KR20230127977A - 폴리뉴클레오티드 백신 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
제1 병원체 항원을 인코딩하는 제1 핵산, 및 임의로 제2 병원체 항원을 인코딩하는 제2 핵산, 및 임의로 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 병원체 항원은 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 상이한 면역 개질제를 포함한다. 또한, 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 동결건조된 조성물, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 본원에 개시된다. 또한, 생산 방법 및 치료적 용도가 본원에 개시된다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
[0001]
본 출원은 2020년 10월 2일에 출원된 미국 가출원 제63/087,118호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 인용에 의해 포함된다.
전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
[0002]
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(파일명: 2437_049PC01_Seqlisting_ST25.txt; 크기: 98,606 바이트; 및 생성 날짜: 2021년 10월 1일)의 전자 제출된 서열 목록의 내용은 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함된다.
분야
[0003]
본 개시는 일반적으로 면역학, 백신, 및 유전자 요법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 개시는 포유동물에서의 감염 및 질환을 치료하거나, 가능성을 감소시키거나, 예방하기 위해 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 항원), 박테리아 항원, 또는 기생충 항원에 대한 면역 반응을 발생시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 개시의 배경
[0004]
중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS)은 SARS-관련 코로나바이러스(SARS-associated coronavirus; SARS-CoV)라고 불리는 코로나바이러스에 의해 유발되는 전염성 바이러스 호흡기 질환이다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 유발하고 COVID-19 팬데믹의 원인이 되는 코로나바이러스의 균주이다. COVID-19로 고통받는 환자에 대해 가벼운 증상에서 사망으로 이어질 수 있는 중증 질환에 이르기까지 광범위한 증상이 보고되었다. 일반적인 증상은 열, 호흡기 증상, 피로, 통증, 미각 및/또는 후각 상실, 및 장 장애(예를 들어, 메스꺼움, 구토, 및/또는 설사)를 포함한다.
[0005]
SARS-CoV-2에 대한 안전하고 효과적인 백신의 개발이 시급히 요구된다. 불활성화된 바이러스, 항원 서브유닛, 및 핵산(DNA 및 RNA) 백신을 포함하는 여러 잠재적인 백신 접근법이 전 세계의 클리닉에서 조사되고 있다. 최근에, SARS-CoV-2 "S" 단백질을 인코딩하는 플라스미드 벡터는 설치류에서 전기 펄스의 도움으로 또는 붉은털 원숭이에서 전달 시스템 또는 애주번트 없이 근육내 투여되었고, 이들 DNA 백신은 중화 항체의 생성 및 항원-특이적 T-세포 반응을 야기하였다. 문헌[Smith, T.R.F., et al., Nature Communications, 11(2601):1-13 (2020)](이하 "Smith 2020") 및 문헌[Hirao, L.A., et al., Science, 369(6505):806-11 (2020)](이하 "Hirao 2020")을 참조한다.
[0006]
DNA 백신은 각각 불활성화된 바이러스 및 서브유닛 백신과 관련된 체액성 및 세포성 면역 및 저위험 독성 및 폴딩 문제를 일으키는 이들의 잠재력으로 인해 통상적인 불활성화된 또는 단백질 서브유닛 백신에 비해 특정 이점을 가질 수 있다. 또한, RNA 백신과 비교하여, DNA 백신은 더 나은 안정성, 지속성, 더 낮은 비용, 및 더 긴 발생 이력에 대한 잠재력을 가질 수 있다. 이들의 매력에도 불구하고, 차선의 면역원성 및 효과적인 전달과 같은 문제는 DNA 백신과 우려되어 왔으며, 이는 DNA 백신이 실행 가능한 옵션이 되기 위해 극복되어야 한다.
[0007]
따라서, 예방 및 치료 환경에서 효과적인 개선된 DNA 백신 조성물에 대한 요구가 남아 있다.
본 개시의 간략한 개요
[0008]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, SARS CoV-2 항원)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 메신저 RNA(mRNA) 벡터) 및 (ii) 전달 성분(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 벡터는 하나 이상의 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 항원 및 임의로 제2 바이러스 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태는 본 개시의 벡터 또는 조성물의 생체내 투여 후 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2) 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0009]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 핵산 서열 및 하나 이상의 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 다중시스트론성 벡터(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 메신저 RNA(mRNA) 벡터) 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 담체/애주번트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태는 본 개시의 다중시스트론성 DNA 플라스미드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 생체내 투여 후 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2) 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0010]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 항원의 DNA 서열 및 하나 이상의 면역 개질제의 DNA 서열을 포함하는 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 DNA 담체/애주번트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 항원의 RNA 서열 및 하나 이상의 면역 개질제의 RNA 서열을 포함하는 다중시스트론성 mRNA 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 RNA 담체/애주번트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태는 본 개시의 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 생체내 투여 후 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2) 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0011]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, DNA 플라스미드 벡터 또는 메신저 RNA(mRNA) 벡터) 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태는 본 개시의 DNA 플라스미드 벡터, mRNA 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 생체내 투여 후 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2) 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0012]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 항원의 DNA 서열을 포함하는 DNA 플라스미드 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 DNA 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 항원의 RNA 서열을 포함하는 mRNA 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 RNA 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태는 본 개시의 DNA 플라스미드 벡터, mRNA 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 생체내 투여 후 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2) 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 전달 성분은 벤즈알코늄 클로라이드를 추가로 포함한다.
[0013]
본원에 개시된 조성물의 전달 성분은 본원에 개시된 전달 성분의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0014]
일부 양태에서, 병원체는 바이러스, 박테리아 또는 기생충이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 항원은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원은 동일한 항원의 2개 이상의 변이체(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 또는 기생충의 상이한 균주로부터의 항원의 2개 이상의 변이체)를 포함한다.
[0015]
일부 양태에서, 박테리아 항원은 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, rAg85A 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합이다.
[0016]
일부 양태에서, 바이러스 항원은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원, 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 표면 당단백질 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, gE2 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, Pol 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원, G 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, DEN-80E 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, VP35 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, CKD 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36), 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 융합 단백질 MV-F 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, M 단백질 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0017]
일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편 및 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 기생충 항원은 원생동물 항원이다. 일부 양태에서, 기생충 항원은 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 항원, 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 서컴스포로자이트 단백질 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 기생충 항원은 기생성 또는 병원성 진균 항원이다. 일부 양태에서, 기생 또는 병원성 진균 항원은 칸디다(Candida) 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0018]
일부 양태에서, 하나 이상의 항원은 바이러스 항원이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SARS-CoV-2 균주로부터의 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, S 단백질, S 단백질의 S1 서브유닛, S 단백질의 RBD, S 단백질의 막 융합 도메인, M 단백질, E 단백질, 또는 이의 항원성 단편)을 포함한다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2); 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SARS-CoV-2 균주로부터의 하나 이상의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2); 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SARS-CoV-2 균주로부터의 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, S 단백질, S 단백질의 S1 서브유닛, S 단백질의 RBD, M 단백질, 또는 이의 항원성 단편)을 포함한다: B.1.1.7, Q.1, Q.2, Q.3, Q.4, Q.5, Q.6, Q.7, Q.8, B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3, B.1.617.2, AY.1 하위계통, P.1, P.1.1, P.1.2, B.1.427, B.1.429, B.1.525, B.1.526, B.1.617.1, B.1.617.3, B.1.621, B.1.621.1, P.2, 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SARS-CoV-2 균주로부터의 하나 이상의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다: B.1.1.7, Q.1, Q.2, Q.3, Q.4, Q.5, Q.6, Q.7, Q.8, B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3, B.1.617.2, AY.1 하위계통, P.1, P.1.1, P.1.2, B.1.427, B.1.429, B.1.525, B.1.526, B.1.617.1, B.1.617.3, B.1.621, B.1.621.1, P.2, 및 이의 임의의 조합.
[0019]
일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 알파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 ΔH69-V70, Δ144, E484K, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, 및 D1118H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 베타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, D80A, D215G, ΔL241-S243, K417N, E484K, N501Y, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 감마 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, 및 V1176F로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 델타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T19R, ΔD119-F120, ΔE156-F157, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 카파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, 및 Q1071H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 에타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 Q52R, A67V, ΔH69-V70, ΔY144, E484K, D614G, Q677H, 및 F888L로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 이오타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L5F, T95I, D253G, E484K, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 람다 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 G75V, T76I, ΔR246-G252, D253N, L452Q, F490S, D614G, 및 T859N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 뮤 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T95I, Y144S, Y145N, R346K, E484K, N501Y, D614G, P681H, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 엡실론 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 S13I, W152C, L452R, 및 D614G로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0020]
일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 SARS-CoV-2의 2개 이상의 상이한 균주로부터의 적어도 2개의 바이러스 항원(예를 들어, S 단백질로부터의 2개 이상의 항원 또는 항원성 단편, S 단백질의 S1 서브유닛, S 단백질의 RBD, S 단백질의 막 융합 도메인, M 단백질, E 단백질, 또는 이의 임의의 조합)을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 SARS-CoV-2의 2개 이상의 상이한 균주로부터의 적어도 2개의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2의 2개 이상의 상이한 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2); 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, SARS-CoV-2의 2개 이상의 상이한 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: B.1.1.7, Q.1, Q.2, Q.3, Q.4, Q.5, Q.6, Q.7, Q.8, B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3, B.1.617.2, AY.1 하위계통, P.1, P.1.1, P.1.2, B.1.427, B.1.429, B.1.525, B.1.526, B.1.617.1, B.1.617.3, B.1.621, B.1.621.1, P.2, 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, SARS-CoV-2의 2개 이상의 상이한 균주로부터의 적어도 2개의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0021]
SARS-CoV-2 변이체에 대한 돌연변이 및 바이러스 서열 데이터는 각각 그 전체가 인용에 의해 포함되는 CoVariants 웹사이트(https://covariants.org/) 및 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 웹사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/sars-cov-2)에서 공개적으로 이용 가능하다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 알파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 ΔH69-V70, Δ144, E484K, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, 및 D1118H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 베타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, D80A, D215G, ΔL241-S243, K417N, E484K, N501Y, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 감마 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, 및 V1176F로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 델타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T19R, ΔD119-F120, ΔE156-F157, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 카파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, 및 Q1071H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 에타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 Q52R, A67V, ΔH69-V70, ΔY144, E484K, D614G, Q677H, 및 F888L로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 이오타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L5F, T95I, D253G, E484K, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 람다 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 G75V, T76I, ΔR246-G252, D253N, L452Q, F490S, D614G, 및 T859N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 뮤 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T95I, Y144S, Y145N, R346K, E484K, N501Y, D614G, P681H, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 엡실론 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 S13I, W152C, L452R, 및 D614G로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0022]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 SARS-CoV-2 바이러스 항원의 DNA 서열 및 하나 이상의 면역 개질제의 DNA 서열을 포함하는 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 DNA 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 조성물은 선천성 면역계를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 면역강화제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 면역강화제는 비-코딩 DNA(예를 들어, 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 연쇄체), 비-코딩 RNA, 소분자, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된다. 본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 SARS-CoV-2 바이러스 항원의 RNA 서열 및 하나 이상의 면역 개질제의 RNA 서열을 포함하는 다중시스트론성 RNA 플라스미드 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 RNA 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태는 본 개시의 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 생체내 투여 후 SARS-CoV-2 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0023]
본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 SARS-CoV-2 바이러스 항원의 DNA 서열을 포함하는 DNA 플라스미드 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 DNA 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시의 특정 양태는 (i) 하나 이상의 SARS-CoV-2 바이러스 항원의 RNA 서열을 포함하는 RNA 벡터 및 (ii) 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 RNA 담체/애주번트(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태는 본 개시의 DNA 플라스미드 벡터, mRNA 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물의 생체내 투여 후 SARS-CoV-2 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0024]
본 개시의 특정 양태는 (a) 제1 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산; 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다중시스트론성(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 플라스미드 또는 다중시스트론성 메신저 RNA(mRNA))이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 전달 성분, 예컨대, 합성 비-바이러스성 담체/애주번트와 조합된다.
[0025]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 조합된 전달 성분은 본원에 개시된 전달 성분의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0026]
본 개시의 특정 양태는 (a) 제1 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산으로서, 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 핵산; 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 양태에서, 제1 병원체 단백질은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원이다. 일부 양태에서, 병원체 단백질은 바이러스 항원, 예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 병원체는 바이러스 항원, 예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편이다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 및 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2). 일부 양태에서, 병원체 단백질은 박테리아 항원이다. 일부 양태에서, 병원체 단백질은 기생충 항원이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다중시스트론성 DNA 벡터이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다중시스트론성 mRNA 벡터이다.
[0027]
일부 양태에서, (a) SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산으로서, 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 핵산; 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다중시스트론성 DNA 벡터이다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편이다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 및 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2).
[0028]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 알파 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 ΔH69-V70, Δ144, E484K, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, 및 D1118H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 베타 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, D80A, D215G, ΔL241-S243, K417N, E484K, N501Y, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 감마 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, 및 V1176F로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 델타 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T19R, ΔD119-F120, ΔE156-F157, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 카파 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, 및 Q1071H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 에타 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 Q52R, A67V, ΔH69-V70, ΔY144, E484K, D614G, Q677H, 및 F888L로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 이오타 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L5F, T95I, D253G, E484K, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 람다 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 G75V, T76I, ΔR246-G252, D253N, L452Q, F490S, D614G, 및 T859N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 뮤 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T95I, Y144S, Y145N, R346K, E484K, N501Y, D614G, P681H, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 엡실론 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 S13I, W152C, L452R, 및 D614G로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0029]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 상이한 면역 개질제를 인코딩한다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 2개 이상은 IL-12 p35 및 IL-12 p40을 인코딩한다.
[0030]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (c) 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 제2 바이러스 항원 단백질, 제2 박테리아 항원 단백질 또는 제2 기생충 항원 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0031]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (c) SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 또는 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 동일한 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체를 인코딩하고, 여기서 동일한 SARS-CoV2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체는 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2); 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: B.1.1.7, Q.1, Q.2, Q.3, Q.4, Q.5, Q.6, Q.7, Q.8, B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3, B.1.617.2, AY.1 하위계통, P.1, P.1.1, P.1.2, B.1.427, B.1.429, B.1.525, B.1.526, B.1.617.1, B.1.617.3, B.1.621, B.1.621.1, P.2, 및 이의 임의의 조합.
[0032]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0033]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제2 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0034]
일부 양태에서, 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(SEQ ID NO: 31), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터, 사이토케라틴 18(CK18) 프로모터, 사이토케라틴 19(CK19) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터(SEQ ID 32), 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1) 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터(SEQ ID NO: 33), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터(SEQ ID NO: 38)이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 제2 프로모터는 CMV 프로모터이다.
[0035]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0036]
일부 양태에서, 각각의 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0037]
일부 양태에서, 면역 개질제는 인터루킨(IL) 2(IL-2), IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론(IFN) α(IFN-α), IFN-β, 케모카인, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC I), MHC 클래스 II(MHC II), 인간 백혈구 항원(HLA)-DR 이소타입(HLA-DR), CD80, CD86, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 케모카인은 C-C 모티프 케모카인 리간드(CCL) 3(CCL3), CCL4, CCL5, CCL21, CCL28, C-X-C 모티프 케모카인 리간드(CXCL) 10(CXCL10), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0038]
일부 양태에서, IL-12 p35 면역 개질제는 SEQ ID NO: 43(마우스 IL-12 p35) 또는 SEQ ID NO: 47(인간 IL-12 p35)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제는 SEQ ID NO: 45(마우스 IL-12 p40) 또는 SEQ ID NO: 49(인간 IL-12 p40)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0039]
일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
[0040]
일부 양태에서, 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
[0041]
일부 양태에서, 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0042]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 (i) 인터루킨을 인코딩하는 핵산, 및 (ii) 주요 조직적합성 복합체 및/또는 케모카인을 인코딩하는 핵산의 조합을 포함한다.
[0043]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 MHC I를 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 추가로 포함한다.
[0044]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-12를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다.
[0045]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-12를 인코딩하는 핵산 및 IL-15를 인코딩하는 핵산의 조합을 포함한다.
[0046]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-2를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, MHC I을 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
[0047]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 MHC I을 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
[0048]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다.
[0049]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA 또는 mRNA 서열을 포함할 수 있다.
[0050]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2(SARS-CoV-2 전장 S 단백질에 대한 아미노산 서열) 또는 SEQ ID NO: 4(SARS-CoV-2 전장 S 단백질 + D614G에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1(SARS-CoV-2 전장 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 3(SARS-CoV-2 전장 S 단백질 + D614G를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0051]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2(SARS-CoV-2 전장 S 단백질에 대한 아미노산 서열) 또는 SEQ ID NO: 4(SARS-CoV-2 전장 S 단백질 + D614G에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1(SARS-CoV-2 전장 S 단백질을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 3(SARS-CoV-2 전장 S 단백질 + D614G를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0052]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0053]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0054]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6(SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5(SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD를 인코딩하는 핵산 서열)와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0055]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6(SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5(SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD를 인코딩하는 핵산 서열)와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0056]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0057]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0058]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40(SARS-CoV-2 D614G S 단백질의 S1 서브유닛에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39(SARS-CoV-2 D614G S 단백질의 S1 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열)와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0059]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40(SARS-CoV-2 D614G S 단백질의 S1 서브유닛에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39(SARS-CoV-2 D614G S 단백질의 S1 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열)와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0060]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0061]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0062]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0063]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0064]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N-말단 신호 펩티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0065]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0066]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0067]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0068]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8(SARS-CoV-2 M 단백질에 대한 아미노산 서열), SEQ ID NO: 10(SARS-CoV-2 WA9-UW6 변이체 M 단백질에 대한 아미노산 서열), SEQ ID NO: 12(SARS-CoV-2 NIHE 변이체 M 단백질에 대한 아미노산 서열), SEQ ID NO: 14(SARS-CoV-2 Wuhan_IME_BJO7 변이체 M 단백질에 대한 아미노산 서열), SEQ ID NO: 16(SARS-CoV-2 WA-UW-1753 변이체 M 단백질에 대한 아미노산 서열), SEQ ID NO: 18(SARS-CoV-2 WA UW-1755 변이체 M 단백질에 대한 아미노산 서열), 또는 SEQ ID NO: 20(SARS-CoV-2 USA_SC_3572 변이체 M 단백질에 대한 아미노산 서열)의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
[0069]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 연속 아미노산은 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다.
[0070]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7(SARS-CoV-2 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), SEQ ID NO: 9(SARS-CoV-2 WA9-UW6 변이체 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), SEQ ID NO: 11(SARS-CoV-2 NIHE 변이체 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), SEQ ID NO: 13(SARS-CoV-2 Wuhan_IME_BJO7 변이체 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), SEQ ID NO: 15(SARS-CoV-2 WA-UW-1753 변이체 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), SEQ ID NO: 17(SARS-CoV-2 WA UW-1755 변이체 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), 또는 SEQ ID NO: 19(SARS-CoV-2 USA_SC_3572 변이체 M 단백질을 인코딩하는 핵산 서열)와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0071]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0072]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0073]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하고, 여기서 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
[0074]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산, (b) SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산 및 (c) 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하고, 여기서 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
[0075]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 전장 SARS-Cov-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하고, 여기서 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
[0076]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 전장 SARS-Cov-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산, (b) SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산 및 (c) 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하고, 여기서 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함한다.
[0077]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 전사-후 조절 요소는 우드 척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)이다.
[0078]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 핵산, 제2 항원 핵산, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열(SEQ ID NO: 29), 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열(SEQ ID NO: 30), 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0079]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 인핸서 서열은 인간 액틴 인핸서 서열, 인간 미오신 인핸서 서열, 인간 헤모글로빈 인핸서 서열, 인간 근육 크레아틴 인핸서 서열, 바이러스 인핸서 서열, 또는 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 서열이다. 일부 양태에서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열 또는 β-액틴 인트론 서열이다. 양태에서, 인핸서 서열은 SV40 인핸서 서열(SEQ ID NO: 37)이다.
[0080]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 역 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 ITR 및 제2 ITR을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된다.
[0081]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 캡 및 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함하는 다중시스트론성 mRNA이다. 일부 양태에서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열(SEQ ID NO: 29), 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열(SEQ ID NO: 30), 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 다중시스트론성 mRNA는 5' UTR 및/또는 3' UTR을 포함한다.
[0082]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공되며, 여기서 벡터는 DNA 플라스미드, 다중시스트론성 mRNA, 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체이다. 일부 양태에서, 벡터는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
[0083]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 전달 성분을 추가로 포함한다.
[0084]
조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 본원에 개시된 전달 성분의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0085]
일부 양태에서, IL-12 p35 면역 개질제는 SEQ ID NO: 43(마우스 IL-12 p35) 또는 SEQ ID NO: 47(인간 IL-12 p35)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제는 SEQ ID NO: 45(마우스 IL-12 p40) 또는 SEQ ID NO: 49(인간 IL-12 p40)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0086]
일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p35, IL-12 p40, 또는 이의 조합을 인코딩한다. 일부 양태에서, IL-12 p35 면역 개질제는 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제는 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
[0087]
일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0088]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p35 면역 개질제를 인코딩하고, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p40 면역 개질제를 인코딩한다. 일부 양태에서, IL-12 p35 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0089]
일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 애주번트를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 애주번트는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0090]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 mRNA)를 포함하는 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터)가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 플라스미드 벡터는 DNA 플라스미드 벡터이다.
[0091]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p35를 인코딩하고, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p40을 인코딩한다.
[0092]
일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0093]
일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0094]
또한, (a) 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 (b) 전달 성분을 포함하는 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신이 또한 본원에 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 제1 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 포함하고, 제1 항원 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 임의로 전달 성분은 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머 또는 이의 유도체이다. 일부 양태에서, 전달 성분은 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머 또는 이의 유도체이다. 일부 양태에서, 제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 전달 성분은 벤즈알코늄 클로라이드를 추가로 포함한다.
[0095]
조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 본원에 개시된 전달 성분의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0096]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0097]
일부 양태에서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0098]
일부 양태에서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 F1-Ag, 예르시니아 페스티스 V-Ag, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 Apa 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 HP65 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 rAg85A 항원, E71 VP1 항원, GST-태깅된 E71-VP1 항원, Cox 단백질 항원, GST-태깅된 Cox 단백질 항원, HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 gB2 항원, HSV-2 gC2 항원, HSV-2 gD2 항원, HSV-2 gE2 항원, HIV Env 항원, HIV Gag 항원, HIV Nef 항원, HIV Pol 항원, HPV 부캡시드 단백질 L2 항원, HCV NS3 항원, RSV F 항원, RSV G 항원, 뎅기 바이러스 E 단백질 항원, 뎅기 바이러스 EDIII 항원, 뎅기 바이러스 NS1 항원, 뎅기 바이러스 DEN-80E 항원, 에볼라 바이러스 GB 항원, 에볼라 바이러스 VP24 항원, 에볼라 바이러스 VP40 항원, 에볼라 바이러스 NP 항원, 에볼라 바이러스 VP30 항원, 에볼라 바이러스 VP35 항원, 지카 바이러스 외피 도메인 III 항원, 지카 바이러스 CKD 항원, 치쿤구니야 바이러스 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI (SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL (SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG (SEQ ID NO: 36), 홍역 바이러스 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 홍역 바이러스 융합 단백질 MV-F 항원, MERS-CoV S 단백질 항원, MERS-CoV S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, MERS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질 항원, SARS-CoV S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV E 단백질 항원, SARS-CoV M 단백질 항원, 톡소플라스마 곤디 MIC8 항원, 플라스모디움 팔시파룸 SERA5 폴리펩티드 항원, 플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로자이트 단백질 항원, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 (NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2 (M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0099]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 또는 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 동일한 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체를 인코딩하고, 여기서 동일한 SARS-CoV2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체는 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2); 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: B.1.1.7, Q.1, Q.2, Q.3, Q.4, Q.5, Q.6, Q.7, Q.8, B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3, B.1.617.2, AY.1 하위계통, P.1, P.1.1, P.1.2, B.1.427, B.1.429, B.1.525, B.1.526, B.1.617.1, B.1.617.3, B.1.621, B.1.621.1, P.2, 및 이의 임의의 조합.
[0100]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 알파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 ΔH69-V70, Δ144, E484K, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, 및 D1118H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 베타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, D80A, D215G, ΔL241-S243, K417N, E484K, N501Y, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 감마 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, 및 V1176F로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 델타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T19R, ΔD119-F120, ΔE156-F157, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 카파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, 및 Q1071H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 에타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 Q52R, A67V, ΔH69-V70, ΔY144, E484K, D614G, Q677H, 및 F888L로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 이오타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L5F, T95I, D253G, E484K, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 람다 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 G75V, T76I, ΔR246-G252, D253N, L452Q, F490S, D614G, 및 T859N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 뮤 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T95I, Y144S, Y145N, R346K, E484K, N501Y, D614G, P681H, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산은 엡실론 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 S13I, W152C, L452R, 및 D614G로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0101]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0102]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제2 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
[0103]
일부 양태에서, 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터, 사이토케라틴 18(CK18) 프로모터, 사이토케라틴 19(CK19) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1) 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 제2 프로모터는 CMV 프로모터이다.
[0104]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0105]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0106]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 IRES 서열을 통해 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0107]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0108]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0109]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0110]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0111]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 IRES 서열을 통해 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0112]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0113]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛을 인코딩하는 제1 항원 핵산) 및/또는 제2 항원 핵산(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛을 인코딩하는 제2 항원 핵산)에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0114]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0115]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0116]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0117]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0118]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0119]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 전사-후 조절 요소는 우드 척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)이다.
[0120]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 핵산, 제2 항원 핵산, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열, 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열, 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 조합이다.
[0121]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 인핸서 서열은 인간 액틴 인핸서 서열, 인간 미오신 인핸서 서열, 인간 헤모글로빈 인핸서 서열, 인간 근육 크레아틴 인핸서 서열, 바이러스 인핸서 서열, 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 서열, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열, β-액틴 인트론 서열, 또는 이의 조합이다.
[0122]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 역 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 ITR 및 제2 ITR을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 둘 모두 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된다.
[0123]
일부 양태에서, 벡터는 DNA 플라스미드 벡터이다. 일부 양태에서, DNA 플라스미드 벡터는 pVac 1, pVac 4, 및 pVac 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
[0124]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 애주번트를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 애주번트는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0125]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 동결건조된다.
[0126]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 양이온성 폴리머이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머는 합성 작용성화된 폴리머, 지질, 리포폴리머, 또는 이의 화학적 유도체이다. 일부 양태에서, 합성 작용성화된 폴리머는 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머이다.
[0127]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 화학식 (CP)xLyYz로 표현되며, 여기서 (a) CP는 적어도 하나의 2차 아민 기를 함유하는 양이온성 폴리머를 나타내고, 상기 양이온성 폴리머는 1,000 내지 25,000 달톤 범위 내의 평균 분자량을 갖고; (b) Y는 에스테르, 아미드, 디설파이드, 또는 포스페이트 연결을 함유하는 이작용성 생분해성 링커를 나타내고; (c) L은 리간드를 나타내고; (d) x는 1 내지 20 범위의 정수이고; (e) y는 0 내지 100 범위의 정수이고; (f) z는 0 내지 40 범위의 정수이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머는 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 포함한다. 일부 양태에서, 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 포함하는 양이온성 폴리머는 하기 화학식을 갖는 BD15K-12이다:
상기 식에서, PEI는 대략 15,000 Da이고, 여기서 PEI 당 평균 12개의 가교제가 존재한다. 일부 양태에서, 이작용성 생분해성 링커는 친수성이고, 디설파이드 결합을 포함하는 생분해성 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 이작용성 생분해성 링커는 디티오디프로피오닐 링커이다.
[0128]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 LPEI 및 다중-블록 코폴리머를 가교시키기 위한 디티오디프로피오닐 링커를 포함하고, 여기서 LPEI는 1,000 내지 25,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 적어도 하나의 리간드에 공유적으로 연결된다.
[0129]
일부 양태에서, 리간드는 당 모이어티, 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 리간드이다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 단당류이다. 일부 양태에서, 단당류는 갈락토스이다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 올리고당류이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 당단백질, 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체이다. 일부 양태에서, 성장 인자 수용체는 표피 성장 인자 수용체이다. 일부 양태에서, 당단백질은 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)이다. 일부 양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원이다.
[0130]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 올레산, 팔미트산, 및 스테아르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방 아실 사슬에 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 다가음이온성 화합물에 정전기적으로 끌리는 적어도 하나의 아민 기를 포함한다. 일부 양태에서, 다가음이온성 화합물은 핵산이고, 여기서 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 핵산을 축합하여 콤팩트한 구조를 형성한다.
[0131]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 지질 또는 PEG에 공유적으로 연결된 PEI 백본을 포함하는 양이온성 리포폴리머이다. 일부 양태에서, PEI 백본은 지질 및 PEG에 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 지질 및 PEG는 공유 결합에 의해 PEI 백본에 직접 부착된다. 일부 양태에서, 지질은 PEG 스페이서를 통해 PEI 백본에 부착된다. 일부 양태에서, PEG는 50 내지 20,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 양태에서, PEG 대 PEI의 몰비는 0.1:1 내지 500:1의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, 지질 대 PEI의 몰비는 0.1:1 내지 500:1의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, C12 내지 C18 지방산, 또는 지방산 유도체이다. 일부 양태에서, PEI는 콜레스테롤 및 PEG에 공유적으로 연결되고, 여기서 양이온성 리포폴리머에서 평균 PEG:PEI:콜레스테롤 몰비는 1 내지 5 PEG:1 PEI:0.4 내지 1.5 콜레스테롤의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, PEI는 100 내지 500,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 또는 분지형 배열을 갖는다.
[0132]
일부 양태에서, 양이온성 리포폴리머는 수용체 리간드, 막 투과제, 엔도솜용해제, 핵 국소화 서열, 및 pH 민감성 엔도솜용해 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 펜던트 작용성 모이어티를 추가로 포함한다.
[0133]
일부 양태에서, 양이온성 리포폴리머는 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 PEI 백본에 직접적으로 부착되거나 PEG 링커를 통해 부착된다. 일부 양태에서, 표적화 리간드는 당 모이어티, 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 단당류이다. 일부 양태에서, 단당류는 갈락토스이다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 올리고당류이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 당단백질, 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체이다. 일부 양태에서, 성장 인자 수용체는 표피 성장 인자 수용체이다. 일부 양태에서, 당단백질은 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)이다. 일부 양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원이다.
[0134]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 양이온성 폴리머는 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0135]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 양이온성 폴리머와 복합체화된 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml(예를 들어, 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml; 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml)의 핵산(예를 들어, DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 mRNA 벡터)을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 양이온성 폴리머와 복합체화된 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml(예를 들어, 약 1 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 2 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 6 mg/ml 내지 약 10 mg/ml)의 핵산(예를 들어, DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 mRNA 벡터)을 포함한다.
[0136]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 리포폴리아민을 포함한다:
(스타라민).
[0137]
일부 양태에서, 전달 성분은 리포폴리아민과 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 혼합물을 포함한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 폴리(L-글루탐산), 스티렌 말레산 무수물, 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 또는 폴리디비닐에테르 말레산 무수물이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
(메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 변형된 스타라민)
상기 식에서, n은 각각 2 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 10 내지 100개의 반복 단위의 정수를 나타낸다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, n = 11이다(스타라민-mPEG515). 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
(스타라민-mPEG11).
