CN110616198A

CN110616198A - 一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗

Info

Publication number: CN110616198A
Application number: CN201810628239.1A
Authority: CN
Inventors: 张林琦; 周东明; 贾雯旭; 张超; 史宣玲
Original assignee: Tsinghua University; Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Tsinghua University; Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2038-06-19
Also published as: CN110616198B

Abstract

本发明公开了一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS‑CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗。本发明保护一种重组腺病毒，是重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的；所述重组质粒是将特异DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域得到的；所述特异DNA分子中具有全长MERS‑CoV Spike蛋白的编码基因；所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒E1基因。本发明还保护表达全长MERS‑CoV Spike蛋白的重组腺病毒；所述重组腺病毒的出发毒株为黑猩猩腺病毒68型或非复制型黑猩猩腺病毒68型。本发明研发的针对新型冠状病毒MERS‑CoV的疫苗具有重要的理论指导价值和广泛的应用前景，为中东呼吸综合征的根治提供了可能性。

Description

一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗

技术领域

本发明涉及一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗。

背景技术

新型冠状病毒(MERS-CoV)于2012年首次在中东地区被发现感染人类，随后这种病毒感染疾病又先后出现在欧洲几个国家和地区。多数MERS-CoV感染病人均会出现严重的呼吸道疾病，其临床症状同2003年爆发的由SARS-CoV引起的疾病非常相似。由于这种疾病可以人传染给人，因此引起了全世界的高度关注。到目前为止，还没有特异性的药物和疫苗对这种疾病进行治疗和预防。

MERS-CoV利用其表面的膜蛋白S(又称S蛋白)进入易感细胞。S蛋白由如下三个结构域组成：位于N端的S1结构域、位于近膜端的S2结构域、跨膜结构域。MERS-CoV对宿主细胞的易感性是由S1结构域决定的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗。

本发明保护一种重组腺病毒，是重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的；所述重组质粒是将特异DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域得到的；所述特异DNA分子中具有全长MERS-CoV Spike蛋白的编码基因；所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒E1基因。

所述细胞培养可为单次细胞培养。

所述细胞培养可为多次连续细胞培养。

所述细胞培养为多次连续细胞培养时，第一次细胞培养为将重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行培养。所述细胞培养为多次连续细胞培养时，从第二次细胞培养开始，每次细胞培养的步骤均为：将上一代细胞培养完成后收集细胞并破碎后收集的上清液感染新的腺病毒包装细胞，然后进行培养。所述细胞培养为多次连续细胞培养时，最后一次细胞培养后，收集细胞并破碎，然后收集的上清液，进行病毒纯化，得到病毒液。

所述重组腺病毒的制备方法，依次包括如下步骤：

(1)将线性化的重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成；

(2)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液。

所述重组腺病毒的制备方法，依次包括如下步骤：

(2)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；

(3)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；

(4)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；

(5)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；

(6)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；

(7)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；

(8)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；

(9)取上清液，进行氯化铯密度梯度离心纯化，获得病毒液。

本发明还保护表达全长MERS-CoV Spike蛋白的重组腺病毒；所述重组腺病毒的出发毒株为黑猩猩腺病毒68型或非复制型黑猩猩腺病毒68型。所述非复制型黑猩猩腺病毒68型是将线性化的黑猩猩腺病毒载体AdC68转染腺病毒包装细胞并进行细胞培养得到的病毒。所述非复制型黑猩猩腺病毒68型是将线性化的黑猩猩腺病毒载体AdC68对应的腺病毒。

本发明还保护一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括重组质粒和腺病毒包装细胞；所述重组质粒是将特异DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域得到的；所述特异DNA分子中具有全长MERS-CoV Spike蛋白的编码基因；所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒E1基因。

本发明还保护一种重组质粒，是将特异DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域得到的；所述特异DNA分子中具有全长MERS-CoV Spike蛋白的编码基因。

以上任一所述重组质粒中，特异DNA分子具体插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的PI-SceI和I-CeuI酶切位点之间。

以上任一所述全长MERS Spike蛋白如序列表的序列1所示。

以上任一所述全长MERS Spike蛋白的编码基因如序列表的序列2所示。

以上任一所述特异DNA分子如序列表的序列3所示。

以上任一所述腺病毒包装细胞为HEK293A细胞。

本发明还保护以上任一所述重组腺病毒在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。

本发明还保护以上任一任一所述重组腺病毒在制备用于中和新型冠状病毒的药物中的应用。

本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组腺病毒；

所述产品为如下(a)或(b)：

(a)新型冠状病毒疫苗；

(b)用于中和新型冠状病毒的药物。

本发明中尽可能地保证原始的S结构，不仅保留膜锚定信号肽，还保留了S2后部的跨膜区和胞内区，尽可能地模拟刺突蛋白锚定在细胞表面的状态，从而作为一个强有力的免疫原。本发明在黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域插入全长MERS Spike蛋白的编码基因，通过腺病毒侵染细胞，将遗传物质导入靶细胞中转录表达全长MERS Spike蛋白。全长MERS Spike蛋白中具有膜锚定信号肽、跨膜区和胞内区，所以表达好的蛋白不会分泌到胞外，而是模拟病毒颗粒表面刺突，插在靶细胞的膜上，从而起到免疫原的作用，刺激机体产生免疫反应。

