CN113248577A

CN113248577A - 一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法

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Publication number: CN113248577A
Application number: CN202110144105.4A
Authority: CN
Inventors: 高强; 郑泽宇; 吴慕胜; 王治伟; 吕哲
Original assignee: Sinovac Research & Development Co ltd
Current assignee: Sinovac Research & Development Co ltd
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN113248577B

Abstract

本发明涉及以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列、目的基因序列、包含所述目的基因序列的腺病毒载体、外源转入所述腺病毒载体的细胞以及以包含所述目的氨基酸序列的冠状病毒疫苗。本发明提供了5种冠状病毒疫苗的目标氨基酸以及相应的基因序列，进一步使用腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体冠状病毒疫苗。本发明提供的冠状病毒疫苗可以快速制备，适用于新型冠状病毒2019‑nCoV的预防，具有良好的免疫原性，可以诱导高水平的抗体表达。

Description

一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及流行病预防及疫苗生产领域，具体涉及一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒2019-nCoV(WHO命名)是一种以前尚未在人类中发现的新型冠状病毒。国际病毒分类委员会于2020年2月将新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名确定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2，英文缩写SARS-CoV-2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2)。WHO于2020年2月将由新型冠状病毒2019-nCoV引发的疾病命名为2019冠状病毒病，英文缩写COVID-19(Corona Virus Disease 2019)。

冠状病毒属于套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链RNA的病毒，是自然界中广泛存在的一大类病毒，引起的疾病患者表现为从普通感冒到严重肺部感染等不同的临床症状，例如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸道综合症(SARS)。2019-nCoV与SARS-CoV同属于冠状病毒β 家族。现亟需开发能够有效预防引起新型冠状病毒2019-nCoV感染的疫苗，用于有效防止新型冠状病毒2019-nCoV感染引起的肺炎，甚至是严重呼吸道感染在全世界范围内的蔓延。

目前应用于人体的预防病毒感染的疫苗主要包括采用病毒经减毒后制备的减毒活疫苗，如水痘减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等；以及灭活全病毒颗粒疫苗，如肠道病毒EV71型灭活疫苗、甲型肝炎疫苗等。然而，减毒疫苗要费很长时间使病毒繁殖许多代，然后逐渐减除病毒的大部分活性，难以满足急性传染病的预防需要。灭活疫苗则在免疫病理方面存在许多难以解决的问题，例如有些灭活病毒进入人体会在病毒入侵时加重病情。

随着分子生物学技术和遗传操作技术的广泛应用，重组病毒载体疫苗得到了很大的发展。重组病毒载体疫苗的种类有很多，如痘病毒活载体疫苗、腺病毒载体疫苗、反转录病毒载体疫苗、不分节段的单股RNA病毒载体疫苗等。这些病毒载体因病毒基因组的复制特定和病毒生物学特性的不同，而适合于不同动物和人类疾病的预防与治疗。病毒载体疫苗能够克服传统疫苗的一些弊端，有助于区分野毒感染和疫苗接种，从而达到预防、治疗甚至净化传染病的目的。

发明内容

冠状病毒2019-nCoV编码的蛋白包括RNA聚合酶蛋白、纤突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中，纤突蛋白(Spike蛋白，下文简称S蛋白)为糖蛋白。该蛋白既是诱导保护性免疫应答的决定因素，又是与宿主细胞血管紧张素转换酶2 (angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受体结合的部位。且在小鼠和非洲绿猴中，S蛋白已被证实可诱导血清中和抗体产生，后者具有中和SARS-CoV的作用。另外，S蛋白可诱导CD4+和CD8+T细胞应答。因此，本发明选择S蛋白作为靶标进行冠状病毒疫苗的研发。

本发明的第一目的是提供以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列，包括含有SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。所述氨基酸序列参见本发明的序列表。

本发明的第二目的是提供所述冠状病毒疫苗的目的基因序列，其包括编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列或与其相似度为90％以上的氨基酸序列的DNA序列。

作为本发明的一种优选方案，所述目的基因序列是经过密码子优化后的DNA序列。

本发明的第三目的是提供包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的腺病毒载体。其是将所述目的基因序列插入到腺病毒载体中构建而成。

作为本发明的一种优选方案，所述腺病毒载体包括：包含所述目的基因序列的腺病毒穿梭质粒以及腺病毒骨架质粒。所述包含所述目的基因序列的腺病毒穿梭质粒是将所述目的基因序列插入到所述穿梭质粒中构建而成。