일부 양태에서, 혼합물 중의 리포폴리아민 대 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 비는 1:1 내지 10:1이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0138]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 리포폴리아민을 포함한다:
(크로사민).
[0139]
일부 양태에서, 전달 성분은 리포폴리아민과 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 혼합물을 포함한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 폴리(L-글루탐산), 스티렌 말레산 무수물, 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 또는 폴리디비닐에테르 말레산 무수물이다. 일부 양태에서, 혼합물 중의 리포폴리아민 대 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 비는 1:1 내지 10:1이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0140]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 폴록사머 백본의 적어도 하나의 말단에 공유적으로 커플링된 금속 킬레이터를 갖는 폴록사머 백본을 포함한다. 일부 양태에서, 금속 킬레이터는 폴록사머 백본의 적어도 2개의 말단에 커플링된다. 일부 양태에서, 폴록사머 백본은 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 공개 제2010/0004313호에 개시된 폴록사머 백본이다. 일부 양태에서, 금속 킬레이터는 미국 공개 제2010/0004313호에 개시된 금속 킬레이터이다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 폴리머 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:
상기 식에서,
A는 2 내지 141의 정수를 나타내고;
B는 16 내지 67의 정수를 나타내고;
C는 2 내지 141의 정수를 나타내고;
RA 및 RC는 동일하거나 상이하고, R'-L- 또는 H이고, 여기서 RA 및 RC 중 적어도 하나는 R'-L-이고;
L은 결합, -CO-, -CH2-O-, 또는 -O-CO-이고;
R'는 금속 킬레이터이다.
[0141]
일부 양태에서, 금속 킬레이터는 RNNH―, RN2N―, 또는 (R''―(N(R'')―CH2CH2)x)2―N―CH2CO―이고, 여기서 각각의 x는 독립적으로 0 내지 2이고, R''는 HO2C-CH2-이다. 일부 양태에서, 금속 킬레이터는 12-크라운-4, 15-크라운-5, 18-크라운-6, 20-크라운-6, 21-크라운-7, 및 24-크라운-8로 이루어진 군으로부터 선택된 크라운 에테르이다. 일부 양태에서, 크라운 에테르는 치환된-크라운 에테르이고, 여기서 치환된 크라운 에테르는 하기를 갖는다:
(1) NH 또는 S로 독립적으로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 산소,
(2) -C6H4-, -C10H6-, 또는 -C6H10-로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-CH2- 모이어티,
(3) -C4H2O- 또는 -C5H3N-으로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-O-CH2- 모이어티, 또는
(4) 이의 임의의 조합.
[0142]
일부 양태에서, 금속 킬레이터는 크립탄드이고, 여기서 크립탄드는 (1,2,2) 크립탄드, (2,2,2) 크립탄드, (2,2,3) 크립탄드, 및 (2,3,3) 크립탄드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 크립탄드는 치환된-크립탄드이고, 여기서 치환된-크립탄드는 하기를 갖는다:
(1) NH 또는 S로 독립적으로 치환된 하나 이상의 크립탄드 에테르 산소,
(2) -C6H4-, -C10H6-, 또는 -C6H10-로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-CH2- 모이어티,
(3) -C4H2O- 또는 -C5H3N-으로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-O-CH2- 모이어티, 또는
(4) 이의 임의의 조합.
[0143]
일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머(아자-크라운-연결 폴록사머)이고, 여기서 크라운 폴록사머는 하기 화학식을 갖는 폴리머 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 여기서 폴리머의 총 분자량은 약 2,000 Da 내지 약 2,200 Da이다:
상기 식에서,
a는 약 10 단위의 정수를 나타내고;
b는 약 21 단위의 정수를 나타낸다.
[0144]
일부 양태에서, 폴리머는 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다.
[0145]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 β-아미노 에스테르이다. 일부 양태에서, 폴리머는 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다.
[0146]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 폴리-이노신-폴리시티딜산이다. 일부 양태에서, 폴리-이노신-폴리시티딜산은 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다.
[0147]
일부 양태에서, 전달 성분은 벤즈알코늄 클로라이드를 추가로 포함한다.
[0148]
일부 양태에서, 전달 성분은 BD15-12를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 BD15-12 폴리머(N:P)의 비는 5:1이다.
[0149]
일부 양태에서, 전달 성분은 Omnifect를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 Omnifect 폴리머(N:P)의 비는 10:1이다.
[0150]
일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머(아자-크라운-연결 폴록사머)를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 크라운 폴록사머(N:P)의 비는 5:1이다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 PEG-PEI-콜레스테롤(PPC) 리포폴리머를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 Omnifect를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 BD15-12를 포함한다.
[0151]
일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민 및 mPEG 변형된 스타라민을 포함한다. 일부 양태에서, mPEG 변형된 스타라민은 스타라민-mPEG515이다. 일부 양태에서, mPEG 변형된 스타라민은 스타라민-mPEG11이다. 일부 양태에서, 스타라민 대 mPEG 변형된 스타라민의 비는 10:1이다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 폴리머(N:P) 비는 5:1이다. 일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민, mPEG 변형된 스타라민, 및 크라운 폴록사머를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민, 스타라민-mPEG515, 및 크라운 폴록사머를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민, 스타라민-mPEG11, 및 크라운 폴록사머를 포함한다.
[0152]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 동결건조된다.
[0153]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
[0154]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 키트는 유리 바이알을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법에서 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 또는 약학적 조성물을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 조성물, 약학적 조성물, 백신 또는 동결건조된 백신을 재구성하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2), 박테리아 또는 기생충 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하는 방법에서 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
[0155]
또한, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 유효량의 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 반응은 본원에 개시된 하나 이상의 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 보호 면역 반응이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 근육내, 피하, 림프내, 비강내, 또는 복강내 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다.
[0156]
일부 양태에서, 면역 반응은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원에 대한 것이다.
[0157]
일부 양태에서, 면역 반응은 예르시니아 페스티스 항원 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, 또는 rAg85A 항원이다.
[0158]
일부 양태에서, 면역 반응은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원 또는 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원 또는 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, 또는 HSV-2 표면 당단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, 또는 gE2 항원이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, 또는 Pol 항원이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원 또는 G 항원이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, 또는 DEN-80E 항원이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, 또는 VP35 항원이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, 또는 CKD 항원이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), 또는 MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36)이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 또는 융합 단백질 MV-F 항원이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, 또는 S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, 또는 M 단백질 항원이다.
[0159]
일부 양태에서, 면역 반응은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 면역 반응은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편 및 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편에 대한 것이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 본원에 개시된 2개 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편에 대한 것이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된 본원에 개시된 2개 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편에 대한 것이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 동일한 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체를 인코딩하고, 여기서 동일한 SARS-CoV2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체는 SARS-CoV-2의 2개 이상의 상이한 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 면역 반응은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 2개 이상의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편에 대한 것이다. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2); 및 이의 임의의 조합. 일부 양태에서, 상이한 SARS-CoV-2 균주는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: B.1.1.7, Q.1, Q.2, Q.3, Q.4, Q.5, Q.6, Q.7, Q.8, B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3, B.1.617.2, AY.1 하위계통, P.1, P.1.1, P.1.2, B.1.427, B.1.429, B.1.525, B.1.526, B.1.617.1, B.1.617.3, B.1.621, B.1.621.1, P.2, 및 이의 임의의 조합.
[0160]
일부 양태에서, 면역 반응은 기생충 항원에 대한 것이고, 여기서 기생충 항원은 원생동물 항원이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 톡소플라스마 곤디 항원 또는 플라스모디움 팔시파룸 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 또는 서컴스포로자이트 단백질 항원이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 기생충 항원에 대한 것이고, 여기서 기생충 항원은 기생성 또는 병원성 진균 항원이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 칸디다 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충에 대한 것이다.
[0161]
또한, 대상체에서 바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2), 박테리아 또는 기생충 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 근육내, 피하, 림프내, 또는 복강내 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다.
[0162]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 본원에 개시된 전달 성분을 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 조합하는 단계, (b) 조합된 전달 성분 및 폴리뉴클레오티드를 분말로 동결건조시키는 단계, 및 (c) 분말을 희석제로 재구성하여 전달 성분과 복합체화된 핵산의 용액을 형성시키는 단계를 포함한다.
[0163]
또한, 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신이 본원에 제공된다.
[0164]
도 1(FIG. 1)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 2개의 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 인터루킨 12(IL-12) p35 및 IL-12 p40을 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0165] 도 2(FIG. 2)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 2개의 CMV 프로모터의 제어 하에 IL-12 p35 및 IL-12 p40을 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(MHC I)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0166] 도 3(FIG. 3)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 2개의 CMV 프로모터의 제어 하에 IL-12 p35 및 IL-12 p40을 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(MHC II)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0167] 도 4(FIG. 4)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 CMV 프로모터의 제어 하에 인터루킨 2(IL-2)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0168] 도 5(FIG. 5)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-2를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC I를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0169] 도 6(FIG. 6)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-2를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC II를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0170] 도 7(FIG. 7)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-2를 인코딩하는 유전자, 프로모터 Z(Prom-X)의 제어 하에 C-C 모티프 케모카인 리간드 (CCL) 3 (CCL3)를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Y(Prom-Y)의 제어 하에 CCL4를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0171] 도 8(FIG. 8)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 CMV 프로모터의 제어 하에 인터루킨 15(IL-15)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0172] 도 9(FIG. 9)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-15를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC I를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0173] 도 10(FIG. 10)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-15를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC II를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0174] 도 11(FIG. 11)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-15를 인코딩하는 유전자, 프로모터 X(Prom-X)의 제어 하에 CCL3를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Y(Prom-Y)의 제어 하에 CCL4를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0175] 도 12(FIG. 12)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 X(Prom-X)의 제어 하에 CCL3를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Y(Prom-Y)의 제어 하에 CCL4를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0176] 도 13a 내지 13b(FIG. 13a-13b)는 S1 및 S2 서브유닛이 구획된 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 개략도(도 13a) 및 작제물 pVac1 내지 pVac 5의 개요(도 13b)를 제공한다.
[0177] 도 14a 내지 14i(FIG. 14a-14i)는 pVac 벡터를 포함하는 벡터의 개략도를 제공한다. 모든 작제물은 D614G 아미노산 치환을 갖는 부분(S1, 아미노산 15 내지 695) 또는 완전 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(S, 아미노산 1 내지 1273)을 발현한다. S 단백질은 포유동물 EF-1α 프로모터의 제어 하에 있다. 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 pUNO 벡터가 제공된다(도 14a). 도 14b는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 서브유닛을 발현하는 pVac1을 제공한다. 도 14c는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 서브유닛 및 IL-12; 2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하의 단일 유전자(p35 및 p40)를 발현하는 pVac2를 제공한다. 도 14d는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 서브유닛, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열의 제어 하에 SARS-CoV-2 M 항원, 및 인간 이종이량체 사이토카인 IL12; 2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하에 단일 유전자(p35 및 p40)를 발현하는 pVac3을 제공한다. 도 14e(FIG. 14e)는 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 pVac4를 제공한다. 도 14f(FIG. 14f)는 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하고 인간 이종이량체 사이토카인 IL12(2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하에 있는 단일 유전자 p35 및 p40)를 공동-발현하는 pVac5를 제공한다(pVac5; 도 14f). 도 14g(FIG. 14g)는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열의 제어 하에 M 항원과 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하고 인간 이종이량체 사이토카인 IL12; 2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하에 단일 유전자(p35 및 p40)를 공동 발현하는 pVac6을 제공한다. 도 14h(FIG. 14h)는 CMV 프로모터의 제어 하에 M 항원과 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 pVac7을 제공한다. 도 14i(FIG. 14i)는 pVac 1 벡터를 작제하는 데 사용된 p2CMV-V4 백본 벡터를 제공한다.
[0178] 도 15a 내지 15f(FIG. 15a-15f)는 pVac1 형질감염 후 293T 세포 용해물에서 스파이크 S1 단백질 발현(도 15a), pVac1, pVac2, 또는 pVac3으로의 형질감염 후 293T 세포 용해물에서 스파이크 S1 단백질 발현(도 15b), 세포 용해물에서 스파이크 단백질 발현(도 15c) 및 세포 배지(도 15d), pVac2와 pVac 3 둘 모두의 형질감염 후 시험관내 mIL12 발현(도 15e), 및 스파이크 단백질 플라스미드 및 Omnifect로의 형질감염 후 293T 세포 용해물 및 상청액에서 스파이크 단백질 발현 수준(도 15f)을 제공한다.
[0179] 도 16(FIG. 16)은 플라스미드 DNA의 CP 전달이 생체내에서 항원의 발현을 초래한다는 것을 보여준다. CP로 IM 전달에 의해, 리포터 유전자 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 발현하는 플라스미드를 주사한 마우스로부터의 혈액은 접종 후 1, 3, 및 7일에 수집되고 SEAP 효소 활성에 대해 시험되었다. SEAP 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 표시된다. 데이터는 그룹당 5마리 마우스의 산술 평균 역가로 표시된다.
[0180] 도 17a(FIG. 17a)는 전기천공(EP)에 의해 전달된 pVac1로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 SARS-CoV-2 D614G S eGFP 리포터 슈도타입화된 렌티바이러스를 부분적으로 중화시킬 수 있음을 보여준다. 도 17b(FIG. 17b)는 크라운 폴록사머(CP; 아자-크라운-연결된-폴록사머)가 근육내(IM) 경로에 의해 전달된 SARS-CoV-2 D614G S 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA(pVac1 또는 pUNO)로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 IgG 항원-특이적 항체를 생산한다는 것을 보여준다. 도 17c(FIG. 17c)는 CP와 함께 IM으로 전달된 SARS-CoV-2 D614G S 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA(pVac1 또는 pUNO)로 면역화된 마우스로부터의 비장이 15mer S 중첩 펩티드 라이브러리의 존재에서 인터페론 감마(IFNγ)를 생산한다는 것을 보여준다. 도 17c의 각 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
[0181] 도 18(FIG. 18)은 CP에 의해 전달된 pUNO로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 SARS-CoV-2 D614G S eGFP 리포터 슈도타입화된 렌티바이러스를 효과적으로 중화시킬 수 있음을 제공한다.
[0182] 도 19(FIG. 19)는 CP와 IM 전달된 SARS-CoV-2 D614G S 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA(pUNO, pVac2 또는 pVac3)로 면역화된 마우스로부터의 비장이 15mer S 중첩 펩티드 라이브러리의 존재에서 인터페론 감마(IFNγ)를 생산한다는 것을 제공한다. 각각의 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
[0183] 도 20a(FIG. 20a)는 2 또는 3회의 면역화(도 19a) 후 CP DNA 백신 제형(pVac1 및 pUNO 250ug, IM)에 대한 T 세포 반응을 보여준다. 각각의 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 20b(FIG. 20b)는 2 또는 3회의 면역화 후 CP DNA 백신 제형(pVac1 및 pUNO 250ug, IM)에 대한 B 세포 반응을 보여준다. 항체 역가는 2회 면역화된 그룹에 비해 3회 면역화된 그룹에서 더 높다.
[0165] 도 2(FIG. 2)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 2개의 CMV 프로모터의 제어 하에 IL-12 p35 및 IL-12 p40을 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(MHC I)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0166] 도 3(FIG. 3)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 2개의 CMV 프로모터의 제어 하에 IL-12 p35 및 IL-12 p40을 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(MHC II)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0167] 도 4(FIG. 4)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 CMV 프로모터의 제어 하에 인터루킨 2(IL-2)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0168] 도 5(FIG. 5)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-2를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC I를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0169] 도 6(FIG. 6)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-2를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC II를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0170] 도 7(FIG. 7)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-2를 인코딩하는 유전자, 프로모터 Z(Prom-X)의 제어 하에 C-C 모티프 케모카인 리간드 (CCL) 3 (CCL3)를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Y(Prom-Y)의 제어 하에 CCL4를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0171] 도 8(FIG. 8)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 CMV 프로모터의 제어 하에 인터루킨 15(IL-15)를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0172] 도 9(FIG. 9)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-15를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC I를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0173] 도 10(FIG. 10)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-15를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Z(Prom-Z)의 제어 하에 MHC II를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0174] 도 11(FIG. 11)은 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, CMV 프로모터의 제어 하에 IL-15를 인코딩하는 유전자, 프로모터 X(Prom-X)의 제어 하에 CCL3를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Y(Prom-Y)의 제어 하에 CCL4를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0175] 도 12(FIG. 12)는 플라스미드 백본에서 프로모터 1(Prom-1)의 제어 하에 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 2(Prom-2)의 제어 하에 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 유전자, 프로모터 X(Prom-X)의 제어 하에 CCL3를 인코딩하는 유전자, 및 프로모터 Y(Prom-Y)의 제어 하에 CCL4를 인코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 작제물의 개략도를 제공한다.
[0176] 도 13a 내지 13b(FIG. 13a-13b)는 S1 및 S2 서브유닛이 구획된 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 개략도(도 13a) 및 작제물 pVac1 내지 pVac 5의 개요(도 13b)를 제공한다.
[0177] 도 14a 내지 14i(FIG. 14a-14i)는 pVac 벡터를 포함하는 벡터의 개략도를 제공한다. 모든 작제물은 D614G 아미노산 치환을 갖는 부분(S1, 아미노산 15 내지 695) 또는 완전 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(S, 아미노산 1 내지 1273)을 발현한다. S 단백질은 포유동물 EF-1α 프로모터의 제어 하에 있다. 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 pUNO 벡터가 제공된다(도 14a). 도 14b는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 서브유닛을 발현하는 pVac1을 제공한다. 도 14c는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 서브유닛 및 IL-12; 2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하의 단일 유전자(p35 및 p40)를 발현하는 pVac2를 제공한다. 도 14d는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 서브유닛, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열의 제어 하에 SARS-CoV-2 M 항원, 및 인간 이종이량체 사이토카인 IL12; 2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하에 단일 유전자(p35 및 p40)를 발현하는 pVac3을 제공한다. 도 14e(FIG. 14e)는 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 pVac4를 제공한다. 도 14f(FIG. 14f)는 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하고 인간 이종이량체 사이토카인 IL12(2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하에 있는 단일 유전자 p35 및 p40)를 공동-발현하는 pVac5를 제공한다(pVac5; 도 14f). 도 14g(FIG. 14g)는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열의 제어 하에 M 항원과 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하고 인간 이종이량체 사이토카인 IL12; 2개의 별개의 CMV 프로모터의 제어 하에 단일 유전자(p35 및 p40)를 공동 발현하는 pVac6을 제공한다. 도 14h(FIG. 14h)는 CMV 프로모터의 제어 하에 M 항원과 D614G 돌연변이를 갖는 전장 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 pVac7을 제공한다. 도 14i(FIG. 14i)는 pVac 1 벡터를 작제하는 데 사용된 p2CMV-V4 백본 벡터를 제공한다.
[0178] 도 15a 내지 15f(FIG. 15a-15f)는 pVac1 형질감염 후 293T 세포 용해물에서 스파이크 S1 단백질 발현(도 15a), pVac1, pVac2, 또는 pVac3으로의 형질감염 후 293T 세포 용해물에서 스파이크 S1 단백질 발현(도 15b), 세포 용해물에서 스파이크 단백질 발현(도 15c) 및 세포 배지(도 15d), pVac2와 pVac 3 둘 모두의 형질감염 후 시험관내 mIL12 발현(도 15e), 및 스파이크 단백질 플라스미드 및 Omnifect로의 형질감염 후 293T 세포 용해물 및 상청액에서 스파이크 단백질 발현 수준(도 15f)을 제공한다.
[0179] 도 16(FIG. 16)은 플라스미드 DNA의 CP 전달이 생체내에서 항원의 발현을 초래한다는 것을 보여준다. CP로 IM 전달에 의해, 리포터 유전자 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 발현하는 플라스미드를 주사한 마우스로부터의 혈액은 접종 후 1, 3, 및 7일에 수집되고 SEAP 효소 활성에 대해 시험되었다. SEAP 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 표시된다. 데이터는 그룹당 5마리 마우스의 산술 평균 역가로 표시된다.
[0180] 도 17a(FIG. 17a)는 전기천공(EP)에 의해 전달된 pVac1로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 SARS-CoV-2 D614G S eGFP 리포터 슈도타입화된 렌티바이러스를 부분적으로 중화시킬 수 있음을 보여준다. 도 17b(FIG. 17b)는 크라운 폴록사머(CP; 아자-크라운-연결된-폴록사머)가 근육내(IM) 경로에 의해 전달된 SARS-CoV-2 D614G S 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA(pVac1 또는 pUNO)로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 IgG 항원-특이적 항체를 생산한다는 것을 보여준다. 도 17c(FIG. 17c)는 CP와 함께 IM으로 전달된 SARS-CoV-2 D614G S 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA(pVac1 또는 pUNO)로 면역화된 마우스로부터의 비장이 15mer S 중첩 펩티드 라이브러리의 존재에서 인터페론 감마(IFNγ)를 생산한다는 것을 보여준다. 도 17c의 각 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
[0181] 도 18(FIG. 18)은 CP에 의해 전달된 pUNO로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 SARS-CoV-2 D614G S eGFP 리포터 슈도타입화된 렌티바이러스를 효과적으로 중화시킬 수 있음을 제공한다.
[0182] 도 19(FIG. 19)는 CP와 IM 전달된 SARS-CoV-2 D614G S 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA(pUNO, pVac2 또는 pVac3)로 면역화된 마우스로부터의 비장이 15mer S 중첩 펩티드 라이브러리의 존재에서 인터페론 감마(IFNγ)를 생산한다는 것을 제공한다. 각각의 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
[0183] 도 20a(FIG. 20a)는 2 또는 3회의 면역화(도 19a) 후 CP DNA 백신 제형(pVac1 및 pUNO 250ug, IM)에 대한 T 세포 반응을 보여준다. 각각의 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 20b(FIG. 20b)는 2 또는 3회의 면역화 후 CP DNA 백신 제형(pVac1 및 pUNO 250ug, IM)에 대한 B 세포 반응을 보여준다. 항체 역가는 2회 면역화된 그룹에 비해 3회 면역화된 그룹에서 더 높다.
본 개시의 상세한 설명
5.1
개요
[0184]
본 개시의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 mRNA), 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 및 백신은, 예를 들어, 하나 이상의 수준에서 DNA-기반 백신 접근법과 종종 관련된 차선의 면역원성의 문제를 다룬다. 첫째로, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 사이토카인 및 케모카인과 같은 강력한 면역 개질제를 공동-발현할 수 있다. 둘째로, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 바이러스 항원 대신 다중 바이러스 항원 및/또는 바이러스 항원의 다중 에피톰을 포함할 수 있으며, 이는 면역원성의 스펙트럼을 확장시키기 위해 본원에 개시된 벡터로부터 공동-발현될 수 있다. 셋째로, 일부 양태에서, 백신 효율을 추가로 개선하기 위해, 본원에 개시된 벡터는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 뉴클레아제 분해로부터 보호하고 세포 구획을 통한 이의 전위를 촉진하는 전달 시스템(예를 들어, 본원에 개시된 전달 성분)으로 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 전달 시스템은 또한 백신 전달 및 항원 발현 부위로의 항원 제시 세포의 동원을 촉진하는 애주번트 성질을 나타내도록 제형화될 수 있고, 이에 의해 백신 벡터 및 발현된 바이러스 항원의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 제시를 유도하기 위한 전문 항원 제시 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 문헌[Greenland, J.R., et al., Molecular Therapy, 12(1):164-70 (2005)](이하 "Greenland 2005") 및 문헌[Suschak, J.J., et al., Human Vaccines & Immunotherapeutics, 13(12):2837-48 (2017)](이하 "Suschak 2017")을 참조한다.
[0185]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, SARS CoV-2 항원)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 2개 이상의 SARS-CoV-2 균주로부터의 바이러스 항원(예를 들어, S 단백질, S 단백질의 S1 서브유닛, S 단백질의 RBD, S 단백질의 막 융합 도메인, M 단백질, E 단백질, 또는 이의 항원성 단편)을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 하나 이상의 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 항원 및 임의로 제2 바이러스 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 항원 및 상이한 SARS CoV-2 균주로부터의 제2 SARS CoV-2 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 S 단백질 항원 및 상이한 SARS CoV-2 균주로부터의 제2 SARS CoV-2 S 단백질 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
[0186]
일부 양태에서, 본 개시는 (a) 제1 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제1 항원 핵산; 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 플라스미드 또는 다중시스트론성 mRNA)에 관한 것이다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (c) 제2 병원체 항원(예를 들어, 제2 SARS-CoV-2 단백질 항원 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 개시의 핵산 분자는 본 발명의 핵산 분자를 자연에 존재하는 것과 구별하는 하나 이상의 특징을 포함한다(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자 및 면역 개질제를 인코딩하는 유전자를 포함하는). 임의의 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 일부 양태에서, 다중 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 항원)의 발현은 면역원성의 스펙트럼을 확장시키는 반면, 적어도 하나의 면역 개질제의 발현은 다중 병원체 항원에 대한 면역 반응을 증가시킨다. 일부 양태에서, 병원체 항원은 바이러스 병원체 항원, 박테리아 병원체 항원, 또는 기생충 병원체 항원이다.
[0187]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 제1 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제1 항원 핵산으로서, 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 핵산; (b) 제2 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제2 핵산으로서, 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산; 및 (c) 면역 개질제를 인코딩하는 제3 핵산으로서, 제3 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3 핵산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 도 1 내지 12 중 임의의 것에 개시된 바와 같은 요소를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 도 1 내지 12 중 임의의 것에 예시된 벡터 작제물은 "Covid-19 스파이크 유전자"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및 "Covid-19 유전자-2"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)를 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다.
[0188]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 (a) 제1 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제1 핵산으로서, 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 핵산; (b) 제2 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제2 핵산으로서, IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산; 및 (c) 제1 면역 개질제를 인코딩하는 제3 핵산으로서, 제3 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3 핵산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 면역 개질제를 인코딩하는 제4 핵산을 추가로 포함하고, 여기서 제4 핵산은 제4 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 도 14c(pVac 2), 14d(pVac 3), 14f(pVac 5), 또는 14g(pVac 6) 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 요소를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 도 14c(pVac 2), 14d(pVac 3), 14f(pVac 5), 또는 14g(pVac 6) 중 어느 하나에 예시된 벡터 작제물은 SARS-CoV-2 전장 표면(S) 단백질, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및/또는 SARS-CoV-2 막(M) 단백질(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제2 핵산)을 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다.
[0189]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제1 핵산을 포함할 수 있고, 여기서 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 병원체 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편)을 인코딩하는 제2 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제2 핵산은 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및 제2 병원체 항원은 상이한 SARS CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 항원이다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및 제2 병원체 항원은 동일한 SARS-CoV-2 항원의 상이한 변이체이고, 여기서 동일한 SARS-CoV-2 항원의 상이한 변이체는 SARS CoV-2의 상이한 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및 제2 병원체 항원은 SARS-CoV-2 S 단백질 항원의 상이한 변이체이고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 항원의 상이한 변이체는 SARS CoV-2의 상이한 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 프로모터를 추가로 포함하고, 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 도 14b(pVac 1), 14 e(pVac 4), 또는 14h(pVac 7) 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 요소를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 도 14b(pVac 1), 14e(pVac 4), 또는 14h(pVac 7) 중 어느 하나에 예시된 벡터 작제물은 SARS-CoV-2 전장 표면(S) 단백질, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및/또는 SARS-CoV-2 막(M) 단백질(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제2 핵산)을 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다.
[0190]
일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 알파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 ΔH69-V70, Δ144, E484K, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, 및 D1118H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 베타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, D80A, D215G, ΔL241-S243, K417N, E484K, N501Y, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 감마 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, 및 V1176F로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 델타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T19R, ΔD119-F120, ΔE156-F157, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 카파 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, 및 Q1071H로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 에타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 Q52R, A67V, ΔH69-V70, ΔY144, E484K, D614G, Q677H, 및 F888L로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 이오타 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 L5F, T95I, D253G, E484K, D614G, 및 A701V로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 람다 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 G75V, T76I, ΔR246-G252, D253N, L452Q, F490S, D614G, 및 T859N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 뮤 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 T95I, Y144S, Y145N, R346K, E484K, N501Y, D614G, P681H, 및 D950N으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및/또는 제2 병원체 항원은 엡실론 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편으로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편은 S13I, W152C, L452R, 및 D614G로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0191]
일부 양태에서, 본 개시는 또한 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물은 전달 성분(예를 들어, 양이온성 폴리머, 예컨대, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머, PEG-PEI-콜레스테롤(PPC) 리포폴리머, 리포폴리아민, 또는 리포폴리아민 유도체)를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, PEG-PEI-콜레스테롤(PPC) 리포폴리머는 2.5:1:0.6의 평균 PEG:PEI:콜레스테롤 비를 갖는다.
[0192]
일부 양태에서, 전달 성분은 애주번트 성질을 나타낸다. 임의의 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 일부 양태에서, 전달 성분의 애주번트 성질은 백신 전달 및 항원 발현 부위로의 항원 제시 세포의 동원을 촉진하여, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 제시를 유발하는 전문 항원 제시 세포로의 폴리뉴클레오티드 및 발현된 항원의 흡수를 증가시킨다. 일부 양태에서, 본 개시는 (i) 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, SARS CoV-2 항원)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 메신저 RNA(mRNA) 벡터) 및 (ii) 전달 성분(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 포함하는 백신 또는 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 벡터는 하나 이상의 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 항원 및 임의로 제2 바이러스 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 항원 및 상이한 SARS CoV-2 균주로부터의 제2 SARS CoV-2 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 S 단백질 항원 및 상이한 SARS CoV-2 균주로부터의 제2 SARS CoV-2 S 단백질 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
[0193]
일부 양태는 본 개시의 벡터 또는 조성물의 생체내 투여 후 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2) 공격 또는 감염에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다.
[0194]
본 개시는 또한 유효량의 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는 또한 유효량의 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 감염은 SARS-CoV-2 바이러스 감염이다. 본 개시는 또한 본원에 개시된 임의의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
5.2
정의
[0195]
본 개시가 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 우선 특정 용어가 정의된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어 각각은 하기에 기재된 의미를 가질 것이다. 추가 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.
[0196]
본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 없이 2개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 양태들 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
[0197]
양태가 본원에서 "포함하는"이라는 언어로 설명될 때마다, "~로 이루어지는" 및/또는 "~로 필수적으로 이루어지는"과 관련하여 설명된 달리 유사한 양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
[0198]
본원에서 사용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 언급된 기준 값과 유사하고, 달리 언급되지 않거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 언급된 기준 값의 어느 한 방향으로(크거나 작음) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위 내에 있는 값을 지칭한다. 용어 "대략" 또는 "약"이 본원에서 특정 값에 적용될 때, 용어 "대략" 또는 "약"이 없는 값이 또한 본원에 개시된다.
[0199]
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우, 이의 분수(예컨대, 정수의 10 분의 1 및 100 분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[0200]
본원에서 사용되는 용어 "ug" 및 "uM"은 각각 "μg" 및 "μM"과 상호교환적으로 사용된다.
