видами собачьих, и в литературе нет сообщений о CAdV2, вызывающем продуктивную инфекцию в любых отличных от собачьих видах, включая человека. Это ограничение со стороны хозяина обеспечивает внутренний защитный барьер для передачи вируса к другим видам и делает применение вакцинных векторов на основе CAdV2 в межвидовой ветеринарии привлекательным предложением. Таким образом, изобретение охватывает способы амплификации или экспрессии белка путем введения или инокуляции хозяина рекомбинантным вирусом CAdV2 или вектором, причем хозяином не является представитель собачьих или не является естественный хозяин рекомбинантного вируса или вектора, и/или существует экспрессия без продуктивной репликации и/или с ограниченным репликативным циклом.
Для введения животным семейства собачьих, поскольку CAdV, в частности, CAdV2, применяют в качестве вакцинных штаммов для собак, настоящее изобретение обеспечивает средство введения дополнительного(ых) нужного(ых) эпитопа(ов), например, антигена(ов) патогена(ов) или токсина(ов) собачьих. Экспрессия дополнительного(ых) нужного(ых) эпитопа(ов), кодирующихся в векторе rCAdV2, таким образом, обеспечивает средство вызывания in vivo ответов на этот (эти) нужный(ые) эпитоп(ы), а также аденовирус собачьих путем инокуляции собаки или щенка вакцинным рекомбинантным CAdV2. Дополнительный(е) нужный(ые) эпитоп(ы) могут быть антигеном патогена собачьих (кроме аденовируса), из антигена патогена собачьих (кроме аденовируса), другим антигеном, который вызывает ответ у собак или щенков на патоген собачьих (кроме аденовируса), или из другого антигена, который вызывает ответ у собак или щенков на патоген собачьих (кроме аденовируса).
Соответствующим образом, данное изобретение предусматривает, что рекомбинантный CAdV2 может содержать гетерологическую ДНК, кодирующую нужный эпитоп из любого антигена патогена собачьих, например: бешенства, герпесвируса собачьих, вируса собачьей чумы, парвовируса собачьих и т.п. Варианты осуществления изобретения включают рекомбинанты CadV, содержащие экзогенную ДНК, которая кодирует больше одного белка, например, кодирует два или больше эпитопов, например, антигены патогенов собачьих. Изобретение также предусматривает композиции, содержащие рекомби- 19 044953 нанты CAdV в комбинации с другими антигенами.
Для введения животным, не относящимся к собачьим, настоящее изобретение обеспечивает средство введения нужного эпитопа, причем нужный антигенный эпитоп является антигеном, производным от патогена предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного, например, выбранного из группы патогенов крупного рогатого скота: вируса диареи крупного рогатого скота (BVDV), вируса парагриппа-3 (PI-3), вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота (BRSV), герпесвируса крупного рогатого скота (BHV), ротавируса крупного рогатого скота (BRV), энтеровируса крупного рогатого скота (BEV), коронавируса крупного рогатого скота (BCV), бешенства крупного рогатого скота (BR), парвовируса крупного рогатого скота (ВР), аденовируса, астровируса, Mannheimia haemolytica (старое название Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus (Histophilus ovis и Haemophilus agni), актиномицета (Corynebacterium), Actinomyces pyogenes, Chlamydia psittaci, Campylobacter fetus venerealis и Campylobacter fetus fetus (старое название С fetus intestinalis), Leptospira interrogans, Leptospira hardjo, Leptospira pomona и Leptospira grippotyphosa, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo (Leptospira hardjoprajitno и Leptospira hardjo-bovis), Brucella abortus, Brucella suis и Brucella melitensis, Listeria monocytogenes, Chlamydia psittaci, Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Moraxella bovis, видов Klebsiella, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium; Salmonella newport, видов Mycobacterium avium paratuberculosis, Cryptsporidium parvum, Cryptsporidium hominis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, видов Mycoplasma, Mycoplasma dispar и видов Ureaplasma, Tritrichomonas foetus, Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton sarkisovii, Neospora caninum (старое название Toxoplasma gondii), Babesia bigemina и Babesia bovis, Dictyocaulus viviparous (легочная нематода), и их комбинаций. Для введения животным, не относящимся к собачьим, настоящее изобретение обеспечивает средство введения нужного эпитопа, причем нужный антигенный эпитоп является антигеном, производным от патогена предназначенного для получения пищевых продуктов сельскохозяйственного животного, например, выбранного из группы патогенов свиней: видов Salmonella, в частности, S. typhimurium S. choleraesuis; астровирусов; ротавируса; вируса трансмиссивного гастроэнтерита; видов Brachyspira, в частности, В. hyodysenteriae, В. pilosicoli; видов Clostridium, в частности, С. difficile, С. perfringens типов А, В и С, С. novyi, С. septicum, С. tetani; кишечных пикорнавирусов свиней; кишечных калицивирусов свиней; респираторных патогенов, к которым относятся: Actinobacillus pleuropneumonia; Bordetella bronchiseptica; Erysipelothrix rhsiopathiae; Haemophilus parasuis, в частности, подтипов 1, 7 и 14; виды Pasteurella, в частности, p. multocida; виды Mycoplasma, в частности, М. hyopneumoniae, M. hyorhinis; вирус свиного гриппа А; вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS); цирковирус свиней; парвовирус свиней; вирус псевдобешенства; Eperythrozoonosis suis, виды Mycobacterium, в частности, М. avium, M. intracellulare, M. bovis; респираторный коронавирус свиней; коронавирус свиней, в частности, вирус трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), вирус эпидемической диареи свиней (PEDV) и дельта-коронавирус; Arcanobacterium pyogenes; аденовирус свиней; классическая чума свиней; цитомегаловирусы свиней; африканская чума свиней; или другие патогены, к которым относятся Escherichia coli, виды Streptococcus, в частности, S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, в предпочтительном варианте подвид equisimilis; Brucella suis, в частности, биовары 1, 2 и 3; виды Leptospira, в частности, L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe; вирус энцефаломиокардита; вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита; вирус японского энцефалита; вирус лихорадки Западного Нила; реовирус; рубулавирус; вирус Менангле; вирус Нипах; вирус везикулярного стоматита; вирус везикулярной экзантемы свиней; поксвирус свиней; вирус герпеса свиней; и Staphylococcus hyicus, и их комбинации.
Термин ДНК-вакцинация или вакцинация полинуклеотидом означает прямую инокуляцию генетического материала с применением подходящих фармацевтических композиций.
Специалистам в данной области техники известны разные физические и химические способы инактивации. Термин инактивированный касается ранее вирулентных или невирулентных вируса или бактерии, которые были подвергнуты облучению (ультрафиолетовыми лучами (UV), рентгеновскими лучами, электронным пучком или гамма-лучами), нагреванию или химической обработке для инактивации или уничтожения таких вируса или бактерии при сохранении их иммуногенности. Подходящими инактивирующими агентами являются бета-пропиолактон, бинарный или бета- либо ацетил-этиленимин, глутаральдегид, озон и формалин (формальдегид).
Для инактивации формалином или формальдегидом формальдегид обычно смешивают с водой и метиловым спиртом для образования формалина. Добавление метилового спирта предотвращает распад или перекрестную реакцию во время процесса активации. В одном варианте осуществления применяют приблизительно от 0,1 до 1% 37% раствора формальдегида для инактивации вируса или бактерии. Критически важным является регулирование количества формалина, достаточного для обеспечения инактивации материала, но не настолько большого для того, чтобы возникали побочные эффекты из-за высокой дозы.
- 20 044953
Конкретнее, термин инактивированный в контексте вируса означает, что вирус не способен к репликации in vivo или in vitro и, соответственно, термин инактивированный в контексте бактерии означает, что бактерия не способна к воспроизводству in vivo или in vitro. Например, термин инактивированный может касаться вируса, который был размножен in vitro, и был инактивирован с применением химических или физических средств, таким образом, чтобы он утратил способность к репликации. В другом примере термин инактивированный может касаться бактерии, которая была размножена, а потом инактивирована с применением химических или физических средств с образованием в результате суспензии бактерии, фрагментов или компонентов бактерии, например, с образованием бактерина, который может применяться как компонент вакцины.
В контексте данного описания термины инактивированный, убитый или KV употребляются взаимозаменяемо.
Термин живая вакцина касается вакцины, которая включает либо живой организм, либо репликационно-компетентный вирус или вирусный вектор.
Фармацевтическая композиция по существу состоит из одного или нескольких ингредиентов, способных модифицировать физиологические, например, иммунологические функции организма, в который ее вводят, или организмов, которые живут в/на этом организме. Термин включает, кроме прочего, антибиотики или противопаразитарные средства, а также другие составляющие, которые обычно применяют для достижения определенных других целей, к которым, кроме прочих, относятся технологические характеристики, стерильность, стойкость, возможность введения композиции энтеральным или парентеральным путями, например, перорально, интраназально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, чрескожно или другим подходящим путем, переносимость после введения или свойства контролируемого высвобождения. Неограничительный пример такой фармацевтической композиции, представленной исключительно с целью демонстрации, может быть приготовленный таким образом: супернатант культуры клеток инфицированной культуры клеток смешивают со стабилизатором (например, спермидином и/или альбумином сыворотки крупного рогатого скота (BSA) и смесь после этого лиофилизируют или дегидратируют другими способами. Перед вакцинацией смесь регидратируют в водных растворах (например, солевом, фосфатно-буферном растворе (PBS) или неводных растворах (например, масляной эмульсии, адъюванте на алюминиевой основе).
Для рекомбинантных вирусных вакцин на основе вектора предпочтительными путями введения являются подкожный (SC), внутримышечный (IM), чрескожный (TD) или внутрикожный (ID). Это введение осуществляют с помощью шприца с иглой или устройства без иглы. Варианты осуществления изобретения могут вводиться орально, интраназально, анально, вагинально, перорально, внутрижелудочно, парентерально, подкожно, чрескожно, внутримышечно или внутривенно. Примерами композиций согласно изобретению могут быть жидкие препараты для отверстий, например, для орального, назального, анального, вагинального, перорального, внутрижелудочного и др. введения, такие, как суспензии, сиропы или эликсиры; и препараты для парентерального, подкожного, чрескожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъекционного введения), такие, как стерильные суспензии или эмульсии. В таких композициях рекомбинантный CAdV2 и/или антигены могут находиться в смеси с подходящим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, таким, как стерильная вода, физиологический солевой раствор, глюкоза и т.п. Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие, как увлажняющие агенты или эмульгаторы, буферные средства для поддержания уровня рН, адъюванты, гелеобразующие вещества или примеси, повышающие вязкость, консерванты, ароматизаторы, красители и т.п., в зависимости от пути введения и нужного препарата.
В одном аспекте настоящее изобретение касается вакцинной стратегии, которая основывается на режиме введения прайм-буст, причем для прайм-введения и буст-введения применяют композицию, включающую фармацевтически или ветеринарно приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель, адъювант или основу и рекомбинантный CAdV согласно настоящему изобретению.
Режим прайм-буст включает по крайней мере одно прайм-введение и по крайней мере одно буствведение с применением по крайней мере одного гетерологического антигена и/или его вариантов или фрагментов. Вакцина, которую применяют для прайм-введения, может по природе отличаться от вакцин, применяемых впоследствии в качестве бустерной вакцины. Также следует отметить, что и праймвведение, и буст-введение могут включать рекомбинантный CAdV согласно настоящему изобретению. Прайм-введение может включать одно или несколько введений. Подобным образом и буст-введение может включать одно или несколько введений.
Другой аспект настоящего изобретения касается комплекта для прайм-буст-вакцинации согласно настоящему изобретению. Комплект может включать по крайней мере два флакона: первый флакон, содержащий вакцину для прайм-вакцинации согласно настоящему изобретению, и второй флакон, содержащий вакцину для буст-вакцинации согласно данному изобретению. Комплект в предпочтительном варианте может содержать дополнительные первый или второй флаконы для дополнительных праймвакцинаций или дополнительных буст-вакцинаций.
В одном варианте осуществления комплект может включать два флакона, один из которых содер- 21 044953 жит вакцину на основе плазмиды для прайм-вакцинации согласно настоящему изобретению, а другой флакон содержит вакцину на основе рекомбинантного вирусного вектора для буст-вакцинации согласно настоящему изобретению.
В контексте данного описания фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические агенты, агенты, задерживающие адсорбцию, и т.п. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, в частности, в тех, которые включают лиофилизированные иммуногенные композиции, стабилизаторы для применения согласно настоящему изобретению включают стабилизаторы для лиофилизации или сушки замораживанием.
В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению содержит адъювант. Адъюванты в контексте данного описания могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсию типа вода в масле, эмульсию типа масло в воде, эмульсию типа вода в масле в воде. Эмульсия, в частности, может быть на основе легкого жидкого вазелинового масла (по стандартам Европейской фармакопеи); изопреноидного масла, такого, как сквалан или сквален; масла, образованного в результате олигомеризации алкенов, в частности, изобутена или децена; эстеров кислот или спиртов, которые содержат линейную алкильную группу, конкретнее - растительные масла, этилолеат, пропиленгликольди-(каприлат/капрат), глицерилтри(каприлат/капрат) или пропиленгликольдиолеат; эстеры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эстеры изостеариновой кислоты. Масло применяют в комбинации с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторами в предпочтительном варианте являются неионные поверхностноактивные вещества, в частности, эстеры сорбита, маннита (например, ангидроманнитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислоты, которые являются необязательно этоксилированными, и блок-сополимеров полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности, продуктов Pluronic, в частности, L121. См. Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.), John Wiley and Sons, NY, pp 51 - 94 (1995), и Todd et al., Vaccine 15: 564 - 570 (1997). Типичными адъювантами являются эмульсия SPT, описанная на странице 147 публикации Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach под редакцией M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсия MF59, описанная на странице 183 той же публикации.
Еще одним примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и производного алкенила. Предпочтительными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые сшиты, в частности, с полиалкенильными этерами Сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под термином карбомер (Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). Специалисты в данной области техники также могут обратиться к Патенту США № 2,909,462, в котором описываются такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по крайней мере 3 гидроксильные группы, в предпочтительном варианте - не больше, чем 8, атомы водорода с по крайней мере тремя гидроксилами, замененными на ненасыщенные алифатические радикалы, имеющие по крайней мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этилен-ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы сами могут содержать другие заместители, такие, как метил. Продукты, продающиеся под названием CARBOPOL®; (BF Goodrich, Ohio, США), являются особенно подходящими. Они сшиты с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Среди них можно упомянуть Carbopol 974Р, 934Р и 971P. Наибольшее предпочтение отдают применению CARBOPOL® 971P. К сополимерам малеинового ангидрида и производным алкенила относятся сополимеры EMA (Monsanto), являющиеся сополимерами малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде ведет к образованию раствора кислоты, который должен быть нейтрализован, в предпочтительном варианте до физиологического уровня рН, для получения раствора адъюванта, в который включают такую иммуногенную, иммунологическую или вакцинную композицию.
Другими подходящими адъювантами являются, кроме прочих, адъювантная система RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), монофосфорил-липид А, липидаминный адъювант Avridine, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или другой), токсин холеры, IMS 1314 или мурамилдипептид, или естественные или рекомбинантные цитокины либо их аналоги или стимуляторы высвобождения эндогенного цитокина, среди многих других.
Можно ожидать, что адъювант может добавляться в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, в предпочтительном варианте в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, в еще более предпочтительном варианте - в количестве от приблизительно 500 мкг до приблизительно 5 мг на дозу, в еще более предпочтительном варианте - в количестве от приблизительно 750 мкг до приблизительно 2,5 мг на дозу, и в наиболее предпочтительном варианте - в количестве от приблизительно 1 мг на дозу. В альтернативном варианте адъювант может быть в концен- 22 044953 трации приблизительно от 0,01 до 50%, в предпочтительном варианте в концентрации приблизительно от до 30%, в еще более предпочтительном варианте - в концентрации приблизительно от 5 до 25%, в еще более предпочтительном варианте - в концентрации приблизительно от 7 до 22%, и в наиболее предпочтительном варианте - в концентрации от 10 до 20% по объему конечного продукта.
Разбавители включают воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Изотонические агенты могут включать, кроме прочих, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают, кроме прочих, альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты.
Изолированный означает измененный человеческой рукой из естественного состояния, т.е. если он встречается в природе, то он был изменен или удален из первоначальной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, присутствующий в природе в живом организме, не является изолированным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих материалов его естественного состояния, является изолированным в смысле употребленного в этом описании термина.