作为本发明的一种优选方案，所述腺病毒载体为AdMax腺病毒系统，其包括：插入所述目的基因序列的AdMax腺病毒系统穿梭质粒(优选含有loxP位点)，还包括AdMax腺病毒系统骨架质粒。

本发明的第四目的是提供表达所述冠状病毒疫苗目的氨基酸序列的细胞，所述细胞中外源转入了包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的腺病毒载体。

作为本发明的一种优选方案，所述细胞中外源转入了包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的腺病毒穿梭质粒以及腺病毒骨架质粒。

作为本发明的一种优选方案，所述细胞中外源转入了包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的AdMax腺病毒系统穿梭质粒以及 AdMax腺病毒系统骨架质粒。

作为本发明的一种优选方案，所述细胞为整合腺病毒E1基因的细胞，优选为HEK-293细胞或HEK-293A细胞。HEK-293细胞是用 5型腺病毒75株系转化、含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。HEK-293细胞是贴壁依赖性呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，其允许Ad5和其它血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞大规模培养采用的贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养方式均可用于HEK-293细胞的大规模培养。

本发明提供的载体优选采用AdMax腺病毒系统，并优选将其转入 HEK-293细胞中。AdMax系统包括含有loxP位点的穿梭质粒以及骨架质粒，外源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在 HEK-293细胞中进行基因重组来产生重组腺病毒。其进行重组腺病毒包装的基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使转染进HEK-293 细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，产生重组腺病毒，这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供E1 区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。AdMax 系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方便快捷的腺病毒包装系统之一。与现在使用最普及的 AdEasy系统相比，AdMax系统出毒更快，能够高效率、简便而快速地获得重组腺病毒，并且病毒的产率明显提高。利用AdMax系统，只需要2～4周就能完成从质粒构建到重组出毒的全过程，成功率大于 98％(其中95％的克隆含有目的基因)，因为重组出毒是在真核细胞内完成的，保持了对腺病毒的生存压力，因此有助于保持重组腺病毒基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34％，而且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

本发明的第五目的是提供以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗，其包含SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

本发明提供的疫苗中还可以含有免疫佐剂。所述免疫佐剂可以选用无机佐剂，优选为氢氧化铝佐剂。所述免疫佐剂还可以选用有机佐剂，如脂多糖、细胞因子等。

本发明提供的疫苗优选为液体疫苗，可以采用多种剂型形式。具体而言，所述冠状病毒疫苗可以是肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。在实际应用时，可以根据转染效率、局部免疫监视等临床需要进行调整和选择，如选择单一的剂型进行注射免疫，或者选择多种混合剂型进行注射免疫。

本发明的第六目的是提供所述冠状病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：将含有所述目的基因序列的腺病毒载体转染入细胞，进行细胞培养，收获含有病毒的培养液。

作为本发明的一种优选方案，所述方法具体包括：将转染后的细胞培养至出毒，将病毒从细胞中充分释放后，收集上清液，得第一代毒种；用所述第一代毒种感染细胞，收获含有病毒的培养液。采用上述先包装第一代毒种、再将其感染细胞的方式进行培养，可以实现规模化生产，满足疫苗生产需要。

作为本发明的一种优选方案，所述细胞为整合腺病毒E1基因的细胞，优选为HEK-293细胞或HEK-293A细胞。

本发明采用上述方法收获的培养液可以作为疫苗粗品。为了获得可以进行免疫的疫苗产品，所述方法进一步还包括：对所述含有病毒的培养液进行纯化。

作为本发明的一种优选方案，所述纯化包括如下步骤：(1)加入核酸内切酶消化核酸物质；(2)密度梯度离心；(3)凝胶排阻层析。经过上述步骤依次处理后，可以除去绝大部分杂质，获得疫苗纯品。

具体而言，上述步骤(1)加入核酸内切酶，可以消化核酸物质，为接下来的更精细纯化做铺垫。在加入核酸内切酶之前，可以先对培养液进行浓缩。

步骤(2)将以上所得的酶切处理液采用密度梯度离心法分离纯化腺病毒颗粒，以去除大部分杂蛋白质及部分核酸分子，收集富集后的病毒粒子样品。本发明优选密度梯度离心以恒定流速装载 20％-55％蔗糖溶液，然后以4000rpm离心建立密度增加的蔗糖梯度，随后加速至30000rpm。按照糖密度梯度进行分离，分段鉴定以获得目的产物。