[0201]
단위, 접두사, 및 기호는 SI(Systeme International de Unites) 승인 형식으로 표시된다. 수치 범위는 상기 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 본원에 제공된 표제는 본 개시의 다양한 양태들의 제한이 아니며, 명세서 전체를 참조하여 정의할 수 있다. 이에 따라, 하기에 바로 정의되는 용어들은 그 전체가 명세서를 참조하여 더 완전하게 정의된다.
[0202]
본원에서 사용되는 용어 "코로나바이러스" 또는 "CoV"는 코로나바이러스과에 대한 일반적인 명칭을 지칭한다. 인간에서, CoV는 호흡기 감염을 유발하며, 이는 전형적으로 경증이지만 SARS(중증 급성 호흡기 증후군)-CoV, MERS(중동 호흡기 증후군)-CoV, 및 SARS-CoV-2와 같은 드문 형태에서는 치명적일 수 있다. CoV는 나선 대칭의 뉴클레오캡시드를 갖고, 게놈 크기는 약 26 내지 약 32 킬로염기의 범위이다. 다른 예시적인 인간 CoV는 CoV 229E, CoV NL63, CoV OC43, CoV HKU1, 및 CoV HKU20을 포함한다. CoV의 외피는 3개의 당단백질을 운반한다: 스파이크(S) 단백질(수용체 결합, 세포 융합, 주요 항원); 외피(E) 단백질(작은 엔벨로프-관련 단백질); 및 막(M) 단백질(출아 및 외피 형성). 몇 가지 유형의 CoV에는 제4 당단백질인 헤마글루티닌-에스테라제(HE) 단백질이 있다. 게놈은 5' 메틸화된 캡 및 3' 폴리-A를 갖고 mRNA로서 직접적으로 기능한다. 인간 세포로의 CoV의 진입은 세포내이입 및 막 융합을 통해 발생하고; 복제는 세포의 세포질에서 일어난다. CoV는 호흡기 분비물의 에어로졸, 분변-경구 경로, 및 역학적 전염에 의해 전염된다. 대부분의 바이러스 성장은 상피 세포에서 발생한다. 때때로, 간, 신장, 심장 또는 눈뿐만 아니라 대식세포와 같은 다른 세포 유형이 감염될 수 있다.
[0203]
본원에서 사용되는 용어 "SARS-CoV-2"는 COVID-19 팬데믹의 원인이 되는 호흡기 질환인 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 유발하는 코로나바이러스의 균주를 지칭한다. 분류학적으로, SARS-CoV-2는 사르베코바이러스 아속(베타-CoV 계통 B)의 구성원이며 SARS-CoV의 균주이다. 이는 동물원성 기원을 갖는 것으로 여겨지며 박쥐 코로나바이러스와 유전적으로 매우 유사하여 박쥐-매개 바이러스에서 유래되었음을 시사한다. 이의 RNA 서열은 길이가 대략 30,000개 염기이다. SARS-CoV-2는 다른 바이러스에서 병원성 및 전염성을 증가시키는 것으로 알려진 특성인 다염기 절단 부위의 이의 혼입에서 공지된 베타코로나바이러스 중에서 독특하다. 다른 코로나바이러스와 마찬가지로, SARS-CoV-2는 S(스파이크), E(외피), M(막), 및 N(뉴클레오캡시드) 단백질의 4가지 구조 단백질을 갖는다. N 단백질은 RNA 게놈을 보유하고, S, E, 및 M 단백질은 함께 바이러스 외피를 생성한다. 스파이크 단백질은 바이러스가 숙주 세포의 막에 부착되고 이와 융합되게 하는 역할을 하는 단백질이고; 구체적으로, 이의 S1 서브유닛은 부착, S2 서브유닛 융합을 촉매작용한다. 바이러스의 스파이크 단백질에 대한 단백질 모델링 실험은 SARS-CoV-2가 인간 세포 상의 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 대해 이들을 세포 진입의 기전으로 사용하기에 충분한 친화성을 갖는다는 것을 시사하였다. 문헌[Xu, X, et al., Science China Life Sciences, 63(3):457-60 (2020)]을 참조한다. SARS-CoV-2는 또한 바시긴을 사용하여 세포 진입을 도울 수 있다. 문헌[Wang, K., et al., bioRxiv, doi:10.1101/2020.03.14.988345 (2020)]을 참조한다.
[0204]
용어 "핵산", "핵산 분자," "뉴클레오티드", "뉴클레오티드(들) 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자", mRNA 포함) 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 폴리머 형태, 또는 이의 임의의 포스포에스테르 유사체, 예컨대, 단일 가닥 형태 또는 이중-가닥 나선의 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일-가닥 DNA(ssDNA) 또는 단일-가닥 RNA(ssRNA)를 지칭한다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조만을 지칭하며, 이를 임의의 특정 3차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편), 플라스미드, 초나선 DNA 및 염색체에서 발견되는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중-가닥 DNA 분자의 구조를 논의함에 있어서, 서열은 DNA의 비-전사된 가닥(즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3'로의 방향으로의 서열만을 제공하는 정상적인 관례에 따라 본원에 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, DNA 플라스미드, 합성 DNA, 및 반-합성 DNA를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 개시의 "핵산 조성물"은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다.
[0205]
RNA는, 예를 들어, 세포 내부에서 DNA-서열의 전사에 의해 수득될 수 있다. 진핵 세포에서, 전사는 전형적으로 핵 또는 미토콘드리아 내부에서 수행된다. 생체내에서, DNA의 전사는 일반적으로 미성숙 RNA를 초래하고, 이는 메신저 RNA(mRNA)로 가공되어야 한다. 예를 들어, 진핵 유기체에서 미성숙 RNA의 가공은 스플라이싱, 5'-캡핑, 폴리아데닐화, 핵 또는 미토콘드리아로부터의 외수송 등과 같은 다양한 여러 전사후-변형을 포함한다. 이들 과정은 합하여 또한 RNA의 성숙으로 지칭된다. 성숙한 mRNA는 일반적으로 특정 펩티드, 단백질, 또는 단백질 항원의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 전형적으로, 성숙한 mRNA는 5' 캡, 임의로 5'-UTR, 개방형 해독틀, 임의로 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다.
[0206]
본원에서 사용되는 용어 "다중시스트론성 mRNA" 또는 "다중시스트론성 mRNA 벡터"는 2개 이상의 개방형 해독틀을 갖는 mRNA를 지칭한다. 이러한 맥락에서 개방형 해독틀은 폴리펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 코돈의 서열이다.
[0207]
본원에서 사용되는 용어 "5'-캡"은 전형적으로 성숙한 mRNA의 5'-말단을 "캡핑"하는 개체, 전형적으로 변형된 뉴클레오티드 개체를 지칭한다. 5'-캡은 전형적으로 변형된 뉴클레오티드, 특히 구아닌 뉴클레오티드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 일부 양태에서, 5'-캡은 5'-5'-트리포스페이트 연결을 통해 5'-말단에 연결된다. 5'-캡은 메틸화될 수 있고, 예를 들어, m7GpppN이고, 여기서 N은 5'-캡, 전형적으로 RNA의 5'-말단을 보유하는 핵산의 말단 5' 뉴클레오티드이다. 자연 발생 5'-캡은 m7GpppN이다.
[0208]
"폴리(A) 꼬리" 또는 "3'-폴리(A) 꼬리"로도 불리는, 본원에서 사용되는 "폴리(A) 서열"은 전형적으로 아데닌 뉴클레오티드, 예를 들어, 최대 약 400개의 아데닌 뉴클레오티드의 서열인 것으로 이해된다. 폴리(A) 서열은 mRNA의 3' 말단에 위치할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리(A) 서열은 또한 mRNA 또는 임의의 다른 핵산 분자 내에, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, RNA의 생성을 위한 주형으로서 작용하는 벡터, 바람직하게는 예를 들어, 벡터의 전사에 의한 mRNA 내에 위치할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리(A) 서열은 본원에 정의된 바와 같은 mRNA의 3'-UTR에 존재한다.
[0209]
일부 양태에서, 3'-UTR 서열은 단백질 코딩 영역(즉, 개방형 해독틀)과 mRNA 분자의 3' 말단 사이에 위치하는 mRNA의 일부이다. 3'-말단 폴리(A) 서열('폴리(A) 꼬리')이 RNA에 첨가된 경우(예를 들어, 폴리아데닐화에 의해), 용어 3'-UTR은 단백질 코딩 영역과 3'-말단 폴리(A) 서열 사이에 위치한 분자의 해당 부분을 지칭할 수 있다. 일부 양태에서, 3'-UTR은 또한 폴리(A) 서열(예를 들어, RNA 분자의 바로 3' 말단에 위치하지 않는 폴리(A) 서열)을 포함할 수 있다. mRNA의 3'-UTR은 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 3'-UTR 서열은 일반적으로 유전자에 의해 인코딩되며, 이는 유전자 발현 과정 동안 각각의 mRNA로 전사된다. 게놈 서열은 먼저 선택적 인트론을 포함하는 미성숙 mRNA로 전사된다. 미성숙 mRNA는 이후 성숙 과정에서 성숙한 mRNA로 추가로 가공된다. 이러한 성숙 과정은 5' 캡핑, 선택적인 인트론 및 3'-말단의 변형을 절단하도록 미성숙 mRNA를 스플라이싱, 예를 들어, 미성숙 mRNA의 3'-말단의 폴리아데닐화 및 임의의 엔도-/엑소뉴클레아제 절단 등의 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 3'-UTR은 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 3'에 위치하는(예를 들어, 단백질 코딩 영역의 종결 코돈의 바로 3'에 위치하는) 성숙한 mRNA의 서열에 상응하고, 이는 RNA 분자의 3' 말단 또는 3' 말단 폴리(A) 서열의 5'-측으로(예를 들어, 3' 말단의 바로 5' 또는 3' 말단 폴리(A) 서열의 바로 5'의 뉴클레오티드로) 연장된다. 용어 "~에 상응하는"은 3'-UTR 서열이 3'-UTR 서열을 지정하는 데 사용되는 mRNA 서열에서와 같은 RNA 서열, 또는 이러한 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있음을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "유전자의 3'-UTR", 예컨대, "알파 또는 베타 글로빈의 3'-UTR"은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙한 mRNA, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 수득된 mRNA의 3'-UTR에 상응하는 서열이다. 용어 "유전자의 3'-UTR"은 3'-UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포괄한다. 일부 양태에서, 3'-UTR은 향상된 반-유사(즉, 안정한 mRNA를 제공함)를 갖는 mRNA와 관련된 유전자로부터 유래되고, 예를 들어, 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 티로신 하이드록실라제 유전자, 리폭시게나제 유전자, 및 콜라겐 알파 1(I) 유전자와 같은 콜라겐 알파 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 3'-UTR이다.
[0210]
5'-UTR은 전형적으로 메신저 RNA(mRNA)의 특정 섹션인 것으로 이해된다. 이는 mRNA의 개방형 해독틀의 5'에 위치한다. 일부 양태에서, 5'-UTR은 전사 개시 부위에서 시작하여 개방형 해독틀의 개시 코돈 전에 하나의 뉴클레오티드로 끝난다. 5'-UTR은 조절 요소로도 불리는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는, 예를 들어, 리보솜 결합 부위 또는 5'-말단 올리고피리미딘 트랙트일 수 있다. 5'-UTR은, 예를 들어, 5'-캡의 첨가에 의해 전사후 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 5'-UTR은 5' 캡과 개시 코돈 사이에 위치하는 성숙한 mRNA의 서열에 상응한다. 일부 양태에서, 5'-UTR은 5'-캡의 3'에 위치한 뉴클레오티드로부터(예를 들어, 5' 캡의 바로 3'에 위치한 뉴클레오티드로부터) 단백질 코딩 영역의 개시 코돈의 5'에 위치한 뉴클레오티드로(예를 들어, 단백질 코딩 영역의 개시 코돈의 바로 5'에 위치한 뉴클레오티드로) 연장되는 서열에 상응한다. 성숙한 mRNA의 5' 캡의 바로 3'에 위치한 뉴클레오티드는 전형적으로 전사 개시 부위에 상응한다. 용어 "~에 상응하는"은 5'-UTR 서열이 5'-UTR 서열을 지정하는 데 사용되는 mRNA 서열에서와 같은 RNA 서열, 또는 이러한 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있음을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "유전자의 5'-UTR"은 이러한 유전자로부터 유래된 성숙한 mRNA의 5'-UTR에 상응하는 서열이다.
[0211]
본원에서 사용되는 용어 "형질감염시키는" 또는 "형질감염"은 특히 세포질 및/또는 세포 핵과 관련하여 세포 외부 환경으로부터 내부 세포 환경으로 핵산의 수송을 지칭한다. 임의의 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 핵산은 하나 이상의 양이온성 폴리머/핵산 복합체 내에 캡슐화되거나 이에 부착되거나 함께 함유된 후 세포에 전달될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 특정 형질감염 사례는 핵산을 세포 핵으로 전달한다. 핵산은 DNA 및 RNA뿐만 아니라 이의 합성 동족체를 포함한다. 이러한 핵산은 미스센스, 안티센스, 넌센스, 뿐만 아니라 단백질 생산 뉴클레오티드, 단백질, 펩티드, 및 핵산 생산을 제어하는 온 및 오프 및 레이트 조절 뉴클레오티드를 포함한다. 특히, 이로 제한되지는 않지만, 이들은 천연 또는 인공 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 혼성 서열 또는 합성 또는 반-합성 서열일 수 있다. 또한, 핵산은 올리고뉴클레오티드에서 염색체에 이르기까지 크기가 다양할 수 있다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물성, 박테리아, 바이러스, 또는 합성 기원의 것일 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수득될 수 있다.
[0212]
본원에서 사용되는 용어 "생분해성" 또는 "생분해"는 가용화 가수분해에 의해, 또는 유기체의 효소 및 다른 산물일 수 있는 생물학적으로 형성된 개체의 작용에 의해 물질이 덜 복잡한 중간체 또는 최종 산물로 전환되는 것으로 정의된다.
[0213]
본원에서 사용되는 "펩티드"는 임의의 길이의 펩티드를 의미하고 단백질을 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "올리고펩티드"는 특정 크기가 달리 언급되지 않는 한, 임의의 특정 의도된 크기 제한 없이 본원에서 사용된다.
[0214]
본원에서 사용되는 탄수화물의 "유도체"는, 예를 들어, 당의 산 형태, 예를 들어, 글루쿠론산; 당의 아민, 예를 들어, 갈락토사민; 당의 포스페이트, 예를 들어, 만노스-6-포스페이트 등을 포함한다.
[0215]
본원에서 사용되는 용어 "역말단 반복부"(또는 "ITR")는 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열 다음에 이의 역 상보체가 후속하는 것을 지칭한다. 초기 서열과 역보체 사이의 뉴클레오티드의 개재 서열은 0(제로)을 포함하는 임의의 길이일 수 있다.
[0216]
"투여하는" 및 유사한 용어는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 대상체에게 치료제(예를 들어, 본원에 기재된 핵산 분자, 벡터, 조성물, 및 약학적 조성물)를 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 경구, 척수내, 국소 경막외, 흉골내, 표피, 점막, 비강내, 질, 직장, 설하 투여, 및 이의 조합을 포함한다. 투여는 또한, 예를 들어, 1회, 다회, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
[0217]
대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 관련된 증상, 합병증, 병태, 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증 또는 재발의 역전, 완화, 개선, 억제, 감속, 또는 예방의 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정 또는 대상체로의 활성제 투여를 지칭한다.
[0218]
본원에서 사용되는 "치료적 유효량", "유효량", "치료 용량", "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 본원에 기재된 바와 같은 치료 목표를 달성하는 양 또는 용량을 의미한다. 당업자는 치료적 유효량 등이 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 다중 용량(즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 용량)의 투여에 의해 달성될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 질환 퇴행을 촉진하거나 질환의 발달 또는 재발을 억제하는 치료제의 능력은 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서와 같이 당업자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 또는 시험관내 검정에서 제제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
[0219]
본원에서 사용되는 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질환 또는 병태가 발병하지 않았지만, 질환 또는 병태가 발병할 위험이 있거나 발병하기 쉬운, 대상체에서 질환 또는 병태를 발병할 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
[0220]
본원에서 사용되는 용어 "애주번트"는 백신에 대한 신체의 반응을 개선하는 임의의 성분을 지칭한다.
[0221]
본원에서 사용되는 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역원적 활성 조성물을 지칭한다. 따라서, 일부 양태에서, 백신은 항원을 포함하거나 전달하는 의약이며, 백신접종에 의해 특정 방어 및 보호 물질을 생성하기 위해 인간 또는 동물에서 사용되도록 의도된다.
[0222]
본원에서 사용되는 용어 "면역을 유도하는" 또는 "면역원적 활성"은 면역 반응을 자극하는, 즉, 항체, 특히 체액성 항체의 생산을 자극하거나, 세포-매개 반응을 자극하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 순환 또는 분비 항체의 생산 또는 국소 점막 영역, 말초 혈액, 뇌척수액 등에서 세포-매개 반응의 생성을 자극하는 능력을 지칭한다. 일부 양태에서, 본 개시의 면역원적 활성 성분(들)의 유효 면역량은 다양할 수 있고, 면역 반응을 유발하고 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 보호 면역 반응을 제공하기에 충분한 임의의 양일 수 있다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 플라스미드 DNA)를 포함하는 투여 단위가 고려된다. 환자 당 적어도 하나의 투여 단위가 본원에서 백신접종 요법으로 고려된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 투여 단위가 유용할 수 있다. 당업자는 투여 단위 당 특정량의 백신 조성물 뿐만 아니라 백신접종 요법 당 투여 단위의 총 수가 유효 면역량의 바이러스 또는 이의 성분이 궁극적으로 대상체에게 전달되는 한 최적화될 수 있음을 빠르게 인지할 것이다.
[0223]
조성물 또는 백신과 같은 물질에 대한 "면역학적 반응"은 대상체에서 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 발달이다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 하기 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 관심의 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 유도되는, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산. 일부 양태에서, 대상체는 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 수 있어서, 새로운 감염에 대한 내성이 향상되고/거나 질환의 임상 중증도가 감소될 것이다. 일부 양태에서, 이러한 보호는 감염된 대상체에 의해 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 부족, 보다 빠른 회복 시간 및/또는 감염된 대상체에서 감소된 바이러스 역가에 의해 입증될 수 있다.
[0224]
본 개시의 항원성 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편 또는 변이체일 수 있는 것으로 인식된다. 일부 양태에서, 용어 "활성 단편" 또는 "활성 변이체" 또는 "항원 단편"은 폴리펩티드의 항원 특성의 전부 또는 일부를 보유하는 단편 또는 변이체를 지칭한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시는 대상체에서 면역원성 반응을 유발하는 임의의 SARS-CoV-2 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 포괄한다. SARS-CoV-2 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은, 이로 제한되지는 않지만, 대상체에서 반응을 유발하거나, 유도하거나, 자극하는 단백질, 펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체와 같은 임의의 SARS-CoV-2 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원일 수 있다. SARS-CoV-2 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 알파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.1.7 및 Q.1 내지 Q.8); 베타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.351, B.1.351.2, 및 B.1.351.3); 델타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.2 및 AY.1 하위계통); SARS-CoV-2 균주 감마 균주(예를 들어, 균주 P.1, P.1.1, 및 P.1.2); 엡실론 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.427 및 B.1.429); 에타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.525); 이오타 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.526); 카파 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.617.1); 람다 SARS-CoV-2 균주; B.1.617.3 SARS-CoV-2 균주; 뮤 SARS-CoV-2 균주(예를 들어, 균주 B.1.621 및 B.1.621.1); 또는 제타 균주(예를 들어, 균주 P.2)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 SARS-CoV-2의 임의의 균주로부터 유래될 수 있다. SARS-CoV-2 변이체에 대한 돌연변이 및 바이러스 서열 데이터는 각각 그 전체가 인용에 의해 포함되는 CoVariants 웹사이트(https://covariants.org/) 및 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 웹사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/sars-cov-2)에서 공개적으로 이용 가능하다.
[0225]
용어 "에피토프"는 특정 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐 상의 부위를 지칭한다. 상기 용어는 또한 "항원 결정기" 또는 "항원 결정기 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력을 보여주는 간단한 면역검정에서 확인될 수 있다.
[0226]
본원에서 사용되는 용어 "약학적 제제", "약학적 조성물" 또는 "약물" 또는 임의의 다른 유사한 용어는 요망되는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도하는 당 분야에 이전에 공지된 방법에 의한 및/또는 본 개시에 교시된 방법에 의한 투여에 적합한 임의의 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하고, 이로 제한되지는 않지만, (1) 유기체에 대한 예방 효과를 갖고 바람직하지 않은 생물학적 효과, 예컨대, 감염을 예방하는 것, (2) 질환에 의해 초래된 병태를 경감시키는 것, 예를 들어, 질환의 결과로서 초래되는 통증 또는 염증을 경감시키는 것, 및/또는 (3) 유기체로부터 질환을 경감, 감소 또는 완전히 제거하는 것을 포함할 수 있다. 효과는 국소적이거나 효과는 전신적일 수 있다.
[0227]
"약학적으로 허용되는 담체"는, 제제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고, 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 치료량의 제제를 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 비독성인 담체를 지칭한다. 특정 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 수성 용매, 즉, 임의로 추가의 공용매와 함께 물을 포함하는 용매이다. 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 물, 수중 완충 용액(예컨대, 인산염-완충 염수(PBS), 및 수중 5% 덱스트로스(D5W))을 포함한다. 특정 구현예에서, 수성 용매는 디메틸 설폭사이드(DMSO)를, 예를 들어, 약 1 내지 4%, 또는 1 내지 3%의 양으로 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 등장성이다(즉, 혈장과 같은 체액과 실질적으로 동일한 삼투압을 갖는다).
[0228]
"대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 비인간 영장류, 양, 개와 같은 척추동물, 및 마우스, 래트, 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
[0229]
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 생산하는 과정을 지칭한다. 일부 양태에서, 이는 비제한적으로 폴리뉴클레오티드의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 사용되는 유전자 산물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역 후 변형, 예를 들어, 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 또는 단백질분해 절단을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
[0230]
본원에서 사용되는 용어 "5'" 또는 "5 프라임"은 핵산 또는 핵산 서열의 5' 말단을 지칭하고, 용어 "3'" 또는 "3 프라임"은 핵산 또는 핵산 서열의 3' 말단을 지칭한다.
[0231]
2개 이상의 핵산과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않으면서 최대 일치도를 위해 비교되고 정렬될 때(필요 시, 갭 도입) 동일하거나 특정 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 시각적 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하는 데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당 분야에 공지되어 있다.
[0232]
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 양태에서, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 네이티브 유전자로부터 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소를 포함하거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해한다. 유전자가 대부분의 시간에 대부분의 세포 유형에서 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 유전자가 특정 세포 유형에서 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 지칭된다. 특정 발달 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "발달-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 지칭된다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 광 등으로 세포를 노출 또는 처리한 후 발현되도록 유전자를 유도하고 초래하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절성 프로모터"로 지칭된다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 규정되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인지된다.
[0233]
용어 "작동 가능하게 연결된"은 정상적인 기능을 수행할 수 있는 방식으로 함께 연결된 유전 요소를 지칭한다. 예를 들어, 유전자는 이의 전사가 프로모터의 제어 하에 있을 때 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 이러한 전사는 유전자에 의해 인코딩된 산물의 생산을 초래한다.
[0234]
본원에서 사용되는 용어 "면역 개질제"는 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 단백질을 지칭한다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 사이토카인, 케모카인, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC I), MHC 클래스 II(MHC II), 인간 백혈구 항원(HLA)-DR 이소형(HLA-DR), CD80, CD86, 및 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 사이토카인 면역 개질제는 인터루킨 (IL) 2(IL-2), IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론 (IFN) α (IFN-α), 및 IFN-β를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 케모카인 면역 개질제는 C-C 모티프 케모카인 리간드(CCL) 3(CCL3), CCL4, CCL5, CCL21, CCL28, C-X-C 모티프 케모카인 리간드(CXCL) 10(CXCL10), 및 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 면역 개질제는 면역 개질제의 조합, 예를 들어, 항원과 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드로부터 공동-발현된 사이토카인 또는 케모카인 단백질 또는 이의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hirao, L.A., et al, Vaccine, 26:3112-20 (2008); Kanagavelu, S.K., et al., Vaccine, 30:691-702 (2012); Ahlers, D.J., et al., Curr Mol Med., 3:285-301 (2003); Jafarfzade, B.S., et al., Bratisl Lek Listy, 118:564-9 (2017); Ahler, J.D. and Belyakov, I.M., Eur J Immunol, 39:2657-69 (2009); Moore, A.C., et al., J Virol. 76:243-50 (2002); Barouch, D.H., et al., PNAS, 97:4192-7 (2000); Kalams, S.A., et al., J Infectious Disease, 208:818-29 (2013); Buchbinder, S., et al., PLOS One, 12(7):e0179597 (2017); Henke, A, et al., Intervirology, 49:249-52 (2006); 및 Yang, S.H., et al., Gen Ther., 13:1110-7 (2006)]을 참조한다.
[0235]
본원에서 사용되는 용어 "표적화 리간드"는 직접적으로 또는 하나 이상의 스페이서 분자를 통해 폴리머에 접합된 리간드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 양태에서, 폴리머의 이용 가능한 아미노 기의 작은 부분만이 리간드에 커플링된다. 일부 양태에서, 폴리머에 접합된 표적화 리간드는 폴리머-핵산 복합체가 특이적 표적 세포에 결합하고 이러한 세포(예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 조혈 세포 등)로 침투하도록 지시한다. 일부 양태에서, 표적 리간드는 또한 세포내 표적화 요소일 수 있어서, 핵산/약물의 전달이 특정 선호되는 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)을 향해 유도되게 할 수 있다. 일부 양태에서, 리간드는 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드 리간드는 당단백질(예를 들어, 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)), 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체(예를 들어, 표피 성장 인자 수용체)이다. 일부 양태에서, 항원 리간드는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원이다. 일부 양태에서, 리간드는 융합제(예를 들어, 폴리믹신 B 및 헤마글루티닌 HA2), 리소좀영양제, 또는 핵 국소화 신호(NLS)(예를 들어, T-항원 등)이다. 일부 양태에서, 리간드는 아미노 기에 커플링된 당 모이어티이다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 단당류 또는 올리고당류, 예컨대, 갈락토스, 글루코스, 푸코스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 만노스, 셀로비오스, 니트로스, 트리오스, 덱스트로스, 트레할로스, 말토스, 갈락토사민, 글루코사민, 갈락투론산, 글루쿠론산, 및 글루콘산이다.
[0236]
용어 "항체"는 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편(즉, 항원 결합 단편)을 포함한다. 이러한 활성 단편은 다수의 기법에 의해 본 개시의 항체로부터 유래될 수 있다. 항체의 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기법의 추가 설명은, 예를 들어, 문헌[Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)]을 참조한다. 용어 "항체"는 또한 이중특이적 및 키메라 항체 및 비포유동물 종에서의 항체를 포함한다.
[0237]
본원에서 사용되는 용어 "생분해성 링커" 또는 "생물작용성 생분해성 링커"는 양이온성 다중-블록 코폴리머를 가교시키는 데 사용되는 에스테르, 아미드, 디설파이드, 및/또는 포스페이트 결합을 함유하는 생분해성 링커를 지칭한다. 일부 양태에서, 생분해성 링커는 친수성이고, 디설파이드 결합을 포함하는 생분해성 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 생분해성 링커는 디티오디프로피오닐 링커이다.
[0238]
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자; 또는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는 개체를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 양태에서, 벡터는 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 일부 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 유인원 바이러스 40(SV40), 사이토메갈로바이러스(CMV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 벡터, 또는 벡터의 일부인 폴리뉴클레오티드는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터, 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 문맥에 따라 때때로 상호교환적으로 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 또한 동등한 기능을 제공할 수 있는 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 배큘로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)가 본원에 개시된다.
[0239]
본원에서 사용되는 용어 "폴록사머" 또는 "폴록사머 백본"은 일반식 HO-(C2H4O) a (C3H6O) b (C2H4O) c -H를 갖는 분자를 지칭하며, 여기서 a 및 c는 거의 동일하다. 문헌[Handbook of Biodegradable Polymers, Chapter 12' "The Poloxamers: Their Chemistry andMedical Applications" authored by Lorraine E. Reeve]을 참조한다. 또한, 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 공개 제2010/0004313호를 참조한다. 폴록사머는 순차적인 일련의 반응의 산물이기 때문에, 개별 폴록사머 블록의 사슬 길이는 평균 사슬 길이에 대한 통계적 분포이다. 따라서, 에틸렌옥시 기(a 및 c)의 수 및 프로필렌옥시 기(b)의 수는 평균인 것으로 의도된다. 폴록사머는 일반적으로 폴리에틸렌 옥사이드의 2개의 친수성 사슬이 측접된 폴리프로필렌 옥사이드의 중심 소수성 사슬을 갖는, 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 양친매성 트리블록 코폴리머를 기반으로 한다. 폴록사머 백본의 폴리머 블록의 길이는 다양한 폴리머 작제물 사이에서 다양할 수 있기 때문에, 많은 상이한 폴록사머가 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일 양태에서, 예를 들어, 폴록사머 백본의 평균 분자량은 약 100 내지 약 100,000 달톤의 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서, 폴록사머 백본의 평균 분자량은 약 500 내지 약 50,000 달톤의 범위일 수 있다. 추가의 또 다른 양태에서, 폴록사머 백본의 평균 분자량은 약 1000 내지 약 20,000 달톤의 범위일 수 있다. 폴록사머 백본은 또한 에틸렌 옥사이드 대 프로필렌 옥사이드의 비로 기재될 수 있다. 또 다른 양태에서, 에틸렌 옥사이드 대 프로필렌 에옥사이드의 비는 약 20:1 내지 약 1:20이다. 예를 들어, 일 양태에서, 에틸렌 옥사이드 대 프로필렌 옥사이드의 비는 약 5:1 내지 약 1:5이다.
[0240]
본 개시의 다양한 추가적인 양태는 하기 서브섹션에서 추가로 상세히 기술, 개시 또는 예시된다.
5.3
폴리뉴클레오티드
[0241]
일부 양태에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 및 백신)에 사용하기 위한 DNA 또는 mRNA 서열(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 또는 다중시스트론성 mRNA)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 바이러스 항원(예를 들어, SARS CoV-2 항원)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 양태에서, 벡터는 하나 이상의 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS CoV-2 항원 및 임의로 제2 바이러스 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 벡터는 SARS-CoV-2 항원 및 제2 SARS-CoV-2 항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 서열은 SARS-CoV-2 항원 및 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 제2 SARS-CoV-2 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 핵산 서열은 동일한 SARS-CoV-2 항원의 상이한 변이체를 인코딩하고, 여기서 동일한 SARS-CoV-2 항원의 상이한 변이체는 SARS CoV-2의 상이한 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 핵산 서열은 SARS-CoV-2 S 단백질 항원의 상이한 변이체를 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 항원은 SARS CoV-2의 상이한 균주로부터 유래된다.
[0242]
일부 양태에서, 본 개시는 (a) 병원체 단백질 항원(예를 들어, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산; 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 상이한 면역 개질제를 인코딩한다.