本发明避免了人5型腺病毒载体预存免疫的缺陷，同时保留了腺病毒的高滴度、易生产储存的优点，对中东呼吸综合征的根治提出了疫苗的有效策略，具有广泛的应用前景。本发明研发的针对新型冠状病毒MERS-CoV的疫苗具有重要的理论指导价值和广泛的应用前景，为中东呼吸综合征的根治提供了可能性。

附图说明

图1为实施例1中Western Blot的结果。

图2为实施例2的步骤四中ED50值以10为底的对数结果。

图3为实施例2的步骤五中的中和活性结果。

图4为实施例2的步骤五中ID50值以10为底的对数结果。

图5为实施例2的步骤六中的中和活性结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

黑猩猩腺病毒载体AdC68：Hexon-modified recombinant E1-deletedadenoviral vectors as bivalent vaccine carriers for Coxsackievirus A16 andEnterovirus 71.。黑猩猩腺病毒载体AdC68中，E1区域和E3区域均已删除，E1区域删除使得产生的重组病毒不能在普通细胞复制，具有很高的生物安全性，E3区域删除增加了其包容性。

HEK293A细胞为腺病毒包装细胞，具有E1基因。

实施例1、重组病毒的制备

一、重组质粒的构建

1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入pShuttle-CMV载体的XbaI和NheI酶切位点之间，得到重组质粒pShuttle-MERS-CoV Spike。

序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。序列表的序列1所示的蛋白质即全长MERS-CoV Spike蛋白。

2、用内切酶PI-SceI和I-CeuI双酶切重组质粒pShuttle-MERS-CoV Spike，回收约5019bp的DNA片段。

经测序，该DNA片段如序列表的序列3所示。序列表的序列3中，第238-617位核苷酸为CMV增强子，618-821位核苷酸为CMV启动子，937-4998位核苷酸为全长MERS-CoV Spike蛋白的编码区。

3、用内切酶PI-SceI和I-CeuI双酶切黑猩猩腺病毒载体AdC68，回收约36000bp的载体骨架。

4、将步骤2回收的DNA片段和步骤3回收的载体骨架连接，得到重组质粒pAdC68-MERS-CoV Spike。根据测序结果，对重组质粒pAdC68-MERS-CoV Spike进行结构描述如下：将黑猩猩腺病毒载体AdC68的PI-SceI和I-CeuI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3所示的DNA分子。重组质粒pAdC68-MERS-CoV Spike中，序列表的序列3所示的DNA分子的插入位置为黑猩猩腺病毒载体AdC68中的△E1区域。

二、制备重组病毒

细胞培养条件：37℃、5％CO₂的恒温培养箱。

1、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。

2、取重组质粒pAdC68-MERS-CoV Spike，用限制性内切酶PacI酶切，得到线性化质粒。

3、借助Lipofectamine2000将步骤2得到的线性化质粒转染完成步骤1的细胞并培养2小时(无血清DMEM培养基)，然后将细胞转移至含10％胎牛血清的DMEM培养基培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成(约10-14天)。

4、完成步骤3后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P0代上清)。

5、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。

6、将P0代上清感染完成步骤5的细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态(约24-48小时)。

7、完成步骤6后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P1代上清)。

8、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。

9、将P1代上清感染完成步骤8的细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态(约24-48小时)。

10、完成步骤9后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P2代上清)。

11、采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293A细胞至细胞密度达到80％。

12、将P2代上清感染完成步骤11的细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态(约24-48小时)。

13、完成步骤12后，收集细胞，用无血清DMEM培养基重悬，然后反复冻融3次，然后4℃、3000g离心10分钟，收集上清(P3代上清)。

14、取P3代上清，进行氯化铯密度梯度离心纯化，获得病毒液，即为AdC68-MERS-CoV Spike病毒液。

15、取AdC68-MERS-CoV Spike病毒液，提取基因组DNA。采用限制性内切酶Bgl Ⅱ酶切基因组DNA，采用重组质粒pAdC68-MERS-CoV Spike作为基因组DNA的阳性对照。阳性对照酶切后显示11条带，其中5255bp条带为特征带。基因组DNA酶切后显示12条带，其中3523bp条带和6727bp条带为特征带。结果表明，得到了正确的重组病毒。