步骤(3)将经步骤(2)处理的产物采用凝胶排阻层析进行分离纯化，以除杂DNA分子和部分杂蛋白，收集流穿样品。本发明优选凝胶排阻层析采用的固定相为Sepharose4FF，流动相为20mM Tris+150mM NaCl+2mM MgCl₂，pH7.5。

作为本发明的一种优选方案，上述纯化后的产物经鉴定后再进行滤膜过滤除菌。所述滤膜优选采用孔径0.22μm的一次性滤膜。

本发明的第七目的是提供所述氨基酸序列、所述基因序列、所述腺病毒载体、所述细胞、所述冠状病毒疫苗或所述方法制备而成的冠状病毒疫苗在制备用于预防新型冠状病毒2019-nCoV感染引起的疾病的药物中的应用。所述疾病即为世界卫生组织命名的2019冠状病毒病，英文缩写COVID-19。

优选地，所述疾病为新型冠状病毒2019-nCoV感染引起的肺炎，严重急性呼吸道感染，肠道疾病，心脏衰竭，肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。

本发明提供了5种冠状病毒疫苗的目标氨基酸以及相应的基因序列，进一步使用腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体冠状病毒疫苗。本发明采用的氨基酸序列为冠状病毒β家族较为保守的序列，且这些序列均能与ACE2结合，是引起免疫反应的重要抗原决定簇，既可以预防2003 Sars-CoV感染引起的疾病，也能够预防2019-nCoV感染引起的疾病，能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。本发明提供的重组腺病毒载体新型冠状病毒疫苗可以快速制备，适用于新型冠状病毒 2019-nCoV的预防，具有良好的免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗体表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例确认了冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列，具体如下表1 所示。

表1：目的氨基酸序列

实施例2

本实施例构建了包含目的基因序列的腺病毒载体。具体步骤如下：

分别合成目的氨基酸序列SEQ1～5对应的基因序列，分别用Bgl II和Sal I进行双酶切，回收目的基因片断，将其连接至AdMax腺病毒系统的穿梭质粒(pDC316)上，转化DH5-α感受态，涂布于含有amp抗性的LB平板，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR 鉴定为阳性的克隆进行测序验证。将验证后正确的含有目的基因序列的载体质粒分别记为pCOV-1、pCOV-2、pCOV-3、pCOV-4、 pCOV-5。

实施例3

本实施例将实施例2构建的腺病毒载体转染入HEK293细胞，继而表达冠状病毒疫苗的抗原(目标氨基酸序列)并鉴定。具体步骤为：

(1)将培养的HEK293细胞计数，以8×10⁵细胞/孔接种6孔板，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜；转染前1小时，小心将细胞版中培养基吸出，置换为换成新鲜的含2％FBS的MEM培养基，每孔2mL。

(2)将实施例2构建的含有目的基因序列的穿梭质粒和 pDC316载体，使用转染至HEK293细胞；每个转染孔取对应质粒 1μg，加入到200μL无FBS的MEM培养基中，混匀，加入脂质体转染试剂TurboFect Transfection Reagent(Thermo Scientific,#R0531) 3μL，混匀后在室温放置30min；将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

(3)细胞培养12小时后将培养基换成新鲜的含10％FBS的 MEM培养基。将细胞置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。转染 48小时后，小心地吸弃培养基，用PBS洗涤细胞一次。

(4)将6孔板置于冰上，每孔各加入150μL细胞裂解液(含 50mmol/L DTT、1×蛋白酶抑制剂和250U/mL核酸酶的1×SDS-PAGE buffer)。将裂解的细胞收集起来，转移至1.5mL离心管中，冰浴 15min，95℃加热5min，冰浴冷却，4℃12000rpm离心5min，取上清分装，进行Western blot检测，其余样品冻存。

(5)检测试验使用购买的sigma公司的4-12％SDS-PAGE胶，每孔加入处理后的细胞样品10μL。上样完成后，在100V条件下电泳2h，使蛋白质在胶上分离。将硝酸纤维素膜活化后盖在SDS-PAGE 胶上，通电300mA，保持1小时，使SDS-PAGE胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上。电转完成后，将硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后以1:2000的稀释度加入多克隆抗体，4℃ 放置过夜。将膜用Western blot洗涤液洗涤4次，每次于摇床上摇动 20min。然后加入以1:5000稀释于5％脱脂奶粉的HRP标记的IgG 抗体，室温孵育1小时。用Western blot洗涤液将膜洗涤4次，使用显色试剂进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。