[0243]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (c) 제2 병원체 단백질 항원(예를 들어, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및 제2 병원체 항원은 상이한 SARS CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 항원이다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및 제2 병원체 항원은 동일한 SARS-CoV-2 항원의 상이한 변이체이고, 여기서 동일한 SARS-CoV-2 항원의 상이한 변이체는 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제1 병원체 항원 및 제2 병원체 항원은 SARS-CoV-2 S 단백질 항원의 상이한 변이체이고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 항원의 상이한 변이체는 SARS CoV-2의 상이한 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0244]
일부 양태에서, 제1 및/또는 제2 병원체 항원은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, rAg85A 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0245]
일부 양태에서, 제1 및/또는 제2 병원체 단백질은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 항원이다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원, 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 표면 당단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, gE2 항원, 또는 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, Pol 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 조합이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원, G 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, DEN-80E 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, VP35 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, CKD 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36), 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 융합 단백질 MV-F 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, M 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0246]
일부 양태에서, 제1 및/또는 제2 병원체 단백질은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제1 병원체 단백질은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편을 포함하고, 제2 병원체 단백질은 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 병원체는 단백질은 기생충 항원이고, 여기서 기생충 항원은 원생동물 항원이다. 일부 양태에서, 병원체 단백질은 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충 항원이다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 서컴스포로자이트 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 병원체 단백질은 기생충 항원에 대한 것이고, 여기서 기생충 항원은 기생성 또는 병원성 진균 항원이다. 일부 양태에서, 기생 또는 병원성 진균 항원은 칸디다 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0247]
일부 양태에서, 본 개시는 (a) SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산; 및 (b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 또는 다중시스트론성 mRNA)에 관한 것이다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 상이한 면역 개질제를 인코딩한다.
[0248]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (c) SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 또는 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0249]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제2 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0250]
일부 양태에서, 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(SEQ ID NO: 31), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터, 사이토케라틴 18(CK18) 프로모터, 사이토케라틴 19(CK19) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터(SEQ ID 32), 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1) 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CMV 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, CAG 프로모터(SEQ ID NO: 33), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 제2 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 제2 프로모터는 포유동물 EF1 프로모터이다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터(SEQ ID NO: 38)이다.
[0251]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0252]
일부 양태에서, 각각의 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0253]
일부 양태에서, 면역 개질제는 인터루킨(IL) 2(IL-2), IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론(IFN) α(IFN-α), IFN-β, 케모카인, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC I), MHC 클래스 II(MHC II), 인간 백혈구 항원(HLA)-DR 이소타입(HLA-DR), CD80, CD86, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 케모카인은 C-C 모티프 케모카인 리간드(CCL) 3(CCL3), CCL4, CCL5, CCL21, CCL28, C-X-C 모티프 케모카인 리간드(CXCL) 10(CXCL10), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0254]
일부 양태에서, 면역 개질제는 인터루킨, 예를 들어, IL-12이다. IL-12는 4개의 알파 나선을 포함한다. 이는 2개의 개별 유전자, IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)에 의해 인코딩된 이종이량체 사이토카인이다. 활성 이종이량체(p70로 지칭됨), 및 p40의 동종이량체가 단백질 합성 후에 형성된다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 IL-12 이종이량체(IL-12 p70) 또는 IL-12 동종이량체(예를 들어, IL-12 p35 또는 IL-12 p40)이다.
[0255]
일부 양태에서, IL-12 p35 면역 개질제는 SEQ ID NO: 43(마우스 IL-12 p35) 또는 SEQ ID NO: 47(인간 IL-12 p35)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제는 SEQ ID NO: 45(마우스 IL-12 p40) 또는 SEQ ID NO: 49(인간 IL-12 p40)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0256]
일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
[0257]
일부 양태에서, 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)이다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0258]
일부 양태에서, 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0259]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 (i) 인터루킨을 인코딩하는 핵산, 및 (ii) 주요 조직적합성 복합체 및/또는 케모카인을 인코딩하는 핵산의 조합을 포함한다.
[0260]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 MHC I를 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 추가로 포함한다.
[0261]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-12를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다.
[0262]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-12를 인코딩하는 핵산 및 IL-15를 인코딩하는 핵산의 조합을 포함한다.
[0263]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 IL-2를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 MHC I을 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, 이의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
[0264]
일부 양태에서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산은 CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함한다.
[0265]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 전장 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0266]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 전장 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0267]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0268]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0269]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0270]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0271]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0272]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0273]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0274]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0275]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0276]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0277]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0278]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0279]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N-말단 신호 펩티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0280]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0281]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0282]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0283]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 M 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 E 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합을 인코딩할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 동일한 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 변이체를 인코딩하고, 여기서 동일한 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편의 변이체는 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 항원 핵산 및 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편의 변이체를 인코딩하고, 여기서 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편의 변이체는 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다.
[0284]
예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0285]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 연속 아미노산 서열은 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 폴리펩티드는 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다.
[0286]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0287]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0288]
일부 양태에서, 본 개시는 제1 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산으로서, 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 항원 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 다중시스트론성 DNA 또는 다중시스트론성 mRNA)에 관한 것이다. 일부 양태에서, 제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0289]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0290]
일부 양태에서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0291]
일부 양태에서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 F1-Ag, 예르시니아 페스티스 V-Ag, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 Apa 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 HP65 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 rAg85A 항원, E71 VP1 항원, GST-태깅된 E71-VP1 항원, Cox 단백질 항원, GST-태깅된 Cox 단백질 항원, HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 gB2 항원, HSV-2 gC2 항원, HSV-2 gD2 항원, HSV-2 gE2 항원, HIV Env 항원, HIV Gag 항원, HIV Nef 항원, HIV Pol 항원, HPV 부캡시드 단백질 L2 항원, HCV NS3 항원, RSV F 항원, RSV G 항원, 뎅기 바이러스 E 단백질 항원, 뎅기 바이러스 EDIII 항원, 뎅기 바이러스 NS1 항원, 뎅기 바이러스 DEN-80E 항원, 에볼라 바이러스 GB 항원, 에볼라 바이러스 VP24 항원, 에볼라 바이러스 VP40 항원, 에볼라 바이러스 NP 항원, 에볼라 바이러스 VP30 항원, 에볼라 바이러스 VP35 항원, 지카 바이러스 외피 도메인 III 항원, 지카 바이러스 CKD 항원, 치쿤구니야 바이러스 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI (SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL (SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG (SEQ ID NO: 36), 홍역 바이러스 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 홍역 바이러스 융합 단백질 MV-F 항원, MERS-CoV S 단백질 항원, MERS-CoV S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, MERS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질 항원, SARS-CoV S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV E 단백질 항원, SARS-CoV M 단백질 항원, 톡소플라스마 곤디 MIC8 항원, 플라스모디움 팔시파룸 SERA5 폴리펩티드 항원, 플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로자이트 단백질 항원, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 (NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2 (M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0292]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 또는 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편 및 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편 및 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터의 제2 SARS CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다.
[0293]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0294]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제2 프로모터를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
[0295]
일부 양태에서, 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터, 사이토케라틴 18(CK18) 프로모터, 사이토케라틴 19(CK19) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1) 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 제2 프로모터는 CMV 프로모터이다.
[0296]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0297]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0298]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 IRES 서열을 통해 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0299]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 여기서 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0300]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0301]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0302]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0303]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 IRES 서열을 통해 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0304]
일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0305]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛을 인코딩하는 제1 항원 핵산) 및/또는 제2 항원 핵산(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, 또는 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛을 인코딩하는 제1 항원 핵산)에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0306]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0307]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0308]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0309]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0310]
일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 제1 항원 핵산 및/또는 제2 항원 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)에서의 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0311]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 번역-후 조절 요소는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역의 3'에 위치한다. 본 개시에 유용한 전사-후 조절 요소의 비-제한적인 예는 돌연변이된 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE), 마이크로RNA 결합 부위, DNA 핵 표적화 서열, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 전사-후 조절 요소는 WPRE이다.
[0312]
폴리뉴클레오티드는 또한 임의의 단백질 코딩 서열의 다운스트림일 수 있는 하나 이상의 폴리아데닐화(폴리(a)) 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호의 예는 SV40 폴리(a) 꼬리(SEQ ID NO: 29), LTR 폴리(a) 꼬리, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(a) 꼬리(SEQ ID NO: 30), 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리(a) 꼬리, 또는 인간 β-글로빈 폴리(a) 꼬리를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 핵산, 제2 항원 핵산, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열, 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열, 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 조합이다.
[0313]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 임의의 단백질 코딩 서열의 업스트림에 적어도 하나의 인핸서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 인핸서는 DNA 발현에 필요할 수 있다. 일부 양태에서, 인핸서는 인간 액틴 인핸서, 인간 미오신 인핸서, 인간 헤모글로빈 인핸서, 인간 근육 크레아틴 인핸서, 또는 CMV, HA, RSV 또는 EBV로부터의 것과 같은 바이러스 인핸서이다. 일부 양태에서, 인핸서는 미국 특허 제5,593,972호, 제5,962,428호, 및 WO 94/016737호에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서이다. 일부 양태에서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열 또는 β-액틴 인트론 서열이다. 양태들에서, 인핸서 서열은 SV40 인핸서 서열(SEQ ID NO: 37)이다.
[0314]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 역말단 반복부(ITR)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 ITR 및 제2 ITR을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 ITR, 예를 들어, 5' ITR, 및 제2 ITR, 예를 들어, 3' ITR을 포함한다. 전형적으로, ITR은 파보바이러스(예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV)) DNA 복제 및 원핵 플라스미드로부터의 구조, 또는 절제에 관여한다(Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb and Muzyczka, 1988). 또한, ITR은 AAV 프로바이러스 통합 및 AAV DNA의 비리온으로의 패키징에 필요한 최소 서열인 것으로 보인다(McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989). 이들 요소는 파보바이러스 게놈의 효율적인 증식에 필수적이다. 일부 양태에서, ITR은 헤어핀 T-자형 구조로 폴딩된다. 일부 양태에서, ITR은 비-T-자형 헤어핀 구조로, 예를 들어, U-자형 헤어핀 구조로 폴딩된다.
[0315]
일부 양태에서, 본 개시에 유용한 ITR은 AAV 게놈으로부터의 ITR을 포함한다. 특정 양태에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈의 ITR이다. 일부 양태에서, ITR은 AAV2 게놈의 ITR이다. 일부 양태에서, ITR은 하나 이상의 AAV 게놈으로부터 유래된 ITR을 이의 5' 및 3' 말단에 포함하도록 유전적으로 조작된 합성 서열이다.
[0316]
일부 양태에서, ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다. 일부 양태에서, ITR은 비-AAV의 ITR이다. 일부 양태에서, ITR은 비제한적으로 보카바이러스, 디펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파보바이러스, 코피파보바이러스, 프로토파보바이러스, 테트라파보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스과 파보비리다에로부터의 비-AAV 게놈의 ITR이다. 특정 양태에서, ITR은 에리트로바이러스 파보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다. 일부 양태에서, ITR은 머스코비 오리 파보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 특정 양태에서, MDPV 균주는 약독화된, 예를 들어, MDPV 균주 FZ91-30이다. 일부 양태에서, MDPV 균주는 병원성, 예를 들어, MDPV 균주 YY이다. 일부 양태에서, ITR은 돼지 파보바이러스, 예를 들어, 돼지 파보바이러스 U44978로부터 유래된다. 일부 양태에서, ITR은 마우스 분 바이러스, 예를 들어, 마우스 분 바이러스 U34256으로부터 유래된다. 일부 양태에서, ITR은 개 파보바이러스, 예를 들어, 개 파보바이러스 M19296으로부터 유래된다. 일부 양태에서, ITR은 밍크 장염 바이러스, 예를 들어, 밍크 장염 바이러스 D00765로부터 유래된다. 일부 양태에서, ITR은 디펜도파보바이러스로부터 유래된다. 특정 양태에서, 디펜도파보바이러스는 디펜도바이러스 구스 파보바이러스(GPV) 균주이다. 일부 양태에서, GPV 균주는 약독화된, 예를 들어, GPV 균주 82-0321V이다. 일부 양태에서, GPV 균주는 병원성, 예를 들어, GPV 균주이다.
[0317]
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 또한 벡터를 염색체외로 유지하고 세포에서 벡터의 다중 카피를 생산하기 위해 포유동물 복제 기점(예를 들어, 엡스테인 바 바이러스 복제 기점)을 포함할 수 있다.
[0318]
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 다중시스트론성 mRNA이다. 일부 양태에서, 다중시스트론성 mRNA는 5' 캡 및 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열(SEQ ID NO: 29), 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열(SEQ ID NO: 30), 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 다중시스트론성 mRNA는 5' UTR 및/또는 3' UTR을 포함한다.
[0319]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0320]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 2에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0321]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 3에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0322]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 4에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0323]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 5에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0324]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 6에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0325]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 7에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0326]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 8에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0327]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 9에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0328]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 10에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0329]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 11에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0330]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 12에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0331]
일부 양태에서, 도 1 내지 12 중 어느 하나에 예시된 벡터 작제물은 "Covid-19 스파이크 유전자"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및 "Covid-19 유전자-2"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)를 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 벡터 작제물은 DNA 또는 mRNA를 발현하는 데 사용될 수 있다.
[0332]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 항원)을 인코딩하고 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SARS CoV-2 항원, 및 임의로 제2 바이러스 항원(예를 들어, 제2 SARS CoV-2 항원 및/또는 인플루엔자 바이러스 항원)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
[0333]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 14c(pVac 2)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0334]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)을 인코딩하고 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p340을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 14d(pVac 3)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0335]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 14f(pVac 5)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0336]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, 전장 SARS-CoV-2 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)을 인코딩하고 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p340을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 14g(pVac 6)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0337]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드 서열은 도 14b(pVac 1) 또는 14e(pVac 4)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0338]
일부 양태에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드 서열은 도 14h(pVac 7)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0339]
일부 양태에서, 도 14a 내지 14h 중 어느 하나에 예시된 벡터 작제물은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질(제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및/또는 SASRS-CoV-2 M 단백질(제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)을 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 벡터 작제물은 DNA 또는 mRNA를 발현하는 데 사용될 수 있다.
[0340]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, rAg85A 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0341]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원, 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 표면 당단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, gE2 항원, 또는 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, Pol 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 조합이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원, G 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, DEN-80E 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, VP35 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, CKD 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36), 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 융합 단백질 MV-F 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, M 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0342]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편 및 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 적어도 2개의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편은 동일한 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체이고, 여기서 동일한 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편의 상이한 변이체는 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래된다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩하며, 여기서 하나 이상의 기생충 항원은 하나 이상의 원생동물 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 서컴스포로자이트 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩하며, 여기서 하나 이상의 기생충 항원은 하나 이상의 기생성 또는 병원성 진균 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 기생성 또는 병원성 진균 항원은 칸디다 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0343]
일부 양태에서, 제1 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
[0344]
일부 양태에서, 제2 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
[0345]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0346]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0347]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
[0348]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
[0349]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0350]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0351]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다.
[0352]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다.
[0353]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0354]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0355]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0356]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0357]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N-말단 신호 펩티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0358]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0359]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0360]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0361]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 M 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
[0362]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 연속 아미노산 서열은 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다.
[0363]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 E 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
[0364]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
[0365]
일부 양태에서, 프로모터 1은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터 2는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터 X는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터 Y는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터 Z는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0366]
일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
5.4
벡터, 백신, 조성물, 및 약학적 조성물
[0367]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 작제물이 본원에 제공되며, 여기서 벡터는 DNA 플라스미드 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체이다. 벡터의 예는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 플라스미드 벡터 및 다중시스트론성 mRNA 벡터가 본원에 제공된다.
[0368]
또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 및 백신)이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물, 또는 백신)은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 전달 성분(예를 들어, 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머)을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 벤즈알코늄 클로라이드를 추가로 포함한다.
[0369]
일부 양태에서, IL-12 p35 면역 개질제는 SEQ ID NO: 43(마우스 IL-12 p35) 또는 SEQ ID NO: 47(인간 IL-12 p35)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제는 SEQ ID NO: 45(마우스 IL-12 p40) 또는 SEQ ID NO: 49(인간 IL-12 p40)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
[0370]
일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p35, IL-12 p40, 또는 이의 조합을 인코딩한다. 일부 양태에서, IL-12 p35 면역 개질제는 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제는 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
[0371]
일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0372]
일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물, 또는 백신)은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p35 면역 개질제를 인코딩하고, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p40 면역 개질제를 인코딩한다. 일부 양태에서, IL-12 p35 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 42(마우스 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 46(인간 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, IL-12 p40 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 44(마우스 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열) 또는 SEQ ID NO: 48(인간 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0373]
일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 또한, 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물, 또는 백신)은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물, 또는 백신)은 IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p35를 인코딩하고, 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드는 IL-12 p40을 인코딩한다.
[0374]
일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0375]
일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시키는 바이러스 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 비-구조 단백질 1(Nsp1), SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b)을 포함한다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 동일한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 항원 핵산에 의해 인코딩된 바이러스 항원과 상이한 바이러스로부터 유래된다. 일부 양태에서, 바이러스 단백질은 본원에 개시된 병원체 항원에 의해 유발된 국소 염증 반응 및/또는 인터페론 반응을 약화시킨다. 일부 양태에서, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 적어도 하나의 면역 개질제는 SARS-CoV-2 Nsp1, SARS-CoV-2 Nsp6, SARS-CoV-2 Nsp13, SARS-CoV-2 ORF3a, SARS-CoV-2 ORF6, SARS-CoV-2 ORF7a, SARS-CoV-2 ORF7b, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 면역 개질제는 비-코딩 5'-C-포스페이트-G-3'(CpG) 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 톨-유사 수용체 9(TLR9) 신호전달 경로를 활성화시킨다. 일부 양태에서, 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Bauer, A. et al., Nucleic Acids Research 38(12):3891-908 (2010); Cornelie, S. et al., Journal of Biological Chemistry 279(15):15124-9 (2004); Klinman, D. et al., J Immunol. 158(8):3635-9 (1997); Klinman, D. et al., Immunological Reviews 199(1):201-16 (2004); Luo, Z. et al., Mol Med Rep. 6(6):1309-14 (2012); Bode, C. et al., Expert Rev Vaccines 10(4):499-511 (2011); 및 Kuo, T. et al., Scientific Reports 10:20085 (2020)]에서 이전에 보고된 비-코딩 CpG 디뉴클레오티드의 하나 이상의 연쇄체를 포함한다.
[0376]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0377]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 2에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0378]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 3에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0379]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 4에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0380]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 5에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0381]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 6에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0382]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 7에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0383]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 8에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0384]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 9에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0385]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 10에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0386]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 11에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0387]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, CCL3를 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, CCL3를 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 12에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0388]
일부 양태에서, 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 도 1 내지 12 중 어느 것에 예시된 벡터 작제물에 도시된 바와 같이 구성된 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함할 수 있고, 벡터 작제물은 "Covid-19 스파이크 유전자"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및 "Covid-19 유전자-2"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)를 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원을 인코딩한다.
[0389]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 14c(pVac 2)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0390]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)을 인코딩하고 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p340을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 14d(pVac 3)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0391]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 14f(pVac 5)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0392]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, 전장 SARS-CoV-2 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)을 인코딩하고 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p340을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 14g(pVac 6)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0393]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드 서열은 도 14b(pVac 1) 또는 14e(pVac 4)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0394]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드 서열은 도 14h(pVac 7)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0395]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물 또는 백신)은 도 X(pVac 1 내지 7) 중 어느 것에 예시된 벡터 작제물에 도시된 바와 같이 구성된 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함할 수 있고, 벡터 작제물은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질(제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및/또는 SASRS-CoV-2 M 단백질(제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)을 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원을 인코딩한다.
[0396]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, rAg85A 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0397]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원, 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 표면 당단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, gE2 항원, 또는 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, Pol 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 조합이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원, G 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, DEN-80E 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, VP35 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, CKD 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36), 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 융합 단백질 MV-F 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, M 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0398]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편 및 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩하고, 여기서 하나 이상의 기생충 항원은 하나 이상의 원생동물 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 서컴스포로자이트 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩하며, 여기서 하나 이상의 기생충 항원은 하나 이상의 기생성 또는 병원성 진균 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 기생성 또는 병원성 진균 항원은 칸디다 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0399]
일부 양태에서, 제1 또는 제2 항원 핵산은 각각 제1 SARS-CoV-2 단백질 및 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
[0400]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
[0401]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0402]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0403]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
[0404]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
[0405]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0406]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0407]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다.
[0408]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다.
[0409]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0410]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0411]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0412]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0413]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N-말단 신호 펩티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0414]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0415]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0416]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0417]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 M 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
[0418]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 연속 아미노산 서열은 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다.
[0419]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 E 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
[0420]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
[0421]
일부 양태에서, 프로모터 1은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0422]
일부 양태에서, 프로모터 2는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0423]
일부 양태에서, 프로모터 X는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0424]
일부 양태에서, 프로모터 Y는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0425]
일부 양태에서, 프로모터 Z는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0426]
일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0427]
본 개시의 폴리뉴클레오티드 및 조성물(예를 들어, 약학적 조성물, 백신, 벡터, 및 DNA 플라스미드 벡터)은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다.
[0428]
제형은, 잘 알려져 있고 당업자에게 용이하게 이용 가능한 다수의 출처에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th Ed.)]에는 본 개시와 관련하여 사용될 수 있는 제형이 기재되어 있다. 비경구 투여에 적합한 제형은, 예를 들어, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰풀 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 전 멸균 액체 담체의 조건, 예를 들어, 주사용수만을 필요로 하는 동결 건조된(동결건조된) 조건으로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 정제 등으로부터 제조될 수 있다. 상기 특히 언급된 성분 이외에, 본 개시의 제형은 고려되는 유형의 제형과 관련하여 당 분야에서 통상적인 다른 제제를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
[0429]
본 개시는 또한 일정 기간 동안 안전하게 저장되고 사용 전에 재구성될 수 있는 동결건조된(또는 냉동-건조된) 조성물 또는 백신을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은, 예를 들어, 수성 성분이 실질적으로 없는 동결건조된 제품이다. 일부 양태에서, 동결건조된 조성물 또는 백신은, 예를 들어, 투여 전에 희석제에서 재구성된다. 일부 양태에서, 동결건조된 조성물 또는 백신은 물에서 재구성된다.
[0430]
일부 양태는 (1) 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 플라스미드 벡터 및 (2) 본원에 개시된 임의의 전달 성분을 포함하는 동결건조된 조성물 또는 백신에 관한 것이며, 여기서 조성물에는 수성 성분이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 본 개시의 조성물 또는 백신은 동결건조된다.
[0431]
일부 양태에서, 동결건조된 조성물 또는 백신은 0℃ 내지 5℃에서 적어도 약 1개월(또는 30일), 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 동안 안정하다. 일부 양태에서, 동결건조된 조성물 또는 백신은 0℃ 내지 5℃에서 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 또는 적어도 5년 동안 안정하다. 일부 양태에서, 동결건조된 조성물 또는 백신은 25℃에서 적어도 약 7일, 약 10일, 또는 약 14일 동안 안정하다.
[0432]
일부 양태에서, 동결건조된 조성물 또는 백신은 투여를 위해 재구성된 조성물 또는 백신 제형으로 재구성된다. 일부 양태에서, 재구성된 조성물 또는 백신은 희석제(예를 들어, 물)로 동결건조된 조성물 또는 백신의 재구성 후 0℃ 내지 5℃에서 적어도 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 또는 약 6개월 동안 안정하다. 일부 양태에서, 재구성된 조성물 또는 백신은 희석제로 동결건조된 조성물의 재구성 후 25℃에서 적어도 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 동안 안정하다. 일부 양태에서, 희석제는 물이다.
[0433]
본 개시의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 애주번트와 같은 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 애주번트는 대안적인 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 또는 벡터에서 발현되거나 본 개시의 조성물과 조합하여 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 애주번트는 신호 서열이 결실되고 임의로 IgE로부터의 신호 펩티드를 포함하는, α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현 케모카인(TECK), 점막-관련 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, IL-15를 포함하는 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 애주번트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 조합일 수 있다. 유용한 애주번트일 수 있는 다른 유전자는 MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, 돌연변이체 형태의 IL-18, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2, 이의 기능성 단편, 및 이의 조합을 인코딩하는 것들을 포함한다.
[0434]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 백신 약학적 조성물은 무균, 발열원 비함유 및 미립자 비함유일 수 있다. 등장성 제형 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 소듐 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토스를 포함할 수 있다. 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충 염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제는 제형이 LGS 또는 다가양이온 또는 다가음이온을 포함하여 연장된 기간 동안 실온 또는 주위 온도에서 안정하게 할 수 있다.
[0435]
일부 양태에서, 본 개시의 조성물에 대한 치료적 유효 및 최적 투여량 범위는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 지원자 대상체 또는 시험 동물은 예정된 간격으로 다양한 투여량으로 접종될 수 있고, 시험 혈액 샘플은 혈액에 존재하는 항체 및/또는 SARS-CoV-2 중화 활성의 수준에 대해, 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다. 이러한 결과는 포유동물, 특히 인간 대상체의 효과적인 면역화를 위한 최적화된 면역화 투여량 및 일정을 개선하는 데 사용될 수 있다.
[0436]
또한, 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 또는 백신을 포함하는 재조합 숙주 세포가 본원에 제공된다. 숙주 세포는 원핵 세포, 효모와 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포와 같은 다른 진핵 세포, 및 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 면역글로불린 사슬을 내인성으로 생산하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10, HBK, NSO, HT1080 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 재조합 숙주 세포는 당업자에게 용이하게 이용 가능한 기법에 의해 본원에 기재된 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 백신을 세포에 도입함으로써 제조된다. 이들은 칼슘 인산염 형질감염, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염, 리포펙션, 및 문헌[Sambrook. et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd. ed.. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY (1989)]에서 확인되는 것들과 같은 다른 기법을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
5.4.1
전달 성분
[0437]
일부 양태에서, 개시된 조성물, 약학적 조성물, 백신, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터는 전달 성분을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 "네이키드 DNA" 또는 제형화된 플라스미드 DNA에 기반한 비-바이러스 전달 성분 또는 시스템이다. 일부 양태에서, 전달 성분 또는 시스템은 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 비-바이러스 전달 성분은 양이온성 폴리머이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머는 합성 작용성화된 폴리머, 지질, 리포폴리머, 또는 이의 화학적 유도체이다.
[0438]
"네이키드 DNA" 또는 제형화된 플라스미드 DNA에 기반한 비-바이러스 유전자 전달 성분 또는 시스템은 사용의 단순성 및 특이적 면역 반응을 유발하지 않기 때문에 바이러스 벡터에 비해 잠재적인 이점을 갖는다. 양이온성 지질, 펩티드, 및 폴리머를 포함하는 다수의 합성 유전자 전달 시스템이 네이키드 DNA의 한계를 극복하기 위해 기재되어 있다. 유사하게, 비-바이러스 전달 시스템은 mRNA의 전달을 위해 사용될 수 있다.
[0439]
폴리머는 이들의 우수한 분자 가요성이 신규한 화학의 복합적인 변형 및 혼입을 가능하게 하기 때문에 현재 시스템에 대한 실행 가능한 대안으로 부상하였다. 폴리(L-리신)(PLL) 및 폴리(L-아르기닌)(PLA), 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온성 폴리머는 DNA를 축합하고 DNA 안정성 및 막관통 전달을 촉진하는 이들의 능력으로 인해 유전자 전달 후보로서 폭넓게 연구되어 왔다. PEI는 DNA를 좁게 분포된 적게 양으로 하전된 구형 복합체로 효율적으로 축합하고 시험관내 및 생체내에서 세포를 형질감염시킬 수 있다. PEI는 폴리머/DNA 비율이 증가함에 따라 PEI의 형질감염 활성이 증가한다는 점에서 다른 양이온성 폴리머와 유사하다. PLL에 비해 PEI의 뚜렷한 이점은 PEI가 높은 형질감염 효율을 산출할 수 있게 하는 이의 엔도솜용해 활성이다. 상업적 분지형 PEI는 25%의 1차 아민, 50%의 2차 아민 및 25%의 3차 아민을 포함한다. PEI의 전체 양성자화 수준은 pH 7에서 pH 5로 2배가 되는데, 이는 엔도솜에서 PEI가 크게 양성자화된다는 것을 의미한다. PEI의 양성자화는 엔도솜 막을 가로질러 클로라이드 유입을 촉발하고, 물이 엔도솜 내부의 높은 이온 농도에 대항하여 뒤따르며, 이는 결국 삼투성 팽창 및 포획된 DNA의 방출로부터 엔도솜 붕괴를 초래한다. 이의 고유한 엔도솜용해 활성으로 인해, PEI는 일반적으로 형질감염을 위한 엔도솜용해제의 첨가를 필요로 하지 않는다. 이들 이점으로 인해, PEI는 보다 안전하고 보다 효율적인 전달 시스템을 생성하기 위해 폴리머 작용성화 전략에서 점점 더 많이 이용되어 왔다.
[0440]
일부 양태에서, 전달 성분은 양이온성 폴리머이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머는 합성 작용성화된 폴리머, 지질, 리포폴리머, 또는 이의 화학적 유도체이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머는 약 0.1:1 내지 약 100:1의 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 mRNA 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 mRNA 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 10:1이다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 양이온성 폴리머와 복합체화된 약 0.5 mg/ml 내지 약 5.0 mg/ml의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 폴록사머 또는 이의 유도체이다. 일부 양태에서, 폴록사머 또는 이의 유도체는 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 β-아미노 에스테르이다. 일부 양태에서, 폴리머는 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 폴리-이노신-폴리시티딜산이다. 일부 양태에서, 폴리-이노신-폴리시티딜산은 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다.
5.4.1.1
생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머
일부 양태에서, 전달 성분은 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머, 예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호에 개시된 임의의 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머이다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 선형 폴리(알킬렌이민)(LPAI) 및 친수성 링커의 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머이며, 여기서 상기 LPAI 블록은 생분해성 에스테르, 아미드, 디설파이드, 또는 포스페이트 연결 결합과 상기 친수성 링커에 의해 함께 가교된다. 일부 양태에서, 선형 폴리(알킬렌이민)(LPAI)은 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-.베타.-사이클로덱스트린, 스페르민 및 스페르미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다. 일부 양태에서, 선형 폴리(알킬렌이민)(LPAI)은 선형 폴리(에틸렌이민)(LPEI)이다.
[0441]
일부 양태에서, 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 생분해성 링커에 의해 다른 모이어티, 예를 들어, 형광 마커, 지질 앵커 또는 이의 유도체, 즉, 콜레스테롤, 지방산 또는 이의 유도체에 연결된다. 일부 양태에서, 본 개시에 사용된 선형 PEI의 분자량은 1,000 내지 25,000 달톤의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, 선형 PEI 블록은 바람직하게는 생분해성 디설피이드이산-유래된 링커, 즉, 디티오디프로피오네이트 유도체를 이용하여 디아미드 연결을 통해 서로 연결된다. 일부 양태에서, 링커 대 PEI의 몰비는 1/1 내지 5/1의 범위 내에 있고; 지질 앵커 대 PEI의 몰비는 0/1 내지 3/1이다. 일부 양태에서, 폴리머는 바람직하게는 클로라이드 반대이온과 함께 폴리암모늄 염으로서 제형화된다. PEI의 독성은 이의 분자량이 증가함에 따라 증가하기 때문에, 폴리머에서 블록으로서 저분자량 PEI의 사용은 포유동물 세포의 형질감염을 위한 및 유전자 요법의 생체내 적용을 위한 일반 시약으로서 사용하기 위한 개선된 유전자 담체를 제공한다.