三、制备对照病毒

用黑猩猩腺病毒载体AdC68代替重组质粒pAdC68-MERS-CoV Spike，其他同步骤二。在步骤14获得病毒液，即为AdC68病毒液。

四、病毒的鉴定

1、滴度鉴定

采用吸光光度值法检测AdC68-MERS-CoV Spike病毒液或AdC68病毒液的滴度。

病毒滴度＝OD260×稀释倍数×1.1×10¹²。

病毒滴度的单位为病毒颗粒数/毫升(vp/mL)

AdC68-MERS-CoV Spike病毒液的滴度为1.1×10¹³vp/mL。

AdC68病毒液的滴度为4×10¹²vp/mL。

2、抗原表达的鉴定

细胞培养条件：37℃、5％CO₂的恒温培养箱。

①将HEK293A细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种六孔板，培养至细胞密度为90％左右。

②用AdC68-MERS-CoV Spike病毒液感染完成步骤①的细胞，感染剂量分别为(10⁸vp/孔、10⁹vp/孔或10¹⁰vp/孔)，每个剂量设置3个重复处理。培养24小时，然后收集细胞。

③用AdC68病毒液感染完成步骤①的细胞，感染剂量为10⁹vp/孔，设置3个重复处理。培养24小时，然后收集细胞。

④取步骤②和步骤③收集的细胞，进行细胞裂解，然后收集上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行Western Blot(一抗采用抗MERS-CoV Spike的兔多克隆抗体)。β-actin蛋白作为内参。

抗MERS-CoV Spike的兔多克隆抗体的信息如下：MERS-CoV(NCoV/Novelcoronavirus)Spike Antibody,Rabbit PAb,Antigen Affinity Purified：义翘神州，40069-T44。

结果见图1。

实施例2、重组病毒的应用

一、动物免疫

6周龄的雌性BALB/C小鼠，分成12组，每组5只，分别处理如下：

第一组(G1组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为pH7.2的PBS缓冲液；

第二组(G2组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为pH7.2的PBS缓冲液；

第三组(G3组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为AdC68病毒液(病毒量为2×10⁸vp)；

第四组(G4组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为AdC68病毒液(病毒量为2×10¹⁰vp)；

第五组(G5组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为AdC68病毒液(病毒量为2×10⁸vp)；

第六组(G6组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为AdC68病毒液(病毒量为2×10¹⁰vp)；

第七组(G7组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为AdC68-MERS-CoV Spike病毒液(病毒量为2×10⁸vp)；

第八组(G8组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为AdC68-MERS-CoV Spike病毒液(病毒量为2×10⁹vp)；

第九组(G9组)：采用滴鼻方式进行单次免疫，免疫物为AdC68-MERS-CoV Spike病毒液(病毒量为2×10¹⁰vp)；

第十组(G10组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为AdC68-MERS-CoVSpike病毒液(病毒量为2×10⁸vp)；

第十一组(G11组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为AdC68-MERS-CoVSpike病毒液(病毒量为2×10⁹vp)；

第十二组(G12组)：采用肌肉注射方式进行单次免疫，免疫物为AdC68-MERS-CoVSpike病毒液(病毒量为2×10¹⁰vp)；

以上各组中，滴鼻方式免疫的免疫体积均为20μl，肌肉注射方式免疫的免疫体积均为50μl体积，用pH7.2的PBS缓冲液作为溶剂调整病毒浓度。

初次免疫后第2周开始采血，每两周采血一次(眼眶取血)。

二、MERS-CoV假病毒的制备

表达MERS-CoV全长膜蛋白的质粒(命名为MERS-CoV膜蛋白质粒)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的MERS-CoV假型病毒，其感染性同活病毒相似。骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase：参考文献:He J,Choe S,Walker R,Di Marzio P,Morgan DO,Landau NR.J Virol 69:6705–6711,1995.。

将序列表的序列4所示的双链DNA分子(MERS-CoV全长膜蛋白的编码基因)插入pcDNA3.1(+)载体的HindIII和XhoI酶切位点之间，得到MERS-CoV膜蛋白质粒。

将MERS-CoV膜蛋白质粒和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，37℃静置孵育，转染48小时后收集细胞培养上清，即为含有MERS-CoV假病毒的病毒液(简称MERS-CoV病毒液)。利用p24定量检测的ELISA试剂盒(HIV P24抗原定量检测试剂盒，KEY-BIO,96T)检测MERS-CoV病毒液的病毒滴度，MERS-CoV病毒液的OD_450nm(吸光值为1(1021TCID50/ml)，吸光值越大说明病毒含量越高。