Western blot结果显示，细胞中表达的氨基酸序列完全正确，与目的氨基酸序列一致。

实施例4

本实施例将实施例2中提供的腺病毒载体转染入HEK293细胞，继而进行冠状病毒疫苗一代毒种的包装和鉴定。

1.第一代毒种的包装

将实施例2中构建好的AdMax腺病毒系统的穿梭质粒分别与 AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染至整合有 E1表达框的293细胞(以下简称HEK-293细胞)进行重组腺病毒的包装。过程如下：

(1)将培养的HEK293细胞计数，以5×105细胞/孔接种6孔板，培养基为MEM+10％FBS，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。

(2)转染当天与转染前1小时，将旧培养基吸出，置换为换成新鲜的含10％FBS的MEM培养基，每孔2mL。

(3)待细胞生长至底面积的80-90％时，取骨架质粒 (pBHGloxΔE1,3Cre)和穿梭质粒，每个转染孔取对应骨架质粒4μg，穿梭质粒1μg，加入到300μL无FBS的MEM培养基中，混匀，室温放置5min，加入转染试剂3μL，混匀后在室温放置30min。

(4)将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。将细胞置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。

(5)细胞培养12小时后将长满的细胞传代于25cm²细胞培养瓶中，用含5％FBS的MEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落时进行收毒。

(6)将出毒的细胞培养瓶先后置于-70℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液3000rpm 离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为所包装的冠状病毒重组腺病毒第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。

2.第一代毒种的鉴定

2.1PCR扩增及测序鉴定

使用载体的通用引物，扩增全序列，引物序列如下：

F：5'acg tgg gta taa gag gcg 3'

R：5'cga tgc tag acg atc cag 3'

根据病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取重组腺病毒一代毒种基因组，使用以上引物，进行PCR鉴定。PCR扩增条件为：98℃ 变性30s；57℃退火45s；72℃延长1-5min；循环30次。

结果显示，扩增条带大小正确。将目标条带进行胶回收并测序，比对结果表明，测序结果序列完全正确。

2.2表达鉴定

将冠状病毒重组腺病毒一代毒种感染HEK293细胞，48小时后收集细胞进行Western blot检测。具体检测方法参见实施例3的相关内容。

实施例5

本实施例将实施例4提供的一代毒种感染HEK293细胞，以实现重组腺病毒的规模化培养，从而获得冠状病毒疫苗粗品。具体步骤为：

(1)将HEK293细胞在37℃、5％CO₂条件下130rpm悬浮培养。毒种接种时，将活度大于95％的细胞稀释至1.0×10⁶cells/mL，终体积为1L。将实施例4提供的重组腺病毒第一代毒种感染HEK293 细胞，37℃，5％CO2，130rpm摇动培养。每隔24小时取样，检测细胞活度和密度。

(2)毒种接种72小时后，当细胞活度下降到40％以下时，每个细胞摇瓶各加入10mL tween-20(终浓度1％)，130rpm，继续摇动 1小时。细胞培养液于6000rpm离心30min，取上清，得重组腺病毒培养液。

上述方法收获的重组腺病毒培养液即为冠状病毒疫苗粗品，将其置于-70℃冻存。

实施例6

本实施例对实施例5提供的重组腺病毒培养液(即冠状病毒疫苗粗品)进行纯化。具体步骤为：

(1)将实施例5提供的-70℃冻存的重组腺病毒培养液融化后合并，先用300kDa膜包进行超滤浓缩及缓冲液置换，超滤缓冲液为 20mM Tris+150mM NaCl+2mM MgCl2pH7.5，超滤换液3次后，浓缩至最小体积，排空膜包及管路后，用少量超滤缓冲液冲洗管路，所得液体合并至超滤浓缩液，混匀。加入核酸内切酶 Benzonase(30U/mL)，37℃水浴，酶解4h消化核酸物质。