Аттенуация означает снижение вирулентности патогена. Согласно данному изобретению, аттенуация является синонимом лишения вирулентности. Согласно данному изобретению, аттенуированным вирусом является тот, в котором вирулентность была снижена таким образом, чтобы он не вызывал клинических признаков инфекции, но был способен вызывать иммунную реакцию у животного, являющегося объектом, но этот термин также может означать, что уменьшается частота и тяжесть клинических признаков у животных, инфицированных аттенуированным вирусом, в частности, заявленным вирусным вектором CAdV, по сравнению с контрольной группой животных, инфицированных неаттенуированным вирусом или патогеном и не получающих аттенуированного вируса. В этом контексте термин снижать / сниженный означает снижение по крайней мере на 10%, в предпочтительном варианте на 25%, в еще более предпочтительном варианте - на 50%, в еще более предпочтительном варианте - на 60%, в еще более предпочтительном варианте - на 70%, в еще более предпочтительном варианте - на 80%, в еще более предпочтительном варианте - на 90% и в наиболее предпочтительном варианте - на 100% по сравнению с контрольной группой, как определено выше. Таким образом, аттенуированный, лишенный вирулентности патоген, такой, как, например, заявленный аттенуированный вирусный вектор, в частности, заявленный вирусный вектор CAdV, является пригодным для создания ослабленной живой вакцины (MLV) или модифицированной живой иммуногенной композиции.
В данном описании эффективная доза означает, кроме прочего, количество антигена, вызывающее или способное вызвать иммунную реакцию, которая обеспечивает снижение клинических симптомов у животного, которому вводится антиген.
В данном описании термин эффективное количество означает, в контексте композиции, количество иммуногенной композиции, способной вызвать иммунную реакцию, которая уменьшает частоту или снижает тяжесть инфекции или случаев болезни у животных. В частности, эффективное количество касается количества колониеобразующих единиц (CFU) на дозу. В альтернативном варианте в контексте терапии термин эффективное количество касается количества терапии, которое достаточно для снижения или ослабления тяжести или продолжительности болезни или нарушения, или одного или нескольких их симптомов, предотвращения прогрессирования болезни или нарушения, вызывания регрессии болезни или нарушения, профилактики рецидива, развития, начала или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с болезнью или нарушением, или усиления или улучшения профилактики или лечения при применении другой терапии или другого терапевтического средства.
Иммунная реакция или иммунологическая реакция означает, кроме прочего, развитие клеточной и/или опосредуемой антителом иммунной реакции на (иммуногенную) композицию нужной вакцины. Обычно иммунная или иммунологическая реакция включает, кроме прочего, один или несколько таких эффектов: продуцирование или активацию антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в нужную композицию или вакцину. В предпочтительном варианте хозяин демонстрирует терапевтический или защитный иммунологический (вторичный) ответ, таким образом, чтобы резистентность к новой инфекции повышалась, и/или клиническая тяжесть болезни снижалась. Такая защита демонстрируется путем уменьшения количества симптомов, тяжести симптомов или отсутствия одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией патогена, задержки начала виремии, снижения вирусной персистенции, снижения общей вирусной нагрузки и/или снижения вирусной экскреции. Таким образом, изобретение также обеспечивает способ вызывания иммунологической реакции у хозяина, относящегося к позвоночным, который включает введение хозяину иммуногенной или вакцинной композиции, включающей рекомбинантный вирус CadV или вектор и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Защита от болезни, защитный иммунитет, функциональный иммунитет, снижение клинических симптомов, вызывание иммунологической реакции, индуцирование/продуцирование нейтрализующих антител и/или преобразование сыворотки и другие подобные фразы означают продуцирование антител против антигена и/или вызывание в результате частичной или полной реакции против болезни или состояния, которая генерируется путем введения одной или нескольких терапевтических компози- 23 044953 ций согласно изобретению, или их комбинацию, что в результате обеспечивает уменьшение вредных последствий, которые бы ожидались у неиммунизированного субъекта, испытавшего действие болезни или инфекции. То есть, тяжесть вредных последствий инфекции у вакцинированного субъекта уменьшается. Инфекция вакцинированного субъекта может быть снижена, замедленная или полностью смещенная. В этом описании в случае, если имеется в виду полное предотвращение инфекции, это специально указывается. Если о полном предотвращении не сказано, термин включает частичное предотвращение.
В контексте данного описания снижение частоты и/или тяжести клинических признаков или снижение клинических симптомов означает, кроме прочего, уменьшение количества инфицированных субъектов в группе, уменьшение или устранение количества субъектов, демонстрирующих клинические признаки инфекции, или снижение тяжести любых клинических признаков, наличествующих у одного или нескольких субъектов, по сравнению с инфекцией дикого типа. Например, этот термин должен касаться любого снижения патогенной нагрузки, выделения патогена, снижения передачи патогена или снижения любого клинического признака, который является симптомом малярии. В предпочтительном варианте эти клинические признаки снижаются у одного или нескольких субъектов, получающих терапевтическую композицию согласно настоящему изобретению, по крайней мере на 10% по сравнению с субъектами, которые не получают композицию и становятся инфицированными. В еще более предпочтительном варианте клинические признаки снижаются у субъектов, получающих композицию согласно настоящему изобретению, по крайней мере на 20%, в предпочтительном варианте по крайней мере на 30%, в еще более предпочтительном варианте - по крайней мере на 40%, и в еще более предпочтительном варианте - по крайней мере на 50%.
Термин увеличенная защита в контексте данного описания означает, кроме прочего, статистически значимое снижение одного или нескольких клинических симптомов, связанных с инфицированием инфекционным агентом, в вакцинированной группе субъектов по сравнению с невакцинированной контрольной группой субъектов. Термин статистически значимое снижение клинических симптомов означает, кроме прочего, что частота случаев по крайней мере одного клинического симптома в вакцинированной группе субъектов по крайней мере на 10%, в предпочтительном варианте на 20%, в еще более предпочтительном варианте - на 30%, в еще более предпочтительном варианте - на 50%, и в еще более предпочтительном варианте - на 70% ниже, чем в невакцинированной контрольной группе после иммунизации инфекционным агентом.
Длительная защита означает улучшенную эффективность, которая сохраняется на протяжении по крайней мере 3 недель, но в еще более предпочтительном варианте - по крайней мере 3 месяца, в еще лучшем варианте - по крайней мере 6 месяцев. В случае скота наиболее желательна длительная защита, которая продолжается до достижения среднего возраста, в котором животных сдают на мясо.
Термин снижение виремии, вызванной вирусом, означает, кроме прочего, уменьшение вирусов, поступающих в кровоток животного, причем уровень виремии, т.е. количество копий вирусных ДНК или РНК на мл сыворотки крови или количество бляшкообразующих колоний на децилитр сыворотки крови снижается в сыворотке крови животных, получающих композицию согласно настоящему изобретению, по крайней мере на 50% по сравнению с животными, которые не получают композицию и могут быть инфицированными. В еще более предпочтительном варианте уровень виремии снижается у животных, получающих композицию согласно настоящему изобретению, по крайней мере на 90%, в предпочтительном варианте по крайней мере на 99,9%, в еще более предпочтительном варианте - по крайней мере на 99,99%, и в еще более предпочтительном варианте - по крайней мере на 99,999%.
В контексте данного описания термин виремия, в частности, следует понимать как состояние, при котором частицы вируса воспроизводятся и циркулируют в кровотоке животного, в частности, млекопитающего, птицы или насекомого.
Безопасность означает отсутствие неблагоприятных последствий у вакцинированного животного после вакцинации, включая, кроме прочего: потенциальное возвращение вакцины на основе бактерий к вирулентности, клинически значимые побочные эффекты, такие, как стойкая, системная болезнь или неприемлемое воспаление в месте введения вакцины.
Термины вакцинация или вакцинирование или их варианты в контексте данного описания означают, кроме прочего, процесс, включающий введение иммуногенной композиции согласно изобретению, которая при введении животному вызывает или способна вызывать - прямо или косвенно - иммунную реакцию у вышеупомянутого животного.
Смертность в контексте данного изобретения означает смерть, вызванную инфекцией, и включает ситуацию, в которой инфекция настолько тяжелая, что животное подвергают эвтаназии для предотвращения страданий и обеспечения гуманного лишения его жизни.
Рецептирование.
Субъект, которому вводят композицию, в предпочтительном варианте является животным, включая, кроме прочих, крупный рогатый скот, коней, овец, свиней, птицу (например, кур), коз, котов, собак, хомяков, мышей и крыс, причем в наиболее предпочтительном варианте млекопитающее является свиньей.
Композиции согласно изобретению включают эффективное иммунизирующее количество одной
- 24 044953 или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемой основы. Вакцины включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемую основу. Композиция должна соответствовать режиму введения.
Иммуногенная композиция в случае необходимости также может содержать незначительное количество увлажняющих средств либо эмульгаторов или буферных средств для поддержания уровня рН. Иммуногенная композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией, таблеткой, пилюлей, капсулой, композицией с замедленным высвобождением или порошком. Композиция для перорального введения может включать стандартные носители, такие, как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевая соль сахарина, целлюлоза, карбонат магния фармацевтического качества и т.п.
Предпочтительные пути введения включают, кроме прочих, интраназальный, пероральный, чрескожный и внутримышечный. Желательно введение в питьевой воде, в наиболее предпочтительном варианте - единой дозой. Специалистам в данной области станет понятно, что композиции согласно изобретению также могут вводиться одной, двумя или большим количеством доз, а также другими путями введения. Например, к таким другим путям относятся подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, и, в зависимости от нужной продолжительности и эффективности лечения, композиции согласно изобретению могут вводиться один или несколько раз, а также периодически, например, ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев, и в разных дозах, например, приблизительно от 103 до 108 TCID50 (см. титр вируса выше). В конкретном аспекте настоящего изобретения доза составляет приблизительно от 103 до 108 TCID50, особенно для живого вируса / живой вакцины.
Композиции в случае необходимости могут быть представлены в упаковке или дозировочном устройстве, которое может содержать одну или несколько форм дозированных единиц, содержащих активный ингредиент. Упаковка может включать, например, металлическую фольгу или пластиковую пленку, например, блистерную упаковку. Упаковка или дозировочное устройство могут сопровождаться инструкциями для введения, в предпочтительном варианте - для введения млекопитающему, в частности, свинье. К такой упаковке может прилагаться записка в форме, определенной правительственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, причем эта записка должна отображать утверждение со стороны правительственного органа производства, применения или продажи для введения человеку.
Краткое описание фигур
Представленные далее фигуры составляют часть данного описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов данного изобретения. Изобретение лучше объясняется со ссылкой на одну или несколько из этих фигур в комбинации с подробным описанием представленных авторами конкретных вариантов осуществления.
Фиг. 1. Схематическое изображение генерации инфекционного клона CAdV2. (А) Синтезированный фрагмент ДНК, кодирующий 5' и 3' концы вирусного генома с промежуточным уникальным сайтом рестрикции и клонированный в челночный вектор pBR322 E. coli. Сайты рестрикционной эндонуклеазы PmeI (стрелки) были вставлены путем инженерии в последовательность на 5' и 3' концах ITR для облегчения эксцизии генома CAdV-2 из остова вектора pBR322. (В) В. Клонирование генома CAdV-2 длДНК в вектор через гомологическую рекомбинацию в BJ5183 REC+ E. coli. (С) Успешный HR-рекомбинантный rCAdV-2 инфекционный клон. ITR = инвертированный конечный повтор.
Фиг. 2. Схема организации Е3 участка CAdV-2.
Фиг. 3. Схематическое изображение гомологической рекомбинации между линеаризованным инфекционным клоном ДНК и Е3-направленным трансферным фрагментом CAdV-2.
Фиг. 4. Схема BIVI-генерированной Е3-делеции (АЕ3А и АЕ3В) трансферного(ых) фрагмента(ов) в остове CAdV-2.
Фиг. 5. Схема BIVI-генерированных Е3-делеций. А. Схема Е3 ORF с общими комбинированными размерами остающихся ORF1 и 2 ДНК и количеством каждого. В. Схема генома CAdV-2, показывающая общее количество Е3 ORF1 и ORF2 ДНК, остающихся в АЕ3А и АЕ3В конфигурациях. В делеции А (АЕ3А) все, кроме первых 186 нуклеотидов Е3 ORF1 и последних 301 нуклеотидов ORF2, были делетированы, тогда как для делеции В Е3 (АЕ3В) 186 нуклеотидов Е3 ORF1 и 83 нуклеотидов ORF2 остаются.
Фиг. 6. Е3 делеция и вставка экспрессионных кассет.
Фиг. 7. Выполняли анализ прочности промотора путем количественного определения экспрессии CPV VP2 путем временной экспрессии из экспрессионных последовательностей, как выявлено путем IFA в трансфицированных клетках MDCK. Панель А: показано CPV IFA клеток MDCK, трансфицированных экспрессионными плазмидами CPV VP2 под управлением промоторов CMVie или CMV5. Панель В: гистограмма CPV VP2 ELISA клеток MDCK, трансфицированных экспрессионными плазмидами CPV VP2 под управлением промоторов CMVie, CAG или CMV5, как указано. Панель С: гистограмма осуществленного с помощью Molecular Devices ImageXpress MicroXL количественного определения CPV VP2положительных клеток MDCK, трансфицированных экспрессионными плазмидами CPV VP2 под управлением промоторов CMVie или CMV5, как указано.
- 25 044953
Фиг. 8. Схема экспрессионной кассеты CMVie EGFP SV40 polyA в остове CAV-2 MCS-1-5. Вставка осуществлена в Δ Е3В ORF2, где все, кроме первых 186 нуклеотидов Е3 ORF1 и последних 82 нуклеотидов, делетированы. После гена EGFP находится сигнал polyA SV40. ITR = инвертированный конечный повтор.
Фиг. 9. Схема CMVie CPV VP2 (n) SV40 polyA экспрессионной кассеты в остове CAV-2. Вставка осуществлена в Δ Е3В ORF2, где все, кроме первых 186 нуклеотидов Е3 ORF1 и последних 82 нуклеотидов, делетированы. После гена VP2 (n) находится сигнал polyA SV40.
Фиг. 10: ПЦР-анализ rCAV-2 ДНК, очищенной от инфицированных клеток и супернатантов. ПЦР осуществляли для проверки присутствия CMVie CPV VP2 (n) трансгенной экспрессионной кассеты в rCAV2ΔE3B/CMVie CPV VP2 из изолированных вирусных ДНК. Панель A, pCAV-2 контрольный вирус; панель В, клон #1; панель С, клон #2. Панель D, контрольные реакции с CMVie CPV VP2 (n) трансферная плазмида. М является 1 т. о. + маркер длины ДНК. Панель Е. Ожидаемые результаты специфических к трансгенной экспрессионной кассете ПЦР-реакций. Реакции 1 и 2 используют праймеры, специфические к CAV-2 H-A Р VIII, U-экзон и CVP VP2; реакции 3, 4 и 5 используют праймеры, специфические к CPV VP2 (см. панель Е). Реакция 7 (положительная реакция для CAdV-2) использует CAV-2-специфические праймеры Н-А Р VIII и праймеры U-экзона.
Фиг. 11. Проточный цитометрический анализ инфицированных rCAV-2 клеток MDCK. Панели А F являются гистограммами сигнала, присутствующего в отдельных клетках. Суспензию клеток MDCK инфицировали контрольным вирусом rCAV-2, несущим BRSV F (со) (панели В и Е), или инфицировали rCAV-2, несущим экспрессионные кассеты CPV VP2 (со) (панели С и F), и окрашивали через 72 ч после инфицирования FITC-конъюгированным антителом против CPV VP2 (панели А, В и С) или FITCконъюгированным антителом против CAV2 (панели D, Е и F). Панель G представляет сводку и подсчет результатов, показанных в панели A-F.
Фиг. 12. Схема CMVie BRSV F (со) BGH polyA экспрессионной кассеты в остове CAdV-2. После гена BRSV F (со) располагается сигнал BGH polyA.
Фиг. 13. Схема CMVie RabGP BGH polyA экспрессионной кассеты в остове CAdV-2. После гена RabGP располагается сигнал BGH polyA.
Фиг. 14. CAdV-2-специфическая IFA инфицированных вирусом rCAV-2 RabGP P2 клеток E1 BMDCK. CAdV-2 IFA инфицированных клеток El B-MDCK выполняли через 60 ч после инфицирования клеток с применением антител против CAdV-2, прямо конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и моноклонального антитела мыши против RabG и FITC-конъюгированного антитела козы против мыши.