三、MERS-S1蛋白的制备

1、将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入Pvrc8400质粒的NotI和NheI酶切位点，得到重组质粒。

2、借助PEI转染试剂，将步骤1得到的重组质粒转染长至90％密度的293T细胞，先用无血清DMEM培养基培养6-8小时，然后采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养72小时。

3、完成步骤2后，收集上清，采用镍柱进行蛋白纯化，收集蛋白溶液。

4、取步骤3得到的蛋白溶液，进行浓缩和体系置换，将蛋白体系更换为pH7.2的PBS缓冲液，得到MERS-S1蛋白溶液。

四、疫苗诱导的总抗体的检测

取步骤一得到血样，分离血清，采用ELISA进行总IgG的检测。总IgG检测中，用MERS-S1蛋白包被酶标板(100ng/孔)，血清先稀释至100倍体积、然后进行3倍梯度稀释(共8个稀释度，稀释用溶剂为含10％FBS的DMEM培养基)，二抗为Anti-mouse IgG HRP。

第40周，各组小鼠血清的ED50值见表1(N.D代表检测结果为阴性)。

表1

组别	ED50值	组别	ED50值
				G1组	N.D.	G7组	10668
G2组	N.D.	G8组	24636
				G3组	N.D.	G9组	29643
G4组	N.D.	G10组	125
				G5组	N.D.	G11组	6279
G6组	N.D.	G12组	19388

各组小鼠每2周的血清的ED50值以10为底的对数见图2(W代表周)。

五、疫苗免疫后的动物血清中抗体中和活性检测

待测溶液为：取步骤一得到血样，分离获得的血清。

(1)采用含10％FBS的DMEM培养基将待测溶液稀释至48倍，然后3倍梯度稀释，依次得到血清浓度不同的稀释液。

(2)将100微升步骤(1)得到的稀释液与50微升步骤二制备的MERS-CoV病毒液(病毒含量为100TCID50)混合，37℃静置孵育1小时。设置用100微升含10％FBS的DMEM培养基代替100微升稀释液的空白对照。

(3)完成步骤(2)后，加入50微升Huh7细胞的细胞液(约含2×10⁴个Huh7细胞)，37℃静置孵育48小时(实际应用中，48-72小时均可)。

(4)完成步骤(3)后，加入100μl PBS缓冲液和50μl细胞裂解液(Bright-Glo^TMLuciferase Assay System，Promega，E2650)，静置2min，然后用化学发光仪检测荧光素酶活性。

每种处理设置3个复孔，结果取平均值。

中和活性＝(空白对照组的荧光强度-加入稀释液的实验组的荧光强度)/空白对照组的荧光强度×100％。

中和活性为50％时对应的血清稀释倍数即位ID50。

第14周，G9组三只随机小鼠(编号42、编号43和编号45)和G12组三只随机小鼠(编号57、编号58和编号60)的中和活性结果见图3。

第40周，各组小鼠血清的ID50值见表2(N.D代表检测结果为阴性)。

表2

各组小鼠每2周的血清ID50值以10为底的对数见图4(W代表周)。

结果表明，免疫血清能够非常好的中和MERS-CoV假病毒。

六、特异性检测

1、制备SARS假病毒

将序列表的序列6所示的双链DNA分子(SARS全长膜蛋白的编码基因)插入pcDNA3.1(+)载体的HindIII和XhoI酶切位点之间，得到SARS膜蛋白质粒。

将SARS膜蛋白质粒和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，37℃静置孵育，转染48小时后收集细胞培养上清，即为含有SARS假病毒的病毒液(简称SARS病毒液)。

2、中和活性检测

用SARS病毒液代替MERS-CoV病毒液，其他同步骤五。

第14周，G9组三只随机小鼠(编号42、编号43和编号45)和G12组三只随机小鼠(编号57、编号58和编号60)的中和活性结果见图5。免疫血清对SARS假病毒完全不中和。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗

<130> CGGNQAYX-186032

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1353

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu

1 5 10 15

Ser Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu

20 25 30

Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile

35 40 45

Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr

50 55 60

Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp

65 70 75 80

His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr

85 90 95

Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe

100 105 110

Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly

115 120 125

Thr Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Ser Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr

130 135 140

Pro Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys

145 150 155 160

Met Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys

165 170 175

Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly

180 185 190

Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His

195 200 205

Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser

210 215 220

Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met

225 230 235 240

Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile

245 250 255

Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp

260 265 270

Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp

275 280 285

Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln

290 295 300

Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro

305 310 315 320

Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala

325 330 335

Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu

340 345 350

Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala

355 360 365

Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp

370 375 380

Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys

385 390 395 400

Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser

405 410 415

Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala

420 425 430

Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr

435 440 445

Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile

450 455 460

Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile

465 470 475 480

Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys

485 490 495

Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr

500 505 510

Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser

515 520 525

Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln

530 535 540

Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr

545 550 555 560

Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn

580 585 590

Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu

595 600 605

Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly

610 615 620

Val Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly

625 630 635 640

Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser

645 650 655

Val Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr

660 665 670

Leu Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln

675 680 685

Tyr Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr

690 695 700

Gly Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser

705 710 715 720

Ser Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys

725 730 735

Ala Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg Ser

740 745 750

Val Pro Gly Glu Met Arg Leu Ala Ser Ile Ala Phe Asn His Pro Ile

755 760 765

Gln Val Asp Gln Leu Asn Ser Ser Tyr Phe Lys Leu Ser Ile Pro Thr

770 775 780

Asn Phe Ser Phe Gly Val Thr Gln Glu Tyr Ile Gln Thr Thr Ile Gln

785 790 795 800

Lys Val Thr Val Asp Cys Lys Gln Tyr Val Cys Asn Gly Phe Gln Lys

805 810 815

Cys Glu Gln Leu Leu Arg Glu Tyr Gly Gln Phe Cys Ser Lys Ile Asn

820 825 830

Gln Ala Leu His Gly Ala Asn Leu Arg Gln Asp Asp Ser Val Arg Asn

835 840 845

Leu Phe Ala Ser Val Lys Ser Ser Gln Ser Ser Pro Ile Ile Pro Gly

850 855 860

Phe Gly Gly Asp Phe Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Val Ser Ile Ser

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Thr Gly Ser Arg Ser Ala Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp

885 890 895

Lys Val Thr Ile Ala Asp Pro Gly Tyr Met Gln Gly Tyr Asp Asp Cys

900 905 910

Met Gln Gln Gly Pro Ala Ser Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr

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Val Ala Gly Tyr Lys Val Leu Pro Pro Leu Met Asp Val Asn Met Glu

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Ala Ala Tyr Thr Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val Gly Trp

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Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala Gln Ser Ile

965 970 975

Phe Tyr Arg Leu Asn Gly Val Gly Ile Thr Gln Gln Val Leu Ser Glu

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Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Lys Phe Asn Gln Ala Leu Gly Ala Met

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Gln Thr Gly Phe Thr Thr Thr Asn Glu Ala Phe Gln Lys Val Gln

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Asp Ala Val Asn Asn Asn Ala Gln Ala Leu Ser Lys Leu Ala Ser

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Glu Leu Ser Asn Thr Phe Gly Ala Ile Ser Ala Ser Ile Gly Asp

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Ile Ile Gln Arg Leu Asp Val Leu Glu Gln Asp Ala Gln Ile Asp

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Arg Leu Ile Asn Gly Arg Leu Thr Thr Leu Asn Ala Phe Val Ala

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Gln Gln Leu Val Arg Ser Glu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gln Leu

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Ala Lys Asp Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ala Gln Ser Lys Arg

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Ser Gly Phe Cys Gly Gln Gly Thr His Ile Val Ser Phe Val Val

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Asn Ala Pro Asn Gly Leu Tyr Phe Met His Val Gly Tyr Tyr Pro

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Ser Asn His Ile Glu Val Val Ser Ala Tyr Gly Leu Cys Asp Ala

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Ala Asn Pro Thr Asn Cys Ile Ala Pro Val Asn Gly Tyr Phe Ile

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Lys Thr Asn Asn Thr Arg Ile Val Asp Glu Trp Ser Tyr Thr Gly

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Ser Ser Phe Tyr Ala Pro Glu Pro Ile Thr Ser Leu Asn Thr Lys

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Tyr Val Ala Pro Gln Val Thr Tyr Gln Asn Ile Ser Thr Asn Leu

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Pro Pro Pro Leu Leu Gly Asn Ser Thr Gly Ile Asp Phe Gln Asp

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Glu Leu Asp Glu Phe Phe Lys Asn Val Ser Thr Ser Ile Pro Asn

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Tyr Glu Met Leu Ser Leu Gln Gln Val Val Lys Ala Leu Asn Glu

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Ser Tyr Ile Asp Leu Lys Glu Leu Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn

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Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Val

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Ala Leu Ala Leu Cys Val Phe Phe Ile Leu Cys Cys Thr Gly Cys

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Gly Thr Asn Cys Met Gly Lys Leu Lys Cys Asn Arg Cys Cys Asp

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gctatcccct ttgctcagtc cattttctac cggctgaacg gcgtgggaat cacccagcag 3900