(2)密度梯度离心，具体步骤为：

将病毒原液以恒定流速装载到转子中，然后以恒定流速装载 20％-55％蔗糖溶液。以4000rpm离心建立密度增加的蔗糖梯度，随后加速至30000rpm(约90000g力)运行16小时。达到最终速度后，温度从 +4℃变为+22℃。病毒颗粒会移动到与其密度相匹配蔗糖梯度中。离心步骤完成前一小时，手动将温度从+22℃变为+4℃。按照糖梯度分段收集后电镜检查收集目的组分。

(3)凝胶排阻柱层析，具体步骤为：

将经密度梯度离心法分离纯化所得的洗脱峰使用Sepharose 4FF 进一步纯化。流动相为20mM Tris+150mM NaCl+2mM MgCl2pH7.5，收集外水体积峰。收集组分经电镜检查后确定收集组分为腺病毒颗粒。

(4)步骤(3)纯化后的产物经鉴定后用0.22μm一次性滤器过滤除菌。

经上述纯化后，得到冠状病毒疫苗纯品，分装保存于-70℃冰箱。

实施例7

本实施例对实施例6纯化得到的冠状病毒疫苗纯品进行鉴定和滴度测定。

1.PCR扩增全序列和测序鉴定

具体检测方法参见实施例4相关内容。结果显示疫苗纯化样品均检测到目标条带。将目标条带胶回收并测序，比对结果表明，疫苗纯品所包含的基因序列完全正确，与目的基因序列一致。

2.Western blot检测

将冠状病毒疫苗候选株纯化样品以感染HEK293细胞，48小时后收集细胞进行Western blot检测。具体检测方法参见实施例3相关内容。检测结果显示，疫苗纯品所包含的氨基酸序列完全正确，与目的氨基酸序列一致。

3.滴度测定

使用Clontech Adeno-XTM Rapid Titer Kit进行重组腺病毒滴度的测定。操作按试剂盒所附说明书进行，具体方法如下：

a)将HEK293细胞接种于24孔板。细胞密度为5×10⁵cells/mL，每孔接种0.5mL，培养基为MEM+10％FBS。

b)使用培养基把将要检测的病毒从10^-2至10^-6进行10倍稀释，制备一系列稀释度的病毒样品，每孔50μL加入到细胞中。

c)细胞于37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时。

d)吸弃细胞的培养基，让细胞稍微晾干。每孔轻轻加入0.5mL 冰甲醇，于-20℃放置10min，对细胞进行固定。

e)吸弃甲醇，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入 0.25mL抗-Hexon抗体稀释液(1:1000稀释)，37℃孵育1小时。

f)吸弃抗-Hexon抗体，用PBS+1％BSA将细胞轻轻洗3次，每孔加入0.25mL HRP标记的Rat anti-mouse antibody(1:500稀释)， 37℃孵育1小时。

g)在吸弃0.25mL HRP标记的Rat anti-mouse antibody之前，将 10×DAB底物用1×Stable Peroxidase Buffer稀释成1×DAB工作液，让其达到室温。

h)吸弃Rat anti-mouse antibody稀释液，用PBS+1％BSA将细胞轻轻地洗3次。每孔加入0.25mL DAB工作液，室温放置10min。

i)吸弃DAB工作液，用PBS将细胞轻轻地洗2次。

j)于显微镜下对棕色/黑色的阳性细胞进行计数。每孔至少随机计数3个视野，计算其平均阳性细胞数。

k)计算感染滴度(ifu/mL)。公式如下：感染滴度(ifu/mL)＝视野的阳性细胞数*每孔的视野数/病毒体积(mL)/稀释度。

滴度测定结果显示，实施例6获得的冠状病毒疫苗纯品，感染滴度达1.0×10¹⁰ifu/mL以上。

实施例8

本实施例将实施例6提供的冠状病毒疫苗免疫小鼠，并进行免疫学评价。

1.小鼠免疫

根据实验设计，将冠状病毒候选疫苗和对照疫苗用生理盐水稀释到特定的浓度，使用1mL注射器，经左后腿内侧肌肉注射免疫，每只50μL。每只小鼠的免疫剂量为1×10⁸ifu。