Фиг. 15. Проточный цитометрический анализ CAdV2 CMVie CPV VP 2-инфицированных клеток AI-ST 2015: через 72 ч после инфицирования.
Фиг. 16. rCAdV-2 с новыми промоторами EHV-4: проточный цитометрический анализ инфицированных клеток AI-ST 2015: через 48 ч после инфицирования.
Фиг. 17. rCAdV-2 с новыми промоторами EHV-4: дот-блот анализ экспрессии белка CPV VP2 в инфицированных клетках MDCK. 1° = 1/50 a-CPV-FITC mAb (VMRD); 2° = 1/1,000 Ig-пероксидазы козы против мыши (JIR). (А) Первоначальные данные дот-блот анализа. (В) Полуколичественные данные, полученные от дот-блот анализа: Для подсчета дот-блот анализы анализируют с помощью программы ImageJ (Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York). Цвета изображений инвертируют для вычитания фона и записывают интегральную плотность каждой точки. Значениям присваивают знаки + и -таким образом: ++++ = >800000, +++ = от 500000 до 800000, ++ = от 300000 до 499999, + = от 120000 до 299999, +/- = от 80000 до 119999 и - = <80000. Фиг. 18: выявление RabG в клетках, инфицированных rCAdV-2 p455 RabG: экспрессия выявляется в < 1% клеток, инфицированных первоначальным rCAdV-2 CMVie RabG.
Фиг. 18. Сводка проточного цитометрического анализа белков RabG, экспрессированных клетками AI-ST 2015, инфицированными инфекционными клонами rCAdV-2.
Фиг. 19А. Выявление CPV VP2 в клетках, инфицированных rCAdV-2 p430 и р455 (обозначенных как g430 и МСР455, соответственно) RabG.
Фиг. 19В. Выявление RabG в клетках, инфицированных rCAdV-2 p455 (обозначенных как МСР455) RabG.
Фиг. 19С. Выявление CAdV-2 и RabG в клетках, инфицированных rCAdV-2 р455 (обозначенных как МСР455) RabG.
Обзор последовательностей.
Представленные ниже последовательности детально представлены и, таким образом, раскрываются в настоящем изобретении.
- 26 044953
Таблица 1
ОБОЗНАЧЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ | НАЗВАНИЕ | ДНК/РНК/БЕЛОК | |
SEQ ID NO | 1 | участок CAdV2 ΔΕ3Α-Ε3 | ДНК |
SEQ ID NO | 2 | участок CAdV2 ΔΕ3Β-Ε3 | ДНК |
SEQ ID NO | 3 | промотор huCMVie | ДНК |
SEQ ID NO | 4 | промотор huCMV 5 | ДНК |
SEQ ID NO | 5 | праймер huCMVie 5’ F | Искусственный |
SEQ ID NO | 6 | праймер huCMVie 3’ R | Искусственный |
SEQ ID NO | 7 | экспрессионная кассета huCMVie EGFP | ДНК |
SEQ ID NO | 8 | прямой EGFP (ПЦР скрин-праймер) | Искусственный |
SEQ ID NO | 9 | обратный EGFP (ПЦР скрин-праймер) | Искусственный |
SEQ ID NO | 10 | экспрессионная кассета huCMVie CPV VP2 (η) | ДНК |
SEQ ID NO | 11 | Набор 1 Η-ΑΡ VIII F-праймер (ФИГ. 10Ε) | Искусственный |
SEQ ID NO | 12 | Набор 1 VP2 R-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 13 | Набор 2 VP2 F-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 14 | Набор 2U Exon R-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 15 | Набор 3 VP2 F-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 16 | Набор 3 VP2 R-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 17 | Набор 4 УР2Б-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 18 | Набор 4 VP2 R-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 19 | Набор 5УР2Б-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 20 | Набор 5VP2R-npafiMep (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 21 | Набор 6Н-АР VIIIF-праймер (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 22 | Набор 6U обратный праймер экзона (ФИГ. 10Е) | Искусственный |
SEQ ID NO | 23 | Экспрессионная кассета huCMVie CPV VP2 (со) | ДНК |
SEQ ID NO | 24 | Белок парвовируса собачьих VP2 | Белок |
SEQ ID NO | 25 | Экспрессионная кассета huCMVie RabGP | ДНК |
SEQ ID NO | 26 | гликопротеин бешенства Пастера G (п) | Белок |
SEQ ID NO | 27 | Экспрессионная кассета huCMVie BRSV F (со) | ДНК |
SEQ ID NO | 28 | Полипептид BRSV F (со) | Белок |
SEQ ID NO | 29 | Промотор EHV-4 600 и. о. (4pgG600) | ДНК |
SEQ ID NO | 30 | Промотор EHV-4 600 и. о. (4рМСР600) | ДНК |
SEQ ID NO | 31 | Промотор EHV-4 430 п. о. (pG430) | ДНК |
SEQ ID NO | 32 | Промотор EHV-4 МСР455 и. о. (р455) | ДНК |
SEQ ID NO | 33 | Праймер gG430 F | Искусственный |
SEQ ID NO | 34 | Праймер gG430 R | Искусственный |
SEQ ID NO | 35 | Праймер МСР455 F | Искусственный |
SEQ ID NO | 36 | Праймер МСР455 R | Искусственный |
SEQ ID NO | 37 | CPV VP2 десплайсированный ORF с сайтами рестрикционной эндонуклеазы BamHI и Sall | ДНК |
SEQ ID NO: 38 | CPV VP2 Gen0.95 ORF с сайтами рестрикционной эндонуклеазы BamHI и Sall | ДНК | |
SEQ ID NO: 39 | Экспрессионная кассета р430 CPV VP2 (десплайсированная) | ДНК | |
SEQ ID NO: 40 | Экспрессионная кассета р430 CPV VP2 (Gen 0.95) | ДНК | |
SEQ ID NO: 41 | Экспрессионная кассета р455 CPV VP2 (Gen 0.95) | ДНК | |
SEQ ID NO: 42 | Экспрессионная кассета р430 RabG (η) | ДНК | |
SEQ ID NO: 43 | Экспрессионная кассета р455 RabG (η) | ДНК | |
SEQ ID NO: 44 | Десплайсированный прямой праймер | Искусственный | |
SEQ ID NO: 45 | Десплайсированный обратный праймер | Искусственный | |
SEQ ID NO: 46 | Прямой праймер Gen0.95 | Искусственный | |
SEQ ID NO: 47 | Обратный праймер Gen0.95 | Искусственный |
Примеры.
Представленные ниже примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области станет понятно, что технологии, описанные ниже в примерах, представляют технологии, определенные авторами изобретения как хорошо функционирующие при практическом осуществлении изобретения и, таким образом, они считаются относящимися к предпочтительным режимам его практического осуществления. Однако специалистам в данной области техники после ознакомления с данным описанием станет понятно, что существует возможность многочисленных изменений в конкретных описанных вариантах осуществления с получением такого же самого или подобного результата без отклонения от сущности и объема изобретения.
Пример 1.
Изоляция вируса CadV.
Вирус CAdV2 первоначально был выделен из мазка из ротоглотки собаки с ларинготрахеитом и был получен как первый пассаж в линии клеток MDCK CCL-34 Американской коллекции типовых культур (АТСС). Вирус пропускали 8 раз после приобретения, и 8-й пассаж разделяли на аликвоты и определяли как исходный вакцинный вирус. Посевной исходный вакцинный вирус CAdV-2 производили в Boe- 27 044953 hringer Ingelheim Vetmedica, Inc. на основе CAdV-2, MSV Lot # 001-dil, F: 11-24-98. Главный посевной материал CAdV-2 является близко родственным с торонтским штаммом (номер доступа в Genbank
U77082.1). CAdV-2 серийно производится компанией Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. как собачья вакцина.
Инфекционный клон ДНК является полным геномом CAdV-2, клонированным в pBR322 низкокопийный челночный вектор Е. coli. Способ гомологической рекомбинации (Kremer, E.J., et al., Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer. J Virol, 2000. 74(1): p. 505 - 12.) применяли для построения ДНК инфекционных клонов. CAdV-2 ДНК очищали от посевного CAdV-2 MLV) и рекомбинировали в BJ5183 Е. coli с вектором на основе pBR322, который содержит ДНК, гомологичную инвертированным конечным повторам CAdV-2.
CAdV-2 спасали из клеток почек собак Madine Darby (MDCK), трансфицированных линеаризованным инфекционным клоном ДНК с фиг. 1 для представления полного инфекционного клона ДНК.
Пример 2.
Генерация клонов CAdV с делецией E3 и вставкой.
CAdV-2 успешно использовали как векторную вирусную вакцину для животных. Известно, что домен Е3 CAdV-2 не является незаменимым (ни одна из открытых рамок считывания Е3 (ORF) не требуется для вирусной репликации в культуре ткани (Fisher et al. 2002) и представляет логическую мишень для вставки гетерологических ДНК.
Примерами эффективных вакцин на основе CAdV-2, в которых трансгены локализованы к домену Е3, могут быть вирус собачьей чумы (Fisher et al. 2002), вирус панлейкопении кошачьих (Yang et al. 2008) и бешенства котов (Hu et al., 2007), собак (Hu et al., 2006), мышей (Li et al., 2006), енотов, свиней (Lui et al., 2008), скунсов (Henderson et al., 2009) и овец (Bouet-Cararo et al., 2011).
Фиг. 2 является схемой организации участка Е3 CAdV-2. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы Nrul с 4146 п. о. (п. о. 23932)/SalI (п. о. 28078) иллюстрируется с открытыми рамками считывания (ORF), показанными как белок Н-А VIII, ORF1, ORF2 и U-экзон. Для этого фрагмента ДНК показаны позиции выбранных сайтов рестрикционной эндонуклеазы (NruI, DraIII, SspI и SalI), и нумерация указывается относительно близкородственного торонтского штамма (номер доступа в Genbank U77082.1) CAdV-2.
Как указано в публикации Fischer et al. (2002), геномная организация Е3 участков лишь приблизительно сохранена между разными аденовирусами (Linne, Т., Differences in the Е3 regions of the canine adenovirus type 1 and type 2. Virus Res, 1992. 23 (1-2): p. 119 - 33), поэтому точные границы несущественных локусов Е3 участка CAdV2 не могут быть транспонированы из сайтов Е3 вставки в другие вирусы. В первой последовательности весь сегмент ДНК ORF1 и ORF2 из Е3 был делетирован для максимизации размера трансгенных вставок, однако инфекционные клоны ДНК не способствовали спасению rCAdV-2. Было обнаружено, что эта стратегия случайно приводит к удалению последних пяти кодонов (включая стоп-кодон) гена гексон-ассоциированного белка VIII (Н-А-PVIII), который распространяется на Е3 ORF1 (другая рамка считывания) в 5' Е3 фланкирующей ДНК, с образованием в результате гена Н-А PVIII с существенным удлинением 3' (результатом может быть Н-А PVIII с делецией 5 аминокислот с последующим существенным с-конечным добавлением).
Таким образом, трансферные плазмиды были переконструированы таким образом, что 5' и 3' Е3 фланкирующие ДНК содержали первые 183 п. о. Е3 ORF1 и последние 47 п. о. ORF2, которые оказались достаточными для спасения rCAdV-2.
Пример 3.
Гомологическая рекомбинация для генерации инфекционных клонов днк CADV-2.
Гомологическую рекомбинацию в Rec+ BJ5183 Е. coli между линеаризованными инфекционными клонами ДНК CAdV-2 и Е3-направленными трансферными плазмидами / фрагментами CAdV-2 на основе способов, описанных в публикациях Chartier et al. (1996) и Kremer et al. (2000), применяли для генерации rCAdV-2 с кассетами экспрессии трансгена, локализованными к Е3 домену. Как объясняется на фиг. 3, инфекционный клон, содержащий уникальный сайт рестрикции в Е3 домене, рекомбинируется с трансферным фрагментом, содержащим ~500 п. о. CAdV-2 фланкирующую ДНК 5' и 3' к кассетам экспрессии трансгена для а) направления кассеты экспрессии трансгена на Е3 участок и б) эффективного удаления выбранных частей Е3.
ДНК была изолирована из расширенных клонов BJ5183, идентифицированных с применением трансген-специфического ПЦР-скрининга, и эти ДНК расщеплялись путем электрофореза на агарозном геле для подтверждения их миграции в >23,1 т. о. (успешный HR в результате обеспечивает разновидность ДНК ~ 35 т. о., которая, как суперскрученная ДНК, мигрирует похоже на 23,1 т. о. маркер на 0,7% агарозном геле). Данные ДНК после этого трансформировали и расширяли в Stbl2 или XL-10 Gold E. coli для очистки в большем масштабе и применения для генерации rCAdV-2 в клетках млекопитающих.
Фиг. 3 является схематическим изображением гомологической рекомбинации между NruI/SalIлинеаризованным инфекционным клоном ДНК (нативная последовательность CAdV-2) и Е3направляющим CAdV-2 трансферным фрагментом, который включает вышеупомянутую делецию Е3 и уникальный(е) сайт(ы) рестрикции (определенный как MCS для сайта множественного клонирования), расположенный(е) между остальными частями Е3. Инфекционный клон ДНК ограничивается левым и
- 28 044953 правым инвертированными конечными повторами, LITR и RITR, соответственно.
Пример 4.
Генерация инфекционных клонов ДНК ΔΕ3 rCAdV-2.
ЕЗ-делетированные rCAdV-2: ΔΕ3Α и ΔΕ3Β.
ПЦР с перекрытием праймеров применяли для генерации CAdV-2 Е3-направляющих трансферных фрагментов, кодирующих выбранные Е3 делеции и ~500 основ 5' и 3' фланкирующей последовательности для обеспечения направленной гомологической рекомбинации (HR) в BJ5183 Е. coli. (см. Схемы на фиг. 4 и 5). Как показано на фиг. 5А и В, в А делеции (ΔΕ3Α), все, кроме первых 186 нуклеотидов Е3 ORF1 и последних 301 нуклеотида ORF2, были делетированы, тогда как для Е3 В делеции (ΔΕ3Β) 186 нуклеотидов Е3 ORF1 и 83 нуклеотидов ORF2 остаются (см. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 для 5' и 3' флангов).
Оба инфекционных клона, содержащие делеции ΔΕ3Α и ΔΕ3Β, были успешно спасены из трансфицированных клеток MDCK и E1 B-MDCK, что указывает на то, что специфические делеции Е3 поддерживают вирусное спасение. Поскольку конфигурация ΔΕ3Β охватывает большую Е3-делецию, она становится оптимальной конструкцией для генерации rCAdV-2, несущей кассету экспрессии трансгена, двигающуюся вперед. Эта большая делеция указывает, что практически весь Е3 участок, например, приблизительно 82% Е3 участка, может быть делетирован без отрицательного влияния на вирусное спасение.
Пример 5.
Построение экспрессионных кассет с Е3 делецией/вставкой с CMV промоторами.
Генерация промоторов HCMV-IE и CMV5.
Амплификацию 3' конца непосредственного раннего промотора человеческого цитомегаловируса (hCMV-IE) (SEQ ID NO: 3) выполняли с применением ПЦР, как описано выше, с применениями пары праймеров hCMV-IE 5Т (SEQ. ID NO: 5) (5'- TTATTAATAGTAATCAATTACGGGG -3')/ hCMV-IE 3' R (SEQ. ID NO: 6) (5'- GCCACCGTACACGCCTACCGCCC -3') и ВАС ДНК EHV-gG (10 нг) как матрицы. Полученный а результате фрагмент ДНК впоследствии клонировали в вектор pCR™BluntII TOPO® (ThermoFisher Scientific) и вырезали путем расщепления рестрикционными ферментами Kpn-1 и BamH-1 и дальше клонировали в плазмидный челночный вектор на основе pUC18 для дальнейшей манипуляции и построения трансферных плазмид CAdV. Человеческий промотор CMV5 (SEQ ID NO: 4) синтезировали с применением GENSCRIPT® продуктов генного синтеза с 5'- 3' сайтами рестрикции Spe-1 и BamH-1, соответственно, и клонировали в челночный вектор pUC57 E. coli для дальнейшей манипуляции и построения трансферных плазмид CAdV.
Сравнение промоторной активности CMVIE и CMV5.
