CN112079904B

CN112079904B - 一种重组的h7n9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112079904B
Application number: CN202011000015.XA
Authority: CN
Inventors: 胡娇; 刘秀梵; 李如梦; 李军; 胡增垒; 王晓泉; 顾敏
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112079904A

Abstract

本发明公开了一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用，基于重组杆状病毒昆虫细胞培养系统，分别构建了表达H7N9高致病性禽流感病毒HA蛋白、NA蛋白、M1蛋白的重组杆状病毒。将三株重组杆状病毒共感染悬浮的昆虫细胞，可收获到在细胞内自行组装的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒。经超滤管与不同梯度浓度蔗糖浓缩纯化后，与佐剂混和乳化制备疫苗。制备的疫苗免疫鸡可诱导机体产生特异性抗体，具有免疫原性强、安全性好、遗传稳定性高等优点。以致死剂量的H7N9亚型高致病性禽流感病毒攻击后，能够提供完全的临床保护且显著抑制鸡的排毒。本发明为预防H7N9亚型禽流感病毒感染提供了一种新的方法，也为流感病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

Description

一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)属于A型流感病毒，是一种具有8节段的单股负链的RNA病毒，它可引起一种或多种禽类和其它动物发病和死亡。2013年，H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现，迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰，对公共卫生和家禽养殖造成了重大威胁。在第五波流行中发现，在连接HA1和HA2肽区的裂解位点插入四个碱性氨基酸残基(KRKRTAR/G或KGKRIAR/G)，多个氨基酸的存在证明H7N9 AIV已经从LPAI病毒进化为HPAI病毒，为H7N9的防控带来了更大的困难。

接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。家禽的疫苗接种对于减少家禽的带毒排毒及降低人群对H7N9病毒的暴露风险有重要意义。目前商品化的H7N9禽流感疫苗为灭活疫苗，在疫病防控上起到了较好的作用。但是，传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产，具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外，灭活疫苗只能诱导抗体免疫，而不能诱导细胞免疫。因此，需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗，以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。

病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒，可模拟病毒粒子的天然结构，能激活细胞免疫反应和体液免疫反应，诱导的免疫保护更为全面。利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产VLP疫苗。由于杆状病毒表达系统不依赖鸡胚生产，且能保证禽流感大流行时疫苗的充足供应，具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势，被广泛应用于临床实验中。因此利用杆状病毒表达系统生产流感VLP疫苗具有较大的应用潜力。

发明内容

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，含有

A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质M1蛋白；A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的genebank公开序列号为:PB2(KY751288)、PB1(KY751256)、PA(KY751233)、HA(KY751058)、NP(KY751157)、NA(KY751124)、M(KY751091)、NS(KY751190)。

所述HA蛋白由SEQ ID NO：1所示序列或其简并序列编码；NA蛋白由SEQ ID NO：2所示序列或其简并序列编码；M1蛋白由SEQ ID NO：3所示序列或其简并序列编码。

第二方面，提供所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括：通过HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒共同感染悬浮的昆虫细胞，自行组装后收获上清经浓缩纯化处理制备而成。

在一些实施例中，制备方法包括：将HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒按照MOI为1：1：1共感染昆虫细胞，培养后收集细胞上清，收获同时含有HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒。

进一步的，HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒为分别构建含有H7N9禽流感病毒的HA/NA/M1基因的重组杆状病毒穿梭质粒，与杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞制备形成；

其中，HA基因重组杆状病毒的制备方法，包括：

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的HA基因(SEQ ID NO：1)设计引物，HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，HA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.5所示；利用HA基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR扩增；

将扩增后的HA基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得HA基因重组杆状病毒穿梭质粒；

用HA基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得HA基因重组杆状病毒；将成功拯救的HA基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得HA基因重组杆状病毒；

NA基因重组杆状病毒的制备方法，包括：

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的NA基因(SEQ ID NO：2)设计引物，NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，NA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；利用NA基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR扩增；