[0442]
일부 양태에서, 생분해성, 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 저분자량 선형 PEI 블록 및 디티오산 모이어티, 즉, 디티오디프로피온산을 생분해성 링커로서 포함한다. 생분해성, 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 생분해성 디설파이드 연결을 통해 저분자량 선형 PEI 단위를 가교시킴으로써 합성된다. 이러한 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 수용성이고 단일 블록 폴리머에 비해 형질감염적으로 우수하다(68 내지 70배 더 높은 활성). 미국 특허 제8,445,017호를 참조한다.
[0443]
일부 양태에서, 폴리머에 대한 링커의 분자량 비율은 폴리아민 폴리머 백본의 희석을 최소화하는 < 0.2이다. 일부 양태에서, 링커와 폴리머 블록 사이의 화학적 결합은 아미드 결합에 비해 더 쉽게 생분해될 수 있는 디설파이드 결합이다. 본 개시에서 또한 사용될 수 있는 다른 생분해성 결합은 포스포에스테르, 하이드라존, 시스-아소티닐, 우레탄 및 폴리(에틸)을 포함한다. 임의의 링커는 단계적 방식으로 반응하기 때문에, 이는 상이한 블록 또는 동일한 블록의 상이한 영역을 연결할 수 있다(루프 형성). 후자는 다중 루핑으로 인해 용해도가 낮은 약하게 가교된 물질의 형성에 유리할 것이다. 미국 특허 제8,445,017호에 개시된 공정은 LPEI 블록에 질소 원자의 부분적 및 가역적 차단/보호를 혼입시킴으로써 이러한 문제를 해결한다. 이러한 LPEI 작용성화는 또한 폴리머 용해도를 증가시켜, LPEI 블록의 연결을 용이하게 한다. 이러한 과정은 또한 양이온성 폴리머 상에 펜던트 보조 리간드(예를 들어, 지질, 또는 형광 마커)의 편리한 혼입을 가능하게 한다.
[0444]
일부 양태에서, 양이온성 블록 코폴리머는 다음 화학식 (CP)xLyYz로 표현되며, 여기서 CP는 적어도 하나의 2차 아민 기를 함유하는 양이온성 폴리머를 나타내고, 상기 CP 폴리머는 1,000 내지 25,000 달톤 범위의 평균 분자량을 갖고; Y는 에스테르, 아미드, 디설파이드, 또는 포스페이트 연결을 함유하는 이작용성 생분해성 링커를 나타내고; L은 리간드를 나타내고; x는 1 내지 20 범위의 정수이고; y는 0 내지 100의 정수이고; 및 z는 0 내지 40 범위의 정수이다. 일부 양태에서, 양이온성 폴리머는 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 포함한다. 일부 양태에서, LPEI는 하기 화학식을 갖는 BD15-12이다:
상기 식에서, PEI는 대략 15,000 Da이고, 여기서 PEI 당 평균 12개의 가교제가 존재한다. 일부 양태에서, LPEI는 하기 화학식을 갖는 Omnifect이다:
상기 식에서, PEI는 대략 3,600 Da이고, 여기서 PEI 당 평균 3개의 가교제가 있고, PEI 당 평균 1개의 PEG-지질이 존재한다. 일부 양태에서, 이작용성 생분해성 링커는 친수성이고, 디설파이드 결합을 포함하는 생분해성 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 이작용성 생분해성 링커는 디티오디프로피오닐 링커이다.
[0445]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 LPEI 및 다중-블록 코폴리머를 가교시키기 위한 디티오디프로피오닐 링커를 포함하고, 여기서 LPEI는 1,000 내지 25,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 적어도 하나의 리간드에 공유적으로 연결된다.
[0446]
일부 양태에서, 본 개시의 LPEI 및 리포폴리머의 생분해성, 가교된, 양이온성, 다중-블록 코폴리머는 핵산과 같은 다가음이온성 화합물에 정전기적으로 끌리는 아민 기를 갖는다. 일부 양태에서, 양이온성 코폴리머는 DNA를 축합하고 콤팩트한 구조를 형성한다. 또한, 생물활성 물질의 전달 후 모노머 분해 생성물의 낮은 독성은 감소된 세포독성 및 증가된 형질감염 효율을 갖는 유전자 운반체를 제공한다.
[0447]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 직접적으로 또는 스페이서 분자를 통해 추적자(예를 들어, 형광 마커) 또는 리간드와 접합된다. 일부 양태에서, 이용 가능한 아미노 기의 작은 부분만이 리간드에 커플링된다. 폴리머에 접합된 리간드는 폴리머-핵산 복합체가 특이적 표적 세포에 결합하고 이러한 세포 내로 침투하도록 지시하는 표적화 리간드이다. 표적화 리간드는 또한 세포내 표적화 요소일 수 있어서, 핵산/약물의 전달이 특정 선호되는 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)을 향해 유도될 수 있도록 한다. 폴리머에 접합된 표적화 리간드는 폴리머-핵산 복합체가 특이적 표적 세포에 결합하고 이러한 세포(예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 조혈 세포 등)로 침투하도록 지시한다. 표적화 리간드는 또한 세포내 표적화 요소일 수 있어서, 핵산/약물의 전달이 특정 선호되는 세포 구획(미토콘드리아, 핵 등)을 향해 유도될 수 있도록 한다.
[0448]
일부 양태에서, 표적화 리간드는 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 당단백질(예를 들어, 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)), 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체(예를 들어, 표피 성장 인자 수용체)이다. 일부 양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원이다. 일부 양태에서, 리간드는 융합제(예를 들어, 폴리믹신 B 및 헤마글루티닌 HA2), 리소좀영양제, 또는 핵 국소화 신호(NLS)(예를 들어, T-항원 등)이다. 일부 양태에서, 리간드는 아미노 기에 커플링된 당 모이어티이다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 단당류 또는 올리고당류, 예컨대, 갈락토스, 글루코스, 푸코스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 만노스, 셀로비오스, 니트로스, 트리오스, 덱스트로스, 트레할로스, 말토스, 갈락토사민, 글루코사민, 갈락투론산, 글루쿠론산, 및 글루콘산이다.
[0449]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 올레산, 팔미트산, 및 스테아르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방 아실 사슬에 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 다가음이온성 화합물에 정전기적으로 끌리는 적어도 하나의 아민 기를 포함한다. 일부 양태에서, 다가음이온성 화합물은 핵산이고, 여기서 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 핵산을 축합하여 콤팩트한 구조를 형성한다.
[0450]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, A 및 B는 개별 선형 폴리에틸렌이민 사슬의 분자량이 5,000 내지 25,000 달톤이 되도록 하고; 분자간 가교는 아민의 약 5 내지 10%를 연결하고; 생분해성 가교는 디티오디프로피오닐(각각의 절반은 3개의 탄소 원자를 포함함)이고 1 내지 10개의 탄소 원자일 수 있다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 10,000 내지 15,000 달톤 선형 PEI를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조). 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 10,000 내지 15,000 달톤 선형 PEI를 포함하고(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조), 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 추가로 접합된다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 10,000 내지 15,000 달톤 선형 PEI를 포함하고(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조), 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 추가로 접합된다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 15,000 내지 20,000 달톤 선형 PEI를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조). 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 15,000 내지 20,000 달톤 선형 PEI를 포함하고(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조), 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 추가로 접합된다.
[0451]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0452]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머와 복합체화된 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml(예를 들어, 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml; 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml)의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머와 복합체화된 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml(예를 들어, 약 1 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 2 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 6 mg/ml 내지 약 10 mg/ml)의 핵산을 포함한다.
5.4.1.2
PEI 백본을 포함하는 양이온성 리포폴리머
[0453]
일부 양태에서, 전달 성분은 미국 특허 제7,964,571호에 개시된 바와 같은 지질 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유적으로 연결된 PEI 백본을 포함하는 양이온성 리포폴리머이다. 일부 양태에서, PEI 백본은 지질 및 PEG에 공유적으로 연결된다. 일부 양태에서, 지질 및 PEG는 공유 결합에 의해 PEI 백본에 직접 부착된다. 일부 양태에서, 지질은 PEG 스페이서를 통해 PEI 백본에 부착된다. 일부 양태에서, PEG는 50 내지 20,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 양태에서, PEG 대 PEI의 몰비는 0.1:1 내지 500:1의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, 지질 대 PEI의 몰비는 0.1:1 내지 500:1의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, C12 내지 C18 지방산, 또는 지방산 유도체이다. PEG의 첨가는 생물학적 환경에서 핵산/폴리머 복합체의 안정성을 향상시키고, 전달의 조직 선택성을 개선하기 위해 PPC 사슬에 리간드(예를 들어, 표적화 리간드)의 혼입을 가능하게 한다. 미국 특허 제7,964,571호를 참조한다.
[0454]
일부 양태에서, 양이온성 리포폴리머는 콜레스테롤 및 PEG에 공유적으로 연결된 PEI 백본을 포함하는 PEG:PEI:콜레스테롤(PPC) 리포폴리머이다. 일부 양태에서, PEI는 콜레스테롤 및 PEG에 공유적으로 연결되고, 여기서 양이온성 리포폴리머에서 평균 PEG:PEI:콜레스테롤 몰비는 1 내지 5 PEG:1 PEI:0.4 내지 1.5 콜레스테롤의 범위 내에 있다. 일부 양태에서, PEG-PEI-콜레스테롤(PPC) 리포폴리머는 2.5:1:0.6의 평균 PEG:PEI:콜레스테롤 비를 갖는다. 일부 양태에서, PEI는 100 내지 500,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 또는 분지형 배열을 갖는다.
[0455]
일부 양태에서, 양이온성 리포폴리머는 수용체 리간드, 막 투과제, 엔도솜용해제, 핵 국소화 서열, 및 pH 민감성 엔도솜용해 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 펜던트 작용성 모이어티를 추가로 포함한다.
[0456]
일부 양태에서, 양이온성 리포폴리머는 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 여기서 표적화 리간드는 PEI 백본에 직접적으로 부착되거나 PEG 링커를 통해 부착된다. 일부 양태에서, 표적화 리간드는 당 모이어티, 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 단당류이다. 일부 양태에서, 단당류는 갈락토스이다. 일부 양태에서, 당 모이어티는 올리고당류이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 당단백질, 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체이다. 일부 양태에서, 성장 인자 수용체는 표피 성장 인자 수용체이다. 일부 양태에서, 당단백질은 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)이다. 일부 양태에서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원이다.
[0457]
일부 양태에서, 양이온성 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 양이온성 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 양이온성 리포폴리머 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0458]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 양이온성 폴리머와 복합체화된 약 0.1 mg/ml 내지 약 10.0 mg/ml(예를 들어, 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml; 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml)의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 양이온성 폴리머와 복합체화된 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml(예를 들어, 약 1 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 2 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 6 mg/ml 내지 약 10 mg/ml)의 핵산을 포함한다.
5.4.1.3
리포폴리아민 및 이의 유도체
[0459]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 리포폴리아민을 포함한다:
(스타라민).
[0460]
일부 양태에서, 전달 성분은 리포폴리아민과 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 혼합물을 포함한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 폴리(L-글루탐산), 스티렌 말레산 무수물, 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 또는 폴리디비닐에테르 말레산 무수물이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
(메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 변형된 스타라민)
상기 식에서, n은 각각 2 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 10 내지 100개의 반복 단위의 정수이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
상기 식에서, n = 11이다(스타라민-mPEG515). 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는다:
(스타라민-mPEG11).
일부 양태에서, 혼합물 중의 리포폴리아민 대 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 비는 1:1 내지 10:1이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0461]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 리포폴리아민을 포함한다:
(크로사민).
[0462]
일부 양태에서, 전달 성분은 리포폴리아민과 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 혼합물을 포함한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 폴리(L-글루탐산), 스티렌 말레산 무수물, 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 또는 폴리디비닐에테르 말레산 무수물이다. 일부 양태에서, 혼합물 중의 리포폴리아민 대 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 비는 1:1 내지 10:1이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.01:1 내지 약 40:1; 약 0.01:1 내지 약 30:1; 약 0.01:1 내지 약 20:1; 약 0.01:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.01:1 내지 약 5:1)의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재한다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 0.1:1 내지 약 50:1(예를 들어, 약 0.1:1 내지 약 40:1; 약 0.1:1 내지 약 30:1; 약 0.1:1 내지 약 20:1; 약 0.1:1 내지 약 10:1, 또는 약 0.1:1 내지 약 5:1)이다. 일부 양태에서, 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1이다.
[0463]
일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 리포폴리아민 또는 이의 유도체와 복합체화된 약 0.1 mg/ml 내지 약 10.0 mg/ml(예를 들어, 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml; 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 5 mg/ml)의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 리포폴리아민 또는 이의 유도체와 복합체화된 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml(예를 들어, 약 1 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 2 mg/ml 내지 약 6 mg/ml; 약 5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml; 또는 약 6 mg/ml 내지 약 10 mg/ml)의 핵산을 포함한다.
[0464]
일부 양태에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터는 전달 성분, 예를 들어, 리포폴리머와 복합체화되거나 이에 의해 캡슐화된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터는 전달 성분, 예를 들어, 리포폴리머에 의해 캡슐화된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 전달 성분, 예를 들어, 리포폴리머에 의해 캡슐화된다. 일부 양태에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터의 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 60%, 또는 약 40% 내지 약 80%는 전달 성분, 예를 들어, 리포폴리머와 복합체에 의해 캡슐화된다. 일부 양태에서, 전달 성분은 미세세포 구조를 형성한다.
5.4.1.4
폴록사머 및 이의 유도체
[0465]
일부 양태에서, 전달 성분은 폴록사머 백본의 적어도 하나의 말단에 공유적으로 커플링된 금속 킬레이터를 갖는 폴록사머 백본(예를 들어, 크라운 폴록사머)을 포함한다. 일부 양태에서, 금속 킬레이터는 폴록사머 백본의 적어도 2개의 말단에 커플링된다. 일부 양태에서, 폴록사머 백본은 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 미국 공개 제2010/0004313호에 개시된 폴록사머 백본이다. 일부 양태에서, 금속 킬레이터는 미국 공개 제2010/0004313호에 개시된 금속 킬레이터이다. 일부 양태에서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신의 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 폴리머 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:
상기 식에서,
A는 2 내지 141의 정수를 나타내고;
B는 16 내지 67의 정수를 나타내고;
C는 2 내지 141의 정수를 나타내고;
RA 및 RC는 동일하거나 상이하고, R'-L- 또는 H이고, 여기서 RA 및 RC 중 적어도 하나는 R'-L-이고;
L은 결합, -CO-, -CH2-O-, 또는 -O-CO-이고;
R'는 금속 킬레이터이다.
[0466]
일부 양태에서, 금속 킬레이터는 R N NH―, R N 2N―, 또는 (R''―(N(R'')―CH2CH2) x )2―N―CH2CO―이고, 여기서 각각의 x는 독립적으로 0 내지 2이고, R''는 HO2C-CH2-이다.
[0467]
일부 양태에서, 금속 킬레이터는 12-크라운-4, 15-크라운-5, 18-크라운-6, 20-크라운-6, 21-크라운-7, 및 24-크라운-8로 이루어진 군으로부터 선택된 크라운 에테르이다. 일부 양태에서, 크라운 에테르는 치환된-크라운 에테르이고, 여기서 치환된 크라운 에테르는 하기를 갖는다:
(1) NH 또는 S로 독립적으로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 산소,
(2) -C6H4-, -C10H6-, 또는 -C6H10-로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-CH2- 모이어티,
(3) -C4H2O- 또는 -C5H3N-으로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-O-CH2- 모이어티, 또는
(4) 이의 임의의 조합.
[0468]
일부 양태에서, 금속 킬레이터는 크립탄드이고, 여기서 크립탄드는 (1,2,2) 크립탄드, (2,2,2) 크립탄드, (2,2,3) 크립탄드, 및 (2,3,3) 크립탄드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 크립탄드는 치환된-크립탄드이고, 여기서 치환된-크립탄드는 하기를 갖는다:
(1) NH 또는 S로 독립적으로 치환된 하나 이상의 크립탄드 에테르 산소,
(2) -C6H4-, -C10H6-, 또는 -C6H10-로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-CH2- 모이어티,
(3) -C4H2O- 또는 -C5H3N-으로 치환된 하나 이상의 크라운 에테르 -CH2-O-CH2- 모이어티, 또는
(4) 이의 임의의 조합.
[0469]
일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머(아자-크라운-연결 폴록사머)이고, 여기서 크라운 폴록사머는 하기 화학식을 갖는 폴리머 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 폴리머의 총 분자량은 약 2,000 Da 내지 약 2,200 Da이다:
상기 식에서,
a는 약 10 단위의 정수를 나타내고;
b는 약 21 단위의 정수를 나타낸다.
[0470]
일부 양태에서, 폴리머는 약 0.1% 내지 약 5% 또는 약 0.5% 내지 약 5%로 폴리뉴클레오티드, 다중시스트론성 mRNA 벡터, 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재한다.
[0471]
일부 양태에서, 전달 성분은 벤즈알코늄 클로라이드(BAK)를 추가로 포함한다.
[0472]
일부 양태에서, 전달 성분은 BD15-12를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 BD15-12 폴리머(N:P)의 비는 5:1이다.
[0473]
일부 양태에서, 전달 성분은 Omnifect를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 Omnifect 폴리머(N:P)의 비는 10:1이다.
[0474]
일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머(아자-크라운-연결 폴록사머)를 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 크라운 폴록사머(N:P)의 비는 5:1이다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 PEG-PEI-콜레스테롤(PPC) 리포폴리머를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 Omnifect를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 크라운 폴록사머 및 BD15-12를 포함한다.
[0475]
일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민 및 mPEG 변형된 스타라민을 포함한다. 일부 양태에서, mPEG 변형된 스타라민은 스타라민-mPEG515이다. 일부 양태에서, mPEG 변형된 스타라민은 스타라민-mPEG11이다. 일부 양태에서, 스타라민 대 mPEG 변형된 스타라민의 비는 10:1이다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 대 폴리머(N:P) 비는 5:1이다. 일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민, mPEG 변형된 스타라민, 및 크라운 폴록사머를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민, 스타라민-mPEG515, 및 크라운 폴록사머를 포함한다. 일부 양태에서, 전달 성분은 스타라민, 스타라민-mPEG11, 및 크라운 폴록사머를 포함한다.
5.5
키트 및 용기
[0476]
본 개시는 또한 본원에 기재되고 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물을 포함하는 용기를 특징으로 한다. 일부 양태에서, 용기는 유리 바이알이다.
[0477]
본 개시는 또한 본원에 기재되고 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물을 포함하는 키트를 특징으로 한다. 키트는 특히 진단, 기초 연구, 또는 치료 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 약학적 조성물, 및 다른 제제를 공급하는 데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법에서 하나 이상의 본원에 기재되거나 예시된 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 대상체에서 SARS-CoV-2 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하기 위한 방법에서 본원에 기재되거나 예시된 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
5.6
용도 및 방법
[0478]
본 개시는 또한 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 유효량의 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 또는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 면역 반응은 본원에 개시된 하나 이상의 병원체 항원, 예를 들어, SARS-CoV-2 바이러스 항원에 대한 것이다.
[0479]
일부 양태에서, 면역 반응은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원에 대한 것이다.
[0480]
일부 양태에서, 면역 반응은 예르시니아 페스티스 항원 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원으로부터 선택된 박테리아 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, 또는 rAg85A 항원이다.
[0481]
일부 양태에서, 면역 반응은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 바이러스 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원 또는 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원 또는 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, 또는 HSV-2 표면 당단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, 또는 gE2 항원이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, 또는 Pol 항원이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원 또는 G 항원이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, 또는 DEN-80E 항원이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, 또는 VP35 항원이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, 또는 CKD 항원이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), 또는 MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36)이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 또는 융합 단백질 MV-F 항원이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, 또는 S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, 또는 M 단백질 항원이다.
[0482]
일부 양태에서, 면역 반응은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 면역 반응은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편 및 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편에 대한 것이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 기생충 항원에 대한 것이고, 여기서 기생충 항원은 원생동물 항원이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 톡소플라스마 곤디 항원 또는 플라스모디움 팔시파룸 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충 항원에 대한 것이다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 또는 서컴스포로자이트 단백질 항원이다. 일부 양태에서, 면역 반응은 기생충 항원에 대한 것이고, 여기서 기생충 항원은 기생성 또는 병원성 진균 항원이다. 일부 양태에서, 기생 또는 병원성 진균 항원은 칸디다 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0483]
또한, 대상체에서 바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2), 박테리아 또는 기생충 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
[0484]
또한, 본 개시는 대상체에서 바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2), 박테리아 또는 기생충 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 본원에 기재되거나 예시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 다중시스트론성 mRNA 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 또는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
[0485]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 1에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0486]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 2에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0487]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 3에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0488]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 4에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0489]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 5에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0490]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 6에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0491]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-2를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 7에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0492]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 8에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0493]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I을 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC I를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 9에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0494]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, MHC II를 인코딩하고 프로모터 Z에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 10에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0495]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, IL-15를 인코딩하고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드; 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제5 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제5 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 뉴클레오티드 서열은 도 11에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0496]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, CCL3을 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' 제1 뉴클레오티드 서열로서, CCL3를 인코딩하고 프로모터 X에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제1 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제2 뉴클레오티드 서열로서, CCL4를 인코딩하고 프로모터 Y에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제3 뉴클레오티드 서열로서, 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 1에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 제4 뉴클레오티드 서열로서, 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하고 프로모터 2에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 12에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0497]
일부 양태에서, 방법은 도 1 내지 12 중 어느 것에 예시된 벡터 작제물에 도시된 바와 같이 구성된 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 약학적 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 벡터 작제물은 "Covid-19 스파이크 유전자"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및 "Covid-19 유전자-2"(SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)를 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원을 인코딩한다.
[0498]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 14c(pVac 2)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0499]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, hEF1-HTLV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)을 인코딩하고 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 및 제4 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p340을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 14d(pVac 3)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0500]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 및 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p40을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오티드 서열은 도 14f(pVac 5)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0501]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, 전장 SARS-CoV-2 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)을 인코딩하고 IRES 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열; 제3 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p35를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제3 뉴클레오티드 서열; 제4 뉴클레오티드 서열로서, IL-12 p340을 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드 서열은 도 14g(pVac 6)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0502]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드 서열은 도 14b(pVac 1) 또는 도 14e(pVac 4)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0503]
일부 양태에서, 본 개시의 방법은 제1 뉴클레오티드 서열로서, 제1 병원체 단백질(예를 들어, SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질)을 인코딩하고 제1 프로모터(예를 들어, EF-1α 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열; 및 제2 뉴클레오티드 서열로서, 제2 병원체(예를 들어, SARS-CoV-2 M 단백질)를 인코딩하고 제2 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 조성물의 투여에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 제1 뉴클레오티드 서열은 도 14h(pVac 7)에 도시된 바와 같이 구성된다.
[0504]
일부 양태에서, 방법은 도 14a 내지 14h 중 어느 것에 어느 것에 예시된 벡터 작제물에 도시된 바와 같이 구성된 폴리뉴클레오티드 및 전달 성분을 포함하는 약학적 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하고, 벡터 작제물은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질(제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열) 및/또는 SASRS-CoV-2 M 단백질(제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열)을 본원에 개시된 병원체 항원 또는 이의 항원성 단편의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 대한 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 바이러스 항원, 하나 이상의 박테리아 항원, 또는 하나 이상의 기생충 항원을 포함하는 하나 이상의 항원을 인코딩한다.
[0505]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 항원은 예르시니아 페스티스 피막 항원이다. 일부 양태에서, 예르시니아 페스티스 피막 항원은 F1-Ag 또는 독성 항원(V-Ag)이다. 일부 양태에서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 Apa 항원, HP65 항원, rAg85A 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0506]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 엔테로바이러스 항원은 엔테로바이러스 71(E71) 항원, 콕사키바이러스(Cox) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, E71 항원은 E71-VP1 항원, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST)-태깅된 E71-VP1 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, Cox 단백질 항원은 GST-태깅된 Cox 단백질 항원이다. 일부 양태에서, HSV 항원은 HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 표면 당단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HSV-2 표면 당단백질 항원은 gB2 항원, gC2 항원, gD2 항원, gE2 항원, 또는 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, HIV 항원은 Env 항원, Gag 항원, Nef 항원, Pol 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 조합이다. 일부 양태에서, HPV 항원은 부캡시드 단백질 L2 항원이다. 일부 양태에서, 부캡시드 단백질 L2 항원은 부캡시드 단백질 L2의 하나 이상의 에피토프 도메인(아미노산 10 내지 36 및/또는 아미노산 65 내지 89)을 포함한다. 일부 양태에서, HCV 항원은 비-구조 3(NS3) 항원이다. 일부 양태에서, RSV 항원은 F 항원, G 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뎅기 바이러스 항원은 E 단백질 항원, E 단백질 도메인 III(EDIII) 항원, 비-구조 단백질 1(NS1) 항원, DEN-80E 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 에볼라 바이러스 항원은 스파이크 당단백질(GB) 항원, VP24 항원, VP40 항원, 핵단백질(NP) 항원, VP30 항원, VP35 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 지카 바이러스 항원은 외피 도메인 III 항원, CKD 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 치쿤구니야 바이러스 항원은 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI(SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL(SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG(SEQ ID NO: 36), 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 홍역 바이러스 항원은 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 융합 단백질 MV-F 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, MERS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, SARS-CoV 항원은 스파이크(S) 단백질 항원, S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, 외피(E) 단백질 항원, M 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다.
[0507]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 임의의 인플루엔자 바이러스 타입 또는 서브타입으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된다. 일부 양태에서, 인플루엔자 바이러스 타입 A로부터 유래된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 (a) H1 내지 H18 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 HA 서브타입 및 (b) N1 내지 N11 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 NA 서브타입을 갖는다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H2N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H5N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N7; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H7N9; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H9N2; 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H1N1; 인플루엔자 바이러스 타입 A, 서브타입 H3N2; 또는 이의 조합으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 타입 B로부터 유래된다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 또는 이의 항원성 단편 및 본원에 개시된 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다.
[0508]
일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩하며, 여기서 하나 이상의 기생충 항원은 하나 이상의 원생동물 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 톡소플라스마 곤디 항원은 항원 MIC8이다. 일부 양태에서, 플라스모디움 팔시파룸 항원은 SERA5 폴리펩티드 항원, 서컴스포로자이트 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 기생충 항원을 인코딩하며, 여기서 하나 이상의 기생충 항원은 하나 이상의 기생성 또는 병원성 진균 항원을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 기생성 또는 병원성 진균 항원은 칸디다 종 항원(예를 들어, 칸디다 알비칸스 항원, 칸디다 글라브라타 항원, 칸디다 파라프실로시스 항원, 칸디다 트로피칼리스 항원, 칸디다 루시타니아에 항원, 칸디다 크루세이 항원), 뉴모시스티스 종 항원, 말라세지아 종 항원(예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 항원), 아스페르길루스 푸미가투스 항원, 크립토코커스 종 항원(예를 들어, 크립토코커스 네오포르만스 항원, 크립토코커스 가티 항원), 히스토플라스마 캅술라툼 항원, 블라스토미세스 더마티디스 항원, 파라코시디오이데스 종 항원(예를 들어, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스 항원, 파라콕시디오이데스 루트지 항원), 콕시디오이데스 종 항원(예를 들어, 콕시디오이데스 이미티스 항원, 콕시디오이데스 포사다시 항원), 페니실리움 마르네페이 항원, 스포로트릭스 쉔키 항원, 트리코스포론 아사히 항원, 푸사리움 종 항원(예를 들어, 푸사리움 솔라눔 항원, 푸사리움 옥시스포룸 항원), 네크트리아 종 항원, 슈도알레스케리아 보이디 항원, 클라도피알포라 반티아눔 항원, 라미클로리디움 종 항원, 다크트릴라리아 갈로파바 항원, 엑소피알라 종 항원(예를 들어, 엑소필라 진셀메이 항원, 엑소필라 더마티디스 항원), 쿠르불라리아 종 항원, 바이폴라리스 종 항원, 알테르나리아 종 항원, 라카지아 로보이 항원, 코니디오볼루스 종 항원(예를 들어, 코니디오볼루스 코로나투스 항원, 코니디오볼루스 인콘그루우스 항원), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0509]
일부 양태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 각각 제1 SARS-CoV-2 항원 및 제2 SARS-CoV-2 항원을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
[0510]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
[0511]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0512]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0513]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
[0514]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
[0515]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0516]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 6의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0517]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다.
[0518]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함한다.
[0519]
일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0520]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 40의 연속 아미노산은 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이(즉, 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 또는 이의 임의의 조합)를 포함한다.
[0521]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 각각 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Li, T. et al., Emerg Microbes Infect. 9(1):2076-90 (2020); Lee, P. et al., Immune Netw. 21(1):e4 (2021); Yu, J. et al., Science 369(6505):806-11 (2020); Cattin-Ortola, J. et al., Nat Commun. 12(1):5333 (2021); Corbett, K. et al., Nature 586(7830):567-71 (2020); Hsieh, C. et al., Science 369(6510):1501-5 (2020); 및 Harvey, W. et al., Nat Rev Microbiol. 19(7):409-24 (2021)]에서 이전에 보고된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
[0522]
일부 양태에서, SARS-CoV-2 전장 S 단백질, SARS-Cov-2 S 단백질의 RBD, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛, 또는 이의 항원성 단편에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13, S12P, S13I, L5F, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, ΔH69-V70, G75V, T76I, D80A, T95I, R102I, ΔD119-F120, C136Y, D138Y, ΔF140, ΔL141-Y144, ΔY144, Y144S, Y145N, ΔH146, N148S, K150R, K150E, K150T, K150Q, S151P, W152C, E154K, ΔE156-F157, F157L, F157A, R158G, R190S, ΔI210, D215G, A222V, ΔL241-S243, ΔL242-L244, ΔA243-L244, ΔR246-G252, R246I, Y248과 L249 사이의 11-아미노산 잔기 삽입, D253G, D253N, R346K, V367F, E406W, K417E, K417V, K417N, K417T, N439K, K444A, K444R, K444N, K444Q, V445A, V445E, G447A, N450D, L452R, L452Q, Y453F, L455F, N460I, S477G, S477N, S477R, T478I, T478K, V483I, E484K, E484Q, G485R, F486A, F486V, F486L, N487A, F490S, Q493E, Q493K, S494P, N501Y, A570D, Q613H, D614G, H655Y, Q677H, Δ678-679, Δ681-682, Δ681-684, Δ682-685, P681H, P681R, R682S, R682A, R682Q, R683S, R683G, R683Q, R685G, R685Q, I692V, A701V, T716I, F817P, T859N, F888L, A892P, A899P, A942P, D950N, S982A, K986P, V987P, T1027I, Q1071H, D1118H, V1176F, M1229I, ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, ΔK1255-T1273, D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0523]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N-말단 신호 펩티드에 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1 내지 13에 상응한다. 일부 양태에서, N-말단 신호 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔM1-S13이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0524]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 양태에서, 전장 SARS-CoV-2 S 단백질의 C-말단에서 하나 이상의 돌연변이는 C-말단 소포체(ER) 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 이는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1254 내지 1273에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A, E1258A, D1259A, D1260A, E1262A, K1269A, H1271K, T1273A, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 D1257A + E1258A + D1259A + D1260A + E1262A(즉, D/E에서 A로의 돌연변이체)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, C-말단 ER 체류 펩티드에서 하나 이상의 돌연변이는 ΔC1253-T1273, ΔC1254-T1273, 또는 ΔK1255-T1273이다.