Сообщения в литературе продемонстрировали более надежную экспрессию белка из кассет экспрессии трансгена млекопитающих под управлением промотора CMV5 по сравнению с промотором CMVie. Промотор CMV5 отличается от промотора CMVie тем, что он содержит, после сайта начала транскрипции CMVie, ~560 п. о. ДНК, которая кодирует тройную лидерную последовательность аденовируса человеческого аденовируса типа 5 (HuAd5) с главным поздним энхансером аденовируса, окруженным сайтами донора и акцептора сплайсинга (Massie et al., 1995, Improved adenovirus vector provides herpes simplex virus ribonucleotide reductase R1 and R2 subunits very efficiently. Nature Biotechnology 13: 602-608). Было продемонстрировано, что применение промотора CMV5 существенно усиливает экспрессию белка в 293 клетках (Massie et al., 1998, Inducible overexpression of a toxic protein by an adenovirus vector with a tetracycline-regulatable expression cassette. Journal of Virology 72 (3): 2289 - 2296).
Согласно этим сообщениям, прямые сравнения экспрессии белка из кассет под управлением CMVie или CMV5 путем временной инфекции экспрессионных плазмид, содержащих CPV VP2, демонстрируют более надежную экспрессию белка из кассет экспрессии трансгена млекопитающих под управлением промотора CMV5 по сравнению с промотором CMVie. Как показано на фиг. 7, выполняли анализ силы промотора путем количественного определения экспрессии CPV VP2 путем временной экспрессии из экспрессионных последовательностей, как выявляется с помощью IFA в трансфицированных клетках MDCK. Панель А: показано CPV IFA клеток MDCK, трансфицированных экспрессионными плазмидами CPV VP2 под управлением промоторов CMVie или CMV5. Панель В: гистограмма CPV VP2 ELISA клеток MDCK, трансфицированных экспрессионными плазмидами CPV VP2 под управлением промоторов CMVie или CMV5. Панель С: гистограмма осуществляемого с применением Molecular Devices ImageXpress MicroXL количественного определения CPV VP2-положительных клеток MDCK, трансфицированных экспрессионными плазмидами CPV VP2 под управлением промоторов CMVie или CMV5, как указано. Результаты указывают, что промотор CMV5 может направлять надежную экспрессию трансгена, и экспрессия из CMV5 больше с точки зрения как оптической плотности IFA, так и относительного количества FITC-положительных клеток MDCK, чем в случае промотора CMVie. Таким образом, промотор CMV5 был выбран для управления транскрипцией экспрессионных кассет CAdV-2. Однако ни один из инфекционных клонов rCAdV-2, содержащих промотор CMV5, не обеспечивал спасения rCAdV-2.
Как показано в табл. 2, хотя CMV5 руководит надежной временной экспрессией трансгена VP2, ни один из инфекционных клонов rCAdV-2, содержащий промотор CMV5, не обеспечивал спасения rCAdV- 29 044953
2.
Для прямой оценки возможности вмешательства промоторной последовательности CMV5 в спасение rCAdV-2 фрагмент ДНК, содержащий промотор CMV5, сайт множественного клонирования (MCS) и последовательность полиаденилирования (polyA) обезьяньего вируса 40 (SV40) включали в Е3 участок генома CAdV-2. Все из компонентов ДНК, клонированных в АЕ3В, за исключением ~560 п. о. ДНК, что отличает CMV5 от CMVie (и MCS), являются частью ранее спасенных вирусов rCAdV-2. Попытки спасения были неудачными, что явным образом указывает на то, что промотор CMV5 препятствует спасению rCAdV-2. Для подтверждения этого вывода был разработан обратный эксперимент, согласно которому применяли гомологическую рекомбинацию для замены CMV5 MCS SV40 polyA участка в этом инфекционном клоне на подходящую для спасения экспрессионную кассету на основе CMVie.
Генерация CAdV-2AE3B/CMVie EGFP, содержащая экспрессионную кассету CMV-IE-EGF, вставленную в участок АЕ3В генома CAdV2.
RCAdV-2, содержащий экспрессионную кассету усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP, Clontech) (2,6 т. о. (SEQ ID NO.: 7, CMVie EGFP) был генерирован для способствования оценке вирусного спасения и тропизма в выбранных линиях клеток и видах in vivo. В общих чертах, CAdV-2 АЕ3 В-направляющий CMVie EGFP трансферный фрагмент (EGFP ORF под управлением CMVie с последующей последовательностью полиаденилирования SV40 с фланкирующей ~500 п. о. CAdV-2 ДНК, заканчивающейся в позиции 183 ORF1 (5') и начинающейся в позиции 82 CAdV-2 Е3 ORF2 (3')), применяли для гомологической рекомбинации для генерации rCAdV-2AE3B/CMVie EGFP. Успешные HR события оценивали путем выявления видов ДНК с ~35 т. о. ПЦР-скрининг колоний выполняли для идентификации клонов, которые содержали кассету экспрессии трансгена (прямая Р SEQ ID NO.: 8; обратная Р SEQ ID NO.: 9). Положительные клоны визуализировали путем электрофореза на агарозном геле, причем положительный клон имел ~0,7 т. о. продукт ПЦР, который соответствовал трансгенной кассете EFG. Кроме того, надлежащую вставку трансгена и последовательность подтверждали путем анализа последовательности с применением секвенатора ILLUMINA® MiSeq, способов приготовления библиотек NextEr_XT и программы NexGene (Softgenetic; версия 2.3), и программы SEQUENCER® (Genecodes; версия 5.1).
Успешное Pme-1 расщепление rCAdV-2GFP обеспечило на выходе два вида: ~32,7 т. о. (геном rCAdV-2) и~2,7 т. о. (фрагмент PBR322). Трансфекция клеток MDCK и E1 B-MDCK была достигнута с применением трансфекционного реагента LIPOFECTAMINE® 2000 (ThermoFisher Scientific). Инфекционные клоны rCAdV-2AE3B/CMVie EGFP были успешно спасены из трансфицированных клеток MDCK и E1 B-MDCK, как указывал сигнал GFP через флуоресценцию в трансфицированных клетках. Вирусы собирали из супернатантов/лизатов трансфицированных клеток и подвергали трем последовательным циклам замораживания-размораживания (-70°С/37°С), стерилизовали путем фильтрации, а потом пропускали на MDCK и E1 B-MDCK. Инфицированные клетки затем наблюдали на зависимый от инфекции сигнал EGFF через флуоресцентную микроскопию (данные не показаны).
Кассету экспрессии трансгена CMVIE EGFP SV40 polyA успешно клонировали в АЕ3В домен CAdV2. Рекомбинантный вирус был успешно спасен, и EGFP можно было выявить путем флуоресцентного микроскопического анализа после инфицирования.
Генерация и спасение rCAdV-2 АЕ3В с экспрессионной кассетой усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) из rCAdV-2 АЕ3В инфекционного клона, несущего не поддающийся спасению промотор CMV5.
Для подтверждения вывода о том, что промотор CMV5 ингибирует спасение rCAdV-2 (см. выше раздел Применение промотора CMV5 для экспрессии трансгена), был проведен обратный эксперимент, в котором применяли гомологическую рекомбинацию для замены polyA участка CMV5 MCS SV40 в инфекционном клоне MCS-1 на экспрессионную кассету на основе CMVie, которая подвергалась спасению. В общих чертах, указанный CAdV-2 Е3-направляющий трансгенный трансферный фрагмент CMVie EGFP применяли для гомологической рекомбинации для генерации АЕ3В rCAdV-2 из инфекционного клона MCS-1-5 (MCS-1-5 содержит промотор CMV5, малый сайт множественного клонирования (MCS) и последовательность полиаденилирования SV40). Очищенный ~2,6 т. о. трансферный фрагмент EGFP и линеаризованный инфекционный клон ДНК rCAV-2, производный от MCS-1-5, совместно трансформировали через электропорацию в клетки BJ5183 Е. coli, которые потом отбирали на планшетах с LB-агаром с 50 мкг/мл карбенициллина. ПЦР-скрининг колоний выполняли для идентификации клонов, которые содержали кассету экспрессии трансгена. Успешная гомологическая рекомбинация в результате дает вид ДНК с ~35 т. о., который, как суперскрученная ДНК, проходит вместе или несколько быстрее, чем 23,1 т. о. вид маркерной ДНК на 0,7% агарозном геле. Положительные клоны визуализировали путем электрофореза на агарозном геле (фиг. 4). Схема polyA экспрессионной кассеты CMVie EGFP SV40 в остове CAV-2 MCS-1-5 инфекционного клона ДНК объясняется на фиг. 8.
Расщепленный PmeI вирус rCAV-2 MCS-1-5 EGFP трансфицировали в клетки MDCK и клетки E1 B-MDCK с применением LIPOFECTAMINE® 2000 CD и 3000. Инфекционные клоны rCAdV2AE3B/CMVie EGFP, производные от инфекционного клона ДНК rCAdV-2 MCS-1-5, успешно способст- 30 044953 вовали спасению rCAdV-2 из трансфицированных клеток E1 B-MDCK, как указывает сигнал GFP через флуоресценцию в трансфицированных клетках (данные не показаны). В Приложении VI (фон) высказывается предположение, что спасение rCAdV-2, несущего EGFP экспрессионную кассету, производную от остова CAdV-2 MCS-1, дополнительно подтверждает вывод о том, что ингибирование спасения rCAdV-2 зависит от CMV5 и локализовано к 560 п. о. последовательности ДНК huAd5 в CMV5.
Генерация rCAdV-2AE3B/CMVie CPV VP2 (нативного), содержащего экспрессионную кассету CMV-IE-VP2, вставленную в АЕ3В участок генома CAd2.
Генерировали VP2 ген rCAdV-2, который содержал парвовирус собачьих (CPV). В общих чертах, аналогично вышеупомянутому, CAdV-2 АЕ3-направляющий трансферный фрагмент, содержащий CPV VP2 ORF (SEQ ID NO.: 10) под управлением CMVie, применяли для гомологической рекомбинации для генерации АЕ3В rCAdV-2, содержащего экспрессионную кассету VP2 (см. фиг. 9). Клоны, которые содержали успешную интеграцию трансгена, были выявлены путем ПЦР-скрининга, при котором 1,7 т. о. продукт ПЦР был визуализирован путем электрофореза на агарозном геле. Надлежащую вставку трансгена и последовательность подтверждали путем анализа последовательности с применением секвенатора ILLUMINA® MiSeq, способов приготовления библиотек NextEr_XT и программы NexGene (Softgenetic; версия 2.3) и программы SEQUENCER® (Genecodes; версия 5.1).
Успешное PmeI-1 расщепление rCAdV-2GFP давало на выходе два вида: ~32,7 т. о. (геном rCAdV-2) и ~2,7 т. о. (PBR322 фрагмент). Инфекционные клоны rCAdV-2AE3B/CMVie CPV VP2 были успешно спасены из трансфицированных клеток MDCK и E1 B-MDCK, как выявляли с помощью CAdV-2 IFAs (данные не показаны). Хотя экспрессия белка CPV VP2 в инфицированных клетках была неудачной, как было выявлено из-за отсутствия иммунофлуоресцентной окраски антителом против белка VP2, присутствие кассеты экспрессии трансгена было выявлено в очищенных вирусных геномах путем ПЦР.
ПЦР-анализ rCAV-2 ДНК, очищенной от инфицированных клеток и супернатантов, осуществляли для проверки присутствия кассеты экспрессии трансгена CMVie CPV VP2 (n) в клонах rCAV2?E3B/CMVie CPV VP2 (фиг. 10). Панель A: pCAV-2 контрольный вирус; панель В: клон #1; панель С: клон #2. Панель D: контрольные реакции с CMVie CPV VP2 (n) трансферная плазмида. М является 1 т. о. + маркером длины ДНК. Панель Е: ожидаемые результаты специфических к трансгенной экспрессионной кассете ПЦР-реакций. В реакциях 1 и 2 использовали праймеры, специфические к CAV-2 Н-А Р VIII, U-экзон (SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12) и CVP VP2 (SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14); в реакциях 3, 4 и 5 использовали праймеры, специфические к CPV VP2 (см. панель Е) (SEQ ID NO.: 15 20). В реакции 7 (положительная реакция для CAdV-2) используют CAV-2-специфический праймер Н-А Р VIII и праймер U-экзона (SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 22).
Таким образом, хотя кассета экспрессии трансгена CMVIE CPV VP2 (n) SV40 polyA была успешно клонирована в домен АЕ3В CAdV2, рекомбинантный вирус успешно спасен, и присутствие последовательности VP2 было подтверждено, экспрессия белка VP2 не выявлялась.
Генерация rCAdV-2AE3B/CMVie CPV VP2 (кодон-оптимизированного), содержащего экспрессионную кассету CMV-IE-VP2, вставленную в АЕ3В участок генома CAd2:
CAdV-2 E3-направляющий CMVie CPV VP2 кодон-оптимизированный (со) фрагмент передачи трансгена (CPV VP2 ORF (со) под управлением CMVie со следующей последовательностью полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH) с фланкирующей ~500 п. о. CAdV-2 ДНК, которая заканчивается в позиции 183 ORF1 (5') и начинается в позиции 82 CAdV-2 Е3 ORF2 (3')) (SEQ ID NO.: 23), генерировали путем ПЦР с перекрытием праймеров и клонировали в вектор ТОРО для архивации и амплификации. Последовательность применяли для гомологической рекомбинации для генерации АЕЗВ rCAdV-2.
Клоны, содержащие успешную интеграцию трансгена, выявляли путем ПЦР-скрининга, причем 2,3 т. о. продукт ПЦР визуализировали путем электрофореза на агарозном геле. Надлежащая вставка трансгена и последовательность были подтверждены анализом последовательности с применением секвенатора ILLUMINA® MiSeq, способов приготовления библиотек NextEr_XT и программы NexGene (Softgenetic; версия 2.3) и программы SEQUENCER® (Genecodes; версия 5.1).
Инфекционные клоны rCAdV-2AE3B/CMVie CPV VP2 (со) были успешно спасены из трансфицированных клеток MDCK и E1 B-MDCK, что было продемонстрировано через CAdV-2 IFA, которую выполняли на Р1-инфицированных клетках с применением антител против CAdV-2, прямо конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (данные не показаны). Для подтверждения того, что спасенный вирус кодирует кассету экспрессии трансгена CMVie CPV VP2 (со), очищали геномы rCAdV-2 и Р5 CAdV-2 вируса Р2. ПЦР-анализ экстрагированных ДНК с применением праймеров, специфических к участкам генома CAdV-2 (гексон-ассоциированный белок VIII (Н-А Р VIII) и U-экзон), применяли промотор CMVie и CPV VP2 (данные не показаны). ПЦР-анализ выявил продукты ПЦР надлежащего размера, указывая на то, что очищенные Р2 вирусные геномы кодируют кассету экспрессии трансгена CMVie CPV VP2 (со).
Проточный цитометрический анализ CMVie CPV VP2 (со) rCAdV инфицированных клеток с применением антител против CAdV2 и CPV VP2 применяли для подтверждения экспрессии инфицирован- 31 044953 ных клеток MDCK. В общих чертах, суспензию клеток MDCK инфицировали rCAdV-2 и контрольным rCAdV-2 в 12-лунковом формате и культивировали в течение 72 ч (37°С, 5,0% СО2 при 125 об/мин в увлажненном инкубаторе). После этого клетки собирали, промывали PBS, а потом, применяя CYTOFIX/CYTOPERM™ набор для фиксации/пермеабилизации (BD Biosciences, Cat. #554714), обрабатывали фиксирующим раствором CYTOFIX™ с последующими двумя промываниями раствором для пермеабилизации CYTOPERM™. После этого клетки инкубировали с FITC-конъюгированным антителом против CAdV-2 или антителом против CPV VP2 (антитело против CAV2: VMRD, Кат. # F-CAV-50X и антитело против CPV VP2: VMRD, Кат. # CJ-F-CPV 50X, соответственно), дважды промывали CYTOPERM™ и анализировали путем проточной цитометрии с применением системы проточной цитометрии BD Biosciences FACSCANTO™.
Фиг. 11 показывает результаты проточного цитометрического анализа инфицированных CMVie CPV VP2 (со) rCAdV клеток MDCK. Панели А-F являются гистограммами сигнала, присутствующего в отдельных клетках. Суспензию клеток MDCK инфицировали контрольным вирусом rCAdV-2, несущим BRSV F (со) (панели В и Е) или инфицировали rCAV-2, несущим экспрессионные кассеты CPV VP2 (со) (панели С и F) и окрашивали через 72 ч после инфицирования FITC-конъюгированным антителом против CPV VP2 (панели А, В и С) или FITC-конъюгированным антителом против CAV2 (панели D, Е и F). Панель G представляет сводку и подсчет результатов, показанных на фиг. 11. Результаты окраски антителом против CAV-2 показывают, что большинство rCAV2-BRSV F (со)- или rCAV2-CPV VP2 (со)инфицированных (фиг. 1, панели Е и F, соответственно) клеток MDCK экспрессируют белки CAdV2, тогда как неинфицированные клетки (фиг. 1, панель D) являются эффективно отрицательными для CAdV-2. Окраска антителами против CPV VP2 (фиг. 1, панели А, В и С) показывает, что только инфицированные rCAV2-CPV VP2 клетки MDCK (панель С) экспрессируют белки CPV VP2, хотя определенный фоновый сигнал наблюдается в неинфицированных и rCAV2-BRSV F-инфицированных клетках с антителами против CPV VP2 (панели А и В, соответственно).