将扩增后的NA基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得NA基因重组杆状病毒穿梭质粒；

用NA基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得NA基因重组杆状病毒；将成功拯救的NA基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得NA基因重组杆状病毒；

M1基因重组杆状病毒的制备方法，包括：

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的M1基因(SEQ ID NO：3)设计引物，M1基因的上游引物序列如SEQ ID NO.8所示，M1基因的下游引物序列如SEQ ID NO.9所示；利用M1基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR扩增；

将扩增后的M1基因与杆状病毒载体经酶切、连接、转化，获得M1基因重组杆状病毒穿梭质粒；

用M1基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得M1基因重组杆状病毒；将成功拯救的M1基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得M1基因重组杆状病毒。

在一些实施例中，所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括：

步骤一、将制得的HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒按照MOI为1：1：1共感染昆虫细胞，感染72h后收获细胞上清；

步骤二、将感染细胞上清液经超滤管5000×g离心浓缩得浓缩液；

步骤三、将浓缩液经30％-60％不同梯度浓度蔗糖溶液进行纯化，收获40％-50％浓度蔗糖间透明条带，110000×g离心脱糖收获离心后的沉淀液，即得。

在一些实施例中，所述昆虫细胞为Sf9细胞；杆状病毒DNA为优化过的DNA，采用flashBAC^TM DNA；所述的杆状病毒载体为pVL1393。

第三方面，提供一种疫苗，包括药学上可以接受的载体和免疫量的所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒。所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：水包油包水型佐剂；其中所述的水包油包水型佐剂为Montanide^TMISA系列佐剂，进一步为Montanide^TMISA 71VG佐剂；疫苗成分比例为禽流感病毒样颗粒：佐剂＝1：2。

在一些实施例中，疫苗的制备方法，包括如下步骤：是将基于昆虫杆状病毒悬浮培养系统表达H7N9亚型禽流感病毒的HA、NA、M1蛋白的三种重组杆状病毒共感染组装形成的病毒样颗粒与Montanide^TMISA佐剂混合制备形成；进一步地，该方法包括以下步骤：

1.根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15株)的HA基因(SEQ ID NO：1)、NA基因(SEQ ID NO：2)和M1基因(SEQ ID NO：3)设计引物，PCR扩增获取目的基因；

2.将目的基因分别与杆状病毒载体pVL1393经双酶切、连接、转化，获得重组杆状病毒穿梭质粒；

3.用重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞进行拯救重组杆状病毒，利用PCR、间接免疫荧光试验鉴定重组病毒中目的蛋白的表达；

4.将成功拯救的重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，并分别鉴定其遗传稳定性；

5.将稳定遗传且序列无突变的三种重组杆状病毒按照MOI为1：1：1共感染Sf9昆虫细胞，72h后离心收上清，电镜观察鉴定；

6.将感染上清液经超滤管5000xg离心浓缩；将浓缩液经30％-60％不同梯度浓度蔗糖纯化，收获40％-50％浓度间透明条带，110000xg离心脱糖收获沉淀液，利用BCA测定蛋白浓度；

7.将收获的病毒样颗粒以免疫剂量与佐剂1：2混合乳化，制备疫苗。

第三方面，提供所述的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒/所述的疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。其中，禽流感病毒包括H7N9亚型禽流感病毒。将制备的疫苗免疫SPF鸡，一次免疫三周内分别采血检测抗体效价。免疫三周后以致死剂量的H7N9高致病性禽流感病毒攻击，观察死亡并检测排毒。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种检测重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及检测方法，本发明基于重组杆状病毒昆虫细胞培养系统，构建了三株表达H7N9高致病性禽流感病毒HA、NA、M1蛋白的重组杆状病毒。将三株重组病毒以MOI为1共感染悬浮细胞，即可收获到在细胞内自行组装的H7N9禽流感病毒样颗粒。经超滤管与不同梯度浓度蔗糖浓缩纯化后，病毒样颗粒血凝(HA)效价达到11log₂。将收获的H7N9禽流感病毒样颗粒定量后，与佐剂混和乳化制备疫苗。同时设置了不同处理方式收获的病毒样颗粒与不同免疫剂量组，还比较了与重组杆状病毒亚单位灭活疫苗(刘秀梵,胡娇,梁艳艳,胡增垒,李如梦,王晓泉,顾敏.表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法与应用,CN 108888761A[P].2018)免疫效果。疫苗免疫后第3周各疫苗都能诱导产生抗体应答，平均血凝抑制抗体滴度在6log₂以上；疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。与对照组相比，各疫苗免疫鸡的血清中均能检测到高滴度的中和抗体和IgY抗体。免疫3周后，用GD15毒株以10^6.0EID₅₀的剂量通过滴鼻点眼的方式攻毒。未免疫组在攻毒后出现严重的临床症状，且5天内全部死亡，而所有疫苗免疫鸡在攻毒后14天内均未出现症状且未发生死亡，说明H7N9 VLP疫苗可提供100％的临床保护。攻毒后的排毒检测结果显示，疫苗免疫后最高仅有30％的鸡能检测到排毒，且排毒量较低。其中纯化VLP-1组仅在攻毒后第3天能检测到少量排毒外，其余天均未检测到排毒。组织病毒载量检测结果显示，rBac-HA-GD15灭活疫苗组在盲肠中能检测到排毒，而VLP疫苗15ug组未检测到排毒。组织病理学实验显示，VLP疫苗免疫后，H7N9病毒感染造成的肺脏病变明显较轻。这些结果说明，通过单独表达HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒共感染Sf9细胞可成功组装H7N9 VLP，且VLP疫苗能够诱导产生较强的抗体免疫应答，能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护且显著抑制排毒。该发明制备的病毒样颗粒疫苗为H7N9禽流感的防控提供了新的疫苗选择，为研制其他新型病毒样颗粒疫苗奠定了基础，并由于其操作简单、免疫效力强、安全性高等优势，具有很大的实际应用潜力。

附图说明

图1为双酶切鉴定重组穿梭质粒的图谱。其中line 1为pVL1393载体(9632bp)与目的基因NA片段，其中line 2为pVL1393载体与目的基因M1片段，其中line 3为pVL1393载体与目的基因HA片段。

图2是利用间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的结果图。其中绿色荧光(左边)为目的蛋白的鉴定，红色荧光(右边)为杆状病毒的GP64蛋白的鉴定结果图。

图3是提取重组杆状病毒DNA，利用PCR扩增目的基因进行鉴定。其中Lane1～4分为Mock、rBac-M1-GD15、rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15的鉴定结果图。

图4为禽流感病毒样颗粒的透射电镜图。

图5为疫苗免疫后的抗体水平的检测情况：A图为免疫后三周内的HI抗体变化；B图为免疫第三周的血清与2013-2018年的H7N9毒株交叉反应的结果；C和D图是检测免疫第三周的血清的中和抗体与IgY抗体结果图。

图6为以H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD15攻毒后临床观察14天各组SPF鸡的存活情况。

图7为以H7N9禽流感病毒GD15攻毒后各组SPF鸡喉头与泄殖腔的排毒定量检测结果。

图8为攻H7N9高致病性禽流感病毒GD15毒后第3、5天各组SPF鸡的心脏、盲肠、脾脏、肺脏的排毒定量结果。

图9为攻H7N9高致病性禽流感病毒GD15毒后第3、5天各组鸡的肺脏组织病理变化结果图(HE染色)。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明作进一步详细的描述。若无特别说明，本发明所述的实验方法，均为常规方法；所述的生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1：重组穿梭质粒的构建

本实验中使用的H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD15/2016(以下简称GD15株)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室保存并提供。该毒株已在genebank上公开了序列，序列号为:PB2(KY751288)、PB1(KY751256)、PA(KY751233)、HA(KY751058)、NP(KY751157)、NA(KY751124)、M(KY751091)、NS(KY751190)。根据禽流感病毒GD15株的HA、NA、M1基因的核酸序列使用Primer Premier 5.0软件进行设计引物，用于基因的扩增。

表1扩增HA、NA与M1基因的引物信息

注：GCCACC(粗体)代表Kozak序列；下划直线为酶切位点。

PCR反应体系如下：模板质粒：1μL；上游引物：1μL；下游引物：1μL；2×TransStartFastPfu PCR SuperMix：12.5μL；ddH₂O：9.5μL。

PCR程序为：

HA的扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，56℃50s，72℃2min，25个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存。

NA的扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，58℃50s，72℃2min，25个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存。

M1的扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，25个循环；72℃充分延伸10min，4℃保存。

待PCR程序完成时，取10μL产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，待电泳完成后，在实验室凝胶成像系统中观察有特异性的条带出现。切割目的条带，用DNA凝胶抽提试剂盒提纯，回收目的片段。将回收的目的片段与pVL1393载体同时进行双酶切后连接，连接体系如下：

将连接产物转化DH5α感受态细胞。常规方法小量提取质粒，酶切、电泳初步鉴定后测序，将序列保真的阳性质粒分别命名为pVL-HA-GD15、pVL-NA-GD15、pVL-M1-GD15。

实施例2：重组杆状病毒的拯救

将重组穿梭质粒pVL-HA-GD15、pVL-NA-GD15、pVL-M1-GD15和优化过的杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9细胞，简要流程如下：

1)在六孔细胞板中加入Sf9细胞，1×10⁶/孔，将细胞板水平静置于27℃培养箱中，培养1h，同时准备转染样品；

2)准备DNA转染复合物：将重组穿梭质粒分别稀释至浓度为100ng/μL备用；将转染试剂温热至室温并轻轻混匀；准备两个无菌EP管，分别加入100μL无血清培养基；其中一管加入5μL(100ng)flashBAC^TMDNA，轻弹EP管混合均匀；加入5μL(500ng)转移载体质粒，轻弹管子混合均匀，再加入4μL的转染试剂轻弹EP管混合均匀，瞬离沉淀；在另一管中依次加入5μL(500ng)转移载体质粒与4μL的转染试剂，轻弹EP管混合均匀，瞬离沉淀，作为对照；在室温下孵育15-20min使其形成转染复合物；

3)细胞培养1h后，去除培养液，沿孔壁缓缓加入1mL无血清培养基，轻轻洗细胞单层两次；

4)加入转染复合物，27℃孵育16-24h；

5)去除转染复合物，每孔加入2mL含5％血清的新鲜培养基，继续培养4天(从共转染开始5天)；

6)转染后继续培养5天，收集细胞培养上清3000rpm离心10min，即可收获第1代重组杆状病毒。将收获的细胞上清分装，避光保存，短期保存在4℃，长期保存在-70℃。

实施例3：重组杆状病毒的鉴定

1重组杆状病毒基因组中外源基因的PCR鉴定

1.1重组病毒DNA的提取

重组杆状病毒DNA的提取按照全式金病毒提取试剂盒说明书进行：

1)Poly A Carrier RNA与Binding Buffer 1：50混匀，称为MIX A；

2)每个样品取200μL上清，加入200μL BB5与20μL蛋白酶K，涡旋混匀；

3)56℃孵育15min，加入250μL无水乙醇，涡旋震荡混匀后放置室温15min；

4)装好吸附柱，将混合液转移至柱内，12000rpm离心1min，弃去下层液体；

5)加入500μL WB5，12000rpm离心1min，弃去滤液，重复一次该步骤；

6)12000rpm离心1min，弃去下层收集管，换为1.5mL Eppendorf管；

7)在柱内加入30μL Elution Buffer，室温放置1min，12000rpm离心1min洗脱核酸后弃柱。

1.2 PCR扩增外源基因

根据pVL1393载体说明书，设计引物扩增重组杆状病毒基因组中的外源基因HA、NA、M1进行鉴定。用SnapGene软件设计引物，引物命名分别为1393-RF和1393-RR，引物由南京擎科生物科技有限公司合成，序列如下：

1393-RF:5’-TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG-3’(SEQ ID NO：10)；

1393-RR:5’-CAACAACGCACAGAATCTAG-3’(SEQ ID NO：11)。

将PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图3)，条带大小正确。切割目的条带用DNA凝胶抽提试剂盒进行纯化、回收，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定，发现基因序列无突变。

2间接免疫荧光检测目的蛋白表达

转染5天后收集细胞，进行间接免疫荧光(IFA)，简要流程为：

1)将六孔板内液体吸尽，每孔加入500μL冷甲醇固定液(-20℃预冷)，轻拿平放于4℃冰箱固定10min；

2)将固定液弃去，用PBS洗细胞板3遍，左右晃动5min，弃去孔内液体；

3)加入1:1000稀释的一抗，37℃孵育1h；

4)重复步骤2)；

5)加入1:1000稀释的二抗，37℃孵育45min，PBS洗3遍，每遍5min；

6)重复步骤2)；

7)荧光显微镜下观察，有特异性荧光出现(图2)，拍取照片记录。

3重组杆状病毒的空斑纯化

将收获的转染上清感染六孔板的Sf9细胞中，进行连续三轮的空斑实验纯化重组杆状病毒，获得第4代重组杆状病毒(rBac-GD15-p4-X，X为HA/NA/M1)。

4重组杆状病毒的遗传稳定性鉴定

Sf9细胞接种至250mL容量的摇瓶中，10⁶cells/mL，培养体积为80mL。将重组杆状病毒均以MOI＝0.01的感染复数接种Sf9悬浮细胞，进行病毒传代扩增至第10代。每代病毒均进行外源蛋白表达的鉴定、病毒TCID₅₀的测定。其中第5代(p5)为挑取的单个空斑首次在悬浮细胞中扩增，因此p5代病毒的滴度普遍较低(表2)。而第6代至第10代重组杆状病毒的滴度虽有波动，但相对比较稳定，病毒滴度在10⁷-10⁸TCID₅₀/0.1mL的范围。

表2重组杆状病毒的滴度

ND:not determined.未检测.

实施例4：VLP的收获与鉴定

1 VLP的组装

通过重组杆状病毒共感染Sf9细胞的方式组装H7N9 VLP。将rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15、rBac-M1-GD15这三种杆状病毒以MOI＝1:1:1感染Sf9细胞，细胞密度为10⁶cells/mL，体积为100mL。感染72h后，收获细胞培养上清，3000rpm离心10min去除细胞碎片，4℃短暂保存。

2 VLP的超滤

根据H7N9 VLP的大小，选择了配有Ultracel-50滤膜的Amicon Ultra-15离心式过滤器进行VLP浓缩：将最多15mL的VLP上清液样品添加到

过滤器装置；将带盖超滤离心管放入离心机转子中，以最大5000×g的转速离心约15-60min；直至过滤器内剩余2mL浓缩液，离心管底部可见透明液体。打开超滤管盖，轻轻取出过滤器，用200μL移液枪缓慢顺着边缘插入，枪头轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，回收过滤器内的浓缩样品。

3 VLP的纯化

用蔗糖密度梯度离心法进行VLP纯化。

配制不同浓度蔗糖溶液：配制30％、40％、50％、60％(m/V)蔗糖溶液，0.22μm滤膜过滤；加入蔗糖溶液：用微量移液器沿管壁缓慢依次加入60％、50％、40％和30％蔗糖溶液各5mL，加入过程中四种液体应有明显分层，记录分层线，最后将超滤浓缩好的VLP样品沿管壁缓慢加至离心管内。配平，不足可用无菌的STE溶液(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)补充；超速离心：110000×g，4℃离心2h。离心结束后可在不同密度蔗糖层观察到明亮条带，根据之间的分层线，将30％-40％，40％-50％，50％-60％蔗糖层间的条带吸出；去蔗糖：将蔗糖混合液重新加至无菌离心管内，STE溶液补充体积配平。110000×g,4℃离心1.5h后去除蔗糖。离心后弃去上清，用少量STE溶液将离心后的沉淀重悬，置于4℃保存；将最终收获的样品进行生物学的鉴定，并用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

4红细胞凝集试验

为了比较超滤纯化后的HA滴度，收集感染上清及浓缩液，按标准方法进行血凝(HA)试验，测定样品的HA效价。结果显示，病毒感染细胞培养上清的HA滴度为6log₂，经超滤处理的VLP样品HA效价上升4倍，再经超离纯化后HA效价较培养上清增加32倍(表3)，说明重组杆状病毒共感染组装的VLP具有HA活性，且超滤浓缩和超离纯化均能显著提高VLP的抗原产量。

表3 H7N9 VLP的血凝滴度检测

5电镜观察

将收集的样品滴加到碳涂层铜网上吸附，在室温下温育5min。用吸水纸轻轻吸去铜网上的多余液体，干燥后用1％的磷钨酸负染样品，并在室温下孵育2min。再用吸水纸缓慢吸弃铜网上多余的磷钨酸，室温晾干，在透射电子显微镜下可以观察到直径为100nm左右的、有囊膜、内部无遗传物质的圆形颗粒(图4)，囊膜上可见纤突，其形态特征与天然禽流感病毒高度相似，说明重组杆状病毒共感染可以成功组装H7N9 VLP。

实施例5：疫苗的制备

抗原的蛋白浓度均用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)进行测定。将收获的VLP和灭活后的重组杆状病毒rBac-HA-GD15(刘秀梵,胡娇,梁艳艳,胡增垒,李如梦,王晓泉,顾敏.表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法与应用,CN108888761 A[P].2018)均按照抗原与Montanide^TMISA 71 VG佐剂以1:2的比例混合。在匀浆机上以6000r/min间断剧烈震荡30min，充分乳化。乳化至混合液呈乳白色均匀的乳剂，并进行剂型检验，用滴管吸取少量样品滴入自来水中，呈不分散的油包水外观。

实施例6：疫苗免疫实验

1疫苗免疫

疫苗接种前，抽检部分SPF鸡进行H7N9 HI抗体的检测。

将75只4周龄SPF鸡随机分成5组，采用10(PBS组5只)+6的模式分组。免疫攻毒保护实验中，其中10只鸡(PBS组5只)用于观察鸡的临床症状和采集喉头和泄殖腔的棉拭子检测排毒情况。另外6只鸡采集剖检后的心脏、肺和盲肠，观察组织病理变化及测定各脏器中的病毒载量的复制情况。分组与免疫剂量情况见表4。其中纯化VLP-1组是指经超滤管浓缩后再经超离蔗糖纯化的VLP疫苗。浓缩VLP-1组(或VLP-1)指只经过超滤和超离浓缩制备的VLP疫苗，包含7.5μg与15μg两个免疫剂量。采用肌肉注射的方式进行疫苗接种，rBac-HA-GD15组免疫剂量为0.1mL，每只SPF鸡接种0.6mL(抗原含量为256HAU)；PBS组每只SPF鸡接种0.1mL无菌PBS。

表4动物免疫实验分组

2抗体水平测定

免疫组及对照组鸡在免疫后第1、2、3周进行翅静脉采血，分离血清，按标准方法测定血凝抑制(HI)抗体水平，同时利用细胞中和实验和ELISA方法检测血清的中和抗体以和IgY抗体。此外，为评价疫苗免疫血清的交叉反应性，将第3周血清与2013-2018年分离的H7N9禽流感毒株进行交叉HI试验。所用毒株包括：低致病性H7N9亚型禽流感病毒(TM24、JX148、RG126)与高致病性H7N9亚型禽流感病毒(GD15、GX110、SX7)。

免疫组及对照组的鸡分别在免疫后第1、2、3周进行翅静脉采血，分离血清测定HI、病毒中和(SN)与IgY抗体滴度。我们发现，所有疫苗在免疫后第1周均不能诱导可检测到的HI抗体应答；在第2周，各疫苗免疫组的平均HI抗体滴度约为5log₂；第3周，HI抗体进一步上升至6log₂。但是，超离纯化与超滤浓缩的VLP-1(15μg)疫苗在免疫后第2周诱导的血清转化率均为100％，高于浓缩VLP-1(7.5μg)疫苗与rBac-HA-GD15灭活疫苗(图5A)。病毒中和试验的结果显示，各疫苗免疫鸡的血清针对H7N9 GD15株均具有中和活性，中和抗体滴度在160左右(图5C)。即血清稀释160倍可中和病毒，保护100TCID₅₀病毒感染的50％的CEF细胞免于死亡。尽管HI和SN滴度提供了诱导免疫应答的证据，但由疫苗诱导的抗体的定性方面(即IgY亲和力)可能也会影响保护效果。因此，利用ELISA方法测定血清中与HA蛋白具有结合性的IgY抗体滴度，发现四个疫苗诱导的IgY抗体水平相似，滴度在2560-5120之间(图5D)。交叉-HI试验显示，所有疫苗免疫鸡的血清与所测的H7N9病毒的交叉反应性均较好(图5B)。以上结果充分说明，H7N9 VLP疫苗免疫鸡能诱导较好的抗体应答，免疫原性较强。

实施例7：攻毒保护实验

在免疫3周后，用H7N9亚型高致病性禽流感毒株GD15进行攻毒保护试验，攻毒剂量为10^6.0EID₅₀，以滴鼻、点眼的方式进行病毒接种。分别于攻毒后的第3、5、7、9天采集每组鸡的喉头及泄殖腔棉拭子检测排毒情况。于攻毒后的第3、5天，每组各剖杀3只鸡，分别取心脏、脾脏、肺脏、盲肠进行组织的病毒载量测定。其中一部分肺脏用10％中性甲醛固定，制备病理切片观察组织病理变化。临床观察鸡的症状与死亡情况，共2周。

表5试验鸡攻毒后的排毒情况

注：dpi:days post infection.

攻毒后的第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒测定。结果显示(表5)，各疫苗免疫组仅在攻毒后第3天有少量鸡排毒；第5天，rBac-HA-GD15灭活疫苗与浓缩VLP-1(7.5μg)免疫鸡中仅有一只检测到泄殖腔的排毒；所有疫苗免疫鸡在第7天均检测不到排毒；第9天，浓缩VLP-1(15μg)免疫组有一只鸡从泄殖腔排毒。经统计学方法分析，各疫苗免疫组在抑制排毒方面无显著差异。排毒定量结果显示，仅浓缩VLP-1(7.5μg)免疫鸡在第3天可检测到少量病毒，其他时间点病毒含量均在检测限以下(图7)。病毒载量测定结果显示(图8)，攻毒后第3天，除纯化VLP-1免疫组外，其余免疫鸡在盲肠均可分离到少量的病毒，但各组之间无显著差异；其他脏器均未分离到病毒。此外，所有疫苗免疫鸡的肺脏仅观察到轻微的病理变化(图9)，且浓缩VLP-1(7.5μg)免疫鸡在第3天出现较多的肺脏出血和淤血。这些结果说明，H7N9 VLP能显著抑制H7N9攻毒后的排毒与病毒在体内的复制，且能够抑制病毒导致的肺脏组织病理变化。在14天观察期内PBS对照组鸡出现精神沉郁、食欲减退、鸡冠发紫、拉黄绿色稀便等禽流感典型症状，且在攻毒后5天内全部死亡；而各疫苗免疫组未出现任何临床症状，且未发生死亡(图6)。以上结果说明，H7N9 VLP疫苗能提供针对H7N9攻击的完全保护。

图6至图9结果充分说明，H7N9 VLP能显著抑制H7N9攻毒后的排毒与病毒在体内的复制，且能够抑制病毒导致的肺脏组织病理变化。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但并非是对本发明的实施方式的限定。本领域普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明创造构思的前提下，以本发明为基础做出的任何修改、等同替换和改进等，都属于本发明的要求保护范围之列。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒及其制备方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 1

atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60

atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120

ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180

tcaaaaggga aaaggacagt tgatctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240

ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcggccgatt taattattga gaggcgagaa 300

ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctctgag gcaaattctc 360

agagaatcag gcggaattga caaggaaccc atgggattca catacaatgg aataagaact 420

aatggggtga ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480

ctcctgtcaa acacagataa tgctacattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540

agagaaagcc cagctataat agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600

accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660

tctttcgtac cgagtccagg agcaagacca caagttaatg gtcaatctgg aagaattgac 720

tttcattggc taatactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780

atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840

caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatggtg gagggacaat aataagtaac 900

ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960

aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc 1020

ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080

tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140

caatcggcaa ttaatcaaat aacagggaaa ttaaaccggc ttatagcaaa aaccaaccaa 1200

caattcaagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260

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taa 1683

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<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 2

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cgaacaggga ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900

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<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

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caaaacgccc taaatgggaa tggagaccca aacaacatgg acaaggcagt taaattatac 300

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gaaggggctc ttggattggt atgtgccact tgtgagcaga tcgctgacgc acaacatcgg 480

tcccacaggc agatggcaac tactaccaac ccactaatta ggcatgagaa tagaatggta 540

ctagccagta ctacggctaa ggctatggag cagatggctg gatcaagtga acaggcagcg 600

gaagccatgg aagtcgcaag ccaggctagg caaatggtgc aggctatgag aacagtcggg 660

actcacccta actccagtac aggtctaaag gatgatctta ttgaaaattt gcaggcctac 720

cagaaccgga tgggagtgca actgcagcgg ttcaagtga 759

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

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<212> DNA

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caacaacgca cagaatctag 20

Claims

1.一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016的HA基因SEQ ID NO：1设计引物，HA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，HA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.5所示；利用HA基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR 扩增；

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016的NA基因SEQ ID NO：2设计引物，NA基因的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，NA基因的下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；利用NA基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR 扩增；

根据A/Chicken/Guangdong/GD15/2016的M1基因SEQ ID NO：3设计引物，M1基因的上游引物序列如SEQ ID NO.8所示，M1基因的下游引物序列如SEQ ID NO.9所示；利用M1基因的上游和下游引物序列进行RT-PCR 扩增；

用M1基因重组杆状病毒穿梭质粒与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，拯救获得M1基因重组杆状病毒；将成功拯救的M1基因重组杆状病毒经三轮空斑纯化后转移至悬浮的昆虫细胞中扩大培养，制得M1基因重组杆状病毒；

其中，杆状病毒DNA为优化过的DNA，采用flashBAC^TM DNA；所述的杆状病毒载体为pVL1393；

将HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒按照MOI为1：1：1共感染昆虫细胞，培养后收集细胞上清，收获同时含有HA蛋白、NA蛋白和M1蛋白的重组的H7N9 亚型禽流感病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

步骤一、将HA基因重组杆状病毒、NA基因重组杆状病毒、M1基因重组杆状病毒按照MOI为1：1：1共感染昆虫细胞，感染72h后收获细胞上清；

步骤三、将浓缩液经30%-60%不同梯度浓度蔗糖溶液进行纯化，收获40%-50%浓度蔗糖间透明条带，110000×g离心脱糖收获离心后的沉淀液，即得。

3.根据权利要求1所述重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

4.一种重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒，其特征在于，由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到。

5.一种疫苗，其特征在于，包括药学上可以接受的载体和免疫量的权利要求4所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：水包油包水型佐剂；

其中所述的水包油包水型佐剂为Montanide™ISA系列佐剂，为Montanide™ISA 71 VG佐剂；疫苗成分比例为禽流感病毒样颗粒：佐剂=1：2。

7.权利要求4所述的重组的H7N9亚型禽流感病毒样颗粒或权利要求5或6所述的疫苗在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。