[0525]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 681-PRRAR/SVA-688 S1/S2 푸린 절단 부위에서 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R683S(즉, SSAR 돌연변이), (b) Δ681-684(즉, ΔPRRA 돌연변이), (c) Δ678-679 + Δ681-682, (d) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (e) R682Q + R683Q + R685Q, (f) R682S + R685G, 또는 (g) Δ682-685(즉, ΔRRAR 돌연변이)이고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0526]
일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G(즉, 682-AGAG-685 돌연변이) 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682A + R683G + R685G (즉, 682-AGAG-685 돌연변이), (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682Q + R683Q + R685Q, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G 및 (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 (a) R682S + R685G, (b) K986P + V987P (즉, S-2P 돌연변이), 및 (c) F817P + A892P + A899P + A942P (즉, 헥사-프롤린 S 돌연변이)를 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 상응한다.
[0527]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 M 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함한다.
[0528]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 포함하고, 여기서 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 연속 아미노산 서열은 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 폴리펩티드는 A2S, F28L, I48V, V70L, I82T, M84T, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 8에 상응한다.
[0529]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 E 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
[0530]
일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
[0531]
일부 양태에서, 프로모터 1은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0532]
일부 양태에서, 프로모터 2는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0533]
일부 양태에서, 프로모터 X는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0534]
일부 양태에서, 프로모터 Y는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0535]
일부 양태에서, 프로모터 Z는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터이다.
[0536]
일부 양태에서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[0537]
투여 과정은 제제 또는 제제들, 및 요망되는 효과에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 투여 과정은 치료제(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 백신, 조성물, 또는 약학적 조성물)를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. DNA 백신을 포함하는 조성물을 전달하는 방법은 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있다.
[0538]
투여는 치료제에 적절한 임의의 수단, 예를 들어, 비경구, 점막, 폐, 국소, 카테터-기반, 또는 경구 전달 수단에 의해 달성될 수 있다. 비경구 전달은, 예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 복강내, 림프내, 및 기관의 조직으로의 주사를 포함할 수 있다. 점막 전달은, 예를 들어, 바람직하게는 환자의 기도, 즉, 코, 부비동, 인후, 폐로, 예를 들어, 점적액으로서, 분무, 기화, 또는 당 분야에 공지된 다른 방법에 의해 투여되는 비강내 전달을 포함할 수 있다. 경구 또는 비강내 전달은 추진제의 투여를 포함할 수 있다. 폐 전달은 제제의 흡입을 포함할 수 있다. 카테터-기반 전달은 이온영양 카테터-기반 전달에 의한 전달을 포함할 수 있다. 경구 전달은 코팅된 알약의 전달, 또는 입에 의한 액체의 투여를 포함할 수 있다. 투여는 또한 일반적으로 당 분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 완충제, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류 접합체, 리포솜, 및/또는 지질과 같은 약학적으로 허용되는 담체로의 전달을 포함할 수 있다.
[0539]
폐 전달은 제제의 흡입을 포함할 수 있다. 카테터-기반 전달은 이온영양 카테터-기반 전달에 의한 전달을 포함할 수 있다. 경구 전달은 코팅된 알약의 전달, 또는 입에 의한 액체의 투여를 포함할 수 있다. 투여는 또한 일반적으로 당 분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 완충제, 폴리펩티드, 펩티드, 다당류 접합체, 리포솜, 및/또는 지질과 같은 약학적으로 허용되는 담체로의 전달을 포함할 수 있다.
[0540]
일부 양태에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 PFU로 계산하여 대상체당 대략 102 내지 1014 PFU, 105 내지 1012 PFU, 또는 106 내지 1010 PFU에 상응하는 양으로 투여된다. 일부 양태에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 PBS(인산염 완충 염수) 또는 염수에 바이러스 벡터를 현탁시킴으로써 제조된 바이러스 벡터 현탁액을 국소 부위에(예를 들어, 폐 조직, 간, 근육 또는 뇌로) 직접 주사함으로써, 비강 또는 호흡 흡입에 의해, 또는 혈관내(예를 들어, 동맥내, 정맥내, 및 문맥내), 림프내, 피하, 피부내, 피내, 또는 복강내 투여에 의해 투여된다.
[0541]
본 개시는 또한 본원에 기재되거나 예시된 임의의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) 본원에 개시된 전달 성분을 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 조합하는 단계, (b) 조합된 전달 성분 및 폴리뉴클레오티드를 분말로 동결건조시키는 단계, 및 (c) 분말을 희석제로 재구성하여 전달 성분과 복합체화된 핵산의 용액을 형성시키는 단계를 포함한다.
[0542]
본 개시의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당 분야의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다.
[0543]
상기 인용된 모든 참조문헌뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참조문헌 및 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 젠뱅크 번호 및/또는 Uniprot 번호)은 그 전체가 본원에 인용에 의해 포함된다.
[0544]
하기 실시예는 제한이 아니라 예시로서 제공된다.
실시예
6.1
벡터 작제
[0545]
DNA 플라스미드 벡터는 도 1 내지 12에 도시된 바와 같은 요소로 작제된다. 출발 플라스미드 백본 사용 벡터 작제물은 DNA 플라스미드 작제물을 생성하기 위해 요망되는 발현 카세트를 서브클로닝하는 데 이용될 다수의 제한 부위를 함유할 것이다. 벡터로 클로닝되는 각각의 발현 카세트는 기능 단백질 또는 항원을 발현시키는 데 필요한 모든 필요한 성분(예를 들어, 프로모터 서열, 유전자 서열, 폴리 A 꼬리 서열)을 함유할 것이다. 일반적인 방법은 출발 DNA 플라스미드 백본을 적절한 제한 분해 효소로 분해하는 것으로 이루어질 것이다. 삽입 서열은 적절한 제한 분해 효소를 사용하여 제2 DNA 플라스미드로부터 유전자 서열을 단리하고 겔 정제함으로써 수득될 것이다. 대안적으로, 플라스미드 벡터에 삽입될 서열은 합성적으로 생성되거나 이전의 두 가지 접근법의 조합이 사용될 수 있다. 출발 백본 및 삽입 서열은 함께 혼합되고 DNA 리가제를 사용하여 결찰될 것이다. 생성된 DNA 플라스미드는 이후 표준 프로토콜을 사용하여 이. 콜라이로 형질전환되고 적절한 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트 상에 스트리킹된다. 박테리아 콜로니는 후속하여 배지에서 단리되고 성장될 것이며, 이에 따라 정확한 플라스미드를 갖는 콜로니를 확인하기 위해 플라스미드가 정제되고 제한 분해 및 겔 전기영동에 의해 스크리닝될 수 있다.
6.2
전달 성분을 갖는 벡터 제형
[0546]
본 개시는 하기 화학식의 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머와 복합체화된 핵산(예를 들어, DNA 플라스미드 벡터 또는 다중시스트론성 mRNA 벡터)을 포함할 수 있다:
상기 식에서, A 및 B는 개별 선형 폴리에틸렌이민 사슬의 분자량이 5,000 내지 20,000 달톤이 되도록 하고; 분자간 가교는 아민의 약 5 내지 10%를 연결하고; 생분해성 가교는 디티오디프로피오닐(각각의 절반은 3개의 탄소 원자를 포함함)이고 1 내지 10개의 탄소 원자일 수 있다.
[0547]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 10,000 내지 15,000 달톤 선형 PEI를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조). 폴리머를 멸균수에 용해시켜 3 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. DNA를 멸균수에 용해시켜 1 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. 폴리머/DNA 복합체를 제조하기 위해, 2개의 성분을 각각 150 uL의 부피까지 5% 글루코스로 개별적으로 희석한 다음, 플라스미드 DNA 용액을 폴리머 용액에 첨가하였다.
[0548]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 10,000 내지 15,000 달톤 선형 PEI를 포함하고(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조), 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 추가로 접합된다. 생성된 폴리머를 멸균수에 용해시켜 3 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. DNA를 멸균수에 용해시켜 1 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. 폴리머/DNA 복합체를 제조하기 위해, 2개의 성분을 각각 150 uL의 부피까지 5% 글루코스로 개별적으로 희석한 다음, 플라스미드 DNA 용액을 폴리머 용액에 첨가하였다.
[0549]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 10,000 내지 15,000 달톤 선형 PEI를 포함하고(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조), 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 추가로 접합된다. 생성된 폴리머를 멸균수에 용해시켜 3 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. DNA를 멸균수에 용해시켜 1 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. 폴리머/DNA 복합체를 제조하기 위해, 2개의 성분을 각각 150 uL의 부피까지 5% 글루코스로 개별적으로 희석한 다음, 플라스미드 DNA 용액을 폴리머 용액에 첨가하였다.
[0550]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 15,000 내지 20,000 달톤 선형 PEI를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조). 폴리머를 멸균수에 용해시켜 3 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. DNA를 멸균수에 용해시켜 1 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. 폴리머/DNA 복합체를 제조하기 위해, 2개의 성분을 각각 150 uL의 부피까지 5% 글루코스로 개별적으로 희석한 다음, 플라스미드 DNA 용액을 폴리머 용액에 첨가하였다.
[0551]
일부 양태에서, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머는 디티오프로피오닐 연결로 공유적으로 연결된 15,000 내지 20,000 달톤 선형 PEI를 포함하고(예를 들어, 미국 특허 제8,445,017호 참조), 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 추가로 접합된다. 생성된 폴리머를 멸균수에 용해시켜 3 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. DNA를 멸균수에 용해시켜 1 mg/ml의 최종 농도를 제공하였다. 폴리머/DNA 복합체를 제조하기 위해, 2개의 성분을 각각 150 uL의 부피까지 5% 글루코스로 개별적으로 희석한 다음, 플라스미드 DNA 용액을 폴리머 용액에 첨가하였다.
[0552]
복합체 형성을 실온에서 15 분 동안 진행시켰다. 유전자 전달에 대한 전하 비율의 효과를 연구하기 위해, 생분해성 가교된 양이온성 폴리머를 갖는 DNA 복합체가 상이한 비 1/15/1, 10/1, 및 20/1 질소/포스페이트(N/P)로 제조될 수 있다. 복합체 형성 후, 복합체를 입도 및 복합체의 전위 측정을 위해 큐벳에서 희석하였다. 샘플의 전기영동 이동성은 25℃에서, 및 657 nm의 파장에서 및 입고 분석기로 90°의 일정한 각도에서 측정될 수 있다.
6.3
전달 담체 PPC를 갖는 벡터 제형
[0553]
양이온성 리포폴리머를 갖는 완전히 축합된 핵산의 고농축 액체 제형의 벤치-규모 생산을 준비하였다. 이는 양이온성 폴리머와의 핵산 복합체의 제조 후 동결건조 및 등장성 용액으로의 재구성을 포함하였다. 사용된 핵산은 플라스미드 DNA이고, 폴리머는 PEG 및 콜레스테롤에 공유적으로 연결된 PEI 백본(PEG-PEI-콜레스테롤("PPC"))을 포함하였다. PEG와 PEI 사이 및 콜레스테롤과 PEI 사이의 몰비는 각각 0.5 내지 10 및 0.1 내지 10이었다. 먼저, DNA 및 PPC 용액을 주사용수에서 5 mg/ml로 별도로 제조한 다음, 3% 락토스에서 0.3 mg/ml(DNA) 및 1.108 mg/ml(PPC)로 희석하였다. 락토스 용액 중 DNA를 11:1의 질소 대 포스페이트 비(N:P 비)로 마이크로피펫을 사용하여 락토스 용액 중 PPC에 첨가하고, 제형을 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하여 복합체가 형성되도록 하였다. 3% 락토스 중의 PPC/DNA 복합체를 LABCONCO Corp.(Kansas City, Mo)의 FREEZONE 동결 건조 시스템을 사용하여 동결건조시켰다. 500 ul의 제조된 제형을 2 ml의 보로실리케이트 유리 바이알에 첨가한 후, 이를 하기 세그먼트로 이루어진 동결 건조 프로그램을 사용하여 동결건조시켰다:
1)
동결 세그먼트(램프 0.25℃/min, 34℃에서 4 시간 동안 유지),
2)
일차 건조 세그먼트(34℃에서 24 시간 동안 유지),
3)
이차 건조 세그먼트(20℃로 상승시키고 24 시간 동안 유지), 및
4)
0.25℃/min에서 4℃로 상승.
[0554]
생성된 동결건조된 분말을 150 μl의 주사용수로 재구성하여 0.5 mg/ml의 DNA를 제조하였다.
6.4
전달 담체 폴록사머를 갖는 벡터 제형
[0555]
폴록사머를 다양한 농도의 물 또는 염수 용액(0.15 M)에서 1 mg/ml의 핵산을 부드럽게 혼합하였다. 제형화된 플라스미드와 폴록사머 사이의 상호작용을 확인하기 위해 제형화된 폴록사머(5%)/플라스미드 용액을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 제형화되지 않은 플라스미드 DNA와 폴록사머로 제형화된 DNA 사이의 비교는 겔을 통한 유사한 이동을 가졌으므로, 플라스미드 DNA와 폴록사머 사이에 결합이 없음을 지시하였다. 폴록사머를 갖는 제형화된 플라스미드는 포유동물 세포 또는 조직에서 유전자 전달에 사용된다.
6.5
아자-크라운-연결 폴록사머(크라운 폴록사머)의 합성
[0556]
아자-크라운-연결 폴록사머(크라운 폴록사머)를 하기와 같이 작제하였다. 폴록사머 124(Pluronic L-44; 500 mg, 220 μmol)를 톨루엔(3ml)에 용해시키고, 생성된 용액을 톨루엔 중 2M 포스겐 용액 2 ml(4 mmol)로 처리하였다. 실온에서 3 시간 후, 혼합물을 진공에서 농축시키고, 잔류물을 3 ml의 톨루엔에 재용해시키고, 다시 농축시켰다. 잔류물을 건조 클로로포름(5 ml)에 용해시켰다. 이 용액에 아자-18-크라운-6[1-아자-4, 7, 10, 13, 16-펜타옥사사이클로옥타데칸(125 mg, 500 μmol) 및 후니그 염기(Hunig's base)(100 μl, 574 μmol)를 첨가하였다. 70 시간 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 잔류물을 증류수에 재용해시키고, 증류수에 대해 투석하였다[막 컷오프 1000 Da]. 투석물을 농축시켜 410 mg의 표제 화합물을 수득하였다. 양성자 NMR (D2O): 4.20 ppm (t, CH2OC=O); 3.7-3.5 ppm [(-CH2-CH2-O-), 크라운과 폴록사머 둘 모두)]; 3.4 ppm (m, 크라운 CH2N); 1.1 ppm (m, 폴록사머-(CH3)CH-CH2-).
6.6
pVac 벡터 작제
[0557]
바이러스 항원을 발현시키기 위한 DNA 벡터 작제물을 제조하였다. 특히, pVac 1 내지 7로 지칭되는 벡터를 SARS-CoV-2 S 단백질(전장 S 단백질의 아미노산 15 내지 695에 상응하는, SP1 또는 스파이크1)의 S1 서브유닛 또는 둘 모두 D614G 치환을 함유하는 SARS-CoV-2 전장 S 단백질(SARS2S-D614G; 1273개 아미노산 길이)를 발현시키도록 생성시켰다(도 13a). 각각의 벡터의 S 단백질 코딩 서열은 포유동물 EF-1α 프로모터의 제어 하에 있었다. 플라스미드 pVac3, pVac6, 및 pVac7은 SARS-CoV-2 M 항원을 공동-발현하도록 설계되었다. PVac3 및 pVac6 플라스미드는 바이러스 항원 사이에 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 포함하였다. pVac2, pVac3 및 pVac5 플라스미드는 인간 이종이량체 사이토카인 IL12를 추가로 공동-발현하도록 설계되었다. IL-12 p35 및 IL-12 p40 서브유닛에 대한 코딩 서열은 2개의 CMV 프로모터의 제어 하에 있었다(도 13b). 전장 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함하는 비변형된 pUNO 스파이크를 또한 시험하였다(Invivogen(San Diego, CA)).
[0558]
pVac 3의 작제는 TLO1001-SP1-UniRE 벡터 및 단편 MHisPA-unqRE(TWIST, San Francisco, CA; SEQ ID NO: 66)를 사용하여 포함되었다(도 14d). 먼저, p2CMV 벡터를 2개의 CMV 프로모터로부터의 IL-12 p35 및 IL-12 p40 및 hEF1-HTLV 프로모터로부터의 SARS-CoV-2 전장 D614G S 단백질(p2CMV mIL-12 + SARS2S-D614G)을 발현시키도록 조작하였다. 생성된 p2CMV mIL-12 + SARS2S-D614G 벡터를 골격으로서 AgeI/SapI(7677 + 4256 bp)에 의해 절단하였다. AgeImHisPA 삽입물의 PCR을 프라이머 AgeIMhis-F(SEQ ID NO: 51) 및 pAcelsion-R(SEQ ID NO: 52)을 갖는 MHispA-고유 RE 주형을 사용하여 완료하였다. PCR 후, 깁슨 어셈블리 클로닝을 사용하여 p2CMV mIL-12 + SARS2S-D614G 및 MHispA-고유 RE를 포함하는 중간 벡터를 조립하였다. pVac 3 작제를 완료하기 위해, 중간 벡터를 AgeI/SalI-HF (8653 + 46 bp)로 분해하였다. 프라이머 CelsionAgeIsp1-F (SEQ ID NO: 53) 및 IRESSalI-R (SEQ ID NO: 54)을 사용하여 TLO1001-SP1-UniRE 주형으로부터 AgeIspIRESSalI PCR 산물을 증폭시켰다. 이어서, AgeIspIRESSalI PCR 산물을 AgeI/SalI-HF에 의해 분해하고, T4 리가제에 의해 결찰시켰다.
[0559]
pVac 2의 작제(도 14c)는 PspXI/SapI (9782 + 1613 bp)에 의한 pVac 3 벡터(p2CMV mIL-12 + 스파이크1-IRES-M-His-pA)의 분해, 및 이어서 CIP 처리 및 컬럼 정제를 포함하였다. 삽입물에 대한 PCR을 pVac3 주형(p2CMV mIL-12 + 스파이크1-IRES-M-His-pA) 및 PspXI-SV40pA-F (SEQ ID NO: 56) 및 Cls-SapI-R (SEQ ID NO: 57) 프라이머를 갖는 KOD Hot Start DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였다.
[0560]
pVac 1 벡터(도 14b)를 백본으로서 p2CMV-v4 벡터를 사용하여 작제하였다. p2CMV-v4 벡터는 도 14i에 제시되어 있다. p2CMVv4 벡터를 BglII/XmnI(순차 분해: 4693+400 bp)로 절단한 다음, CIP 처리 및 컬럼 정제를 수행하였다. p2CMV mIL-12 + 스파이크1-pA 고유 RE 벡터를 주형으로 사용하여, KOD Hot Start DNA 폴리머라제를 사용하여 Cls-BglII-R-2 (SEQ ID NO: 58) 및 Cls-XmnI-R (SEQ ID NO: 59) 프라이머로 PCR을 수행하였다. 이후, 깁슨 어셈블리를 사용하여 벡터를 완성하였다.
[0561]
완전한 스파이크1-D614G-OP를 갖는 중간 벡터인 pVac 5(도 14f)를 작제하기 위해, 스파이크1-KanR을 합성하였다. 다음으로, 중간 벡터를 AgeI-HF/PspXI에 의해 분해하여 3848, 1772, 및 445 bp의 작제물을 수득하였다. 또한, pVac3 (p2CMV mIL-12 + 스파이크1-pA 고유 RE) 단계 1로부터의 주형을 또한 AgeI-HF/PspXI (Cutsmart)에 의해 분해하여 7927 및 2105 bp의 작제물을 수득하였다. 생성된 작제물을 T4 DNA 리가제에 의해 결찰하고, 클론을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.
[0562]
완전한 스파이크1-D614G-OP를 갖는 중간 벡터인 pVac 4(도 14g)를 작제하기 위해, 스파이크1-KanR을 합성하였다. 다음으로, 중간 벡터를 AgeI-HF/PspXI에 의해 분해하여 3848, 1772, 및 445 bp의 작제물을 수득하였다. 또한, pVac3 p2CMV mIL-12 + 스파이크1-IRES-M-His-pA 고유 RE로부터의 주형을 또한 AgeI-HF/PspXI에 의해 분해하여 7927 및 2105 bp의 작제물을 수득하였다. 생성된 작제물을 T4 DNA 리가제에 의해 결찰하고, 클론을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.
[0563]
pVac6(도 14g)을 작제하기 위해 인간 코돈 최적화된 M 단백질 DNA 단편을 합성하였다. 벡터 p2CMV mIL-12 + 스파이크1-D614G-OP-pA 고유를 PspXI에 의해 분해하고 CIP에 의해 처리하였다. CLS-PspXI-IRES-F (SEQ ID NO: 60) 및 IREScelsion-R (SEQ ID NO: 61) 프라이머를 사용하여 p2CMV mIL-12 + 스파이크1-IRES-M-His-pA로부터의 IRES 단편에 대한 PCR을 완료하였다. 합성된 단편으로부터 M 단백질의 PCR을 Mhiscelsion-F (SEQ ID NO: 62) 및 CLS-M-R (SEQ ID NO: 63) 프라이머를 사용하여 수행되었다. 깁슨 어셈블리를 2개의 인서트와 함께 사용하여 벡터를 생성하였다.
[0564]
pVac7(도 14h)을 작제하기 위해, p2CMV-V4-스파이크1-D614G-OP-pA 고유 RE(pVac3 중간 벡터)를 MluI-HF에 의해 분해하고 CIP에 의해 처리하였다. 합성된 단편으로부터 M 단백질의 PCR을 CLS-XbaI-M-F (SEQ ID NO: 64) 및 CLS-MluI-M-R (SEQ ID NO: 65) 프라이머를 사용하여 완료하였다. 깁슨 어셈블리를 2개의 인서트와 함께 사용하여 벡터를 생성하였다.
6.7
시험관내 발현
[0565]
스파이크 단백질의 발현 수준 및 mIL-12 수준을 COS-1 또는 293T 세포의 시험관내 형질감염 후에 평가하였다. 세포주를 형질감염 하루 전에 10% FBS를 갖는 1 mL의 DMEM에서 150,000개 세포/웰로 12-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음 날, 1 내지 1.5 mg의 플라스미드 DNA를 Omnifect와 혼합하고, 플라스미드 DNA를 실시예에 기재된 바와 같이 혼합하였고; Omnifect/플라스미드 혼합물을 10% FBS의 존재 하에 배양 플레이트의 세포에 첨가하였다. 각 웰에 추가 세포 배양 배지를 첨가하여 각 웰에서 플라스미드 DNA의 농도를 100 내지 200 pM으로 조정하였다. 형질감염된 세포를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간이 종료되었을 때, 세포 배양 배지를 1.5 mL 튜브의 각 웰로부터 수집하고, 세포를 인산염-완충 염수로 세척하고, TENT 완충제(50 mM Tris-Cl [pH8.0] 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100) 또는 베타머캅토에탄올(Qiagen, Hilden, 독일)을 갖는 RNA 용해 완충제로 용해시켰다. 자체 개발된 스파이크 단백질 ELISA, 웨스턴 블롯, 및 qPCR을 사용하여 세포 배양 배지 및 세포 용해물에서 스파이크 단백질 발현 수준을 평가하였다. mIL-12 단백질 발현을 R&D systems(Minneapolis, MN; cat# M1270)로부터 구입한 mIL-12 ELISA에 의해 세포 배양 배지에서 측정하였다. 총 단백질 수준을 BCA 단백질 검정 키트(ThermoFisher, Waltham, MA; cat # 23225)를 사용하여 결정하였다.
웨스턴 블롯
[0566]
총 단백질을 4℃, 10,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 단리하였다. 용해물 단백질 농도를 BCA 검정 키트(ThermoFisher, Waltham, MA; cat # 23225)를 통해 결정하였다. 총 단백질 농도를 표준화하고, 단백질을 Leammli 완충제 및 베타머캅토에탄올과 혼합하고, 95℃에서 5 분 동안 비등시켰다. 단백질을 트리스 글리신 4 내지 12% 프리캐스트 겔에 로딩하고, 100 V에서 2.5 시간 동안 작동시켰다. 겔을 iBlot2 건조 전달 시스템을 사용하여 PVDF 막으로 전달한 후, 막을 실온에서 1 시간 동안 TBST 중 5% 무지방 우유로 차단하였다. 그 후에, 일차 항체를 요망되는 농도로 첨가하고, 막을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 3회 세척한 다음, 권장 농도의 이차 항체와 함께 실온에서 45 분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 막을 TBST로 5 분 동안 3회 세척하고, Licor C-DiGit Blot Scanner에서 ECL 용액을 사용하여 막을 현상하였다.
[0567]
스파이크 S1 단백질의 발현을 293T 세포에서 pVac1의 형질감염 후 확인하였다(도 15a). 또한, PNGase-F로의 분해는 예상되는 분자량 감소를 초래하였다(도 15a). 293T 세포 용해물에서 스파이크 S1 단백질 발현을 또한 pVac1, pVac2, 또는 pVac3으로의 형질감염 후에 확인하였다(도 15b).
qPCR
[0568]
관심 벡터로의 형질감염 후 바이러스 mRNA의 상대적 발현을 평가하기 위해, 정량적 PCR 검정을 개발하였다. 간략히, 293T 세포를 24 시간 동안 비히클 대조 또는 관심 벡터로 형질감염시켰다. 다음으로, 세포를 PBS로 세척하고 베타머캅토에탄올(Qiagen, Hilden, 독일)이 첨가된 RNA 용해 완충제로 용해시켰다. RNA를 Qiagen(Hilden, 독일)의 RNeasy 키트를 사용하여 단리하였다. 분광광도법을 사용하여 RNA 정량화를 수행하고, Verso cDNA 합성 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이후, cDNA를 분자 생물학 등급 수로 1:5 희석하고, Taqman chemistry를 사용하여 5 μL의 샘플에 25 μL의 마스터 믹스를 로딩하였다. qPCR 반응을 표준화된 내인성 대조, 18S에 대한 비교 ΔΔCt 값을 측정하는 고속 taqman 마스터-믹스 조건을 사용하여 Applied Biosystems로부터의 QuantStudio5를 사용하여 수행하였다. RAW Ct 분석과 함께, 통계적 분석을 수행하여 상대적 배수 변화를 계산하였다. 스파이크 S1은 pVac1(3367.1 상대 정량화[RQ]) 또는 pVac2(5538 RQ)로 형질감염된 후 293T 세포 용해물에서 증가된 상대 발현을 나타냈다(증폭 데이터는 제시되지 않음). 또한, 스파이크 S1, 막, 및 18S mRNA는 pVac3으로의 형질감염 후 293T 세포 용해물에서 증가된 상대적 발현을 나타냈다(13412.5 RQ; 데이터는 제시되지 않음).
스파이크 단백질 ELISA
[0569]
스파이크 단백질의 발현 수준을 세포 배양 배지 및 세포 용해물에서 평가하였다. 세포 배양 배지를 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 수집하고, 10,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고 단기 저장을 위해 4℃에서 및/또는 장기 저장(>24 시간)을 위해 -20℃에서 저장하였다. 세포를 인산염-완충 염수로 세척하고, TENT 완충제(50 mM Tris-Cl [pH 8.0] 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100)로 용해시켰다. 용해물을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 수집하고, 10,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하고 단기 저장을 위해 4℃에서 및/또는 장기 저장(>24 시간)을 위해 -20℃에서 저장하였다. 스파이크 단백질 ELISA를 수행하기 위해, 96-웰, Nunc를 1 μg/ml의 일차 스파이크 단백질 항체 형태 Sino Biological(cat# 40150-D003)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 웰을 흡인하고, 300 μl의 세척 완충제(PBS 중 0.05% Tween-20, pH 7.2 내지 7.4)로 4회 세척하였다. 세척 단계 후, 300 μL의 차단 완충제(세척 완충제 중 2% BSA)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 흡인/세척 단계를 반복하였다. Sino Biological로부터의 스파이크 단백질 표준물(40589-V08B1)의 연속 희석액을 희석 완충제(40,000 내지 625 pg/mL)에서 제조하고, 100 μl의 각 표준 희석액, 세포 용해물 및 세포 배양 배지를 표준 웰 및 샘플 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 흡인/세척 단계를 반복하였다. 100 μL의 1 μg/mL 이차 항체(Sino Biological Cat# 4150-D001H)를 각각의 96-웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 흡인/세척 단계를 반복하였다. 등가 부피의 기질 희석 완충제와 함께 DMSO 중 100 μL의 기질 용액 TMB(테트라메틸벤지딘)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 암소 하에 20 분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 정지 용액(1 M 인산)을 각각의 웰에 첨가하였다. 각 웰의 광학 밀도를 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 리더를 사용하여 20 분 이내에 결정하였다.
[0570]
상기 ELISA 방법을 사용하여, 세포 용해물(도 15c)과 세포 배지(도 15d) 둘 모두에서 pVac2와 pVac 3 둘 모두의 형질감염 후 스파이크 단백질을 시험관내에서 확인하였고, mIL12 발현을 세포 배지에서 확인하였다(도 15e). 스파이크 단백질 발현을 pVac1, pVac4 및 pVac5에서 확인하였다(도 15f).
6.8
생체내 발현
분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP) 검정
[0571]
생체내 항원 발현의 동역학 및 양을 평가하기 위해, SEAP를 인코딩하는 리포터 유전자를 갖는 플라스미드 DNA를 0.5% w/v 크라운 폴록사머(CP) 제형과 함께 근육내 주사를 통해 마우스에 투여하였다. 8 내지 10주령의 건강한 암컷 BALB/c 마우스 5마리의 그룹을 SEAP를 인코딩하는 플라스미드 DNA(pDNA)로 면역화하고 CP 또는 PBS로 제형화하였다. 100 ul 용량을 대퇴사두근에서 각각의 마우스(부위당 50 ul)에 투여하였다. 혈액 샘플을 주사 1일, 3일 및 7일 후에 채취하였다. 혈청을 채취 직후 혈액으로부터 분리하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 화학발광 SEAP 검정 Phospha-Light System (Applied Biosystems)을 사용하여 혈청에서 SEAP 효소 활성을 검출하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청을 1x Phospha-Light 반응 완충제 희석제에서 1:20 희석하였다. 샘플을 알루미늄 밀봉 호일로 밀봉된 워터 배쓰에 넣고, 건조 열 블록에서 65℃에서 30 분 동안 열 불활성화시켰다. 3 분 동안 얼음에서 냉각시키고, 실온으로 평형화시킨 후, 50 uL의 PhosphaLight 검정 완충액을 웰에 첨가하고, 샘플을 실온에서 5 분 동안 정치하였다. 이후, 1:20 CSPDR(화학발광 알칼리성 포스페이트 기질) 기질을 함유하는 50 uL의 반응 완충액을 첨가하고, 실온에서 20 분 인큐베이션 후에 발광성을 측정하였다. 웰 당 1 초 통합으로 EL808 ULTRA 마이크로플레이트 리더 발광도계 Bio-Tek(Winooski, VT)에서 발광성을 측정하였다. 각각의 샘플에서 SEAP의 활성을 이중으로 측정하고, 이들 두 측정의 평균을 취하였다.