Таким образом, CMVie CPV VP2 кодон-оптимизированная (со) кассета экспрессии трансгена была успешно клонирована в домен АЕ3В CAdV2. Рекомбинантный вирус был спасен из трансфицированных клеток MDCK, и кассета экспрессии трансгена была выявлена в очищенных вирусных геномах. CPV VP2 мРНК была выявлена в инфицированных клетках (данные не показаны), и экспрессия белка CPV VP2 в инфицированных клетках была подтверждена путем проточного цитометрического анализа, в отличие от нативной экспрессионной кассеты VP2.
Генерация rCAdV-2 АЕ3В с экспрессионной кассетой слитого белка кодон-оптимизированного респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота, вставленной в АЕ3В участок генома CAdV2.
В общих чертах, CAdV-2 E3-направляющий трансферный фрагмент, содержащий слитый (F) белок CPV респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота (BRSV) ORF под управлением CMVie, со следующей BGH последовательностью полиаденилирования с фланкирующей ~500 п. о.
CAdV-2 ДНК, которая заканчивается в позиции 183 ORF1 (5') и начинается в позиции 82 CAdV-2 Е3 ORF2 (3'), применяли для гомологической рекомбинации для генерации АЕ3В rCAdV-2. (SEQ ID NO.: 27). И нативную (n), и кодон-оптимизированную (со) версии гена BRSV F клонировали в среду вектора CAdV-2 и вирусы, несущие обе версии трансгена, были успешно спасены. Однако дальше применяли только ген BRSV F (со).
Инфекционные клоны rCAdV-2AE3B/CMVie BRSV F (СО) были успешно спасены из клеток MDCK, на что указывает СРЕ клеток, инфицированных вирусными супернатантами/лизатами клеток. Присутствие кассеты экспрессии трансгена было выявлено в очищенных вирусных геномах. ДНК была экстрагирована из Р3 rCAV2-BRSV F (со) вируса и использована как матрица для ПЦР-анализа для выявления присутствия гена BRSV F (со) в геноме вируса. Трансген секвенировали для подтверждения последовательности гена.
Экспрессия BRSV F инфицированными клетками была подтверждена путем проточного цитометрического анализа (см. фиг. 11).
Генерация rCAdV-2 АЕ3В экспрессионной кассетой гликопротеина бешенства (n), вставленной в АЕ3В участок генома CAdV2.
В общих чертах, CAdV-2 Е3-направляющий трансферный фрагмент, содержащий Гликопротеин пастеровского штамма бешенства (RabGP) ORF под управлением CMVie, со следующей последовательностью полиаденилирования BGH с фланкирующей ~500 п. о. CAdV-2 ДНК, которая заканчивается в позиции 183 ORF1 (5') и начинается в позиции 82 CAdV-2 Е3 ORF2 (3'), применяли для гомологической рекомбинации для генерации АЕ3В rCAdV-2. (SEQ ID NO.: 25) (см. фиг. 13). Нативный G ген пастеровского штамма бешенства подвергали ПЦР-амплификации из вакцины бешенства на основе оспы енота (вакцина rRCNV-бешенства G2), Lot #D 015-054-). Ожидаемый размер амплифицированной RabGP ДНК составляет ~1,6 т. о.
Фрагмент RabGP после этого лигировали в pUC 18-B-Bf1 b-CO фрагмент и трансформировали в ТОР10 Е. coli. ПЦР-скрининг колонии на RabGP ДНК выполняли, применяя RabGP-специфические праймеры (данные не показаны).
- 32 044953
ДНК расщепляли PmeI для высвобождения трансферных фрагментов (~3,45 т. о.) и Seal для разрезания остова вектора для способствования идентификации трансферных фрагментов. Очищенные ~3,45 т. о. PmeI CMVie RabGP (n) трансгенные (экспрессионная кассета) трансферные фрагменты и линеаризованные rCAV-2 инфекционные клоны ДНК совместно трансформировали через электропорацию в клетки BJ5183 Е. coli, которые потом отбирали на планшетах с LB-агаром с 50 мкг/мл ампициллина. ПЦРскрининг колоний выполняли для идентификации клонов, содержащих кассету экспрессии трансгена, и визуализировали путем электрофореза на агарозном геле (данные не показаны).
Расщепленные PmeI HR клоны ДНК трансфицировали в клетки E1 B-MDCK, применяя LIPOFECTAMINE® 2000 CD. Инфекционные клоны rCAdV-2ΔE3B/CMVie RabGP были успешно спасены из трансфицированных клеток Е1 B-MDCK, как указывается через CAdV-2 IFA, как показано на фиг. 14, CAdV-2 IFA инфицированных вирусом rCAV-2 RabGP P2 клеток EIB-MDCK с применением антител против CAdV-2, прямо конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), подтверждает спасение rCAdV-2 как через антитело против RabG, так и иммунофлуоресценцию CAdV-2 (панели В и С, 48 ч и 72 ч после инфицирования).
Как указывается через флуоресцентные клетки (CAV-2+ и Rab+) на фиг. 14, панели В и С, клетки E1 B-MDCK, инфицированы вирусами rCAV-2 RabGP Е2 и Е3 для экспрессии бешенства G. Однако количество клеток Rab+ оказывается значительно меньше по сравнению с клетками CAdV-2+.
Таблица 2
Сводка BIVI-генерированных инфекционных клонов rCAdV-2
Трансген | Промотор | PolyA | Спасение | Экспрессия белка в инфиц. клетках | Трансферная последовательность | |
1 | Нет: ΔΕ3Α и В | N/A | N/A | Да | NT | SEQ ID NO.: 1, 2 |
2 | EGFP | CMVie | SV40 | Да | Да | SEQ ID NO.: 7 |
3 | CPV VP2 (п) | CMVie | SV40 | Да | NT | SEQ ID NO.: 10 |
4 | CPV VP2 (п) | CMV5 | SV40 | Нет | NT | N/A |
5 | CPV VP2 (со) | CMVie | BGH | Да | Да | SEQ ID NO: 23 |
6 | CPV VP2 (со) | CMV5 | SV40 | Нет | NT | SEQ ID NO.: 7NA |
7 | BRSV F | CMVie | BGH | Да | Да | SEQ ID NO: 27 |
8 | EGFP в MCS1 | CMVie | SV40 | Да | Да | N/A |
11 | Бешенство G (п) | CMVie | BGH | Да | Да | SEQ ID NO: 25 |
12 | Бешенство G (со) | CMVie | SV40 | Нет | NT | Данные не показаны |
13 | Бешенство G (со) | CMV5 | SV40 | Нет | NT | N/A |
N/A = не применяется;
NT = не испытали;
* = экспрессия, наблюдающаяся только с трансфекцией.
Как сведено в табл. 2, было генерировано много инфекционных клонов на основе ΔΕ3Β, которые не способствовали спасению rCAdV-2 из трансфицированных клеток MDCK или E1 B-MDCK. К ним относятся CPV VP2 и бешенство G, содержащие кассеты экспрессии трансгена под управлением промотора CMV5, клоны, содержащие гликопротеин бешенства G, причем нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизированной (76% идентичности со штаммом SAD P5/88), и клоны, содержащие hMGFP (зеленый) (Promega) и MCherry (красный) (Clontech) репортерные последовательности флуоресцентного белка (данные не показаны).
Эта изменчивость, при сравнении между вставками сравнимого размера, является не просто отображением оптимизации кодонов, поскольку нативные и кодон-оптимизированные последовательности способствовали спасению rCAdV-2, несущего BRSV F и CPV VP2 (см. выше табл. 2). Действительно, инфекционные клоны rCAdV-2, несущие нативный hMGFP и MCherry ORF, также не способствовали спасению rCAdV-2 (данные не показаны). Взятые вместе, эти данные указывали на то, что применение промоторов CMV в контексте векторной платформы CAdV-2 является непрогнозируемым, и выбор промотора является значительным фактором в построении экспрессионной кассеты, поскольку он может в значительной мере влиять на спасение клонов rCAdV-2.
Пример 6.
Экспрессионные кассеты с промоторами EHV4.
Идентификация и построение новых промоторов лошадиного происхождения.
Были идентифицированы и изолированы новые гетерологические лошадиные промоторы из лошадиного герпесвируса типа 4 (EHV4). Интерес представляли два промотора; (1) 600 п. о. EHV-4 gG промотор (4pgG600) (SEQ ID NO.: 29) в ORF70, кодирующий гликопротеин G (gG); и (2) 600 п. о. EHV-4 МСР промотор (4рМСР600) (SEQ ID NO.: 30) в ORF42, кодирующий основной капсидный белок (МСР). Ген гликопротеина G (orf70) является активным на протяжении раннего и позднего времени цикла репликации (Colle et al. 1995, Drummer et al. 1998). Основной капсидный белок является одной из наиболее многочисленных составных вириона и требуется для составления капсид в ядре клетки, если недавно синте
- 33 044953 зированная вирусная ДНК готова к упаковке. Таким образом, можно ожидать, что его промотор должен быть активным на протяжении раннего и позднего времени в цикле вирусной репликации. Чувствительные к ограничению размера остова CAdV, обе промоторные последовательности EHV-4 были усечены до приблизительно 75% их первоначальной длины. В частности, 600 п. о. 4pgG600 промотор был усечен до 430 п. о. для генерации промоторного фрагмента р430 (SEQ ID NO.: 31), и 600 п. о. 4рМСР600 промотор был усечен до 455 п. о. для генерации промоторного фрагмента р455 (SEQ ID NO.: 32).
Генерация вирусоподобных частиц (VLP) инфицированными вирусом вакцины rCAdV-2 клетками может быть ключевым фактором для эффективности вакцины аденовируса собачьих (CAdV-2). Хотя rCAdV-2, содержащий экспрессионную кассету CPV VP2 под управлением CMVie, может быть спасен, как было детально указано выше, существенная экспрессия VP2 (для генерации VLP) в rCAdV-2 CMVie CPV VP2 инфицированных клетках не может быть достигнута с применением традиционного промотора CMVie. Кроме того, rCAdV-2 VP2 вирус, содержащий промотор CMV5, не может быть спасен. Таким образом, существовала заинтересованность в применении новых промоторов с вышеупомянутыми характеристиками, способных руководить надежной, устойчивой, воспроизводимой экспрессией нужных антигенов.
Генерация BamHI CAdV-2 трансферных плазмид, содержащих EHV-4 P CPV VP2 (со): генерация KpnI/EHV-4 P ДНК.
Фрагменты gG430 и МСР455 промоторов EHV-4 были амплифицированы с помощью градиентной ПЦР с применением следующих пар олигонуклеотидов: gG430 F: TTTAAAGGTACCTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACC (SEQ ID NO.: 33);
gG430 R: AAATTTGGATCCAACTGCAGCTTATCACAGCTTTACAGGTGG (SEQ ID NO.: 34)
MCP455 F:
TTTAAAGGTACCACTGGTGGTAGCATATACTACCTTTATTTATACGC (SEQ ID NO.: 35);
MCP455 R: AAATTTGGATCCGATCCTATGGTAGCGGTAAAACACCG, (SEQ ID NO.: 36), соответственно.
Ожидаемые размеры амплифицированных gG430 и МСР455 ДНК составляют 454 и 479 п. о., соответственно.
Предварительно приготовленные трансфертные плазмиды CAdV-2, которые применяли для успешной интеграции в АЕ3В и спасение rCAV-2 (как было подробно указано выше), применяли как основу промотора EHV-4, который содержал трансферную плазмиду CPV VP2, путем обмена на основе BamHI/KpnI промотора CMVie на промоторы EHV-4.
Две разные кодон-оптимизированные последовательности CPV VP2, обозначенные как десплайсированные (SEQ ID NO.: 37) и Gen0.95 (SEQ ID NO.: 38), применяли для приготовления трансферных плазмид CAdV-2, которые содержали экспрессионные кассеты под управлением CMVie. Gen0.95 является кодон-оптимизированной последовательностью CPV VP2, полученной от Genscript с Codon Adaptation Index (CAI) 0.95. Анализ Gen0.95 с применением алгоритма поиска сайтов сплайсинга (2013/2014 © Human Splicing Finder -Designed by Ghadi Raϊ; Inserm UMRS910 - Aix Marseille Universite, 27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05) указывал на присутствие 43 потенциальных донорных сайтов сплайсинга. 89 нуклеотидных изменений (5,07% изменения последовательности относительно Gen0.95) было осуществлено для удаления 40 донорных сайтов сплайсинга, которые не изменяли аминокислотную последовательность и не генерировали наименее благоприятные кодоны на основе видов собачьих.
Очищенные ~3,5 т. о. PmeI EHV-4 P CPV VP2 (со) трансфертные фрагменты, содержащие две вышеупомянутые VP2 последовательности, и линеаризованный rCAV-2 инфекционный клон ДНК совместно трансформировали через электропорацию в клетки BJ5183 Е. coli для гомологической рекомбинации. Интактные клоны отбирали на планшетах с LB-агаром с 50 мкг/мл ампициллина. Клоны с надлежащим размером и ориентацией интеграции идентифицировали путем ПЦР-скрининга, отбирали и расширяли.
Успешное PmeI-расщепление инфекционных клонов pCAV-2 дает на выходе виды ДНК ~33,5 (геном pCAV-2) и ~2,7 (фрагмент pBR322) т. о. PmeI-расщепленные инфекционные клоны трансфицировали в E1 B-MDCK и клетки MDCK с помощью LIPOFECTAMINE® 3000. Вирусы пассажей с 1-го (Р1) по 7-й (Р7), обозначенные как pCAV2AE3B/pgG430-VP2 (десплайсированные) (SEQ ID NO.: 39), pCAV2AE3B/gG430-VP2 (Gen 0.95) (SEQ ID NO.: 40) или pCAV2AE3B/p455 -VP2 (Gen0.95) (SEQ ID NO.: 41), были собраны из трансфицированных клеток супернатантов/лизатов, подвергнутых трем последовательным циклам замораживания-размораживания (-70°С/37°С), стерилизовали путем фильтрации, а потом пропускали на клетках E1 B-MDCK.
AI-ST-клетки инфицировали отобранным rCAdV-2 для иммунофлуоресцентных анализов (IFA) на экспрессию белка CAdV-2 и CPV VP2. Через 72 ч после инфицирования клетки фиксировали с применением набора для фиксации/пермеабилизации CYTOFIX/CYTOPERM™ (BD Biosciences, Cat. #554714), обрабатывали фиксирующим раствором CYTOFIX™ с последующими двумя промываниями раствором для пермеабилизации CYTOPERM™. После этого клетки инкубировали с FITC-конъюгированным антителом против CAdV-2 или антителом против CPV VP2 (антитело против CAdV2 (mAb): VMRD, кат. # FCAV-50X и антителом против CPV VP2: VMRD, кат. # CJ-F-CPV 50X, соответственно), дважды промы- 34 044953 вали CYTOPERM™ и анализировали путем проточной цитометрии с применением системы проточной цитометрии BD Biosciences FACSCANTO™.
Белки CAdV-2 и CPV VP2 легко визуализируются с помощью IFA и выявляются путем FC в значительной части клеток AI-ST 2015, инфицированных rCAdV-2, который несет два разных нуклеотидных варианта CPV VP2 (Despl и Gen0.95, через 48 и через 72 ч после инфицирования). Значительное количество белка CPV VP2 было идентифицировано в культуре ткани супернатантов/ лизатов (после замораживания/размораживания) путем дот-блот анализа (и это весьма вероятно отображает присутствие составных VLP).