2.小鼠采血及血清处理

小鼠免疫后，在特定的时间点上经尾静脉采血。血液于室温静置1小时以上。待血清形成，5000rpm离心10min，将血清转移至新的离心管，-20℃冻存，待用。

3.血清抗体水平ELISA检测

实验前一天，ELISA板用重组表达的冠状病毒蛋白以2μg/mL 的浓度进行包被，100μL/孔，4℃放置过夜。实验当天，ELISA板于洗板机内用洗液(PBS+0.2％tween-20)清洗3次。每孔加入120μL封闭液(洗液+2％BSA)，于室温封闭1小时。洗板机清洗3次后，每孔加入100μL样品稀释液(洗液+0.2％BSA)。血清样品以特定的初始稀释度进行3倍稀释(初始稀释度通过预实验来确定)，每个样品设8 个稀释度。同时每板设定4个不加血清的空白对照孔。血清稀释完成后，于室温孵育1小时。洗板5次后，每孔100μL加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1:20000稀释)，室温孵育1小时。洗板5次后进行显色反应。显色过程为每孔加入100μL TMB单组分显色液，显色6min后用2mol/L硫酸终止反应。最后在酶标仪上检测450nm处的吸光值。以空白孔OD450值的2.1倍作为cut-off值，用GraphPad Prism软件计算每个样品的抗体滴度。抗体滴度定义为空白孔OD450 值2.1倍对应的样品稀释度的倒数。

检测结果如表2所示。

表2：血清抗体IgG水平

样品	抗体滴度(1:X)	95％confidence
			COV-1	1317.8	682.6-2543.8
COV-2	995.6	307.0-3228.9
			COV-3	839.1	272.0-2588.4
COV-4	645.2	201.4-2076.0
			COV-5	414.3	111.2-1543.9
AD-control	2	/

由结果可知，本发明所述冠状病毒疫苗均可诱导提高血清抗体水平。

4.细胞免疫水平的检测

4.1脾淋巴细胞的分离

颈椎脱臼处死小鼠，于70％酒精浸泡约3min。将小鼠于生物安全柜内无菌取出脾脏，放到置于无菌平皿中的200目细胞筛上。加入10mL RPMI1640完全培养基，用注射器活塞将脾轻柔地研磨成单个细胞，再用10mL RPMI1640完全培养基冲洗细胞筛，以获得更多的脾细胞。将脾细胞悬液转移至50mL离心管中，500g水平离心 5min。弃上清，细胞用3m|1×红细胞裂解液重悬，室温裂解5min，加入27mL RPMI1640完全培养基，500g水平离心5min。弃上清，细胞再用20mL RPMI1640完全培养基清洗一次，用适量培养基重悬，经200目细胞筛过滤至10mL试管中，取50μL稀释20倍后进行计数，待用。

4.2小鼠脾细胞的体外刺激

将以上分离的小鼠脾细胞取适量稀释至4×106cells/mL，每孔 0.5mL加入到24孔板中。每只小鼠分别设置特异CTL表位刺激孔和无刺激孔。特异表位浓度为每条肽2μg/mL，无刺激加入等量的 DMSO。作为阳性对照，加入PMA和ionomycin刺激孔，其中PMA 浓度为100ng/mL，ionomycin浓度为1μg/mL。同时每孔加入1μL Brilliant Violet 421TM anti-mouse CD107a。细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养1小时后，每孔各加入适量的GolgiStop和 (或)GolgiPlug作为细胞因子分泌的阻断剂。总共培养6小时后进行相关抗原的染色，用于细胞内细胞因子的流式细胞术检测。

4.3细胞表面抗原和细胞内细胞因子染色

脾细胞经体外刺激6小时后，转移至流式管中，600g室温离心 5min，弃上清。配制染色液1，每管50μL，轻轻混匀，室温避光放置15min。每管加入3mL PBS+2％FBS，600g，室温离心5min，弃上清。配制染色液2，每管50μL，轻轻混匀，室温避光放置20min。每管加入3mLPBS+2％FBS，600g室温离心5min，弃上清。每管加入200μL Cytofix/CytopermTMFixationand Permeabilizaiton Solution，室温避光放置20min，对细胞进行固定和穿孔。每管加入1mL 1×Perm/WashTM buffer，800g室温离心5min，弃上清。配制染色液 3，每管50μL，轻轻混匀，室温避光放置30min。每管加入 2mL1×Perm/WashTM buffer，800g室温离心5min，弃上清。每管加入3mL PBS，800g室温离心5min，弃上清。每管用150μL PBS重悬，4℃避光待测。

4.4流式细胞术检测

使用BD FACS CantoTM进行流式细胞术检测。首先各通道调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节各染料间的荧光补偿，然后依次上样，收集数据。通过FSC-A和FSC-H圈单细胞，通过FSC 和SSC圈淋巴细胞，通过PerCP/Cy5.5通道和APC/Cy7通过圈活的 CD3细胞，通过FITC通道和Alexa 700通道圈CD8+T细胞和CD4+T 细胞，最后通过PE通道、PE/Cy7通道、Brilliant Violet 605通道、 Brilliant Violet 421和Brilliant Violet 510通道分别统计CD8+T细胞和CD4+T细胞中IFNγ、TNF、IL-2、CD107a和CD154阳性细胞的百分比。

细胞内细胞因子染色流式细胞术检测结果如表3～表7所示。

表3：细胞内细胞因子IFNγ染色流式细胞术检测结果

表4：细胞内细胞因子IL-2染色流式细胞术检测结果

表5：细胞内细胞因子TNF染色流式细胞术检测结果

表6：细胞内细胞因子CD107a染色流式细胞术检测结果

表7：细胞内细胞因子CD154染色流式细胞术检测结果

样品	CD4细胞CD154<sup>+</sup>(％)	95％confidence
			COV-1	0.18	0.01-0.36
COV-2	0.12	0.01-0.23
			COV-3	0.17	0.06-0.28
COV-4	0.19	0.03-0.34
			COV-5	0.26	0.10-0.41
AD-control	0.00	/

由表3～表6的结果可知，免疫小鼠的脾细胞经表位刺激后， CD8+T细胞和CD4+T细胞可大量分泌IFNγ、TNF、CD107a和IL-2 细胞因子，同时细胞毒性标示物的表达水平显著增高，明显高于对照腺病毒组。与此同时，由表7结果可以看到，免疫小鼠的脾细胞可检测到CD4+T细胞上CD154分子的表达水平显著升高，说明诱导的特异性T细胞可活化B细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京科兴中维生物技术有限公司

<120> 一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法

<130> 20200212

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 198

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

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<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

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20 25 30

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

35 40 45

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

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Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

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1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro

1205 1210

Claims

1.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列，其特征在于，包括SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

2.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的基因序列，其特征在于，包括编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列或与其相似度为90％以上的氨基酸序列的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的目的基因序列，其特征在于，所述目的基因序列是经过密码子优化后的DNA序列。

4.包含权利要求2或3所述目的基因序列的腺病毒载体。

5.根据权利要求4所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体包括：包含所述目的基因序列的腺病毒穿梭质粒以及腺病毒骨架质粒。

6.根据权利要求4所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体包括：包含所述目的基因序列的AdMax腺病毒系统穿梭质粒以及AdMax腺病毒系统骨架质粒。

7.表达权利要求1所述氨基酸序列的细胞，所述细胞中外源转入了权利要求4～6任意一项所述腺病毒载体。

8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为整合腺病毒E1基因的细胞，优选为HEK-293细胞或HEK-293A细胞。

9.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗，其包含SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗中还含有免疫佐剂。

11.根据权利要求10所述的冠状病毒疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为氢氧化铝佐剂。

12.根据权利要求9～11任意一项所述的冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体疫苗。

13.根据权利要求12所述的冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为肌肉内液体注射剂、静脉内液体注射剂、鼻腔内液体注射剂、皮内液体注射剂或皮下液体注射剂。

14.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求4～6任意一项所述腺病毒载体转染入细胞，进行细胞培养，收获含有病毒的培养液。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，将转染后的细胞培养至出毒，将病毒从细胞中充分释放后，收集上清液，得第一代毒种；用所述第一代毒种感染细胞，收获含有病毒的培养液。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述细胞为整合腺病毒E1基因的细胞，优选为HEK-293细胞或HEK-293A细胞。

17.根据权利要求14～16任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述含有病毒的培养液进行纯化。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括如下步骤：(1)加入核酸内切酶消化核酸物质；(2)密度梯度离心；(3)凝胶排阻层析。

19.权利要求1所述氨基酸序列、权利要求2或3所述基因序列、权利要求4～6任意一项所述腺病毒载体、权利要求7或8所述细胞、权利要求9～13任意一项所述冠状病毒疫苗或权利要求14～18任意一项所述方法制备而成的冠状病毒疫苗在制备用于预防新型冠状病毒2019-nCoV感染引起的疾病的药物中的应用。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述疾病为新型冠状病毒2019-nCoV感染引起的肺炎，严重急性呼吸道感染，肠道疾病，心脏衰竭，肾衰竭或严重急性呼吸道综合征。