[0572]
혈청 SEAP 수준을 0일에 근육내 백신접종 후 그룹당 5마리의 마우스의 상대 광 단위(RLU)에 의해 측정하였다. 1, 3 및 7일에 SEAP 분석을 위해 혈청을 수집하고, CP 전달의 유무에 관계없이 근육내 백신접종 후 효소 활성에 대해 측정하였다. 이들 결과는 SEAP를 발현하는 플라스미드 DNA(pDNA SEAP) 전달이 대조 전달에 비해 CP와 비교하여 플라스미드의 제형으로 개선되었음을 보여준다(도 16). 데이터는 그룹당 5마리의 개별 마우스의 산술 평균 역가로 표시된다. 모든 작제물은 크라운 폴록사머(CP)로 제형화된 pDNA SEAP로 백신접종된 마우스의 혈청에서 측정 가능한 수준의 SEAP를 생산하였고, 특히 7일 시점에 발현 수준을 증가시켰다.
6.9
백신 제형
PPC/p백신 제형
[0573]
5% 덱스트로스 용액에서 플라스미드 DNA를 폴리머와 (11:1) 및 (0.5:1) (N:P) 비로 혼합함으로써 백신 플라스미드 DNA를 초기에 0.1 mg/mL에서 PEG-PEI-콜레스테롤(PPC; MW 4.2 kD)로 제조하고, 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 나노복합체가 형성되게 하였다. 이후, pDNA/PPC 나노복합체를 Amicon Ultra Centrifugal Filters (Ultracel-3K MWCO)를 사용하여 1 내지 5 mg/mL로 농축시켰다.
[0574]
PPC/DNA 복합체의 전기영동 이동성을 70 V에서 1 시간 동안 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정하였다. 실온에서 10 분 동안 50 μg의 덱스트란 설페이트 또는 트리톤-X와 함께 복합체를 인큐베이션한 후 100 볼트에서 1 시간 동안 겔 전기영동에 의해 복합체에서의 DNA 온전성을 결정하였다. Milli-Q 수 중 나노복합체의 입도를 Malvern 입도 분석기를 사용하여 동적 광 산란에 의해 90°의 일정한 각도로 657 nm에서 결정하였다. 제형의 오스몰농도는 Fiske210 마이크로-샘플 삼투압계를 사용하여 결정하였고, DNA 정량화는 분광광도계를 사용하여 수행하였고, 제형 pH는 Accumet research AR15 pH 미터를 사용하여 측정하였다.
BD15-12/p백신 제형
[0575]
5% 덱스트로스 용액에서 플라스미드 DNA를 폴리머와 10:1 및 0.5:1의 N:P 비로 혼합함으로써 백신 플라스미드 DNA를 초기에 0.1 mg/mL에서 PEI-기반 코폴리머, BD15-12 (15kD 선형 PEI; MW 26.5 kD)로 제조하고, 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 나노복합체가 형성되게 하였다. 이후, BD15-12/pDNA 나노복합체를 Amicon Ultra Centrifugal Filters (Ultracel-3K MWCO)를 사용하여 2.5 내지 5 mg/mL로 농축시켰다.
[0576]
BD15-12/DNA 복합체의 전기영동 이동성을 70 V에서 1 시간 동안 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정하였다. Milli-Q 수 중 나노복합체의 입도를 Malvern 입도 분석기를 사용하여 동적 광 산란에 의해 90°의 일정한 각도로 657 nm에서 결정하였다. 플라스미드 DNA와 BD15-12의 복합체화는 나노입자로의 DNA 축합을 초래하였고, 아가로스 겔 상에서의 DNA 이동을 방지하였다(데이터는 제시되지 않음). 제형의 오스몰농도는 Fiske 210 마이크로-샘플 삼투압계를 사용하여 결정하였고, DNA 정량화는 분광광도계를 사용하여 수행하였고, 제형 pH는 Accumet research AR15 pH 미터를 사용하여 측정하였다(표 1).
표 1: 제형화된 백신 플라스미드의 DNA 농도, pH, 오스몰농도, 및 입도 결과
1밀리오스몰 농도(mOSM); 2ZAverage(Zave): 광산란을 사용하여 측정된 입자의 평균; 3다분산 지수(PdI); 4di(10): 입자의 10% 미만이 발견되는 크기(nm); 5di(50): 입자의 50%가 발견되는 크기(nm); 6di(90): 입자의 90%가 발견되는 크기(nm).
스타라민: Star-mPEG/p백신 제형:
[0577]
스타라민: 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르(mPEG)/p백신 제형은 스타라민(0.635 kD) 리포솜 및 플라스미드 DNA를 포함한다. 스타라민 단독 또는 스타라민(Star) 및 Star-PEG515(1.2 kD)의 10:1 혼합물을 필름으로 회전-증발시켰다. 리포솜 필름의 플라스크를 고진공 하에 밤새 유지하였다. 주사용수를 필름에 첨가하여 요망되는 스타라민 농도를 제공하고, Branson 워터 배쓰 소니케이터 모델 2510을 사용하여 약 30 분 동안 배쓰를 초음파처리한 후 5 분 동안 프로브 초음파처리하였다(5 내지 10 와트의 출력 와트(rms)를 갖는 연속 펄스 초음파처리 사용)(모델 100; Fisher Scientific Sonic Desmembrator, Pittsburg, PA). 리포솜 용액을 0.2-μm 필터를 통해 여과하고, 5% 덱스트로스로 희석하고, 요망되는 양의 플라스미드와 혼합하였다. 복합체의 입도를 Malvern 입도 분석기 사이저로 측정하였다. 복합체화 효율을 겔 지연 검정(Life Technologies, Carlsbad, CA)에 의해 결정하였다. 스타라민/플라스미드 DNA를 1% 아가로스 겔 상에 로딩함으로써 겔 지연 검정을 수행하였고, 100 V에서 1 시간 동안 전기영동하였다. 스타라민 나노입자로부터 플라스미드 DNA를 방출하기 위해, 10% TritonX-100을 복합체에 첨가하고 용액을 아가로스 겔 상에 로딩하였다. 플라스미드 DNA와 스타라민:스타라민-PEG의 복합체화는 나노입자로의 DNA 축합을 초래하였고, 아가로스 겔 상에서의 DNA 이동을 방지하였다(데이터 제시되지 않음). 제형화 절차로 DNA 및 스타라민 복합체의 응집이 초래되지 않았다. 덱스트란 설페이트 및 트리톤의 첨가는 스타라민으로부터 DNA를 탈복합체화시켜 아가로스 겔 상에서 DNA의 자유 이동성을 야기하였다. 탈복합체화된 DNA 제형에 대한 아가로스 겔 상의 DNA 밴드의 온전한 외관은 DNA가 제형화 과정 동안 분해되지 않았음을 시사한다. 제형의 오스몰농도는 Fiske210 마이크로-샘플 삼투압계를 사용하여 결정하였고, DNA 정량화는 분광광도계를 사용하여 수행하였고, 제형 pH는 Accumet research AR15 pH 미터를 사용하여 측정하였다(표 1).
Omnifect/p백신 제형
[0578]
5% 덱스트로스 용액에서 플라스미드 DNA를 폴리머와 10:1 및 0.5:1의 N:P 비로 혼합함으로써 백신 플라스미드 DNA를 초기에 0.1 mg/mL에서 Omnifect (MW 7.3 kD)로 제조하고, 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 나노복합체가 형성되게 하였다. 이후, Omnifect/pDNA 나노복합체를 Amicon Ultra Centrifugal Filters (Ultracel-3K MWCO)를 사용하여 2.5 내지 5 mg/mL로 농축시켰다.
[0579]
Omnifect/DNA 복합체의 전기영동 이동성을 70 V에서 1 시간 동안 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정하였다. Milli-Q 수 중 나노복합체의 입도를 Malvern 입도 분석기를 사용하여 동적 광 산란에 의해 90°의 일정한 각도로 657 nm에서 결정하였다. 실온에서 10 분 동안 50 μg의 덱스트란 설페이트 또는 트리톤-X와 함께 복합체를 인큐베이션한 후 100 볼트에서 1 시간 동안 겔 전기영동에 의해 복합체에서의 DNA 온전성을 결정하였다. 플라스미드 DNA와 Omnifect의 복합체화는 나노입자로의 DNA 축합을 초래하였고, 아가로스 겔 상에서의 DNA 이동을 방지하였다. 제형화 절차로 DNA 및 스타라민 복합체의 응집이 초래되지 않았다. 추가로, 덱스트란 설페이트 및 트리톤의 첨가는 Omnifect로부터 DNA를 탈복합체화시켜 아가로스 겔 상에서 DNA의 자유 이동을 야기하였다. 탈복합체화된 DNA 제형에 대한 아가로스 겔 상의 DNA 밴드의 온전한 외관은 DNA가 제형화 과정 동안 분해되지 않았음을 시사한다(데이터 제시되지 않음). 제형의 오스몰농도는 Fiske210 마이크로-샘플 삼투압계를 사용하여 결정하였고, DNA 정량화는 분광광도계를 사용하여 수행하였고, 제형 pH는 Accumet research AR15 pH 미터를 사용하여 측정하였다(표 1).
크라운 폴록사머/p백신 제형
[0580]
1 내지 5 mg/ml의 최종 농도를 야기하기 위해 필요한 농도의 플라스미드 DNA를 PBS 또는 NaCl에서 만들고, 혼합물을 저속 볼텍싱에 의해 혼합하고, 필요한 양의 크라운 폴록사머(MW 2.2 Kd)를 DNA 용액에 첨가하여 0.1 내지 5%의 최종 농도를 야기하였다.
[0581]
제형을 -20℃에서 또는 동결건조 목적으로 저장하기 위해, PBS 또는 NaCl 대신에 20 mM Tris-8% 수크로스에서 제형을 제조하였다. 제형의 오스몰농도는 Fiske210 마이크로-샘플 삼투압계를 사용하여 결정하였고, DNA 정량화는 분광광도계를 사용하여 수행하였고, 제형 pH는 Accumet research AR15 pH 미터를 사용하여 측정하였다(표 1).
크라운 폴록사머/양이온 담체 애주번트/p백신 제형
[0582]
0.1 내지 0.5 mg/ml의 최종 농도를 야기하는 데 필요한 농도의 플라스미드 DNA를 5% 덱스트로스 또는 PBS에서 만들고, 혼합물을 저속 볼텍싱에 의해 혼합하고, 필요한 양의 양이온성 애주번트 담체(스타라민, BD15-12, PPC, Omnifect, 벤즈알코늄 클로라이드(BAK))를 플라스미드 DNA에 첨가하였다. pDNA/PPC 나노복합체를 Amicon Ultra Centrifugal Filters (Ultracel-3K MWCO)를 사용하여 1 내지 5 mg/mL로 농축시켰다. 이어서, 크라운 폴록사머(즉, 아자-크라운-연결 폴록사머)를 DNA 용액에 첨가하여 0.1 내지 5%의 최종 농도를 야기하였다. CP-양이온성 담체-pDNA 복합체의 입도를 Malvern 입도 분석기 사이저로 측정하였다. 플라스미드 DNA와 크라운 폴록사머의 혼합은 입도 측정 또는 겔 전기영동에 의해 임의의 검출 가능한 나노입자를 형성하지 않았다. 그러나, 양이온성 전달 시스템이 크라운 폴록사머/DNA 제형에 첨가될 때, 제형에서 측정 가능한 나노입자가 관찰되었다. 복합체화 효율을 겔 지연 검정(Life Technologies, Carlsbad, CA)에 의해 결정하였다. 제형화된 플라스미드 DNA를 1% 아가로스 겔 상에 로딩함으로써 겔 지연 검정을 수행하였고, 100 V에서 1 시간 동안 전기영동하였다. 크라운 폴록사머/DNA 제형을 위한 아가로스 겔 상의 DNA 밴드의 온전한 외관은 크라운 폴록사머가 제형화 과정 동안 DNA에 결합하거나 분해하지 않았음을 시사하였다. 그러나, 양이온성 전달 시스템이 크라운 폴록사머/DNA 제형에 첨가될 때 DNA 밴드의 이동이 관찰되었는데, 이는 DNA와 양이온성 전달 시스템 사이의 상호작용을 시사한다.
[0583]
제형의 오스몰농도는 Fiske210 마이크로-샘플 삼투압계를 사용하여 결정하였고, DNA 정량화는 분광광도계를 사용하여 수행하였고, 제형 pH는 Accumet research AR15 pH 미터를 사용하여 측정하였다(표 2).
표 2: 제형화된 백신 플라스미드의 DNA 농도, pH, 오스몰농도, 및 입도 결과
1밀리오스몰 농도(mOSM); 2ZAverage(Zave): 광산란을 사용하여 측정된 입자의 평균; 3다분산 지수(PdI); 4di(10): 입자의 10% 미만이 발견되는 크기(nm); 5di(50): 입자의 50%가 발견되는 크기(nm); 6di(90): 입자의 90%가 발견되는 크기(nm); 7결정되지 않음(ND)
동결건조 사이클
[0584]
1 ml의 각 제형을 2 ml 유리 바이알에 분취하고, 동결-건조기(LABCONCO Corp. Kansas City, MO.로부터의 FREEZONE Triad 동결 건조 시스템)에 넣었다. 바이알을 16 시간 동안 -45℃로 냉각시킨 다음, 일차 건조를 시작하기 전에 온도를 -15℃로 상승시켰다. 24 시간 후, 선반 온도를 0℃로 상승시키고, 추가 24 시간 동안 진공 하에 유지하였다. 마지막으로, 선반 온도를 72 시간 동안 25℃로 상승시키고, 바이알을 이차 건조 세그먼트의 말미에 진공 하에 캡핑하였다.
6.10
백신 제형에 대한 면역 반응
동물 면역화 절차
[0585]
백신 플라스미드에 대한 면역원성 연구를 사육된 BALB/C 마우스에서 수행하였다. 모든 동물 시험 및 연구는 모든 관련 윤리적 규정을 준수하였고 연구는 IACUC 연구소 위원회의 윤리적 승인을 받았다. 암컷 BALB/c 마우스(약 5 내지 6주령)를 연구에 사용하였다(Envigo, Indianapolis). 0일에, 0.5% 크라운 폴록사머를 갖는 250ug의 제형화된 DNA 플라스미드를 근육내 주사하였다(Quadriceps). 첫 면역화 2주 후에, 동물에게 제1 부스터 용량을 제공하였다. 14일(2wp1) 및 35일(3wp2)에 동물로부터 혈액을 수집하였다. 추가로, 비장세포로부터의 IFN 반응을 35일에 평가하였다.
[0586]
제형 없이 플라스미드를 전달하기 위해 경골에 주사한 후 전기천공을 하였다. 2회(1회/초)의 펄스 수, 25ms의 펄스 지속기간, 및 375/cm의 펄스 강도를 사용하였다. 제형이 없는 DNA 플라스미드의 경우, IM 주사에 50ug 용량을 사용하였다.
[0587]
2회의 면역화의 효능을 3회의 면역화와 비교하는 연구를 또한 수행하였다. 상기 연구에서, 5 내지 6 주령 마우스를 2주 간격으로 0.5% 크라운 폴록사머를 갖는 250ug의 제형화된 DNA 플라스미드로 근육내 면역화시켰다. 분석된 혈액 및 비장을 마지막 주사 3주 후에 분석하였다.
IgG 항원 S-특이적 ELISA
[0588]
개별 혈청 샘플을 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 S-특이적 IgG의 존재에 대해 검정하였다. ELISA 플레이트(96-웰, Nunc)를 PBS 중 1 μg/ml의 정제된 S1 항원으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 세척(0.05% Tween-20을 갖는 PBS) 후, 플레이트를 실온에서 2h 동안 ChonBlock ELISA 완충제(Chondrex, Inc)로 차단하였다. 차단 후, 플레이트를 세척하고 ChonBlock ELISA 완충제에서 혈청의 연속 희석을 별도의 플레이트에서 수행하였다. 연속 희석된 혈청을 검정 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 PBS에서 1:500으로 희석된 항-마우스 IgG, 퍼옥시다제-관련 종-특이적 전체 항체(양으로부터의) 이차 항체(Cytiva)와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 플레이트를 세척하고, TMB 퍼옥시다제 기질 용액(ThermoFisher)을 웰에 첨가하였다. 1M H3PO4(Fisher Scientific)를 첨가하여 반응을 중단시키고, 웰 당 1 초 통합을 사용하는 Gen 5 ELISA 소프트웨어를 사용하여 EL808 ULTRA 마이크로플레이트 리더 발광도계(Winooski, VT)로 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 각각의 혈청 샘플에 대해, 역 혈청 희석의 대수에 대한 광학 밀도(OD)의 플롯을 비선형 회귀(GraphPad Prism)에 의해 생성하였다. 역가는 대략 0.5의 OD에서 역 혈청 희석액으로 규정되었다(모든 플레이트에 포함된 표준 마우스 항-S 단클론성 항체로 표준화됨).
마우스 T-세포 기능 검정
[0589]
IFNγ ELISPOT 검정을 사용하여 마우스 T 세포 기능 검정을 수행하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장을 1X 글루타민 및 펜스트렙이 보충된 CTL-시험 배지(Immunospot Cat# CTLT-005) 배지를 함유하는 멸균 튜브에 수집하였다. 약간의 Macs Octo 해리기(Miltenyi Biotec, Auburn CA)에서 비장을 해리시켜 세포 현탁액을 제조하였다. 이어서, 세포 현탁액을 70μm 세포 스트레이너를 통해 여과하였다. 세포를 원심분리기에서 300 g에서 10 분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛을 1X 글루타민 및 펜스트렙이 보충된 CTL 배지에 재현탁시켰다. CTL 세포 계수 프로그램을 사용하여 세포를 계수하였다. 세포 용액을 각 웰에 대해 250,000개 세포/100μl를 함유하도록 희석하였다.
[0590]
96 웰 마우스 IFN ELISPOT 키트(Mabtech USA) 사전-코팅된 플레이트를 이 검정에 사용하였다. 사용 전에, 플레이트를 멸균 PBS로 4회 수화시켰다(200μl/웰). 이어서, 플레이트를 CTL 배지(RT에서 적어도 30 분 동안 비장세포 단리에 사용된 것과 동일함)로 컨디셔닝하였다. 250,000개의 마우스 비장세포를 각 웰에 플레이팅하고, 표면 당단백질의 N 말단 S1 도메인을 덮는 15mer 펩티드의 푸울로 20h 동안 자극하였다. 펩티베이터 SARS-CoV-2 Prot는 표면 당단백질의 aa 서열 1 내지 692를 함유한다(Miltenyi Biotec, Cat# 130-127-041). 스폿을 제조사 지침에 따라 전개시켰다. CTL 배지 및 PMA(Invitrogen, Waltham, MA)를 각각 음성 및 양성 대조에 사용하였다. 스폿을 Immunospot CTL 리더 S6(CTL, USA)에 의해 스캐닝하고 정량화하였다. 250,000개 세포 당 스폿 형성 단위를 계산하고 이중 웰로부터 평균화하였다.
SARS-CoV-2 슈도바이러스 중화 검정
[0591]
HACE2 및 TMPRSS2(Invivogen, San Diego)를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 96 웰 플레이트에 16 시간 동안 시딩하였다. 백신접종된 그룹 및 나이브 그룹으로부터의 마우스 혈청을 별도의 희석 플레이트에서 1:10 희석으로 시작하여 세포 배지에서 3배 연속 희석하였다. 희석된 혈청을 BPS Bioscience (San Diego, CA)로부터 입수한 고정된 농도의 SARS-CoV-2 S eGFP 리포터(D614G) 슈도타입화된 렌티바이러스와 함께 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 마우스 혈청 및 SARS-CoV-2 S 슈도타입화된 바이러스 혼합물을 세포를 함유하는 96 웰 플레이트로 옮기고, 표준 인큐베이터(37% 습도, 5% CO2)에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. GFP 양성 세포를 감염 후 Immunospot S6 분석기(Cellular Technologies Limited)로 영상화하고, 명시야 이미지를 사용하여 각각의 웰에서 세포의 존재를 확인하였다. SARS-CoV-2 S 슈도바이러스는 hACE2 및 TRMPSS2 단백질 없이 정상 293T 세포를 감염시킬 수 없었다. 중화 역가를 GFP 양성 세포의 수가 바이러스 대조 웰과 비교하여 50% 감소한 혈청 희석액으로 계산하였다.
크라운 폴록사머(pVac1)의 존재 및 부재 하의 신경화 및 면역원성
[0592]
도 17a는 전기천공(EP)에 의해 전달된 pVac1로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 SARS-CoV-2 S eGFP 리포터(D614G) 슈도타입화된 렌티바이러스를 부분적으로 중화시킬 수 있음을 예시한다. 또한, 크라운 폴록사머(CP)와 함께 전달될 때, pVac1은 IgG 항원 S-특이적 ELISA로 측정 시 14일과 35일 둘 모두에 항원-의존성 반응을 확립하였다(도 17b). 마우스 T-세포 기능 검정을 사용하여, 전기천공의 유무와 함께 pUNO 및 pVac1의 T 세포 반응을 측정하였다(도 17c). CP와 함께 전달된 pVac1 및 pUNO 둘 모두는 전기천공을 통한 전달과 비교하여 증가된 T 세포 반응을 가졌다. 도 17c의 각 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다.
[0593]
크라운 폴록사머(CP)로 전달된 pUNO S로 면역화된 마우스로부터의 혈청을 중화 검정을 통해 분석하였다(도 18). CP와 함께 전달될 때, pUNO S는 바이러스 보호를 나타내는 스파이크-슈도바이러스 진입을 차단할 수 있다.
크라운 폴록사머(pVac2 및 PVac3)의 존재 및 부재 하의 면역원성
마우스 T-세포 기능 검정을 사용하여, 전기천공의 유무와 함께 pUNO, pVac2, 및 pVac3의 T 세포 반응을 측정하였다(도 19). 전기천공(EP) 또는 크라운 폴록사머(CP)에 의해 전달된 pUNO, pVac2, 및 pVac3은 15mer S 중첩 펩티드 라이브러리의 존재에서 T 세포 반응(즉, 인터페론 감마(IFNγ) 생산)을 유도하였다. 도 19의 각 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다.
백신 제형에 대한 면역 반응 및 투여 요법
[0594]
마우스 T-세포 기능 검정을 사용하여, 2회 및 3회 면역화 주사에 의한 pUNO 및 pVac1의 T 세포 반응을 측정하였다(도 20a). pVac1에 의한 3회 면역화는 pUNO에 의한 2회 및 3회 면역화 둘 모두보다 더 높은 T-세포 반응을 유도하였다. 모든 면역화 일정은 대조와 비교하여 T 세포 반응을 유도하였다. 각각의 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
[0595]
2회 면역화 또는 3회 면역화 후 DNA 백신(pVac1 및 pUNO 250ug, IM)에 대한 B 세포 반응을 측정하였다(도 20b). 역가는 2회 면역화된 그룹에 비해 3회 면역화된 그룹에서 더 높다. 예기치 않게도, pUNO의 3회 면역화와 비교하여 pVac1의 3회 면역화를 갖는 마우스에서 개선된 세포 반응이 관찰되었다. 각각의 컬럼은 4개의 비장 푸울의 복제물 포인트의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
6.11
추후 전임상 면역화 연구
[0596]
이상적인 부스트 간격 시간을 평가하기 위해, 0.5% 크라운 폴록사머를 갖는 250ug의 제형화된 DNA 플라스미드로의 부스트 IM 주사를 2주, 3주, 및 4주 간격으로 투여하였다. 혈액 및 비장을 단리하여 주사 3주 후에 IgG 반응 및 T 세포 반응을 평가한 다음, SARS-CoV2 슈도바이러스 중화 검정을 수행하였다.
[0597]
제형화된 DNA 플라스미드 백신의 효능을 평가하기 위해, DNA 플라스미드의 평가를 위해 피하 및 피내 경로를 이용하였다. 이들 모든 연구에 대해 IgG 반응 및 T 세포 반응을 평가한 후 SARS-CoV2 슈도바이러스 중화 검정을 수행하였다.
표 3: 서열
SEQUENCE LISTING
<110> CELSION CORPORATION
<120> POLYNUCLEOTIDE VACCINES AND METHODS OF USING THE SAME
<130> 2437.049PC01
<150> US 63/087,118
<151> 2020-10-02
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S Protein
<400> 1
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 2
<211> 1273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S Protein
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
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Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
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Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
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aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
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cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
<210> 28
<211> 419
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 N Protein
<400> 28
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 29
<211> 234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 p(A) tail
<400> 29
ctagctggcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 60
agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 120
taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg 180
gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atgg 234
<210> 30
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bGH p(A) tail
<400> 30
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 31
<211> 742
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CMV promoter
<400> 31
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660
cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720
tcgtttagtg aaccgtcaga tc 742
<210> 32
<211> 418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 promoter
<400> 32
gcgcagcacc atggcctgaa ataacctcta aagaggaact tggttaggta ccttctgagg 60
cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc 120
agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc 180
cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat 240
agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc 300
gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 360
gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctt 418
<210> 33
<211> 508
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAG promoter
<400> 33
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagct 508
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chikungunya virus antigen
<400> 34
Pro Pro Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chikungunya virus antigen
<400> 35
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Asn Leu
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chikungunya virus antigen
<400> 36
Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly
1 5
<210> 37
<211> 251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 Enhancer
<400> 37
ggacctgcag ggcctgaaat aacctctgaa agaggaactt ggttaggtac cttctgaggc 60
ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 120
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 180
ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 240
gtcccactag t 251
<210> 38
<211> 601
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hEF1-HTLV Promoter
<400> 38
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc 240
gaggggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc 300
ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct 360
aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac 420
ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg 480
tttcgttttc tgttctgcgc agttacagat ccaagctgtg accggcgcct acctgagatc 540
accggtcacc atggagatca aggtgctgtt tgccctcatc tgtattgctg ttgctgaggc 600
a 601
<210> 39
<211> 2010
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 D614G Spike Truncated S1
<400> 39
gttaatctca ccacccgaac tcaactccca cccgcatata caaattcctt caccagagga 60
gtgtactatc ctgacaaagt gtttcggtca agtgtcctcc actctactca ggacctcttt 120
ctgcctttct tttctaacgt tacatggttt catgcaatcc atgtgtctgg gacaaacggc 180
accaaacgct tcgacaaccc tgtattgcca ttcaatgatg gggtgtactt tgcctccaca 240
gagaaatcca acatcattcg aggatggatt ttcgggacta ctctggactc aaagacacag 300
agcctgctga tcgttaacaa cgccacaaac gttgtcatca aagtgtgcga attccagttt 360
tgcaatgatc ccttcctggg agtgtactat cacaagaata acaagtcctg gatggagagc 420
gaatttcggg tctacagcag cgcaaacaac tgcaccttcg agtacgtgag tcaacccttt 480
ctgatggacc tggaagggaa acagggaaac ttcaagaacc tgagagagtt tgtctttaag 540
aacatcgacg gctattttaa gatctatagt aagcatacgc ctatcaacct ggtaagggat 600
cttccccagg gcttttcagc cctggaacct ttggttgact tgcctattgg tatcaatatc 660
accagatttc agacccttct ggcattgcat cggtcttatc ttactccagg tgattcctcc 720
tccgggtgga ctgccggcgc cgctgcctac tatgtcggct atctgcaacc aagaacgttc 780
ctgctcaagt acaacgaaaa cggcactatt acggatgctg ttgattgtgc cctggaccct 840
ctgtctgaga ctaaatgcac cctcaagagc tttaccgttg agaaggggat ttaccaaacc 900
agtaatttcc gggtccaacc caccgaaagc attgtgcggt tcccaaatat caccaatctg 960
tgtccctttg gcgaagtgtt caatgctaca aggtttgctt ctgtgtacgc atggaatagg 1020
aaacgcatct ccaattgtgt cgctgattac tccgtgctgt acaattccgc ctctttctca 1080
accttcaagt gttatggcgt ttcacctacc aaacttaacg acctgtgctt cactaatgtg 1140
tatgccgact cttttgtgat acgaggcgat gaagtgagac agattgcacc agggcagacc 1200
ggcaaaattg ccgactacaa ctacaagctt ccagatgact ttaccggatg tgttattgca 1260
tggaactcaa acaatctgga ttccaaggtg ggtggcaact ataactacct gtatagactg 1320
ttcaggaaat ccaacctgaa accattcgag cgagatataa gcacagaaat ctaccaggct 1380
ggaagtacgc cctgcaacgg cgtggaaggg ttcaactgct acttcccatt gcagagttac 1440
ggattccagc ctacaaacgg ggtgggttac caaccctatc gtgtcgtagt cctgagtttt 1500
gagctcctcc atgccccagc cacagtctgt ggccccaaga aaagcaccaa tctggtgaag 1560
aacaaatgcg tgaactttaa ctttaacgga ctcacaggaa ccggcgtatt gacggagagt 1620
aacaagaagt tcctgccatt ccagcagttc ggtcgcgata ttgccgacac taccgacgct 1680
gtccgagatc cccagacatt ggagattctt gatatcacac cctgtagttt cggcggagtg 1740
agcgtgatta cgcccggaac caataccagc aatcaggttg ccgtcctgta tcaggacgtg 1800
aattgcaccg aggtacctgt cgccatccac gctgaccaac ttacacccac atggcgagta 1860
tattccaccg gctccaacgt ctttcagaca cgtgctggat gtctgatcgg tgcagaacac 1920
gttaataata gctacgagtg tgatatcccc atcggtgctg gaatatgcgc ctcttatcaa 1980
actcaaacca actctcctag gcgggcacgt 2010
<210> 40
<211> 670
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 D614G Spike Truncated S1
<400> 40
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
660 665 670
<210> 41
<211> 568
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES Bridge
<400> 41
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacga 568
<210> 42
<211> 648
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse IL-12 p35
<400> 42
atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60
ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 120
ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 180
actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 240
tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 300
acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt 360
ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca 420
cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat 480
gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 540
gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc 600
cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctga 648
<210> 43
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse IL-12 p35
<400> 43
Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg
20 25 30
Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val
35 40 45
Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp
50 55 60
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr
65 70 75 80
Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg
85 90 95
Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr
100 105 110
Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
115 120 125
Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His
130 135 140
Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp
145 150 155 160
Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys
165 170 175
Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys
180 185 190
Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val
195 200 205
Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
210 215
<210> 44
<211> 1008
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse IL-12 p40
<400> 44
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat agacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540
caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcctag 1008
<210> 45
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mouse IL-12 p40
<400> 45
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Ile Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
325 330 335
<210> 46
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IL-12 p35
<400> 46
atgggtccag cgcgcagcct cctccttgtg gctaccctgg tcctcctgga ccacctcagt 60
ttggccagaa acctccccgt ggccactcca gacccaggaa tgttcccatg ccttcaccac 120
tcccaaaacc tgctgagggc cgtcagcaac atgctccaga aggccagaca aactctagaa 180
ttttaccctt gcacttctga agagattgat catgaagata tcacaaaaga taaaaccagc 240
acagtggagg cctgtttacc attggaatta accaagaatg agagttgcct aaattccaga 300
gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 360
gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 420
atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 480
gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 540
tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 600
gctttcagaa ttcgggcagt gactattgat agagtgatga gctatctgaa tgcttcctaa 660
<210> 47
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IL-12 p35
<400> 47
Met Gly Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro
20 25 30
Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val
35 40 45
Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys
50 55 60
Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys
85 90 95
Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala
100 105 110
Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr
115 120 125
Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys
130 135 140
Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu
145 150 155 160
Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr
165 170 175
Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys
180 185 190
Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr
195 200 205
Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
210 215
<210> 48
<211> 989
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IL-12 p40
<400> 48
atgggtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttagac 989
<210> 49
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IL-12 p40
<400> 49
Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
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<400> 50
000
<210> 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AgeIMhis-F
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accggcgcct acctgagatc accggtaacg tagataagcg cttgccacaa cccgggatc 59
<210> 52
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pAcelsion-R
<400> 52
tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa tagggaaatg aagagcccat accacatttg 60
tagaggtttt ac 72
<210> 53
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CelsionAgeIsp1-F
<400> 53
accggcgcct acctgagatc accggtgccg ccaccatgga gatcaaggtg ctgtttg 57
<210> 54
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRESSalI-R
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tgagggaagc ggccgcccgg gtcgactcta gaggatcccg ggttgtggca agcttatcat 60
cgtgtttttc aaaggaaaac 80
<210> 55
<400> 55
000
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PspXI-SV40pA-F
<400> 56
cggctaagcg gccgcagcct cgagcagcta gctggccaga c 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Cls-SapI-R
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tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa tagg 34
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cls-BglII-R-2
<400> 58
attggacatg agccaatata aatgtacgaa gatctgtcga gccatgtg 48
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cls-XmnI-R
<400> 59
agaactttaa aagtgctcat cattg 25
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CLS-PspXI-IRES-F
<400> 60
atacgtaagc ggccgcagcc tcg 23
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IREScelsion-R
<400> 61
tcgtgttttt caaaggaaaa ccac 24
<210> 62
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mhiscelsion-F
<400> 62
acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aagcttgcca caacccg 47
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CLS-M-R
<400> 63
atcatgtctg gccagctagc 20
<210> 64
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CLS-XbaI-M-F
<400> 64
ctagactcga gacagtccac cacaatctag agccaccatg gctgactct 49
<210> 65
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CLS-MluI-M-R
<400> 65
actcatcaat gtatcttatc atgtctgctc gaacgcgttt attgtac 47
Claims (298)
- (a) 제1 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산으로서, 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 제1 항원 핵산; 및
(b) 면역 개질제를 인코딩하는 핵산
을 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제2항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 상이한 면역 개질제를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(c) 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드. - 제5항에 있어서, 제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원, 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 항원, 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제7항에 있어서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 F1-Ag, 예르시니아 페스티스 V-Ag, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 Apa 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 HP65 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 rAg85A 항원, E71 VP1 항원, GST-태깅된 E71-VP1 항원, Cox 단백질 항원, GST-태깅된 Cox 단백질 항원, HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 gB2 항원, HSV-2 gC2 항원, HSV-2 gD2 항원, HSV-2 gE2 항원, HIV Env 항원, HIV Gag 항원, HIV Nef 항원, HIV Pol 항원, HPV 부캡시드 단백질 L2 항원, HCV NS3 항원, RSV F 항원, RSV G 항원, 뎅기 바이러스 E 단백질 항원, 뎅기 바이러스 EDIII 항원, 뎅기 바이러스 NS1 항원, 뎅기 바이러스 DEN-80E 항원, 에볼라 바이러스 GB 항원, 에볼라 바이러스 VP24 항원, 에볼라 바이러스 VP40 항원, 에볼라 바이러스 NP 항원, 에볼라 바이러스 VP30 항원, 에볼라 바이러스 VP35 항원, 지카 바이러스 외피 도메인 III 항원, 지카 바이러스 CKD 항원, 치쿤구니야 바이러스 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI (SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL (SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG (SEQ ID NO: 36), 홍역 바이러스 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 홍역 바이러스 융합 단백질 MV-F 항원, MERS-CoV S 단백질 항원, MERS-CoV S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, MERS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질 항원, SARS-CoV S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV E 단백질 항원, SARS-CoV M 단백질 항원, 톡소플라스마 곤디 MIC8 항원, 플라스모디움 팔시파룸 SERA5 폴리펩티드 항원, 플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로자이트 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 단편인, 폴리뉴클레오티드.