Результаты с фиг. 19 показывают, что белки CAV-2 и CPV VP2 легко визуализируются путем IFA инфицированных AI-ST-клеток (но не в клетках, инфицированных rCAdV-2, который кодирует нерелевантный трансген BRSV), указывая на надежную экспрессию CPV VP2 из десплайсированного и Gen0.95 CPV VP2 (со) вариантов последовательности под управлением промоторов gG430 и МСР455 EHV-4 (см. фиг. 19А). Экспрессию CPV VP2 выявляли в менее чем 3% клеток, инфицированных первоначальным rCAdV-2 CMVie CPV VP2 (см. фиг. 15), что указывает на то, что rCAdV-2, несущий экспрессионные кассеты CPV VP2 под управлением новых производных от EHV4 промоторов р430 и р455, может быть успешно спасен. Неожиданно было выявлено, что экспрессия CPV VP2 под управлением промоторов gG430 и МСР455 EHV-4 была выявлена в 14-36% инфицированных клеток (см. фиг. 16) по сравнению с векторами CadV, в которых промоторные последовательности CMV5 использовали в месте АЕ3В, и в этом случае вирусное спасение было неудачным.
Дот-блот анализ выполняли для того, чтобы проанализировать экспрессию трансгена в инфицированных клетках. В общих чертах, осветленную (6000 х g, 5 мин) культуру ткани супернатантов/лизатов (замораживание/размораживание) из инфицированных клеток AI ST (для rEHV-1) и Е1В MDCK (для rCAdV-2) подвергали серийным разбавлениям PBS перед добавлением в устройство и адсорбировали в PVDF путем отсасывания. Следующими этапами являются 30-минутное подвергание действию 5,0% BioRad Blotting Grade Blocker в TBST, 1,0-часовое подвергание действию 1° антител, три промывания TBST и 1,0-часовое подвергание действию конъюгированных с пероксидазой 2° антител (против мыши и против свиньи, Jackson ImmunoResearch) и визуализация через ТМВ. Для количественного определения дот-блоты анализировали с помощью программы Image (Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York). Цвета изображений инвертируют для вычитания фона и записывают интегральную плотность каждой точки. Значениям присваивают знаки + и - таким способом: ++++ = >800000, +++ = от 500000 до 800000, ++ = от 300000 до 499999, + = от 120000 до 299999, +/- = от 80000 до 119999, и - = <80000.
Как видно на фиг. 17, сильный сигнал белка CPV VP2 наблюдали в культуре ткани супернатантов / лизатов из клеток, инфицированных rCAdV-2, который кодирует экспрессионные кассеты для CPV VP2 под управлением промотора EHV-4, тогда как не выявлялся сигнал в образцах из клеток, инфицированных rCAdV-2, который кодирует нерелевантную экспрессионную кассету. Эти результаты показывают, что значительное количество белка CPV VP2 было распознано в супернатантах культуры ткани. Эти результаты с большой вероятностью отображают присутствие составных CPV VP2 VLP. В этом состоит отличие от первоначальных rCAdV-2 CMVie CPV VP2, в которых дот-блот анализ показал, что сигнал CPV VP2 под управлением CMVie был на таком же уровне или ниже фонового уровня - и на сравнимом уровне с супернатантами/лизатами из отрицательных контрольных образцов (CAdV-2, rCAdV-2 CMVie BRSV F-инфицированные клетки и супернатанты/лизаты культуры клеток из неинфицированных клеток).
Как показано на фиг. 17, белок VP2 может быть распознан в супернатанте и, таким образом, можно ожидать, что он должен быть в конформации, которая должна быть иммуногенной. Важно то, как обсуждалось выше, что спасение рекомбинантного CAdV-2 не достигалось в клонах, в которых трансген находился под управлением промоторных последовательностей CMV5. Таким образом, новые производные от EHV-4 промоторные последовательности согласно настоящему изобретению, такие, как pG430 и р455, не только способствуют экспрессии трансгена, но и поддерживают ключевой этап вирусного спасения.
Генерация трансферных плазмид CAdV-2, содержащих EHV-4 промоторы CPV RabG (n).
Вторую последовательность CAdV-2 генерировали, применяя новый производный от EHV-4 промотор р455 согласно настоящему изобретению. RCAdV-2 RabG (n) был выбран, поскольку экспрессия инфицированными клетками не наблюдалась при применении традиционного промотора CMVie.
Целью данного эксперимента было подтверждение активности нового промотора EHV-4 в контексте rCAdV-2 со вторым трансгеном, RabG (мембранным белком) путем измерения осуществляемой под управлением промотора EHV-4 экспрессии белка RabG инфицированными rCAdV-2 p455 RabG (n) клетками AI-ST 2015.
Последовательность RabG (n) изолировали из спасенного rCAV-2 CMVie RabG (n) (SEQ ID NO.: 25), как обсуждалось выше. 1596 п. о. RabG (n) последовательность, включая последовательность Козак непосредственно 5' от ATG START-кодона, вырезали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и SalI (5' и 3', соответственно) и лигировали в вырезанные BamHI/SalI трансферные фрагменты rCAdV с промото- 35 044953 ром gG430 и промоторами МСР455, которые потом трансформировали в ТОР10 Е. coli.
Очищенные ~3,3 т. о. трансферные фрагменты PmeI EHV-4 P RabG (n) и линеаризованный rCAV-2 инфекционный клон ДНК совместно трансформировали через электропорацию в клетки BJ5183 Е. coli для гомологической рекомбинации. Интактные клоны отбирали на планшетах с LB-агаром с 50 мкг/мл карбенициллина. ПЦР-скрининг колоний выполняли для идентификации клонов EHV-4 pG430/RabG (n) (SEQ ID NO.: 42) и EHV-4 p455/RabG (n) (SEQ ID NO.: 43). Клоны отсеивали с помощью праймеров, специфических к RabG ДНК, и визуализировали путем электрофореза на агарозном геле. Ожидаемые ДНК имеют размер 1501 п. о.
Расщепленные PmeI инфекционные клоны трансфицировали в клетки E1 B-MDCK и MDCK с помощью LIPOFECTAMINE® 3000. Вирусы пассажей 1-7 (Р 1-Р7), обозначенные как pCAV2AEB3/gG430 или МСР455 RabG (n), собирали из трансфицированных клеток супернатантов/лизатов, подвергнутых трем последовательным циклам замораживания-размораживания (-70°С/37°С), стерилизовали путем фильтрации, а потом пропускали на клетках El B-MDCK.
IFA и проточную цитометрию применяли для оценки осуществляемой под управлением промотора EHV-4 экспрессии RabG в инфицированных rCAdV-2 клетках AI-ST 2015. Экспрессию белка CAdV-2 зондировали анти-CAdV-2 FITC-конъюгированными свиными поликлональными антителами (VMRD). Экспрессию белка RabG зондировали мышиными моноклональными антителами (Novus). Белки CAdV-2 и RabG легко визуализируются с помощью IFA и выявляются путем FC в клетках AI-ST 2015, инфицированных rCAdV-2, несущих RabG (n) (через 72 ч после инфицирования).
Результаты на фиг. 18 указывают, что белки CAV-2 и RabG легко выявляются в клетках AI-ST 2015, инфицированных выбранными rCAdV-2 и rEHV-1, путем проточного цитометрического анализа. Эти результаты демонстрируют существенную экспрессию RabG под управлением промотора МСР455 EHV4. В отличие от этого, хотя RabG легко выявляется в клетках, инфицированных rCAdV-2 p455 RabG (см. фиг. 19В и С), экспрессия выявляется у < 2,0% клеток, инфицированных первоначальным rCAdV-2 CMVie RabG (см. фиг. 18).
Следовательно, polyA кассеты экспрессии трансгена gG430 и МСР455 RabG (n) SV40 были успешно клонированы в домен АЕ3В CAdV-2. Рекомбинантный вирус был спасен из трансфицированных клеток E1 B-MDCK, как указывается через СРЕ в инфицированных вирусом клетках. Осуществляемая под управлением промотора МСР455 экспрессия трансгена RabG с применением rCAdV-2 в инфицированных клетках AI-ST 2015 и BIVI 2011 MDCK была подтверждена с помощью IFA и проточной цитометрии.
Пример 7.
Приготовление фармацевтических композиций (вакцин), включающих rCAdV-CMV/CPV VP2.
Парвовирус собачьих (CPV) является высокоинфекционным вирусом, который может вызывать высокую заболеваемость и смертность, в зависимости от вирулентности, хозяина и факторов среды. Применение эффективной программы вакцинации для собак с применением MLV и убитых вирусных вакцин на протяжении последних 30 лет значительно снизило показатели смертности. CPV представляет собой лишенный оболочки однониточный ДНК-вирус с двумя структурными белками (VP1 и VP2), которые образовывают капсиду. Известно, что VP2 участвует в вирусной патогенности и иммунной реакции хозяина и, таким образом, является оптимальным выбором для включения и экспрессии в рекомбинантной системе CAdV2.
Цель данного исследования состояла в выполнении предварительной оценки эффективности экспериментальной вакцины rCAV2-CPV VP2 по сравнению с комбинированной вакциной MLV. Комбинация MLV содержала аденовирус собачьих 2-го типа (CAV2), вирус собачьей чумы (CDV) и парвовирус собачьих (CPV), смешанные на уровне между установленной минимальной иммунизирующей дозой и дозой высвобождения каждой фракции, как установлено в текущих продуктах для каждого конкретного антигена.
В этом исследовании rCAV2-CPV VP2 вводили в двухдозовом режиме с трехнедельным интервалом щенкам 7-недельного возраста или старшим для того, чтобы определить, обеспечивает ли векторная вакцина CAdV-CPV VP2 защиту от провокации CPV. На данное время, поскольку MLV вакцины являются общепринятым стандартом для защиты от CPV и ICH, испытанную группу сравнивали с группой щенков 7-недельного возраста, которым в двухдозовом режиме с трехнедельным интервалом вводили комбинацию MLV вакцины, которая включала CPV, CDV и CAdV2. Эта группа считалась положительной контрольной группой. Третьей группе в двухдозовом режиме с трехнедельным интервалом вводили PBS как провоцирующий контроль. Собакам вводили провоцирующую дозу CPV-2b приблизительно через три недели после второй вакцинации с целью оценки эффективности.
Испытательные вакцины вводили двенадцати (12) здоровым, CAV2- и CPV-серонегативным собакам возрастом от 6 недель 2 дней до 7 недель 2 дней как 1 мл подкожную дозу, которую вводили в двухдозовом режиме с трехнедельным интервалом. Двенадцать (12) животных разбивали на 2 испытуемые группы таким образом: группа 1 - rCAV2-CPV VP2 @ 8,0 logs/мл; группа 2 -комбинация MLV (CAV2, CDV, CPV).
- 36 044953
Фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) вводили группе из шести (6) здоровых, CAV2- и CPVсеронегативных собак возрастом от 6 недель 2 дней до 7 недель 2 дней как 1 мл подкожную дозу в двухдозовом режиме с трехнедельным интервалом. Эту группу считали группой 3, и она служила в качестве провокационного контроля для исследования. Всем животным в группах 1-3 ороназально вводили провоцирующую дозу вирулентного CPV-2b на 22 DPV2. Данные клинического случая после провокации (клинические признаки, пирексия, лимфопения, лейкопения и выявление CPV в фекалиях) анализировали.
Рецептирование вакцины.
Посевной материал культуры тканей rCAV2-CPV VP2 разбавляли 0,01М PBS до целевой дозы, как указано ниже. Адъюванты не применяли. MLV-положительный контроль рецептировали и лиофилизировали с SGGK стабилизатором, причем каждый из антигенов в комбинации имел выше чем минимальную иммунизирующую дозу для линии продукта SOLOJEC®. Целевые дозы для вакцин были следующими:
Таблица 3
Группа | Вакцина | Целевая доза (Logi0FAID50/Mn) |
1 | rCAdV2-CPV VP2 | -8,0 |
2 | MLV (CAV2, CDV, CPV) | CAdV2 - -3,8-5,0 CDV - -1,6-3,0 CPV - -3,6-4,8 |
3 | PBS или MEM | NA |
Провоцирующий материал.
В день введения провоцирующей дозы три флакона замороженного провоцирующего материала CPV-2b подвергали быстрому размораживанию путем ручного перемешивания флакона(ов) в водной ванне 36±2°С. Материал после этого разбавляли 1:10 в среде для культивирования клеток до нужной концентрации. Провоцирующий инокулят оставался на льду все время в течение периода приготовления и провокации.
Титрование вакцинного антигена: CAV 2-CPV VP2.
В общих чертах, осуществляли десятикратное серийное разбавление вакцины. Каждое разбавление добавляли в каждую из 5 лунок в количестве 100 микролитров на лунку в 96-луночные планшеты с посевом клеток Мадин-Дарби почек собак (MDCK) в количестве 2,0x105 клеток/мл. Для каждой вакцины выполняли пять реплик. Планшеты инкубировали в количестве 36±1°С и 5±0,5% СО2 в течение 4±1 дней. После периода инкубации планшеты фиксировали, окрашивали только на вектор и считывали. Титры рассчитывали для 50% конечной точки с применением способа Рида и Менча.
Положительный контроль (CPV-CDV-CAdV2).
В общих чертах, осуществляли десятикратное серийное разбавление вакцины. Каждое разбавление добавляли к каждой из 5 лунок в количестве 100 микролитров на лунку в 96-луночные планшеты с посевом соответствующей концентрации клеток (CPV - MDCK в количестве 2x105 клеток/мл, CDV - VERO в количестве 2x105 клеток/мл, CAV2 - MDCK в количестве 2x105 клеток/мл). Для каждой фракции антигена выполняли пять реплик. Планшеты инкубировали при 36±1°С и 5±0,5% СО2 в течение 3-6 дней. После инкубационного периода планшеты фиксировали, окрашивали прямым конъюгатом FA и считывали. Титры рассчитывали для 50% конечной точки с применением способа Рида и Менча.
Сыворотка.
До 10 мл цельной крови с каждой собаки собирали каждую неделю на сыворотку, начиная с 0 DPV1. Конкретные моменты времени были следующие: 0 DPV1, 7 DPV1, 14 DPV1, 21 DPV1/0 DPV2, 7 DPV2 и 14 DPV2. Крови давали свернуться, центрифугировали при 1000-1300 x g для отделения сыворотки и распределяли на по крайней мере 2 аликвоты. Образцы сыворотки сохраняли при -20°С или более низкой температуре до оценки на титр антитела.
Серологический анализ выполняли, применяя анализ сывороточной нейтрализации (SN). SN-анализ применяли для измерения титров сывороточного антитела к CAV2, CPV-2b и CPV-2c.
В общих чертах, для серологического анализа CAdV2 серийные разбавления инактивированных нагреванием образцов сыворотки смешивали с одинаковыми объемами вирусной суспензии (от 50 до 300 FAID50). Смесь сыворотки-вируса инкубировали при 36±1°С в течение одного часа. В 96-луночные микротитровальные планшеты после этого высеивали клетки MDCK (2x105 клеток/мл в количестве 0,1 мл/лунку). Планшеты инкубировали при 36±1°С в увлажненном 5+0,5% СО2 инкубаторе в течение 5±1 дней. Планшеты фиксировали холодным ацетоном в течение 15±5 мин и вирус выявляли с помощью удельной флуоресценции. Невозможность выявления вируса путем иммунофлуоресценции указывала на присутствие SN-антител. Для определения титров SN-антител конечные точки 50% нейтрализации рассчитывали с применением способа Рида и Менча.
- 37 044953
Таблица 4
Значения CAV2 SN GMT
Группа | D0 (0 DPV1) | D7 | D14 | D21 (0 DPV2) | D28 | D35 | D43 (0 DPC) | D50 | D57 |
rCAV2-CPV VP2 | 1 | 703 | 967 | 645 | 3160 | 3069 | 2170 | 1448 | 1184 |
MLV | 1 | 7 | 575 | 196 | 384 | 418 | 308 | 228 | 215 |
Провокационный контроль | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
В общих чертах, для серологического анализа CPV-2b серийные разбавления инактивированных нагреванием образцов сыворотки смешивали с одинаковыми объемами вирусной суспензии (от 50 до 300 FAID50). Смесь сыворотки-вируса инкубировали при 36±1°С в течение одного часа. Клетки почек собаки (DKFD-00) (2,5x105 клеток/мл в количестве 0,1 мл/лунку) после этого добавляли во все лунки 96луночного микротитровального планшета. Планшеты инкубировали при 36±1°С в увлажненном 5±0,5% СО2 инкубаторе в течение 6±1 дней. Планшеты фиксировали холодным ацетоном в течение 15± 5 мин и вирус выявляли с помощью удельной флуоресценции. Невозможность выявления вируса путем иммунофлуоресценции указывала на присутствие SN-антител. Для определения титров SN-антител конечные точки 50% нейтрализации рассчитывали с применением способа Рида и Менча.
Таблица 5
Значения CPV-2b SN GMT
Группа | D0 (0 DPV1) | D7 | D14 | D21 (0 DPV2) | D28 | D35 | D43 (0 DPC) | D50 | D57 |
rCAV2-CPV VP2 | 1 | 1 | 1 | 6 | 724 | 484 | 558 | 484 | 14596 |
MLV | 1 | 34 | 1085 | 2170 | 6137 | 6502 | 10935 | 10321 | 10321 |
Провокационный контроль | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1007 | 8192 |
В общих чертах, для серологического анализа CPV-2c серийные разбавления инактивированных нагреванием образцов сыворотки смешивали с одинаковыми объемами вирусной суспензии (от 50 до 300 FAID50). Смесь сыворотки-вируса инкубировали при 36±1°С в течение одного часа. В 96-луночные микротитровальные планшеты после этого высеивали клетки MDCK (7x104 клеток/мл в количестве 0,1 мл/лунку). Планшеты инкубировали при 36±1°С в увлажненном 5+0,5% СО2 инкубаторе в течение 5±1 дней. Планшеты фиксировали холодным ацетоном в течение 15±5 мин и вирус выявляли с помощью удельной флуоресценции. Невозможность выявления вируса путем иммунофлуоресценции указывала на присутствие SN-антител. Для определения титров SN-антител конечные точки 50% нейтрализации рассчитывали с применением способа Рида и Менча.
Таблица 6
Значения CPV-2c SN GMT
Группа | DO (0 DPVI) | D7 | D14 | D21 (0 DPV2) | D28 | D35 | D43 (0 DPC) | D50 | D57 |
rCAV2-CPV VP2 | 1 | 1 | 2 | 9 | 911 | 684 | 383 | 342 | 10935 |
MLV | 1 | 14 | 418 | 1772 | 6502 | 8192 | 6137 | 9742 | 7298 |
Провокационный контроль | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 103 | 724 |
Четкий иммунный ответ был замечен относительно 3 групп при сравнении друг с другом антител CAdV2, CPV-2b и CPV-2c.
Группа CAdV2-CPV VP2 демонстрировала значительно более сильный иммунный ответ на CAdV2 в 7 DPV1 по сравнению с группой MLV, однако до 14 DPVI значения GMT в группах были похожими. Титры антитела для обеих групп снижались до 21 DPV1, когда животные получали бустерную дозу. После бустерной дозы уровень антител в обеих группах достигал пика, а потом постепенно выравнивался, причем в группе CAdV2-CPV VP2 выравнивание было с более высоким титром, чем в группе MLV. Отрицательная контрольная группа оставалась отрицательной для антител CAdV2 на протяжении всего исследования.
В отличие от иммунного ответа на антитело CAdV2 в 2 вакцинированных группах, иммунный ответ на антитело CPV группы CAdV2-CPV VP2 был минимальным до второй вакцинации, когда титр антитела CPV достиг пика в 7 DPV2, а потом выравнялся до провокации с применением CPV. После провокации иммунный ответ в группах CAdV2-CPV VP2 снова достиг пика. Вакцина MLV хорошо реагировала на первую вакцинацию, с дополнительным ответом на вторую вакцинацию. Уровень антитела CPV в группе MLV выравнивался после второй вакцинации и не демонстрировал значительного повышения на протяжении фазы провокации в исследовании. Отрицательные контрольные животные оставались отрицательными для антител CPV на протяжении всей фазы вакцинации до первого кровопускания после времени провокации, когда они демонстрировали значительный титр антитела CPV.
Клинические наблюдения.
- 38 044953
Всех животных наблюдали и каждый день измеряли ректальную температуру для базового уровня до ближайшей десятой градуса (Фаренгейт) в -2, -1 и О DPC. После провокации животных наблюдали каждый день в течение периода до 14 дней, когда измеряли ректальную температуру и осуществляли наблюдение клинических признаков. Клетки с животными не чистили до завершения наблюдений соответствующего дня.
Клинические признаки CPV включали, кроме прочего, следующие: (1) кровянистый стул - характерный стул, содержащий по крайней мере 10% крови, обычно в сочетании с диареей и/или слизью; стул обычно имеет темно-красный цвет и имеет заметный сильный железный запах; (2) слизеподобный стул характерный стул, содержащий по крайней мере 10% слизи, может сочетаться с диареей и может содержать или не содержать кровь. Слизеподобный стул может иметь или не иметь структуру и/или форму; (3) диарея - водянистая, без структуры, однородные лужи; (4) жар указывался, если ректальная температура составляла >103,4°F и по крайней мере на 1 градус по Фаренгейту выше базового уровня температуры. Гипотермия указывалась, если температура составляла 99,5°F или ниже и по крайней мере на один градус по Фаренгейту ниже базового уровня температуры.
Всех собак взвешивали до ближайшей десятой килограмма (кг) в 0, 7 и 14 DPC для определения потери/прибавки веса после провокации. Все показатели фиксировали в Записях массы тела.
Относительно клинических признаков единичный случай любого клинического признака, типичного для инфекции CPV, включая, диарею, слизь в стуле или кровь в стуле после провокации, которые определяли животное как положительное на клинические признаки. Отсутствие аппетита, подавленность/ сонливость и наличие рвоты также записывали как подтверждающие критерии для оценки животного как положительного на инфицирование парвовирусом.
У четырех (4) из 18 животных в этом исследовании наблюдалась диарея или рвота в 2 DPC. Эти клинические данные не относятся к типичным признакам начала CPV в 3-4 DPC и могут быть обусловлены голоданием и/или процедурой анестезии, которую применяют во время провокации. Они не считаются признаками инфекции CPV.
Группа rCAdV2-CPV VP2 (группа 1) не демонстрировала признаков инфекции до 10 DPC, когда у одного из 6 животных наблюдали кровянистый, слизеподобный стул в течение 1 дня. Следует отметить, что 1 животное в группе не демонстрировало признаков рвоты в 2 DPC, а это не охватывается кругом признаков начала CPV, как было указано выше, и, таким образом, не считается признаком инфекции.
В группе MLV (группа 2) 2 из 6 животных демонстрировали клинические признаки в 5 и 7 DPC, причем у собаки #12 наблюдали слизеподобный стул в 7 DPC, а у собаки #13 наблюдалась диарея в 5 и 7 DPC. Также следует отметить, что у 3 животных этой группы наблюдались признаки рвоты или диареи в 2 DPC, а это не охватывается кругом признаков начала CPV, как было указано выше, и таким образом, не считается признаком инфекции.
Все собаки в отрицательной контрольной группе (группа 3) демонстрировали ряд клинических признаков, от умеренных до тяжелых (диарею, слизеподобный стул, обезвоживание, рвоту, отсутствие аппетита, кровянистый стул), начиная с 4 DPC и заканчивая 11 DPC, когда 4 животных умерли от CPV (3 в 7 DPC и 1 в 8 DPC).
Пирексия: для пирексии единичный случай пирексии (ректальная температура >103,4°F и по крайней мере на 1 выше, чем базовый уровень до провокации) после провокации определял животное как относящееся к категории положительных.
Испытуемая группа rCAdV2-CPV VP2 (группа 1) демонстрировала 1 случай пирексия у 3 из 6 животных; 1 в 9 DPC и 2 в 12 DPC. Ни у одного из 6 животных в группе MLV (группа 2) пирексия не наблюдалась. В отрицательной контрольной группе (группа 3) 3 из 6 животных демонстрировали по крайней мере 1 случай пирексии (у 1 животного наблюдали 2 случая) от 4 до 5 DPC. У двух из 6 животных наблюдали гипотермию в 7 DPC.
Масса тела: для определения потери/прибавки массы в еженедельном режиме массу каждого отдельного животного оценивали путем вычитания значения массы от показателя предыдущей недели.
Ни у одного животного в испытуемой группе rCAdV2-CPV VP2 (группа 1) и испытуемой группе MLV (группа 2) не наблюдали потери массы в 7 или 14 DPC. Все животные в отрицательной контрольной группе (группа 3) демонстрировали потерю массы в 7 DPC от 0,1 до 0,8 килограмма. Животные, которые оставались в испытании в группе 3 в 14 DPC, имели прибавку в весе в 7 DPC.
Лимфопения: для лимфопении единичный случай лимфопении (>50% потеря по сравнению с базовым уровнем до провокации) после провокации определял собаку как относящуюся к категории положительных. В этом исследовании испытуемая группа rCAdV2-CPV VP2 (группа 1) включала 3 из 6 животных с по крайней мере 1 случаем лимфопении с началом в 9 - 12 DPC. Группа MLV (группа 2) не демонстрировала признаков лимфопении. Все животные в отрицательной контрольной группе (группа 3) имели по крайней мере 1 случай лимфопении с началом в 4 DPC.
Лейкопения: для лейкопении единичный случай лейкопении (>50% потеря по сравнению с базовым уровнем до провокации) после провокации определял собаку как относящуюся к категории положительных. В этом исследовании испытуемая группа rCAdV2-CPV VP2 (группа 1) и группа MLV (группа 2) не
- 39 044953 демонстрировали признаков лейкопении. Отрицательная контрольная группа (группа 3) включала 5 из 6 животных, которые имели по крайней мере 1 случай лейкопении с началом в 6 DPC.
Изоляция вируса из образцов фекалий: для изоляции вируса CPV из фекалий единичный случай выявления вируса CPV в фекалиях после провокации определял собаку как относящуюся к категории положительных. Титр фекального вируса CPV<1,5 Log10FAID50/мл записывали как отрицательный для изоляции фекального вируса CPV. Все другие записанные титры >1,5 Log10FAID50/мл причисляли к категории положительных для выявления фекального вируса CPV.
В этом исследовании группа rCAdV2-CPV VP2 (группа 1) включала 4 из 6 животных, которые демонстрировали по крайней мере 1 день вирусовыделения, которое начиналось между 8 и 14 DPC. В группе MLV (группа 2) не выделялось количество живого вируса, поддающееся выявлению. Все животные в отрицательной контрольной группе выделяли количество вируса, поддающееся выявлению, в фекалиях, начиная с 3 или 4 DPC, и это продолжалось до 9 DPC.
Итог результатов.
Таким образом, собак в возрасте от 6 недель 2 дней до 7 недель 2 дней подвергали вакцинации с применением 1,0 мл нижеприведенных вакцин в 0 DPV1 и 21 DPV1: (группа 1) rCAdV2-CPV VP2 = 8,0 logs/мл; (группа 2) MLV Combo - CAdV2/CDV/CPV = 4,7/2,6/3,9 logs/мл; (группа 3) PBS-Контроль. Всех вакцинированных собак подвергали провокации вирулентным CPV-2b, ороназально в 22 DPV2.
Исследуемая вакцина rCAdV2-CPV VP2 не соответствовала критериям эффективности при введении в двухдозовом режиме в количестве 8,0 logs на дозу. У трех (3) собак наблюдалась лихорадка, выделение CPV в фекалиях и лимфопения, а у 1 собаки наблюдались четкие клинические признаки парвовируса собачьих. У четвертой собаки наблюдалось только выделение CPV. Оказалось, что вакцина обеспечивает начальную защиту приблизительно до 10 DPC, которая заключалась в задержке начала клинических признаков инфекции по сравнению с отрицательными контрольными образцами. У одного вакцинированного животного отмечали полное помутнение роговицы по неизвестной причине.
Пример 8. Приготовление фармацевтических композиций (ВАКЦИН), включающих rCAdV-EHV-4 p430/RabG (n).
Приготовление фармацевтических композиций (вакцин), включающих rCAdV-EHV-4 p430/RabG (n) вакцину.
Рецептирование вакцины.
Посевной материал культуры ткани rCAdV-EHV-4 pp430/RabG (N) разбавляли 0,01М PBS до целевой дозы. Адъювантов не использовали.
Инокуляция свиней с применением rCAdV-EHV-4 pp430/RabG (n) и оценка серологического ответа.
План исследований: для вакцинированных поросят и контрольных групп в возрасте 4-8 недель (одна/две дозы) вводили 2 мл/дозу внутримышечно.
Для исследования свойств векторной вакцины для молодых поросят rCAdV-EHV-4 P(GG430) RABG (N) C1 испытывали в вакцинационно-серологическом исследовании.
Более подробно, поросят вакцинировали дважды с применением rCAdV-EHV-4 p430/RabG (N) C1 в дозе 6,7 logs в 0 и 21 дни исследования (двухэтапная вакцинация, 2х rCAdV). Невакцинированная группа служила в качестве отрицательного контроля.
Серология: анализы по измерению сероконверсии после вакцинации Индукцию нейтрализующих антител CAdV-2 после вакцинации испытали в сыворотке животных, вакцинированных один раз или два раза с применением вакцины rCAdV-2 p430 RabG. Вакцинированные животные демонстрировали заметные титры нейтрализации вируса (VN) к CAdV2, тогда как образцы сыворотки невакцинированных групп не имели заметного уровня нейтрализующего антитела CAdV-2 (табл. 2). Быстрые тесты на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT), которые выполняли на образцах сыворотки в Лаборатории бешенства Канзасского университета, продемонстрировали заметные титры RFFIT у 3 из 12 вакцинированных животных и не выявили заметных титров RFFIT в контрольных группах измерения бешенства нейтрализующих антител. Также осуществляли испытание полного антитела против бешенства с помощью ELISA и выделения вируса, а также вирусовыделения CAdV.
- 40 044953
Таблица 7
Серология | ||||||||||
День наблюдения | 0 DPV1 | 21 DPV1 | 35 DPV1, 14 DPV2 | |||||||
АНАЛИЗ | CAV2 VN | ELISA | RFFIT | CAV2 VN | ELISA | RFFIT | CAV2 VN | ELISA | RFFIT | |
ID поросят | ||||||||||
Плацебо-контроль | 502 | < 2 | * * | < 2 | ** | |||||
506 | < 2 | ** | < 2 | ** | ||||||
508 | < 2 | * * | < 2 | ** | ||||||
525 | < 2 | ** | < 2 | ** | ||||||
527 | < 2 | ** | < 2 | ** | ||||||
529 | < 2 | * * | < 2 | ** | ||||||
531 | < 2 | ** | < 2 | ** | ||||||
548 | < 2 | ** | < 2 | ** | ||||||
580 | < 2 | ** | < 2 | ** | ||||||
Вакцинованые rCAV2 MCP RabG | 501 | < 2 | ** | 45 | ** | 128 | ** | |||
507 | < 2 | ** | 32 | ** | 128 | ** | ||||
509 | < 2 | ** | 64 | ** | 91 | ** | ||||
516 | < 2 | * * | 23 | ** | 45 | ** | ||||
517 | < 2 | * * | 2 | * * | 23 | * * | ||||
519 | < 2 | ** | <2 | ** | 16 | 0,1 Ш/мл | ||||
521 | < 2 | ** | 45 | ** | 181 | ** |
524 | <2 | * * | 45 | ** | 64 | ** | ||||
528 | < 2 | * * | 32 | * * | 91 | ** | ||||
532 | < 2 | * * | 16 | ** | 23 | 0,1 IU/мл | ||||
533 | < 2 | * * | < 2 | ** | 45 | Ф* | ||||
534 | < 2 | * * | 64 | 0,1 Ш/мл | 181 | фф |
Эти результаты подтверждают применение промоторов EHV-4 согласно настоящему изобретению в векторе CadV, демонстрируя эффективную экспрессию нужного трансгена (путем оценки экспрессии для определения пропорции вируса вакцины, которая приводит к экспрессии нужного трансгена в инфицированных клетках), а также вирусное спасание и иммуногенность трансгена у вакцинированных животных. Оценка экспрессии даже была невозможна с векторами CadV с экспрессионными кассетами под управлением промоторов CMV. Все композиции и способы, которые раскрываются и заявляются авторами, могут быть получены и выполнены без лишних экспериментов в свете представленного описания. Хотя композиции и способы согласно настоящему изобретению были описаны на примерах предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области станет понятна возможность внесения изменений в композиции и способы и этапы или последовательность этапов описанного авторами способа без отклонения от идеи, сущности и объема изобретения. Более конкретно, станет очевидно, что некоторые агенты, которые являются химически и физиологически родственными, могут замещать описанные авторами агенты при достижении таких же или подобных результатов. Все подобные замещения и модификации, являющиеся очевидными для специалистов в данной области, считаются охватываемыми сущностью, объемом и идеей изобретения, которые определяются представленной ниже формулой изобретения.
Библиография.
Представленные ниже источники, в той мере, в которой они представляют процедурные и другие детали, дополнительные к изложенным авторами, специально включены в настоящее описание путем ссылки.
1. Buonavoglia, С. and V. Martella, Canine respiratory viruses. Vet Res,
2007. 38(2): p. 355-73.
- 41 044953
2. Tham, К.M., G.W. Horner, and R. Hunter, Isolation and identification of canine adenovirus type-2 from the upper respiratory tract of a dog. N Z Vet J,
1998. 46(3): p. 102-5.
3. Hamelin, С., P. Jouvenne, and R. Assaf, Association of a type-2 canine adenovirus with an outbreak of diarrhoeal disease among a large dog congregation. J Diarrhoeal Dis Res, 1985. 3(2): p. 84-7.
4. Macartney, L., H.M. Cavanagh, and N. Spibey, Isolation of canine adenovirus-2 from the faeces of dogs with enteric disease and its unambiguous typing by restriction endonuclease mapping. Res Vet Sci, 1988. 44(1): p. 9-14.
5. Benetka, V., et al., Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec, 2006. 158(3): p. 91-4.
6. Appel, M., et al., Pathogenicity of low-virulence strains of two canine adenovirus types. Am J Vet Res, 1973. 34(4): p. 543-50.
7. Appel, M., L.E. Carmichael, and D.S. Robson, Canine adenovirus type 2-induced immunity to two canine adenoviruses in pups with maternal antibody. Am J Vet Res, 1975. 36(08): p. 1199-202.
8. Bittie, J.L., W.A. Grant, and F.W. Scott, Canine and feline immunization guidelines—1982. J Am Vet Med Assoc, 1982. 181(4): p. 332-5.
9. Curtis, R. and K.C. Barnett, The 'blue eye' phenomenon. Vet Rec, 1983. 112(15): p. 347-53.
10. Bru, T., S. Salinas, and E.J. Kremer, An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses, 2010. 2(9): p. 2134-53.
11. Hu, R.L., et al., Experimental immunization of cats with a recombinant rabies-canine adenovirus vaccine elicits a long-lasting neutralizing antibody response against rabies. Vaccine, 2007. 25(29): p. 5301-7.
12. Hu, R., et al., Prevention of rabies virus infection in dogs by a recombinant canine adenovirus type-2 encoding the rabies virus glycoprotein. Microbes Infect, 2006. 8(4): p. 1090-7.
13. Li, J., et al., A single immunization with a recombinant canine adenovirus expressing the rabies virus G protein confers protective immunity against rabies in mice. Virology, 2006. 356(1-2): p. 147-54.
14. Henderson, H., et al., Oral immunization of raccoons and skunks with a canine adenovirus recombinant rabies vaccine. Vaccine, 2009. 27(51): p. 7194-7.
- 42 044953
15. Bouet-Cararo, C., et al., Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep.
Vaccine, 2011. 29(6): p. 1304-10.
16. Liu, Y., et al., Efficacy and safety of a live canine adenovirus-vectored rabies virus vaccine in swine. Vaccine, 2008. 26(42): p. 5368-72.
17. Fischer, L., et al., Vaccination of puppies born to immune dams with a canine adenovirus-based vaccine protects against a canine distemper virus challenge. Vaccine, 2002. 20(29-30): p. 3485-97.
18. Yang, S., et al., Complete protection of cats against feline panleukopenia virus challenge by a recombinant canine adenovirus type 2 expressing VP2 from FPV. Vaccine, 2008. 26(11): p. 1482-7.
19. Zhang, S., et al., Oral vaccination of dogs (Canis familiaris) with baits containing the recombinant rabies-canine adenovirus type-2 vaccine confers longlasting immunity against rabies. Vaccine, 2008. 26(3): p. 345-50.
20. Gallichan, W.S., et al., Mucosal immunization with a recombinant adenovirus vector induces local and systemic immunity and protection from herpes simplex virus. Adv Exp Med Biol, 1995. 371B: p. 1581-5.
21. Lubeck, M.D., et al., Immunogenicity of recombinant adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees following intranasal administration. AIDS Res Hum Retroviruses, 1994. 10(11): p. 1443-9.
22. Wang, Y., et al., The use of an El-deleted, replication-defective adenovirus recombinant expressing the rabies virus glycoprotein for early vaccination of mice against rabies virus. J Virol, 1997. 71(5): p. 3677-83.
23. Papp, Z., L.A. Babiuk, and M.E. Baca-Estrada, The effect of preexisting adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine, 1999. 17(7-8): p. 933-43.
24. Babiuk, L.A. and S.K. Tikoo, Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. J Biotechnol, 2000. 83(1-2): p. 105-13.
25. Wright, N., et al., High prevalence of antibodies against canine adenovirus (CAV) type 2 in domestic dog populations in South Africa precludes the use of CAV-based recombinant rabies vaccines. Vaccine, 2013. 31(38): p. 4177-82.
26. Kremer, E.J., et al., Canine adenovirus vectors: an alternative for adenovirus-mediated gene transfer. J Virol, 2000. 74(1): p. 505-12.
- 43 044953
27. Linne, T., Differences in the E3 regions of the canine adenovirus type 1 and type 2. Virus Res, 1992. 23(1-2): p. 119-33.
28. Chartier, C., et al., Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J Virol, 1996. 70(7): p.
4805-10.
29. Lopez de Turiso, J.A., et al., Recombinant vaccine for canine parvovirus in dogs. J Virol, 1992. 66(5): p. 2748-53.
30. Langeveld, J.P., et al., First peptide vaccine providing protection against viral infection in the target animal: studies of canine parvovirus in dogs. J Virol, 1994. 68(7): p. 4506-13.
31. Boshart M, Weber F, Jahn G, Dorsch-Hasler K, Fleckenstein B, Schaffner W. 1985. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41(2):521-30.Bryant, N. A., Davis-Poynter, N., Vanderplasschen, A., and Alcami, A. 2003. Glycoprotein G isoforms from some alphaherpesviruses function as broad-spectrum chemokine binding proteins. The EMBO Journal Vol. 22 ( 4): 833-846.
33. Bustin, S. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 25(2): 169-193.
34. Charoensawan, V., Wilson, D., Teichmann, S.A. 2010. Genomic repertoires of DNA-binding transcription factors across the tree of life. Nucleic Acids Res. 38(21):7364-77
35. Colle, C.F. 3rd, O'Callaghan, D.J. 1995. Transcriptional analyses of the unique short segment of EHV-1 strain Kentucky A. Virus Genes;9(3):257-68.
36. Donnelly, M.L., Luke, G., Mehrotra, A., Li, X., Hughes, L.E., Gani, D., and Ryan, M.D. 2001. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J Gen Virol. 82(Pt 5):1013-25
37. Dorsch-Hasler, K., Keil, G.M., Weber, F., Jasin, M. Schaffner, W., and Koszinowski, U.H. 1985. A long and complex enhancer activates transcription of the gene coding for the highly abundant immediate early mRNA in murine cytomegalovirus. PNAS Vol. 82: 8325-8329.
- 44 044953
38. Drummer, H.E., Studdert, M.J., Crabb, B.S. 1998. Equine herpesvirus-4 glycoprotein G is secreted as a disulphide-linked homodimer and is present as two homodimeric species in the virion. J. Gen. Virol. 79: 1205-1213
39. Fields, B, Knipe, D.M.; and Howley, P.M. 2013. Virology. 6th ed.
Philadelphia; Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams&Wilkins
40. Foecking, M.K., Hofstetter, H. 1986. Powerful and versatile enhancerpromoter unit for mammalian expression vectors. Gene 45(1): 101 -5.
41. Goodwin, E.C. & Rottman, F.M. 1992. The 3’flanking sequence of the bovine growth hormone gene contains novel elements required for efficient and accurate polyadenylation. J.Biol.Chern. 267: 16330-16334.
42. Jang, S.K., Pestova, T.V., Hellen, C.U., Witherell, G.W., Wimmer, E. 1990. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme.;44(1-4):292-309.
43. Kim, D.W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. 1990. Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene 16;91(2):217-23.
44. Lee, E.C., Yu, D., Martinez de Velasco, J., Tessarollo, L., Swing, D.A. et al. 2001. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of ВАС DNA. Genomics 73: 56-65.
45. Luke, GA and Ryan, MD. 2013. The protein coexpression problem in biotechnology and biomedicine: virus 2A and 2A-like sequences provide a solution.Future Virology, Vol. 8, No. 10, Pages 983-996.
46. Ma, G., Eschbaumer, M., Said, A., Hoffmann, B., Beer, M., Osterrieder, N. 2012. An equine herpesvirus type 1 (EHV-1) expressing VP2 and VP5 of serotype 8 bluetongue virus (BTV-8) induces protection in a murine infection model. PLoS One. 2012;7(4):e34425. doi: 10.1371/journal.pone.0034425. Epub 2012 Apr 12.
47. Ma, G., Azab, W., Osterrieder, N. 2013. Equine herpesviruses type 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4)—masters of co-evolution and a constant threat to equids and beyond. Vet Microbiol. 167(1-2):123-34.
48. Nolan, T. Rebecca E Hands, R.E., and Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582
49. Osterrieder, N., Neubauer, A., Brandmuller,C., Kaaden, O.R., and O’Callaghan, D.J. 1996. The equine herpesvirus 1 IR6 protein influences virus growth
- 45 044953 at elevated temperature and is a major determinant of virulence. Virology 226:243251.
50. Proudfoot, N.J. 2011. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes&Development 25:1770-1782.
51. Ptashne, M. 2014. The Chemistry of Regulation of Genes and Other Things The Journal of Biological Chemistry Vol. 289, ( 9) 5417-5435. Reed, L.J., and Muench, H. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. (27) 3; 493-497.
52. Rosas, C.T., Konig, P., Beer, M., Dubovi, E.J., Tischer, B.K., Osterrieder, N., 2007a. Evaluation of the vaccine potential of an equine herpesvirus type 1 vector expressing bovine viral diarrhea virus structural proteins. J. Gen. Virol. 88 (3), 748-757.
53. Rosas, C.T., B.K. Tischer, G.A. Perkins, B. Wagner, L.B. Goodman, N. Osterrieder. 2007b . Live-attenuated recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) induces a neutralizing antibody response against West Nile virus (WNV) Virus Research, 125 , pp. 69-78.
54. Rosas, C.T., Van de Walle, G.R., Metzger, S.M., Loelzer, K., Dubovi, E.J., Kim, S.G., Parrish, C.R., Osterrieder, N., 2008. Evaluation of a vectored equine herpesvirus type 1 (EHV-1) vaccine expressing H3 haemagglutinin in the protection of dogs against canine influenza. Vaccine 26 (19), 2335-3234.
55. Ryan, M.D.,and Drew J. 1994. Foot-and-mouth disease virus 2A oligopeptide mediated cleavage of an artificial polyprotein. EMBO JFeb 15;13(4):928-33.
56. Said, A., Elke Lange, E., Beer, M. Damiani, A., Osterrieder, N. 2013. Recombinant equine herpesvirus 1 (EHV-1) vaccine protects pigs against challenge with influenza A(HlNl)pmdO9 Virus Research 173: 371- 376
57. Shaner, N.C., Campbell, R.E., Steinbach, P.A., Giepmans, B.N., Palmer, A.E., Tsien, R,Y. 2004. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. Dec;22(12):1567-72. Epub 2004 Nov 21.
58. Tischer, B.K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N., 2006. Twostep red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. Biotechnol. Tech. 40, 191-197.
-
Claims (16)
- 59. Tischer, В.К., Kaufer, В.В., Sommer, М., Wussow, F., Arvin, A., andOsterrieder, N. A Self-Excisable Infectious Bacterial Artificial Chromosome Clone ofVaricella-Zoster Virus Allows Analysis of the Essential Tegument Protein Encoded by ORF9. J. Virol.81 (23), 2007, 13200-13208.60. Tischer, B.K, Smith, G.A.,and Osterrieder, N. in: Jeff Braman (ed.), In vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 634,DOI 10.1007/978-l-60761-652-8_30, © Springer Science+Business Media, LLC 2010, Chapter 30: En Passant Mutagenesis: A Two Step Markerless Red Recombination System.61. Thompson, S.R. 2012. Tricks an IRES uses to enslave ribosomes. Trends Microbiol. Nov;20(l 1):558-66.62. Trapp, S., von Einem, J., Hofmann, H., Kostler, J., Wild, J., Wagner, R., Beer, M., Osterrieder, N., 2005. Potential of equine herpesvirus 1 as a vector for immunization. J. Virol. 79, 5445-5454.63. Wellington, J.E., Allen, G.P., Gooley, A.A., Love, D.N., Packer, N.H., Yan, J.X., Whalley, J.M. 1996. The highly O-glycosylated glycoprotein gp2 of equine herpesvirus 1 is encoded by gene 71. J Virol. 70(11):8195-8.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Вектор рекомбинантного аденовируса собачьих (rCAdV), который включает экспрессионную кассету, кодирующую гетерологическую ДНК, функционально связанную с промоторной последовательностью герпесвируса-4 (EHV4) непарнокопытных, причем промоторная последовательность EHV4 представляет собой или i) промоторную последовательность ORF 42 EHV4, включающую полинуклеотид, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO: 32, или ii) промоторную последовательность ORF 70 EHV4, включающую полинуклеотид, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO: 31.
- 2. Вектор rCAdV по п.1, где промоторная последовательность герпесвируса-4 (EHV4) представляет собой промоторную последовательность ORF 42 EHV4.
- 3. Вектор rCAdV по п.1, где промоторная последовательность герпесвируса-4 (EHV4) представляет собой промоторную последовательность ORF 70 EHV4.
- 4. Вектор rCAdV по п.2, где промоторная последовательность ORF 42 EHV4 включает полинуклеотид, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO: 30.
- 5. Вектор rCAdV по п.3, где промоторная последовательность ORF 70 EHV4 включает полинуклеотид, по меньшей мере на 95% идентичный SEQ ID NO: 29.
- 6. Вектор rCAdV по п.5, где промоторная последовательность ORF 70 EHV4 включает SEQ ID NO: 29.
- 7. Вектор rCAdV по п.4, где промоторная последовательность ORF 42 EHV4 включает SEQ ID NO:30.
- 8. Вектор rCAdV по п.3, где промоторная последовательность ORF 70 EHV4 включает SEQ ID NO: 31.
- 9. Вектор rCAdV по п.2, где промоторная последовательность ORF 42 EHV4 включает SEQ ID NO: 32.
- 10. Вектор rCAdV по п.1, где вектор rCAdV представляет собой инфекционный аденовирус собачьих.
- 11. Вектор rCAdV по п.1, где гетерологическая ДНК кодирует антигенный эпитоп, фактор роста или слитый белок, где гетерологическая ДНК включает терапевтический ген.
- 12. Вектор rCAdV по п.11, где гетерологическая ДНК кодирует антигенный эпитоп.
- 13. Вектор rCAdV по п.12, где антигенный эпитоп является патогеном собачьих или кошачьих.
- 14. Вектор rCAdV по п.12, где антигенный эпитоп выделен из патогена животного, предназначенного для получения пищевых продуктов.
- 15. Вектор rCAdV по п.13, где антигенный эпитоп выбран из группы, к которой относятся антиген Morbillivirus, гликопротеин бешенства, белок оболочки вируса лейкоза кошачьих (FeLV), антиген вируса иммунодефицита, антиген парвовируса, антиген поксвируса.
- 16. Вектор rCAdV по п.14, где патоген животного, предназначенного для получения пищевых продуктов, выделен из организма свиньи, крупного рогатого скота, коня, домашней птицы и/или овцы.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/397,139 | 2016-09-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044953B1 true EA044953B1 (ru) | 2023-10-17 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3515504B1 (en) | Canine adenovirus vectors | |
US10619169B2 (en) | EHV insertion site ORF70 | |
US11261464B2 (en) | Promoters | |
US10905758B2 (en) | Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea | |
US11904010B2 (en) | Recombinant virus capable of stably expressing target proteins | |
US11384365B2 (en) | EHV with inactivated UL18 and/or UL8 | |
US11596681B2 (en) | EHV insertion site UL43 | |
EA044953B1 (ru) | Векторы аденовируса собачьих | |
RU2816428C9 (ru) | Рекомбинантный вирус, способный к устойчивой экспрессии белков-мишеней | |
RU2816428C2 (ru) | Рекомбинантный вирус, способный к устойчивой экспрессии белков-мишеней | |
TWI852923B (zh) | 具不活化ul18及/或ul8之新穎馬阿爾發疱疹病毒(ehv) | |
EA048192B1 (ru) | Новые промоторы |