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gtgaatatgg aggctgccta cacctcctcc ctgctgggca gcattgctgg agtgggctgg 2880

actgcaggac tgtcctcctt tgctgccatc ccatttgccc agagcatctt ctacagactg 2940

aatggagtgg gcatcaccca acaggtgctg tctgagaacc agaaactgat tgccaacaag 3000

ttcaaccagg ctctgggagc tatgcagaca ggcttcacca ccaccaatga ggctttccag 3060

aaggtccagg atgctgtgaa caacaatgcc caggctctga gcaaactggc atctgaactg 3120

agcaacacct ttggagccat ctctgctagc attggagaca tcatccagag actggatgtg 3180

ttggaacagg atgcccagat tgacagactg ataaatggca gactgaccac cctgaatgcc 3240

tttgtggctc aacaacttgt gaggtctgag tctgctgccc tgtctgccca acttgccaag 3300

gacaaggtga atgagtgtgt gaaggctcaa agcaagaggt ctggcttctg tggacaaggc 3360

acccacattg tgtcctttgt ggtgaatgcc ccaaatggac tctactttat gcatgtgggc 3420

tactacccaa gcaaccacat tgaggtggtg tctgcctatg gactgtgtga tgctgccaac 3480

ccaaccaact gtattgcccc tgtgaatggc tacttcatca agaccaacaa caccaggatt 3540

gtggatgagt ggtcctacac aggctcctcc ttctatgccc ctgaaccaat cacctccctg 3600

aacaccaaat atgtggctcc acaggtgacc taccagaaca tcagcaccaa cctgcctcct 3660

ccactgctgg gcaacagcac aggcattgac ttccaggatg aactggatga gttcttcaag 3720

aatgtgagca ccagcatccc aaactttggc tccctgaccc agataaacac caccctgctg 3780

gacctgacct atgagatgct gtccctccaa caggtggtga aggctctgaa tgagtcctac 3840

attgacctga aagaactggg caactacacc tactacaaca agtggccatg gtacatctgg 3900

ctgggattca ttgcaggact ggtggccctg gctctgtgcg tcttctttat cctgtgctgt 3960

accggctgcg ggacaaactg tatggggaag ctgaaatgta atcggtgctg tgacagatac 4020

gaggaatatg atctggagcc ccacaaggtg cacgtccatt aa 4062

<210> 5

<211> 2215

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tctagaccac catgggatgg tcatgtatca tcctttttct agtagcaact gcaacctgtg 60

tacattcata tgtggatgtg ggacctgact ctgtgaagtc tgcctgtatt gaggtggaca 120

tccaacagac cttctttgac aagacctggc caagaccaat tgatgtgagc aaggctgatg 180

gcatcatcta cccacagggc aggacctaca gcaacatcac catcacctac cagggactgt 240

ttccatacca gggagatcat ggagatatgt atgtctactc tgctggtcat gccacaggca 300

ccacaccaca gaaactgttt gtggctaact acagccagga tgtgaagcag tttgccaatg 360

gctttgtggt gaggattgga gcagcagcca acagcacagg cacagtgatt atcagcccaa 420

gcacctctgc caccatcagg aagatttacc ctgcctttat gctgggctcc tctgtgggca 480

acttctctga tggcaagatg ggcaggttct tcaaccacac cctggtgctg ctgcctgatg 540

gctgtggcac cctgctgagg gctttctact gtatcttgga accaaggtct ggcaaccact 600

gtcctgctgg caactcctac acctcctttg ccacctacca cacacctgcc acagactgtt 660

ctgatggcaa ctacaacagg aatgcctccc tgaactcctt caaggaatac ttcaacctga 720

ggaactgtac ctttatgtac acctacaaca tcacagagga tgagattttg gagtggtttg 780

gcatcaccca gacagcccag ggagtgcatc tgttctcgag cagatatgtg gacctctatg 840

gaggcaatat gttccagttt gccaccctgc ctgtctatga caccatcaaa tactacagca 900

tcatcccaca cagcatcagg agcatccagt ctgacaggaa ggcttgggct gccttctatg 960

tctacaaact ccaaccactg accttcctgc tggacttctc tgtggatggc tacatcagga 1020

gggctattga ctgtggcttc aatgacctga gccaacttca ctgttcctat gagtcctttg 1080

atgtggagtc tggagtctac tctgtgtcct cctttgaggc taagccatct ggctctgtgg 1140

tggaacaggc tgagggagtg gagtgtgact tcagcccact gctgtctggc acacctccac 1200

aggtctacaa cttcaagaga ctggtgttca ccaactgtaa ctacaacctg accaaactgc 1260

tgtccctgtt ctctgtgaat gacttcactt gtagccagat tagccctgct gccattgcca 1320

gcaactgtta ctcctccctg attctggact acttctccta cccactgagt atgaagtctg 1380

acctgtctgt gtcctctgct ggaccaatca gccagttcaa ctacaagcag tccttcagca 1440

acccaacttg tctgattctg gctacagtgc cacacaacct gaccaccatc accaagccac 1500

tgaaatactc ctacatcaac aagtgtagca gactgctgtc tgatgacagg acagaggtgc 1560

cacaactagt gaatgccaac caatacagcc catgtgtgag cattgtgcca agcacagtgt 1620

gggaggatgg agactactac aggaagcaac ttagcccatt ggagggagga ggctggctgg 1680

tggcatctgg cagcacagtg gctatgacag aacaactcca aatgggcttt ggcatcacag 1740

tccaatatgg cacagacacc aactctgtgt gtccaaaatt ggagtttgcc aatgacacca 1800

agattgccag ccaacttggc aactgtgtgg aatactccct ctatggagtg tctggcaggg 1860

gagtgttcca gaactgtact gctgtgggag tgagacaaca gaggtttgtc tatgatgcct 1920

accagaacct ggtgggctac tactctgatg atggcaacta ctactgtctg agggcttgtg 1980

tgtctgtgcc tgtgtctgtg atttatgaca aggagaccaa gacccatgcc accctgtttg 2040

gatccgtggc ttgtgaacac atctccagca caatgagtca atacagcagg agcaccagga 2100

gtatgctgaa aaggagggac agcacatatg gaccactcca aacacctgtg ggctgtgtgc 2160

tgggactggt gaactcctcc ctgtttgtgg agcatcacca tcaccatcac taata 2215

<210> 6

<211> 3768

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgttcatct tcctgctgtt cctgaccctg accagcggca gcgacctgga ccggtgcacc 60

accttcgacg acgtgcaggc ccccaactac acccagcaca ccagcagcat gcggggcgtg 120

tactaccccg acgagatctt ccggagcgac accctgtacc tgacccagga cctgttcctg 180

cccttctaca gcaacgtgac cggcttccac accatcaacc acaccttcgg caaccccgtg 240

atccccttca aggacggcat ctacttcgcc gccaccgaga agagcaacgt ggtgcggggc 300

tgggtgttcg gcagcaccat gaacaacaag agccagagcg tgatcatcat caacaacagc 360

accaacgtgg tgatccgggc ctgcaacttc gagctgtgcg acaacccctt cttcgccgtg 420

agcaagccca tgggcaccca gacccacacc atgatcttcg acaacgcctt caactgcacc 480

ttcgagtaca tcagcgacgc cttcagcctg gacgtgagcg agaagagcgg caacttcaag 540

cacctgcggg agttcgtgtt caagaacaag gacggcttcc tgtacgtgta caagggctac 600

cagcccatcg acgtggtgcg ggacctgccc agcggcttca acaccctgaa gcccatcttc 660

aagctgcccc tgggcatcaa catcaccaac ttccgggcca tcctgaccgc cttcagcccc 720

gcccaggaca tctggggcac cagcgccgcc gcctacttcg tgggctacct gaagcccacc 780

accttcatgc tgaagtacga cgagaacggc accatcaccg acgccgtgga ctgcagccag 840

aaccccctgg ccgagctgaa gtgcagtgtg aagagcttcg agatcgacaa gggcatctac 900

cagaccagca acttccgggt ggtgcccagc ggcgacgtgg tgcggttccc caacatcacc 960

aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac gccaccaagt tccccagcgt gtacgcctgg 1020

gagcggaaga agatcagcaa ctgcgtggcc gactacagcg tgctgtacaa cagcaccttc 1080

ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgagc gccaccaagc tgaacgacct gtgcttcagc 1140

aacgtgtacg ccgacagctt cgtggtgaag ggcgacgacg tgcggcagat cgcccccggc 1200

cagaccggcg tgatcgccga ctacaactac aagctgcccg acgacttcat gggctgcgtg 1260

ctggcctgga acacccggaa catcgacgcc accagcaccg gcaactacaa ctacaagtac 1320

cggtacctgc ggcacggcaa gctgcggccc ttcgagcggg acatcagcaa cgtgcccttc 1380

agccccgacg gcaagccctg cacccccccc gccctgaact gctactggcc cctgaacgac 1440

tacggcttct acaccactac cggcatcggc taccagccct accgggtggt ggtgctgagc 1500

ttcgagctgc tgaacgcccc cgccaccgtg tgcggcccca agctgagcac cgacctgatc 1560

aagaaccagt gcgtgaactt caacttcaac ggcctgaccg gcaccggcgt gctgaccccc 1620

agcagcaagc ggttccagcc cttccagcag ttcggccggg acgtgagcga cttcaccgac 1680

agcgtgcggg accccaagac cagcgagatc ctggacatca gcccctgcgc cttcggcggc 1740

gtgagcgtga tcacccccgg taccaacgcc agcagcgagg tggccgtgct gtaccaggac 1800

gtgaactgca ccgacgtgag caccgccatc cacgccgacc agctgacccc cgcctggcgg 1860

atctacagca ccggcaacaa cgtgttccag acccaggccg gctgcctgat cggcgccgag 1920

cacgtggaca ccagctacga gtgcgacatc cccatcggcg ccggcatctg cgccagctac 1980

cacaccgtga gcctgctgcg gagcaccagc cagaagagca tcgtggccta caccatgagc 2040

ctgggcgccg acagcagcat cgcctacagc aacaacacca tcgccatccc caccaacttc 2100

agcatcagca tcaccaccga ggtgatgccc gtgagcatgg ccaagaccag cgtggactgc 2160

aacatgtaca tctgcggcga cagcaccgaa tgcgccaacc tgctgctgca gtacggcagc 2220

ttctgcaccc aactgaaccg ggccctgagc ggcatcgccg ccgagcagga ccggaacacc 2280

cgggaggtgt tcgcccaggt gaagcagatg tacaagaccc ccaccctgaa gtacttcggc 2340

ggcttcaact tcagccagat cctgcccgac cccctgaagc ccaccaagcg gagcttcatc 2400

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accaccacca gcaccgccct gggcaagctg caggacgtgg tgaaccagaa cgcccaggcc 2820

ctgaacaccc tggtgaagca gctgagcagc aacttcggcg ccatcagcag cgtgctgaac 2880

gacatcctga gccggctgga caaggtggag gccgaggtgc agatcgaccg gctgatcacc 2940

ggccggctgc agagcctgca gacctacgtg acccagcagc tgatccgggc cgccgagatc 3000

cgggccagcg ccaacctggc cgccaccaag atgagcgagt gcgtgctggg ccagagcaag 3060

cgggtggact tctgcggcaa gggctaccac ctgatgagct tcccccaggc cgccccccac 3120

ggcgtggtgt tcctgcacgt gacctacgtg cccagccagg agcggaactt caccaccgcc 3180

cccgccatct gccacgaggg caaggcctac ttcccccggg agggcgtgtt cgtgttcaac 3240

ggcaccagct ggttcatcac ccagcggaac ttcttcagcc cccagatcat caccaccgac 3300

aacaccttcg tgagcggcaa ctgcgacgtg gtgatcggca tcatcaacaa caccgtgtac 3360

gaccccctgc agcccgagct ggacagcttc aaggaggagc tggacaagta cttcaagaac 3420

cacaccagcc ccgacgtgga cctgggcgac atcagcggca tcaacgccag cgtggtgaac 3480

atccagaagg agatcgaccg gctgaacgag gtggccaaga acctgaacga gagcctgatc 3540

gacctgcagg agctgggcaa gtacgagcag tacatcaagt ggccctggta cgtgtggctg 3600

ggcttcatcg ccggcctgat cgccatcgtg atggtgacca tcctgctgtg ctgcatgacc 3660

agctgctgca gctgcctgaa gggcgcctgc agctgcggca gctgctgcaa gttcgacgag 3720

gacgacagcg agcccgtgct gaagggcgtg aagctgcact acacctga 3768

Claims

1.一种重组腺病毒，是重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的；

所述重组质粒是将特异DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域得到的；

所述特异DNA分子中具有全长MERS-CoV Spike蛋白的编码基因；

所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒E1基因。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于：所述腺病毒包装细胞为HEK293A细胞。

3.如权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于：所述全长MERS Spike蛋白如序列表的序列1所示。

所述全长MERS Spike蛋白的编码基因如序列表的序列2所示。

4.如权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于：所述特异DNA分子如序列表的序列3所示。

5.表达全长MERS-CoV Spike蛋白的重组腺病毒；所述重组腺病毒的出发毒株为黑猩猩腺病毒68型或非复制型黑猩猩腺病毒68型。

6.一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括重组质粒和腺病毒包装细胞；

所述特异DNA分子中具有全长MERS-CoV Spike蛋白的编码基因；

所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒E1基因。

7.一种重组质粒，是将特异DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体AdC68的△E1区域得到的；所述特异DNA分子中具有全长MERS-CoV Spike蛋白的编码基因。

8.权利要求1至5中任一所述重组腺病毒在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。

9.一种产品，其活性成分为权利要求1至5中任一所述重组腺病毒；

所述产品为如下(a)或(b)：

(a)新型冠状病毒疫苗；

(b)用于中和新型冠状病毒的药物。

10.权利要求1至5中任一所述重组腺病毒在制备用于中和新型冠状病毒的药物中的应用。