- 제9항에 있어서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 제1 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 제2 병원체 단백질은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2(M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제10항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 SARS-CoV-2 M 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 E 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 N 단백질 또는 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항에 있어서, 제1 병원체 단백질은 SARS CoV-2 스파이크(S) 단백질, SARS-CoV-2 막(M) 단백질, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 또는 이의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 제2 병원체 단백질은 SARS CoV-2 스파이크(S) 단백질, SARS-CoV-2 막(M) 단백질, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 또는 이의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편인, 폴리뉴클레오티드.
- 제14항에 있어서, 제1 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 제2 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 상기 제1 및 제2 병원체 단백질은 상이한 SARS-CoV-2S 균주로부터 유래되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제16항에 있어서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 프로모터를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제18항에 있어서, 제2 항원 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제20항에 있어서, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 면역 개질제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제20항에 있어서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 면역 개질제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제22항에 있어서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제25항에 있어서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터, 사이토케라틴 18(CK18) 프로모터, 사이토케라틴 19(CK19) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1) 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제27항에 있어서, 제1 프로모터는 포유동물 EF1 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제2 프로모터는 CMV 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 각각의 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있는, 폴리뉴클레오티드.
- 제31항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있는, 폴리뉴클레오티드.
- 제33항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제는 인터루킨(IL) 2(IL-2), IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 과립구-대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 인터페론(IFN) α(IFN-α), IFN-β, 케모카인, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC I), MHC 클래스 II(MHC II), 인간 백혈구 항원(HLA)-DR 이소타입(HLA-DR), CD80, CD86, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제35항에 있어서, 케모카인은 C-C 모티프 케모카인 리간드(CCL) 3(CCL3), CCL4, CCL5, CCL21, CCL28, C-X-C 모티프 케모카인 리간드(CXCL) 10(CXCL10), 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제2항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 (i) 인터루킨을 인코딩하는 핵산, 및 (ii) 주요 조직적합성 복합체 및/또는 케모카인을 인코딩하는 핵산의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제35항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제38항에 있어서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제39항에 있어서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제41항에 있어서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제35항 및 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 MHC I을 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제35항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 IL-12를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제2항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12를 인코딩하는 핵산과 IL-15를 인코딩하는 핵산의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제35항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 IL-2를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제44항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 MHC I을 인코딩하는 핵산, MHC II를 인코딩하는 핵산, CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제44항 및 제46항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상은 CCL3을 인코딩하는 핵산, CCL4를 인코딩하는 핵산, IL-2를 인코딩하는 핵산, IL-15를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 및 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 및 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 및 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 및 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 및 제56항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제48항 및 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 및 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 및 제63항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 및 제66항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항 내지 제59항 및 제66항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제2항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제69항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제73항에 있어서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제75항에 있어서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS-Cov-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 또는 제78항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제84항에 있어서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제86항에 있어서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제77항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-Cov-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제89항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제89항 또는 제90항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제93항에 있어서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제95항에 있어서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제5항에 있어서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-Cov-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제1 항원 핵산은 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 면역 개질제를 인코딩하는 2개 이상의 핵산은 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산 및 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 제1 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 제2 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 또는 제98항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p35를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제104항에 있어서, IL-12 p35는 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12 p40을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제106항에 있어서, IL-12 p40은 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제97항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제109항에 있어서, 전사-후 조절 요소는 우드 척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 핵산, 제2 항원 핵산, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제111항에 있어서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열, 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열, 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 인핸서 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제113항에 있어서, 인핸서 서열은 인간 액틴 인핸서 서열, 인간 미오신 인핸서 서열, 인간 헤모글로빈 인핸서 서열, 인간 근육 크레아틴 인핸서 서열, 바이러스 인핸서 서열, 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 서열, 또는 이의 임의의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
- 제113항 또는 제114항에 있어서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열, β-액틴 인트론 서열, 또는 이의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
- 제115항에 있어서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열인, 폴리뉴클레오티드.
- 제113항 또는 제114항에 있어서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열, SV40 인핸서 서열, β-액틴 인트론 서열, 또는 이의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 역 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제118항에 있어서, 제1 ITR 및 제2 ITR을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제119항에 있어서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 둘 모두 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터는 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체인, 폴리뉴클레오티드.
- 제121항에 있어서, DNA 플라스미드 벡터는 pVac 2, pVac 3, pVac 5, 및 pVac 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
- 제121항에 있어서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 벡터.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제121항 내지 제123항의 벡터를 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제124항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제124항 또는 제125항에 있어서, IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제124항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분을 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, DNA 플라스미드 벡터.
- 제128항에 있어서, DNA 플라스미드 벡터는 pVac 2, pVac 3, pVac 5, 및 pVac 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는, DNA 플라스미드 벡터.
- (a) 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제128항 또는 제129항의 DNA 플라스미드 벡터 및 (b) 전달 성분을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제124항 내지 제127항 및 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제124항 내지 제127항 및 제130항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2, IL-12 p35, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-15, IL-18, TNFα, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, 케모카인, MHC I, MHC II, HLA-DR, CD80, 및 CD86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 면역 개질제를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제124항 내지 제127항 및 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머 또는 이의 유도체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- (a) 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 (b) 전달 성분을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 제1 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제1 항원 핵산을 포함하고,
상기 제1 항원 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고,
임의로, 상기 전달 성분은 양이온성 폴리머, 폴리-이노신-폴리시티딜산, 또는 폴록사머 또는 이의 유도체인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신. - 제134항에 있어서, 제1 병원체 단백질을 인코딩하는 제1 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 또는 제135항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는 제2 항원 핵산을 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항에 있어서, 제2 병원체 단백질을 인코딩하는 제2 항원 핵산은 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 기생충 단백질, 및 이의 임의의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 항원, 엔테로바이러스 항원, 단순 포진 바이러스(HSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인간 유두종바이러스(HPV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 뎅기 바이러스 항원, 에볼라 바이러스 항원, 지카 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 항원, 홍역 바이러스 항원, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 항원, SARS-CoV 항원, 톡소플라스마 곤디 항원, 플라스모디움 팔시파룸 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, 이의 임의의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제138항에 있어서, 제1 병원체 단백질 및/또는 제2 병원체 단백질은 예르시니아 페스티스 F1-Ag, 예르시니아 페스티스 V-Ag, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 Apa 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 HP65 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 rAg85A 항원, E71 VP1 항원, GST-태깅된 E71-VP1 항원, Cox 단백질 항원, GST-태깅된 Cox 단백질 항원, HSV-1 외피 항원, HSV-2 외피 항원, HSV-2 gB2 항원, HSV-2 gC2 항원, HSV-2 gD2 항원, HSV-2 gE2 항원, HIV Env 항원, HIV Gag 항원, HIV Nef 항원, HIV Pol 항원, HPV 부캡시드 단백질 L2 항원, HCV NS3 항원, RSV F 항원, RSV G 항원, 뎅기 바이러스 E 단백질 항원, 뎅기 바이러스 EDIII 항원, 뎅기 바이러스 NS1 항원, 뎅기 바이러스 DEN-80E 항원, 에볼라 바이러스 GB 항원, 에볼라 바이러스 VP24 항원, 에볼라 바이러스 VP40 항원, 에볼라 바이러스 NP 항원, 에볼라 바이러스 VP30 항원, 에볼라 바이러스 VP35 항원, 지카 바이러스 외피 도메인 III 항원, 지카 바이러스 CKD 항원, 치쿤구니야 바이러스 E1 당단백질 서브유닛 항원, MHC 클래스 I 에피토프 PPFGAGRPGQFGDI (SEQ ID NO: 34), MHC 클래스 I 에피토프 TAECKDKNL (SEQ ID NO: 35), MHC 클래스 II 에피토프 VRYKCNCGG (SEQ ID NO: 36), 홍역 바이러스 헤마글루티닌 단백질 MV-H 항원, 홍역 바이러스 융합 단백질 MV-F 항원, MERS-CoV S 단백질 항원, MERS-CoV S 단백질의 수용체-결합 도메인으로부터의 항원, MERS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질 항원, SARS-CoV S 단백질의 수용체 결합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV S 단백질의 막 융합 도메인으로부터의 항원, SARS-CoV E 단백질 항원, SARS-CoV M 단백질 항원, 톡소플라스마 곤디 MIC8 항원, 플라스모디움 팔시파룸 SERA5 폴리펩티드 항원, 플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로자이트 단백질 항원, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 (NA) 항원, 인플루엔자 바이러스 기질-2 (M2) 단백질 항원, 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS CoV-2 스파이크(S) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 병원체 단백질 또는 이의 항원성 단편은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 외피(E) 단백질 또는 이의 항원성 단편, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질 또는 이의 항원성 단편, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항에 있어서, 제1 병원체 단백질은 SARS CoV-2 S 단백질, SARS-CoV-2 M 단백질, SARS-CoV-2 E 단백질, SARS-CoV-2 N 단백질, 또는 이의 항원성 단편으로부터 선택된 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 제2 병원체 단백질은 SARS CoV-2 S 단백질, SARS-CoV-2 M 단백질, SARS-CoV-2 E 단백질, SARS-CoV-2 N 단백질, 또는 이의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 단백질 또는 이의 항원성 단편인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제142항에 있어서, 제1 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 제2 병원체 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편이고, 상기 제1 및 제2 병원체 단백질은 상이한 SARS-CoV-2 균주로부터 유래되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 통해 제1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제144항에 있어서, IRES 서열은 SEQ ID NO: 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제134항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제2 프로모터를 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제146항에 있어서, 제2 항원 핵산은 하나 이상의 제2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프로모터 또는 하나 이상의 제2 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MuLV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 포유동물 신장 인자 1(EF1) 프로모터, 사이토케라틴 18(CK18) 프로모터, 사이토케라틴 19(CK19) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK1) 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제148항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제149항에 있어서, 하나 이상의 제2 프로모터는 CMV 프로모터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제148항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터, RSV 프로모터, Mo-MuLV LTR 프로모터, 포유동물 EF1 프로모터, CK18 프로모터, CK19 프로모터, SV40 프로모터, 뮤린 U6 프로모터, 골격 α-액틴 프로모터, β-액틴 프로모터, 뮤린 PGK1 프로모터, 인간 PGK1 프로모터, CBA 프로모터, CAG 프로모터, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터의 제어 하에 있는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제151항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제153항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제154항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제153항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제157항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 전장 SARS-CoV-2 S 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 SARS-CoV-2 막(M) 단백질 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제159항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 750, 적어도 1,000, 또는 적어도 1,250 개 연속 아미노산을 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제160항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하고, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제161항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제159항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 핵산은 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제163항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 및 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 160, 적어도 170, 적어도 180, 적어도 190, 적어도 200, 적어도 210, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 및 제165항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 및 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 서브유닛 또는 이의 항원성 단편을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 및 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 또는 적어도 660 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 및 제169항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제152항 및 제169항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 SEQ ID NO: 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 핵산은 포유동물 EF1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제173항에 있어서, 포유동물 EF1 프로모터는 hEF1-HTLV 프로모터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 120, 적어도 140, 적어도 160, 적어도 180, 적어도 200, 또는 적어도 220 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 및 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, 또는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 및 제178항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 또는 적어도 400 개 연속 아미노산을 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 및 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제136항 내지 제174항 및 제181항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 핵산은 SEQ ID NO: 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전사-후 조절 요소를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제184항에 있어서, 전사-후 조절 요소는 우드 척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 제1 항원 핵산, 제2 항원 핵산, 면역 개질제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 임의의 조합에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열을 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제186항에 있어서, 3' UTR 폴리(a) 꼬리 서열은 3' UTR SV40 폴리(a) 꼬리 서열, 3' UTR 소 성장 호르몬(bGH) 폴리(A) 서열, 3' UTR 액틴 폴리(A) 꼬리 서열, 3' UTR 헤모글로빈 폴리(A) 서열, 또는 이의 조합인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 인핸서 서열을 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제188항에 있어서, 인핸서 서열은 인간 액틴 인핸서 서열, 인간 미오신 인핸서 서열, 인간 헤모글로빈 인핸서 서열, 인간 근육 크레아틴 인핸서 서열, 바이러스 인핸서 서열, 폴리뉴클레오티드 기능 인핸서 서열, 또는 이의 임의의 조합인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제188항 또는 제189항에 있어서, 인핸서 서열은 CMV 인트론 서열, β-액틴 인트론 서열, 또는 이의 조합인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 역말단 반복부(ITR)를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제191항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 제1 ITR 및 제2 ITR을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제192항에 있어서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 둘 모두 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 DNA 플라스미드 벡터인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제194항에 있어서, DNA 플라스미드 벡터는 pVac 1, pVac 4, 및 pVac 7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터, 박테리아 벡터, 코스미드, 또는 인공 염색체인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제196항에 있어서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제134항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제133항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 폴리머는 합성 작용성화된 폴리머, β-아미노 에스테르, 지질, 리포폴리머, 또는 이의 화학적 유도체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제200항에 있어서, 합성 작용성화된 폴리머는 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제201항에 있어서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 화학식 (CP) x L y Y z 로 표현되고, 여기서
(a) CP는 적어도 하나의 2차 아민 기를 함유하는 양이온성 폴리머를 나타내고, 상기 양이온성 폴리머는 1,000 내지 25,000 달톤 범위 내의 수 평균 분자량을 갖고,
(b) Y는 에스테르, 아미드, 디설파이드, 또는 포스페이트 연결을 함유하는 이작용성 생분해성 링커를 나타내고,
(c) L은 리간드를 나타내고,
(d) x는 1 내지 20 범위의 정수이고,
(e) y는 0 내지 100 범위의 정수이고,
(f) z는 0 내지 40 범위의 정수인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물. - 제202항에 있어서, 양이온성 폴리머는 생분해성 가교된 선형 폴리에틸렌이민(LPEI)을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제202항 또는 제203항에 있어서, 이작용성 생분해성 링커는 친수성이고, 디설파이드 결합을 포함하는 생분해성 연결을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제202항 또는 제203항에 있어서, 이작용성 생분해성 링커는 디티오디프로피오닐 링커인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제201항에 있어서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 LPEI 및 다중-블록 코폴리머를 가교시키기 위한 디티오디프로피오닐 링커를 포함하고, 상기 LPEI는 1,000 내지 25,000 달톤의 평균 분자량을 갖는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제206항에 있어서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 적어도 하나의 리간드에 공유적으로 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물:
- 제202항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드는 당 모이어티, 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 리간드인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제208항에 있어서, 당 모이어티는 단당류 또는 올리고당류인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제209항에 있어서, 단당류는 갈락토스인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제208항에 있어서, 폴리펩티드는 당단백질, 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제211항에 있어서, 성장 인자 수용체는 표피 성장 인자 수용체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제211항에 있어서, 당단백질은 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제208항에 있어서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제201항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 500 내지 20,000 달톤 범위의 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 공유적으로 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제201항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 올레산, 팔미트산, 및 스테아르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방 아실 사슬에 공유적으로 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제201항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 다가음이온성 화합물에 정전기적으로 끌리는 적어도 하나의 아민 기를 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제217항에 있어서, 다가음이온성 화합물은 핵산이고, 생분해성 가교된 양이온성 다중-블록 코폴리머는 핵산을 축합하여 콤팩트한 구조를 형성하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제200항에 있어서, 리포폴리머는 지질 또는 PEG에 공유적으로 연결된 PEI 백본을 포함하는 양이온성 리포폴리머인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항에 있어서, PEI 백본은 지질 또는 PEG에 공유적으로 연결되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제220항에 있어서, 지질 및 PEG는 공유 결합에 의해 PEI 백본에 직접적으로 부착되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제220항에 있어서, 지질은 PEG 스페이서를 통해 PEI 백본에 부착되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 50 내지 20,000 달톤의 분자량을 갖는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 대 PEI의 몰비는 0.1:1 내지 500:1의 범위 내에 있는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 대 PEI의 몰비는 0.1:1 내지 500:1의 범위 내에 있는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, C12 내지 C18 지방산, 또는 지방산 유도체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제226항에 있어서, PEI는 콜레스테롤 및 PEG에 공유적으로 연결되고, 양이온성 리포폴리머에서 평균 PEG:PEI:콜레스테롤 몰비는 1 내지 5 PEG:1 PEI:0.4 내지 1.5 콜레스테롤의 범위 내에 있는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, PEI는 100 내지 500,000 달톤의 분자량을 갖는 선형 또는 분지형 배열을 갖는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 리포폴리머는 수용체 리간드, 막 투과제, 엔도솜용해제, 핵 국소화 서열, 및 pH 민감성 엔도솜용해 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 펜던트 작용성 모이어티를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제219항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 리포폴리머는 표적화 리간드를 추가로 포함하고, 상기 표적화 리간드는 PEI 백본에 직접적으로 부착되거나 PEG 링커를 통해 부착되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제230항에 있어서, 표적화 리간드는 당 모이어티, 폴리펩티드, 폴레이트, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제231항에 있어서, 당 모이어티는 단당류 또는 올리고당류인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제232항에 있어서, 단당류는 갈락토스인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제231항에 있어서, 폴리펩티드는 당단백질, 항체, 항체 단편, 세포 수용체, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제234항에 있어서, 성장 인자 수용체는 표피 성장 인자 수용체인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제234항에 있어서, 당단백질은 트랜스페린 또는 아시알로소뮤코이드(ASOR)인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제231항에 있어서, 항원은 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 기생충 항원인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제133항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 폴리머는 약 0.01:1 내지 약 50:1의 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제238항에 있어서, 양이온성 폴리머 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비는 약 1:10 내지 약 10:1인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제133항 내지 제239항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 양이온성 폴리머와 복합체화된 약 0.1 mg/ml 내지 약 10.0 mg/ml의 핵산을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제127항, 제130항 내지 제132항 및 제134항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 리포폴리아민을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물:
(스타라민). - 제241항에 있어서, 전달 성분은 리포폴리아민과 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 혼합물을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제242항에 있어서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 폴리(L-글루탐산), 스티렌 말레산 무수물, 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 또는 폴리디비닐에테르 말레산 무수물인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제243항에 있어서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 하기 화학식을 갖는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물:
(메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 변형된 스타라민)
상기 식에서, n은 각각 2 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 10 내지 100개의 반복 단위의 정수를 나타낸다. - 제243항 또는 제244항에 있어서, 혼합물 중의 리포폴리아민 대 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 비는 1:1 내지 10:1인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제241항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제246항에 있어서, 리포폴리아민은 약 1:10 내지 약 10:1의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제127항, 제130항 내지 제132항 및 제134항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 리포폴리아민을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물:
- 제248항에 있어서, 전달 성분은 리포폴리아민과 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 혼합물을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제249항에 있어서, 리포폴리아민의 알킬화된 유도체는 폴리옥시알킬렌, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 폴리(L-글루탐산), 스티렌 말레산 무수물, 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 또는 폴리디비닐에테르 말레산 무수물인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제249항 또는 제250항에 있어서, 혼합물 중의 리포폴리아민 대 리포폴리아민의 알킬화된 유도체의 비는 1:1 내지 10:1인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제248항 내지 제251항 중 어느 한 항에 있어서, 리포폴리아민은 약 0.01:1 내지 약 50:1의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제252항에 있어서, 리포폴리아민은 약 1:10 내지 약 10:1의 리포폴리아민 중의 아민 질소 대 DNA 플라스미드 벡터 중의 포스페이트의 비를 야기하기에 충분한 양으로 존재하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제127항, 제130항 내지 제132항 및 제134항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 하기 화학식을 갖는 폴록사머 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물:
상기 식에서,
A는 2 내지 141의 정수를 나타내고;
B는 16 내지 67의 정수를 나타내고;
C는 2 내지 141의 정수를 나타내고;
RA 및 RC는 동일하거나 상이하고, R'-L- 또는 H이고, 여기서 RA 및 RC 중 적어도 하나는 R'-L-이고;
L은 결합, -CO-, -CH2-O-, 또는 -O-CO-이고;
R'는 금속 킬레이터이다. - 제254항에 있어서, 금속 킬레이터는 R N NH―, R N 2N―, 또는 (R''―(N(R'')―CH2CH2) x )2―N―CH2CO―이고, 여기서 각각의 x는 독립적으로 0 내지 2이고, R''는 HO2C-CH2-인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제254항에 있어서, 금속 킬레이터는 크라운 에테르, 치환된-크라운 에테르, 크립탄드, 또는 치환된-크립탄드인, 조성물, 약학적 조성물, 백신, 또는 동결건조된 조성물.
- 제254항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머는 약 0.5% 내지 약 5%의 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 플라스미드 벡터를 갖는 용액에 존재하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제200항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 BD15-12를 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제258항에 있어서, 뉴클레오티드 대 폴리머(N:P) 비는 5:1인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제200항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 Omnifect를 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제260항에 있어서, 뉴클레오티드 대 폴리머(N:P) 비는 10:1인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제200항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 크라운 폴록사머를 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제262항에 있어서, 뉴클레오티드 대 폴리머(N:P) 비는 5:1인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제262항 또는 제263항에 있어서, 전달 성분은 PEG-PEI-콜레스테롤(PPC) 리포폴리머를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제262항 또는 제263항에 있어서, 전달 성분은 벤즈알코늄 클로라이드(BAK)를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제262항 또는 제263항에 있어서, 전달 성분은 Omnifect를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제262항 또는 제263항에 있어서, 전달 성분은 선형 폴리에틸렌아민(LPEI)을 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제267항에 있어서, LPEI는 BD15-12인, 조성물, 약학적 조성물 또는 백신.
- 제200항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 스타라민 및 mPEG 변형된 스타라민을 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제269항에 있어서, mPEG 변형된 스타라민은 스타라민-mPEG515인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제269항에 있어서, mPEG 변형된 스타라민은 스타라민-mPEG11인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제269항 내지 제271항 중 어느 한 항에 있어서, 스타라민 대 mPEG 변형된 스타라민의 비는 10:1인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제269항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 대 폴리머(N:P) 비는 5:1인, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제269항 내지 제273항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 성분은 크라운 폴록사머를 추가로 포함하는, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신.
- 제131항 내지 제133항 및 제199항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 조성물은 0℃ 내지 5℃에서 적어도 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 약 6 개월, 약 7 개월, 약 8 개월, 약 9 개월, 약 10 개월, 약 11 개월, 또는 약 12 개월 동안 안정한, 동결건조된 조성물.
- 제131항 내지 제133항 및 제199항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 조성물은 25℃에서 적어도 약 7일, 약 10일, 또는 약 14일 동안 안정한, 동결건조된 조성물.
- 제131항 내지 제133항 및 제199항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 조성물에 수성 성분이 실질적으로 없는, 동결건조된 조성물.
- 제131항 내지 제133항 및 제199항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 조성물은 희석제로 재구성되는, 동결건조된 조성물.
- 제278항에 있어서, 희석제는 물인, 동결건조된 조성물.
- 제278항 또는 제279항에 있어서, 동결건조된 조성물은 희석제로 재구성된 후 0℃ 내지 5℃에서 적어도 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 또는 약 6 개월 동안 안정한, 동결건조된 조성물.
- 제278항 또는 제279항에 있어서, 동결건조된 조성물은 희석제로 재구성된 후 25℃에서 적어도 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 또는 약 7 일 동안 안정한, 동결건조된 조성물.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항의 벡터, 제128항 또는 제129항의 DNA 플라스미드 벡터, 또는 제124항 내지 제127항, 제130항, 제132항 내지 제198항, 및 제200항 내지 제274항 중 어느 한 항의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 포함하는, 숙주 세포.
- 제282항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포인, 숙주 세포.
- 제282항에 있어서, 숙주 세포는 인간 숙주 세포인, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항의 벡터, 제128항 또는 제129항의 DNA 플라스미드 벡터, 또는 제124항 내지 제127항 및 제130항 내지 제281항 중 어느 한 항의 조성물, 약학적 조성물, 백신, 동결건조된 조성물, 또는 냉동-건조된 조성물을 포함하는, 키트.
- 제285항에 있어서, 유리 바이알을 추가로 포함하는, 키트.
- 제285항 또는 제286항에 있어서, 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위한 방법에서 폴리뉴클레오티드, 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 백신, 조성물, 약학적 조성물, 또는 동결건조된 조성물을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
- 제285항 또는 제286항에 있어서, 대상체에서 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하기 위한 방법에서 폴리뉴클레오티드, 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 백신, 조성물, 약학적 조성물, 동결건조된 조성물, 또는 냉동-건조된 조성물을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
- 제288항에 있어서, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 또는 기생충 감염인, 키트.
- 제289항에 있어서, 감염은 SARS-Cov-2 감염인, 키트.
- 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항의 벡터, 제128항 또는 제129항의 DNA 플라스미드 벡터, 또는 제124항 내지 제127항, 제130항, 제132항 내지 제198항, 및 제200항 내지 제274항 중 어느 한 항의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 제291항에 있어서, 면역 반응은 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원에 대한 것인, 방법.
- 제291항 또는 제292항에 있어서, 면역 반응은 보호 면역 반응인, 방법.
- 대상체에서 감염을 예방, 발병률 감소, 약화 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항의 벡터, 제128항 또는 제129항의 DNA 플라스미드 벡터, 또는 제124항 내지 제127항, 제130항, 제132항 내지 제198항, 및 제200항 내지 제274항 중 어느 한 항의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 제291항 내지 제294항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, DNA 플라스미드 벡터, 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신은 근육내, 피하, 림프내, 또는 복강내 투여 경로에 의해 대상체에게 투여되는, 방법.
- 제294항 또는 제295항에 있어서, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 또는 기생충 감염인, 방법.
- 제294항 내지 제296항 중 어느 한 항에 있어서, 감염은 SARS-CoV-2 감염인, 방법.
- 제124항 내지 제127항, 제130항, 제132항 내지 제198항, 및 제200항 내지 제274항 중 어느 한 항의 조성물, 약학적 조성물, 또는 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 전달 성분을 폴리뉴클레오티드와 조합하는 단계, (b) 상기 조합된 전달 성분 및 폴리뉴클레오티드를 분말로 동결건조시키는 단계, 및 (c) 상기 분말을 희석제로 재구성하여 상기 전달 성분과 복합체화된 핵산의 용액을 형성시키는 단계를 포함하는, 방법.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination |