KR20240027571A - 키메라 아데노바이러스 벡터들 - Google Patents

키메라 아데노바이러스 벡터들 Download PDF

Info

Publication number
KR20240027571A
KR20240027571A KR1020237029040A KR20237029040A KR20240027571A KR 20240027571 A KR20240027571 A KR 20240027571A KR 1020237029040 A KR1020237029040 A KR 1020237029040A KR 20237029040 A KR20237029040 A KR 20237029040A KR 20240027571 A KR20240027571 A KR 20240027571A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sars
protein
cov
nucleic acid
acid encoding
Prior art date
Application number
KR1020237029040A
Other languages
English (en)
Inventor
션 터커
에머리 도라
Original Assignee
박사르트, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2021/035930 external-priority patent/WO2021248017A2/en
Application filed by 박사르트, 인크. filed Critical 박사르트, 인크.
Publication of KR20240027571A publication Critical patent/KR20240027571A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19) N 단백질, 예를 들어, SARS-CoV-2로부터의 N 단백질을 인코딩하는 핵산 및 이종 항원 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터들, 예를 들어, 키메라 아데노바이러스 벡터들과 면역 반응을 유도하기 위해 상기 벡터들을 사용하여 이러한 발현 벡터들을 적용하는 방법들을 제공한다.

Description

키메라 아데노바이러스 벡터들
본 발명은 키메라 아데노바이러스 벡터들에 관한 것이다.
본 출원은 2021년 2월 1일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/144,339호, 2020년 9월 4일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/074,954호, 2020년 6월 29일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/045,710호 및 2020년 6월 5일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/035,490호를 우선권들로 수반하는 2021년 6월 4일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2021/035930호의 일부 계속 출원(continuation-in-part)인 2021년 2월 1일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/144,339호를 우선권으로 수반한다. 각 특허 출원은 모든 목적들로 여기에 참조로 포함된다.
코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 의해 야기되는 전염병이다. 상기 질병의 일부 증상들은, 예를 들면, 발열, 기침, 숨참, 근육통, 가래 생성, 설사, 인후염, 후각의 상실 및 복통을 포함한다. 대부분의 경우들은 가벼운 증상들을 야기하지만, 일부는 바이러스성 폐렴 및 복합 장기 부전으로 진행된다. 상기 질병은 현재 치료되지 않고 있으며, 세계적으로 공동체 발생으로 몇몇 대륙들에 걸쳐 빠르게 확산되고 있다.
본 발명은 키메라 아데노바이러스 벡터들을 제공한다.
일 측면에서, 키메라 아데노바이러스 발현 벡터(chimeric adenoviral expression vector)가 여기에 설명되며, 발현 카세트(expression cassette)를 포함하며, 상기 발현 카세트는, 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 및 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 상기 항원 폴리펩티드는 SARS-CoV2 단백질이 아니다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드는 코로나바이러스 단백질이 아니다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드는 암 항원이다. 다른 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드는 병원체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아, 균류, 또는 기생 생물로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 비시스트로닉(bicistronic) 또는 멀티시스트로닉(multicistronic) 구조체를 포함하며, 상기 구조체는 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있다. 다른 실시예들에서, 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site: IRES), 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skipping element), 또는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산 사이에 위치하는 푸린 난할 부위(furin cleavage site)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A 펩티드(F2A), 말 비염(equine rhinitis) A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스(cytoplasmic polyhedrosis virus) 2A 펩티드(BmCPV 2A), 그리고 B. 모리(mori)의 플라세리 바이러스(flacherie virus) 2A 펩티드(BmIFV 2A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 펩티드를 인코딩하는 리보솜 스키핑 요소를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 T2A 펩티드를 인코딩하는 서열이다. 일부 실시예들에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 결합되고, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 제2 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 각기 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터는 CMV 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 베타-액틴(beta-actin) 프로모터이거나, 상기 제1 프로모터는 베타-액틴 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 CMV 프로모터이다. 다수의 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)와 같은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 톨-유사(Toll-like) 수용체-3(TLR-3)을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제는 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 측면들에서, 본 발명은 여기에 설명되는 바와 같은 키메라 아데노바이러스 벡터를 포함하는 숙주, 예를 들어, 본문에서 여기에 설명되는 바와 같은 키메라 아데노바이러스 벡터와, 예를 들어, 본문에서 여기에 설명되는 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier)를 포함하는 면역원성 조성물; 그리고 대상 내의 항원 폴리펩티드를 향한 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 있어서, 예를 들어, 본문에서 포유동물 대상에 대해 면역원성으로 유효한 양의 여기에 설명되는 바와 같은 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 상기 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 더 제공한다. 일부 실시예들에서, 상기 투여의 루트는 경구, 비강 내, 또는 점막이다. 일부 실시예들에서, 상기 투여의 루트는 정제를 삼키는 것에 의한 경구 전달이다. 일부 실시예들에서, 상기 면역 반응은 상기 대상의 폐포 세포, 흡수성 장세포, 섬모 세포, 배상 세포, 곤봉체 세포들 및/또는 기도 기저 세포 내에 유도된다. 일부 실시예들에서, 상기 대상은 인간이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 키메라 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 발현 카세트는 상기 항원 폴리펩티드가 SARS-CoV-2 단백질이 아닌 조건에서 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 및 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드는 코로나바이러스 폴리펩티드가 아니다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드는 바이러스, 박테리아, 균류, 또는 기생 생물과 같은 병원체로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 구조체를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있다. 다른 실시예들에서, 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 내부 리보솜 유입점(IRES), 리보솜 스키핑 요소, 또는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산 사이에 위치하는 푸린 난할 부위를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스 2A 펩티드(BmCPV 2A), 그리고 B. 모리의 플라세리 바이러스 2A 펩티드(BmIFV 2A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이다. 일부 실시예들에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 결합되며, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 제2 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터 각기 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터는 CMV 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 베타-액틴 프로모터이거나, 상기 제1 프로모터는 베타-액틴 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 폴리뉴클레오티드는 TLR-3 작용제를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제는 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제는 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 다른 측면들에서, 본 발명은, 예를 들어, 본문에서 여기에 설명되는 바와 같은 키메라 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구조체; 상기 발현 구조체를 투여하는 단계를 포함하는 대상 내에 면역 반응을 유도하는 방법; 및 상기 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 상기 발현 구조체를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 일부 실시예들에서, 상기 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다.
다른 측면에서, 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 발현 구조체를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터가 제공되며, 상기 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 발현 구조체는 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산; 및 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 비시스트로닉 구조체는 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있다. 다른 실시예들에서, 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 내부 리보솜 유입점(IRES), 리보솜 스키핑 요소, 또는 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산 사이에 위치하는 푸린 난할 부위를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스 2A 펩티드(BmCPV 2A), 그리고 B. 모리의 플라세리 바이러스 2A 펩티드(BmIFV 2A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 펩티드를 인코딩하는 서열이다. 일부 실시예들에서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 T2A 펩티드를 인코딩하는 서열이다. 일부 실시예들에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 톨-유사 수용체-3(TLR-3)을 인코딩하는 핵산을 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제는 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 다음의 요소들을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다. (a) 제1 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터; 및 (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 (c) 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제3 프로모터인 추가적인 요소를 포함한다. 일부 실시예들에서, 요소 (c)는 상기 발현 카세트 내에서 요소 (a) 및 요소 (b) 사이에 위치한다. 특정한 실시예들에서, 상기 (a)에서의 제1 SARS-CoV-2 단백질 및 상기 (c)에서의 제2 SARS-CoV-2 단백질은 다르다. 다른 실시예들에서, 상기 (a)에서의 SARS-CoV-2 단백질 및 상기 (c)에서의 SARS-CoV-2 단백질은 동일하다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 요소 (a)에서의 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 요소 (c)에서의 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 및/또는 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 20 또는 SEQ ID NO: 20의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함한다.
일부 실시예들에서, 요소 (a)에서의 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 요소 (c)에서의 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 및/또는 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 2의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 SARS-CoV-2 N 단백질을 포함한다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 요소 (a)에서의 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 요소 (c)에서의 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 및/또는 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 부위, 푸린 부위 및 SARS-CoV-2 N 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 10의 서열과 적어도 85%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다.
또한, 상기 키메라 아데노바이러스 벡터 내의 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 각기 CMV 프로모터가 될 수 있다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 셋의 요소들 (a)-(c)가 모둔 존재할 때, 상기 제1 프로모터가 CMV 프로모터가 될 수 있고, 상기 제2 프로모터는 CMV 프로모터가 될 수 있으며, 상기 제3 프로모터는 베타-액틴 프로모터(예를 들어, 인간 베타-액틴 프로모터)가 될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 특징으로 하며, 상기 발현 카세트는 다음의 요소들을 포함한다. (a) SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터 및 (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 각기 CMV 프로모터이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 특징으로 하며, 상기 발현 카세트는 다음의 요소들을 포함한다. (a) SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터; (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터; 및 (c) SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제3 프로모터, 선택적으로 N-말단들로부터 C-말단들까지 상기 발현 카세트 내의 상기 요소들의 순서는 요소 (a), 요소 (c) 및 요소 (b)이다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 서열을 포함한다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함한다.
또한, 이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 요소 (a)에서의 제1 프로모터는 CMV 프로모터이고, 상기 요소 (b)에서의 제2 프로모터는 CMV 프로모터이며, 상기 요소 (c)에서의 제3 프로모터는 베타-액틴 프로모터(예를 들어, 인간 베타-액틴 프로모터)이다.
일부 실시예들에서, 상기 요소 (a), 요소 (b) 및 요소 (c)는 함께 SEQ ID NO: 6의 서열에 의해 인코드된다. 또한, 이러한 측면의 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 SEQ ID NO: 8의 서열에 의해 인코드된다.
다른 측면에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 특징으로 하며, 상기 발현 카세트는 다음의 요소들을 포함한다. (a) SARS-CoV-2 융합 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터, 여기서 상기 SARS-CoV-2 융합 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 영역, 푸린 부위 및 SARS-CoV-2 N 단백질을 포함하고; (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 융합 단백질은 SEQ ID NO: 10의 서열을 포함한다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 각기 CMV 프로모터이다.
이러한 측면의 일부 실시예들에서, 상기 요소 (a) 및 요소 (b)는 함께 SEQ ID NO: 7의 서열에 의해 인코드된다. 또한, 이러한 측면의 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 SEQ ID NO: 9의 서열에 의해 인코드된다.
다른 측면에서, 본 발명은 여기에 설명되는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는 면역원성 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 추가적인 특징으로 하며, 상기 발현 카세트는 다음의 요소들을 포함한다. (a) 제1 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터; (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터; 및 (c) SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제3 프로모터. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 요소 (c)는 상기 발현 카세트 내에서 요소 (a) 및 요소 (b) 사이에 위치한다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 구비하는 SARS-CoV-2 S 단백질을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 요소 (a)에서의 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 동일하다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 각기 CMV 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 상기 제1 프로모터는 CMV 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 CMV 프로모터이며, 상기 제3 프로모터는 베타-액틴 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 요소 (c)는 요소 (a) 및 요소 (b) 사이에 위치하며, 요소 (a), 요소 (c) 및 요소 (b)는 함께 SEQ ID NO: 6 와 적어도 95%의 동일성을 가지는 서열에 의해 인코드되거나, SEQ ID NO: 6의 서열에 의해 인코드된다. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 SEQ ID NO: 8과 적어도 95%의 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, SEQ ID NO: 8의 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상 내에 SARS-CoV-2 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 10의 서열을 가지는 SARS-CoV-2 단백질, 또는 여기에 설명되는 바와 같은 이의 변이체(예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 10과 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 가지는))을 향한 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 여기에 설명되는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터 또는 여기에 설명되는 면역원성 조성물의 면역원성으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 투여의 루트는 경구, 비강 내, 또는 점막(예를 들어, 구강)이다. 특정한 실시예들에서, 상기 투여의 루트는 정제를 삼킴에 의한 경구 전달이다.
상기 방법의 일부 실시예들에서, 상기 면역 반응은 상기 대상의 폐포 세포, 흡수성 장세포, 섬모 세포, 배상 세포, 곤봉체 세포들 및/또는 기도 기저 세포 내에 유도된다. 특정한 실시예들에서, 상기 대상은 인간이다.
또한, 발현 카세트를 포함하는 키메라 폴리뉴클레오티드(이에 한정되는 것은 아니지만, CD8 T-세포 반응을 포함하는 대상 내의 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있는)가 제공되며, 상기 발현 카세트는 다음의 요소들을 포함한다. (a) 제1 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터; (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터; 및 (c) SARS-CoV-2 단백질 또는 비-SARS-CoV-2 항원 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제3 프로모터.
일부 실시예들에서, 상기 키메라 폴리뉴클레오티드는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 요소 (c) 상기 발현 카세트 내에서 요소 (a) 및 요소 (b) 사이에 위치한다.
다른 측면에서, 본 발명은 발현 카세트를 포함하는 키메라 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 발현 카세트는 다음의 요소들을 포함한다. (a) 항원 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터; (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터; 및 (c) SARS-CoV-2 N-단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 결합되는 제3 프로모터. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가진다. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 폴리뉴클레오티드는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11- SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 요소 (c)는 상기 발현 카세트 내에서 요소 (a) 및 요소 (b) 사이에 위치한다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 단백질은 바이러스, 박테리아, 균류, 또는 기생 생물로부터 유래된다. 일부 실시예들에서, 상기 항원 단백질은 암 항원이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상 내에 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 앞서의 단락들에 설시된 키메라 폴리뉴클레오티드를 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 감염 후의 인간 세포들 내의 항원들의 발현을 도시한다.
도 2는 0일 및 14일에서 마우스들의 면역화 이후의 S1에 대한 IgG 항체 역가들을 도시한다. 역가들은 표준 ELISA로 측정되었다.
도 3a 및 도 3b는 0일 및 14일에서 마우스들의 면역화 이후의 S1 및 S2에 대한 IgG 항체 역가들을 도시한다. MSD는 두 항원들에 대해 다중의 시점들에서 결합 신호를 측정하는 데 이용되었다. 조기의 시점들에서는 신호에서 유의미한 차이들이 존재하지 않았지만, 보다 많은 항체 반응들이 이후의 시점들에서 보다 높은 도스 그룹들에서 검출되었다.
도 4a-도 4d는 백신 특이적 반응들을 테스트하기 위해 개발된 전이 유전자 삽입들이다. 재조합 아데노바이러스들은 이들 삽입들인 a: rAd-S, b: rAd-S-N, c: rAd-S1-N, d: rAd-S(고정)-N를 이용하여 만들어졌다.
도 5a-도 5d: 혈청 IgG 및 폐 IgA 반응들을 유도하는 후보 rAd 백신들로의 면역화. 1 x 108 I.U.로 0일 및 14일에 Balb/c 마우스들에 후속하는 S에 대한 항체 역가들, 전체 길이의 S(rAd-S)를 발현시키는 rAd, 전체 길이의 S 및 N을 공동 발현시키는 rAd(rAd-S-N) 또는 S1 도메인 및 N을 포함하는 융합 단백질을 공동 발현시키는 rAd(rAd-S1-N). 도 5a: S1에 대한 IgG 혈청 IgG 종말점 역가들은 표준 ELISA로 측정되었다(예방 접종된 그룹 당 n=6, PBS 투여 그룹에 대해 n=3). 기호들은 평균 역가들을 나타내고, 바들은 표준 편차를 나타낸다. 도 5b: 두 가지 다른 방법들인 대용 VNT(sVNT) 및 세포 기반의 VNT(cVNT)를 이용한 rAd-S-N 및 rAd-S1-N을 포함하는 중화 항체 반응들. 도 5c: 면역된 마우스들에서 S1 및 S2에 대한 IgA 폐 항체 역가들. 종말점 역가들은 표준 ELISA로 측정되었다(그룹 당 n=10). 라인들은 중앙값 및 사분위 범위를 나타낸다. 맨-휘트니 t-검정에 의해 정의된 ** p＜0.01, *** p＜0.001. 도 5d: 면역화 후에 폐들에서 측정된 중화 항체들.
도 6a-도 6b: 전체 길이의 S 및 N 백신들을 동시 발현시키는 rAd로의 면역화는 도스 의존형 방식으로 IgG 반응들을 유도한다. 도 6a 및 도 6b: Balb/c 마우스들은 0일 및 14일에서 전체 길이의 S 및 N을 공동 발현시키는 rAd(rAd-S-N)의 1 x 107 I.U., 1 x 108 I.U. 또는 7.2 x 108 I.U.로 면역되었다. S1에 대해 특이적인 IgG(도 6a) 및 1/4000로 희석된 혈청 내의 S2의 양은 중규모 결합 분석을 이용하여 평가되었다. 포인트들은 평균을 나타내고, 라인들은 표준 편차를 나타낸다.
도 7a-도 7c: 용량 의존형 방식으로 다기능성 T 세포 반응들을 유도하는 전체 길이의 S 및 N 백신들을 공동 발현시키는 rAd로의 면역화. 도 7a: Balb/c 마우스들은 0일 및 14일에서 rAd-S-N의 1 x 108 I.U.(Ad-S-N 높음), 1 x 107 I.U.(Ad-S-N 낮음)로 면역되었다. ICS-FACS에 의해 결정되는 바와 같은 1㎎/㎖(CD4+) 또는 5㎎/㎖(CD8+)의 S 펩티드 풀들로의 지라 세포들의 자극 이후에 IFN-γ, TNF-a, IL-2 또는 IL-4만을 생성하였던 CD4+(상부 패널) 또는 CD8+ T 세포들(하부 패널)의 빈도. b: 1㎎/㎖(CD4+) 또는 5㎎/㎖(CD8+) S 펩티드 풀들로의 지라 세포들의 자극 후에 하나 이상의 시토카인을 생성하였던 다기능성 CD4+(상부 패널) 또는 CD8+ T 세포들(하부 패널)의 빈도. 바들은 중앙값을 나타내고, 라인들은 중앙값의 표준 오차를 나타낸다. c: 0주 및 4주에서 rAd-S-N의 1 x 106 I.U., 1 x 107 I.U., 1x108 I.U. 도스들로의 면역화가 수반되어 4주에서 S 단백질에 대한 IFN-γ T 세포 반응들이 ELISPOT에 의해 측정되었다. 바들은 중앙값을 나타내고, 라인들은 표준 편차를 나타낸다. * p＜0.05; 다중 비교들로의 일방 비-매개변수 ANOVA.
도 8a-도 8b: S에 대한 항체들은 S 단백질이 고정된 버전과 비교하여 야생형 구조에서 발현되었을 때에 우수하였다. Balb/c 마우스들은 0주 및 4주에서 마우스(n=6) 당 1e8 I.U.로 면역되었고, 항체 역가들이 측정되었다. 도 8a: 시간에 대한 IgG 항체 역가들. 도 8b: 중화 항체 반응들은 6주에서 측정되었다. 1:1000이 수행되었던 최대 희석인 점에 유의한다.
도 9a-도 9f. 도 9a: (왼쪽)흐름 세포측정법으로 측정되는 바와 같은 예방접종 이전(1일) 및 이후(8일)에서 말초 혈액 내의 CD27++ CD38++ 형질모세포들의 빈도. 바들은 중앙값들을 나타내지만, 오차 바들은 95% 신뢰 구간들에 대응된다. 윌콕슨 검정이 예방접종 이전 및 이후의 빈도들을 비교하기 위해 이용되었다. 오른쪽: 예방접종 전 및 예방접종 후의 8일에서 하나의 백신에 대한 CD27++ CD38++ 형질모세포들을 나타내는 대표적인 흐름 세포측정 도표. 도 9b: 형질모세포 빈도들에서의 폴드 변화(8일/1일). 전체 24/35의 대상들(69%)이 2-폴드 또는 그보다 높은 증가(전체적으로 3.3 중앙값 폴드 변화 증가로)를 보였다. 도 9c: 낮고 높은 도스의 백신 코호트들에서의 IgA- 및 B7-발현 형질모세포들의 폴드 변화(8일/1일). 맨-휘트니 검정이 둘의 다른 도스 그룹들 사이의 빈도들을 비교하기 위해 이용되었다. 도 9d: Sars-CoV-2 스파이크 항원의 S1 도메인에 반응성인 IgA-양성 항체 분비 세포(ASC)들의 숫자의 폴드 변화(8일/1일). 도 9e: MSD 플랫폼으로 측정된 바와 같은 혈청 내의 S-, N-, 또는 RBD-특이적 IgA 항체들의 폴드 변화(29일/1일). 적색 점선들은 중앙값들을 나타낸다. 맨-휘트니 검정이 둘의 다른 도스 그룹들 사이의 빈도들을 비교하기 위해 이용되었다. 도 9f: MSD 플랫폼으로 측정된 바와 같은 콧물 및 침 샘플들에서 S-, N-, 또는 RBD-특이적 IgA 항체들의 폴드 변화(29일/1일).
도 10a-도 10e는 VXA-CoV2-1가 큰 규모의 항바이러스 T 세포들을 유도하는 것을 예시하는 데이터를 제공한다. 면역화 이전 및 이후의 PBMC들은 SARS-CoV-2 펩티드들로 재자극되었고, CD8 및 항원 탈과립 마커 CD107a에 대해 염색되었으며, 시토카인들에 대해 세포 내로 염색되었다. a: SARS-CoV-2 스파이크 펩티드들에 반응하여 면역화 이전(0일) 및 이후(7일)에서의 IFNγ, TNFa 및 CD107a CD8 T 세포들의 퍼센티지. b: SARS-CoV-2 스파이크 펩티드들에 반응하여 면역화 이전(0일) 및 이후(7일)에서의 CD8 T 세포들의 퍼센트로서의 이중 IFNγ+TNFa+ CD8+T 세포들. c: 다양한 유형들의 항바이러스 T 세포 반응들을 가졌던 대상들의 %를 나타내는 파이 차트(Pie-chart). d: CEF 또는 S 펩티드들로의 자극 이후의 IFNγ의 대표적인 흐름 세포 측정 도표들. e: 4의 지역 코로나바이러스들로부터의 S 및 N 펩티드들에 반응하여 0일에 걸친 면역화 후에 증가된 IFNγ, CD8+ T 세포들의 퍼센트.
도 11a-도 11b는 경구 VXA-CoV-2가 근육 내의 mRNA 백신들보다 높은 규모의 항바이러스 CD8 T 세포들을 유도하는 것을 예시하는 데이터를 제공한다. 면역화 전 및 후의 PBMC들은 SARS-CoV-2 펩티드들로 재자극되었고, CD8 탈과립 마커 CD107a에 대해 표면 염색되었으며, 시토카인들에 대해 세포 내로 염색되었다. 모두 3의 백신들로부터의 PBMC들이 동시에 분석되었다. a: 그래프는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 반응하여 면역화 후의 배경 위의 CD8+ T 세포 증가의 IFNγ, TNFa 및 CD107a 퍼센트를 나타낸다. b: 백스아트 코호트 및 회복기와 함께 a로부터의 IFNγ 데이터가 도표화된다. 회복기 대상들은 감염 전의 샘플들을 얻지 못하였기 때문에 1일에서 감산되지 않는다. c: 화이자(Pfizer) 및 모데나(Moderna) T 세포 반응들의 시간 경과.
도 12a-도 12e는 면역화 이전 및 이후의 PBMC들이 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 또는 스파이크 펩티드들로 재자극되었고, CD4, CD8 및 탈과립 마커 CD107a에 대해 표면 염색되었으며, 시토카인들에 대해 세포 내로 염색되었던 것을 예시하는 데이터를 제공한다. a: 도 10a의 데이터의 도스 계층화. b: 추가 접종 후에 CD8+ IFNγ+ T 세포 반응들의 유지를 보여주는 파수 대상들의 시간 경과. c: 스파이크에 대한 CD4 T 세포 반응들. d-e: VXA-CoV2-1은 뉴클레오캡시드에 반응하여 항-바이러스 T 세포들을 유도한다. 그래프는 CD8+ T 세포들(d) 또는 CD4+ T 세포들(e)의 IFNγ, TNFa 및 CD107a 퍼센트가 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 펩티드들에 반응하여 면역화 후에 배경 위로 증가하는 것을 보여준다.
도 13a-도 13b. a: 모데나 또는 화이자 COVID-19 백신으로 완전하게 예방 접종된(두 도스들) 개인들에서의 SARS-CoV-2 스파이크(S1)에 대한 인간 항체 역가들(IgG). 역가들은 표준화된 SARS-CoV-2 스파이크(S1) 인간 IgG ELISA 키트를 이용하여 제2 도스 이후의 7일에서 측정되었다. * 하나의 대상은 샘플 손실로 인해 제1 도스 이후의 29일에서 측정되었고, 둘의 개인들은 예방접종 이전에 혈청을 받지 않았다. b: 비교 실험에서의 CD4 반응들. 면역화 이전 및 이후의 PBMC들은 SARS-CoV-2 펩티드들로 재자극되었고, CD4 및 탈과립 마커 CD107a에 대해 표면 염색되었으며, 시토카인들에 대해 세포 내로 염색되었다. 그래프는 SARS-CoV-2 스파이크 펩티드들에 반응하여 면역화 이후의 배경에 대한 CD4 T 세포들의 IFNγ, TNFa 및 CD107a 퍼센트 증가를 도시한다.
도 14는 SARS-CoV-2 N 단백질이 결핍되었던 비교 구조체와 비교하여 HPV에 반응하는 T 세포들의 향상된 능력을 가져왔던 HPV E6 및 E7 단백질들과 SARS-CoV-2 N 단백질을 발현시키는 백신 구조체의 비강 내 투여를 예시하는 데이터를 제공한다.
도 15는 S만을 발현시켰던 비교되는 백신보다 높았던 세포독성 항스파이크 T 세포 반응을 유도하였던 SARS-CoV-2 S 및 N 단백질들을 발현시키는 비강 내로 투여된 백신 구조체를 예시하는 데이터를 제공한다.
I. 도입
코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 의해 야기되는 전염병이다. SARS-CoV-2는 폐 및 가능하게는 심지어 장 내의 상피 세포들을 감염시키는 점막 바이러스 병원체이다(9). 상기 질병의 일부 증상들은, 예를 들면, 발열, 기침, 숨참, 근육통, 가래 생성, 설사, 인후염, 후각의 소실 및 복통을 포함한다. 대부분의 경우들은 가벼운 증상들을 야기하지만, 일부는 바이러스성 폐렴 및 복합 장기 부전으로 진행된다.
상기 바이러스는 주로 밀접한 접촉과 사람들이 기침이나 재치기를 할 때에 생성되는 호흡기 액적들을 통해 전파된다. 또한, 사람들은 오염된 표면을 만지고 이후에 그 얼굴을 만지는 것을 통해 COVID-19와 접촉할 수 있다. 비록 전파가 증상들이 나타나기 전에도 가능하지만, 상기 감염은 사람들이 증상을 나타낼 때에 가장 전파되기 쉬워진다. 현재, COVID-19에 대한 백신 또는 특정한 항바이러스 치료는 존재하지 않는다. 상기 질병을 관리하는 것은 증상들의 치료, 지지 치료, 격리 및 일부 실험적 측정들을 수반한다.
SARS-CoV-2 바이러스의 게놈은 완전한 바이러스 입자를 만들기 위해 요구되는 스파이크(spike)(S), 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)(N), 멤브레인(membrane)(M) 및 엔벨로프(envelope)(E)를 포함하는 넷의 주요 구조 단백질들을 인코드한다. 바이러스 침입 후, 16의 비-구조 단백질들이 둘의 큰 전구체 단백질들로부터 형성된다. 이들 바이러스들은 상대적으로 큰 양의 방향의 RNA 가닥(26kb-32kb)을 가지며, 잘못된 편집 없이 상기 RNA는 돌연 변이하고, 진화하며, 새로운 바이러스 종들을 생성하기 위해 다른 패밀리 구성원들과 동종 재조합을 거친다(6). 상기 S 단백질은 상기 단백질이 수용체 결합, 막 융합 및 조직 향성을 책임지기 때문에 코로나바이러스 백신들에 대한 주요 항체 표적인 것으로 여겨진다. SARS-CoV-2 Wu-1(젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 QHD43416.1호)을 SARS-CoV(젠뱅크 수탁 번호 AY525636.1호)와 비교할 때, 상기 S 단백질은 76.2%의 동일성, 87.2%의 유사성 및 1273 위치들에서 2%의 갭들을 가지는 것으로 발견되었다(7). SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 모두는 세포 침입을 위해 동일한 수용체인 일부 인간 세포 유형들에서 발현되는 안지오텐젠신-전환 효소(angiotensin-converting enzyme) 2 수용체를 이용하는 것으로 여겨진다(8). Xu 등의 논문에서 논의된 바와 같이, ACE2의 높은 발현 레벨들이 폐의 II형 폐포 세포들, 회장(ileum) 및 결장의 흡수성 장세포, 그리고 가능하게는 혀와 같은 경구 조직들 내에서도 존재한다(32).
하나 또는 그 이상의 SARS-CoV-2 단백질들을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산들 및 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터(chimeric adenoviral vector)들의 이용을 수반하는 COVID-19를 치료하기 위한 백신들, 면역원성 조성물들 및 방법들이 여기에 제공된다.
II. 정의들
여기서, 예를 들어, 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 언급되는 바와 같은 "키메라(chimeric)" 또는 "재조합(recombinant)"이라는 용어는 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종의 핵산이나 단백질 또는 자연 핵산 또는 단백질의 변형의 도입에 의해 변경되었던 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 키메라 및 재조합 벡터들은 상기 벡터의 자연(비-키메라 또는 비-재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 핵산 서열들을 포함한다. 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 SARS-CoV-2 단백질과 같은 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 지칭한다.
"발현 벡터(expression vector)"라는 용어는 숙주 세포 내에서 특정한 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정된 핵산 원소들로 재조합으로나 합성적으로 생성되는 핵산 구조체를 의미한다. 상기 발현 벡터는 플라스미드(plasmid), 바이러스, 또는 핵산 조각의 일부가 될 수 있다. 통상적으로, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 전사되는 핵산을 포함한다.
"프로모터(promoter)"라는 용어는 핵산의 전사를 안내하는 핵산 제어 서열들의 배열을 지칭한다. 여기에 사용되는 바에 있어서, 프로모터는 폴리머라아제(polymerase) II형 프로모터인 TATA 요소의 경우에서와 같이 전사의 개시 부위 부근에 필수적인 핵산 서열들을 포함한다. 또한, 프로모터는 선택적으로 전사의 개시 부위에 수천의 염기쌍들만큼 많이 위치할 수 있는 말단 상승제 또는 억제제 요소들을 포함한다. 프로모터들은 구성적 및 유도 가능적 프로모터들을 포함한다. "구성적(constitutive)" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건들 하에서 활성인 프로모터이다. "유도 가능적(inducible)" 프로모터는 환경 또는 발달 조절 하에서 활성인 프로모터이다. "작동 가능하게 연결되는"이라는 표현은 핵산 발현 제어 서열(프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위들의 배열과 같은) 및 제2 핵산 서열 사이의 기능성 연결을 지칭하며, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 안내한다.
"SARS-CoV-2" 또는 "중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus) 2"라는 용어는 코로나바이러스과의 바이러스 패밀리로부터의 베타코로나바이러스(betacoronavirus)들의 큰 속(genus) 내에 있는 코로나바이러스를 의미한다. 젠뱅크 수탁 번호 MN908947.3호는 SARS-CoV-2의 공개된 DNA 서열이다. 상기 바이러스는 주로 밀접한 접촉과 사람들이 기침이나 재치기를 할 때에 생성되는 호흡기 액적들을 통해 전파된다.
"SARS-CoV-2 단백질"이라는 용어는 상기 SARS-CoV-2(예를 들어, 젠뱅크 수탁번호 MN908947.3호)의 핵산에 의해 인코드되는 단백질 또는 이러한 단백질의 조각을 지칭한다. 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 단백질의 조각은 젠뱅크 수탁번호 MN908947.3호의 서열에 의해 인코드되는 전체 길이의 단백질로부터의 적어도 10, 20, 또는 그 이상의 인접하는 아미노산들을 포함한다. 예를 들면, SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질(표면 당단백질; 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 이의 변이체들) 또는 SARS-CoV-2 N 단백질(뉴클레오캡시드 인단백질; SEQ ID NO: 2)과 같이 SARS-CoV-2 바이러스의 핵산에 의해 인코드되는 전체 길이의 단백질의 구조 단백질이 될 수 있다. 또한, SARS-CoV-2 단백질은 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 핵산에 의해 인코드되는 전체 길이의 단백질의 다른 부분들을 포함하는 융합 단백질이 될 수 있다. 예를 들면, SARS-CoV-2 융합 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 부위, 푸린(furin) 부위 및 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 10)을 포함할 수 있다.
"COVID-19" 또는 "코로나바이러스 질병 2019"라는 용어는 상기 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 야기되는 전염병을 지칭한다.
여기에 사용되는 바와 같은 "TLR 작용제(agonist)" 또는 "톨-유사 수용체 작용제(Toll-like receptor agonist)"라는 용어는, 예를 들어, TLR-2, TLR-3, TLR-6, TLR-7, 또는 TLR-8을 포함하는 톨-유사 수용체와 결합하고 자극하는 화합물을 지칭한다. TLR 작용제들은 MacKichan의 "IAVI Report."(9:1-5(2005)) 및 Abreu 등의 "J Immunol"(174(8), 4453-4460(2005))에 검토되어 있다. 작용제들은 이들의 수용체에 대한 결합에 후속하여 신호 형질도입을 유도한다.
여기에 사용되는 바에 있어서 "TLR-3 작용제" 또는 "톨-유사 수용체 3 작용제"라는 용어는 상기 TLR-3과 결합하고 자극하는 화합물을 지칭한다. TLR-3 작용제들은 이중 가닥 RNA, 바이러스로 유도된 dsRNA, 폴리이노신(polyinosine)-폴리시티딜산(polycytidylic acid)(폴리 I: C)-폴리아데닐릭(polyadenylic)-폴리우리딜산(polyuridylic acid)(폴리 A:U) 및 폴리 I: 폴리 C, 그리고 IFN-베타 생성을 가져오는 TLR-3에 대한 항체들(또는 항체들의 교차 결합)을 포함하는 이중 가닥 RNA에 대한 몇몇의 화학적으로 합성된 유사체들을 포함하는 것으로 확인되었다(Matsumoto, M 등의 "Biochem Biophys"(Res Commun 24: 1364(2002)), de Bouteiller 등의 "J Biol Chem"(18: 38133-45(2005)). 일부 실시예들에서, TLR-3 작용제는 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18 중의 임의의 것의 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, TLR-3 작용제는 dsRNA(예를 들어, SEQ ID NO: 11에서 설정된 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코드되는 dsRNA)이다.
"이종(heterologous)"이라는 용어는 핵산의 일부와 관련하여 사용될 때에 자연에서는 서로에 대해 동일한 관련성으로 발견되지 않는 둘 또는 그 이상의 하위서열들을 포함하는 핵산을 나타낸다. 예를 들면, 상기 핵산은 통상적으로 재조합으로 생성되며, 새로운 기능성 핵산, 예를 들어, 하나의 소스로부터의 프로모터 및 다른 소스로부터의 코팅 영역을 만들기 위해 배열되는 연관되지 않은 유전자들로부터의 둘 또는 그 이상의 서열들을 가진다. 유사하게, 이종 단백질은 자연에서는 서로에 대해 동일한 관련성으로 발견되지 않는 둘 또는 그 이상의 하위서열들을 포함하는 단백질(예를 들어, 융합 단백질)을 나타낸다.
"핵산" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라는 용어들은 여기서 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)들 또는 리보뉴클레오티드 및 단일- 또는 이중-가닥 형태의 이들의 폴리머들에 관하여 상효 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 합성되는, 자연 발생적으로 생성되는 및 자연 발생적으로 생성되지 않고, 기준 핵산과 유사한 결합 성질들을 가지며, 기준 뉴클레오티드들과 유사한 방식으로 대사 작용을 하는 알려진 뉴클레오티드 유사체들 또는 변형된 골격 잔기들이나 연결들을 포함하는 핵산들을 포괄한다. 이러한 유사체들의 예들은, 한정되는 것은 아니지만, 포스포로티오에이트(phosphorothioate)들, 포스포아미데이트(phosphoramidate)들, 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate)들, 키랄-메틸 포스포네이트(chiral-methyl phosphonate)들, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드(methyl ribonucleotide)들, 펩티드-핵산(PNA)들을 포함한다.
다르게 기재되지 않는 한, 특정한 핵산 서열도 이의 보존적으로 변형된 변이체들(예를 들어, 동의 코돈 치환체들) 및 상보 서열들뿐만 아니라 분명하게 나타내는 서열을 포괄한다. 상세하게는, 동의 코돈 치환체들은 하나 또는 그 이상의 선택된(또는 모든) 코돈들의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신(deoxyinosine) 잔기들로 치환되는 서열들을 발생시켜 구현될 수 있다(Batzer 등의 "Nucleic acid Res."(19: 5081(1991)); Ohtsuka 등의 "J. Biol. Chem."(260: 2605-2608(1985)); Rossolini 등의 "Mol. Cell. Probes"(8: 91-98(1994))). 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 및 폴리뉴클레오티드와 상호 교환적으로 사용된다.
"항원"이라는 용어는 T 세포 수용체들 및/또는 항체들에 의해 인식될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드 사슬의 일부를 지칭한다. 통상적으로, 항원들은 박테리아, 바이러스, 또는 균류 단백질들로부터 유래된다.
본 발명의 조성물들의 "면역원성으로 유효한 도스 또는 양"이라는 표현은 상기 SARS-CoV-2 단백질에 대해 특이적인 면역 반응들을 유도하거나 조절하는 양을 의미한다. 면역 반응들은 체액 면역 반응들 및 세포-매개 면역 반응들을 포함한다. 면역원성 조성물은 임의의 단계에서 질병을 치료하거나 방지하기 위해 치료적이나 예방적으로 사용될 수 있다. 체액 면역 반응들 대체로 혈액의 세포가 없는 구성 성분들, 혈장이나 혈청, 하나의 개체로부터 다른 전달 면역까지의 혈청이나 혈장의 전달에 의해 매개된다. 세포 매개 면역 반응들은 대체로 항원 특이적 림프구들, 하나의 개체로부터 다른 전달 면역까지의 항원 특이적 림프구들의 전달에 의해 매개된다.
키메라 아데노바이러스 벡터를 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터 또는 조성물의 이하는 표현은 상기 SARS-CoV-2 단백질의 소스(예를 들어, SARS-CoV-2 바이러스)와 연관된 질병들 및 장애의 증상들의 중증을 방지하거나, 경감시키거나, 누그러뜨리거나, 감소시키는 벡터 또는 벡터를 포함하는 조성물의 양을 의미한다.
"보조제(adjuvant)"라는 용어는 비특이적 면역 반응 상승제(enhancer)를 지칭한다. 적합한 보조제들은, 예를 들면, 콜레라 독소(cholera toxin), 모노포스포릴 지질(monophosphoryl lipid A)(MPL), 프리운드 완전 보조제(Freund's Complete Adjuvant), 프리운드 불완전 보조제(Freund's Incomplete Adjuvant), 퀼(Quil) A 및 Al(OH)을 포함한다. 또한, 보조제들은 항원-표출 세포 활성화 및 톨-유사 수용체들과 같은 이차 신호전달 분자들을 통한 T 세포들의 향상된 표출을 야기하는 물질들이 될 수 있다. 톨-유사 수용체들의 예들은 이중-가닥 RNA, 박테리아 편모들, LPS, CpG DNA 및 박테리아 지질펩티드를 인식하는 수용체들을 포함한다(Abreu 등의 "J Immunol"(174(8), 4453-4460(2005))에서 최근에 검토됨).
"폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"이라는 용어들은 여기서 아미노산 잔기들의 폴리머에 대해 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 자연 발생적으로 생성되는 아미노산의 인위적인 화학적 모방체인 아미노산 폴리머들뿐만 아니라 자연 발생적으로 생성되는 아미노산 폴리머들 및 자연 발생적으로 생성되지 않는 아미노산 폴리머에도 적용된다.
"아미노산"이라는 용어는 자연 발생적으로 생성되는 및 합성되는 아미노산들뿐만 아니라 상기 자연 발생적으로 생성되는 아미노산들과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체들 및 아미노산 모방체들을 지칭한다. 자연 발생적으로 생성되는 아미노산들은 유전자 코드뿐만 아니라 이후에 변형되는, 예를 들어, 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 및 O-포스포세린(phosphoserine)인 아미노산들에 의해 인코드되는 것들이다. 아미노산 유도체들은 자연 발생적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기, 예를 들어, 헤모세린(homoserine), 노르류신(norleucine), 메티오닌 술폭시드(methionine sulfoxide), 메티오닌 메틸 술포늄(methionine methyl sulfonium)에 결합되는 α 탄소를 가지는 화합물들을 지칭한다. 이러한 유사체들은 변형된 R기들(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격들을 가지지만, 자연 발생적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본적인 화학적 구조를 유지한다. 아미노산 모방체들은 아미노산의 일반적인 화학적 구조와 다른 구조를 가지지만, 자연 발생적으로 생성되는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물들을 지칭한다.
아미노산들은 여기서 통상적으로 알려진 세 개의 문자 기호들에 의하거나, IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권고되는 하나의 문자 기호들에 의해 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드들도 마찬가지로 이들의 통상적으로 허용되는 단일 문자 코드들에 의해 지칭될 수 있다.
여기에 사용되는 바에 있어서, 핵산들 또는 폴리펩티드들의 사례에서 사용되는 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 동일한"이라는 표현은 기준 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 가지는 서열을 지칭한다. 선택적으로는, 퍼센트 동일성은 50%에서 100%까지의 임의의 숫자가 될 수 있다. 일부 실시예들에서, 서열이 여기에 설명되는 방법들, 바람직하게는 다음에 설명하는 바와 같이 표준 파라미터들을 이용하는 BLAST를 이용하여 결정되는 바와 같이 기준 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가질 경우에 상기 서열은 상기 기준 서열과 실질적으로 동일하다. 또한, 퍼센트 동일성은 수동 정렬에 의해 결정될 수 있다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열이 테스트 서열들이 비교되는 기준 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 테스트 및 기준 서열들은 컴퓨터에 입력되고, 필요할 경우에 서열 좌표들이 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터들이 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터들이 시용될 수 있거나, 선택적인 파라미터들이 지정될 수 있다. 상기 서열 비교 알고리즘은 이후에 상기 프로그램 파라미터들을 기초로 하여 상기 기준 서열에 대한 상기 테스트 서열들을 위한 퍼센트 서열 동일성들을 계산한다.
비교 윈도우(comparison window)는 인접하는 위치들의 숫자의 임의의 것의 분절, 예를 들어, 적어도 10의 잔기들의 분절에 대한 참조를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 비교 윈도우는 10 내지 600의 잔기들, 예를 들어, 약 10 내지 약 30의 잔기들, 약 10 내지 약 20의 잔기들, 약 50 내지 약 200의 잔기들, 또는 약 100 내지 약 150의 잔기들을 가지며, 여기서 서열은 둘의 서열들이 최적으로 정렬된 후에 인접하는 위치들의 동일한 숫자의 기준 서열과 비교될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘들은 Altschul 등의 "J. Mol. Biol."(215: 403-410(1990)) 및 Altschul 등의 "Nucleic Acids Res."(25: 3389-3402(1977))에 각기 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘들이다. BLAST 분석들을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(NCBI) 웹 사이트를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬될 때에 일부 양의 값의 임계값 스코어 T와 매치되거나 만족시키는 조회 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인하여 높은 스코어링(scoring)의 서열 쌍들(HSP)들을 확인한다. T는 이웃하는 워드 스코어 임계값으로 지칭된다(Altschul 등의 앞서의 문헌). 이들 초기의 이웃하는 워드 히트들은 이들을 포함하는 보다 긴 HSP들을 발견하기 위하여 검색들을 개시하기 위한 시트들로 기능한다. 상기 워드 히트들은 이후에 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한은 각 서열을 따라 양 방향들로 연장된다. 누적 스코어들은 뉴클레오티드 서열들에 대해 파라미터들 M(매치되는 잔기들의 쌍에 대한 리워드 스코어; 항상 ＞0) 및 N(매치되는 잔기들의 쌍에 대한 페널티 스코어; 항상 ＜0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열들에 대해, 스코어링 행렬이 누적 스코어를 계산하는 데 이용된다. 각 방향으로의 워드 히트들의 연장은 하나 또는 그 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬들의 누적으로 인하여 누적 정렬 스코어가 이의 최대로 구현된 값으로부터 양 X만큼 하락될 때, 누적 스코어가 영(zero)이나 그 아래로 진행될 때, 또는 각 서열의 종료에 도달될 때에 중단된다. 상기 BLAST 알고리즘 파라미터들인 W, T 및 X는 상기 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. 상기 BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열들을 위한)은 28의 워드 사이즈(W), 10의 기댓값(E), M=1, N=-2 및 양 가닥들의 비교를 디폴트들로 사용한다. 아미노산 서열들에 대해, 상기 BLASTP 프로그램은 3의 워드 사이즈(W), 10의 기대값(E) 및 BLOSUM62 스코어링 행렬을 디폴드들로 사용한다(Henikoff 및 Henikoff의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"(89: 10915(1989) 참조).
또한, 상기 BLAST 알고리즘은 둘의 서열들 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin 및 Altschul의 "Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA"(90: 5873-5787(1993) 참조). 상기 BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 측정은 최소 누적 가능성(smallest sum probability)(P(N))이며, 이는 둘의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이에 매치가 우연히 일어날 수 있을 가능성의 표지를 제공한다. 예를 들면, 상기 기준 아미노산 서열에 대한 상기 테스트 아미노산 서열의 비교에서 상기 최소 누적 가능성이 약 0.01 보다 작고, 보다 바람직하게는 약 10-5 보다 작으며, 가장 바람직하게는 약 10-20 보다 작을 경우에 아미노산 서열은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.
III. 본 발명의 조성물들 및 방법들
본 발명은 키메라 아데노바이러스 벡터들을 포함하는 조성물들을 제공한다. 상기 키메라 아데노바이러스 벡터들은 하나 또는 그 이상의 SARS-CoV-2 단백질들을 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산들을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키메라 아데노바이러스 벡터들은 바이러스 벡터들과 함께 투여될 때에 효과적인 보조제로 작용할 수 있는 톨-유사 수용체(TLR) 작용제(예를 들어, TLR-3 작용제)를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에서, 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터들은 다음의 요소들을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. (a) 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 제1 프로모터; 및 (b) 톨-유사 수용체-3(TLR-3) 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 제2 프로모터. 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질은 상기 SARS-CoV-2(예를 들어, 젠뱅크 수탁번호 MN908947.3)의 핵산 또는 상기 단백질의 조각에 의해 인코드된 전체 길이의 단백질(또는 이의 실질적으로 동일한 단백질)이 될 수 있다. 예를 들면, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질(표면 당단백질; 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 이의 실질적으로 동일한 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 이의 변이체들); 또는 SARS-CoV-2 N 단백질(뉴클레오캡시드 인단백질; SEQ ID NO: 2 또는 이의 실질적으로 동일한 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 가지는 이의 변이체)과 같은 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 핵산에 의해 인코드된 전체 길이의 단백질의 구조 단백질이 될 수 있다. 다른 실시예들에서, 제1 SARS-CoV-2 단백질은 ORF1ab 유전자에 의해 인코드된 바와 같이 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 다른 부분들에 의해 인코드된 단백질, ORF3a 유전자에 의해 인코드된 단백질, 상기 E 유전자(엔벨로프 단백질을 인코딩하는)에 의해 인코드된 단백질, M 유전자(멤브레인 당단백질을 인코딩하는)에 의해 인코드된 단백질, ORF6 유전자에 의해 인코드된 단백질, ORF7a 유전자에 의해 인코드된 단백질, ORF8 유전자에 의해 인코드된 단백질, 또는 ORF10 유전자에 의해 인코드된 단백질이 될 수 있다.
또 다른 실시예들에서, 제1 SARS-CoV-2 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 핵산에 의해 인코드된 전체 길이의 단백질의 다른 부분들을 포함하는 융합 단백질이 될 수 있다. 예를 들면, SARS-CoV-2 융합 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 부위, 푸린 부위 및 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 10)을 포함할 수 있다.
요소 (a) 내의 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코드하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있으며, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 인코드할 수 있다. 일부 실시예들에서, 요소 (a) 내의 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있으며, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코드할 수 있다. 일부 실시예들에서, 요소 (a) 내의 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 또는 99%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있으며, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 SARS-CoV-2 S 단백질 변이체를 인코드할 수 있다. 다른 실시예들에서, 요소 (a) 내의 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코드하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있으며, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열을 인코드할 수 있다. 일부 실시예들에서, 요소 (a) 내의 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 또는 99%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있고, SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 SARS-CoV-2 N 단백질 변이체를 인코드할 수 있다. 또 다른 실시예들에서, 요소 (a) 내의 제1 SARS-CoV-2 단백질을 인코드하는 핵산은 SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있고, SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 부위, 푸린 부위 및 SARS-CoV-2 N 단백질(SEQ ID NO: 10)을 포함하는 상기 SARS-CoV-2 융합 단백질의 아미노산 서열을 인코드한다.
제1 SARS-CoV-2 단백질 이외에도, 본 발명의 키메라 아데노바이러스 벡터들은 요소 (c)인 제2 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 제3 프로모터를 더 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, N-말단들로부터 C-말단까지의 상기 발현 카세트 내의 상기 요소들의 순서는 요소 (a), 요소 (c) 및 요소 (b)이다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트 내의 요소 (a) 및 요소 (c) 내의 이들의 각각의 핵산들에 의해 인코드되는 제1 및 제2 SARS-CoV-2 단백질들은 동일하다. 일부 실시예들에서, 상기 발현 카세트 내의 요소 (a) 및 요소 (c) 내의 이들의 각각의 핵산들에 의해 인코드되는 제1 및 제2 SARS-CoV-2 단백질들은 다르다.
예를 들면, 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질(예를 들어, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하며, SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 핵산에 의해 인코드되는 이의 변이체들)이 될 수 있으며, 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 4와 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 인코드되는 SEQ ID NO: 2)이 될 수 있다. 다른 예에서, 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 인코드되는 SEQ ID NO: 2)이 될 수 있으며, 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 S 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고, SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 인코드되는 이의 변이체들)이 될 수 있다.
다른 예에서, 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 가지는 이의 변이체들) 또는 SARS-CoV-2 S 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 이의 변이체들)이 될 수 있으며, 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 융합 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 5의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 인코드되는 SEQ ID NO: 10)이 될 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 제1 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 융합 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 5와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 핵산 서열에 의해 인코드되는 SEQ ID NO: 10)이 될 수 있고, 상기 제2 SARS-CoV-2 단백질은 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 그 변이체) 또는 SARS-CoV-2 S 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20과 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 이의 변이체들)이 될 수 있다.
해당 기술 분야의 숙련자는 SARS-CoV-2 단백질들의 변이체들, 예를 들어, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질의 변이체들이 빠르게 나타나는 점을 이해할 것이다. 둘의 변이체 S 단백질 서열들의 예들인 영국 B.1.1.1.7 변이체 및 남아프리카 B.1.351 501Y.V2 변이체는 각기 SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20로 제공된다. 다른 것들 중에서 브라질 변이체 P.1(L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I); 인도 변이체 B.1.617(L452R, E484Q, D614G) 및 오미크론(Omicron) 변이체를 포함하는 다른 S 단백질 변이체들이 알려져 있다. 따라서 일부 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질 서열은 환자 집단에서 확인되는 변이체 서열이다.
SARS-CoV-2 단백질에 대한 면역 반응을 유발하는 상술한 벡터들 이외에도, 실험예 6에 나타낸 데이터의 관점에서, 통상적으로 SARS-CoV-2 N 단백질인 코로나바이러스 N 단백질과 비-SARS-CoV-2 항원 소스로부터 유래될 수 있는 임의의 제2 항원의 동시 도입이 상기 제2 항원에 대한 CD8 T-세포 면역 반응을 자극하는 데 이용될 수 있는 실시예들이 여기에 제공된다.
이에 따라, 본 발명은 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일성, 또는 적어도 95% 동일성을 가지는 이의 변이체, 또는 이의 조각)을 인코딩하고, 임의의 소스로부터의 제2 항원 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들도 제공한다. 예를 들면, 상기 제2 항원 단백질은 비-SARS-CoV-2 바이러스, 박테리아, 다른 병원체 또는 암으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에서, 상기 제2 항원은 단순포진(herpes simplex) 1형; 단순포진 2형; 뇌염 바이러스(encephalitis virus), 유두종 바이러스(papillomavirus), 수두-대상포진 바이러스(varicella-zoster virus); 엡스타인-바 바이러스(Epstein-barr virus); 인간 거대세포 바이러스(human cytomegalovirus); 인간 헤르페스 바이러스(human herpes virus) 8형; 인간 유두종 바이러스(human papillomavirus); BK 바이러스; JC 바이러스; 두창(smallpox); 폴리오바이러스(poliovirus); B형 간염 바이러스; 인간 보카바이러스(human bocavirus); 파보바이러스(parvovirus) B19; 인간 아스트로바이러스(human astrovirus); 노워크바이러스(norwalk virus); 콕사키바이러스(coxsackievirus); A형 간염 바이러스; 폴리오바이러스; 리노바이러스(rhinovirus); 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스; C형 간염 바이러스; 황열 바이러스(yellow fever virus); 뎅기열 바이러스(dengue virus); 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus); 풍진 바이러스(rubella virus); E형 간염 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV); 인플루엔자 바이러스(influenza virus); 구아나리토 바이러스(Guanarito virus); 후닌 바이러스(Junin virus); 라사 바이러스(Lassa virus); 마츄포 바이러스(Machupo virus); 사비아 바이러스(Sabia virus); 크리민-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus); 에볼라 바이러스(Ebola virus); 마버그 바이러스(Marburg virus); 홍역 바이러스(measles virus); 유행성이하선염 바이러스(mumps virus); 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus); 호흡기 세포융합바이러스(respiratory syncytialvirus); 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus); 헨드라 바이러스(Hendra virus); 니파 바이러스(Nipah virus); 광견병 바이러스(rabies virus); D형 간염; 로타바이러스(rotavirus); 오르비 바이러스(orbivirus); 콜티바이러스(coltivirus); 반나 바이러스(Banna virus); 인간 엔테로바이러스(human Enterovirus); 한타 바이러스(Hanta virus); 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus); 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome corona virus); 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus); 소수포성 발진 바이러스(vesicular exanthema virus); 또는 동부형 말 뇌박염(Eastern equine encephalitis)으로부터 유래되는 단백질 또는 이의 조각이다. 또한, 이용될 수 있는 항원들의 열거에 대해서는 미국 특허 제8,222,224호를 참조하기 바란다.
여기에 설명되는 방하 같이 SARS-CoV-2 N 단백질과 결합하여 사용될 수 있는 제2 항원들의 특정한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 노로바이러스(norovirus)(예를 들어, VP1), 호흡기 세포융합바이러스(RSV), 상기 인플루엔자 바이러스(예를 들어, HA, NA, M1, NP), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)(예를 들어, gag, pol, env 등), 인간 유두종 바이러스(HPV)(예를 들어, L1과 같은 캡시드 단백질들과 같은 단백질들), 베네수엘라 말 뇌척수막염(Venezuelan Equine Encephalomyelitis: VEE) 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 단순포진 바이러스(HSV), 인간 헤르페스 바이러스, 리노바이러스, 콕사키바이러스, 엔테로바이러스, A형, B형, C형, E형 및 G형 간염(HAV, HBV, HCV, HEV, HGV, 예를 들어, 표면 항원), 유행성이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 홍역 바이러스, 폴리오바이러스, 두창 바이러스, 광견병 바이러스, 그리고 수두-대상포진 바이러스로부터 유래되는 것들을 포함한다.
또한, 여기에 설명되는 바와 같은 제2 항원들로서 적합한 바이러스 항원들은 바이러스 비구조 단백질들, 예를 들어, 캡시드 또는 바이러스를 둘러싸는 단백질을 만드는 경우들과는 대조적으로 구조 폴리펩티드들에 대해 인코딩하지 않는 바이러스 핵산에 의해 인코드된 단백질들을 포함한다. 비구조 단백질들은, 예를 들면, 베네수엘라 말 뇌염(VEE), 동부 말 뇌염(EEE), 또는 셈리키 삼림열(Semliki Forest)로부터 유래되는 비구조 단백질 1, 단백질 2, 단백질 3 및 단백질 4(각기 NS1, NS2, NS3 및 NS4)와 같은 바이러스 핵산 복제, 바이러스 유전자 발현, 또는 전사후 처리를 증진시키는 이들 단백질들을 포함한다.
여기에 설명되는 바와 같은 제2 항원들로 유용한 박테리아 항원들은, 예를 들면, 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 표피 포도상 구균(Staphylococcus epidermis), 헬리코박터 파일로리(helicobacter pylori), 연쇄상 구균(Streptococcus bovis), 화농 연쇄상 구균(Streptococcus pyogenes), 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 나균(Mycobacterium leprae), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae), 보렐리아 부르그도페리(Borrelia burgdorferi), 탄저균(Bacillus anthracis), 세레우스균(Bacillus cereus), 보톨리누스균(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실리균(Clostridium difficile), 장티푸스균(Salmonella typhi), 비브리오 콜레라(Vibrio chloerae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 백일해균(Bordetella pertussis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 트레포네 팔리둠(Treponema pallidum), 마이코플리즘 종(Mycoplasm sp.), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 발진열(Rickettsia typhi), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 이질균(Shigella dysenteriae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)(예를 들어, 콜레라 독소 서브유닛 B, 콜레라 독소-공조절 필루스(TCP)); 헬리코박터 파일로리(helicobacter pylori)(예를 들어, VacA, CagA, NAP, Hsp, 카탈라아제(catalase), 우레아제(urease)), 그리고 E. 콜리(coli)(예를 들어, 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin), 섬모 항원들)로부터 유래될 수 있다.
여기에 설명되는 바와 같은 제2 항원들로서 유용한 기생 생물 항원들은, 예를 들면, 람블편모충(Giardia lamblia), 리슈마니아 종(Leishmania sp.), 트리파노소마 종(Trypanosoma sp.), 트리코모나스 종(Trichomonas sp.), 말라리아원충 종(Plasmodium sp.)(예를 들어, pfs25, pfs28, pfs45, pfs84, pfs 48/45, pfs 230, Pvs25 및 Pvs28과 같은 열대열 말라리아원충(P. falciparum) 표면 단백질 항원들); 주혈흡충 종(Schistosoma sp.); 그리고 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(예를 들어, Ag85, MPT64, ESAT-6, CFP10, R8307, MTB-32 MTB-39, CSP, LSA-1, LSA-3, EXP1, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, AMA-1, 1형 내재 막 단백질, RESA, EBA-175 및 DBA)으로부터 유래될 수 있다.
여기에 설명되는 바와 같은 제2 항원들로서 유용한 균류 항원들은, 예를 들면, 무좀(Tinea pedis), 체부 백선(Tinea corporus), 샅백선(Tinea cruris), 손톱백선(Tinea unguium), 흑색 진균증(Cladosporium carionii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 칸디다 종(Candida sp.), 아스페르질루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 그리고 폐포 자충(Pneumocystis carinii)으로부터 유래될 수 있다.
여기에 설명되는 바와 같은 제2 항원들로서 유용한 암 항원들은, 예를 들면, 결장암, 위암, 췌장암, 폐암, 난소암, 전립선암, 유방암, 피부암(예를 들어, 흑색종), 백혈병, 또는 림프종에서 발현되거나 과발현되는 항원들을 포함한다. 예시적인 암 항원들은, 예를 들면, HPV L1, HPV L2, HPV E1, HPV E2, 태반 알칼라인 포스파타아제(placental alkaline phosphatase), AFP, BRCA1, Her2/neu, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CEA, Hcg, 우로키나아제(urokinase)형 플라스미노겐 활성화인자(plasminogen activator)(Upa), 플라스미노겐 활성화인자 억제제, CD53, CD30, CD25, C5, CD11a, CD33, CD20, ErbB2, 그리고 CTLA-4를 포함한다. 추가적인 암 표적들에 대해서는 Sliwkowski 및 Mellman의 "Science"(341: 6151(2013))를 참조하기 바란다.
약화된 아데노바이러스가 SARS-CoV-2 N 단백질 및 제2 항원 단백질(예를 들어, CD8 T-세포 반응을 발생시키기 위해)을 발현시키는 데 이용될 수 있지만, 다른 폴리뉴클레오티드들 또는 벡터들도 이용될 수 있다. 발현 벡터들은, 예를 들면, 바이러스-유래 벡터들, 예를 들어, 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터들, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터들, 아데노바이러스 벡터들, 변형 백시니아 앙카라(modified vaccinia Ankara: MVA) 벡터들, 그리고 렌티바이러스(lentivirus)(예를 들어, HSV-1-유래) 벡터들(예를 들어, Brouard 등의 "British J. Pharm."(157: 153(2009) 참조)을 포함할 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2) 및 제2 항원 단백질은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 노출 또는 피막 DNA, 혹은 RNA, 예를 들어, mRNA(예를 들어, RNA계 백신들에 대한 다양한 측면들의 세부 사항들에 대해서는 미국 공개 특허 제2020/0254086호 참조)에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 실시예들에서, SAR-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 부위 및 제2 항원 단백질을 인코딩하는 부위를 포함하는 벡터는 바이러스 벡터들과 같은 벡터들과 함께 투여될 때에 효과적인 보조제로 기능할 수 있는 TLR 작용제(예를 들어, TLR-3 작용제)를 인코딩하는 핵산을 더 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 벡터는 상기 N 단백질을 인코드하는 핵산의 부위 및 상기 제2 항원 단백질을 인코딩하는 부위 사이에 위치하는 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skipping element)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 비시스트로닉 전사(bicistronic transcript)를 생성하기 위해 상기 N 단백질 및 제2 항원 단백질 사이에 위치하는 IRES를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 상기 N 단백질 및 상기 제2 항원 단백질 사이에 위치하는 바이러스 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A 펩티드(F2A), 말 비염(equine rhinitis) A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스(cytoplasmic polyhedrosis virus) 2A 펩티드(BmCPV 2A), 또는 B. 모리(mori)의 플라세리 바이러스(flacherie virus) 2A 펩티드(BmIFV 2A)를 인코딩하는 서열이다. 일부 실시예들에서, 상기 구조체는 TLR 작용제를 더 인코드한다.
일부 실시예들에서, 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터는 SARS-Co-V2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 N 단백질 서열, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 이의 변이체), 그리고 상기 N 단백질 및 제2 항원 단백질이 다른 프로모터들에 의해 작동되는 제2 항원 단백질을 인코드한다.
일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합되는 제1 프로모터 및 상기 제2 항원 단백질에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터는 TLR 작용제, 예를 들어, TLR-3 작용제에 작동 가능하게 결합되는 제2 프로모터를 더 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, N-말단들로부터 C-말단들까지의 상기 발현 카세트 내의 요소들의 순서는 항원 단백질을 인코딩하는 서열, SARS-Co-V2 N 단백질을 인코딩하는 서열 및 TLR 작용제, 예를 들어, TLR 3 작용제를 인코딩하는 서열이다.
또 다른 실시예들에서, 항원 단백질은 상기 N 단백질 서열에 융합될 수 있으며, 예를 들면, 융합 단백질은 항원 단백질, 푸린 부위 및 SARS-CoV-2 N 단백질, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 2와 적어도 90% 동일하거나 적어도 95% 동일한 이의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 실시예들에서, 벡터에 의해 인코드되는 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%의 동일성을 가진다. 일부 실시예들에서, 벡터에 의해 인코드되는 N 단백질은 SEQ ID NO: 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 가진다.
일부 실시예들에서, 상기 벡터는 제2 항원 단백질이 상기 N 단백질 및 SARS-CoV-2 S 단백질들 모두를 인코드하는 여기에 제공되는 구조체들 내의 SARS-CoV-2 S 단백질을 대체하는 여기에 설명되는 바와 같은 발현 카세트를 포함한다. 따라서 예를 들면, 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 다음의 (5'-3)과 같은 서열들을 포함한다.
CMV-제2 항원 단백질-BGH-bActin-N 단백질-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA
여기서, "CMV"는 CMV 프로모터이고; "제2 항원 단백질"은, 예를 들어, 여기에 설명되는 바와 같은 전염병 제제 또는 암 항원으로부터의 제2 항원 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이며; "BGH"는 소성장 호르몬(bovine growth hormone) 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal) 서열이고; "bActin"은 베타-액틴(beta-actin) 프로모터, 예를 들어, 인간 베타-액틴 프로모터이며; "N-단백질"은 여기에 설명되는 바와 같은 SARS-CoV2 N 단백질, 예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%의 동일성이나 적어도 95%의 동일성을 가지는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이고; "SPA"는 합성 폴리(poly)A 서열이며; "dsRNA"는 TLR 작용제, 예를 들어, TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산 서열이다.
일부 실시예들에서, 선택적인 코로나바이러스로부터의 N 단백질이 N 단백질 및 감염 질병 항원 또는 암 항원과 같은 항원 단백질을 포함하는 구조체들 내의 SARS-CoV-2 N 단백질을 대체하여 적용된다. 따라서 예를 들면, 일부 실시예들에서, 이와 같은 구조체는 SARS-CoV 또는 MERS N 단백질을 포함한다.
일부 실시예들에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어,다음에 설명되는 바와 같은 아데노바이러스 5(Ad5) 벡터이다.
적합한 아데노바이러스 벡터들
일부 실시예들에서, 여기에 설명되는 바와 같은 아데노바이러스 벡터는, 예를 들면, E1/E3 부위들의 결실들을 가지는 Ad5 및 E4 부위의 결실을 가지는 Ad5를 포함할 수 있는 아데노바이러스 5(Ad5)이다. 다른 적합한 아데노바이러스 벡터들은 균주들 2, 경구로 테스트된 균주 4 및 균주 7, 장용(enteric) 아데노바이러스 40 및 아데노바이러스 41, 그리고 항원을 전달하고 전이 유전자 항원에 대해 적응성 면역 반응을 유도하기 충분한 다른 균주들(예를 들어, Ad34)을 포함한다(Lubeck 등의 "Proc Natl Acad Sci USA"(86(17), 6763-6767(1989)); Shen 등의 "J Virol"(75(9), 4297-4307(2001)); Bailey 등의 "Virology"(202(2), 695-706(1994))). 일부 실시예들에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 살아있는 복제 불능의 아데노바이러스 벡터(E1 및 E3 결실 rAd5와 같은), 살아있고 약화된 아데노바이러스 벡터(상기 E1B55K 결실 바이러스들과 같은), 또는 야생형 복제를 구비하는 살아있는 아데노바이러스 벡터이다.
생체 내의 척추동물 세포들을 변형시키는 데 사용되는 발현 벡터들 내의 전사 및 번역 제어 서열들은 바이러스 소스들에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 공통적으로 이용되는 프로모터들 및 상승제들은, 예를 들어, 베타-액틴, 아데노바이러스, 유인원 바이러스(simian virus)(SV40) 및 인간 거대세포 바이러스(CMV)로부터 유래된다. 예를 들면, CMV 프로모터, 베타-액틴 프로모터, SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스(murine mammary tumor virus) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터, 변환기 프로모터, 또는 포유동물 세포들 내의 발현을 위해 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터들의 단백질들 지향 하에서 단백질들의 발현을 가능하게 하는 벡터들이 적합하다. 다른 바이러스 게놈 프로모터, 제어 및/또는 신호 서열들이 이용될 수 있으며, 이러한 제어 서열들은 선택된 숙주 세포와 양립 가능하도록 제공된다.
다양한 프로모터들이 여기에 설명되는 키메라 아데노바이러스 벡터들 내에 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 키메라 아데노바이러스 벡터가 둘 또는 그 이상의 핵산들을 발현시킬 때, 상기 핵산들을 발현시키기 위해 이용되는 프로모터들은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에서, 요소 (a)를 발현시키는 데 이용되는 제1 프로모터 및 (b)를 발현시키는 데 이용되는 제2 프로모터는 모두 CMV 프로모터가 될 수 있거나, 또는 상기 두 프로모터들은 다를 수 있다. 예를 들어, 하나의 프로모터는 CMV 프로모터이고, 다른 하나의 프로모터는 베타-액틴 프로모터이다. 다른 실시예들에서, 요소 (c)가 포함될 때, 제3 프로모터는 상기 제1 및/또는 제2 프로모터와 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 모두 CMV 프로모터가 될 수 있고, 상기 제3 프로모터는 베타-액틴 프로모터(예를 들어, 인간 베타-액틴 프로모터)가 될 수 있다.
또한, 해당 기술 분야의 숙련자는 여기에 설명되는 바와 같은 폴리펩티드들을 발현시키는 발현 카세트들이 폴리아데닐화 신호, 예를 들어, 소성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 및 종료기 서열들 또는 RNA 안정 요소들과 같은 발현을 조절하는 다른 서열들을 포함할 수 있는 점을 이해할 것이다.
TLR 작용제들
또한, 여기에 설명되는 키메라 아데노바이러스 벡터들은 바이러스 벡터들과 함께 투여될 때에 효과적인 보조제로 기능할 수 있는 톨-유사 수용체(TLR) 작용제를 인코딩하는 핵산을 포함한다. TLR 작용제들은 상기 SARS-CoV-2 단백질에 대한 면역 반응을 향상시키도록 사용된다. 일부 실시예들에서, TLR-3 작용제들이 사용된다. 일부 실시예들에서, 여기에 설명되는 TLR 작용제들은 관심의 대상인 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하는 발현 벡터와 동시에 전달될 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 TLR 작용제들은 관심의 대상인 항원(예를 들어, SARS-CoV-2 단백질)을 인코딩하는 발현 벡터와 별도로(즉, 시간적으로나 공간적으로) 전달될 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 비경구가 아닌 루트(예를 들어, 경구로, 비강 내로, 또는 점막으로)를 통해 투여될 수 있는 반면, 상기 TLR 작용제는 경구 루트(예를 들어, 근육 내로, 복강 내로, 또는 피하로)에 의해 전달될 수 있다.
특정 실시예들에서, TLR-3 작용제는 관심의 대상인 항원의 면역 인식을 자극하기 위해 사용될 수 있다. TLR-3 작용제들은, 예를 들면, 쇼트 헤어핀 RNA, 바이러스 유래 RNA, 이중 가닥 또는 쇼트 헤어핀 RNA를 형성할 수 있는 RNA의 짧은 분절들, 그리고 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 TLR-3 작용제는 바이러스 유래 dsRNA, 예를 들면, 신드비드 바이러스(Sindbis virus) 또는 dsRNA 바이러스 중간체들로부터 유래되는 dsRNA이다(Alexopoulou 등의 "Nature"(413: 732-8(2001)). 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제는 쇼트 헤어핀 RNA이다. 쇼트 헤어핀 RNA 서열들은 통상적으로 링커(linker) 서열에 의해 연결되는 둘의 상보성 서열들을 포함한다. 특정한 링커 서열이 본 발명의 중요한 측면은 아니다. dsRNA를 형성하기 위해 상기 둘의 상보성 서열들의 결합을 간섭하지 않는 한은 임의의 적절한 링커 서열이 이용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제는 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18에서 설시되는 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%(예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%)의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제들은 SEQ ID NO: 11의 서열을 포함한다. 특정 실시예들에서, TLR-3 작용제인 dsRNA는 특정한 폴리펩티드를 인코드하지 않지만, 생체 외 또는 생체 내로 반응기 세포(예를 들어, 수지상 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 또는 대식 세포)와 접촉될 때에 전염증성 시토카인(pro-inflammatory cytokine)(예를 들어, IL-6, IL-8, TNF-알파, IFN-알파, IFN-베타 등)을 생성한다.
특정 실시예들에서, 여기에 설명되는 TLR 작용제(예를 들어, TLR-3 작용제)는 SARS-CoV-2 단백질을 인코드하는 동일한 발현 벡터 내에 동시에 전달될 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 TLR 작용제(예를 들어, TLR-3 작용제)는 SARS-CoV-2 단백질을 인코드하는 발현 벡터와 별도로(즉, 시간적으로나 공간적으로) 전달될 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 TLR-3 작용제가 상기 발현 벡터와 별도로 전달될 때, 상기 TLR-3 작용제(예를 들어, 발현된 dsRNA)를 인코딩하는 핵산 및 상기SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터는 동일한 제형으로 동시에 투여될 수 있다. 다른 경우들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키메라 아데노바이러스 벡터는 다른 제형들로 투여될 수 있다. 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터가 다른 제형들로 투여될 때, 이들의 투여는 동시 또는 순차적이 될 수 있다. 예를 들면, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산이 먼저 투여될 수 있고, 이후에 상기 키메라 아데노바이러스 벡터가 투여될 수 있다(예를 들어, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 2일, 4일, 6일, 8일, 또는 10일 이후). 선택적으로는, 상기 아데노바이러스 벡터가 먼저 투여될 수 있고, 이후에 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산이 투여될 수 있다(예를 들어, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 2일, 4일, 6일, 8일, 또는 10일 이후). 일부 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 다른 프로모터들의 제어 하에 있을 수 있다.
IV. 약학 조성물들 및 투여의 루트들
면역원성 약학 조성물은 여기에 설명되는 키메라 아데노바이러스 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier)를 포함할 수 있다. 적합한 운반체들은, 예를 들면, 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스, 완충액, 만니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 전분(starch), 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 사카린 나트륨(sodium saccharine), 활석(talcum), 셀룰로오스(cellulose), 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose) 및 탄산마그네슘(magnesium carbonate)과 같은 고체 운반체, 또는 생분해성 미소 구체들(예를 들어, 폴리아크릴레이트(polylactate), 폴리클리콜레이트(polyglycolate))를 포함한다. 적합한 생분해성 미소 구체들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호, 미국 특허 제5,075,109호, 미국 특허 제5,928,647호, 미국 특허 제5,811,128호 및 미국 특허 제5,820,883호에 개시되어 있다. 상기 면역원성 폴리펩티드 및/또는 운반체 발현 벡터는 상기 생분해성 미소 구체들로 둘러싸일 수 있거나, 상기 미소 구체들의 표면과 연관될 수 있다.
면역원성 약학 조성물 내의 성분들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 상기 면역원성 약학 조성물의 투여의 루트, 약물 방출의 시각표 및/또는 지속, 그리고 표적 전달 부위와 같은 인자들과 밀접하게 연관된다. 일부 실시예들에서, 지연 방출형 코팅 또는 제형의 추가적인 코팅은 기술적인 이유들이나 상기 약물 방출의 크로노그래프 제어를 위해 내강 조건들에 민감하지 않은 다른 막-형성 폴리머들을 포함할 수 있다. 이러한 목적들을 위해 사용되는 물질들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 단독으로나 혼합물들로 사용되는 당, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피르롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐아세테이트(polyvinyl acetate), 하이드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 에틸셀룰로오스(ethylcellulose), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(carboxymethylcellulose sodium) 또는 다른 것들을 포함한다.
분산제들, 착색제들, 색소들, 추가적인 폴리머들, 예를 들어, 폴리(poly)(에틸아크릴레이트(ethylacrylate), 메틸메타클리레이트(methylmethacrylate)), 항-고정제들 및 항-발포제들과 같은 첨가제들이 상기 코팅 층 내로 포함될 수 있다. 다른 화합물들이 막 두께를 증가시키고, 코어 물질 내로의 산성의 위액의 확산을 감소시키도록 추가될 수 있다. 또한, 상기 코팅 층들은 원하는 기계적 성질들을 얻기 위해 약학적으로 허용 가능한 가소제들을 포함할 수 있다. 이러한 가소제들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 트리아세틴(triacetin), 시트르산 에스테르(citric acid ester)들, 프탈산 에스테르(phthalic acid ester)들, 디부틸 세바케이트(dibutyl sebacate), 세틸알코올(cetyl alcohol), 폴리에틸렌글리콜들, 글리세롤 모노에스테르(glycerol monoester)들, 폴리소르베이트(polysorbate)들, 또는 다른 가소제들 및 이들의 혼합물들이다. 상기 가소제의 양은 각 제형들에 대해 선택된 폴리머(들), 선택된 가소제(들) 및 상기 폴리머(들)의 적용된 양들과 관련하여 최적화될 수 있다.
또한, 이러한 면역원성 약학 조성물들은 비-면역원성 완충액들(예를 들어, 중성의 완충 식염수 또는 인산 완충 식염수), 탄수화물들(예를 들어, 글루코오스, 만노오스(mannose), 수크로오스 또는 덱스트란(dextran)들), 만니톨, 단백질들, 폴리펩티드들이나 글리신과 같은 아미노산들, 항산화제들, 정균제(bacteriostat)들, EDTA 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 킬레이트제(chelating agent)들, 보조제들(예를 들어, 수산화알루미늄), 서스펜션화제(suspending agent)들, 증점 안정제(thickening agent)들 및/또는 방부제들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 조성물들은 동결 건조로 조제될 수 있다. 또한, 화합물들은 잘 알려진 기술을 이용하여 리포솜들 내에 캡슐화될 수 있다.
또한, 약학 조성물들은 투여된 면역원성 생물학적 제제가 원하는 장소에 도달하도록 위의 분해에 대해 보호되게 제조될 수 있다. 경구 전달을 위한 DNA 및 약물들의 미세 캡슐화를 위한 방법들은, 예를 들어, 미국 공개 특허 제2004/043952호에 기재되어 있다. 경구 환경에 대해, 이들 중의 몇몇은 유드라지트(Eudragit) 및 타임클록(TimeClock) 방출 시스템들뿐만 아니라 아데노바이러스에 대해 특별하게 설계된 다른 방법들을 포함하여 이들 중의 몇몇이 이용될 수 있다(Lubeck 등의 "Proc Natl Acad Sci USA"(86(17), 6763-6767(1989)); Chourasia 및 Jain, J의 "Pharm Pharm Sci"(6(1), 33-66(2003))). 일부 실시예들에서, 상기 유드라지트 시스템은 상기 키메라 아데노바이러스 벡터를 보다 하부의 소장으로 전달하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물은 정제 또는 캡슐의 형태, 예를 들어, 장용 코팅에 의해 덮인 압축 정제의 형태로 된다. 일부 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물은 젤라틴, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 전분, 또는 풀루란(pullulan)을 포함하는 폴리머 캡슐 내에 캡슐화된다. 일부 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물은 2㎜ 보다 작은 직경의 미소 입자들의 형태로 되며, 예를 들어, 각 미소 입자들은 여기에 설명되는 바와 같은 장용 코팅으로 덮인다. 특정 실시예들에서, 상기 정제, 캡슐 또는 미소 입자의 형태인 면역원성 조성물은 경구로 투여될 수 있다. 일부 실시예들에서, 부위-특이적 전달이 외부에서 발생되는 신호에 따라 정제들 또는 캡슐들을 통해 구현될 수 있다. 조기 모델들은 Digenis 등의 "Pharm. Sci. Tech. Today"(1: 160(1998))에 개시되어 있는 바와 같이 고주파(HF) 신호에 대해 방출되었다. 그 이후에 초기 HF 캡슐 개념은 업데이트되었고, 결과로 인텔리사이트(InteliSite)®로 시판되었다. 업데이트된 캡슐은 무선 주파수 활성의 비-분해형 전달 시스템이다. 캡슐의 방사성 표지화(radio-labeling)는 감마 섬광조영(gamma scintigraphy)을 통해 GI 관의 특이적 영역 내의 상기 캡슐의 위치를 결정하게 한다. 상기 캡슐이 상기 GI 관내의 원하는 장소에 도달될 때, 외부 활성화가 상기 캡슐 약물 저장소의 일련의 윈도우들을 개방시킨다.
일부 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물은 무전 조정 캡슐 내에 둘러싸일 수 있으며, 상기 캡슐은 추적되고, 상기 전달 부위에 도달되면 신호가 인가된다. 일부 실시예들에서, 상기 캡슐은 검출을 하거나 하지 않고 상기 전달 부위에 도착한 것으로 예상될 때에 대응되는 정해진 시간에 상기 캡슐에 신호가 전달된다.
여기에 설명되는 조성물들은 서방형(sustained-release) 제제(즉, 투여에 후속하여 화합물의 느린 방출에 영향을 미치는 캡슐 또는 스펀지와 같은 제제)의 일부로 투여될 수 있다. 이러한 제형들은 대체로 잘 알려진 기술을 이용하제 제조될 수 있다(예를 들어, Coombes 등의 "Vaccine"(14: 1429-1438(1996) 참조). 서방형 제제들은 운반체 기질 내에 분산되거나 및/또는 속도 조절 막에 의해 둘러싸인 저장소 내에 함유되는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체를 포함할 수 있다.
이러한 제제들 내에 사용도기 위한 운반체들은 생체 적합성이고, 생분해성도 될 수 있으며, 바람직하게는 상기 제제는 상대적으로 일정한 레벨의 활성 구성 성분 방출을 제공한다. 이러한 운반체들은 폴리(poly)(락티드(lactide)-코(co)-글리콜리드(glycolide))뿐만 아니라 폴리아크릴레이트, 라텍스(latex), 전분, 셀룰로오스 및 덱스트란의 미소 입자들을 포함한다. 다른 지연 방출형 운반체들은 초거대분자 바이오벡터들을 포함하며, 이들은 비-액상 친수성 코어(예를 들어, 교차 결합된 다당류 또는 올리고당류)를 포함하고, 선택적으로 양친매성 화합물을 포한하는 외부 층을 포함한다(예를 들어, 국제 공개 특허 WO94/20078; 국제 공개 특허 WO94/23701; 및 국제 공개 특허 WO 96/06638 참조). 상기 서방형 제제 내에 포함되는 활성 화합물의 양은 이식의 부위, 방출의 속도 및 예상되는 지속, 그리고 치료되거나 방지되는 상태의 특성에 의존한다.
일부 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물들은 밀봉된 엠들(ampoule)들이나 바이알(vial)들과 같은 단일 도스 또는 다중 도스 용기들 내에 제시된다. 이러한 용기들은 바람직하게는 사용될 때까지 상기 제제의 멸균을 보존하기 위해 완전하게 밀폐된다. 대체로, 제형들은 지성 또는 수성 매체들 내에 서스펜션들, 용액들, 또는 에멀션들로 저장될 수 있다. 선택적으로, 면역원성 조성물은 사용 직전에 살균 액상 운반체의 첨가만을 요구하는 냉동-건조된 상태로 저장될 수 있다.
표적 전달을 위한 조성물들
표적 전달의 일부 실시예들에서, 장용 코팅들이 위장의 낮은 pH 환경으로부터 물질들을 차단하고, 이후에 소화관 내의 원하는 표적에 도달될 때까지 동반된 물질의 방출을 지연시키기 위해 사용된다. 장용 코팅들은 알려져 있으며, 상업적으로 입수 가능하다. 예들은 pH-민감성 폴리머들, 생분해성 폴리머들, 히드로겔(hydrogel)들, 지속 방출 시스템들 및 삼투 전달 시스템들을 포함한다(예를 들어, Chourasia 및 Jain의 "J. Pharm. Pharmaceutical Sci."(6: 33(2003) 참조).
일부 실시예들에서, 상기 표적 전달 부위는 회장이다. 위장관(GIT)의 pH는 위장 내의 강한 산성(pH ~2)으로부터 상기 회장 내의 보다 중성(pH ~5.8-7.0)까지 진행된다. pH 민감성 코팅들은 상기 회장 내에서나 상기 회장 직전에 용해되도록 사용될 수 있다. 예들은 유드라지트® L 및 S 폴리머들(5.5-7.0의 범위의 한계 pH); 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(polyvinyl acetate phthalate)(pH 5.0), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 50 및 55(각기 pH 5.2 및 5.4), 그리고 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(pH 5.0)를 포함한다. Thakral 등은 "Expert Opin. Drug Deliv."(10: 131(2013))에서 회장 전달을 위한 유드라지트® 제형들, 특히 pH≤7.0에서 전달을 보장하는 L 및 S의 결합들을 검토하였다. Crotts 등의 "Eur. J Pharm. Biol."(51: 71(2001))에는 적절한 분해 성질들을 가지는 유드라지트® 제형들이 기재되어 있다. Vijay 등은 "J. Mater. Sci. Mater. Med."(21: 2583(2010))에서 pH 6.8에서의 회장 전달을 위한 아크릴산(AA)-메틸 메타크릴레이트(MMA)계 폴리머들을 검토하였다.
회장 전달을 위해, 폴리머 코팅은 통상적으로 약 pH 6.8에서 용해되며, 약 40분 이내에 완전하게 방출되게 한다(예를 들어, Huyghebaert 등의 "Int. J. Pharm."(298: 26(2005)) 참조). 이를 구현하기 위해, 치료 물질은 다른 코팅들의 층들로 덮일 수 있으며, 예를 들어, 가장 외측의 층이 낮은 pH 상태들에 걸쳐 상기 물질을 보호하고, 정제가 위장을 나갈 때에 용해되며, 상기 정제가 증가되는 pH을 지나가면서 적어도 하나의 내부 층이 용해된다. 원위 회장에 대한 전달을 위한 계층화 코팅들의 예들은, 예를 들어, 국제 공개특허 공보 WO 2015/127278, 국제 공개특허 공보 WO 2016/200951 및 국제 공개특허 공보 WO 2013/148258에 기재되어 있다.
생분해성 폴리머들(예를 들어, 펙틴(pectin), 아조(azo) 폴리머들)은 통상적으로 상기 GIT 내의 미생물장의 효소 활성에 의존한다. 회장에는 락토바실러스(lactobacillus)들 및 엔테로박테리아(enterobacteria)를 포함하여 이전의 단계들 보다 많은 숫자들의 박테리아가 머무른다.
삼투-제어 방출 경구 전달 시스템들(오로스(OROS)®; 알자(Alza))은 수성 상태들에서 시간에 걸쳐 분해되는 삼투 시스템의 예이다. 이러한 물질들은 상기 회장에 특별히 전달되도록 다른 코팅들 또는 변화되는 두께들로 조작될 수 있다(예를 들어, Conley 등의 "Curr. Med. Res. Opin."(22: 1879(2006) 참조).
상기 회장에 대한 전달을 위한 결합 폴리머들은 국제 공개특허 공보 WO 2000/062820에 보고되어 있다. 예들은 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate)(2.4㎎/캡슐)를 포함하는 유드라지트® L100-55(25㎎/캡슐) 및 유드라지트® FS30D(30㎎/정제)가 수반되는 포비돈(Povidone) K-25(20㎎/정제)를 포함한다. pH 민감성 폴리머들이 상기 회장에 대한 효과적인 전달을 위해 적용될 수 있으며, 상술한 바와 같이, 예를 들어, 메타크릴산 코폴리머들(예를 들어, 폴리(메타크릴산-코-메틸메타크릴레이트) 1:1), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트, 카르복시메틸 에틸셀룰로오스, 셸락 또는 다른 적합한 폴리머(들)를 포함한다. 또한, 상기 코팅 층은 pH 보다 박테리아 분해와 같은 다른 관강 내의 구성 성분들에 민감한 막-형성 폴리머들, 또는 다른 막-형성 폴리머와 혼합될 때에 이와 같은 민감성을 가지는 구성 성분으로 이루어질 수 있다. 상기 회장에 대한 지연된 방출을 제공하는 이러한 구성 성분들의 예들은 아조 결합(들), 펙틴 및 이의 염들과 같은 다당류들, 갈락토만난(galactomannan)들, 아밀로오스(amylose) 및 콘드로이틴(chondroitin), 이황화물 폴리머들 그리고 글리코시드들을 포함하는 폴리머들이다.
변화되는 pH, 물 및 효소 민감성들을 가지는 구성 성분들이 상기 회장에 대해 치료 조성물을 표적화하도록 결합되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 코팅의 두께는 방출을 제어하도록 이용될 수 있다. 또한, 상기 구성 성분들은 상기 치료 조성물이 매립되는 기질을 형성하는 데 사용될 수 있다. 대체로 "Frontiers in Drug Design & Discovery"(Bentham Science Pub. 2009) 제4호를 참조하기 바란다.
보조제
본 발명의 일부 실시예들에서, 상기 키메라 아데노바이러스 벡터 내에 인코드되는 상기 TLR 작용제(예를 들어, TLR-3 작용제) 이외에도, 상기 조성물들은 추가적인 보조제들을 더 포함할 수 있다. 적합한 보조제들은, 예를 들면, 지질들 및 비-지질 화합물들, 콜레라 독소(CT), CT 서브유닛 B, CT 유도체 CTK63, E. 콜리 이열성 독소(LT), LT 유도체 LTK63, Al(OH)3, 그리고 예를 들어, 국제 공개특허 공보 WO 04/020592, Anderson 및 Crowle의 "Infect. Immun."(31(1): 413-418(1981)), Roterman 등의 "J. Physiol. Pharmacol."(44(3): 213-32 (1993), Arora 및 Crowle의 "J. Reticuloendothel"(24(3): 271-86(1978)) 및 Crowle와 May의 "Infect. Immun."(38(3): 932-7(1982))에 기재되어 있는 바와 같은 다이온성 유기산들을 포함한다. 적합한 다이온성 유기산들은, 예를 들면, 6,6'-[3,3'-디메틸(demithyl)[1,1'-비페닐(biphenyl)]-4,4'-디일(diyl)]비스(bis)(아조(azo))비스(bis)[4-아미노(amino)-5-하이드록시(hydroxy)-1,3-나프탈렌(naphthalene)-디술폰산(disulfonic acid)](에반스 블루(Evans Blue)) 및 3,3'-[1,1'-비페닐(biphenyl)]-4,4'-디일비스(diylbis)(아조(azo))비스(bis)[4-아미노(amino)-1-나프탈렌술폰산(naphthalenesulfonic acid)](콩고 레드(Congo Red))을 포함한다. 해당 기술 분야의 숙련자는 상기 다이온성 유기산들이 임의의 유형의 투여와 함께 임의의 유전학적 예방접종 방법을 위해 이용될 수 있는 점을 이해할 것이다.
다른 적합한 보조제들은 이미퀴모드(imiquimod) 및 레시퀴모드(resiquimod)와 같은 이미다조퀴놀린(imidazoquinoline) 패밀리의 구성원들과 같은 국소 면?? 조절제(immunomodulator)들을 포함한다(예를 들어, Hengge 등의 "Lancet Infect. Dis."(1(3): 189-98(2001) 참조).
추가적인 적합한 보조제들은, 예를 들면, 추가적인 알룸(alum)계 보조제들(예를 들어, 알히드로겔(Alhydrogel), 레히드라겔(Rehydragel), 인산알루미늄, 알감물린(Algammulin)); 지성계 보조제들(프리운드 불완전 및 완전 보조제(디프코 라보라토리즈(Difco Laboratories), 디트로이트시, 미시간주), 스페콜(Specol), RIBI, 티터맥스(TiterMax), 몬타니드(Montanide) ISA50 또는 셉픽 몬타니드(Seppic MONTANIDE) ISA 720); 비이온성 블록 공중합체계 보조제들, 시토카인들(예를 들어, GM-CSF 또는 Flat3-리간드); 메르크 아주반트(Merck Adjuvant) 65(메르크사(Merck Company, Inc.), 라웨이시, 뉴저지주); AS-2(스미스클린 베컴(SmithKline Beecham), 필라델피아시, 펜실바니아주); 칼슘, 철 또는 아연의 염들; 아크릴화 티로신(acylated tyrosine)의 불용성 서스펜션; 아크릴화 당류; 양이온이나 음이온으로 유도된 다당류들; 폴리포스파젠(polyphosphazene)들; 생분해성 미소 구체들; 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A 및 퀼 A로서 상업적으로 입수할 수 있다. GM-CSF 또는 인터류킨(interleukin)-2, 인터류킨-7, 또는 인터류킨-12와 같은 시토카인들도 적합한 보조제들이다. 헤모시아닌(hemocyanin)들(예를 들어, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌) 및 헤모에리트린(hemoerythrin)들도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, 키틴, 키토산 및 탈아세틸화 키틴과 같은 다당류 보조제들도 보조제들로서 적합할 수 있다. 다른 적합한 보조제들은 무라밀 디펩티드(MDP, N 아세틸무라닐 L 알라닐 D 이소클루타민) 박테리아 펩티도글리칸들 및 이들의 유도체들(예를 들어, 트레오닐-MDP 및 MTPPE)을 포함한다. BCG 및 BCG 세포벽 골격(CWS)도 트레할로스디미콜레이트(trehalose dimycolate)가 있거나 없이 본 발명에서 보조제들로 사용될 수 있다. 트레할로스디미콜레이트는 자체적으로 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,579,945호 참조). 독성이 제거된 내독소들도 단독으로나 다른 보조제들과 결합하여 보조제들로서 유용하다(예를 들어, 미국 특허 제4,866,034호; 미국 특허 제4,435,386호; 미국 특허 제4,505,899호; 미국 특허 제4,436,727호; 미국 특허 제4,436,728호; 미국 특허 제4,505,900호; 및 미국 특허 제4,520,019호). 사포닌(saponin) QS21, 사포닌 QS17, 사포닌 QS7 등도 유용한 보조제들이다(예를 들어, 미국 특허 제5,057,540호; 유럽(EP) 특허 제0362279호; 국제 공개특허 공보 WO96/33739; 및 국제 공개특허 공보 WO 96/11711). 다른 적합한 보조제들은 몬타니드 ISA 720(셉픽(Seppic), 프랑스), SAF(키론(Chiron), 캘리포니아주, 미국), ISCOMS(CSL), MF-59(키론), SBAS 계열의 보조제들(예를 들어, 벨기에의 릭센사르트의 스미스클린 베컴사로부터 입수할 수 있는 SBAS-2, SBAS-4, SBAS-6, 또는 이들의 변이체들), 데톡스(Detox)(코릭사(Corixa), 해밀턴, 몬테나주), 그리고 RC-529(코릭사, 해밀턴, 몬테나주)을 포함한다.
여기에 제공되는 약학 조성물들 내에서, 상기 보조제 조성물은, 예를 들어, 상기 Th1형 또는 Th2형이 우세한 면역 반응을 유도하도록 설계될 수 있다. Th1형 시토카인들(예를 들어, IFN-감마, TNF-알파, IL-2 및 IL-12)의 높은 레벨들은 투여되는 항원에 대한 세포 매개 면역 반응들의 유도를 선호하는 경향이 있다. 이에 비하여, Th2형 시토카인들(예를 들어, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)의 높은 레벨들은 체액 면역 반응들의 유도를 선호하는 경향이 있다. 여기에 제공되는 바와 같은 면역원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 경구 전달에 후속하여, Th1형 및 Th2형 반응들을 유도하는 면역 반응이 통상적으로 유도될 것이다.
투여의 루트들
상기 키메라 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 임의의 비경구가 아닌 루트로(예를 들면, 질, 폐, 침샘들, 비강들, 소장, 결장, 직장, 편도선들, 또는 페이어판(Peyer's patch)들을 통해 예를 들어, 경구로, 비강 내로, 또는 점막으로) 투여될 수 있다. 상기 조성물은 단독으로 또는 여기에 설명되는 바와 같은 보조제와 함께 투여될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물은 정제 또는 캡슐의 형태로 경구로 투여된다. 또 다른 실시예들에서, 상기 면역원성 조성물은 정제 또는 캡슐의 형태로 상기 회장 내의 표적 전달을 위해 경구로 투여된다.
V. 치료적 사용
본 발명의 일 측면은 대상 내에서 SARS-CoV-2 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO: 10의 서열을 가지는 SARS-CoV-2 단백질)을 향한 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위해 여기에 설명되는 면역원성 조성물들을 사용하는 과정을 수반한다. 일부 실시예들에서, 상기 면역 반응은 대상의 폐포 세포, 흡수성 장세포들, 섬모 세포, 배상 세포, 곤봉체 세포들 및/또는 기도 기저 세포 내에 유도된다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "대상"은, 예를 들면, 설치류, 고양이과, 개과 또는 영장류와 같은 임의의 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 상기 면역원성 조성물들은 질병을 방지하기 위해 상기 대상에서 COVID-19가 진전되기 전에 사용될 수 있다. 상기 질병은 종래 기술 분야에서 일반적으로 승인된 기준을 이용하여 진단될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 감염은 상기 대상으로부터의 생리학적 샘플(예를 들어, 비강 면봉 또는 점막 샘플)에서 바이러스 역가의 측정에 의해 진단될 수 있다.
실험예들에서 나타난 바와 같이, 여기에 설명되는 백신들은 CD4+ 및 CD8+ T-세포 면역 반응을 유발하는 데 특히 효과적이 될 수 있다. 일부 실시예들에서, 이러한 상당인 T-세포 반응, 예를 들어, CD8+ T 세포 반응은 제2 항원 단백질(이러한 예에서는 SARS-CoV-2 S 단백질이었지만, 다른 SARS-CoV-2 단백질, 또는 다음에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 비-SARS-CoV-2 단백질이 될 수도 있음)에 대한 CD8+ T-세포 반응을 포함하여 T 세포 반응을 자극하도록 작용하는 상기 SARS-CoV-2 N 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 이의 실질적으로 동일한 변이체들)의 존재에서 유발될 수 있다. 이에 따라, 일부 실시예들에서, SARS-CoV-2 N 단백질뿐만 아니라 제2 항원 단백질의 발현을 가져오는 여기에 설명되는 바와 같은 백신은 대상에서, 예를 들어, 인간 대상에서 CD8+ T-세포 반응을 포함하는 면역 반응을 촉발시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 인간 대상은 항체계 면역 반응을 진전시키는 적은 능력을 가지거나, 이와 다르게 CD8+ T-세포 면역 반응으로부터 유익할 수 있는 대상이다. 예시적인 대상들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 적어도 50세, 적어도 60세 또는 적어도 70세, 또는 항체 결핍 질환이 있는 노인들을 포함하며(예를 들어, 이의 설명에 대해서는 Angel A. Justiz Vaillant, Kamleshun Ramphul의 "ANTIBODY DEFICIENCY DISORER"(Treasure Island(FL): StatPearls Publishing; 2020) 참조), 이에 한정되는 것은 아니지만, X-연계 무감마글로불린혈증(agammaglobulinemia)(브루턴병(Bruton disease)), 신생아의 일시성 저감마글로불린혈증(hypogammaglobulinemia), 선택적 Ig 면역결핍들, 예를 들면, IgA 선택적 결핍, 과도 IgM 증후군 및 공통 가변성 면역결핍 질환이 있는 대상들을 포함한다.
면역치료는 통상적으로 치료가, 예를 들어, 바이러스 감염된 세포들에 대해 여기에 설명되는 키메라 아데노바이러스 벡터들을 포함하는 면역원성 조성물의 투여와 반응하도록 내생 숙주 면역체계의 생체 내의 자극에 의존하는 능동 면역치료이다.
여기에 설명되는 면역원성 조성물의 투여의 빈도뿐만 아니라 용량은 개인들 사이에서 변화될 것이며, 표준 기술들을 이용하여 쉽게 확립될 수 있다. 일부 실시예들에서, 1 내지 10(예를 들어, 2 내지 10, 3 내지 10, 4 내지 10, 5 내지 10, 6 내지 10, 7 내지 10, 8 내지 10, 9 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1, 그리고 2)의 도스들이 52주의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 일부 실시예들에서, 2 또는 3의 도스들이 1개월의 간격으로 투여되거나, 예를 들면, 2-3의 도스들이 매 2개월-3개월에 투여된다. 상기 간격들은 특정 치료들을 위해 일 년에 한 번으로 가능하다. 추가(booster) 예방접종이 이후에 주기적으로 이루어질 수 있다.
적합한 도스는, 예를 들면, 앞서 설명한 바와 같이 투여될 때에 항-바이러스 면역 반응을 증진시킬 수 있고, 기저(즉, 치료되지 않은) 레벨의 적어도 10%-50% 위인 화합물의 양이다. 이러한 반응은 환자에서 항-바이러스 항체들을 측정하거나, 예를 들어, 생체 외에서 환자들의 바이러스 감염된 세포들을 사멸시킬 수 있는 세포용해 T 세포들의 백신 의존형 발생에 의해 모니터될 수 있다. 또한, 면역원성 반응들은 상기 면역원성 폴리펩티드들 및 면역원성 폴리펩티드들에 대해 특이적인 체액 내의 항체들 사이에 형성되는 면역 복합체들을 검출하여 측정될 수 있다. 치료의 개시 이전 및 이후의 개인으로부터 취해진 체액의 샘플들이 상기 면역 복합체들에 대해 분석될 수 있다. 요약하면, 두 샘플들 내에서 검출된 면역 복합체들의 숫자가 비교될 수 있다. 제1 샘플(치료전)에 대한 제2 샘플(치료후 개시) 내의 상기 면역 복합체들의 숫자의 실질적인 변화는 성공적인 치료를 반영한다. 또한, 이러한 백신들은 예방 접종되지 않은 환자들에 비하여 예방 접종된 환자들에서 COVID-19 질병의 방지를 가져오는 면역 반응을 야기할 수 있어야 한다.
예시적인 용량들은 감염 단위(I.U.)로 측정될 수 있다. 복제-결손 재조합 Ad5 벡터는 I.U. 단위들을 이용하여 적정되고 정량화될 수 있다. 이는 복제-결손 Ad5의 성장을 가능하게 하는 유착 인간 배아 신장(HEK) 293 세포주에서 IU 분석의 수행을 통해 구현된다. HEK293 세포들은 24-웰 살균 조직 배양 플레이트 상에 둘러지며, 부착되게 두어진다. 바이러스 물질은 후속되는 10-폴드(fold) 희석들로 희석되며, 적절한 숫자의 복제들, 통상적으로 이중 또는 삼중으로 둘러진 HEK293 세포들의 개개의 웰들에 감염된다. 감염은 ~40시간-42시간 동안 37℃의 5%의 CO2에서의 배양을 통해 진행되게 두어진다. 세포들은 이후에 침투성이 가능하도록 메탄올로 고정되고, 세척되며, 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 완충 용액으로 차단된다. 세포들은 이후에 Ad5 헥손 표면 단백질에 대해 토끼 유래의 일차 항체로 배양되고, 세척되며, HRP-접합 항-토끼 이차 항체에 대해 조사된다. 감염된 세포들은 이후에 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(diaminobenzidine tetrahydrochloride: DAB) 및 과산화수소로의 배양을 거쳐 염색된다. 감염된 세포들은 위상 대비 현미경 관찰법을 이용하여 가시화되고, 희석이 구분되는 개별적인 감염 사례들을 나타내도록 선택된다. 이들은 감염되지 않은 세포들의 반투명한 단일 층에 대해 매우 잘 보일 수 있는 어둡게 염색되는 세포들로서 가시화될 수 있다. 전체 감염된 세포들은 적절한 희석의 적어도 열의 가시 범위들 내의 가시 범위마다 계수된다. 바이러스 역가는 사용된 대물렌즈/접안렌즈 배율에 대한 가시 범위들의 전체 숫자와 함께 이들 계수들의 평균적인 숫자를 이용하고, 상기 계수들 내에 이용된 희석 인자를 곱하여 계산될 수 있다.
일부 실시예들에서, 투여되는 백신들은 107-1011 I.U., 예를 들어, 108-1011 I.U., 109-1011 I.U., 5 x 109-5 x 1010 I.U.의 용량을 가질 수 있다. 적합한 도스 사이즈들은 환자의 사이즈와 함께 변화될 것이지만, 주사되는 백신에 대해 약 0.01㎖로부터 약 10㎖까지, 보다 통상적으로는 약 0.025㎖으로부터 약 7.5㎖까지, 가장 보다 통상적으로는 약 0.05㎖로부터 약 5㎖까지의 범위가 될 것이다. 정제 또는 캡슐 최종 제품을 위해, 상기 사이즈는 10㎎ 내지 1000㎎, 보다 통상적으로는 100㎎-400㎎가 될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자는 상기 도스 사이즈가 치료되는 특정한 환자 또는 특정한 질병이나 장애에 기초하여 조정될 수 있는 점을 이해할 것이다.
실험예들
다음의 실험예들은 예시적으로 의도된 예들이며, 본 발명이 이들에 제한되는 것은 아니다.
실험예 1: 재조합 아데노바이러스 구조체들의 생성
SARS-CoV-2 감염을 방지하기 위한 몇몇의 다른 재조합 아데노바이러스(rAd) 구조체들이 다른 항원들이 이용되었던 점을 제외하면 미리 임상적으로 평가되었던 동일한 벡터 플랫폼을 이용하여 개발되었다(14, 15). 몇몇의 rAd SARS-CoV-2 백신들은 표준 방법들에 의해 생성되었다(예를 들어, He 등에 기재된 바와 같이(50)).
셋의 백신 구조체들이 젠뱅크 수탁 번호 MN908947.3호로서 공개적으로 입수 가능한 SARS-CoV-2의 공개된 DNA 서열을 기초로 하여 형성되었다. 상세하게는, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질(또는 표면 당단백질; 다음의 SEQ 1) 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질(또는 뉴클레오캡시드 인단백질; 다음의 SEQ 2)의 공개된 아미노산 서열들이 호모 사피엔스(Homo sapiens) 세포들 내의 발현을 위해 최적화된 핵산 서열 코돈을 합성하는 데 이용되었다. 상기 SARS-CoV-2 S 유전자 및 SARS-CoV-2 N 유전자에 대한 코돈 최적화 핵산 서열들은 각기 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4에 나타난다. 이들 서열들은 아데노바이러스 5형(pAd)의 E1 부위로 복제되는 전이 유전자들을 포함하는 재조합 플라스미드들을 생성하는 데 이용되었다.
둘의 재조합 pAd 플라스미드들이 SARS-CoV-2의 서열들로부터 구조화되었다.
1. ED81.4.1: pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-CMV-dsRNA-SPA. CMV 프로모터의 제어 하의 SEQ ID NO: 3을 포함하는 재조합 Ad5 벡터.
2. ED84A6.4.1: pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-bActin-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA. 상기 CMV 프로모터 제어 하의 SEQ ID NO: 3 및 베타-액틴 프로모터 제어 하의 SEQ ID NO: 4을 포함하는 재조합 Ad5 벡터. dsRNA 보조제가 수반되는 상기 SPA를 통한 최초 CMV 프로모터로부터의 전체 전이 유전자 카세트의 서열은 SEQ ID NO: 6로서 포함된다. 이러한 전이 유전자 구조체를 포함하는 전체 재조합 아데노바이러스 게놈의 서열은 SEQ ID NO: 9로서 포함된다.
또한, 제3 pAd 플라스미드가 상기 SARS-CoV-2 S 유전자(S1 및 S2 사이의 자연 푸린 부위를 포함)의 S1 부위와 전체 길이의 SARS-CoV-2 N 유전자를 결합하는 융합 서열(SEQ ID NO: 5)을 이용하여 구조화되었다.
3. ST05.1.3.3: pAd-CMV-SARS-CoV-2-S1-푸린(furin)-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA. 상기 CMV 프로모터의 제어 하의 SEQ ID NO: 5를 포함하는 재조합 Ad5 벡터. 상기 dsRNA 보조제가 수반되는 상기 SPA를 통한 초기 CMV 프로모터로부터의 전체 전이 유전자 카세트의 서열은 SEQ ID NO: 7로서 포함된다. 이러한 전이 유전자 구조체를 포함하는 전체 재조합 아데노바이러스 게놈의 서열은 SEQ ID NO: 9로서 포함된다.
서열들은 제한 부위들(예를 들어, Sthl 및 Sgfl)을 이용하여 셔틀(shuttle) 플라스미드내로 복제되었다. 상기 셔틀 플라스미드는 상기 E1 유전자(pAd)가 결실된 아데노바이러스 5형의 전체 서열을 포함하는 플라스미드(pAd) 상으로 전이 유전자들을 잠그는 데 이용되었다. 상기 pAd 플라스미드는 재조합 아데노바이러스의 복제 및 정제가 백신들 내에서 API로 이용될 수 있도록 전이로 E1 유전자 생성물을 제공하는 인간 세포들에 세포 감염되었다.
실험예 2: 항원 단백질들의 발현
셋의 다른 후보 물질들이 세포내 염색/흐름 세포측정법에 의해 발현에 대해 평가되었다. HEK293 세포들은 24-웰 플레이트 내에 3e5의 세포들/웰로 조직 배양되게 두어졌다. 4시간 후에, 상기 세포들은 1의 MOI에서 다양한 구조체들로 감염되었다. 세포들은 40시간 이후에 수확되었고, 상기 S1 또는 N 단백질들(젠스트립트(Genscript))을 인식하는 인간 단일 클론 항체들이 별도의 웰들을 염색하는 데 이용되었다. 항-인간 IgG PE 이차 항체가 고정된 세포들에 대한 발현을 시각화하도록 이용되었다. 상기 N 단백질은 아니었지만 전체 길이의 SARS-CoV-2 S 단백질을 발현시켰던 후보 물질(rAd-S; 앞서 설명한 플라스미드 pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-CMV-dsRNA-SPA)은 이러한 발현 패턴들을 분명하게 보여주었다. S1-N의 융합 단백질을 발현시켰던 후보 물질(rAd-S1-N; 앞서 설명한 바와 같은 플라스미드 pAd-CMV-SARS-CoV-2-S1-Furin-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA)은 별도의 프로모터들로부터 S 및 N을 발현시켰던 상기 후보 물질(rAd-S-N; 앞서 설명한 바와 같은 플라스미드 pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-bActin-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA)의 경우와 같이 S 및 N 단백질들 모두를 발현시켰다(도 1).
실험예 3: 마우스들에서 면역원성
초기 마우스 면역원성 연구들의 일차적인 목적은 어떤 rAd 벡터들이 상당한 항체 반응들을 유도하였던 지를 결정하는 것이었다. 결과들은 어느 후보 백신이 GMP 제조를 위해 선택될 수 있었던 지를 결정하는 데 이용되었다. 동물들은 i.n.(N=6)으로 면역되었고, 항체 역가들이 시간에 걸쳐 측정되었다. 별도의 프로모터들로부터 벗어나 S 및 N 모두를 발현시키는 상기 rAd 벡터(상술한 바와 같은 플라스미드 pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-bActin-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA)는 SARS-CoV-2로부터의 S 단백질의 S1 구성 성분과 동등한 역가들을 생성하였다. 상기 rAd-S-N 벡터는 rAd-S1-N을 발현시키는 융합 단백질보다 약간 높은 S1 항체 반응들을 가졌다(도 2).
선택된 백신 rAd-S-N의 도스 반응이 이후에 면역원성을 테스트하기 위해 수행되었다. 셋의 다른 도스 레벨들이 테스트되었고, 항체 반응들인 S1 및 S2 모두가 중규모 장치(mesoscale device)를 이용하여 측정되었다. 유사한 반응들이 이른 시점들에서 모두 셋의 도스 레벨들에 나타났지만, 보다 높은 도스의 그룹들은 이후의 시점들에서 향상된 항체 반응들을 가졌다(도 3a 및 도 3b).
실험예 4: 인간들에서의 면역원성
상기 rAd-S-N 플라스미드(상술한 바와 같은 pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-bActin-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA)가 GMP 설비에서 제조되고, 건조되며, 정제들 내에 위치된다. 사람 임상 시험으로 다른 도스 레벨들에서 사람들에게 면역 반응들을 유도하는 상기 rAd-S-N의 능력을 평가된다.
실험예 5: SARS-CoV-2 감염을 방지하기 위한 재조합 아데노바이러스 점막 백신의 임상전 연구들
도입
2019년에 COVID-19 질병의 원인 인자인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 새로운 코로나바이러스의 출현은 지난 세기 동안에 볼 수 없었던 범세계적이고 상당한 이환율, 치사율 및 사회 경제적인 혼란을 가져왔다. 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 무증상 감염으로부터 가벼운 감염과 심각한 폐렴 및 급성 호흡 곤란을 가져오는 발열과 기침에 이르기까지 다양한 심각성의 호흡기 질병이다(1). 현재의 보고들은 무증상 전파가 실질적인 점인 제시하고 있으며(2), SARS-CoV-2 감염은 대부분의 개인들에서 일과성 항체 반응을 유도한다(3). 이에 따라, 성공적인 조정의 개발이 이러한 바이러스의 감염 및 전파 및 이와 연관된 임상적 및 사회적 결과들에 대해 세계 인구를 보호할 시급한 요구가 있다. 효과가 있는 백신들로의 집단 면역화는 많은 다른 전염병들의 전파를 방지하는 데 매우 성공적이었으며, 집단 면역의 도입을 통해 취약한 사람들에서 질병을 방지할 수도 있다. 상당한 노력과 자원들이 긴급하게 효과가 있는 SARS-CoV-2 백신들을 확인하는 데 투자되고 있다. 수많은 다른 백신 플랫폼들이 폐렴에 대한 임상전 면역원성 및 효능을 입증하였으며(4, 5); 몇몇의 백신들은 I상 또는 II상 안전성 및 면역원성을 입증하였다(6-8). 이러한 분야에서의 효능도 일부 플랫폼들에 대해 이루어졌다.
보다 진보된 SARS-CoV-2 백신 후보 물질들은 모두 일부는 -80℃의 저장을 요구하면서 근육 내(IM)의 루트에 의해 주어진다. 이는 사람들에게 사회적으로 거리를 두고 모임을 회피하게 요구하는 세계적인 유행 동안에 백신 보급 및 개발에 대해 주요한 장벽이 되고 있다. 임의의 백신 캠페인의 궁극적인 목표는 백신의 설정된 숫자의 도스를 제조하는 것이 아니라 바이러스 확산을 억제하기 위한 충분한 집단 면역을 제공하여 질병으로부터 보호하는 것이다. 주사되는 용액은 장기간 관리자에게 맡겨지고, 나누어지며, 물류비용이 요구되며, 이는 도스 이용 가능성이 면역까지 즉각적으로 옮겨지지 못하는 것을 의미한다. 또한, 전신 면역화는 말초 및 하기도에서 면역을 유도할 수 있다. 그러나 이들 백신들은 van Doremalen 등의 "4 Mucosal IgA"(폴리머 구조 및 분비 성분들의 첨가로)에 의해 보고된 매우 낮은 점막 IgA에 의해 입증된 바와 같이 상기도에서 점막 면역을 유도하지 못할 수 있으며, 보다 유력한 바이러스 중화를 제공하고(9), 바이러스 전파를 차단할 수 있으며(10, 11), 대체로 호흡기 병원체에 대한 방어의 제1 라인인 정해진 불임 면역을 생성할 가능성이 있다.
점막 백신들은 젖은 표면들에서 점막 면역 반응들, 항체들 및 T 세포들을 유도할 수 있다. 본 발명자들은 사람들에게 정제 형태로 전달되는 인플루엔자 및 노로바이러스들을 포함하여 다중의 표지들에 대한 경구 백신들을 개발하고 있다. 본 발명자들의 백신 플랫폼은 보조제로서 새로운 톨-유사 수용체 3 작용제와 함께 항원을 발현시키는 복제-결핍 아데노바이러스 5형 벡터 백신이다. 이들 백신들은 잘 견디며, 발현된 항원들에 대해 강한 체액 및 세포 면역 반응들을 발생시킬 수 있었다(12-14). 사람들에게서 보호적인 효능이 잘 특성화된 실험적인 인플루엔자 감염 모델에서 나타난 바와 같이 예방접종 후의 90일 또는 그 이상에서 호흡기 바이러스에 대해 입증되었다(15). 또한, 상기 백신은 실온 안정성이 있고, 바늘이 필요 없고, 투여가 용이한 이점들을 가지며, 백신 개발 및 접근의 관점에서 주사되는 백신 접근 방법들에 비해 몇 가지 이점들을 제공한다.
여기서, 본 발명자들은 백스아트(Vaxart)의 경구 아데노바이러스 플랫폼을 기반으로 하는 SARS-CoV-2 백신의 임상전 개발을 설명한다. 중요한 접근 방식은 초기 면역원성 실험들이 진행되었던 동안에 제조 전의 시드들을 생성하기 위하여 몇몇의 백신 후보 물질들을 병렬로 개발하는 것이었다. 상기 백신들이 상기 세계적인 유행 동안에 만들어졌던 것으로 정해졌으면, 선적으로부터 제조 및 규정 시각표를 유지하기 위해 신속한 결정이 요구되었다. 본 발명자들은 상기 스파이크(S) 및 뉴클레오캡시드(N) SARS-CoV-2 단백질들에 기초하여 항원들을 발현시켰던 넷의 후보 백신들의 상대적인 면역원성을 평가하였다. 이들 단백질들은 SARS-CoV 및 MERS와 같은 관련된 코로나바이러스들에 대한 항원들로서 잘 특성화되었으며(Yong 등(16)에서 검토됨), SARS-CoV-2 스파이크에 대해 더욱 특성화되었다. 본 발명자들의 백신의 목표는 셋의 레벨들로 면역원성을 유도하는 것이다. 첫 번째는 S에 대해 효능 있는 혈청 중화 항체들을 유도하는 것이고, 두 번째는 점막 면역 반응들을 유도하는 것이며, 세 번째는 백신 항원들 모두에 대해 T 세포 반응들을 유도하는 것이다. 바이러스 감염뿐만 아니라 질병으로부터 개인들 보호할 수 있는 강하고 광범위한 면역을 유도하기 위한 이러한 셋 가지의 접근 목적들은 세계적인 유행병 동안에 신속한 백신의 보급을 증진시키고, 집단 면역을 통해 바이러스 전파로부터 인구를 보호한다.
여기서, 본 발명자들은 중화 항체(Nab), IgG 및 IgA 항체 반응들, 그리고 하나 또는 그 이상의 SARS-CoV-2 항원들을 발현시키는 rAd 벡터들의 면역화가 수반된 마우스들에서 T 세포 반응들의 유도를 보고하였다.
결과들
벡터 구조
초기에, 셋의 다른 rAd 벡터들이 다른 SARS-CoV-2 항원들을 발현시키도록 구조화되었다. 전체 길이의 S 단백질(rAd-S)을 발현시키는 벡터, 상기 S 단백질 및 상기 N 단백질(rAd-S-N)을 발현시키는 벡터, 그리고 상기 N 단백질과 S1 도메인의 융합 단백질(rAd-S1-N)을 발현시키는 벡터가 존재하였다. 상기 rAd-S-N의 N 단백질은 인간 베타 액틴 프로모터의 제어 하에서 발현되었고, 이는 마우스 세포들보다 인간 세포들에서 훨씬 더 효능이 있다. S 단백질을 발현시켰던 추가적인 구조체는 융합 전 형태로 고정(rAd-S(고정)-N)되었고, 이후의 일자에서 중화 항체 반응들을 연구하기 위해 대조군으로 구조화되었다. 이는 도 4에 기재되어 있다. 다양한 전이 유전자들의 발현이 흐름 세포측정법 및 상기 S 또는 N 단백질에 대한 단일 클론 항체들을 이용하여 293의 세포들의 감염에 후속하여 확인되었다.
S 및 N 항원들을 발현시키는 rAd 벡터들의 면역원성
초기 마우스 면역원성 연구들의 일차적인 목적은 어떤 rAd 벡터들이 S에 대한 상당한 항체 반응들을 유도하였던 지를 결정하고, 제조를 위해 시간에 맞춰 GMP 시드를 제공하기에 충분하도록 신속하게 이들 결과들을 얻는 것이었다. 본 발명자들과 다른 연구자들(17)은 마우스들에 경구로 투여된 백신 벡터들에 의한 전이 유전자 발현이 이들의 장 내의 환경에서 억제될 수 있었고, 이에 따라 면역원성이 비강 내(i.n.) 면역화에 후속하여 평가되었던 점을 관찰하였다. 동물들은 i.n.으로 면역되었고, 항체 역가들은 IgG ELISA에 의해 시간에 걸쳐 측정되었다. 셋의 rAd 벡터들 모두가 2주 및 4주에서 거의 동등한 항-S1 IgG 역가들을 유도하였고, 모든 동물들에서 상기 IgG 역가는 이차 면역화에 의해 상당히 증가되었다(p＜0.05, 맨-휘트니(Mann Whitney) t-검정)(도 5a). 그러나, 전체 길이의 S(rAd-S-N)를 발현시키는 벡터는 S1만을 발현시키는 벡터에 비하여 보다 높은 중화 역가들을 유도하였다(도 5b). 이는 하나는 베로 세포(Vero cell)(cVNT)들의 SARS-CoV-2 감염에 기초하고, 다른 하나는 대용 중화 분석(sVNT)에 기초하는 둘의 다른 중화 분석들에 의해 측정되었다. 또한, rAd-S-N은 S1에 대해 보다 높은 폐 IgA 반응들을 유도하였고, 놀랍지도 않게 최종 면역화 이후의 2추에서 rAd-S1-N에 비하여 S2에 대한 반응들을 유도하였다(도 5c). 특히, rAd-S-N이 상기 S1을 함유하는 백신(rAd-S1-N)과 비교되어 사용되었을 때에 폐 내에서의 중화 역가들도 상당히 높았다(도 5d). 이는 상기 rAd-S-N 후보 물질이 상기 S1 도메인만을 포함하는 백신에 비하여 보다 큰 작용 반응들(NAb 및 IgA)을 유도하였던 것을 입증한다. 상기 N 단백질이 상기 S 단백질보다 훨씬 잘 보존되고, 감염에 의해 유도되는 장기간의 T 세포 반응들의 목적이기 때문에(18), 상기 벡터 rAd-S-N이 GMP 제조를 위해 선택되었다.
rAd-S-N의 셋의 도스 레벨들이 이후에 이러한 백신의 도스 반응성들을 이해하기 위해 테스트되었다. S1(도 6a) 및 S2(도 6b) 모두에 대해 항체 반응들이 측정되었다. 유사한 반응들이 모든 시점들에서 모두 셋의 도스 레벨들로 나타났다. S1 및 S2에 대한 반응들은 모든 그룹들에서 보다 이른 시간들에 비하여 6주에서 상당히 증가되었다.
다른 도스들에서 rAd-S-N에 의한 S-특이적 T 세포들의 도입이 이후에 평가되었다. IFN-γ, TNF-a 및 IL-2와 같은 효과기 시토카인들을 생성하였던 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 도입이 2의 면역화들 이후에 2추에서 관찰되었다(도 7a). 특히, 적은 IL-4가 이러한 백신에 의해 CD4+ T 세포들에서만 유도되었으며, 질병의 백신 의존 증강에 대한 위험성이 매우 낮았던 점을 보장하는 레벨을 제공하였다. 또한, rAd-S-N으로의 면역화는 이중 및 삼중의 양성의 다기능성 IFN-γ, TNF-a 및 IL-2 CD4+ T 세포들을 유도하였다(도 7b). 이차 도스 반응 실험이 최종 면역화 이후의 4주(연구의 8주)에서 상기 S 단백질에 대한 T 세포 반응들을 중점으로 하여 수행되었다. 지라 세포들이 둘의 별도의 펩티드 풀들로 나누어진 상기 S 단백질에 대한 펩티드 라이브러리로 하룻밤 동안 자극되었다. 둘의 풀들 내의 T 세포 반응들은 합산되었고, 도포로 되었다(도 7c). 동물들에게 1e7 I.U.가 투여되었으며, 1e8 I.U.의 도스 레벨들은 치료되지 않은 동물들에 비해 상당히 높은 T 세포 반응들을 가졌지만, 서로에 대해 유사한 숫자의 IFN-γ 분비 세포들을 생성하였으며, 1e7 I.U.의 도스에서 도스 정점지속을 입증하였다. 특히, 이러한 T 세포 분석은 잠재적으로 T 세포 반응들의 피크 이후인 상기 이차 면역 후의 4주에서 수행되었다.
rAd-발현 야생형 S는 안정화/융합전 S에 비하여 우수한 중화 반응을 유도한다.
추가적인 연구가 rAd-S-N을 안정화된 S-단백질 및 제거된 막 운반 부위를 가지는 백신 후보 물질(rAd-S(고정)-N)과 비교하기 위해 수행되었다. 상기 S 단백질의 안정화된 버전은 중화 항체 반응들을 향상시키고, 덜 중화시키지 않는 항체들을 생성하는 방식으로 제시되었다. 상기 S 단백질은 Amanat 등에 기재된 바와 같은 변형을 통해 안정화되었다(19). rAd-S-N은 비록 맨-휘트니(Mann-Whitney)(p=0.067)에 의해 6주에서 통계적으로 유의미하지는 않았지만 테스트된 시점들에서 S1에 대해 보다 높은 혈청 IgG 역가들을 유도하였다(도 8a). 그러나, rAd-S-N은 상기 안정화된 버전(p=0.0152) 보다 상당히 높은 중화 항체 반응들을 유도하였다(도 8b). 이들 결과들은 상기 S 단백질의 야생형 버전이 마우스들에서 rAd계 백신보다 우수한 점을 제시한다.
논의
COVID-19의 세계적인 유행에 대한 종반전은 안전하고 효과적인 백신의 확인과 제조 및 후속되는 범세계적인 면역화 캠페인을 요구한다. 수많은 백신 후보 물질들이 III상의 범세계적인 효능 테스트까지 촉진되었고, 이들 시험들에서 충분히 성공적일 경우에 제1 세대의 면역화 캠페인이 형성될 수 있다. 그러나 모든 이들 개발된 후보 물질들은 주사되는 S계 백신들이다. 이와 같은 접근 방식은 바이러스 전파를 방지하지 못할 가능성이 있더라도, 마카크(macaque) 시험감염 연구들에서 입증된 바와 같이 폐렴 및 바이러스 성장과 하기도 및 주변의 손상을 방지해야 한다(4, 5).
범세계적인 COVID-19 면역화 캠페인에서 하나의 중요한 제한은 저온 유통 체계 분산 및 물류와 백신을 주사하기 위해 적절하게 훈련된 의료계 종사자(HCW)들을 요구하는 애로가 될 것이다. 저온 유통 체계 및 훈련을 포함하여 현재의 물류비용은 하위 중소득 국가(LMIC)에서 개인들을 완전하게 면역화시키는 데 두 배의 비용이 들 수 있다(20). 주사 계열의 백신들을 위해 훈련된 HCW들을 요구하는 집단 면역화 캠페인을 실시하는 것은 모든 국가들에서 의료계 자원들에 상당한 영향을 가져올 것이다. 저온 유통 체계, 생물학적으로 유해한 날카로운 폐기물 처리 및 훈련에 대한 필요성은 증가되는 비용, 불공평한 백신 접근, 지연된 백신 접종 및 이러한 세계적인 유행병의 연장을 가져올 것이다. 이들 비용은 백신들이 장기간의 보호를 제공하지 못할 경우에(다른 베타-코로나바이러스들에 대한 자연 면역은 오래가지 못함(21)) 확대될 것이며, 매년 주사 계열의 캠페인들이 요구된다. 백스아트의 경구 정제 플랫폼은 이들 면역학적뿐만 아니라 물류비용 및 경제적인 접근 및 수용 문제점들에 대한 해결 방안을 제공한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 임상전 동물 모델에서 백스아트의 백신 플랫폼을 이용한 SARS-CoV-2 백신의 면역원성, 즉 혈청 및 점막 중화 항체들 및 다기능성 T 세포들의 도입을 입증하였다.
마우스 연구들은 세계적인 유행병을 처리하는 데 중요한 제조 및 임상 연구들로 옮겨지기 이전에 2020년 봄에 후보 백신들의 면역원성을 신속하게 테스트하기 위해 설계되었다. 백스아트의 경구 정제 백신 플랫폼은 이미 사람들에서 몇몇의 상이한 병원체들에 대해 신뢰성 있는 점막(호흡기 및 장 내), T 세포 및 항체 반응들을 생성할 수 있는 것으로 이미 증명되었다(12, 14, 22, 23). 본 발명자들은 본 발명자들의 이전의 인간 인플루엔자 바이러스 시험감염 연구로부터 경구 면역화가 상업적인 4가의 비활성화 백신과 동등하게 면역화 후의 90일에서 보호적 효능을 유도할 수 있었던 점을 알고 있었다(15). 이들 특징들은 COVID-19에 대한 상기 플랫폼의 적용이 이러한 병원체 코로나바이러스에 대한 효능을 전달할 수 있었고, 바이러스 감염에 대한 지속 가능한 보호를 제공할 수 있었던 점에 대한 확신을 제공한다. 최종적으로, 자격이 있는 의료 지원이 관리자에게 요구되지 않기 때문에 정제 백신 캠페인은 훨씬 쉬워진다. 이러한 투여의 용이성은 폴리오바이러스의 제거에서 경구 폴리오 백신으로 관리자에 대한 용이한 성공에 의해 입증된 바와 같이 향상된 백신 접근성과 잠재적인 허용 가능성을 가져올 것이다(24). 이들 특징들은 실질적으로 보다 많은 자원들이 이러한 백신의 접종을 확보하는 데 요구될 수 있고, 주어지는 COVID-19의 범세계적인 레벨들에 대한 현실부정, 백신에 대한 신뢰 부족 및 주저 때문에 인하여 다른 백신들에 비해 SARS-CoV-2 면역화 캠페인 동안에 보다 중요할 수 있었다(25, 26). 상기 정제 백신은 냉장고들이나 냉동고들을 필요로 하지 않고, 바늘들이나 바이알들을 요구하지 않으며, 잠재적으로는 표준 우편에 의하거나 전달 드론에 의해 선적될 수 있다. 이들 특징들은 개발 및 보급 물류비용을 상당히 개선하며, 심지어 보다 적은 기술적 자원들로 격리된 지역들에 대한 접근도 가능하게 한다. 최종적으로, 면역학적인 시각에서, 이러한 아데노바이러스의 경구 투여는 rAd5계 SARS-CoV2 백신에서 상당히 감소된 백신 효능을 야기한 것으로 나타났고(27), 동일한 아데노바이러스 플랫폼이 상기 IM 루트로 다시 투여될 때에 지속 가능하고 증가된 면역을 방지할 수 있었던(28) 문제점들이 있는 아데노바이러스들에 대한 기존의 면역과 절충되지 못하거나, 실질적인 항-벡터 면역을 생성한다(12, 13).
항원의 선택은 적시에 신속한 중대한 결정이 요구되기 때문에 새로운 세계적인 유행병 동안에는 어려울 수 있다. 상기 S 단백질은 상기 단백질이 수용체 결합, 막 융합 및 조직 향성을 담당하기 때문에 코로나바이러스 백신들에 대한 주요한 중화 항체 표적이 되는 것으로 여겨진다. SARS-CoV-2 Wu-1을 SARS-CoV와 비교할 때, 상기 S 단백질은 76.2% 동일성을 가지는 것으로 발견되었다(29). SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 모두는 세포 침입을 위해 동일한 수용체인 일부 인간 세포 유형들에서 발현되는(30) 엔지오텐신 변환 효소 2 수용체(ACE2)를 이용하는 것으로 여겨진다. 따라서, SARS-CoV-2 S 단백질이 현재까지 백신 개발에서 중요한 표적 항원으로 사용되고 있으며, 표적 세포들에 대한 바이러스 결합을 위한 중요한 기전으로서 기능하는 점이 이상적인 표적이 되고 있다. 그러나, 백신들에서 S 단백질 및 IgG 혈청 반응에 대한 전체적인 의존은 결과적으로 바이러스 이탈을 가져온다. 인플루엔자에 대해, 글리코실화 부위를 포함하여 혈구 응집소 결합 단백질의 작은 변화들이 보호를 위한 주사되는 백신들의 능력에 큰 영향을 미칠 수 있다(31). SARS-CoV-2는 대부분의 RNA 바이러스들보다 안정한 것으로 나타나지만, 널리 분배된 백신의 선택 압력이 없이도 압력 S 단백질 돌연변이들이 이미 관찰되었다. 백신 압력이 개시되면, 이탈 돌연변이들이 나타날 수 있었다. 본 발명자들은 이러한 문제를 처리하기 위해 두 가지 접근 방식들을 택하였으며, 첫 번째는 백신 내에 보다 보존된 N 단백질을 유도하는 것이고, 두 번째는 점막 IgA을 통해 보다 넓은 면역 반응들을 유도하는 것이다.
ACE2의 높은 발현 레벨들이 폐의 II형 폐포 세포들, 상기 회장 및 결장의 흡수성 장세포들과 가능하게는 혀와 같은 구강 조직들 내에도 존재한다(32). 비록 코로나바이러스들이 감염된 사람들로부터의 대변 샘플들에 분비될 수 있는 SARS-CoV 및 MERS-CoV 바이러스들 모두에서 볼 수 있는 바와 같은 경구-대변 루트를 통한 전파의 일부 증거가 존재하지만(34), 바이러스의 전파는 주로 밀접하게 접촉하는 보호되지 않은 개인들 사이에서 호흡기 액적들과 매개물들을 통해 일어나는 것으로 여겨진다(33). 또한, 호흡기 증상들보다는 위장 증상들이 있었던 개인들의 하위 집단이 보다 길게 바이러스를 뿌릴 가능성이 있는 증거도 있다(35). 호흡기 및 장관 모두에서 S에 대한 면역 점막 면역 반응들을 작동시키는 것은 단지 하나의 점막 부위만을 표적으로 하는 것보다 보다 광범위한 면역과 전파를 차단하는 보다 높은 능력을 제공할 수 있다. 단지 질병보다는 전파를 차단하는 것이 감염 비율을 감소시키고, 궁극적으로 SARS-CoV-2를 근절시키는 데 필수적이다. 본 발명자들은 이전에 경구의 정제로 만들어진 rAd계 백신이 호흡기 감염 및 후속되는 인플루엔자 바이러스의 발산에 대한 보호(15)뿐만 아니라 사람들에서 노로바이러스 항원들에 대한 장내의 면역을 유도할 수 있는 점을 입증하였다(12). 또한, 점막 IgA는 단량체 IgG 반응보다는 순환하는 바이러스들에서 S 단백질들의 임의의 이종성을 처리할 수 있는 가능성이 있다. 또한, mIgA는 다른 호흡기 병원체들에 대해 IgG 보다 교차 반응성에서 보다 효력이 있는 것으로 발견되었다(36). 또한, IgA는 COVID-19 감염에서 IgG 보다 중화시키는 동형이 될 수 있으며, 실제로 중화 IgA가 조기 면역 반응에서 우세하다(37). 특히, 본 발명자들은 본 발명자들의 마우스 연구에서도 본 발명자들의 폐에 대한 혈청 항체에서 중화 대 비-중화 항체들 사이의 보다 높은 비율을 발견하였으며, 이는 IgA가 IgG에 비해 보다 효력을 가질 수 있는 개념을 지지한다. 폴리머 IgA는 항원 및 Fc 수용체들에 대해 다중의 결합 상호 작용들을 통해 약한 단일의 상호작용을 보다 높은 전체적인 친화도의 결합과 활성화 신호로 전환시킬 수 있으며, 이종의 바이러스들에 대해 보다 많은 교차 면역을 생성할 수 있다(38).
이러한 잠재적인 백신 유래 이탈 문제를 완화시키기 위한 본 발명자들의 두 번째 계획은 상기 백신 구조체 내에 N 단백질을 포함시키는 것이었다. 상기 N 단백질은 몇몇의 면역 우세 T 세포 에피토프(epitope)들을 포함하는 b-코로나바이러스들 사이에서 고노도 보존되었고(90% 이상 동일), N에 대한 장기 기억이 SARS-CoV가 회복된 대상들뿐만 아니라 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2에 노출된 것이 알려지지 않은 사람들에서 발견될 수 있었다(18, 39). 감염 설정에서, 상기 N 단백질에 대한 T 세포 반응들은 증가된 중화 항체 반응들과 상호 연관되는 것으로 여겨진다(40). 모든 이들 반응들은 본 발명자들이 본 발명자들의 백신 접근 방식에 N을 첨가하게 하였다. 상기 단백질은 293A의 세포들에서 발현되었다. 그러나 인간 베타 액틴 프로모터가 마우스들보다 인간 세포들에서 활성적이었으므로, 본 발명자들은 Balb/c 마우스들에서 면역 반응들을 탐구하지는 않았지만, 향후의 NHP 및 인간 연구들에서 보다 상세하게 조사할 것이다.
SARS-CoV-2 백신에 포함되는 상기 S 단백질의 최적의 서열과 구조는 논쟁의 대상이 되고 있다. 몇몇 실험실들은 수용체 결합 도메인(RBD) 내의 중요 중화 도메인들에 대해 S 단백질을 감소시키는 것이 보다 높은 중화 항체 반응들 및 보다 적은 비-중화 항체들을 증진시킬 수 있었던 것으로 제시하였다(41, 42). 본 발명자들은 이러한 접근 방식을 증진시키기 위한 시도로서 RBD를 포함하는 S1 도메인으로 구성된 백신 후보 물질을 만들었다. 비록 상기 S1계 백신이 S1에 대해 유사한 IgG 결합 역가들을 생성하였지만, 중화 항체 반응들은 전체 길이의 S 항원에 비교하여 상당히 낮았다. 다른 유전자 기반의 백신들도 S에 대한 환원적 접근 방식이 그다지 잘 작동하지 않으며, 전체 길이의 S-단백질을 발현시키는 DNA 백신이 보다 짧은 S 분절들보다 높은 중화 항체들을 생성하였던 점을 보여주었다(5). 이들 마카크 연구들과 부합되어, 본 발명자들은 Ad-인코드 항원의 서열이 항체 기능, 여기서는 중화에 관하여 상당한 영향을 미쳤던 점을 관찰하였다. 비-중화 항체 에피토프들을 노출시킬 가능성을 감소시키는 것이 이론적으로는 합당해 보이지만, 이는 보다 많은 중화 항체들이 개발되게 하는 T 세포 기여를 감소시킬 수 있다. 실제로, SARS-CoV-2에 대한 반응들의 54%를 구성하는 상기 스파이크 단백질 T 세포 반응들은 수용체 결합 도메인에 대해 11%만이 보여졌다(43). 상기 S 단백질을 안정화시키는 것은 단백질 백신에 대해서는 중요할 수 있지만, 유전자 기반의 백신에 대해서는 필수적이 아닐 수 있다. 전자는 생체 외로 생성되며, 주사를 준비되는 균질하고 한정된 구조를 유지하도록 생산된다. 이에 비하여, 후자는 실질적으로 융합전의 형태로 자연 감염과 같이 생체 내로 세포의 표면상에 발현되며, 추가적인 안정화는 상기 중요 중화 에피토프들에 대한 항체들을 생성하기 위해서는 B 세포들에 대해 필수적이 아닐 수 있다. 본 발명자들은 본 실험예에서 설명한 바와 같이 상기 S 및 N 단백질들을 인코딩하는 구조체 내의 야생형 버전에 대해 S의 안정화된 버전을 직접 비교하였다. 상기 야생형 버전은 중화 항체 반응들을 유도하는 데 상당히 우수하였다. 흥미롭게도, 이는 NHP들에서의 DNA 백신 연구에서도 관찰되었으며, 여기서 상기 안정화된 버전은 야생형 S5에 비하여 보다 낮은 중화 항체(NAb) 역가들을 유도하는 것으로 나타났다. 약간 다른 결과가 NHP들에서 Mercado 등의 rAd26 벡터들의 연구들에서 관찰되었으며, 여기서 상기 S 단백질의 안정화된 버전을 발현시키는 것은 NAb를 향상시키지만, T 세포 반응들을 저하시키는 것으로 나타났다(44). 요약하면 안정화가 유전자 기반 또는 벡터 기반의 백신들에서 면역 반응들을 보편적으로 향상시키지는 않는다.
다중의 백신 후보 물질들이 임상 시험에서나 임상 시험이 개시되기 전에 존재하였다. 에볼라 바이러스와 같이 지역적인 병원체들에 대해 알려진 안전성 및 면역원성으로 인하여, 재조합 아데노바이러스 벡터들을 기반으로 하는 둘의 유망한 후보 백신들인 옥스퍼드 대학의 ChAdOx1-nCov 및 일본 약학의 AdVac 플랫폼들이 있다(45-48). 본 발명자들은 본 발명자들의 연구에서 Balb/c 마우스들에서 ChAdOx1-nCov에 비하여 보다 강한 혈청 IgG 및 NAb 역가들을 발견하였다(4). 그러나 이는 분석 성분들의 차이점들을 반영할 수 있었다. rAd36 백신 연구가 Hassan 등에 의해 수행되었으며, 여기서 1e10VP의 도스들이 비강 내 전달로 주어졌다(49). 결과들은 마우스 SARS-CoV-2 시험감염 모델에서 폐 감염을 차단하는 관점에서 유의미하였다. 이들은 본 발명자들의 연구에 비하여 2- 내지 3-폴드 높은 도스들을 사용하였음에도 불구하고 본 발명자들의 연구들과 유사하게 배경 역가들 위의 1e4의 혈청 항체 역가들로 역가들을 보고하였다. 실제로 본 발명자들의 연구에서, 동등하게 강한 T 세포 및 항체 반응들이 비강 내의 루트로 1e7 I.U. 및 1e8 I.U.를 사용하여 관찰되었다. 이들 도스들을 사용하여, 본 발명자들은 펩티드 재자극 이후에 IFN-γ 및 TNF-a를 분비하는 CD8+ T 세포 반응들의 높은 퍼센티지들(14%까지) 및 강한 CD4+ T 세포들을 관찰하였다. 비록 본 발명자들이 이들 항원 특이적 T 세포들의 전달 성질들을 평가하지는 않았지만, 본 발명자들은 사람들에서 이러한 Ad계 백신의 경구 투여가 점막 회귀 림프구들의 높은 레벨들을 유도하는 것을 인지하고 있다(12, 15). 상기 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 비율은 이러한 마우스 연구에서 다가능성이었다. 다중 기능들을 가지는 백신-유도 T 세포들은 감염에 후속하여 바이러스의 보다 효과적인 제거를 제공할 수 있으며, 이에 따라 질병의 방지에 수반될 수 있었지만, 이 시점에서 질병에 대한 보호를 위해 요구되는 최적의 T 세포 표현형이 어떤 것인지는 분명하지 않다.
요약하면, 백신 후보 물질을 생성하는 본 발명자들의 첫 번째 단계에서 마우스들에서의 본 연구들은 심지어 낮은 백신 도스들에서의 구조체의 면역원성과 T 세포 반응들과 우수한 전신 및 점막 중화 항체를 유도하는 유망한 후보 물질 항원으로서 전체 길이의 스파이크 단백질의 설명을 나타낸다. 향후의 작업은 사람들에서의 면역 반응들에 중점을 둘 것이다.
방법들
백신 구조체들
본 연구를 위해, 넷의 재조합 아데노바이러스 백신 구조체들이 젠뱅크 수탁번호 MN908947.3호로 공공적으로 입수 가능한 SARS-CoV-2의 공개된 DNA 서열을 기초로 하여 생성되었다. 상세하게는, 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(S 단백질) 및 상기 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N 단백질)의 공개된 아미노산 서열들이 호모 사피엔스 세포들(블루 헤론 바이오테크놀로지(Blue Heron Biotechnology), 보셀시, 워싱턴주)에서의 발현을 위해 최적화된 핵산 서열들 코돈을 합성하는 데 이용되었다. 이들 서열들은 He 등(50)에 기재되어 있는 바와 같이 경구 rAd 정제들에 대한 이전의 임상 시험들에 사용되었던 동일한 벡터 골격을 이용하여 아데노바이러스 5형(rAd5)의 E1 부위 내로 복제된 전이 유전자들을 포함하는 재조합 플라스미드들을 생성하는 데 이용되었다(12, 15). 도 4에 도시한 바와 같이, 다음의 넷의 구조체들이 생성되었다.
a. rAd-S: CMV 프로모터의 제어 하에서 전체 길이의 SARS-CoV-2 S 유전자를 포함하는 rAd5 벡터.
b. rAd-S-N: CMV 프로모터의 제어 하에서 전체 길이의 SARS-CoV-2 S 유전자 및 인간 베타-액틴 프로모터의 제어 하에서 전체 길이의 SARS-CoV-2 N 유전자를 포함하는 rAd5 벡터.
c. rAd-S1-N: SARS-CoV-2 S 유전자(S1 및 S2 사이의 자연 푸린 부위를 포함)의 S1 부위와 상기 전체 길이의 SARS-CoV-2 N 유전자를 결합시키는 융합 서열을 이용한 rAd5 벡터.
d. rAd-S(고정)-N: 상기 CMV 프로모터의 제어 하에서 제거된 막 운반 부위를 가지는 안정화된 S 유전자 및 상기 인간 베타-액틴 프로모터의 제어 하에서 전체 길이의 SARS-CoV-2 N 유전자를 포함하는 rAd5 벡터. 상기 S 유전자는 다음의 변형들을 통해 안정화된다.
a) 위치 682, 위치 683, 위치 685에서 아르기닌 잔기들이 자연 푸린 난할 부위(furin cleavage site)를 제거하도록 결실되었다.
b) 둘의 안정화 돌연변이들인 K986P 및 V987P가 도입되었다.
c) 막 운반 부위가 P1213에 후속하여 제거되었고, 박테리오파지 T4 피브리틴 삼량체화 폴드온 도메인(fibritin trimerization foldon domain) 서열(51)(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)로 대체되었다.
모든 백신들은 Expi293F 서스펜션 세포주(써모피셔사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 내에서 성장되었고, CsCl 밀도 원심 분리로 정제되었으며, 동물 실험들을 위해 액체 형태로 제공되었다.
동물 실험들
연구들은 동물 보호 이용 위원회(IACUC)의 윤리 규정들에 대해 승인되었다. 모든 절차들은 지역, 주 및 연방 가이드라인과 규정들에 따라 수행되었다. 암컷 6주-8주 연령의 Balb/c 마우스들이 잭슨 랩스(Jackson labs)(바하버시, 메인주)로부터 구매되었다. 마우스들은 알약들을 삼키지 못하기 때문에, 다양한 구조체들의 면역원성을 테스트하기 위해 액상 제제들이 마우스마다 20㎖, 콧구멍마다 10㎖로 비강 내로 주입되었다. 혈청은 다양한 시점들에서 뺨 천공에 의해 획득되었다.
항체 평가
ELISA들
단백질들에 대한 특정한 항체 역가들은 앞서 설명한 방법들과 유사하게 측정되었다(52). 요약하면, 마이크로티터(microtiter) 플레이트들(MaxiSorp: Nunc)에 1.0㎍/㎖ S1 단백질(젠스크립트)로 1의 탄산염 완충액(pH 9.6의 0.1M) 중에서 도포되었다. 상기 플레이트들은 가습 챔버 내에서 하룻밤 동안 4℃에서 배양되었고, 이후에 세척 이전에 1시간 동안 PBS 플러스 0.05% 트윈(Tween) 20(PBST) 플러스 1% BSA 용액 중에 차단되었다. 혈장 샘플들은 PBST 중에서 연속적으로 희석되었다. 2시간의 배양 후, 상기 플레이트들은 PBST 적어도 5회 세척되었다. 항체들이 이후에 항-마우스 IgG1-겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP) 및 항-마우스 IgG2a-HRP(베틸 라보라토리즈(Bethyl Laboratories), 몽고메리, 텍사스주)의 혼합물로서 첨가되었다. 각 이차 항체는 1:5,000의 희석으로 사용되었다. 상기 플레이트들은 1시간의 배양 후에 적어도 5회 세척되었다. 항원 특이적 마우스 항체들은 3,3=,5,5=-테트라메틸(tetramethyl)-벤지딘(benzidine)(TMB) 기재(로클랜드(Rockland), 길버츠빌, 팬실베이나주)로 검출되었고, H2SO4가 정지 용액으로 사용되었다. 상기 플레이트들은 스펙트라 맥스(Spectra Max) M2 마이크로플레이트 판독기 상의 450㎚에서 판독되었다. 평균 항체 역가들은 다르게 기재되지 않는 한은 평균 배경 플러스 2 표준 편차들보다 큰 흡수 값을 가져오는 상호 희석으로 보고되었다.
항체 결합 항체들
S1 및 S2 모두에 대한 반응들을 동시에 측정하기 위해 멀티-스폿(MULTI-SPOT)® 96-웰, 2-스폿 플레이트(중규모 장치: MSD)에 SARS CoV-2 항원들이 도포되었다. 단백질들은 포유동물 세포들(293의 세포들) 내에 생성된 소스(네이티브 안티겐사(Native Antigen Company))로부터 상업적으로 획득되었다. 이들은 바이오티닐화(biotinylated)되었고, 이들 개개에 U-PLEX 링커들에 의해 이들 각각의 스폿들에 부착되었다. IgG 항체들을 측정하기 위해, 플레이트들은 MSD 블로커(Blocker) B로 1시간 동안 진탕시키면서 차단되었고, 이후에 샘플들의 첨가 이전에 세 번 세척되었으며, 1:4000으로 희석되었다. 진탕시키면서 2시간 동안 배양한 후, 상기 플레이트들 세 번 세척되었다. 상기 플레이트들은 이후에 1㎍/㎖으로 검출 항체(MSD SULFO-TAGTM 항-마우스 IgG)로 1시간 동안 배양되었다. 3회 세척한 후, 레드 버퍼(Read Buffer)가 첨가되었고, 상기 플레이트들은 메조 퀵플렉스(Meso QuickPlex) SQ 120 상에서 판독되었다.
SARS-CoV-2 중화 분석들
중화 항체들은 SARS-CoV-2 대용 바이러스 중화 테스트(sVNT) 키트(젠스트립트)에 기초하여 통상적으로 검출되었다. 이러한 ELISA계 키트는 상기 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 및 숙주 세포들 상의 ACE2 수용체 수용체 사이의 상호 작용을 저해하는 항체들을 검출하며, 베로 세포들의 SARS-CoV-2 감염에 대한 종래의 바이러스 중화 역가들과 밀접하게 상호 연관된다(53). 이러한 접근 방식의 이점은 BSL-2 실험실에서 이루어질 수 있는 분석인 점이다. 상기 후보 백신들로 면역된 마우스들로부터의 혈청들은 제공된 샘플 희석 완충액을 사용하여 1:20, 1:100, 1:300, 1:500, 1:750 및 1:1000으로 희석되었다. 면역되지 않은 마우스들로부터의 혈청들은 1:20으로 희석되었다. 폐 샘플들은 1:5, 1:20 및 1:100으로 희석되었다. 양성 및 음성 대조군들은 제공된 프로토콜이 수반되어 1:9의 부피 비율로 제조되었다. 희석 후, 혈청들 또는 폐 샘플들은 30분 동안 37℃에서 HRP-RBD 용액으로 1:1의 비율로 개별적으로 배양되었다. 배양에 이어서, 100㎖의 각 HRP-RBD 및 샘플 또는 대조군 혼합물이 hACE2-예비 코팅 포집 플레이트 내의 대응되는 웰들에 첨가되었고, 37℃에서 15분 동안 다시 한 번 배양되었다. 이후에, 웰들은 철저하게 세척되었고, 100㎖의 제공된 TMB(3,3=,5,5=-테트라메틸-벤지딘) 용액이 각 웰에 첨가되었고, 15분 동안 실온에서(20℃-25℃) 배양되도록 두어졌다. 마지막으로 50㎖의 정지 용액이 각 웰에 첨가되었고, 상기 플레이트는 450㎚에서 스펙트라 맥스 M2 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독되었다. 주어진 샘플의 흡수도는 주어진 샘플에서의 항-SARS-CoV-2 RBD 중화 항체의 역가와 역으로 관련된다. 테스트 키트 프로토콜마다, 음성 대조군의 OD에 대해 샘플의 OD를 비교할 때에 20%의 억제의 차단이 중화 항체들의 존재에 대해 양성인 것으로 결정되었다. 가장 낮은 희석에서 음성이었던 샘플들은 테스트된 가장 낮은 희석의 1.2인 혈청들에 대해 10 또는 폐 샘플들에 대해 2.5로 설정되었다.
추가적인 중화 항체 반응들이 일부 연구들에서 BSL3 조건들 하의 비시메데리(Visimederi)에서 cVNT 분석을 이용하여 측정되었다. 상기 cVNT 분석은 동물 또는 인간 샘플들에서 살아있는 SARS-COV-2에 대한 특이적 중화 항체들을 검출하기 위해 세포병변 효과(CPE)의 판독을 가진다. 상기 cVNT/CPE 분석은 바이러스가 다중의 사이클들의 감염을 만들게 하고, 세포들로부터 방출되게 하며, 며칠(통상적으로 72시간의 배양) 내의 이의 기하급수적 성장이 CPE로 분명하게 식별될 수 있는 지지체의 표면으로부터 부분적이거나 완전한 세포 단일 층을 가져오게 한다. 혈청 샘플들은 30분 동안 56℃에서 가열로 비활성화되며, 1:10으로부터 시작하여 2-폴드 희석들이 수행되었고, 이후에 SARS-CoV-2의 100 TCID50을 포함하는 동등한 부피의 바이러스 용액과 혼합되었다. 혈청-바이러스 혼합물은 5%의 CO2를 포함하는 가습 분위기에서 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 배양 후, 각 희석에서 100㎕의 혼합물이 반융합성의 베로 E6 단일 층을 포함하는 세포 플레이트에 이중으로 참가된다. 72시간의 배양 후에 상기 플레이트들은 역 광학 현미경에 의해 조사된다. CPE로부터 50% 이상의 세포들을 보호하는 가장 높은 혈청 희석이 중화 역가로서 취해진다.
폐 IgA ELISA들
최종 면역화 후의 2주(연구의 28일)에, 마우스들은 희생되었고, 심장 천공을 통해 혈액이 취해졌다. 폐는 제거되었고, -80℃에서 얼려지게 냉동되었다. 융해에 따라, 폐들이 계량되었다. 폐들은 펠릿 막자들(시그마(Sigma) Z359947)을 이용하여 150㎖의 DPBS 중에서 균질화되었다. 균질화물들은 1300rpm에서 3분 동안 원심 분리되었고, 상청액들은 냉동되었다. 폐 균질물 내의 전체 단백질 함량이 IgA 함량의 평가 이전에 모든 샘플들에서 동등한 조직의 양들을 확보하도록 브래포드(Bradford) 분석을 이용하여 평가되었다. 폐들에서의 항원-특이적 IgA 역가들은 마우스 IgA ELISA 키트(맵테크(Mabtech)) 및 pNPP 기재(맵테크)를 이용하여 검출되었다. 요약하면, 맥시소프 플레이트들(Nunc)에 4℃에서의 하룻밤 동안의 흡수를 위해 PBS 중의 S1 또는 S2(네이티브 안티겐사; 50ng/웰)이 도포되었고, 이후에 세척 전에 1시간 동안 PBS 플러스 0.05% 트윈 20(PBST) 플러스 0.1% BSA(PBS/T/B) 용액 중에서 차단되었다. 폐 균질물들은 PBS/T/B 중에서 1:30의 희석으로부터 시작하여 연속적으로 희석되었다. 2시간의 배양 및 세척 후, 결합된 IgA가 제조업자의 프로토콜에 따라 MT39A-ALP 접합 항체(1:1000)를 이용하여 검출되었다. 플레이트들은 415㎚에서 판독되었다. 종말점 역가들이 자연 마우스 혈청에 대한 흡수도보다 흡수도 3x 큰 표준 편차들에서 희석 곡선의 x-축 절단으로 취해졌다. 반응하지 않은 동물들은 테스트된 가장 낮은 희석의 값의 1/2의 역가로 설정되었다.
T 세포 반응들
지라들이 제거되었고, 5㎖의 주사기로 멸균 여과기를 통해 밀어지기 이전에 5㎖의 행크스 평형 염류 완충액(Hanks Balanced Salt Solution)(1M HEPES 및 5% FBS를 포함) 내에 두어졌다. RBC 용해(에비오용액(Ebiosolution)들), 재현탁 및 계수 이후, 세포들이 분석을 위해 준비되었다. 세포들은 상기 세포들을 자극하기 위해 하룻밤 동안 1㎎/㎖에서 전체 길이의 S 단백질(젠스크립트)을 나타내는 둘의 펩티드 풀들로 5e5의 세포들/웰레서 배양되었다. 상기 배양 배지는 0.01M 헤르페스(HEPES), 1X l-글루타민, 1X MEM 염기성 아미노산들, 1X 펜스트렙(penstrep), 10% FBS 및 5.5e-5몰/ℓ 베타-메르캅토에탄올을 구비하는 RPMI 배지들(론자(Lonza))로 구성되었다. 항원 특이적 IFN-γ ELISPOT들은 맵테크 키트를 이용하여 측정되었다. 적절한 항체들로의 염색 후에 흐름 세포측정기 분석이 어툰(Attune) 흐름 세포측정기 및 플로우조(FlowJo) 버전 10.7.1을 이용하여 수행되었다. 흐름 세포측정을 위해, 웰 당 2e6의 지라 세포들이 마지막의 4시간의 배양을 위해 브레펠딘(Brefeldin) A(써모피셔)가 첨가된 1㎍/㎖ 또는 5㎍/㎖에서의 전체 길이의 S를 나타내는 펩티드 풀들로 18시간 동안 37℃에서 배양되었다. 사용된 항체들은 APC-H7 접합 CD4, FITC 접합 CD8, BV650 접합 CD3, PerCP-Cy5.5 접합 IFN-y, BV421 접합 IL-2, PE-Cy7 접합 TNFa, APC 접합 IL-4, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 접합 CD44, 그리고 PE 접합 CD62L(BD 바이오사이언시즈)이었다.
실험예 1-실험예 5에서 언급된 참조 문헌들
1. Huang C, Wang Y, Li X 등의 "Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet"(2020; 395(10223): 497-506).
2. Tan J, Liu S, Zhuang L 등의 "Transmission and clinical characteristics of asymptomatic patients with SARS-CoV-2 infection"(Future Virol 2020: 10.2217/fvl-020-0087).
3. Long QX, Tang XJ, Shi QL 등의 "Clinical and immunological assessment of asymptomatic SARS-CoV-2 infections"(Nat Med 2020; 26(8): 1200-4).
4. van Doremalen N, Lambe T, Spencer A, 등의 "ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques"(Nature 2020).
5. Yu J, Tostanoski LH, Peter L 등의 "DNA vaccine protection against SARS-CoV-2 in rhesus macaques"(Science 2020).
6. Folegatti PM, Ewer KJ, Aley PK 등의 "Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial"(Lancet 2020).
7. Zhu FC, Guan XH, Li YH 등의 "Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial"(Lancet 2020; 396(10249): 479-88).
8. Jackson LA, Anderson EJ, Rouphael NG 등의 "An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2-Preliminary Report"(N Engl J Med 2020).
9. Renegar KB, Jackson GD, Mestecky J의 "In vitro comparison of the biologic activities of monoclonal monomeric IgA, polymeric IgA, and secretory IgA"(Journal of immunology 1998; 160(3): 1219-23).
10. Seibert CW, Rahmat S, Krause JC 등의 "Recombinant IgA is sufficient to prevent influenza virus transmission in guinea pigs"(Journal of virology 2013; 87(14): 7793-804).
11. Lowen AC, Steel J, Mubareka S, Carnero E, Garcia-Sastre A, Palese P.의 "Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model"(J Virol 2009; 83(7): 2803-18).
12. Kim L, Liebowitz D, Lin K 등의 "Safety and immunogenicity of an oral tablet norovirus vaccine, a phase I randomized, placebo-controlled trial"(JCI Insight 2018; 3(13): e121077).
13. Liebowitz D, Lindbloom JD, Brandl JR, Garg SJ, Tucker SN.의 "High titre neutralising antibodies to influenza after oral tablet immunisation: a phase 1, randomised, placebo-controlled trial"(The Lancet infectious diseases 2015; 15(9): 1041-8).
14. Peters W, Brandl JR, Lindbloom JD 등의 "Oral administration of an adenovirus vector encoding both an avian influenza A hemagglutinin and a TLR3 ligand induces antigen specific granzyme B and IFN-gamma T 세포 responses humans"(Vaccine 2013; 31: 1752-8).
15. Liebowitz D, Gottlieb K, Kolhatkar NS 등의 "Efficacy and immune correlates of protection induced by an oral influenza vaccine evaluated in a phase 2, placebo-controlled human experimental infection study"(The Lancet infectious diseases 2020; 20: 435-44).
16. Yong CY, Ong HK, Yeap SK, Ho KL, Tan WS의 "Recent Advances in the Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus"(Front Microbiol 2019; 10: 1781).
17. Revaud J, Unterfinger Y, Rol N 등의 "Firewalls Prevent Systemic Dissemination of Vectors Derived from Human Adenovirus Type 5 and Suppress Production of Transgene-Encoded Antigen in a Murine Model of Oral Vaccination"(Front Cell Infect Microbiol 2018; 8: 6.)
18. Peng H, Yang LT, Wang LY 등의 "Long-lived memory T lymphocyte responses against SARS coronavirus nucleocapsid protein in SARS-recovered patients"(Virology 2006; 351(2): 466-75).
19. Amanat F, Stadlbauer D, Strohmeier S 등의 "A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans"(medRxiv 2020).
20. Gandhi G, Lydon P, Cornejo S, Brenzel L, Wrobel S, Chang H의 "Projections of costs, financing, and additional resource requirements for low- and lower middle-income country immunization programs over the decade, 2011-2020"(Vaccine 2013; 31 Suppl 2: B137-48).
21. Kissler SM, Tedijanto C, Goldstein E, Grad YH, Lipsitch M의 "Projecting the transmission dynamics of SARS-CoV-2 through the postpandemic period"(Science 2020; 368(6493): 860-8).
22. Kim L, Martinez CJ, Hodgson KA 등의 "Systemic and mucosal immune responses following oral adenoviral delivery of influenza vaccine to the human intestine by radio controlled capsule"(Scientific Reports 2016; 6(1): 37295).
23. Liebowitz D, Lindbloom JD, Brandl JR, Garg SJ, Tucker SN의 "High Titer Neutralizing Antibodies to Influenza Following Oral Tablet Immunization: A Randomized, Placebo-controlled Trial"(The Lancet infectious diseases 2015; 15: 1041-8).
24. Hird TR, Grassly NC의 "Systematic review of mucosal immunity induced by oral and inactivated poliovirus vaccines against virus shedding following oral poliovirus challenge"(PLoS pathogens 2012; 8(4): e1002599).
25. Jaiswal J, LoSchiavo C, Perlman DC의 "Disinformation, Misinformation and Inequality-Driven Mistrust in the Time of COVID-19: Lessons Unlearned from AIDS Denialism"(AIDS Behav 2020).
26. Palamenghi L, Barello S, Boccia S, Graffigna G의 "Mistrust in biomedical research and vaccine hesitancy: the forefront challenge in the battle against COVID-19 in Italy"(Eur J Epidemiol 2020).
27. Zhu FC, Li YH, Guan XH 등의 "Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial"(Lancet 2020; 395(10240): 1845-54).
28. Baden LR, Walsh SR, Seaman MS 등의 "First-in-Human Evaluation of the Safety and Immunogenicity of a Recombinant Adenovirus Serotype 26 HIV-1 Env Vaccine(IPCAVD 001)"(The Journal of infectious diseases 2012; 207(2): 240-7).
29. Kumar S, Maurya VK, Prasad AK, Bhatt MLB, Saxena SK의 "Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus(2019-nCoV) and SARS coronavirus(SARS-CoV)"(Virusdisease 2020; 31(1): 13-21).
30. Wan Y, Shang J, Graham R, Baric RS, Li F의 "Receptor Recognition by the Novel Coronavirus from Wuhan: an Analysis Based on Decade-Long Structural Studies of SARS Coronavirus"(Journal of virology 2020; 94(7)).
31. Zost SJ, Parkhouse K, Gumina ME 등의 "Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains"(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2017; 114(47): 12578-83).
32. Xu H, Zhong L, Deng J 등의 "High expression of ACE2 receptor of 2019-nCoV on the epithelial cells of oral mucosa"(Int J Oral Sci 2020; 12(1): 8).
33. Aylward B, Liang W의 "Report of the WHO-China Joint Mission on Coronavirus Disease 2019(COVID-19)"(WHO Report 2020).
34. Yeo C, Kaushal S, Yeo D의 "Enteric involvement of coronaviruses: is faecal-oral transmission of SARS-CoV-2 possible?"(Lancet Gastroenterol Hepatol 2020).
35. Han C, Duan C, Zhang S 등의 "Digestive Symptoms in COVID-19 Patients with Mild Disease Severity: Clinical Presentation, Stool Viral RNA Testing, and Outcomes"(American Journal of Gastroenterology 2020).
36. Muramatsu M, Yoshida R, Yokoyama A 등의 "Comparison of antiviral activity between IgA and IgG specific to influenza virus hemagglutinin: increased potential of IgA for heterosubtypic immunity"(PLoS One 2014; 9(1): e85582).
37. Sterlin D, Mathian A, Miyara M 등의 "IgA dominates the early neutralizing antibody response to SARS-CoV-2"(medRxiv 2020: 2020. 06. 10. 20126532).
38. Tamura S, Funato H, Hirabayashi Y 등의 "Cross-protection against influenza A virus infection by passively transferred respiratory tract IgA antibodies to different hemagglutinin molecules"(Eur J Immunol 1991; 21(6): 1337-44).
39. Le Bert N, Tan AT, Kunasegaran K 등의 "SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls"(Nature 2020; 584(7821): 457-62).
40. Ni L, Ye F, Cheng ML 등의 "Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals"(Immunity 2020; 52(6): 971-7 e3).
41. Tai W, Zhang X, Drelich A 등의 "A novel receptor-binding domain (RBD)-based mRNA vaccine against SARS-CoV-2"(Cell Res 2020).
42. Zha L, Zhao H, Mohsen MO 등의 "Development of a COVID-19 vaccine based on the receptor binding domain displayed on virus-like particles"(bioRxiv 2020: 2020. 05. 06.079830).
43. Mateus J, Grifoni A, Tarke A 등의 "Selective and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes in unexposed humans"(Science 2020: eabd3871).
44. Mercado NB, Zahn R, Wegmann F 등의 "Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques"(Nature 2020).
45. Mutua G, Anzala O, Luhn K 등의 "Safety and Immunogenicity of a 2-Dose Heterologous Vaccine Regimen With Ad26.ZEBOV and MVA-BN-Filo Ebola Vaccines: 12-Month Data From a Phase 1 Randomized Clinical Trial in Nairobi, Kenya"(J Infect Dis 2019; 220(1): 57-67).
46. Anywaine Z, Whitworth H, Kaleebu P 등의 "Safety and Immunogenicity of a 2-Dose Heterologous Vaccination Regimen With Ad26.ZEBOV and MVA-BN-Filo Ebola Vaccines: 12-Month Data From a Phase 1 Randomized Clinical Trial in Uganda and Tanzania"(J Infect Dis 2019; 220(1): 46-56).
47. Antrobus RD, Coughlan L, Berthoud TK 등의 "Clinical assessment of a novel recombinant simian adenovirus ChAdOx1 as a vectored vaccine expressing conserved Influenza A antigens"(Mol Ther 2014; 22(3): 668-74).
48. van Doremalen N, Haddock E, Feldmann F 등의 "A single dose of ChAdOx1 MERS provides broad protective immunity against a variety of MERS-CoV strains"(bioRxiv 2020: 2020. 04. 13. 036293).
49. Hassan AO, Kafai NM, Dmitriev IP 등의 "A single intranasal dose of chimpanzee adenovirus-vectored vaccine confers sterilizing immunity against SARS-CoV-2 infection"(bioRxiv 2020: 2020. 07. 16. 205088).
50. He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J, Kinzler KW, Vogelstein B의 "A simplified system for generating recombinant adenoviruses"(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1998; 95(5): 2509-14).
51. Guthe S, Kapinos L, Moglich A, Meier S, Grzesiek S, Kiefhaber T의 "Very fast folding and association of a trimerization domain from bacteriophage T4 fibritin"(J Mol Biol 2004; 337(4): 905-15).
52. Tucker SN, Lin K, Stevens S, Scollay R, Bennett MJ, Olson DC의 "Systemic and mucosal antibody responses following retroductal gene transfer to the salivary gland"(Mol Therapy 2003; 8: 392-9).
53. Tan CW, Chia WN, Qin X 등의 "A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein-protein interaction"(Nat Biotechnol 2020).
실험예 6
연구 VXA-COV2-101은 실험예 6 및 실험예 7에서 VXA-CoV2-1로 언급되고, 연령의 건강한 성인 대상들에게 투여되었던 SARS-CoV-2 경구 정제 백신(rAd-S-N, SEQ ID NO: 8)의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 1상의 개방 표지의 도스 범위 시험이었다.
본 연구의 목적들은 장용 정제로 전달된 VXA-CoV2-1 경구 백신의 전성 및 면역원성을 평가하는 것이었다.
대상들은 남부 캘리포니아에서 단일의 1상 단위로 등록되었다. 선별 평가 및 적격성 승인의 완료에 이어서 35의 대상들이 이러한 시험에 등록되었고, 코호트(cohort) 1 파수 대상들(n=5)은 1일에 예방 접종되었고, 29일에 반복 도스를 가졌다. 코호트 2 및 코호트 3 대상들은 1일에 단일의 예방접종을 받았다. 연구 설계을 다음의 표에 나타낸다.
VXA-COV2-101 연구 설계
코호트 1 파수 대상들은 29일에 첫 번째와 동일한 도스 레벨로 두 번째 도스(추가 접종)를 받았다.
B 세포/항체 분석
높은 항체를 형성하는 잠재성을 가지는 B 세포들의 증진에서 VXA-CoV2-1의 능력이 흐름 세포측정법을 기반으로 하는 측정들 및 ELISPOT에 의한 항체 분비 세포(ASC) 분석을 이용하여 평가되었다. 예방접종에 반응하는 B 세포들이 자극의 부위 및 국소 배출 림프절들에서 활성화되며, 이에 따라 이들이 배 중심 반응에 후속하여 형질모세포들 내로 분화되는 점은 이전에 잘 구현되어 왔다. 면역화 후의 6주 내지 8주 사이에서, 상당한 비율의 형질모세포들이 상기 배 중심들을 떠나고, 일시적으로 말초 순환에 나타남으로써, 이들은 백신 항원 특이적 항체 분비 세포(ASC)들에 대해 매우 농후화되는 것으로 발견될 수 있다. 이에 따라, 상기 VXA-COV2-101 연구에서 예방접종 전 및 예방접종 후에 수집된 고정된 전체 혈액 샘플들의 흐름 세포측정 분석은 베이스라인 레벨들에 비해 2-폴드 또는 이보다 높은 형질모세포 빈도들의 증가를 보여주는 대략 70%(24/35)의 백신들로 예방접종에 후속하여 8일에서 전체적인 CD27++ CD38++ 형질모세포 집단에서 상당한 확장을 나타내었다(도 9a-도 9b). 추가적인 조사는 특히 보다 높은 도스 레벨로 VXA-CoV2-1을 수용하였던 코호트에서 예방접종 후에 순환하는 형질모세포들의 표면상에서 IgA 및 점막 회귀 수용체 α4β7 모두의 상향 조절을 나타내었으며(도 9c), 이에 따라 점막 조직들에 대한 이러한 IgA를 생성하는 B 세포 집단의 백신 유도 이동을 제시하였다(Mora 및 von Andrian(2008)). 전체적으로, 이들 결과들은 사람들에서 2상 인플루엔자 A 시험감염사 연구의 내용에서 회사가 공개한 이전의 데이터와 부합되며, 여기서 경구 인플루엔자 예방접종이 수반되어 유사한 점막 특징들을 가지는 형질모세포의 발생이 백신 유도 보호의 강한 지표가 되는 것으로 발견되었다(Liebowitz 등(2020)).
또한, ELISpot 분석이 상기 SARS-CoV-2 스파이크(S) 항원의 S1 도메인을 인식하고 결합될 수 있는 순환 항체 분비 B 세포들을 유도하는 VXA-CoV2-1의 능력을 측정하는 데 이용되었다. 이러한 분석은 베이스라인 레벨들 보다 4-폴드 증가된 전체적인 중앙값으로 첫 번째 면역화 이후의 8일에서 S1-반응성 IgA-분비 ASC의 상당한 백신 유도 발생(윌콕슨(Wilcoxon) 검정에 의해 p=0.0002)을 나타내었다(도 9d). 보다 상세하게는, 1일과 8일 모두에서 ASC 측정들이 이용될 수 있었던 보다 낮은 보스의 백신 그룹들에서 8/12(67%)의 대상들이 예방접종 전의 레벨들(2.67의 중앙값 폴드 증가; 95% CI: 1.0-13.32)에 대해 일 백만의 세포들마다 예방접종 후의 8일에서 IgA-분비 ASC 숫자들의 중앙값 2-폴드 또는 그보다 높은 증가에 의해 나타난 바와 같이 여기서는 "반응자(responder)들"로 분류되었다. 반응자들의 약간 높은 퍼센티지(11/15 대상들, 73%)가 보다 높은 백신 도스 코호트에서 기록되었다(4의 중앙값 폴드; 95% CI: 1.3-13.32).
다른 SARS-CoV-2 항원들에 특이적인 IgA 항체들의 레벨들이 중규모 디스커버리(Meso Scale Discovery: MSD) 플랫폼을 이용하여 면역화 이전 및 이후에 혈청, 침 및 콧물 샘플들에서 측정되었다. 흐름 세포측정 및 ELISPOT를 통해 관찰된 B 세포 반응들의 점막 특징들과 일치하여, SARS-CoV-2 스파이크(S), 뉴클레오단백질(N) 및 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)를 표적으로 하는 IgA 항체들이 혈청 및 점막 구획들 모두에서 발견될 수 있었다. 전체적으로, 23%(8/35)의 백신들이 29일에 혈청 내에서 50% 또는 그 이상의 백신-특이적 IgA 증가를 보였으며, 분석에서 6/8의 대상들이 모두 셋의 SARS-CoV-2 항원들을 표적으로 하는 IgA를 생성하였다. 상기 IgA+ B7+ 형질모세포 측정들과 부합되어, 보다 높은 도스 코호트 내의 대상들은 혈청에서 S에 특이적인 보다 높은 IgA 항체 반응들을 보여주었다(도 9). 본 발명자들이 예상하였던 바와 같이, 정해진 VXA-CoV2-1 경구 백신 후보 물질의 고유한 특성들이 점막 구획들 대 혈청에서 SARS-COV-2-특이적 IgA 항체 반응들을 가지는 백신들의 높은 퍼센티지로 나타났고, 침 및 콧물 샘플들에서 2-폴드 또는 그 이상의 높은 점막 IgA의 증가에 도달되었으며(도 9f), 보다 상세하게는, 10/35(29%)의 백신들이 이들의 침에서 2-폴드 또는 그보다 높은 IgA 항체들의 증가를 가졌던 반면, 12/35(35%)가 예방접종 후의 29일에 이들의 콧물 구획에서 동일한 임계값에 도달하였다. 둘의 도스 그룹들 사이의 상기 침 또는 콧물 샘플들에서 백신-특이적 IgA 반응들의 유의미한 차이들은 관찰되지 않을 수 있었다(도 9f). 중화시키는 IgA의 능력을 측정하는 것은 점막 샘플들의 한계들로 어렵지만, 일차적인 발견들은 상기 대상들이 특이적 콧물 IgA의 2-폴드 증가를 가졌고, 스파이크 단백질에 대한 ACE2결합을 측정하였던 대용 중화 분석에서 중화시키는 능력을 가졌던 점을 제시하고 있다(도 9f). 분비성의 IgA는 Sterlin 등(Sterlin 등(2021))에 의해 보고되었던 바와 같이 SARS-CoV-2에 대해 보다 높은 중화시키는 능력의 IgG를 가졌던 것을 보여주었다.
몇몇 보고들이 COVID-19에 대한 보호에 기여하는 데 점막 면역의 잠재성 및 IgA 항체들의 발생을 강조하였기 때문에 이들 발견들은 유망하였다(Ejemel 등(2020); Russell 등(2020); Sterlin 등(2021)). 특히, 주사 가능한 백신들은 호흡기 점막 내에서 IgA 항체들을 효과적으로 유도하도록 설계되지 않는 반면, 경구 예방접종 계획들은 이러한 이점을 제공할 수 있었다(Jeyanathan 등(2020)). 중요 점막 표면들에서의 SARS-CoV-2-특이적 IgA 반응들의 도입도 안정화 면역을 유도할 수 있었고, 특히 새로운 SARS-CoV-2 변이체들이 검출되지 않았던 예방 접종된 대상들에서 복제될 수 있는 상황에서 매우 바람직한 특성들인 보다 큰 바이러스 전파를 차단하는 능력을 가질 수 있었다.
혈청 예방접종 후에 IgG 항체들의 분석은 SARS-CoV-2 특이적 항체 반응들의 증가의 부존재를 나타내었다. 유사하게, 혈청에서 상당한 SARS-CoV-2 항체 매개 중화는 관찰되지 않았다. 혈청에서 백신-특이적 IgG 및 항체 중화의 결핍에 대한 지저 원인들은 현재는 정의되지 않고 있지만, 본 연구에서 사용된 도스 레벨들로 VXA-CoV2-1의 단일의 경구 도스가 강한 백신-특이적 IgG 중화 반응들을 유도하기에는 충분하지 않았을 가능성이 있다. 또한, VXA-CoV2-1 구조체 내의 N에 대해 인코딩하는 유전자의 존재가 T 세포-매개 면역을 향한 혈청 중화 항체들로부터 멀어지게 이러한 백신 후보 물질의 면역원성 프로파일을 왜곡할 수 있는 점을 배제할 수 없다.
T 세포 분석
VXA-CoV2-1이 항-바이러스 CD4 및 CD8 T 세포들을 유도하였는지를 결정하기 위해, PBMC들이 상기 S 및 N 단백질들의 전체 길이의 서열의 SARS-CoV-2 중첩 펩티드 풀들로 자극되었으며, 항-바이러스 시토카인인 인터페론 감마(IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFa)의 방출이 측정되었다. 중요한 점은, IFNγ 및 TNFa가 항-바이러스 보호의 상호 연관들로 확인되었던 것이다(Madedonas 등의 "Springer Semin Immunopathol"(28: 209-219, 2006); Precopio 등의 "J. Exp Med"(204: 1405-1416, 2007)). 유사하게, IFNγ 및 CD107a의 결합이 잠재적 세포독성 세포들의 신호로서 확인되기 때문에(Soghoian 등의 "Sci Transl Med"(4: 123ra125, 2012)), 탈과립 마커 CD107a가 추가적으로 분석되었다.
본 발명자들은 VXA-CoV2-1의 단일 경구 도스로의 예방접종이 0일의 베이스라인 레벨들과 비교하여 S에 반응하여 7일에서 IFNγ, TNFa 및 CD107a를 발현시키는 CD8+S-특이적 T 세포들의 통계적으로 유의미한 증가를 유도하였던 것을 발견하였다(도 10a). 동일한 데이터의 도스 반응 도표도 도시된다(도 12a).
또한, 다기능성이 IFNγ 및 TNFa의 S-특이적 이중 발현을 측정함에 의해 평가되었으며, 본 발명자들은 7일 대 0일에서 세포들을 생성하는 IFNγ/TNFa 모두를 생성하였던 T 세포들의 양의 상당한 증가를 관찰하였다(도 10b). 다기능성은 특히 예방 접종에서 보호의 상호 연관으로 여겨진다(앞서의 문헌들인 Makedonas 등(2006); Precopio 등(2007)). 이에 따라, 이중 IFNγ 및 TNFa 분비 CD8 T 세포들에서 상당한 증가는 항-바이러스 반응을 발생시키는 데 의미 있는 상당한 진보를 나타낸다. 대략 25%의 대상들에서 예방접종 후의 7일에 강한 항-바이러스 반응과 부합되는 다기능성 CD8 S-특이적 T 세포 반응이 진행되었다(도 10c). CD8 T를 발현시키는 시토카인의 강한 증가가 S-특이적이었고, 예방접종 후의 보편화된 감염의 결과가 아닌 것을 보이기 위해, 세포들은 EBV, CMV 및 인플루엔자 펩티드들(CEF)의 펩티드 풀로 병렬로 자극되었고, IFNγ 발현에 대해 흐름 세포측정법으로 측정되었다(도 10d). 상기 S 펩티드 반응들과는 다르게, CEF 펩티드 자극 IFNγ 반응들은 예방접종 이전 및 이후에 변화되지 않고 남았다.
VXA-CoV2-1 유도 CD8 T 세포 반응들은 본 연구에서 측정된 좁은 도스 범위에서 도스 효과를 향하는 경향을 보이지 않았으므로(도 12a), VXA-CoV2-1의 두 도스 레벨들로부터의 대상들이 상기 CD8 반응들의 통계적 분석을 위해 결합되었다. 추가 접종되었고, 분석을 위해 이용될 수 있는 PBMC들을 가졌던 4의 대상들이 시간에 걸쳐 IFN-γ 반응들에 대해 모니터되었으며(도 12b), T 세포 반응들이 제2 면역화로 유지되었거나 추가되었던 것을 입증하였다.
또한, N에 대한 T 세포 반응들은 S보다는 적은 정도까지만 몇몇 개인들에서 증가되었다(도 12d, 도 12e). IFNγ+ CD107a+ 세포독성 CD4 T 세포들은 바이러스 제어에서 CD8 T 세포들을 증가시키는 능력을 가진다. 비록 상당하지는 않았지만, 백신들도 세포독성 능력들을 가졌던 S-특이적 CD4 T 세포들의 증가를 보여주었다(도 12c). IFNγ+ CD107a+ 세포독성 CD4 T 세포들이 바이러스 대조군에서 CD8 T 세포들을 증가시키는 능력을 가지는 점은 이전에 나타났었다(Johnson 등의 "J. Virol"(89: 7494-7505, 2015)).
항바이러스 T 세포들은 사람의 지역적 코로나바이러스들과 교차 반응한다.
지역적인 코로나바이러스들을 향한 VXA-CoV2-1 유도 면역 반응의 교차 반응성을 평가하기 위해, 아홉의 VXA-CoV2-1 예방 접종된 대상들로부터의 PBMC들이 세포내 염색을 통해 측정된 IFNγ 방출을 가지는 넷의 지역적인 사람 코로나바이러스들(HCoV)(229E, HKU1, OC43 및 NL63)의 S 및 N 단백질들로부터의 펩티드 라이브러리들로 자극되었다. PBMC 샘플들은 이용 가능성 및 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 이전의 T 세포 반응들에 기초하는 평가를 위해 선택되었다. IFNγ 분비 CD8 T 세포들의 증가가 모두 넷의 지역적 HCoV에 대해 예방접종 전의 레벨들과 비교하여 검출되었으며(도 10e), 상기 VXA-CoV2-1 유도 T 세포들이 순환하는 지역적 HCoV와 교차 반응하는 점을 제시하였다.
실험예 7
경구 예방접종은 보다 큰 규모의 T 세포들을 유도한다.
VXA-CoV2-1에 의해 유도되는 반응들을 근육 내(IM)의 mRNA 코비드 백신들과 비교하기 위해, 본 발명자들은 혈액 샘플들이 제공되도록 EUA 하에서 mRNA 백신들로 예방 접종되었던 이력이 있는 지원자들을 모집하였다. PBMC들은 예방접종 전 및 예방접종 후의 7일에 본 발명자들의 백신들과 동일한 시점들에서 취해졌으며, T 세포 활성은 상기 VXA-CoV2-101 시험으로부터의 PBMC들과 함께 동일한 생체 외의 분석으로 측정되었고, 분석 가변성에 대한 제어를 위해 동일한 분석이 수행되었다.
상기 VXA-CoV2-1 정제들을 받았던 대상들은 화이자 백신(bnt162b1) 또는 모데나 백신(mRNA-1273)으로 예방 접종되었던 경우들보다 몇몇 폴드 높았던 T 세포 반응들을 가졌다. CD8+T 세포들로부터의 IFNγ 방출은 p=0.0283(bnt162b1) 및 p=0.061(mRNA-1273)로 상당히 증가되었고(도 11a), TNFa 및 CD107a는 예방접종 전의 베이스라인 위의 보다 적은 증가를 보였다. 백신들에 대한 CD8+ T 세포들로부터의 IFNγ의 0일 위의 평균 퍼센트 증가는 bnt162b1/mRNA-1273/VXA-CoV2-1 백신들에 대해 각기 0.4/0.09/2.3이었다. 이러한 양들은 VXA-CoV2-1 정제들 대 IM 백신들을 받았던 경우들의 ＞5 폴드 증가였다.
작은 하위 집단만이 다른 백신들과 동일한 분석으로 테스트되었기 때문에, 대상 선택에서 잠재적인 편향을 설명하기 위해 이전에 측정된 전체 코호트가 결합된 mRNA 백신들에 대해 여전히 보였던 유의성(p=0.0066)으로 비교를 위해 함께 그래프로 구성되었다(도 11b). 비-반응자들을 포함하여 전체 코호트의 평균은 상기 IM 백신들 위로 보였던 ＞3.5-폴드 증가인 1.5%의 S 특이적 IFNγ+ CD8 T 세포들이다. 비교를 위해, 본 발명자들은 SARS-CoV-2로 이전에 감염된 대상들(회복기)의 반응도 측정하였고, 여기서 4의 회복기 대상들의 평균 IFNγ 반응은 0.8%의 S 특이적 IFNγ+ CD8 T 세포들이었다. 상기 IM 백신들로부터의 보고된 T 세포 측정들이 제2 도스 백신 이후의 7일에 취해졌으므로(Sahin 등의 "Nature"(2021)), PBMC들도 동일한 분석에서 제2 도스 후의 7일에 측정되었으며, 특히 우수한 반응들을 가졌던 하나의 대상을 제외하면 두 시점들에서 동일한 규모의 반응들을 가지는 것으로 발견되었다(도 11c). bnt162b로의 예방접종 후의 T 세포 반응들의 크기는 제2 도스 후의 7일에 Sahin과 동료들에 의해 보고된 데이터와 유사하다("Nature"(2021)). 백스아트 시험에서 작은 코호트(n=5)가 VXA-CoV2-1의 2 도스들을 수용하였고, CD8+ T 세포 IFNγ 퍼센티지들은 제2 도스 후의 7일에서 유지되었거나 증가되었다(도 12b). VXA-CoV2-1을 수용하였던 대상들에서 CD4 T 세포 반응들도 mRNA-1273 및 bnt162b 대상들과 비교할 때에 상당히 높았다(도 13b).
대상들이 예방접종 상태의 자가 보고에 의존하는 변화되는 면역 반응들과 연구를 지닐 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 ELISA를 통해 항-S 항체 반응들을 측정하였고, bnt162b1 및 mRNA-1273 모두로부터 이들 개인들의 예방접종 상태를 확인하고, 관찰된 보다 낮은 T 세포 반응들이 백신 투여의 결핍으로 인한 것이 아니었던 것을 입증하는 강한 항-S 항체 반응들을 관찰하였다(도 13a).
T 세포 분석들의 요약-실험예 6 및 실험예 7
실험예 7에 제시된 연구에서, 실질적인 항-바이러스 T 세포 반응들이 상기 mRNA 백신들로 관찰된 경우보다 높은 빈도들로 경구 면역화 후에 보고되었다. VXA-CoV2-1 및 mRNAs와 같은 계놈계 백신들은 생체 내의 MHC-I 및 MHC-II와 함께 항원의 표출 때문에 실질적인 T 세포 활성화를 유도할 것으로 예측된다. 그러나, 상기 경구 백신이 본 발명자들의 연구에서 보다 우수하게 진행되었다. 한 가지 현저한 차이는 상기 N 단백질이 VXA-CoV2-1 내에 제시되지만, mRNA 백신 내에는 제시되지 않은 점이다. 비록 이전에 향상된 항원 표출과 연관되지는 않았지만, N은 인터페론 유도 경로들에 영향을 미치는 것 및 TRIM21을 활성화시키는 것을 포함하여 다중의 생리학적 기능들을 가지는 것으로 알려져 있다(Caddy 등의 "EMBO J 40"(e106228, 2021)); Mu 등의 "Cell Discov 6"(65, 2020)). 이론에 의해 구속받지 않고, 비록 본 발명자들이 이러한 플랫폼으로는 다른 표지들에 대해 이러한 규모의 T 세포 반응들을 볼 수는 없었지만, 상기 VXA-CoV2-1에 사용된 TLR-3 작용제는 수지상 세포들을 성숙시켜 T 세포 활성화를 향상시킬 수 있으며, 교차 표출을 증진시키고, 세포독성 T 세포들에 의한 항-바이러스 반응들을 작동시킨다(Weck 등의 "Blood"(109: 3890-3894, 2007)).
예방접종 후의 SARS-CoV-2에 대한 T 세포 반응들이 다중의 다른 연구들에서 측정되었다. 상기 Bnt162b2 백신으로의 예방접종에 따라, CD38, CD39 및 PD-1를 발현시키는 T 세포들의 활성화 및 가동화가 관찰되었다(Oberhardt 등의 "Nature"(2021)). 본 발명자들의 백신은 관찰된 이들 마커들의 증가뿐만 아니라 HLA-DR+CD38+ T 세포 집단들의 증가로 유사한 결과들을 생성하였다. CD38+ HLA-DR+ T 세포들은 바이러스 감염에서 관찰되며, 인플루엔자에서 보이는 바와 같이 이차 시험감염에 따라 기억 반응들의 최적의 소환을 필요로 한다(Jia 등의 "Clin Transl Immunology"(10: e1336, 2021)). SARS-CoV-2에서, CD38+HLA-DR+CD8 T 세포들은 IFNγ 반응들과 상호 연관되었으며, 혈액암이 있는 COVID-19 환자들의 생존과 관련되었다(Bange 등의 "Nat Med"(27: 1280-1289, 2021)).
교차 반응성의 측면에서, T 세포 반응들은 HCoV의 다른 종들에 대해서도 강한 것으로 발견되었으며, HCoV 교차 반응성 T 세포들의 숫자의 실질적인 증가를 보였다. 항체 반응들이 출현하는 모든 변이체들에 대해 충분하게 교차 반응을 할 수 없기 때문에, T 세포 반응들은 이러한 세계적인 유행병에서 갈수록 중요한 역할을 수행할 수 있으며, 여기서 주사된 허가 받은 백신들이 혈청 항체들의 효과 있는 유도자들이 된다. 반응들이 넓은 범위의 에피토프들까지 이루어지는 T 세포 면역우세 계층들의 성질로 인하여, 공개적 및 개인적 클론형들 모두가 생성된다(Shomuradova 등의 "Immunity"(53: 1245-1257 e1245, 2020); Snyder 등의 "medRxiv"(2020, 2007. 2031. 20165647(2020)). 또한, T 세포들은 변이체들에 대해 보다 저항성을 가가지고, 교차 보호될 가능성이 있다(Johnson 등의 "J Immunol"(194: 1755-1762, 2015); da Silva 등의 "medRxiv"(2021); Tarke 등의 "Cell Rep Med 2"(100204, 2021)). 중화 항체들은 좁은 범위의 에피토프들을 표적으로 하므로, 선택 압력으로 인해 야기되는 돌연변이들은 백신 효능을 감소시키는 경향이 있지만, T 세포 반응들을 이탈하지는 않는다. 이는 변이체 균주들로의 T 세포 면역에 적은 영향이 있는 것을 보여주는 SARS-CoV-2로 입증되었다(Tarke 등의 "supra"(2021); Alter 등의 "Nature"(596: 268-272, 2021); Tarke 등의 "bioRxiv"(2021)).
상기 세계적인 유행병 동안에 조기에 수행된 처음 반응자들의 예비 연구에서, 백신들과 널리 확산되는 감염들이 일어났기 이전에 임상적 성과에 대한 대부분의 중요한 상호 연관성은 항체 레벨들 보다는 T 세포 반응들의 이미 존재하는 크기였다(Wylie 등의 "medRxiv"(2020. 2011. 2002. 20222778, 2021). 항체들이 mRNA 백신들의 실질적인 효능을 위해 상호 연관될 가능성이 있지만(Gilber 등의 "medRxiv"(2021)), 상기 Bnt162b2 백신에 대한 연구들은 중화 항체들이 이와 같은 시점에서 검출될 수 없었던 점에도 불구하고 한 번의 도스가 12일만큼 빠르게 일부 보호를 유도하였던 것을 보여주었으며, T 세포 매개 면역이 보호에서 이른 역할을 수행할 수 있는 점을 제시하였다(Kalimuddin 등의 "Med(NY)"(2: 682-688 e684, 2021)). Bnt162b2에 의해 유도되는 S-특이적 T 세포들은 CD38의 발현을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 본 발명자들이 흐름 세포측정 표현형 분석을 통해 얻은 데이터와 일치한다. 마지막으로, 항체들이나 B세포들을 만드는 능력이 없는 사람들이 SARS-CoV-2에 대해 성공적인 면역 반응들을 구비할 수 있고, 감염의 정상적인 과정을 가지는 것으로 나타난다(Meyts 등의 "J. Allergy Clin Immunol"(147: 520-531, 2021)). 또한, 혈액암이 있는 환자들에서 CD8 T 세포들이 생존과 상호 연관되는 것으로 나타났다(Huang 등의 "Res Sq"(2021)).
이미 완전하게 예방 접종된 사람들도 감염시킬 수 있는 SARS-CoV-2의 다중 변이체들의 증가는 가능한 이종의 추가 접종 계획들로 현재의 보호를 보완하기 위한 새로운 접근 방식들이 필요한 상황을 발생시킨다.(Barros-Martins 등의 "Nat Med"(27: 1525-1529, 2021)). 6개월-8개월마다 필요한 어떤 백신은 부유한 국가들에서는 실시하기 어려울 수 있으며, 세계의 대다수에서 거의 불가능할 수 있다. 또한, 변이체들은 혈청 반응들을 피하기 때문에 점막 회귀 T 세포들을 생성하는 능력이 확산과 전파를 감소시키는 데 매우 중요하게 될 수 있다. 변이체들 에 대해 교차 보호성의 반응을 생성하고, 분배되기에 용이한 경구 정제는 범세계적인 접근에 영향을 미치는 중요한 문제를 해결할 수 있다.
결론적으로, VXA-CoV2-1로의 경구 면역화는 항-바이러스 SARS-CoV-2 특이적 T 세포들을 유도한다. 유도되는 IFNγ를 생성하는 CD8+ T 세포들의 레벨은 현재 COVID-19에 대해 사용되고 있는 IM mRNA 백신들 보다 큰 규모이다. 또한, 이들 T 세포들은 넷의 지역적인 사람 코로나바이러스들에 대해 교차 반응적이며, 이러한 백신이 출현되는 세계적 유행의 코로나바이러스들의 넓은 배열에 대해 교차 보호를 제공할 수 있는 것을 나타낸다. T 세포들이 사망과 중증의 감염에 대해 보호하는 데 중요할 수 있기 때문에, 본 발명자들의 백신 후보 물질은 현재의 것과 미래의 것들인 세계적인 유행병과 싸우기 위한 관리자에게 용이한 범세계적인 백신 계획을 제공할 수 있다.
방법들: 실험예 6 및 실험예 7
T 세포 면역원성 분석
PBMC들은 해동되었고, 하룻밤 동안 두어졌으며, 브레펠딘(Brefeldin) A(인트로겐(Invitrogen)), 모넨신(Monensin)(바이오레전드(Biolegend)), 그리고 CD107a-알렉사(Alexa)488(클론 H4A3)(써모피셔사이언티픽)의 존재 하에서 SARS-CoV-2(Miltenyi)의 또는 지역적인 인간 코로나바이러스들(JPT)의 S 혹은 N 펩티드 라이브러리들로 5시간 동안 37℃에서 96웰의 둥근 바닥 플레이트 내에서 1 x 10^7 세포들/㎖의 농도로 임무노쿨트(Immunocult) 배지(스템셀 테크놀로지즈(Stemcell Technologies)) 내에서 배양되었다. 세포들은 수확되었고, 표면은 CD4-BV605(클론 OKT4), CD8-BV785(클론 RPA-T8), 그리고 좀비(zombie) 근-IR 생존력 염료(바이오레전드)로 염색되었다. 4% PFA(바이오티움(Biotium))로 고정하고, 시토페름(Cytoperm)(BD 바이오사이언시즈)으로 투과시킨 후, 상기 시토카인인 IFNg-BV510에 대한 항체들(클론 B27)(바이오레전드), TNFa-e450(클론 Mab11)(써모피셔사이언티픽), IL-2-APC(클론 MQ1-17H12)(써모피셔사이언티픽), IL-4-PerCP5.5(클론 8D4-8)(바이오레전드), IL-5-PE(클론 JES1-39D10)(바이오레전드), 그리고 IL-13-PE-Cy7(클론 JES10-5A2)(바이오레전드)이 세포내 시토카인 반응을 평가하기 위해 이용되었고, 어툰(써모피셔사이언티픽) 흐름 세포측정기를 이용하여 분석되었다. 데이터 분석은 플로우조(Flowjo), 엑셀 및 그라패드 프리즘(Graphpad Prism)에서 수행되었다.
임상 프로토콜
1상 임상 연구인 임상 시험.org NCT04563702가 둘의 다른 도스 레벨들(1 x 1010 I.U. 및 5 x 1010 I.U.)로 35의 대상들에서 백신(VXA-CoV2-1로 표기됨)의 안정성과 면역원성을 평가하기 위해 설계되었다. 5의 파수들이 첫 번째로 복용하였고, 백신 유도 독성들에 대한 모니터링의 1주 후에 치료되는 코호트 내의 나머지 대상들은 4의 플라시보(placebo) 대조군들로 무작위로 추출되었다. 낮은 도스 그룹 내의 5의 대상들만이 추가 접종되었고, 모든 다른 대상들에게는 VXA-CoV2-1의 1 도스가 주어졌다.
PBMC 분리, 냉동 보존 및 해동
VXA-CoV2-101 시험을 위해 PBMC들이 시험 대상의 혈액으로부터 분리되었고, WCCT로 현장에서 추출되었다. 비교 연구를 위해 PBMC들은 훈련된 사혈 전문의에 의해 취해진 혈액으로부터 추출되었다. 혈액은 헤파린 바쿠테이너(Vacutainer)® 튜브들(BD, 프랭클린 레이크시, 뉴저지주)에서 수집되었고, PBMC들이 같은 날에 류코셉(Leucosep) 튜브들(그레이니어 바이오 원(Greinier bio one)) 및 피콜 페이크 플러스(Ficoll Paque Plus)(시티바(Cytiva))를 이용하여 분리되었다. PBMC들은 분석의 시간까지 액체 질소 중에 저장되기 이전에 -80℃에서 쿨 셀(Cool Cell)(코닝(Corning)) 내에서 10% DMSO가 있는 FBS 중에 냉동되었다. 세포들은 제조업자(셀룰라 테크놀로지 주식회사(Cellular Technology Ltd)(CTL), 셰이커 하이츠시, 오하이오주)의 지시들에 따라 혈청이 없는 시약들을 이용하여 해동되었다.
백신
VXA-CoV2-1은 CMV 프로모터의 제어 하의 전체 길이의 SARS-CoV-2 S 유전자 및 인간 베타-액틴 프로모터 제어 하의 전체 길이의 SARS-CoV-2 N 유전자를 포함하는 rAd5 벡터이다. rAd5 백신 구조체들은 젠뱅크 수탁 번호 MN908947.3호로 공공적으로 입수할 수 있는 SARS-CoV-2의 공개된 DNA 서열에 기초하여 생성되었다. SARS-CoV-2 S 및 상기 SARS-CoV-2 N의 공개된 아미노산 서열들은 경구 rAd 정제들에 대한 이전의 임상 시험들에 사용된 동일한 벡터 골격을 이용하여 아데노바이러스 5형의 E1 부위 내로 복제되는 전이유전자들을 포함하는 재조합 플라스미드들을 생성하는 데 이용되었다2. 모든 백신들은 Expi293F 서스펜션 세포주(써모피셔사이언티픽) 내에서 성장되었고, CsCl 밀도 원심 분리에 의해 정제되었다.
비교 연구
비교 연구들을 위해, PBMC들이 예방접종 이전(0일), 제1 도스 후의 7일(7일) 및 제2 도스 후의 7일(추가 접종 후)에 bnt162b1(BioNT-화이자) 또는 mRNA-1273(모데나) mRNA 백신들을 수용하도록 계획되었던 건강한 개인들로부터 수집되었다. 모든 대상들은 상기 백신을 수용하기 이전 및 2의 다른 시점들인 제1 도스 후의 7일 및 제2 도스 후의 7일에 혈액 공여에 서명하고, 고지 받았으며, 동의하였다. 예방접종 상태를 확인하기 위해, mRNA 예방 접종된 대상들로부터의 혈청들이 0일 및 28일에 수집되었다.
질량 세포측정
초기 처리를 위해, 750㎕의 헤파린 처리된 혈액은 1050㎕의 스마트 튜브 프로테오믹 스태빌라이저(Smart Tube Proteomic Stabilizer)(스마트 튜브사(Smart Tube Inc.) 카트(cat) #PROT1)와 혼합되었고, 11분 동안 실온에서 배양되었으며, 이후에 드라이아이스 상에서 신속하게 냉동되었고, -80℃에서 저장되었다. 냉동된 샘플들은 후속되는 분석을 위해 드라이아이스 상에 선적되었다.
각 공여자로부터의 둘의 샘플들이 -80℃의 저장으로부터 얼음물 배스로 옮겨졌고, 재현탁되었으며, 적혈구 용해를 위해 1X 해동-용해 완충액(스마트 튜브사, 카트# THAWLYSE1) 중에서 두 번 세척되었다. 적혈구 용해에 이어서, 세포들은 계수되었고, 1.5 x 106 세포들이 96-웰 블록 내에 수동으로 정렬되었다. 샘플들은 이전에 설명된 로봇 시스템에 의해 팔라듐 금속으로 20-플렉스 계획으로 바코드가 부착되었다38 39. 상기 바코드가 부착된 샘플들에 대해 후속되는 염색 단계들이 수동으로 수행되었다. 바코드가 부착된 세포들은 Fc-블록(휴먼 트루스테인(Human TruStain) FcX, 바이오레전드 카트 # 422302)으로 실온에서 처리되었고, 세포 염색 배지(0.5% BSA 및 0.02% 아지드나트륨을 포함하는 PBS)로 한 번 세척되었고, 세포 염색 배지 내에서 30분 동안 표면 항체들로 염색되었다. 표면 항체 염색에 이어서, 세포들은 얼음 냉각된 100%의 메탄올(써모피셔, 카트# A412-4)로 투과되었고, 세척되었으며, 60분 동안 세포내 항체들로 염색되었다. 세포내 염색 후, 세포들은 세척되었고, 이리듐 삽입제(플루이다임(Fluidigm), 카트# 201192B) 및 1.6% 파라포름알데히드(써모피셔, 카트# 50-980-487)를 포함하는 용액 내에 재현탁되었다. 질량 세포측정기 상에서의 샘플 분석 이전에, 샘플들은 세척되었고, 1X 4 요소 정규화 비드들(140/142Ce, 151/153Eu, 165Ho, 175/176Lu)(플루이다임, 카트# 201078) 내에 재현탁되었다. 수집된 데이터는 모든 바코드가 부착된 샘플들에 걸쳐 정규화되었고, 앞서 설명한 바와 같이 바코드가 제거되었다40.
S1 ELISA
S1 특이적 항체들은 바이오레전드의 레전드 맥스 휴먼(Legend Max Human) IgG ELISA 키트를 이용하여 측정되었다. ELISA는 제조업자의 지시들에 따라 실행되었다.
통계
통계적 분석들은 그라패드 프리즘 v9 소프트웨어를 이용하여 수행되었다. 각 특이적 테스트는 도면의 범례들에 표지된다. ≤0.05의 P 값들은 유의미한 것으로 간주되었다. 막대그래프들은 평균들 및 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
실험예 6-실험예 7에서 언급된 참조 문헌들
Ejemel, M., Li, Q., Hou, S., Schiller, Z.A., Tree, J.A., Wallace, A., Amcheslavsky, A., Kurt Yilmaz, N., Buttigieg, K.R., Elmore, M.J. 등의 "A cross-reactive human IgA monoclonal antibody blocks SARS-CoV-2 spike-ACE2 interaction"(Nat Commun 11, 4198(2020)).
Grifoni, A., Weiskopf, D., Ramirez, S.I., Mateus, J., Dan, J.M., Moderbacher, C.R., Rawlings, S.A., Sutherland, A., Premkumar, L., Jadi, R.S. 등의 "Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals"(Cell 181, 1489-1501 e14159(2020).
He, X.S., Sasaki, S., Narvaez, C.F., Zhang, C., Liu, H., Woo, J.C., Kemble, G.W., Dekker, C.L., Davis, M.M. 및 Greenberg, H.B.의 "Plasmablast-derived polyclonal antibody response after influenza vaccination"(J Immunol Methods 365, 67-75(2011)).
Jeyanathan, M., Afkhami, S., Smaill, F., Miller, M.S., Lichty, B.D. 및 Xing, Z의 "Immunological considerations for COVID-19 vaccine strategies"(Nat Rev Immunol 20, 615-632(2020).
Ledford, H의 "How 'killer' T cells could boost COVID immunity in face of new variants"(Nature 590, 374-375(2021).
Lee, W.S., Wheatley, A.K., Kent, S.J. 및 DeKosky, B.J.의 "Antibody-dependent enhancement and SARS-CoV-2 vaccines and therapies"(Nat Microbiol 5, 1185-1191(2020).
Liebowitz, D., Gottlieb, K., Kolhatkar, N.S., Garg, S.J., Asher, J.M., Nazareno, J., Kim, K., McIlwain, D.R. 및 Tucker, S.N의 "Efficacy, immunogenicity, and safety of an oral influenza vaccine: a placebo-controlled and active-controlled phase 2 human challenge study"(Lancet Infect Dis 20, 435-444(2020).
Mora, J.R. 및 von Andrian, U.H.의 "Differentiation and homing of IgA-secreting cells"(Mucosal immunology 1, 96-109(2008).
Russell, M.W., Moldoveanu, Z., Ogra, P.L. 및 Mestecky, J.의 "Mucosal Immunity in COVID-19: A Neglected but Critical Aspect of SARS-CoV-2 Infection"(Front Immunol 11, 611337(2020).
Sterlin, D., Mathian, A., Miyara, M., Mohr, A., Anna, F., Claer, L., Quentric, P., Fadlallah, J., Devilliers, H., Ghillani, P. 등의 "IgA dominates the early neutralizing antibody response to SARS-CoV-2"(Sci Transl Med 13(2021).
Makedonas, G. & Betts, M.R.의 "Polyfunctional analysis of human t cell responses: importance in vaccine immunogenicity and natural infection"(Springer Semin Immunopathol 28, 209-219(2006)).
Precopio, M.L. 등의 "Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses"(J Exp Med 204, 1405-1416(2007)).
Soghoian, D.Z. 등의 "HIV-specific cytolytic CD4 T cell responses during acute HIV infection predict disease outcome"(Sci Transl Med 4, 123ra125 (2012)).
Johnson, S. 등의 "Cooperativity of HIV-Specific Cytolytic CD4 T Cells and CD8 T Cells in Control of HIV Viremia"(J Virol 89, 7494-7505(2015)).
Bendall, S.C. 등의 "Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum"(Science 332, 687-696(2011)).
Willinger, T., Freeman, T., Hasegawa, H., McMichael, A.J. & Callan, M.F.의 "Molecular signatures distinguish human central memory from effector memory CD8 T cell subsets"(J Immunol 175, 5895-5903(2005)).
Neidleman, J. 등의 "SARS-CoV-2-Specific T Cells Exhibit Phenotypic Features of Helper Function, Lack of Terminal Differentiation, and High Proliferation Potential"(Cell Rep Med 1, 100081(2020)).
Rha, M.S. 등의 "PD-1-Expressing SARS-CoV-2-Specific CD8(+) T Cells Are Not Exhausted, but Functional in Patients with COVID-19"(Immunity 54, 44-52 e43(2021)).
Chen, Y. 등의 "CXCR5(+)PD-1(+) follicular helper CD8 T cells control B cell tolerance"(Nat Commun 10, 4415(2019)).
Mylvaganam, G.H. 등의 "Dynamics of SIV-specific CXCR5+ CD8 T cells during chronic SIV infection"(Proc Natl Acad Sci USA 114, 1976-1981(2017)).
Miller, J.D. 등의 "Human effector and memory CD8+ T cell responses to smallpox and yellow fever vaccines"(Immunity 28, 710-722(2008)).
Christiaansen, A.F. 등의 "CD11a and CD49d enhance the detection of antigen-specific T cells following human vaccination"(Vaccine 35, 4255-4261(2017)).
Dey, A. 등의 "Human Circulating Antibody-Producing B Cell as a Predictive Measure of Mucosal Immunity to Poliovirus"(PloS one 11, e0146010(2016)).
Sahin, U. 등의 "BNT162b2 vaccine induces neutralizing antibodies and poly-specific T cells in humans"(Nature(2021)).
Caddy, S.L. 등의 "Viral nucleoprotein antibodies activate TRIM21 and induce T cell immunity"(EMBO J 40, e106228(2021)).
Mu, J. 등의 "SARS-CoV-2 N protein antagonizes type I interferon signaling by suppressing phosphorylation and nuclear translocation of STAT1 and STAT2"(Cell Discov 6, 65(2020)).
Weck, M.M. 등의 "TLR ligands differentially affect uptake and presentation of cellular antigens"(Blood 109, 3890-3894(2007)).
Oberhardt, V. 등의 "Rapid and stable mobilization of CD8+ T cells by SARS-CoV-2 mRNA vaccine"(Nature(2021)).
Jia, X. 등의 "High expression of CD38 and MHC class II on CD8(+) T cells during severe influenza disease reflects bystander activation and trogocytosis"(Clin Transl Immunology 10, e1336(2021)).
Bange, E.M. 등의 "CD8(+) T cells contribute to survival in patients with COVID-19 and hematologic cancer"(Nat Med 27, 1280-1289(2021)).
Shomuradova, A.S. 등의 "SARS-CoV-2 Epitopes Are Recognized by a Public and Diverse Repertoire of Human T Cell Receptors"(Immunity 53, 1245-1257 e1245(2020)).
Snyder, T.M. 등의 "Magnitude and Dynamics of the T-cell Response to SARS-CoV-2 Infection at Both Individual and Population Levels"(medRxiv, 2020. 2007. 2031. 20165647(2020)).
Johnson, S. 등의 "Protective efficacy of individual CD8+ T cell specificities in chronic viral infection"(J Immunol 194, 1755-1762(2015)).
da Silva Antunes, R. 등의 "Differential T cell reactivity to seasonal coronaviruses and SARS-CoV-2 in community and health care workers"(medRxiv(2021)).
Tarke, A. 등의 "Comprehensive analysis of T cell immunodominance and immunoprevalence of SARS-CoV-2 epitopes in COVID-19 cases"(Cell Rep Med 2, 100204(2021)).
Alter, G. 등의 "Immunogenicity of Ad26.COV2.S vaccine against SARS-CoV-2 variants in humans"(Nature 596, 268-272(2021)).
Tarke, A. 등의 "Negligible impact of SARS-CoV-2 variants on CD4 (+) and CD8 (+)"
Wyllie, D. 등의 "SARS-CoV-2 responsive T cell numbers and anti-Spike IgG levels are both associated with protection from COVID-19: A prospective cohort study in keyworkers"(medRxiv, 2020. 2011. 2002. 20222778(2021)).
Gilbert, P.B. 등의 "Immune Correlates Analysis of the mRNA-1273 COVID-19 Vaccine Efficacy Trial"(medRxiv(2021)).
Kalimuddin, S. 등의 "Early T cell and binding antibody responses are associated with COVID-19 RNA vaccine efficacy onset"(Med(NY) 2, 682-688 e684(2021)).
Meyts, I. 등의 "Coronavirus disease 2019 in patients with inborn errors of immunity: An international study"(J Allergy Clin Immunol 147, 520-531(2021).
Huang, A. 등의 "CD8 T cells compensate for impaired humoral immunity in COVID-19 patients with hematologic cancer"(Res Sq(2021)).
Barros-Martins, J. 등의 "Immune responses against SARS-CoV-2 variants after heterologous and homologous ChAdOx1 nCoV-19/BNT162b2 vaccination"(Nat Med 27, 1525-1529(2021)).
실험예 8
상기 N 단백질이 T 세포 반응들을 증강시킬 수 있었던 지를 테스트하기 위해, 실험이 마우스들에서 수행되었다. 둘의 백신 구조체들이 본 연구에 사용되었다. JL82는 E1/E3에 대해 결핍된 전체 아데노바이러스 5형 게놈을 포괄하고, 소성장 호르몬 폴리아데닐화 신호가 수반되어 CMV 프로모터/상승제의 제어 하에서 delE1 위치에 전이 유전자 카세트를 포함하는 pAd5 벡터이다. 전이 유전자 삽입은 융합 단백질로서 발현되는 HPV16 E6/E7 전이 유전자를 인코드한다.
HPV16 E6/E7 및 상기 N 단백질 모두를 발현시키는 ED107.58을 발생시키기 위해, 정지 코돈 없이 JL82로부터 E6/E7의 전이 유전자 서열이 T2A 서열(doi: 10.1038/s41598-017-02460-2)을 통해 상기 전체 길이의 SARS-CoV-2 N 유전자(젠뱅크 수탁번호 MN908947.3호)에 연결되었다. HPV16 및 SARS-CoV-2 서열들 모두는 호모 사피엔스(H. sapiens)에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 전체 삽입 서열이 사내에서 합성되었고, 재조합을 통해 pAd 내로 복제되었다. SEQ ID NO: 21-SEQ ID NO: 24를 참조하기 바란다.
15주 연령의 암컷 C57BL/6J 마우스들이 비강 내의 루트를 통해 예방 접종되었다. 예방 접종 후의 7일에, 마우스들은 희생되었고, 지라들로부터 세포들이 분리되었다. 지라 세포들은 이후에 상기 HPV E6 및 E7 단백질들로부터 유래된 15mer 중첩 펩티드들의 풀들로 대략 18시간 동안 자극되었다. 대략 18시간 후, 인터페론 감마의 방출이 T 세포 기능성의 측정으로서 ELISpot을 통해 측정되었다.
HPV16 E6 및 E7 펩티드들에 상응하는 JL82와 비교하여 ED107로 예방 접종된 마우스들로부터 분비된 인터페론 감마의 증가가 있었다(도 14). 이는 본 발명자들의 백신 구조체 내의 SARS-CoV-2 N 단백질의 존재가 HPV16에 반응하는 T 세포들의 능력을 향상시켰던 점을 제시한다.
실험예 9
본 실험예는 S만을 발현시키는 대응되는 백신보다 높았던 세포독성 항-스파이크 T 세포들 반응을 유도하는 S 및 N를 발현시키는 구조체를 예시하는 데이터를 제공한다.
아프리카 녹색 원숭이(African green monkey)들이 S 및 N(ED88) 또는 S만(ED90)을 발현시키는 구조체로 비강 내로 예방 접종되었다. 이들 원숭이들로부터 T 세포들의 반응을 측정하기 위해, 본 발명자들은 예방접종 전 및 예방접종 후의 7일에서 PBMC들을 취하였다. PBMC들은 이후에 상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질로부터의 15mer 중첩 펩티드들의 풀들로 골지 차단제(golgi blocking reagent)들의 존재에서 5시간 동안 자극되었다. 세포독성 작용성의 측정으로서, CD8 T 세포들에 의한 IFN-γ 방출이 측정되었다.
CD8 T 세포들로부터의 IFN-γ의 상당한 증가가 ED90과 비교하여 ED88로 예방 접종된 원숭이들로부터의 스파이크 펩티드들에 반응하여 관찰되었다(도 15). 1일에 ED90으로 예방 접종된 원숭이는 예방접종 전의 레벨들 위의 IFN-γ 증가를 보여주었던 반면, ED88로 예방 접종된 모두 5의 원숭이들은 베이스라인 위의 IFN-γ의 증가를 보여주었다. 4중의 2의 원숭이들이 ED88로 예방 접종된 원숭이들의 평균 아래였던 예방 접종되지 않은 그룹의 베이스라인 위의 반응을 보였다. 본 발명자들은 이러한 데이터로부터 ED88, N 및 S 단백질들 모두를 발현시키는 백신이 S만을 발현시키는 백신보다 높았던 세포독성 항-스파이크 T 세포 반응을 가졌던 것으로 결론지을 수 있었다.
도 15는 예방접종 전의 샘플들의 베이스라인 위의 스파이크 펩티드들에 반응하는 IFN-γ 양성인 예방접종 후의 8일에서의 CD8 T 세포들을 도시한다.
여기에 설명되는 실험예들과 실시예들이 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 이들의 다양한 변경들 또는 변화들이 앞서의 관점에서 해당 기술 분야의 숙련자에게 제시될 것이며, 본원의 사상과 이해 및 첨부된 특허 청구 범위의 범주 내에 속하는 점이 이해될 것이다. 여기에 언급되는 모든 공개 문헌들, 특허들 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전체적으로 여기에 참조로 포함된다.
서열들의 표
SEQ ID NO: 1 : SARS-CoV-2 S 단백질(표면 당단백질) 아미노산 서열
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID NO: 2 : SARS-CoV-2 N 단백질(뉴클레오캡시드 인단백질) 아미노산 서열
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA*
SEQ ID NO: 3 : SARS-CoV-2 S 단백질(표면 당단백질) 핵산 서열
ggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGTCCCTGGGAGCTGAGAATTCAGTCGCGTATTCAAACAATTCCATTGCTATTCCTACTAATTTCACTATCTCCGTCACGACCGAGATCCTGCCAGTTTCCATGACTAAGACTTCTGTTGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATAGCACCGAGTGCAGTAATCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACACAACTCAATCGAGCACTGACCGGTATTGCAGTTGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTCTTTGCACAGGTCAAACAAATTTACAAAACCCCCCCCATAAAAGACTTTGGTGGGTTCAACTTCAGCCAAATCCTCCCAGATCCCAGCAAGCCCTCCAAAAGATCCTTCATCGAAGACCTTTTGTTCAATAAGGTAACCCTGGCCGACGCAGGCTTCATCAAACAATATGGCGATTGCCTTGGAGACATTGCTGCGCGCGATTTGATCTGTGCTCAGAAATTTAACGGTTTGACCGTGCTGCCCCCACTTCTGACTGATGAGATGATAGCACAGTATACTTCTGCTCTTCTGGCAGGAACAATCACTTCCGGGTGGACCTTTGGCGCTGGTGCAGCACTGCAAATCCCCTTCGCAATGCAAATGGCCTACCGATTCAATGGTATTGGTGTTACCCAGAACGTGCTCTATGAGAATCAGAAACTCATCGCCAATCAGTTCAATAGCGCTATTGGCAAGATTCAGGATTCCCTCAGCTCTACCGCCAGCGCTCTGGGGAAGCTCCAGGACGTGGTGAACCAAAATGCTCAAGCGCTCAATACCCTTGTGAAACAGCTCAGCTCCAATTTTGGCGCAATTAGCAGCGTTCTGAATGATATTCTGTCCCGGCTGGACAAGGTAGAAGCAGAAGTCCAGATCGACAGGCTGATCACCGGGCGGTTGCAGAGTCTCCAGACCTATGTCACACAACAGCTGATCCGCGCCGCCGAGATCAGGGCTTCCGCTAACCTGGCCGCCACTAAGATGTCCGAATGCGTGTTGGGGCAGAGTAAGCGGGTCGACTTTTGCGGGAAGGGATACCATCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCACCCCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACATATGTGCCCGCTCAGGAAAAGAATTTCACAACCGCACCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTTCCTAGAGAAGGAGTTTTCGTATCTAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTTTACGAGCCTCAGATTATAACTACGGACAACACTTTCGTGTCAGGCAACTGTGACGTGGTGATTGGGATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCATTGCAGCCCGAGTTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTTGATAAGTATTTCAAGAACCATACCTCTCCCGACGTGGACCTGGGGGACATTAGCGGCATCAATGCATCCGTTGTGAATATCCAGAAAGAAATCGATAGGCTGAATGAGGTCGCAAAAAATCTTAATGAGTCACTGATTGATCTGCAGGAACTCGGCAAATATGAGCAGTATATTAAGTGGCCGTGGTACATATGGCTCGGCTTTATCGCCGGTCTGATTGCCATCGTGATGGTGACCATTATGCTGTGTTGTATGACAAGCTGCTGTTCATGTCTCAAAGGATGCTGCTCCTGCGGTAGCTGCTGTAAGTTCGATGAAGACGACAGTGAGCCCGTGCTCAAAGGAGTGAAACTCCACTACACATAAcgatcg
SEQ ID NO: 4 : SARS-CoV-2 N 단백질(뉴클레오캡시드 인단백질) 핵산 서열
ggtaccgccaccATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAcgatcg
SEQ ID NO: 5 : SARS-CoV-2 융합: S1-푸린-N 핵산 서열
ggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAcgatcg
SEQ ID NO: 6 : CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-bActin-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA
TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGACTCTAGCCTAGCTCTGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGAGGTCGACGGTATCGATGggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGTCCCTGGGAGCTGAGAATTCAGTCGCGTATTCAAACAATTCCATTGCTATTCCTACTAATTTCACTATCTCCGTCACGACCGAGATCCTGCCAGTTTCCATGACTAAGACTTCTGTTGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATAGCACCGAGTGCAGTAATCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACACAACTCAATCGAGCACTGACCGGTATTGCAGTTGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTCTTTGCACAGGTCAAACAAATTTACAAAACCCCCCCCATAAAAGACTTTGGTGGGTTCAACTTCAGCCAAATCCTCCCAGATCCCAGCAAGCCCTCCAAAAGATCCTTCATCGAAGACCTTTTGTTCAATAAGGTAACCCTGGCCGACGCAGGCTTCATCAAACAATATGGCGATTGCCTTGGAGACATTGCTGCGCGCGATTTGATCTGTGCTCAGAAATTTAACGGTTTGACCGTGCTGCCCCCACTTCTGACTGATGAGATGATAGCACAGTATACTTCTGCTCTTCTGGCAGGAACAATCACTTCCGGGTGGACCTTTGGCGCTGGTGCAGCACTGCAAATCCCCTTCGCAATGCAAATGGCCTACCGATTCAATGGTATTGGTGTTACCCAGAACGTGCTCTATGAGAATCAGAAACTCATCGCCAATCAGTTCAATAGCGCTATTGGCAAGATTCAGGATTCCCTCAGCTCTACCGCCAGCGCTCTGGGGAAGCTCCAGGACGTGGTGAACCAAAATGCTCAAGCGCTCAATACCCTTGTGAAACAGCTCAGCTCCAATTTTGGCGCAATTAGCAGCGTTCTGAATGATATTCTGTCCCGGCTGGACAAGGTAGAAGCAGAAGTCCAGATCGACAGGCTGATCACCGGGCGGTTGCAGAGTCTCCAGACCTATGTCACACAACAGCTGATCCGCGCCGCCGAGATCAGGGCTTCCGCTAACCTGGCCGCCACTAAGATGTCCGAATGCGTGTTGGGGCAGAGTAAGCGGGTCGACTTTTGCGGGAAGGGATACCATCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCACCCCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACATATGTGCCCGCTCAGGAAAAGAATTTCACAACCGCACCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTTCCTAGAGAAGGAGTTTTCGTATCTAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTTTACGAGCCTCAGATTATAACTACGGACAACACTTTCGTGTCAGGCAACTGTGACGTGGTGATTGGGATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCATTGCAGCCCGAGTTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTTGATAAGTATTTCAAGAACCATACCTCTCCCGACGTGGACCTGGGGGACATTAGCGGCATCAATGCATCCGTTGTGAATATCCAGAAAGAAATCGATAGGCTGAATGAGGTCGCAAAAAATCTTAATGAGTCACTGATTGATCTGCAGGAACTCGGCAAATATGAGCAGTATATTAAGTGGCCGTGGTACATATGGCTCGGCTTTATCGCCGGTCTGATTGCCATCGTGATGGTGACCATTATGCTGTGTTGTATGACAAGCTGCTGTTCATGTCTCAAAGGATGCTGCTCCTGCGGTAGCTGCTGTAAGTTCGATGAAGACGACAGTGAGCCCGTGCTCAAAGGAGTGAAACTCCACTACACATAAcgatcgacgcgtAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAaagcttgcggccgcGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACcctgcaggccgccaccATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAggcgcgccgctgaccgatAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGacgcgttagttattaataGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATATCGGGCCACTGCAGGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTCTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
SEQ ID NO: 7 : CMV-SARS-CoV-2-S1-푸린-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA
TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgactctagCctAGCTCtgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGAGGTCGACGGTATCGATGggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAcgatcgGATATCGCTAGCGTACCGGCGGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAAAGCTTAcgcgttagttattaataGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATATCGGGCCACTGCAGGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTCTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
SEQ ID NO: 8 : rAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-bActin-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA
TAAGGATCCCATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATACTGCTAGAGATCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTGGCCACAGGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGACTCTAGCCTAGCTCTGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGAGGTCGACGGTATCGATGggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGTCCCTGGGAGCTGAGAATTCAGTCGCGTATTCAAACAATTCCATTGCTATTCCTACTAATTTCACTATCTCCGTCACGACCGAGATCCTGCCAGTTTCCATGACTAAGACTTCTGTTGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATAGCACCGAGTGCAGTAATCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACACAACTCAATCGAGCACTGACCGGTATTGCAGTTGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTCTTTGCACAGGTCAAACAAATTTACAAAACCCCCCCCATAAAAGACTTTGGTGGGTTCAACTTCAGCCAAATCCTCCCAGATCCCAGCAAGCCCTCCAAAAGATCCTTCATCGAAGACCTTTTGTTCAATAAGGTAACCCTGGCCGACGCAGGCTTCATCAAACAATATGGCGATTGCCTTGGAGACATTGCTGCGCGCGATTTGATCTGTGCTCAGAAATTTAACGGTTTGACCGTGCTGCCCCCACTTCTGACTGATGAGATGATAGCACAGTATACTTCTGCTCTTCTGGCAGGAACAATCACTTCCGGGTGGACCTTTGGCGCTGGTGCAGCACTGCAAATCCCCTTCGCAATGCAAATGGCCTACCGATTCAATGGTATTGGTGTTACCCAGAACGTGCTCTATGAGAATCAGAAACTCATCGCCAATCAGTTCAATAGCGCTATTGGCAAGATTCAGGATTCCCTCAGCTCTACCGCCAGCGCTCTGGGGAAGCTCCAGGACGTGGTGAACCAAAATGCTCAAGCGCTCAATACCCTTGTGAAACAGCTCAGCTCCAATTTTGGCGCAATTAGCAGCGTTCTGAATGATATTCTGTCCCGGCTGGACAAGGTAGAAGCAGAAGTCCAGATCGACAGGCTGATCACCGGGCGGTTGCAGAGTCTCCAGACCTATGTCACACAACAGCTGATCCGCGCCGCCGAGATCAGGGCTTCCGCTAACCTGGCCGCCACTAAGATGTCCGAATGCGTGTTGGGGCAGAGTAAGCGGGTCGACTTTTGCGGGAAGGGATACCATCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCACCCCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACATATGTGCCCGCTCAGGAAAAGAATTTCACAACCGCACCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTTCCTAGAGAAGGAGTTTTCGTATCTAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTTTACGAGCCTCAGATTATAACTACGGACAACACTTTCGTGTCAGGCAACTGTGACGTGGTGATTGGGATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCATTGCAGCCCGAGTTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTTGATAAGTATTTCAAGAACCATACCTCTCCCGACGTGGACCTGGGGGACATTAGCGGCATCAATGCATCCGTTGTGAATATCCAGAAAGAAATCGATAGGCTGAATGAGGTCGCAAAAAATCTTAATGAGTCACTGATTGATCTGCAGGAACTCGGCAAATATGAGCAGTATATTAAGTGGCCGTGGTACATATGGCTCGGCTTTATCGCCGGTCTGATTGCCATCGTGATGGTGACCATTATGCTGTGTTGTATGACAAGCTGCTGTTCATGTCTCAAAGGATGCTGCTCCTGCGGTAGCTGCTGTAAGTTCGATGAAGACGACAGTGAGCCCGTGCTCAAAGGAGTGAAACTCCACTACACATAAcgatcgacgcgtAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAaagcttgcggccgcGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACcctgcaggccgccaccATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAggcgcgccgctgaccgatAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGacgcgttagttattaataGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATATCGGGCCACTGCAGGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTCTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCTCGAGCCTAAGCTTGTCGACTCGAAGATCTGGGCGTGGTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTTAAAACATAAATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTTATTTAGGGGTTTTGCGCGCGCGGTAGGCCCGGGACCAGCGGTCTCGGTCGTTGAGGGTCCTGTGTATTTTTTCCAGGACGTGGTAAAGGTGACTCTGGATGTTCAGATACATGGGCATAAGCCCGTCTCTGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAGCTTCATGCTGCGGGGTGGTGTTGTAGATGATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGGGGCAGGCCCTTGGTGTAAGTGTTTACAAAGCGGTTAAGCTGGGATGGGTGCATACGTGGGGATATGAGATGCATCTTGGACTGTATTTTTAGGTTGGCTATGTTCCCAGCCATATCCCTCCGGGGATTCATGTTGTGCAGAACCACCAGCACAGTGTATCCGGTGCACTTGGGAAATTTGTCATGTAGCTTAGAAGGAAATGCGTGGAAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGACCTCCAAGATTTTCCATGCATTCGTCCATAATGATGGCAATGGGCCCACGGGCGGCGGCCTGGGCGAAGATATTTCTGGGATCACTAACGTCATAGTTGTGTTCCAGGATGAGATCGTCATAGGCCATTTTTACAAAGCGCGGGCGGAGGGTGCCAGACTGCGGTATAATGGTTCCATCCGGCCCAGGGGCGTAGTTACCCTCACAGATTTGCATTTCCCACGCTTTGAGTTCAGATGGGGGGATCATGTCTACCTGCGGGGCGATGAAGAAAACGGTTTCCGGGGTAGGGGAGATCAGCTGGGAAGAAAGCAGGTTCCTGAGCAGCTGCGACTTACCGCAGCCGGTGGGCCCGTAAATCACACCTATTACCGGCTGCAACTGGTAGTTAAGAGAGCTGCAGCTGCCGTCATCCCTGAGCAGGGGGGCCACTTCGTTAAGCATGTCCCTGACTCGCATGTTTTCCCTGACCAAATCCGCCAGAAGGCGCTCGCCGCCCAGCGATAGCAGTTCTTGCAAGGAAGCAAAGTTTTTCAACGGTTTGAGACCGTCCGCCGTAGGCATGCTTTTGAGCGTTTGACCAAGCAGTTCCAGGCGGTCCCACAGCTCGGTCACCTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCATATCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGGCGGCTTTCGCTGTACGGCAGTAGTCGGTGCTCGTCCAGACGGGCCAGGGTCATGTCTTTCCACGGGCGCAGGGTCCTCGTCAGCGTAGTCTGGGTCACGGTGAAGGGGTGCGCTCCGGGCTGCGCGCTGGCCAGGGTGCGCTTGAGGCTGGTCCTGCTGGTGCTGAAGCGCTGCCGGTCTTCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCATTTGACCATGGTGTCATAGTCCAGCCCCTCCGCGGCGTGGCCCTTGGCGCGCAGCTTGCCCTTGGAGGAGGCGCCGCACGAGGGGCAGTGCAGACTTTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGCGCGAGAAATACCGATTCCGGGGAGTAGGCATCCGCGCCGCAGGCCCCGCAGACGGTCTCGCATTCCACGAGCCAGGTGAGCTCTGGCCGTTCGGGGTCAAAAACCAGGTTTCCCCCATGCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGGTTTCCATGAGCCGGTGTCCACGCTCGGTGACGAAAAGGCTGTCCGTGTCCCCGTATACAGACTTGAGAGGCCTGTCCTCGAGCGGTGTTCCGCGGTCCTCCTCGTATAGAAACTCGGACCACTCTGAGACAAAGGCTCGCGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCTAAGTGGGAGGGGTAGCGGTCGTTGTCCACTAGGGGGTCCACTCGCTCCAGGGTGTGAAGACACATGTCGCCCTCTTCGGCATCAAGGAAGGTGATTGGTTTGTAGGTGTAGGCCACGTGACCGGGTGTTCCTGAAGGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGCGTTCGTCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTGAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCATCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGGTGGCAAACGACCCGTAGAGGGCGTTGGACAGCAACTTGGCGATGGAGCGCAGGGTTTGGTTTTTGTCGCGATCGGCGCGCTCCTTGGCCGCGATGTTTAGCTGCACGTATTCGCGCGCAACGCACCGCCATTCGGGAAAGACGGTGGTGCGCTCGTCGGGCACCAGGTGCACGCGCCAACCGCGGTTGTGCAGGGTGACAAGGTCAACGCTGGTGGCTACCTCTCCGCGTAGGCGCTCGTTGGTCCAGCAGAGGCGGCCGCCCTTGCGCGAGCAGAATGGCGGTAGGGGGTCTAGCTGCGTCTCGTCCGGGGGGTCTGCGTCCACGGTAAAGACCCCGGGCAGCAGGCGCGCGTCGAAGTAGTCTATCTTGCATCCTTGCAAGTCTAGCGCCTGCTGCCATGCGCGGGCGGCAAGCGCGCGCTCGTATGGGTTGAGTGGGGGACCCCATGGCATGGGGTGGGTGAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAAATGTCGTAAACGTAGAGGGGCTCTCTGAGTATTCCAAGATATGTAGGGTAGCATCTTCCACCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAATCGTATAGTTCGTGCGAGGGAGCGAGGAGGTCGGGACCGAGGTTGCTACGGGCGGGCTGCTCTGCTCGGAAGACTATCTGCCTGAAGATGGCATGTGAGTTGGATGATATGGTTGGACGCTGGAAGACGTTGAAGCTGGCGTCTGTGAGACCTACCGCGTCACGCACGAAGGAGGCGTAGGAGTCGCGCAGCTTGTTGACCAGCTCGGCGGTGACCTGCACGTCTAGGGCGCAGTAGTCCAGGGTTTCCTTGATGATGTCATACTTATCCTGTCCCTTTTTTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTGGTAGGCGCAGCATCCCTTTTCTACGGGTAGCGCGTATGCCTGCGCGGCCTTCCGGAGCGAGGTGTGGGTGAGCGCAAAGGTGTCCCTGACCATGACTTTGAGGTACTGGTATTTGAAGTCAGTGTCGTCGCATCCGCCCTGCTCCCAGAGCAAAAAGTCCGTGCGCTTTTTGGAACGCGGATTTGGCAGGGCGAAGGTGACATCGTTGAAGAGTATCTTTCCCGCGCGAGGCATAAAGTTGCGTGTGATGCGGAAGGGTCCCGGCACCTCGGAACGGTTGTTAATTACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCAAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACAATGTAAAGTTCCAAGAAGCGCGGGATGCCCTTGATGGAAGGCAATTTTTTAAGTTCCTCGTAGGTGAGCTCTTCAGGGGAGCTGAGCCCGTGCTCTGAAAGGGCCCAGTCTGCAAGATGAGGGTTGGAAGCGACGAATGAGCTCCACAGGTCACGGGCCATTAGCATTTGCAGGTGGTCGCGAAAGGTCCTAAACTGGCGACCTATGGCCATTTTTTCTGGGGTGATGCAGTAGAAGGTAAGCGGGTCTTGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGTTCGCGGCTAGGTCTCGCGCGGCAGTCACTAGAGGCTCATCTCCGCCGAACTTCATGACCAGCATGAAGGGCACGAGCTGCTTCCCAAAGGCCCCCATCCAAGTATAGGTCTCTACATCGTAGGTGACAAAGAGACGCTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATCGGGAAGAACTGGATCTCCCGCCACCAATTGGAGGAGTGGCTATTGATGTGGTGAAAGTAGAAGTCCCTGCGACGGGCCGAACACTCGTGCTGGCTTTTGTAAAAACGTGCGCAGTACTGGCAGCGGTGCACGGGCTGTACATCCTGCACGAGGTTGACCTGACGACCGCGCACAAGGAAGCAGAGTGGGAATTTGAGCCCCTCGCCTGGCGGGTTTGGCTGGTGGTCTTCTACTTCGGCTGCTTGTCCTTGACCGTCTGGCTGCTCGAGGGGAGTTACGGTGGATCGGACCACCACGCCGCGCGAGCCCAAAGTCCAGATGTCCGCGCGCGGCGGTCGGAGCTTGATGACAACATCGCGCAGATGGGAGCTGTCCATGGTCTGGAGCTCCCGCGGCGTCAGGTCAGGCGGGAGCTCCTGCAGGTTTACCTCGCATAGACGGGTCAGGGCGCGGGCTAGATCCAGGTGATACCTAATTTCCAGGGGCTGGTTGGTGGCGGCGTCGATGGCTTGCAAGAGGCCGCATCCCCGCGGCGCGACTACGGTACCGCGCGGCGGGCGGTGGGCCGCGGGGGTGTCCTTGGATGATGCATCTAAAAGCGGTGACGCGGGCGAGCCCCCGGAGGTAGGGGGGGCTCCGGACCCGCCGGGAGAGGGGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGCAGGAGCTGGTGCTGCGCGCGTAGGTTGCTGGCGAACGCGACGACGCGGCGGTTGATCTCCTGAATCTGGCGCCTCTGCGTGAAGACGACGGGCCCGGTGAGCTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATTTCGGTGTCGTTGACGGCGGCCTGGCGCAAAATCTCCTGCACGTCTCCTGAGTTGTCTTGATAGGCGATCTCGGCCATGAACTGCTCGATCTCTTCCTCCTGGAGATCTCCGCGTCCGGCTCGCTCCACGGTGGCGGCGAGGTCGTTGGAAATGCGGGCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTGAGGCCTCCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGCCCCCTTCGGCATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGCGCGAGATTGAGCTCCACGTGCCGGGCGAAGACGGCGTAGTTTCGCAGGCGCTGAAAGAGGTAGTTGAGGGTGGTGGCGGTGTGTTCTGCCACGAAGAAGTACATAACCCAGCGTCGCAACGTGGATTCGTTGATATCCCCCAAGGCCTCAAGGCGCTCCATGGCCTCGTAGAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGACACGGTTAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGACAGTGTCGCGCACCTCGCGCTCAAAGGCTACAGGGGCCTCTTCTTCTTCTTCAATCTCCTCTTCCATAAGGGCCTCCCCTTCTTCTTCTTCTGGCGGCGGTGGGGGAGGGGGGACACGGCGGCGACGACGGCGCACCGGGAGGCGGTCGACAAAGCGCTCGATCATCTCCCCGCGGCGACGGCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGGCCGTTCTCGCGGGGGCGCAGTTGGAAGACGCCGCCCGTCATGTCCCGGTTATGGGTTGGCGGGGGGCTGCCATGCGGCAGGGATACGGCGCTAACGATGCATCTCAACAATTGTTGTGTAGGTACTCCGCCGCCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGCGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGACAGAAGCACCATGTCCTTGGGTCCGGCCTGCTGAATGCGCAGGCGGTCGGCCATGCCCCAGGCTTCGTTTTGACATCGGCGCAGGTCTTTGTAGTAGTCTTGCATGAGCCTTTCTACCGGCACTTCTTCTTCTCCTTCCTCTTGTCCTGCATCTCTTGCATCTATCGCTGCGGCGGCGGCGGAGTTTGGCCGTAGGTGGCGCCCTCTTCCTCCCATGCGTGTGACCCCGAAGCCCCTCATCGGCTGAAGCAGGGCTAGGTCGGCGACAACGCGCTCGGCTAATATGGCCTGCTGCACCTGCGTGAGGGTAGACTGGAAGTCATCCATGTCCACAAAGCGGTGGTATGCGCCCGTGTTGATGGTGTAAGTGCAGTTGGCCATAACGGACCAGTTAACGGTCTGGTGACCCGGCTGCGAGAGCTCGGTGTACCTGAGACGCGAGTAAGCCCTCGAGTCAAATACGTAGTCGTTGCAAGTCCGCACCAGGTACTGGTATCCCACCAAAAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGGGGCCAGCGTAGGGTGGCCGGGGCTCCGGGGGCGAGATCTTCCAACATAAGGCGATGATATCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGAAAGTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAAAAAGTGCTCCATGGTCGGGACGCTCTGGCCGGTCAGGCGCGCGCAATCGTTGACGCTCTAGCGTGCAAAAGGAGAGCCTGTAAGCGGGCACTCTTCCGTGGTCTGGTGGATAAATTCGCAAGGGTATCATGGCGGACGACCGGGGTTCGAGCCCCGTATCCGGCCGTCCGCCGTGATCCATGCGGTTACCGCCCGCGTGTCGAACCCAGGTGTGCGACGTCAGACAACGGGGGAGTGCTCCTTTTGGCTTCCTTCCAGGCGCGGCGGCTGCTGCGCTAGCTTTTTTGGCCACTGGCCGCGCGCAGCGTAAGCGGTTAGGCTGGAAAGCGAAAGCATTAAGTGGCTCGCTCCCTGTAGCCGGAGGGTTATTTTCCAAGGGTTGAGTCGCGGGACCCCCGGTTCGAGTCTCGGACCGGCCGGACTGCGGCGAACGGGGGTTTGCCTCCCCGTCATGCAAGACCCCGCTTGCAAATTCCTCCGGAAACAGGGACGAGCCCCTTTTTTGCTTTTCCCAGATGCATCCGGTGCTGCGGCAGATGCGCCCCCCTCCTCAGCAGCGGCAAGAGCAAGAGCAGCGGCAGACATGCAGGGCACCCTCCCCTCCTCCTACCGCGTCAGGAGGGGCGACATCCGCGGTTGACGCGGCAGCAGATGGTGATTACGAACCCCCGCGGCGCCGGGCCCGGCACTACCTGGACTTGGAGGAGGGCGAGGGCCTGGCGCGGCTAGGAGCGCCCTCTCCTGAGCGGCACCCAAGGGTGCAGCTGAAGCGTGATACGCGTGAGGCGTACGTGCCGCGGCAGAACCTGTTTCGCGACCGCGAGGGAGAGGAGCCCGAGGAGATGCGGGATCGAAAGTTCCACGCAGGGCGCGAGCTGCGGCATGGCCTGAATCGCGAGCGGTTGCTGCGCGAGGAGGACTTTGAGCCCGACGCGCGAACCGGGATTAGTCCCGCGCGCGCACACGTGGCGGCCGCCGACCTGGTAACCGCATACGAGCAGACGGTGAACCAGGAGATTAACTTTCAAAAAAGCTTTAACAACCACGTGCGTACGCTTGTGGCGCGCGAGGAGGTGGCTATAGGACTGATGCATCTGTGGGACTTTGTAAGCGCGCTGGAGCAAAACCCAAATAGCAAGCCGCTCATGGCGCAGCTGTTCCTTATAGTGCAGCACAGCAGGGACAACGAGGCATTCAGGGATGCGCTGCTAAACATAGTAGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTGCTCGATTTGATAAACATCCTGCAGAGCATAGTGGTGCAGGAGCGCAGCTTGAGCCTGGCTGACAAGGTGGCCGCCATCAACTATTCCATGCTTAGCCTGGGCAAGTTTTACGCCCGCAAGATATACCATACCCCTTACGTTCCCATAGACAAGGAGGTAAAGATCGAGGGGTTCTACATGCGCATGGCGCTGAAGGTGCTTACCTTGAGCGACGACCTGGGCGTTTATCGCAACGAGCGCATCCACAAGGCCGTGAGCGTGAGCCGGCGGCGCGAGCTCAGCGACCGCGAGCTGATGCACAGCCTGCAAAGGGCCCTGGCTGGCACGGGCAGCGGCGATAGAGAGGCCGAGTCCTACTTTGACGCGGGCGCTGACCTGCGCTGGGCCCCAAGCCGACGCGCCCTGGAGGCAGCTGGGGCCGGACCTGGGCTGGCGGTGGCACCCGCGCGCGCTGGCAACGTCGGCGGCGTGGAGGAATATGACGAGGACGATGAGTACGAGCCAGAGGACGGCGAGTACTAAGCGGTGATGTTTCTGATCAGATGATGCAAGACGCAACGGACCCGGCGGTGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCCTTAACTCCACGGACGACTGGCGCCAGGTCATGGACCGCATCATGTCGCTGACTGCGCGCAATCCTGACGCGTTCCGGCAGCAGCCGCAGGCCAACCGGCTCTCCGCAATTCTGGAAGCGGTGGTCCCGGCGCGCGCAAACCCCACGCACGAGAAGGTGCTGGCGATCGTAAACGCGCTGGCCGAAAACAGGGCCATCCGGCCCGACGAGGCCGGCCTGGTCTACGACGCGCTGCTTCAGCGCGTGGCTCGTTACAACAGCGGCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGGCTGGTGGGGGATGTGCGCGAGGCCGTGGCGCAGCGTGAGCGCGCGCAGCAGCAGGGCAACCTGGGCTCCATGGTTGCACTAAACGCCTTCCTGAGTACACAGCCCGCCAACGTGCCGCGGGGACAGGAGGACTACACCAACTTTGTGAGCGCACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACACCGCAAAGTGAGGTGTACCAGTCTGGGCCAGACTATTTTTTCCAGACCAGTAGACAAGGCCTGCAGACCGTAAACCTGAGCCAGGCTTTCAAAAACTTGCAGGGGCTGTGGGGGGTGCGGGCTCCCACAGGCGACCGCGCGACCGTGTCTAGCTTGCTGACGCCCAACTCGCGCCTGTTGCTGCTGCTAATAGCGCCCTTCACGGACAGTGGCAGCGTGTCCCGGGACACATACCTAGGTCACTTGCTGACACTGTACCGCGAGGCCATAGGTCAGGCGCATGTGGACGAGCATACTTTCCAGGAGATTACAAGTGTCAGCCGCGCGCTGGGGCAGGAGGACACGGGCAGCCTGGAGGCAACCCTAAACTACCTGCTGACCAACCGGCGGCAGAAGATCCCCTCGTTGCACAGTTTAAACAGCGAGGAGGAGCGCATTTTGCGCTACGTGCAGCAGAGCGTGAGCCTTAACCTGATGCGCGACGGGGTAACGCCCAGCGTGGCGCTGGACATGACCGCGCGCAACATGGAACCGGGCATGTATGCCTCAAACCGGCCGTTTATCAACCGCCTAATGGACTACTTGCATCGCGCGGCCGCCGTGAACCCCGAGTATTTCACCAATGCCATCTTGAACCCGCACTGGCTACCGCCCCCTGGTTTCTACACCGGGGGATTCGAGGTGCCCGAGGGTAACGATGGATTCCTCTGGGACGACATAGACGACAGCGTGTTTTCCCCGCAACCGCAGACCCTGCTAGAGTTGCAACAGCGCGAGCAGGCAGAGGCGGCGCTGCGAAAGGAAAGCTTCCGCAGGCCAAGCAGCTTGTCCGATCTAGGCGCTGCGGCCCCGCGGTCAGATGCTAGTAGCCCATTTCCAAGCTTGATAGGGTCTCTTACCAGCACTCGCACCACCCGCCCGCGCCTGCTGGGCGAGGAGGAGTACCTAAACAACTCGCTGCTGCAGCCGCAGCGCGAAAAAAACCTGCCTCCGGCATTTCCCAACAACGGGATAGAGAGCCTAGTGGACAAGATGAGTAGATGGAAGACGTACGCGCAGGAGCACAGGGACGTGCCAGGCCCGCGCCCGCCCACCCGTCGTCAAAGGCACGACCGTCAGCGGGGTCTGGTGTGGGAGGACGATGACTCGGCAGACGACAGCAGCGTCCTGGATTTGGGAGGGAGTGGCAACCCGTTTGCGCACCTTCGCCCCAGGCTGGGGAGAATGTTTTAAAAAAAAAAAAGCATGATGCAAAATAAAAAACTCACCAAGGCCATGGCACCGAGCGTTGGTTTTCTTGTATTCCCCTTAGTATGCGGCGCGCGGCGATGTATGAGGAAGGTCCTCCTCCCTCCTACGAGAGTGTGGTGAGCGCGGCGCCAGTGGCGGCGGCGCTGGGTTCTCCCTTCGATGCTCCCCTGGACCCGCCGTTTGTGCCTCCGCGGTACCTGCGGCCTACCGGGGGGAGAAACAGCATCCGTTACTCTGAGTTGGCACCCCTATTCGACACCACCCGTGTGTACCTGGTGGACAACAAGTCAACGGATGTGGCATCCCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTTCTGACCACGGTCATTCAAAACAATGACTACAGCCCGGGGGAGGCAAGCACACAGACCATCAATCTTGACGACCGGTCGCACTGGGGCGGCGACCTGAAAACCATCCTGCATACCAACATGCCAAATGTGAACGAGTTCATGTTTACCAATAAGTTTAAGGCGCGGGTGATGGTGTCGCGCTTGCCTACTAAGGACAATCAGGTGGAGCTGAAATACGAGTGGGTGGAGTTCACGCTGCCCGAGGGCAACTACTCCGAGACCATGACCATAGACCTTATGAACAACGCGATCGTGGAGCACTACTTGAAAGTGGGCAGACAGAACGGGGTTCTGGAAAGCGACATCGGGGTAAAGTTTGACACCCGCAACTTCAGACTGGGGTTTGACCCCGTCACTGGTCTTGTCATGCCTGGGGTATATACAAACGAAGCCTTCCATCCAGACATCATTTTGCTGCCAGGATGCGGGGTGGACTTCACCCACAGCCGCCTGAGCAACTTGTTGGGCATCCGCAAGCGGCAACCCTTCCAGGAGGGCTTTAGGATCACCTACGATGATCTGGAGGGTGGTAACATTCCCGCACTGTTGGATGTGGACGCCTACCAGGCGAGCTTGAAAGATGACACCGAACAGGGCGGGGGTGGCGCAGGCGGCAGCAACAGCAGTGGCAGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACGCGGCAGCCGCGGCAATGCAGCCGGTGGAGGACATGAACGATCATGCCATTCGCGGCGACACCTTTGCCACACGGGCTGAGGAGAAGCGCGCTGAGGCCGAAGCAGCGGCCGAAGCTGCCGCCCCCGCTGCGCAACCCGAGGTCGAGAAGCCTCAGAAGAAACCGGTGATCAAACCCCTGACAGAGGACAGCAAGAAACGCAGTTACAACCTAATAAGCAATGACAGCACCTTCACCCAGTACCGCAGCTGGTACCTTGCATACAACTACGGCGACCCTCAGACCGGAATCCGCTCATGGACCCTGCTTTGCACTCCTGACGTAACCTGCGGCTCGGAGCAGGTCTACTGGTCGTTGCCAGACATGATGCAAGACCCCGTGACCTTCCGCTCCACGCGCCAGATCAGCAACTTTCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTGTTGCCCGTGCACTCCAAGAGCTTCTACAACGACCAGGCCGTCTACTCCCAACTCATCCGCCAGTTTACCTCTCTGACCCACGTGTTCAATCGCTTTCCCGAGAACCAGATTTTGGCGCGCCCGCCAGCCCCCACCATCACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACGCTACCGCTGCGCAACAGCATCGGAGGAGTCCAGCGAGTGACCATTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTTTACAAGGCCCTGGGCATAGTCTCGCCGCGCGTCCTATCGAGCCGCACTTTTTGAGCAAGCATGTCCATCCTTATATCGCCCAGCAATAACACAGGCTGGGGCCTGCGCTTCCCAAGCAAGATGTTTGGCGGGGCCAAGAAGCGCTCCGACCAACACCCAGTGCGCGTGCGCGGGCACTACCGCGCGCCCTGGGGCGCGCACAAACGCGGCCGCACTGGGCGCACCACCGTCGATGACGCCATCGACGCGGTGGTGGAGGAGGCGCGCAACTACACGCCCACGCCGCCACCAGTGTCCACAGTGGACGCGGCCATTCAGACCGTGGTGCGCGGAGCCCGGCGCTATGCTAAAATGAAGAGACGGCGGAGGCGCGTAGCACGTCGCCACCGCCGCCGACCCGGCACTGCCGCCCAACGCGCGGCGGCGGCCCTGCTTAACCGCGCACGTCGCACCGGCCGACGGGCGGCCATGCGGGCCGCTCGAAGGCTGGCCGCGGGTATTGTCACTGTGCCCCCCAGGTCCAGGCGACGAGCGGCCGCCGCAGCAGCCGCGGCCATTAGTGCTATGACTCAGGGTCGCAGGGGCAACGTGTATTGGGTGCGCGACTCGGTTAGCGGCCTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCGCGCAACTAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCGTACTGTTGTATGTATCCAGCGGCGGCGGCGCGCAACGAAGCTATGTCCAAGCGCAAAATCAAAGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCGGAGATCTATGGCCCCCCGAAGAAGGAAGAGCAGGATTACAAGCCCCGAAAGCTAAAGCGGGTCAAAAAGAAAAAGAAAGATGATGATGATGAACTTGACGACGAGGTGGAACTGCTGCACGCTACCGCGCCCAGGCGACGGGTACAGTGGAAAGGTCGACGCGTAAAACGTGTTTTGCGACCCGGCACCACCGTAGTCTTTACGCCCGGTGAGCGCTCCACCCGCACCTACAAGCGCGTGTATGATGAGGTGTACGGCGACGAGGACCTGCTTGAGCAGGCCAACGAGCGCCTCGGGGAGTTTGCCTACGGAAAGCGGCATAAGGACATGCTGGCGTTGCCGCTGGACGAGGGCAACCCAACACCTAGCCTAAAGCCCGTAACACTGCAGCAGGTGCTGCCCGCGCTTGCACCGTCCGAAGAAAAGCGCGGCCTAAAGCGCGAGTCTGGTGACTTGGCACCCACCGTGCAGCTGATGGTACCCAAGCGCCAGCGACTGGAAGATGTCTTGGAAAAAATGACCGTGGAACCTGGGCTGGAGCCCGAGGTCCGCGTGCGGCCAATCAAGCAGGTGGCGCCGGGACTGGGCGTGCAGACCGTGGACGTTCAGATACCCACTACCAGTAGCACCAGTATTGCCACCGCCACAGAGGGCATGGAGACACAAACGTCCCCGGTTGCCTCAGCGGTGGCGGATGCCGCGGTGCAGGCGGTCGCTGCGGCCGCGTCCAAGACCTCTACGGAGGTGCAAACGGACCCGTGGATGTTTCGCGTTTCAGCCCCCCGGCGCCCGCGCCGTTCGAGGAAGTACGGCGCCGCCAGCGCGCTACTGCCCGAATATGCCCTACATCCTTCCATTGCGCCTACCCCCGGCTATCGTGGCTACACCTACCGCCCCAGAAGACGAGCAACTACCCGACGCCGAACCACCACTGGAACCCGCCGCCGCCGTCGCCGTCGCCAGCCCGTGCTGGCCCCGATTTCCGTGCGCAGGGTGGCTCGCGAAGGAGGCAGGACCCTGGTGCTGCCAACAGCGCGCTACCACCCCAGCATCGTTTAAAAGCCGGTCTTTGTGGTTCTTGCAGATATGGCCCTCACCTGCCGCCTCCGTTTCCCGGTGCCGGGATTCCGAGGAAGAATGCACCGTAGGAGGGGCATGGCCGGCCACGGCCTGACGGGCGGCATGCGTCGTGCGCACCACCGGCGGCGGCGCGCGTCGCACCGTCGCATGCGCGGCGGTATCCTGCCCCTCCTTATTCCACTGATCGCCGCGGCGATTGGCGCCGTGCCCGGAATTGCATCCGTGGCCTTGCAGGCGCAGAGACACTGATTAAAAACAAGTTGCATGTGGAAAAATCAAAATAAAAAGTCTGGACTCTCACGCTCGCTTGGTCCTGTAACTATTTTGTAGAATGGAAGACATCAACTTTGCGTCTCTGGCCCCGCGACACGGCTCGCGCCCGTTCATGGGAAACTGGCAAGATATCGGCACCAGCAATATGAGCGGTGGCGCCTTCAGCTGGGGCTCGCTGTGGAGCGGCATTAAAAATTTCGGTTCCACCGTTAAGAACTATGGCAGCAAGGCCTGGAACAGCAGCACAGGCCAGATGCTGAGGGATAAGTTGAAAGAGCAAAATTTCCAACAAAAGGTGGTAGATGGCCTGGCCTCTGGCATTAGCGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCAGTGCAAAATAAGATTAACAGTAAGCTTGATCCCCGCCCTCCCGTAGAGGAGCCTCCACCGGCCGTGGAGACAGTGTCTCCAGAGGGGCGTGGCGAAAAGCGTCCGCGCCCCGACAGGGAAGAAACTCTGGTGACGCAAATAGACGAGCCTCCCTCGTACGAGGAGGCACTAAAGCAAGGCCTGCCCACCACCCGTCCCATCGCGCCCATGGCTACCGGAGTGCTGGGCCAGCACACACCCGTAACGCTGGACCTGCCTCCCCCCGCCGACACCCAGCAGAAACCTGTGCTGCCAGGCCCGACCGCCGTTGTTGTAACCCGTCCTAGCCGCGCGTCCCTGCGCCGCGCCGCCAGCGGTCCGCGATCGTTGCGGCCCGTAGCCAGTGGCAACTGGCAAAGCACACTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGGGTGCAATCCCTGAAGCGCCGACGATGCTTCTGATAGCTAACGTGTCGTATGTGTGTCATGTATGCGTCCATGTCGCCGCCAGAGGAGCTGCTGAGCCGCCGCGCGCCCGCTTTCCAAGATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACAGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTAAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCAGCCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGCTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTATAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCAGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAAAGAAGCAAGCAACATCAACAACAGCTGCCGCCATGGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAAGCCATTGTCAAAGATCTTGGTTGTGGGCCATATTTTTTGGGCACCTATGACAAGCGCTTTCCAGGCTTTGTTTCTCCACACAAGCTCGCCTGCGCCATAGTCAATACGGCCGGTCGCGAGACTGGGGGCGTACACTGGATGGCCTTTGCCTGGAACCCGCACTCAAAAACATGCTACCTCTTTGAGCCCTTTGGCTTTTCTGACCAGCGACTCAAGCAGGTTTACCAGTTTGAGTACGAGTCACTCCTGCGCCGTAGCGCCATTGCTTCTTCCCCCGACCGCTGTATAACGCTGGAAAAGTCCACCCAAAGCGTACAGGGGCCCAACTCGGCCGCCTGTGGACTATTCTGCTGCATGTTTCTCCACGCCTTTGCCAACTGGCCCCAAACTCCCATGGATCACAACCCCACCATGAACCTTATTACCGGGGTACCCAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACAGCCCACCCTGCGTCGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGCTTTTATTTGTACACTCTCGGGTGATTATTTACCCCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCGCTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGCGCGTGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAAAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATAAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCGTGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTTCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGATGCTTGTAGGTCACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTCAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGTTTGAAGTTCGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAGCGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCACACTCAGCGGGTTCATCACCGTAATTTCACTTTCCGCTTCGCTGGGCTCTTCCTCTTCCTCTTGCGTCCGCATACCACGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACTGTGCGCTTACCTCCTTTGCCATGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATTACCTCTGGTGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAAGGGCGCTTCTTTTTCTTCTTGGGCGCAATGGCCAAATCCGCCGCCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCGTCTTGTGATGAGTCTTCCTCGTCCTCGGACTCGATACGCCGCCTCATCCGCTTTTTTGGGGGCGCCCGGGGAGGCGGCGGCGACGGGGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGGGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATTTCCTTCTCCTATAGGCAGAAAAAGATCATGGAGTCAGTCGAGAAGAAGGACAGCCTAACCGCCCCCTCTGAGTTCGCCACCACCGCCTCCACCGATGCCGCCAACGCGCCTACCACCTTCCCCGTCGAGGCACCCCCGCTTGAGGAGGAGGAAGTGATTATCGAGCAGGACCCAGGTTTTGTAAGCGAAGACGACGAGGACCGCTCAGTACCAACAGAGGATAAAAAGCAAGACCAGGACAACGCAGAGGCAAACGAGGAACAAGTCGGGCGGGGGGACGAAAGGCATGGCGACTACCTAGATGTGGGAGACGACGTGCTGTTGAAGCATCTGCAGCGCCAGTGCGCCATTATCTGCGACGCGTTGCAAGAGCGCAGCGATGTGCCCCTCGCCATAGCGGATGTCAGCCTTGCCTACGAACGCCACCTATTCTCACCGCGCGTACCCCCCAAACGCCAAGAAAACGGCACATGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCCGTATTTGCCGTGCCAGAGGTGCTTGCCACCTATCACATCTTTTTCCAAAACTGCAAGATACCCCTATCCTGCCGTGCCAACCGCAGCCGAGCGGACAAGCAGCTGGCCTTGCGGCAGGGCGCTGTCATACCTGATATCGCCTCGCTCAACGAAGTGCCAAAAATCTTTGAGGGTCTTGGACGCGACGAGAAGCGCGCGGCAAACGCTCTGCAACAGGAAAACAGCGAAAATGAAAGTCACTCTGGAGTGTTGGTGGAACTCGAGGGTGACAACGCGCGCCTAGCCGTACTAAAACGCAGCATCGAGGTCACCCACTTTGCCTACCCGGCACTTAACCTACCCCCCAAGGTCATGAGCACAGTCATGAGTGAGCTGATCGTGCGCCGTGCGCAGCCCCTGGAGAGGGATGCAAATTTGCAAGAACAAACAGAGGAGGGCCTACCCGCAGTTGGCGACGAGCAGCTAGCGCGCTGGCTTCAAACGCGCGAGCCTGCCGACTTGGAGGAGCGACGCAAACTAATGATGGCCGCAGTGCTCGTTACCGTGGAGCTTGAGTGCATGCAGCGGTTCTTTGCTGACCCGGAGATGCAGCGCAAGCTAGAGGAAACATTGCACTACACCTTTCGACAGGGCTACGTACGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTCTGCAACCTGGTCTCCTACCTTGGAATTTTGCACGAAAACCGCCTTGGGCAAAACGTGCTTCATTCCACGCTCAAGGGCGAGGCGCGCCGCGACTACGTCCGCGACTGCGTTTACTTATTTCTATGCTACACCTGGCAGACGGCCATGGGCGTTTGGCAGCAGTGCTTGGAGGAGTGCAACCTCAAGGAGCTGCAGAAACTGCTAAAGCAAAACTTGAAGGACCTATGGACGGCCTTCAACGAGCGCTCCGTGGCCGCGCACCTGGCGGACATCATTTTCCCCGAACGCCTGCTTAAAACCCTGCAACAGGGTCTGCCAGACTTCACCAGTCAAAGCATGTTGCAGAACTTTAGGAACTTTATCCTAGAGCGCTCAGGAATCTTGCCCGCCACCTGCTGTGCACTTCCTAGCGACTTTGTGCCCATTAAGTACCGCGAATGCCCTCCGCCGCTTTGGGGCCACTGCTACCTTCTGCAGCTAGCCAACTACCTTGCCTACCACTCTGACATAATGGAAGACGTGAGCGGTGACGGTCTACTGGAGTGTCACTGTCGCTGCAACCTATGCACCCCGCACCGCTCCCTGGTTTGCAATTCGCAGCTGCTTAACGAAAGTCAAATTATCGGTACCTTTGAGCTGCAGGGTCCCTCGCCTGACGAAAAGTCCGCGGCTCCGGGGTTGAAACTCACTCCGGGGCTGTGGACGTCGGCTTACCTTCGCAAATTTGTACCTGAGGACTACCACGCCCACGAGATTAGGTTCTACGAAGACCAATCCCGCCCGCCTAATGCGGAGCTTACCGCCTGCGTCATTACCCAGGGCCACATTCTTGGCCAATTGCAAGCCATCAACAAAGCCCGCCAAGAGTTTCTGCTACGAAAGGGACGGGGGGTTTACTTGGACCCCCAGTCCGGCGAGGAGCTCAACCCAATCCCCCCGCCGCCGCAGCCCTATCAGCAGCAGCCGCGGGCCCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAAAAAGAAGCTGCAGCTGCCGCCGCCACCCACGGACGAGGAGGAATACTGGGACAGTCAGGCAGAGGAGGTTTTGGACGAGGAGGAGGAGGACATGATGGAAGACTGGGAGAGCCTAGACGAGGAAGCTTCCGAGGTCGAAGAGGTGTCAGACGAAACACCGTCACCCTCGGTCGCATTCCCCTCGCCGGCGCCCCAGAAATCGGCAACCGGTTCCAGCATGGCTACAACCTCCGCTCCTCAGGCGCCGCCGGCACTGCCCGTTCGCCGACCCAACCGTAGATGGGACACCACTGGAACCAGGGCCGGTAAGTCCAAGCAGCCGCCGCCGTTAGCCCAAGAGCAACAACAGCGCCAAGGCTACCGCTCATGGCGCGGGCACAAGAACGCCATAGTTGCTTGCTTGCAAGACTGTGGGGGCAACATCTCCTTCGCCCGCCGCTTTCTTCTCTACCATCACGGCGTGGCCTTCCCCCGTAACATCCTGCATTACTACCGTCATCTCTACAGCCCATACTGCACCGGCGGCAGCGGCAGCAACAGCAGCGGCCACACAGAAGCAAAGGCGACCGGATAGCAAGACTCTGACAAAGCCCAAGAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGCAGGAGGAGGAGCGCTGCGTCTGGCGCCCAACGAACCCGTATCGACCCGCGAGCTTAGAAACAGGATTTTTCCCACTCTGTATGCTATATTTCAACAGAGCAGGGGCCAAGAACAAGAGCTGAAAATAAAAAACAGGTCTCTGCGATCCCTCACCCGCAGCTGCCTGTATCACAAAAGCGAAGATCAGCTTCGGCGCACGCTGGAAGACGCGGAGGCTCTCTTCAGTAAATACTGCGCGCTGACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTCAAATTTAAGCGCGAAAACTACGTCATCTCCAGCGGCCACACCCGGCGCCAGCACCTGTTGTCAGCGCCATTATGAGCAAGGAAATTCCCACGCCCTACATGTGGAGTTACCAGCCACAAATGGGACTTGCGGCTGGAGCTGCCCAAGACTACTCAACCCGAATAAACTACATGAGCGCGGGACCCCACATGATATCCCGGGTCAACGGAATACGCGCCCACCGAAACCGAATTCTCCTGGAACAGGCGGCTATTACCACCACACCTCGTAATAACCTTAATCCCCGTAGTTGGCCCGCTGCCCTGGTGTACCAGGAAAGTCCCGCTCCCACCACTGTGGTACTTCCCAGAGACGCCCAGGCCGAAGTTCAGATGACTAACTCAGGGGCGCAGCTTGCGGGCGGCTTTCGTCACAGGGTGCGGTCGCCCGGGCAGGGTATAACTCACCTGACAATCAGAGGGCGAGGTATTCAGCTCAACGACGAGTCGGTGAGCTCCTCGCTTGGTCTCCGTCCGGACGGGACATTTCAGATCGGCGGCGCCGGCCGCTCTTCATTCACGCCTCGTCAGGCAATCCTAACTCTGCAGACCTCGTCCTCTGAGCCGCGCTCTGGAGGCATTGGAACTCTGCAATTTATTGAGGAGTTTGTGCCATCGGTCTACTTTAACCCCTTCTCGGGACCTCCCGGCCACTATCCGGATCAATTTATTCCTAACTTTGACGCGGTAAAGGACTCGGCGGACGGCTACGACTGAATGTTAAGTGGAGAGGCAGAGCAACTGCGCCTGAAACACCTGGTCCACTGTCGCCGCCACAAGTGCTTTGCCCGCGACTCCGGTGAGTTTTGCTACTTTGAATTGCCCGAGGATCATATCGAGGGCCCGGCGCACGGCGTCCGGCTTACCGCCCAGGGAGAGCTTGCCCGTAGCCTGATTCGGGAGTTTACCCAGCGCCCCCTGCTAGTTGAGCGGGACAGGGGACCCTGTGTTCTCACTGTGATTTGCAACTGTCCTAACCCTGGATTACATCAAGATCCTCTAGTTAATGTCAGGTCGCCTAAGTCGATTAACTAGAGTACCCGGGGATCTTATTCCCTTTAACTAATAAAAAAAAATAATAAAGCATCACTTACTTAAAATCAGTTAGCAAATTTCTGTCCAGTTTATTCAGCAGCACCTCCTTGCCCTCCTCCCAGCTCTGGTATTGCAGCTTCCTCCTGGCTGCAAACTTTCTCCACAATCTAAATGGAATGTCAGTTTCCTCCTGTTCCTGTCCATCCGCACCCACTATCTTCATGTTGTTGCAGATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTCAACCCCGTGTATCCATATGACACGGAAACCGGTCCTCCAACTGTGCCTTTTCTTACTCCTCCCTTTGTATCCCCCAATGGGTTTCAAGAGAGTCCCCCTGGGGTACTCTCTTTGCGCCTATCCGAACCTCTAGTTACCTCCAATGGCATGCTTGCGCTCAAAATGGGCAACGGCCTCTCTCTGGACGAGGCCGGCAACCTTACCTCCCAAAATGTAACCACTGTGAGCCCACCTCTCAAAAAAACCAAGTCAAACATAAACCTGGAAATATCTGCACCCCTCACAGTTACCTCAGAAGCCCTAACTGTGGCTGCCGCCGCACCTCTAATGGTCGCGGGCAACACACTCACCATGCAATCACAGGCCCCGCTAACCGTGCACGACTCCAAACTTAGCATTGCCACCCAAGGACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAAGCTAGCCCTGCAAACATCAGGCCCCCTCACCACCACCGATAGCAGTACCCTTACTATCACTGCCTCACCCCCTCTAACTACTGCCACTGGTAGCTTGGGCATTGACTTGAAAGAGCCCATTTATACACAAAATGGAAAACTAGGACTAAAGTACGGGGCTCCTTTGCATGTAACAGACGACCTAAACACTTTGACCGTAGCAACTGGTCCAGGTGTGACTATTAATAATACTTCCTTGCAAACTAAAGTTACTGGAGCCTTGGGTTTTGATTCACAAGGCAATATGCAACTTAATGTAGCAGGAGGACTAAGGATTGATTCTCAAAACAGACGCCTTATACTTGATGTTAGTTATCCGTTTGATGCTCAAAACCAACTAAATCTAAGACTAGGACAGGGCCCTCTTTTTATAAACTCAGCCCACAACTTGGATATTAACTACAACAAAGGCCTTTACTTGTTTACAGCTTCAAACAATTCCAAAAAGCTTGAGGTTAACCTAAGCACTGCCAAGGGGTTGATGTTTGACGCTACAGCCATAGCCATTAATGCAGGAGATGGGCTTGAATTTGGTTCACCTAATGCACCAAACACAAATCCCCTCAAAACAAAAATTGGCCATGGCCTAGAATTTGATTCAAACAAGGCTATGGTTCCTAAACTAGGAACTGGCCTTAGTTTTGACAGCACAGGTGCCATTACAGTAGGAAACAAAAATAATGATAAGCTAACTTTGTGGACCACACCAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATGCAGAGAAAGATGCTAAACTCACTTTGGTCTTAACAAAATGTGGCAGTCAAATACTTGCTACAGTTTCAGTTTTGGCTGTTAAAGGCAGTTTGGCTCCAATATCTGGAACAGTTCAAAGTGCTCATCTTATTATAAGATTTGACGAAAATGGAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGGAACTTTAGAAATGGAGATCTTACTGAAGGCACAGCCTATACAAACGCTGTTGGATTTATGCCTAACCTATCAGCTTATCCAAAATCTCACGGTAAAACTGCCAAAAGTAACATTGTCAGTCAAGTTTACTTAAACGGAGACAAAACTAAACCTGTAACACTAACCATTACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTCCAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTACATTAATGAAATATTTGCCACATCCTCTTACACTTTTTCATACATTGCCCAAGAATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATTTTTCAATTGCAGAAAATTTCAAGTCATTTTTCATTCAGTAGTATAGCCCCACCACCACATAGCTTATACAGATCACCGTACCTTAATCAAACTCACAGAACCCTAGTATTCAACCTGCCACCTCCCTCCCAACACACAGAGTACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGGCCTTAAAAAGCATCATATCATGGGTAACAGACATATTCTTAGGTGTTATATTCCACACGGTTTCCTGTCGAGCCAAACGCTCATCAGTGATATTAATAAACTCCCCGGGCAGCTCACTTAAGTTCATGTCGCTGTCCAGCTGCTGAGCCACAGGCTGCTGTCCAACTTGCGGTTGCTTAACGGGCGGCGAAGGAGAAGTCCACGCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAGCAGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATAAGGCGCCTTGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGATCTCACTTAAATCAGCACAGTAACTGCAGCACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAAGGCGCTGTATCCAAAGCTCATGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCACAAGCGCAGGTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACACGCTGGACATAAACATTACCTCTTTTGGCATGTTGTAATTCACCACCTCCCGGTACCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACCACCATCCTAAACCAGCTGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATACACTGCAGGGAACCGGGACTGGAACAATGACAGTGGAGAGCCCAGGACTCGTAACCATGGATCATCATGCTCGTCATGATATCAATGTTGGCACAACACAGGCACACGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCTCCTCCCGCGTTAGAACCATATCCCAGGGAACAACCCATTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGACCTCGCACGTAACTCACGTTGTGCATTGTCAAAGTGTTACATTCGGGCAGCAGCGGATGATCCTCCAGTATGGTAGCGCGGGTTTCTGTCTCAAAAGGAGGTAGACGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGACAACCGAGATCGTGTTGGTCGTAGTGTCATGCCAAATGGAACGCCGGACGTAGTCATATTTCCTGAAGCAAAACCAGGTGCGGGCGTGACAAACAGATCTGCGTCTCCGGTCTCGCCGCTTAGATCGCTCTGTGTAGTAGTTGTAGTATATCCACTCTCTCAAAGCATCCAGGCGCCCCCTGGCTTCGGGTTCTATGTAAACTCCTTCATGCGCCGCTGCCCTGATAACATCCACCACCGCAGAATAAGCCACACCCAGCCAACCTACACATTCGTTCTGCGAGTCACACACGGGAGGAGCGGGAAGAGCTGGAAGAACCATGTTTTTTTTTTTATTCCAAAAGATTATCCAAAACCTCAAAATGAAGATCTATTAAGTGAACGCGCTCCCCTCCGGTGGCGTGGTCAAACTCTACAGCCAAAGAACAGATAATGGCATTTGTAAGATGTTGCACAATGGCTTCCAAAAGGCAAACGGCCCTCACGTCCAAGTGGACGTAAAGGCTAAACCCTTCAGGGTGAATCTCCTCTATAAACATTCCAGCACCTTCAACCATGCCCAAATAATTCTCATCTCGCCACCTTCTCAATATATCTCTAAGCAAATCCCGAATATTAAGTCCGGCCATTGTAAAAATCTGCTCCAGAGCGCCCTCCACCTTCAGCCTCAAGCAGCGAATCATGATTGCAAAAATTCAGGTTCCTCACAGACCTGTATAAGATTCAAAAGCGGAACATTAACAAAAATACCGCGATCCCGTAGGTCCCTTCGCAGGGCCAGCTGAACATAATCGTGCAGGTCTGCACGGACCAGCGCGGCCACTTCCCCGCCAGGAACCATGACAAAAGAACCCACACTGATTATGACACGCATACTCGGAGCTATGCTAACCAGCGTAGCCCCGATGTAAGCTTGTTGCATGGGCGGCGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAAAAATCAGGCAAAGCCTCGCGCAAAAAAGAAAGCACATCGTAGTCATGCTCATGCAGATAAAGGCAGGTAAGCTCCGGAACCACCACAGAAAAAGACACCATTTTTCTCTCAAACATGTCTGCGGGTTTCTGCATAAACACAAAATAAAATAACAAAAAAACATTTAAACATTAGAAGCCTGTCTTACAACAGGAAAAACAACCCTTATAAGCATAAGACGGACTACGGCCATGCCGGCGTGACCGTAAAAAAACTGGTCACCGTGATTAAAAAGCACCACCGACAGCTCCTCGGTCATGTCCGGAGTCATAATGTAAGACTCGGTAAACACATCAGGTTGATTCACATCGGTCAGTGCTAAAAAGCGACCGAAATAGCCCGGGGGAATACATACCCGCAGGCGTAGAGACAACATTACAGCCCCCATAGGAGGTATAACAAAATTAATAGGAGAGAAAAACACATAAACACCTGAAAAACCCTCCTGCCTAGGCAAAATAGCACCCTCCCGCTCCAGAACAACATACAGCGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAACCTATTAAAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGTGCAGAGCGAGTATATATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTCACTTCCCATTTTAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAACCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATT
SEQ ID NO: 9 : rAd-CMV-SARS-CoV-2-S1-푸린-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA
TAAGGATCCCATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATACTGCTAGAGATCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTGGCCACAGGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgactctagCctAGCTCtgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGAGGTCGACGGTATCGATGggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAcgatcgGATATCGCTAGCGTACCGGCGGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAAAGCTTAcgcgttagttattaataGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGATATCGGGCCACTGCAGGAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTCTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCTCGAGCCTAAGCTTGTCGACTCGAAGATCTGGGCGTGGTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTTAAAACATAAATAAAAAACCAGACTCTGTTTGGATTTGGATCAAGCAAGTGTCTTGCTGTCTTTATTTAGGGGTTTTGCGCGCGCGGTAGGCCCGGGACCAGCGGTCTCGGTCGTTGAGGGTCCTGTGTATTTTTTCCAGGACGTGGTAAAGGTGACTCTGGATGTTCAGATACATGGGCATAAGCCCGTCTCTGGGGTGGAGGTAGCACCACTGCAGAGCTTCATGCTGCGGGGTGGTGTTGTAGATGATCCAGTCGTAGCAGGAGCGCTGGGCGTGGTGCCTAAAAATGTCTTTCAGTAGCAAGCTGATTGCCAGGGGCAGGCCCTTGGTGTAAGTGTTTACAAAGCGGTTAAGCTGGGATGGGTGCATACGTGGGGATATGAGATGCATCTTGGACTGTATTTTTAGGTTGGCTATGTTCCCAGCCATATCCCTCCGGGGATTCATGTTGTGCAGAACCACCAGCACAGTGTATCCGGTGCACTTGGGAAATTTGTCATGTAGCTTAGAAGGAAATGCGTGGAAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGACCTCCAAGATTTTCCATGCATTCGTCCATAATGATGGCAATGGGCCCACGGGCGGCGGCCTGGGCGAAGATATTTCTGGGATCACTAACGTCATAGTTGTGTTCCAGGATGAGATCGTCATAGGCCATTTTTACAAAGCGCGGGCGGAGGGTGCCAGACTGCGGTATAATGGTTCCATCCGGCCCAGGGGCGTAGTTACCCTCACAGATTTGCATTTCCCACGCTTTGAGTTCAGATGGGGGGATCATGTCTACCTGCGGGGCGATGAAGAAAACGGTTTCCGGGGTAGGGGAGATCAGCTGGGAAGAAAGCAGGTTCCTGAGCAGCTGCGACTTACCGCAGCCGGTGGGCCCGTAAATCACACCTATTACCGGCTGCAACTGGTAGTTAAGAGAGCTGCAGCTGCCGTCATCCCTGAGCAGGGGGGCCACTTCGTTAAGCATGTCCCTGACTCGCATGTTTTCCCTGACCAAATCCGCCAGAAGGCGCTCGCCGCCCAGCGATAGCAGTTCTTGCAAGGAAGCAAAGTTTTTCAACGGTTTGAGACCGTCCGCCGTAGGCATGCTTTTGAGCGTTTGACCAAGCAGTTCCAGGCGGTCCCACAGCTCGGTCACCTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCATATCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGGCGGCTTTCGCTGTACGGCAGTAGTCGGTGCTCGTCCAGACGGGCCAGGGTCATGTCTTTCCACGGGCGCAGGGTCCTCGTCAGCGTAGTCTGGGTCACGGTGAAGGGGTGCGCTCCGGGCTGCGCGCTGGCCAGGGTGCGCTTGAGGCTGGTCCTGCTGGTGCTGAAGCGCTGCCGGTCTTCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCATTTGACCATGGTGTCATAGTCCAGCCCCTCCGCGGCGTGGCCCTTGGCGCGCAGCTTGCCCTTGGAGGAGGCGCCGCACGAGGGGCAGTGCAGACTTTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGCGCGAGAAATACCGATTCCGGGGAGTAGGCATCCGCGCCGCAGGCCCCGCAGACGGTCTCGCATTCCACGAGCCAGGTGAGCTCTGGCCGTTCGGGGTCAAAAACCAGGTTTCCCCCATGCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGGTTTCCATGAGCCGGTGTCCACGCTCGGTGACGAAAAGGCTGTCCGTGTCCCCGTATACAGACTTGAGAGGCCTGTCCTCGAGCGGTGTTCCGCGGTCCTCCTCGTATAGAAACTCGGACCACTCTGAGACAAAGGCTCGCGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCTAAGTGGGAGGGGTAGCGGTCGTTGTCCACTAGGGGGTCCACTCGCTCCAGGGTGTGAAGACACATGTCGCCCTCTTCGGCATCAAGGAAGGTGATTGGTTTGTAGGTGTAGGCCACGTGACCGGGTGTTCCTGAAGGGGGGCTATAAAAGGGGGTGGGGGCGCGTTCGTCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTGAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCATCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGGTGGCAAACGACCCGTAGAGGGCGTTGGACAGCAACTTGGCGATGGAGCGCAGGGTTTGGTTTTTGTCGCGATCGGCGCGCTCCTTGGCCGCGATGTTTAGCTGCACGTATTCGCGCGCAACGCACCGCCATTCGGGAAAGACGGTGGTGCGCTCGTCGGGCACCAGGTGCACGCGCCAACCGCGGTTGTGCAGGGTGACAAGGTCAACGCTGGTGGCTACCTCTCCGCGTAGGCGCTCGTTGGTCCAGCAGAGGCGGCCGCCCTTGCGCGAGCAGAATGGCGGTAGGGGGTCTAGCTGCGTCTCGTCCGGGGGGTCTGCGTCCACGGTAAAGACCCCGGGCAGCAGGCGCGCGTCGAAGTAGTCTATCTTGCATCCTTGCAAGTCTAGCGCCTGCTGCCATGCGCGGGCGGCAAGCGCGCGCTCGTATGGGTTGAGTGGGGGACCCCATGGCATGGGGTGGGTGAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAAATGTCGTAAACGTAGAGGGGCTCTCTGAGTATTCCAAGATATGTAGGGTAGCATCTTCCACCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAATCGTATAGTTCGTGCGAGGGAGCGAGGAGGTCGGGACCGAGGTTGCTACGGGCGGGCTGCTCTGCTCGGAAGACTATCTGCCTGAAGATGGCATGTGAGTTGGATGATATGGTTGGACGCTGGAAGACGTTGAAGCTGGCGTCTGTGAGACCTACCGCGTCACGCACGAAGGAGGCGTAGGAGTCGCGCAGCTTGTTGACCAGCTCGGCGGTGACCTGCACGTCTAGGGCGCAGTAGTCCAGGGTTTCCTTGATGATGTCATACTTATCCTGTCCCTTTTTTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTGGTAGGCGCAGCATCCCTTTTCTACGGGTAGCGCGTATGCCTGCGCGGCCTTCCGGAGCGAGGTGTGGGTGAGCGCAAAGGTGTCCCTGACCATGACTTTGAGGTACTGGTATTTGAAGTCAGTGTCGTCGCATCCGCCCTGCTCCCAGAGCAAAAAGTCCGTGCGCTTTTTGGAACGCGGATTTGGCAGGGCGAAGGTGACATCGTTGAAGAGTATCTTTCCCGCGCGAGGCATAAAGTTGCGTGTGATGCGGAAGGGTCCCGGCACCTCGGAACGGTTGTTAATTACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCAAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACAATGTAAAGTTCCAAGAAGCGCGGGATGCCCTTGATGGAAGGCAATTTTTTAAGTTCCTCGTAGGTGAGCTCTTCAGGGGAGCTGAGCCCGTGCTCTGAAAGGGCCCAGTCTGCAAGATGAGGGTTGGAAGCGACGAATGAGCTCCACAGGTCACGGGCCATTAGCATTTGCAGGTGGTCGCGAAAGGTCCTAAACTGGCGACCTATGGCCATTTTTTCTGGGGTGATGCAGTAGAAGGTAAGCGGGTCTTGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGTTCGCGGCTAGGTCTCGCGCGGCAGTCACTAGAGGCTCATCTCCGCCGAACTTCATGACCAGCATGAAGGGCACGAGCTGCTTCCCAAAGGCCCCCATCCAAGTATAGGTCTCTACATCGTAGGTGACAAAGAGACGCTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATCGGGAAGAACTGGATCTCCCGCCACCAATTGGAGGAGTGGCTATTGATGTGGTGAAAGTAGAAGTCCCTGCGACGGGCCGAACACTCGTGCTGGCTTTTGTAAAAACGTGCGCAGTACTGGCAGCGGTGCACGGGCTGTACATCCTGCACGAGGTTGACCTGACGACCGCGCACAAGGAAGCAGAGTGGGAATTTGAGCCCCTCGCCTGGCGGGTTTGGCTGGTGGTCTTCTACTTCGGCTGCTTGTCCTTGACCGTCTGGCTGCTCGAGGGGAGTTACGGTGGATCGGACCACCACGCCGCGCGAGCCCAAAGTCCAGATGTCCGCGCGCGGCGGTCGGAGCTTGATGACAACATCGCGCAGATGGGAGCTGTCCATGGTCTGGAGCTCCCGCGGCGTCAGGTCAGGCGGGAGCTCCTGCAGGTTTACCTCGCATAGACGGGTCAGGGCGCGGGCTAGATCCAGGTGATACCTAATTTCCAGGGGCTGGTTGGTGGCGGCGTCGATGGCTTGCAAGAGGCCGCATCCCCGCGGCGCGACTACGGTACCGCGCGGCGGGCGGTGGGCCGCGGGGGTGTCCTTGGATGATGCATCTAAAAGCGGTGACGCGGGCGAGCCCCCGGAGGTAGGGGGGGCTCCGGACCCGCCGGGAGAGGGGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGCAGGAGCTGGTGCTGCGCGCGTAGGTTGCTGGCGAACGCGACGACGCGGCGGTTGATCTCCTGAATCTGGCGCCTCTGCGTGAAGACGACGGGCCCGGTGAGCTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATTTCGGTGTCGTTGACGGCGGCCTGGCGCAAAATCTCCTGCACGTCTCCTGAGTTGTCTTGATAGGCGATCTCGGCCATGAACTGCTCGATCTCTTCCTCCTGGAGATCTCCGCGTCCGGCTCGCTCCACGGTGGCGGCGAGGTCGTTGGAAATGCGGGCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTGAGGCCTCCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGCCCCCTTCGGCATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGCGCGAGATTGAGCTCCACGTGCCGGGCGAAGACGGCGTAGTTTCGCAGGCGCTGAAAGAGGTAGTTGAGGGTGGTGGCGGTGTGTTCTGCCACGAAGAAGTACATAACCCAGCGTCGCAACGTGGATTCGTTGATATCCCCCAAGGCCTCAAGGCGCTCCATGGCCTCGTAGAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGACACGGTTAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGACAGTGTCGCGCACCTCGCGCTCAAAGGCTACAGGGGCCTCTTCTTCTTCTTCAATCTCCTCTTCCATAAGGGCCTCCCCTTCTTCTTCTTCTGGCGGCGGTGGGGGAGGGGGGACACGGCGGCGACGACGGCGCACCGGGAGGCGGTCGACAAAGCGCTCGATCATCTCCCCGCGGCGACGGCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGGCCGTTCTCGCGGGGGCGCAGTTGGAAGACGCCGCCCGTCATGTCCCGGTTATGGGTTGGCGGGGGGCTGCCATGCGGCAGGGATACGGCGCTAACGATGCATCTCAACAATTGTTGTGTAGGTACTCCGCCGCCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGCGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGACAGAAGCACCATGTCCTTGGGTCCGGCCTGCTGAATGCGCAGGCGGTCGGCCATGCCCCAGGCTTCGTTTTGACATCGGCGCAGGTCTTTGTAGTAGTCTTGCATGAGCCTTTCTACCGGCACTTCTTCTTCTCCTTCCTCTTGTCCTGCATCTCTTGCATCTATCGCTGCGGCGGCGGCGGAGTTTGGCCGTAGGTGGCGCCCTCTTCCTCCCATGCGTGTGACCCCGAAGCCCCTCATCGGCTGAAGCAGGGCTAGGTCGGCGACAACGCGCTCGGCTAATATGGCCTGCTGCACCTGCGTGAGGGTAGACTGGAAGTCATCCATGTCCACAAAGCGGTGGTATGCGCCCGTGTTGATGGTGTAAGTGCAGTTGGCCATAACGGACCAGTTAACGGTCTGGTGACCCGGCTGCGAGAGCTCGGTGTACCTGAGACGCGAGTAAGCCCTCGAGTCAAATACGTAGTCGTTGCAAGTCCGCACCAGGTACTGGTATCCCACCAAAAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGGGGCCAGCGTAGGGTGGCCGGGGCTCCGGGGGCGAGATCTTCCAACATAAGGCGATGATATCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGAAAGTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAAAAAGTGCTCCATGGTCGGGACGCTCTGGCCGGTCAGGCGCGCGCAATCGTTGACGCTCTAGCGTGCAAAAGGAGAGCCTGTAAGCGGGCACTCTTCCGTGGTCTGGTGGATAAATTCGCAAGGGTATCATGGCGGACGACCGGGGTTCGAGCCCCGTATCCGGCCGTCCGCCGTGATCCATGCGGTTACCGCCCGCGTGTCGAACCCAGGTGTGCGACGTCAGACAACGGGGGAGTGCTCCTTTTGGCTTCCTTCCAGGCGCGGCGGCTGCTGCGCTAGCTTTTTTGGCCACTGGCCGCGCGCAGCGTAAGCGGTTAGGCTGGAAAGCGAAAGCATTAAGTGGCTCGCTCCCTGTAGCCGGAGGGTTATTTTCCAAGGGTTGAGTCGCGGGACCCCCGGTTCGAGTCTCGGACCGGCCGGACTGCGGCGAACGGGGGTTTGCCTCCCCGTCATGCAAGACCCCGCTTGCAAATTCCTCCGGAAACAGGGACGAGCCCCTTTTTTGCTTTTCCCAGATGCATCCGGTGCTGCGGCAGATGCGCCCCCCTCCTCAGCAGCGGCAAGAGCAAGAGCAGCGGCAGACATGCAGGGCACCCTCCCCTCCTCCTACCGCGTCAGGAGGGGCGACATCCGCGGTTGACGCGGCAGCAGATGGTGATTACGAACCCCCGCGGCGCCGGGCCCGGCACTACCTGGACTTGGAGGAGGGCGAGGGCCTGGCGCGGCTAGGAGCGCCCTCTCCTGAGCGGCACCCAAGGGTGCAGCTGAAGCGTGATACGCGTGAGGCGTACGTGCCGCGGCAGAACCTGTTTCGCGACCGCGAGGGAGAGGAGCCCGAGGAGATGCGGGATCGAAAGTTCCACGCAGGGCGCGAGCTGCGGCATGGCCTGAATCGCGAGCGGTTGCTGCGCGAGGAGGACTTTGAGCCCGACGCGCGAACCGGGATTAGTCCCGCGCGCGCACACGTGGCGGCCGCCGACCTGGTAACCGCATACGAGCAGACGGTGAACCAGGAGATTAACTTTCAAAAAAGCTTTAACAACCACGTGCGTACGCTTGTGGCGCGCGAGGAGGTGGCTATAGGACTGATGCATCTGTGGGACTTTGTAAGCGCGCTGGAGCAAAACCCAAATAGCAAGCCGCTCATGGCGCAGCTGTTCCTTATAGTGCAGCACAGCAGGGACAACGAGGCATTCAGGGATGCGCTGCTAAACATAGTAGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTGCTCGATTTGATAAACATCCTGCAGAGCATAGTGGTGCAGGAGCGCAGCTTGAGCCTGGCTGACAAGGTGGCCGCCATCAACTATTCCATGCTTAGCCTGGGCAAGTTTTACGCCCGCAAGATATACCATACCCCTTACGTTCCCATAGACAAGGAGGTAAAGATCGAGGGGTTCTACATGCGCATGGCGCTGAAGGTGCTTACCTTGAGCGACGACCTGGGCGTTTATCGCAACGAGCGCATCCACAAGGCCGTGAGCGTGAGCCGGCGGCGCGAGCTCAGCGACCGCGAGCTGATGCACAGCCTGCAAAGGGCCCTGGCTGGCACGGGCAGCGGCGATAGAGAGGCCGAGTCCTACTTTGACGCGGGCGCTGACCTGCGCTGGGCCCCAAGCCGACGCGCCCTGGAGGCAGCTGGGGCCGGACCTGGGCTGGCGGTGGCACCCGCGCGCGCTGGCAACGTCGGCGGCGTGGAGGAATATGACGAGGACGATGAGTACGAGCCAGAGGACGGCGAGTACTAAGCGGTGATGTTTCTGATCAGATGATGCAAGACGCAACGGACCCGGCGGTGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCCTTAACTCCACGGACGACTGGCGCCAGGTCATGGACCGCATCATGTCGCTGACTGCGCGCAATCCTGACGCGTTCCGGCAGCAGCCGCAGGCCAACCGGCTCTCCGCAATTCTGGAAGCGGTGGTCCCGGCGCGCGCAAACCCCACGCACGAGAAGGTGCTGGCGATCGTAAACGCGCTGGCCGAAAACAGGGCCATCCGGCCCGACGAGGCCGGCCTGGTCTACGACGCGCTGCTTCAGCGCGTGGCTCGTTACAACAGCGGCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGGCTGGTGGGGGATGTGCGCGAGGCCGTGGCGCAGCGTGAGCGCGCGCAGCAGCAGGGCAACCTGGGCTCCATGGTTGCACTAAACGCCTTCCTGAGTACACAGCCCGCCAACGTGCCGCGGGGACAGGAGGACTACACCAACTTTGTGAGCGCACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACACCGCAAAGTGAGGTGTACCAGTCTGGGCCAGACTATTTTTTCCAGACCAGTAGACAAGGCCTGCAGACCGTAAACCTGAGCCAGGCTTTCAAAAACTTGCAGGGGCTGTGGGGGGTGCGGGCTCCCACAGGCGACCGCGCGACCGTGTCTAGCTTGCTGACGCCCAACTCGCGCCTGTTGCTGCTGCTAATAGCGCCCTTCACGGACAGTGGCAGCGTGTCCCGGGACACATACCTAGGTCACTTGCTGACACTGTACCGCGAGGCCATAGGTCAGGCGCATGTGGACGAGCATACTTTCCAGGAGATTACAAGTGTCAGCCGCGCGCTGGGGCAGGAGGACACGGGCAGCCTGGAGGCAACCCTAAACTACCTGCTGACCAACCGGCGGCAGAAGATCCCCTCGTTGCACAGTTTAAACAGCGAGGAGGAGCGCATTTTGCGCTACGTGCAGCAGAGCGTGAGCCTTAACCTGATGCGCGACGGGGTAACGCCCAGCGTGGCGCTGGACATGACCGCGCGCAACATGGAACCGGGCATGTATGCCTCAAACCGGCCGTTTATCAACCGCCTAATGGACTACTTGCATCGCGCGGCCGCCGTGAACCCCGAGTATTTCACCAATGCCATCTTGAACCCGCACTGGCTACCGCCCCCTGGTTTCTACACCGGGGGATTCGAGGTGCCCGAGGGTAACGATGGATTCCTCTGGGACGACATAGACGACAGCGTGTTTTCCCCGCAACCGCAGACCCTGCTAGAGTTGCAACAGCGCGAGCAGGCAGAGGCGGCGCTGCGAAAGGAAAGCTTCCGCAGGCCAAGCAGCTTGTCCGATCTAGGCGCTGCGGCCCCGCGGTCAGATGCTAGTAGCCCATTTCCAAGCTTGATAGGGTCTCTTACCAGCACTCGCACCACCCGCCCGCGCCTGCTGGGCGAGGAGGAGTACCTAAACAACTCGCTGCTGCAGCCGCAGCGCGAAAAAAACCTGCCTCCGGCATTTCCCAACAACGGGATAGAGAGCCTAGTGGACAAGATGAGTAGATGGAAGACGTACGCGCAGGAGCACAGGGACGTGCCAGGCCCGCGCCCGCCCACCCGTCGTCAAAGGCACGACCGTCAGCGGGGTCTGGTGTGGGAGGACGATGACTCGGCAGACGACAGCAGCGTCCTGGATTTGGGAGGGAGTGGCAACCCGTTTGCGCACCTTCGCCCCAGGCTGGGGAGAATGTTTTAAAAAAAAAAAAGCATGATGCAAAATAAAAAACTCACCAAGGCCATGGCACCGAGCGTTGGTTTTCTTGTATTCCCCTTAGTATGCGGCGCGCGGCGATGTATGAGGAAGGTCCTCCTCCCTCCTACGAGAGTGTGGTGAGCGCGGCGCCAGTGGCGGCGGCGCTGGGTTCTCCCTTCGATGCTCCCCTGGACCCGCCGTTTGTGCCTCCGCGGTACCTGCGGCCTACCGGGGGGAGAAACAGCATCCGTTACTCTGAGTTGGCACCCCTATTCGACACCACCCGTGTGTACCTGGTGGACAACAAGTCAACGGATGTGGCATCCCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTTCTGACCACGGTCATTCAAAACAATGACTACAGCCCGGGGGAGGCAAGCACACAGACCATCAATCTTGACGACCGGTCGCACTGGGGCGGCGACCTGAAAACCATCCTGCATACCAACATGCCAAATGTGAACGAGTTCATGTTTACCAATAAGTTTAAGGCGCGGGTGATGGTGTCGCGCTTGCCTACTAAGGACAATCAGGTGGAGCTGAAATACGAGTGGGTGGAGTTCACGCTGCCCGAGGGCAACTACTCCGAGACCATGACCATAGACCTTATGAACAACGCGATCGTGGAGCACTACTTGAAAGTGGGCAGACAGAACGGGGTTCTGGAAAGCGACATCGGGGTAAAGTTTGACACCCGCAACTTCAGACTGGGGTTTGACCCCGTCACTGGTCTTGTCATGCCTGGGGTATATACAAACGAAGCCTTCCATCCAGACATCATTTTGCTGCCAGGATGCGGGGTGGACTTCACCCACAGCCGCCTGAGCAACTTGTTGGGCATCCGCAAGCGGCAACCCTTCCAGGAGGGCTTTAGGATCACCTACGATGATCTGGAGGGTGGTAACATTCCCGCACTGTTGGATGTGGACGCCTACCAGGCGAGCTTGAAAGATGACACCGAACAGGGCGGGGGTGGCGCAGGCGGCAGCAACAGCAGTGGCAGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACGCGGCAGCCGCGGCAATGCAGCCGGTGGAGGACATGAACGATCATGCCATTCGCGGCGACACCTTTGCCACACGGGCTGAGGAGAAGCGCGCTGAGGCCGAAGCAGCGGCCGAAGCTGCCGCCCCCGCTGCGCAACCCGAGGTCGAGAAGCCTCAGAAGAAACCGGTGATCAAACCCCTGACAGAGGACAGCAAGAAACGCAGTTACAACCTAATAAGCAATGACAGCACCTTCACCCAGTACCGCAGCTGGTACCTTGCATACAACTACGGCGACCCTCAGACCGGAATCCGCTCATGGACCCTGCTTTGCACTCCTGACGTAACCTGCGGCTCGGAGCAGGTCTACTGGTCGTTGCCAGACATGATGCAAGACCCCGTGACCTTCCGCTCCACGCGCCAGATCAGCAACTTTCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTGTTGCCCGTGCACTCCAAGAGCTTCTACAACGACCAGGCCGTCTACTCCCAACTCATCCGCCAGTTTACCTCTCTGACCCACGTGTTCAATCGCTTTCCCGAGAACCAGATTTTGGCGCGCCCGCCAGCCCCCACCATCACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACGCTACCGCTGCGCAACAGCATCGGAGGAGTCCAGCGAGTGACCATTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTTTACAAGGCCCTGGGCATAGTCTCGCCGCGCGTCCTATCGAGCCGCACTTTTTGAGCAAGCATGTCCATCCTTATATCGCCCAGCAATAACACAGGCTGGGGCCTGCGCTTCCCAAGCAAGATGTTTGGCGGGGCCAAGAAGCGCTCCGACCAACACCCAGTGCGCGTGCGCGGGCACTACCGCGCGCCCTGGGGCGCGCACAAACGCGGCCGCACTGGGCGCACCACCGTCGATGACGCCATCGACGCGGTGGTGGAGGAGGCGCGCAACTACACGCCCACGCCGCCACCAGTGTCCACAGTGGACGCGGCCATTCAGACCGTGGTGCGCGGAGCCCGGCGCTATGCTAAAATGAAGAGACGGCGGAGGCGCGTAGCACGTCGCCACCGCCGCCGACCCGGCACTGCCGCCCAACGCGCGGCGGCGGCCCTGCTTAACCGCGCACGTCGCACCGGCCGACGGGCGGCCATGCGGGCCGCTCGAAGGCTGGCCGCGGGTATTGTCACTGTGCCCCCCAGGTCCAGGCGACGAGCGGCCGCCGCAGCAGCCGCGGCCATTAGTGCTATGACTCAGGGTCGCAGGGGCAACGTGTATTGGGTGCGCGACTCGGTTAGCGGCCTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCGCGCAACTAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCGTACTGTTGTATGTATCCAGCGGCGGCGGCGCGCAACGAAGCTATGTCCAAGCGCAAAATCAAAGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCGGAGATCTATGGCCCCCCGAAGAAGGAAGAGCAGGATTACAAGCCCCGAAAGCTAAAGCGGGTCAAAAAGAAAAAGAAAGATGATGATGATGAACTTGACGACGAGGTGGAACTGCTGCACGCTACCGCGCCCAGGCGACGGGTACAGTGGAAAGGTCGACGCGTAAAACGTGTTTTGCGACCCGGCACCACCGTAGTCTTTACGCCCGGTGAGCGCTCCACCCGCACCTACAAGCGCGTGTATGATGAGGTGTACGGCGACGAGGACCTGCTTGAGCAGGCCAACGAGCGCCTCGGGGAGTTTGCCTACGGAAAGCGGCATAAGGACATGCTGGCGTTGCCGCTGGACGAGGGCAACCCAACACCTAGCCTAAAGCCCGTAACACTGCAGCAGGTGCTGCCCGCGCTTGCACCGTCCGAAGAAAAGCGCGGCCTAAAGCGCGAGTCTGGTGACTTGGCACCCACCGTGCAGCTGATGGTACCCAAGCGCCAGCGACTGGAAGATGTCTTGGAAAAAATGACCGTGGAACCTGGGCTGGAGCCCGAGGTCCGCGTGCGGCCAATCAAGCAGGTGGCGCCGGGACTGGGCGTGCAGACCGTGGACGTTCAGATACCCACTACCAGTAGCACCAGTATTGCCACCGCCACAGAGGGCATGGAGACACAAACGTCCCCGGTTGCCTCAGCGGTGGCGGATGCCGCGGTGCAGGCGGTCGCTGCGGCCGCGTCCAAGACCTCTACGGAGGTGCAAACGGACCCGTGGATGTTTCGCGTTTCAGCCCCCCGGCGCCCGCGCCGTTCGAGGAAGTACGGCGCCGCCAGCGCGCTACTGCCCGAATATGCCCTACATCCTTCCATTGCGCCTACCCCCGGCTATCGTGGCTACACCTACCGCCCCAGAAGACGAGCAACTACCCGACGCCGAACCACCACTGGAACCCGCCGCCGCCGTCGCCGTCGCCAGCCCGTGCTGGCCCCGATTTCCGTGCGCAGGGTGGCTCGCGAAGGAGGCAGGACCCTGGTGCTGCCAACAGCGCGCTACCACCCCAGCATCGTTTAAAAGCCGGTCTTTGTGGTTCTTGCAGATATGGCCCTCACCTGCCGCCTCCGTTTCCCGGTGCCGGGATTCCGAGGAAGAATGCACCGTAGGAGGGGCATGGCCGGCCACGGCCTGACGGGCGGCATGCGTCGTGCGCACCACCGGCGGCGGCGCGCGTCGCACCGTCGCATGCGCGGCGGTATCCTGCCCCTCCTTATTCCACTGATCGCCGCGGCGATTGGCGCCGTGCCCGGAATTGCATCCGTGGCCTTGCAGGCGCAGAGACACTGATTAAAAACAAGTTGCATGTGGAAAAATCAAAATAAAAAGTCTGGACTCTCACGCTCGCTTGGTCCTGTAACTATTTTGTAGAATGGAAGACATCAACTTTGCGTCTCTGGCCCCGCGACACGGCTCGCGCCCGTTCATGGGAAACTGGCAAGATATCGGCACCAGCAATATGAGCGGTGGCGCCTTCAGCTGGGGCTCGCTGTGGAGCGGCATTAAAAATTTCGGTTCCACCGTTAAGAACTATGGCAGCAAGGCCTGGAACAGCAGCACAGGCCAGATGCTGAGGGATAAGTTGAAAGAGCAAAATTTCCAACAAAAGGTGGTAGATGGCCTGGCCTCTGGCATTAGCGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCAGTGCAAAATAAGATTAACAGTAAGCTTGATCCCCGCCCTCCCGTAGAGGAGCCTCCACCGGCCGTGGAGACAGTGTCTCCAGAGGGGCGTGGCGAAAAGCGTCCGCGCCCCGACAGGGAAGAAACTCTGGTGACGCAAATAGACGAGCCTCCCTCGTACGAGGAGGCACTAAAGCAAGGCCTGCCCACCACCCGTCCCATCGCGCCCATGGCTACCGGAGTGCTGGGCCAGCACACACCCGTAACGCTGGACCTGCCTCCCCCCGCCGACACCCAGCAGAAACCTGTGCTGCCAGGCCCGACCGCCGTTGTTGTAACCCGTCCTAGCCGCGCGTCCCTGCGCCGCGCCGCCAGCGGTCCGCGATCGTTGCGGCCCGTAGCCAGTGGCAACTGGCAAAGCACACTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGGGTGCAATCCCTGAAGCGCCGACGATGCTTCTGATAGCTAACGTGTCGTATGTGTGTCATGTATGCGTCCATGTCGCCGCCAGAGGAGCTGCTGAGCCGCCGCGCGCCCGCTTTCCAAGATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACAGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTAAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCAGCCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGCTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTATAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCAGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAAAGAAGCAAGCAACATCAACAACAGCTGCCGCCATGGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAAGCCATTGTCAAAGATCTTGGTTGTGGGCCATATTTTTTGGGCACCTATGACAAGCGCTTTCCAGGCTTTGTTTCTCCACACAAGCTCGCCTGCGCCATAGTCAATACGGCCGGTCGCGAGACTGGGGGCGTACACTGGATGGCCTTTGCCTGGAACCCGCACTCAAAAACATGCTACCTCTTTGAGCCCTTTGGCTTTTCTGACCAGCGACTCAAGCAGGTTTACCAGTTTGAGTACGAGTCACTCCTGCGCCGTAGCGCCATTGCTTCTTCCCCCGACCGCTGTATAACGCTGGAAAAGTCCACCCAAAGCGTACAGGGGCCCAACTCGGCCGCCTGTGGACTATTCTGCTGCATGTTTCTCCACGCCTTTGCCAACTGGCCCCAAACTCCCATGGATCACAACCCCACCATGAACCTTATTACCGGGGTACCCAACTCCATGCTCAACAGTCCCCAGGTACAGCCCACCCTGCGTCGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGCTTTTATTTGTACACTCTCGGGTGATTATTTACCCCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCGCTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGCGCGTGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAAAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATAAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCGTGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTTCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGATGCTTGTAGGTCACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTCAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGTTTGAAGTTCGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAGCGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCACACTCAGCGGGTTCATCACCGTAATTTCACTTTCCGCTTCGCTGGGCTCTTCCTCTTCCTCTTGCGTCCGCATACCACGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACTGTGCGCTTACCTCCTTTGCCATGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATTACCTCTGGTGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAAGGGCGCTTCTTTTTCTTCTTGGGCGCAATGGCCAAATCCGCCGCCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCGTCTTGTGATGAGTCTTCCTCGTCCTCGGACTCGATACGCCGCCTCATCCGCTTTTTTGGGGGCGCCCGGGGAGGCGGCGGCGACGGGGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGGGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATTTCCTTCTCCTATAGGCAGAAAAAGATCATGGAGTCAGTCGAGAAGAAGGACAGCCTAACCGCCCCCTCTGAGTTCGCCACCACCGCCTCCACCGATGCCGCCAACGCGCCTACCACCTTCCCCGTCGAGGCACCCCCGCTTGAGGAGGAGGAAGTGATTATCGAGCAGGACCCAGGTTTTGTAAGCGAAGACGACGAGGACCGCTCAGTACCAACAGAGGATAAAAAGCAAGACCAGGACAACGCAGAGGCAAACGAGGAACAAGTCGGGCGGGGGGACGAAAGGCATGGCGACTACCTAGATGTGGGAGACGACGTGCTGTTGAAGCATCTGCAGCGCCAGTGCGCCATTATCTGCGACGCGTTGCAAGAGCGCAGCGATGTGCCCCTCGCCATAGCGGATGTCAGCCTTGCCTACGAACGCCACCTATTCTCACCGCGCGTACCCCCCAAACGCCAAGAAAACGGCACATGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCCGTATTTGCCGTGCCAGAGGTGCTTGCCACCTATCACATCTTTTTCCAAAACTGCAAGATACCCCTATCCTGCCGTGCCAACCGCAGCCGAGCGGACAAGCAGCTGGCCTTGCGGCAGGGCGCTGTCATACCTGATATCGCCTCGCTCAACGAAGTGCCAAAAATCTTTGAGGGTCTTGGACGCGACGAGAAGCGCGCGGCAAACGCTCTGCAACAGGAAAACAGCGAAAATGAAAGTCACTCTGGAGTGTTGGTGGAACTCGAGGGTGACAACGCGCGCCTAGCCGTACTAAAACGCAGCATCGAGGTCACCCACTTTGCCTACCCGGCACTTAACCTACCCCCCAAGGTCATGAGCACAGTCATGAGTGAGCTGATCGTGCGCCGTGCGCAGCCCCTGGAGAGGGATGCAAATTTGCAAGAACAAACAGAGGAGGGCCTACCCGCAGTTGGCGACGAGCAGCTAGCGCGCTGGCTTCAAACGCGCGAGCCTGCCGACTTGGAGGAGCGACGCAAACTAATGATGGCCGCAGTGCTCGTTACCGTGGAGCTTGAGTGCATGCAGCGGTTCTTTGCTGACCCGGAGATGCAGCGCAAGCTAGAGGAAACATTGCACTACACCTTTCGACAGGGCTACGTACGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTCTGCAACCTGGTCTCCTACCTTGGAATTTTGCACGAAAACCGCCTTGGGCAAAACGTGCTTCATTCCACGCTCAAGGGCGAGGCGCGCCGCGACTACGTCCGCGACTGCGTTTACTTATTTCTATGCTACACCTGGCAGACGGCCATGGGCGTTTGGCAGCAGTGCTTGGAGGAGTGCAACCTCAAGGAGCTGCAGAAACTGCTAAAGCAAAACTTGAAGGACCTATGGACGGCCTTCAACGAGCGCTCCGTGGCCGCGCACCTGGCGGACATCATTTTCCCCGAACGCCTGCTTAAAACCCTGCAACAGGGTCTGCCAGACTTCACCAGTCAAAGCATGTTGCAGAACTTTAGGAACTTTATCCTAGAGCGCTCAGGAATCTTGCCCGCCACCTGCTGTGCACTTCCTAGCGACTTTGTGCCCATTAAGTACCGCGAATGCCCTCCGCCGCTTTGGGGCCACTGCTACCTTCTGCAGCTAGCCAACTACCTTGCCTACCACTCTGACATAATGGAAGACGTGAGCGGTGACGGTCTACTGGAGTGTCACTGTCGCTGCAACCTATGCACCCCGCACCGCTCCCTGGTTTGCAATTCGCAGCTGCTTAACGAAAGTCAAATTATCGGTACCTTTGAGCTGCAGGGTCCCTCGCCTGACGAAAAGTCCGCGGCTCCGGGGTTGAAACTCACTCCGGGGCTGTGGACGTCGGCTTACCTTCGCAAATTTGTACCTGAGGACTACCACGCCCACGAGATTAGGTTCTACGAAGACCAATCCCGCCCGCCTAATGCGGAGCTTACCGCCTGCGTCATTACCCAGGGCCACATTCTTGGCCAATTGCAAGCCATCAACAAAGCCCGCCAAGAGTTTCTGCTACGAAAGGGACGGGGGGTTTACTTGGACCCCCAGTCCGGCGAGGAGCTCAACCCAATCCCCCCGCCGCCGCAGCCCTATCAGCAGCAGCCGCGGGCCCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAAAAAGAAGCTGCAGCTGCCGCCGCCACCCACGGACGAGGAGGAATACTGGGACAGTCAGGCAGAGGAGGTTTTGGACGAGGAGGAGGAGGACATGATGGAAGACTGGGAGAGCCTAGACGAGGAAGCTTCCGAGGTCGAAGAGGTGTCAGACGAAACACCGTCACCCTCGGTCGCATTCCCCTCGCCGGCGCCCCAGAAATCGGCAACCGGTTCCAGCATGGCTACAACCTCCGCTCCTCAGGCGCCGCCGGCACTGCCCGTTCGCCGACCCAACCGTAGATGGGACACCACTGGAACCAGGGCCGGTAAGTCCAAGCAGCCGCCGCCGTTAGCCCAAGAGCAACAACAGCGCCAAGGCTACCGCTCATGGCGCGGGCACAAGAACGCCATAGTTGCTTGCTTGCAAGACTGTGGGGGCAACATCTCCTTCGCCCGCCGCTTTCTTCTCTACCATCACGGCGTGGCCTTCCCCCGTAACATCCTGCATTACTACCGTCATCTCTACAGCCCATACTGCACCGGCGGCAGCGGCAGCAACAGCAGCGGCCACACAGAAGCAAAGGCGACCGGATAGCAAGACTCTGACAAAGCCCAAGAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGCAGGAGGAGGAGCGCTGCGTCTGGCGCCCAACGAACCCGTATCGACCCGCGAGCTTAGAAACAGGATTTTTCCCACTCTGTATGCTATATTTCAACAGAGCAGGGGCCAAGAACAAGAGCTGAAAATAAAAAACAGGTCTCTGCGATCCCTCACCCGCAGCTGCCTGTATCACAAAAGCGAAGATCAGCTTCGGCGCACGCTGGAAGACGCGGAGGCTCTCTTCAGTAAATACTGCGCGCTGACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTCAAATTTAAGCGCGAAAACTACGTCATCTCCAGCGGCCACACCCGGCGCCAGCACCTGTTGTCAGCGCCATTATGAGCAAGGAAATTCCCACGCCCTACATGTGGAGTTACCAGCCACAAATGGGACTTGCGGCTGGAGCTGCCCAAGACTACTCAACCCGAATAAACTACATGAGCGCGGGACCCCACATGATATCCCGGGTCAACGGAATACGCGCCCACCGAAACCGAATTCTCCTGGAACAGGCGGCTATTACCACCACACCTCGTAATAACCTTAATCCCCGTAGTTGGCCCGCTGCCCTGGTGTACCAGGAAAGTCCCGCTCCCACCACTGTGGTACTTCCCAGAGACGCCCAGGCCGAAGTTCAGATGACTAACTCAGGGGCGCAGCTTGCGGGCGGCTTTCGTCACAGGGTGCGGTCGCCCGGGCAGGGTATAACTCACCTGACAATCAGAGGGCGAGGTATTCAGCTCAACGACGAGTCGGTGAGCTCCTCGCTTGGTCTCCGTCCGGACGGGACATTTCAGATCGGCGGCGCCGGCCGCTCTTCATTCACGCCTCGTCAGGCAATCCTAACTCTGCAGACCTCGTCCTCTGAGCCGCGCTCTGGAGGCATTGGAACTCTGCAATTTATTGAGGAGTTTGTGCCATCGGTCTACTTTAACCCCTTCTCGGGACCTCCCGGCCACTATCCGGATCAATTTATTCCTAACTTTGACGCGGTAAAGGACTCGGCGGACGGCTACGACTGAATGTTAAGTGGAGAGGCAGAGCAACTGCGCCTGAAACACCTGGTCCACTGTCGCCGCCACAAGTGCTTTGCCCGCGACTCCGGTGAGTTTTGCTACTTTGAATTGCCCGAGGATCATATCGAGGGCCCGGCGCACGGCGTCCGGCTTACCGCCCAGGGAGAGCTTGCCCGTAGCCTGATTCGGGAGTTTACCCAGCGCCCCCTGCTAGTTGAGCGGGACAGGGGACCCTGTGTTCTCACTGTGATTTGCAACTGTCCTAACCCTGGATTACATCAAGATCCTCTAGTTAATGTCAGGTCGCCTAAGTCGATTAACTAGAGTACCCGGGGATCTTATTCCCTTTAACTAATAAAAAAAAATAATAAAGCATCACTTACTTAAAATCAGTTAGCAAATTTCTGTCCAGTTTATTCAGCAGCACCTCCTTGCCCTCCTCCCAGCTCTGGTATTGCAGCTTCCTCCTGGCTGCAAACTTTCTCCACAATCTAAATGGAATGTCAGTTTCCTCCTGTTCCTGTCCATCCGCACCCACTATCTTCATGTTGTTGCAGATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTCAACCCCGTGTATCCATATGACACGGAAACCGGTCCTCCAACTGTGCCTTTTCTTACTCCTCCCTTTGTATCCCCCAATGGGTTTCAAGAGAGTCCCCCTGGGGTACTCTCTTTGCGCCTATCCGAACCTCTAGTTACCTCCAATGGCATGCTTGCGCTCAAAATGGGCAACGGCCTCTCTCTGGACGAGGCCGGCAACCTTACCTCCCAAAATGTAACCACTGTGAGCCCACCTCTCAAAAAAACCAAGTCAAACATAAACCTGGAAATATCTGCACCCCTCACAGTTACCTCAGAAGCCCTAACTGTGGCTGCCGCCGCACCTCTAATGGTCGCGGGCAACACACTCACCATGCAATCACAGGCCCCGCTAACCGTGCACGACTCCAAACTTAGCATTGCCACCCAAGGACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAAGCTAGCCCTGCAAACATCAGGCCCCCTCACCACCACCGATAGCAGTACCCTTACTATCACTGCCTCACCCCCTCTAACTACTGCCACTGGTAGCTTGGGCATTGACTTGAAAGAGCCCATTTATACACAAAATGGAAAACTAGGACTAAAGTACGGGGCTCCTTTGCATGTAACAGACGACCTAAACACTTTGACCGTAGCAACTGGTCCAGGTGTGACTATTAATAATACTTCCTTGCAAACTAAAGTTACTGGAGCCTTGGGTTTTGATTCACAAGGCAATATGCAACTTAATGTAGCAGGAGGACTAAGGATTGATTCTCAAAACAGACGCCTTATACTTGATGTTAGTTATCCGTTTGATGCTCAAAACCAACTAAATCTAAGACTAGGACAGGGCCCTCTTTTTATAAACTCAGCCCACAACTTGGATATTAACTACAACAAAGGCCTTTACTTGTTTACAGCTTCAAACAATTCCAAAAAGCTTGAGGTTAACCTAAGCACTGCCAAGGGGTTGATGTTTGACGCTACAGCCATAGCCATTAATGCAGGAGATGGGCTTGAATTTGGTTCACCTAATGCACCAAACACAAATCCCCTCAAAACAAAAATTGGCCATGGCCTAGAATTTGATTCAAACAAGGCTATGGTTCCTAAACTAGGAACTGGCCTTAGTTTTGACAGCACAGGTGCCATTACAGTAGGAAACAAAAATAATGATAAGCTAACTTTGTGGACCACACCAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATGCAGAGAAAGATGCTAAACTCACTTTGGTCTTAACAAAATGTGGCAGTCAAATACTTGCTACAGTTTCAGTTTTGGCTGTTAAAGGCAGTTTGGCTCCAATATCTGGAACAGTTCAAAGTGCTCATCTTATTATAAGATTTGACGAAAATGGAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGGAACTTTAGAAATGGAGATCTTACTGAAGGCACAGCCTATACAAACGCTGTTGGATTTATGCCTAACCTATCAGCTTATCCAAAATCTCACGGTAAAACTGCCAAAAGTAACATTGTCAGTCAAGTTTACTTAAACGGAGACAAAACTAAACCTGTAACACTAACCATTACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTCCAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTACATTAATGAAATATTTGCCACATCCTCTTACACTTTTTCATACATTGCCCAAGAATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATTTTTCAATTGCAGAAAATTTCAAGTCATTTTTCATTCAGTAGTATAGCCCCACCACCACATAGCTTATACAGATCACCGTACCTTAATCAAACTCACAGAACCCTAGTATTCAACCTGCCACCTCCCTCCCAACACACAGAGTACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGGCCTTAAAAAGCATCATATCATGGGTAACAGACATATTCTTAGGTGTTATATTCCACACGGTTTCCTGTCGAGCCAAACGCTCATCAGTGATATTAATAAACTCCCCGGGCAGCTCACTTAAGTTCATGTCGCTGTCCAGCTGCTGAGCCACAGGCTGCTGTCCAACTTGCGGTTGCTTAACGGGCGGCGAAGGAGAAGTCCACGCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAGCAGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATAAGGCGCCTTGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGATCTCACTTAAATCAGCACAGTAACTGCAGCACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAAGGCGCTGTATCCAAAGCTCATGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCACAAGCGCAGGTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACACGCTGGACATAAACATTACCTCTTTTGGCATGTTGTAATTCACCACCTCCCGGTACCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACCACCATCCTAAACCAGCTGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATACACTGCAGGGAACCGGGACTGGAACAATGACAGTGGAGAGCCCAGGACTCGTAACCATGGATCATCATGCTCGTCATGATATCAATGTTGGCACAACACAGGCACACGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCTCCTCCCGCGTTAGAACCATATCCCAGGGAACAACCCATTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGACCTCGCACGTAACTCACGTTGTGCATTGTCAAAGTGTTACATTCGGGCAGCAGCGGATGATCCTCCAGTATGGTAGCGCGGGTTTCTGTCTCAAAAGGAGGTAGACGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGACAACCGAGATCGTGTTGGTCGTAGTGTCATGCCAAATGGAACGCCGGACGTAGTCATATTTCCTGAAGCAAAACCAGGTGCGGGCGTGACAAACAGATCTGCGTCTCCGGTCTCGCCGCTTAGATCGCTCTGTGTAGTAGTTGTAGTATATCCACTCTCTCAAAGCATCCAGGCGCCCCCTGGCTTCGGGTTCTATGTAAACTCCTTCATGCGCCGCTGCCCTGATAACATCCACCACCGCAGAATAAGCCACACCCAGCCAACCTACACATTCGTTCTGCGAGTCACACACGGGAGGAGCGGGAAGAGCTGGAAGAACCATGTTTTTTTTTTTATTCCAAAAGATTATCCAAAACCTCAAAATGAAGATCTATTAAGTGAACGCGCTCCCCTCCGGTGGCGTGGTCAAACTCTACAGCCAAAGAACAGATAATGGCATTTGTAAGATGTTGCACAATGGCTTCCAAAAGGCAAACGGCCCTCACGTCCAAGTGGACGTAAAGGCTAAACCCTTCAGGGTGAATCTCCTCTATAAACATTCCAGCACCTTCAACCATGCCCAAATAATTCTCATCTCGCCACCTTCTCAATATATCTCTAAGCAAATCCCGAATATTAAGTCCGGCCATTGTAAAAATCTGCTCCAGAGCGCCCTCCACCTTCAGCCTCAAGCAGCGAATCATGATTGCAAAAATTCAGGTTCCTCACAGACCTGTATAAGATTCAAAAGCGGAACATTAACAAAAATACCGCGATCCCGTAGGTCCCTTCGCAGGGCCAGCTGAACATAATCGTGCAGGTCTGCACGGACCAGCGCGGCCACTTCCCCGCCAGGAACCATGACAAAAGAACCCACACTGATTATGACACGCATACTCGGAGCTATGCTAACCAGCGTAGCCCCGATGTAAGCTTGTTGCATGGGCGGCGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAAAAATCAGGCAAAGCCTCGCGCAAAAAAGAAAGCACATCGTAGTCATGCTCATGCAGATAAAGGCAGGTAAGCTCCGGAACCACCACAGAAAAAGACACCATTTTTCTCTCAAACATGTCTGCGGGTTTCTGCATAAACACAAAATAAAATAACAAAAAAACATTTAAACATTAGAAGCCTGTCTTACAACAGGAAAAACAACCCTTATAAGCATAAGACGGACTACGGCCATGCCGGCGTGACCGTAAAAAAACTGGTCACCGTGATTAAAAAGCACCACCGACAGCTCCTCGGTCATGTCCGGAGTCATAATGTAAGACTCGGTAAACACATCAGGTTGATTCACATCGGTCAGTGCTAAAAAGCGACCGAAATAGCCCGGGGGAATACATACCCGCAGGCGTAGAGACAACATTACAGCCCCCATAGGAGGTATAACAAAATTAATAGGAGAGAAAAACACATAAACACCTGAAAAACCCTCCTGCCTAGGCAAAATAGCACCCTCCCGCTCCAGAACAACATACAGCGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAACCTATTAAAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGTGCAGAGCGAGTATATATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTCACTTCCCATTTTAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAACCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATT
SEQ ID NO: 10 : S1-N의 아미노 서열
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMMSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SEQ ID NO: 11 : TLR-3 작용제 서열
GAAACGATATGGGCTGAATACTTAAGTATTCAGCCCATATCGTTTC
SEQ ID NO: 12 : TLR-3 작용제 서열
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTAYGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGATGCATCGTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTCAGCTGCGGATCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTATCGAATTCAAGCTTGTCGACTCGAAGATCCTAGACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCCCTTTAGATATCATCGATGTCTCGGCGGTGGTGGCGCGTCGCGCCGCTGGGTTTTATAGGGCGCCGCCGCGGCCGCTCGAGCCATAAAAGGCAACTTTCGGAACGGCGCACGCTGATTGGCCCCGCGCCGCTCACTCACCGGCTTCGCCGCACGAGTGCAGCATTTTTTTACCCCCTCTCCCCTCCTTTTGCGAAAAAAAAAAAGAGCGAGAGCGAGATTGAGGAAGAGGAGGAGGGAGAGTTTTGGCGTTGGCCGCCTTGGGGTGCTGGGCGTCGACGATATCTAAGGGCGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCG
SEQ ID NO: 13 : TLR-3 작용제 서열
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTCAGCTGCGGATCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTATCGAATTCAAGCTTGTCGACTCGAAGATCGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAATAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACRGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATACTGGTACCGGGCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGATCCGCAGCTGAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTA
SEQ ID NO: 14 : TLR-3 작용제 서열
GATGGTACTTCAAGCTAGTACTTAAGTACTAGCTTGAAGCACCATC
SEQ ID NO: 15 : TLR-3 작용제 서열
GATGGTGCTTCAAGCTAGTACGAATCCGTACTAGCTTGAAGCACCATC
SEQ ID NO: 16 : TLR-3 작용제 서열
GAAACGATAGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC
SEQ ID NO: 17 : TLR-3 작용제 서열
CCTAATAATTATCAAAATGTGGATCCACATTTTGATAATTATTAGG
SEQ ID NO: 18 : TLR-3 작용제 서열
CCTAATAATTATCAAAATGTAATTACATTTTGATAATTATTAGG
SEQ ID NO: 19
UK B.1.1.7 S 단백질 변이체
GISAID 수탁 #EPI_ISL_601443
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIDDTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPINFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILARLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTHNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID NO: 20
S. African B.1.351 501Y.V2 S 단백질 변이체
GISAID 수탁 #EPI_ISL_678597
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22를 인코딩하는 JL82 삽입 DNA 서열
ATGGACGCCATGAAACGAGGCCTGTGCTGCGTCCTCCTGCTGTGTGGGGCAGTGTTCGTTAGTCACCAGAAGCGAACCGCAATGTTTCAGGACCCCCAGGAAAGGCCCCGAAAATTGCCGCAGCTGTGCACCGAGCTCCAGACAACCATTCATGACATCATTCTGGAGTGTGTGTATTGTAAGCAGCAGCTGTTGAGGAGGGAGGTGTATGACTTCGCTTTTCGGGACGGTTGCATTGTTTACCGGGATGGAAACCCTTACGCCGTTTGCGATAAATGTCTGAAGTTCTATAGCAAAATTAGTGAATATAGGCATTATTGCTACTCACTGTACGGAACCACACTGGAACAGCAGTATAACAAACCCCTGTGCGACCTTCTGATTAGGTGCATTAATTGTCAGAAACCGCTGTGCCCAGAGGAAAAGCAGCGCCATCTTGACAAGAAACAGAGATTCCATAACATCCGGGGCAGATGGACTGGACGCTGCATGTCTTGTTGTCGCTCCTCAAGGACGAGACGGGCCGCGGCTGCCAGGAAGAAACGTAGGATGCCCGGCGATACCCCGACACTGCACGAATATATGCTGGACCTCCAACCCGAGACGACAGATCTGTACGGTTACGAGCAACTGAACGACTCCTCCGAGGAAGAAGACGAAATCGACGGGCCCGCAGGTCAGGCAGCACCTGACCGCGCCCACTACAATATTGTCACCTTTTGCTGCAAATGTGACTCCACACTCCGAcgTTGTGTTCAATCAACCCACGTGGATATTCGAACTCTGGAGGATCTTCTGATGGGAACCCTGGGTATTGTATGCCCCATCTGCAGCCAAAAACCATAG
SEQ ID NO: 22 : SEQ ID NO: 21에 의해 인코드된 JL82 삽입 아미노산 서열(HPV16E6E7)
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRAAAARKKRRMPGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAAPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP*
SEQ ID NO: 23 : HPV16E6E7-T2A-SARS-COV-2 N 삽입 DNA 서열. T2A 펩티드를 인코딩하는 서열은 밑줄.
ATGGACGCCATGAAACGAGGCCTGTGCTGCGTCCTCCTGCTGTGTGGGGCAGTGTTCGTTAGTCACCAGAAGCGAACCGCAATGTTTCAGGACCCCCAGGAAAGGCCCCGAAAATTGCCGCAGCTGTGCACCGAGCTCCAGACAACCATTCATGACATCATTCTGGAGTGTGTGTATTGTAAGCAGCAGCTGTTGAGGAGGGAGGTGTATGACTTCGCTTTTCGGGACGGTTGCATTGTTTACCGGGATGGAAACCCTTACGCCGTTTGCGATAAATGTCTGAAGTTCTATAGCAAAATTAGTGAATATAGGCATTATTGCTACTCACTGTACGGAACCACACTGGAACAGCAGTATAACAAACCCCTGTGCGACCTTCTGATTAGGTGCATTAATTGTCAGAAACCGCTGTGCCCAGAGGAAAAGCAGCGCCATCTTGACAAGAAACAGAGATTCCATAACATCCGGGGCAGATGGACTGGACGCTGCATGTCTTGTTGTCGCTCCTCAAGGACGAGACGGGCCGCGGCTGCCAGGAAGAAACGTAGGATGCCCGGCGATACCCCGACACTGCACGAATATATGCTGGACCTCCAACCCGAGACGACAGATCTGTACGGTTACGAGCAACTGAACGACTCCTCCGAGGAAGAAGACGAAATCGACGGGCCCGCAGGTCAGGCAGCACCTGACCGCGCCCACTACAATATTGTCACCTTTTGCTGCAAATGTGACTCCACACTCCGAcgTTGTGTTCAATCAACCCACGTGGATATTCGAACTCTGGAGGATCTTCTGATGGGAACCCTGGGTATTGTATGCCCCATCTGCAGCCAAAAACCAGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGA
SEQ ID NO:23에 의해 인코드된 펩티드 서열들
HPV16E6E7(SEQ ID NO:22):
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDGCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRAAAARKKRRMPGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAAPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRRCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
SEQ ID NO: 24: T2A 아미노산 서열:
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SARS-COV-2 N 단백질(SEQ ID NO: 2)
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA*
SEQUENCE LISTING <110> VAXART, INC. <120> CHIMERIC ADENOVIRAL VECTORS <130> 090402-1295023-001903WO <140> PCT/US2022/014599 <141> 2022-01-31 <150> PCT/US2021/035930 <151> 2021-06-04 <150> 63/144,339 <151> 2021-02-01 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn 1010 1015 1020 Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys 1025 1030 1035 Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 1040 1045 1050 Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1055 1060 1065 Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His 1070 1075 1080 Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn 1085 1090 1095 Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln 1100 1105 1110 Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val 1115 1120 1125 Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro 1130 1135 1140 Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn 1145 1150 1155 His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu 1175 1180 1185 Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu 1190 1195 1200 Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu 1205 1210 1215 Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met 1220 1225 1230 Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro 1250 1255 1260 Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 2 <211> 419 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 2 Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr 1 5 10 15 Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg 20 25 30 Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn 35 40 45 Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu 50 55 60 Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro 65 70 75 80 Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly 85 90 95 Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110 Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp 115 120 125 Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp 130 135 140 His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln 145 150 155 160 Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn 180 185 190 Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala 195 200 205 Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 210 215 220 Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln 225 230 235 240 Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys 245 250 255 Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln 260 265 270 Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp 275 280 285 Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile 290 295 300 Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile 305 310 315 320 Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala 325 330 335 Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu 340 345 350 Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro 355 360 365 Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu 385 390 395 400 Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser 405 410 415 Thr Gln Ala <210> 3 <211> 3840 <212> DNA <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 3 ggtaccgcca ccatgtttgt ttttctcgta ctcctgcccc tggtttcctc ccaatgtgtc 60 aatctgacta cccggaccca acttcctccc gcctacacca attcctttac ccgaggtgtt 120 tactacccag acaaagtgtt caggtcatcc gtcctccata gtacccaaga cctcttcctc 180 cctttttttt ctaacgttac ctggtttcac gctattcacg ttagcggcac caacggcacc 240 aaaagattcg ataaccccgt actgccgttc aacgacgggg tatattttgc ctctactgaa 300 aaatcaaaca tcatacgcgg atggatcttt gggactaccc tggactcaaa aactcagtcc 360 ctgctgattg tgaataacgc taccaacgtg gtgatcaaag tctgtgaatt ccagttttgc 420 aacgatcctt ttctcggcgt ttattatcac aaaaataaca aatcctggat ggagagcgag 480 ttccgggtgt actcctccgc gaataattgc accttcgaat atgtgtctca gccattcctc 540 atggacctcg aggggaagca gggcaatttt aagaatctgc gagaattcgt gttcaagaat 600 atagacggtt acttcaagat ttactccaaa cacaccccga ttaacctggt tagggacttg 660 cctcagggct tttctgcatt ggagcccctc gtggacctcc caatcggcat aaacattaca 720 agatttcaga ctttgcttgc attgcacagg agctatttga cacccggcga ttcttcttcc 780 ggatggaccg ctggagcagc tgcttattac gtgggctatc tgcagcctcg aacctttctt 840 ttgaagtaca acgaaaatgg aactatcacc gatgcagttg actgcgccct ggaccccctg 900 tccgaaacta agtgcacgct caaaagtttc acagtagaga aggggatata ccagactagc 960 aatttccgcg ttcagccaac cgaaagtata gtgcgctttc ctaatataac taacctgtgt 1020 cctttcgggg aagtgtttaa cgccactaga ttcgcttccg tctacgcctg gaatagaaag 1080 aggatctcaa attgcgttgc tgactatagt gttttgtaca attccgcctc tttctcaacc 1140 ttcaaatgtt acggggtgag ccctaccaaa ctgaacgacc tgtgctttac aaacgtatac 1200 gccgacagct ttgttatcag aggagacgag gttcgccaga ttgctccggg tcagacaggc 1260 aagattgctg attataatta caaactgccc gacgacttta caggatgtgt gatcgcgtgg 1320 aacagtaaca atcttgactc aaaggttggg ggtaattata attatcttta ccggctgttc 1380 agaaaaagca atttgaaacc cttcgaaagg gacatatcca ccgagatcta tcaggccggg 1440 tccactccat gcaatggtgt ggaaggtttt aattgctact tcccattgca gtcttatgga 1500 ttccaaccaa ccaatggcgt aggctaccag ccgtatcgcg ttgtcgtgct cagcttcgag 1560 ctgctccacg cccccgcgac cgtatgcggt cctaagaagt ccaccaatct tgttaagaac 1620 aagtgtgtaa actttaactt taacgggctg accgggaccg gcgttctgac tgaatctaac 1680 aaaaaattcc tgcctttcca gcagttcggc cgcgatattg ctgacaccac tgacgctgta 1740 agagaccctc agacccttga aattctcgat atcacacctt gcagctttgg gggcgtgtcc 1800 gtcatcactc caggaactaa cacaagcaac caggtggcag tgttgtacca ggatgttaat 1860 tgtaccgagg tgccagtggc catccacgcc gatcaattga cacctacctg gagggtttac 1920 agcacagggt ccaatgtttt tcagacaaga gccggatgtc tgatcggtgc cgagcatgtc 1980 aacaattcct acgagtgtga tatccccatt ggtgcgggaa tttgtgcatc atatcagacc 2040 cagactaata gcccaagaag agctagatcc gtcgctagtc aatccatcat tgcatataca 2100 atgtccctgg gagctgagaa ttcagtcgcg tattcaaaca attccattgc tattcctact 2160 aatttcacta tctccgtcac gaccgagatc ctgccagttt ccatgactaa gacttctgtt 2220 gactgcacca tgtatatctg tggcgatagc accgagtgca gtaatctgct tctgcagtac 2280 ggctccttct gcacacaact caatcgagca ctgaccggta ttgcagttga gcaggacaag 2340 aacacacagg aggtctttgc acaggtcaaa caaatttaca aaaccccccc cataaaagac 2400 tttggtgggt tcaacttcag ccaaatcctc ccagatccca gcaagccctc caaaagatcc 2460 ttcatcgaag accttttgtt caataaggta accctggccg acgcaggctt catcaaacaa 2520 tatggcgatt gccttggaga cattgctgcg cgcgatttga tctgtgctca gaaatttaac 2580 ggtttgaccg tgctgccccc acttctgact gatgagatga tagcacagta tacttctgct 2640 cttctggcag gaacaatcac ttccgggtgg acctttggcg ctggtgcagc actgcaaatc 2700 cccttcgcaa tgcaaatggc ctaccgattc aatggtattg gtgttaccca gaacgtgctc 2760 tatgagaatc agaaactcat cgccaatcag ttcaatagcg ctattggcaa gattcaggat 2820 tccctcagct ctaccgccag cgctctgggg aagctccagg acgtggtgaa ccaaaatgct 2880 caagcgctca atacccttgt gaaacagctc agctccaatt ttggcgcaat tagcagcgtt 2940 ctgaatgata ttctgtcccg gctggacaag gtagaagcag aagtccagat cgacaggctg 3000 atcaccgggc ggttgcagag tctccagacc tatgtcacac aacagctgat ccgcgccgcc 3060 gagatcaggg cttccgctaa cctggccgcc actaagatgt ccgaatgcgt gttggggcag 3120 agtaagcggg tcgacttttg cgggaaggga taccatctga tgagcttccc tcagtctgca 3180 ccccacggag tagtgttcct ccacgtcaca tatgtgcccg ctcaggaaaa gaatttcaca 3240 accgcacctg ctatctgtca cgacggcaag gcccactttc ctagagaagg agttttcgta 3300 tctaacggca cccactggtt cgtgacacag cggaactttt acgagcctca gattataact 3360 acggacaaca ctttcgtgtc aggcaactgt gacgtggtga ttgggatcgt gaacaacaca 3420 gtctacgacc cattgcagcc cgagttggac tccttcaaag aggagcttga taagtatttc 3480 aagaaccata cctctcccga cgtggacctg ggggacatta gcggcatcaa tgcatccgtt 3540 gtgaatatcc agaaagaaat cgataggctg aatgaggtcg caaaaaatct taatgagtca 3600 ctgattgatc tgcaggaact cggcaaatat gagcagtata ttaagtggcc gtggtacata 3660 tggctcggct ttatcgccgg tctgattgcc atcgtgatgg tgaccattat gctgtgttgt 3720 atgacaagct gctgttcatg tctcaaagga tgctgctcct gcggtagctg ctgtaagttc 3780 gatgaagacg acagtgagcc cgtgctcaaa ggagtgaaac tccactacac ataacgatcg 3840 <210> 4 <211> 1278 <212> DNA <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 4 ggtaccgcca ccatgtccga taacggcccc cagaatcaga gaaacgctcc ccgcatcacg 60 ttcggcggac caagtgacag cacaggcagt aaccagaacg gagaacgctc cggtgctcgc 120 tccaagcagc gacggccgca agggcttccc aacaataccg ccagctggtt tacggctctg 180 acccaacacg ggaaagaaga tcttaaattc cccaggggcc agggcgtccc tatcaatact 240 aactccagcc cggatgatca gataggctac tatagacgcg ctacccgacg gatacgaggg 300 ggggacggca aaatgaagga cctttccccc cggtggtatt tctattactt gggcaccgga 360 ccagaagccg gactgcctta cggcgctaac aaagacggaa taatctgggt tgcgacggag 420 ggcgccctga atacacctaa agaccatatc ggcacaagaa atcctgctaa caatgccgcg 480 attgtgctcc agctgcctca gggaaccacg ctgcctaaag ggttttacgc tgaggggtca 540 agggggggga gtcaagcgtc tagtaggtca tcctctcgct ctcgcaatag ttcccggaac 600 tcaaccccag gcagcagcag aggaacctct cccgcacgga tggctggcaa tgggggagat 660 gctgcccttg ctctccttct gctggatcgc cttaaccagc tcgaatcaaa gatgtctgga 720 aaaggtcagc agcagcaagg ccagaccgtg acaaagaaga gtgcagctga agctagtaaa 780 aagccacgcc aaaaacggac cgcaactaag gcatataacg taacacaggc cttcggcaga 840 agaggtccag aacaaacaca gggaaacttt ggcgatcaag agctgattag acagggcaca 900 gattacaaac actggccaca gatcgcgcag tttgcaccaa gcgcctctgc attcttcggg 960 atgagtcgga ttgggatgga agtcactcca tccgggacct ggcttaccta cacaggggca 1020 ataaaactcg acgacaaaga cccaaacttt aaagatcagg tcatcctgct gaataaacac 1080 atcgatgcct acaaaacttt ccccccaacc gaaccaaaga aagacaagaa aaaaaaggca 1140 gacgaaacgc aagcgctccc tcagcgccag aagaagcagc agaccgttac actgttgcca 1200 gcagcagatc tggatgattt ttccaagcag cttcaacaga gtatgtcaag cgctgacagc 1260 actcaggctt gacgatcg 1278 <210> 5 <211> 3369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 ggtaccgcca ccatgtttgt ttttctcgta ctcctgcccc tggtttcctc ccaatgtgtc 60 aatctgacta cccggaccca acttcctccc gcctacacca attcctttac ccgaggtgtt 120 tactacccag acaaagtgtt caggtcatcc gtcctccata gtacccaaga cctcttcctc 180 cctttttttt ctaacgttac ctggtttcac gctattcacg ttagcggcac caacggcacc 240 aaaagattcg ataaccccgt actgccgttc aacgacgggg tatattttgc ctctactgaa 300 aaatcaaaca tcatacgcgg atggatcttt gggactaccc tggactcaaa aactcagtcc 360 ctgctgattg tgaataacgc taccaacgtg gtgatcaaag tctgtgaatt ccagttttgc 420 aacgatcctt ttctcggcgt ttattatcac aaaaataaca aatcctggat ggagagcgag 480 ttccgggtgt actcctccgc gaataattgc accttcgaat atgtgtctca gccattcctc 540 atggacctcg aggggaagca gggcaatttt aagaatctgc gagaattcgt gttcaagaat 600 atagacggtt acttcaagat ttactccaaa cacaccccga ttaacctggt tagggacttg 660 cctcagggct tttctgcatt ggagcccctc gtggacctcc caatcggcat aaacattaca 720 agatttcaga ctttgcttgc attgcacagg agctatttga cacccggcga ttcttcttcc 780 ggatggaccg ctggagcagc tgcttattac gtgggctatc tgcagcctcg aacctttctt 840 ttgaagtaca acgaaaatgg aactatcacc gatgcagttg actgcgccct ggaccccctg 900 tccgaaacta agtgcacgct caaaagtttc acagtagaga aggggatata ccagactagc 960 aatttccgcg ttcagccaac cgaaagtata gtgcgctttc ctaatataac taacctgtgt 1020 cctttcgggg aagtgtttaa cgccactaga ttcgcttccg tctacgcctg gaatagaaag 1080 aggatctcaa attgcgttgc tgactatagt gttttgtaca attccgcctc tttctcaacc 1140 ttcaaatgtt acggggtgag ccctaccaaa ctgaacgacc tgtgctttac aaacgtatac 1200 gccgacagct ttgttatcag aggagacgag gttcgccaga ttgctccggg tcagacaggc 1260 aagattgctg attataatta caaactgccc gacgacttta caggatgtgt gatcgcgtgg 1320 aacagtaaca atcttgactc aaaggttggg ggtaattata attatcttta ccggctgttc 1380 agaaaaagca atttgaaacc cttcgaaagg gacatatcca ccgagatcta tcaggccggg 1440 tccactccat gcaatggtgt ggaaggtttt aattgctact tcccattgca gtcttatgga 1500 ttccaaccaa ccaatggcgt aggctaccag ccgtatcgcg ttgtcgtgct cagcttcgag 1560 ctgctccacg cccccgcgac cgtatgcggt cctaagaagt ccaccaatct tgttaagaac 1620 aagtgtgtaa actttaactt taacgggctg accgggaccg gcgttctgac tgaatctaac 1680 aaaaaattcc tgcctttcca gcagttcggc cgcgatattg ctgacaccac tgacgctgta 1740 agagaccctc agacccttga aattctcgat atcacacctt gcagctttgg gggcgtgtcc 1800 gtcatcactc caggaactaa cacaagcaac caggtggcag tgttgtacca ggatgttaat 1860 tgtaccgagg tgccagtggc catccacgcc gatcaattga cacctacctg gagggtttac 1920 agcacagggt ccaatgtttt tcagacaaga gccggatgtc tgatcggtgc cgagcatgtc 1980 aacaattcct acgagtgtga tatccccatt ggtgcgggaa tttgtgcatc atatcagacc 2040 cagactaata gcccaagaag agctagatcc gtcgctagtc aatccatcat tgcatataca 2100 atgatgtccg ataacggccc ccagaatcag agaaacgctc cccgcatcac gttcggcgga 2160 ccaagtgaca gcacaggcag taaccagaac ggagaacgct ccggtgctcg ctccaagcag 2220 cgacggccgc aagggcttcc caacaatacc gccagctggt ttacggctct gacccaacac 2280 gggaaagaag atcttaaatt ccccaggggc cagggcgtcc ctatcaatac taactccagc 2340 ccggatgatc agataggcta ctatagacgc gctacccgac ggatacgagg gggggacggc 2400 aaaatgaagg acctttcccc ccggtggtat ttctattact tgggcaccgg accagaagcc 2460 ggactgcctt acggcgctaa caaagacgga ataatctggg ttgcgacgga gggcgccctg 2520 aatacaccta aagaccatat cggcacaaga aatcctgcta acaatgccgc gattgtgctc 2580 cagctgcctc agggaaccac gctgcctaaa gggttttacg ctgaggggtc aagggggggg 2640 agtcaagcgt ctagtaggtc atcctctcgc tctcgcaata gttcccggaa ctcaacccca 2700 ggcagcagca gaggaacctc tcccgcacgg atggctggca atgggggaga tgctgccctt 2760 gctctccttc tgctggatcg ccttaaccag ctcgaatcaa agatgtctgg aaaaggtcag 2820 cagcagcaag gccagaccgt gacaaagaag agtgcagctg aagctagtaa aaagccacgc 2880 caaaaacgga ccgcaactaa ggcatataac gtaacacagg ccttcggcag aagaggtcca 2940 gaacaaacac agggaaactt tggcgatcaa gagctgatta gacagggcac agattacaaa 3000 cactggccac agatcgcgca gtttgcacca agcgcctctg cattcttcgg gatgagtcgg 3060 attgggatgg aagtcactcc atccgggacc tggcttacct acacaggggc aataaaactc 3120 gacgacaaag acccaaactt taaagatcag gtcatcctgc tgaataaaca catcgatgcc 3180 tacaaaactt tccccccaac cgaaccaaag aaagacaaga aaaaaaaggc agacgaaacg 3240 caagcgctcc ctcagcgcca gaagaagcag cagaccgtta cactgttgcc agcagcagat 3300 ctggatgatt tttccaagca gcttcaacag agtatgtcaa gcgctgacag cactcaggct 3360 tgacgatcg 3369 <210> 6 <211> 7310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc 600 tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tgactctagc ctagctctga 660 agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 720 caatagaaac tgggcatgtg gagacagaga agactcttgg gtttctgata ggcactgact 780 ctctctgcct attggtctat tttcccaccc ttaggctgct ggtctgagcc taggagatct 840 ctcgaggtcg acggtatcga tgggtaccgc caccatgttt gtttttctcg tactcctgcc 900 cctggtttcc tcccaatgtg tcaatctgac tacccggacc caacttcctc ccgcctacac 960 caattccttt acccgaggtg tttactaccc agacaaagtg ttcaggtcat ccgtcctcca 1020 tagtacccaa gacctcttcc tccctttttt ttctaacgtt acctggtttc acgctattca 1080 cgttagcggc accaacggca ccaaaagatt cgataacccc gtactgccgt tcaacgacgg 1140 ggtatatttt gcctctactg aaaaatcaaa catcatacgc ggatggatct ttgggactac 1200 cctggactca aaaactcagt ccctgctgat tgtgaataac gctaccaacg tggtgatcaa 1260 agtctgtgaa ttccagtttt gcaacgatcc ttttctcggc gtttattatc acaaaaataa 1320 caaatcctgg atggagagcg agttccgggt gtactcctcc gcgaataatt gcaccttcga 1380 atatgtgtct cagccattcc tcatggacct cgaggggaag cagggcaatt ttaagaatct 1440 gcgagaattc gtgttcaaga atatagacgg ttacttcaag atttactcca aacacacccc 1500 gattaacctg gttagggact tgcctcaggg cttttctgca ttggagcccc tcgtggacct 1560 cccaatcggc ataaacatta caagatttca gactttgctt gcattgcaca ggagctattt 1620 gacacccggc gattcttctt ccggatggac cgctggagca gctgcttatt acgtgggcta 1680 tctgcagcct cgaacctttc ttttgaagta caacgaaaat ggaactatca ccgatgcagt 1740 tgactgcgcc ctggaccccc tgtccgaaac taagtgcacg ctcaaaagtt tcacagtaga 1800 gaaggggata taccagacta gcaatttccg cgttcagcca accgaaagta tagtgcgctt 1860 tcctaatata actaacctgt gtcctttcgg ggaagtgttt aacgccacta gattcgcttc 1920 cgtctacgcc tggaatagaa agaggatctc aaattgcgtt gctgactata gtgttttgta 1980 caattccgcc tctttctcaa ccttcaaatg ttacggggtg agccctacca aactgaacga 2040 cctgtgcttt acaaacgtat acgccgacag ctttgttatc agaggagacg aggttcgcca 2100 gattgctccg ggtcagacag gcaagattgc tgattataat tacaaactgc ccgacgactt 2160 tacaggatgt gtgatcgcgt ggaacagtaa caatcttgac tcaaaggttg ggggtaatta 2220 taattatctt taccggctgt tcagaaaaag caatttgaaa cccttcgaaa gggacatatc 2280 caccgagatc tatcaggccg ggtccactcc atgcaatggt gtggaaggtt ttaattgcta 2340 cttcccattg cagtcttatg gattccaacc aaccaatggc gtaggctacc agccgtatcg 2400 cgttgtcgtg ctcagcttcg agctgctcca cgcccccgcg accgtatgcg gtcctaagaa 2460 gtccaccaat cttgttaaga acaagtgtgt aaactttaac tttaacgggc tgaccgggac 2520 cggcgttctg actgaatcta acaaaaaatt cctgcctttc cagcagttcg gccgcgatat 2580 tgctgacacc actgacgctg taagagaccc tcagaccctt gaaattctcg atatcacacc 2640 ttgcagcttt gggggcgtgt ccgtcatcac tccaggaact aacacaagca accaggtggc 2700 agtgttgtac caggatgtta attgtaccga ggtgccagtg gccatccacg ccgatcaatt 2760 gacacctacc tggagggttt acagcacagg gtccaatgtt tttcagacaa gagccggatg 2820 tctgatcggt gccgagcatg tcaacaattc ctacgagtgt gatatcccca ttggtgcggg 2880 aatttgtgca tcatatcaga cccagactaa tagcccaaga agagctagat ccgtcgctag 2940 tcaatccatc attgcatata caatgtccct gggagctgag aattcagtcg cgtattcaaa 3000 caattccatt gctattccta ctaatttcac tatctccgtc acgaccgaga tcctgccagt 3060 ttccatgact aagacttctg ttgactgcac catgtatatc tgtggcgata gcaccgagtg 3120 cagtaatctg cttctgcagt acggctcctt ctgcacacaa ctcaatcgag cactgaccgg 3180 tattgcagtt gagcaggaca agaacacaca ggaggtcttt gcacaggtca aacaaattta 3240 caaaaccccc cccataaaag actttggtgg gttcaacttc agccaaatcc tcccagatcc 3300 cagcaagccc tccaaaagat ccttcatcga agaccttttg ttcaataagg taaccctggc 3360 cgacgcaggc ttcatcaaac aatatggcga ttgccttgga gacattgctg cgcgcgattt 3420 gatctgtgct cagaaattta acggtttgac cgtgctgccc ccacttctga ctgatgagat 3480 gatagcacag tatacttctg ctcttctggc aggaacaatc acttccgggt ggacctttgg 3540 cgctggtgca gcactgcaaa tccccttcgc aatgcaaatg gcctaccgat tcaatggtat 3600 tggtgttacc cagaacgtgc tctatgagaa tcagaaactc atcgccaatc agttcaatag 3660 cgctattggc aagattcagg attccctcag ctctaccgcc agcgctctgg ggaagctcca 3720 ggacgtggtg aaccaaaatg ctcaagcgct caataccctt gtgaaacagc tcagctccaa 3780 ttttggcgca attagcagcg ttctgaatga tattctgtcc cggctggaca aggtagaagc 3840 agaagtccag atcgacaggc tgatcaccgg gcggttgcag agtctccaga cctatgtcac 3900 acaacagctg atccgcgccg ccgagatcag ggcttccgct aacctggccg ccactaagat 3960 gtccgaatgc gtgttggggc agagtaagcg ggtcgacttt tgcgggaagg gataccatct 4020 gatgagcttc cctcagtctg caccccacgg agtagtgttc ctccacgtca catatgtgcc 4080 cgctcaggaa aagaatttca caaccgcacc tgctatctgt cacgacggca aggcccactt 4140 tcctagagaa ggagttttcg tatctaacgg cacccactgg ttcgtgacac agcggaactt 4200 ttacgagcct cagattataa ctacggacaa cactttcgtg tcaggcaact gtgacgtggt 4260 gattgggatc gtgaacaaca cagtctacga cccattgcag cccgagttgg actccttcaa 4320 agaggagctt gataagtatt tcaagaacca tacctctccc gacgtggacc tgggggacat 4380 tagcggcatc aatgcatccg ttgtgaatat ccagaaagaa atcgataggc tgaatgaggt 4440 cgcaaaaaat cttaatgagt cactgattga tctgcaggaa ctcggcaaat atgagcagta 4500 tattaagtgg ccgtggtaca tatggctcgg ctttatcgcc ggtctgattg ccatcgtgat 4560 ggtgaccatt atgctgtgtt gtatgacaag ctgctgttca tgtctcaaag gatgctgctc 4620 ctgcggtagc tgctgtaagt tcgatgaaga cgacagtgag cccgtgctca aaggagtgaa 4680 actccactac acataacgat cgacgcgtag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 4740 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4800 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4860 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 4920 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccaaagc 4980 ttgcggccgc gcccagcacc ccaaggcggc caacgccaaa actctccctc ctcctcttcc 5040 tcaatctcgc tctcgctctt tttttttttc gcaaaaggag gggagagggg gtaaaaaaat 5100 gctgcactgt gcggcgaagc cggtgagtga gcggcgcggg gccaatcagc gtgcgccgtt 5160 ccgaaagttg ccttttatgg ctcgagcggc cgcggcggcg ccctataaaa cccagcggcg 5220 cgacgcgcca ccaccgccga gaccctgcag gccgccacca tgtccgataa cggcccccag 5280 aatcagagaa acgctccccg catcacgttc ggcggaccaa gtgacagcac aggcagtaac 5340 cagaacggag aacgctccgg tgctcgctcc aagcagcgac ggccgcaagg gcttcccaac 5400 aataccgcca gctggtttac ggctctgacc caacacggga aagaagatct taaattcccc 5460 aggggccagg gcgtccctat caatactaac tccagcccgg atgatcagat aggctactat 5520 agacgcgcta cccgacggat acgagggggg gacggcaaaa tgaaggacct ttccccccgg 5580 tggtatttct attacttggg caccggacca gaagccggac tgccttacgg cgctaacaaa 5640 gacggaataa tctgggttgc gacggagggc gccctgaata cacctaaaga ccatatcggc 5700 acaagaaatc ctgctaacaa tgccgcgatt gtgctccagc tgcctcaggg aaccacgctg 5760 cctaaagggt tttacgctga ggggtcaagg ggggggagtc aagcgtctag taggtcatcc 5820 tctcgctctc gcaatagttc ccggaactca accccaggca gcagcagagg aacctctccc 5880 gcacggatgg ctggcaatgg gggagatgct gcccttgctc tccttctgct ggatcgcctt 5940 aaccagctcg aatcaaagat gtctggaaaa ggtcagcagc agcaaggcca gaccgtgaca 6000 aagaagagtg cagctgaagc tagtaaaaag ccacgccaaa aacggaccgc aactaaggca 6060 tataacgtaa cacaggcctt cggcagaaga ggtccagaac aaacacaggg aaactttggc 6120 gatcaagagc tgattagaca gggcacagat tacaaacact ggccacagat cgcgcagttt 6180 gcaccaagcg cctctgcatt cttcgggatg agtcggattg ggatggaagt cactccatcc 6240 gggacctggc ttacctacac aggggcaata aaactcgacg acaaagaccc aaactttaaa 6300 gatcaggtca tcctgctgaa taaacacatc gatgcctaca aaactttccc cccaaccgaa 6360 ccaaagaaag acaagaaaaa aaaggcagac gaaacgcaag cgctccctca gcgccagaag 6420 aagcagcaga ccgttacact gttgccagca gcagatctgg atgatttttc caagcagctt 6480 caacagagta tgtcaagcgc tgacagcact caggcttgag gcgcgccgct gaccgataaa 6540 taaaatatct ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgacg cgttagttat 6600 taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 6660 taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 6720 ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 6780 gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 6840 ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 6900 ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 6960 atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 7020 agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 7080 ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 7140 gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagag atatcgggcc 7200 actgcaggaa acgatatggg ctgaatacgg atccgtattc agcccatatc gtttctctag 7260 aaataaaata tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg 7310 <210> 7 <211> 5281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 7 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc 600 tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tgactctagc ctagctctga 660 agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 720 caatagaaac tgggcatgtg gagacagaga agactcttgg gtttctgata ggcactgact 780 ctctctgcct attggtctat tttcccaccc ttaggctgct ggtctgagcc taggagatct 840 ctcgaggtcg acggtatcga tgggtaccgc caccatgttt gtttttctcg tactcctgcc 900 cctggtttcc tcccaatgtg tcaatctgac tacccggacc caacttcctc ccgcctacac 960 caattccttt acccgaggtg tttactaccc agacaaagtg ttcaggtcat ccgtcctcca 1020 tagtacccaa gacctcttcc tccctttttt ttctaacgtt acctggtttc acgctattca 1080 cgttagcggc accaacggca ccaaaagatt cgataacccc gtactgccgt tcaacgacgg 1140 ggtatatttt gcctctactg aaaaatcaaa catcatacgc ggatggatct ttgggactac 1200 cctggactca aaaactcagt ccctgctgat tgtgaataac gctaccaacg tggtgatcaa 1260 agtctgtgaa ttccagtttt gcaacgatcc ttttctcggc gtttattatc acaaaaataa 1320 caaatcctgg atggagagcg agttccgggt gtactcctcc gcgaataatt gcaccttcga 1380 atatgtgtct cagccattcc tcatggacct cgaggggaag cagggcaatt ttaagaatct 1440 gcgagaattc gtgttcaaga atatagacgg ttacttcaag atttactcca aacacacccc 1500 gattaacctg gttagggact tgcctcaggg cttttctgca ttggagcccc tcgtggacct 1560 cccaatcggc ataaacatta caagatttca gactttgctt gcattgcaca ggagctattt 1620 gacacccggc gattcttctt ccggatggac cgctggagca gctgcttatt acgtgggcta 1680 tctgcagcct cgaacctttc ttttgaagta caacgaaaat ggaactatca ccgatgcagt 1740 tgactgcgcc ctggaccccc tgtccgaaac taagtgcacg ctcaaaagtt tcacagtaga 1800 gaaggggata taccagacta gcaatttccg cgttcagcca accgaaagta tagtgcgctt 1860 tcctaatata actaacctgt gtcctttcgg ggaagtgttt aacgccacta gattcgcttc 1920 cgtctacgcc tggaatagaa agaggatctc aaattgcgtt gctgactata gtgttttgta 1980 caattccgcc tctttctcaa ccttcaaatg ttacggggtg agccctacca aactgaacga 2040 cctgtgcttt acaaacgtat acgccgacag ctttgttatc agaggagacg aggttcgcca 2100 gattgctccg ggtcagacag gcaagattgc tgattataat tacaaactgc ccgacgactt 2160 tacaggatgt gtgatcgcgt ggaacagtaa caatcttgac tcaaaggttg ggggtaatta 2220 taattatctt taccggctgt tcagaaaaag caatttgaaa cccttcgaaa gggacatatc 2280 caccgagatc tatcaggccg ggtccactcc atgcaatggt gtggaaggtt ttaattgcta 2340 cttcccattg cagtcttatg gattccaacc aaccaatggc gtaggctacc agccgtatcg 2400 cgttgtcgtg ctcagcttcg agctgctcca cgcccccgcg accgtatgcg gtcctaagaa 2460 gtccaccaat cttgttaaga acaagtgtgt aaactttaac tttaacgggc tgaccgggac 2520 cggcgttctg actgaatcta acaaaaaatt cctgcctttc cagcagttcg gccgcgatat 2580 tgctgacacc actgacgctg taagagaccc tcagaccctt gaaattctcg atatcacacc 2640 ttgcagcttt gggggcgtgt ccgtcatcac tccaggaact aacacaagca accaggtggc 2700 agtgttgtac caggatgtta attgtaccga ggtgccagtg gccatccacg ccgatcaatt 2760 gacacctacc tggagggttt acagcacagg gtccaatgtt tttcagacaa gagccggatg 2820 tctgatcggt gccgagcatg tcaacaattc ctacgagtgt gatatcccca ttggtgcggg 2880 aatttgtgca tcatatcaga cccagactaa tagcccaaga agagctagat ccgtcgctag 2940 tcaatccatc attgcatata caatgatgtc cgataacggc ccccagaatc agagaaacgc 3000 tccccgcatc acgttcggcg gaccaagtga cagcacaggc agtaaccaga acggagaacg 3060 ctccggtgct cgctccaagc agcgacggcc gcaagggctt cccaacaata ccgccagctg 3120 gtttacggct ctgacccaac acgggaaaga agatcttaaa ttccccaggg gccagggcgt 3180 ccctatcaat actaactcca gcccggatga tcagataggc tactatagac gcgctacccg 3240 acggatacga gggggggacg gcaaaatgaa ggacctttcc ccccggtggt atttctatta 3300 cttgggcacc ggaccagaag ccggactgcc ttacggcgct aacaaagacg gaataatctg 3360 ggttgcgacg gagggcgccc tgaatacacc taaagaccat atcggcacaa gaaatcctgc 3420 taacaatgcc gcgattgtgc tccagctgcc tcagggaacc acgctgccta aagggtttta 3480 cgctgagggg tcaagggggg ggagtcaagc gtctagtagg tcatcctctc gctctcgcaa 3540 tagttcccgg aactcaaccc caggcagcag cagaggaacc tctcccgcac ggatggctgg 3600 caatggggga gatgctgccc ttgctctcct tctgctggat cgccttaacc agctcgaatc 3660 aaagatgtct ggaaaaggtc agcagcagca aggccagacc gtgacaaaga agagtgcagc 3720 tgaagctagt aaaaagccac gccaaaaacg gaccgcaact aaggcatata acgtaacaca 3780 ggccttcggc agaagaggtc cagaacaaac acagggaaac tttggcgatc aagagctgat 3840 tagacagggc acagattaca aacactggcc acagatcgcg cagtttgcac caagcgcctc 3900 tgcattcttc gggatgagtc ggattgggat ggaagtcact ccatccggga cctggcttac 3960 ctacacaggg gcaataaaac tcgacgacaa agacccaaac tttaaagatc aggtcatcct 4020 gctgaataaa cacatcgatg cctacaaaac tttcccccca accgaaccaa agaaagacaa 4080 gaaaaaaaag gcagacgaaa cgcaagcgct ccctcagcgc cagaagaagc agcagaccgt 4140 tacactgttg ccagcagcag atctggatga tttttccaag cagcttcaac agagtatgtc 4200 aagcgctgac agcactcagg cttgacgatc ggatatcgct agcgtaccgg cggccgccct 4260 attctatagt gtcacctaaa tgctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt 4320 tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 4380 cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 4440 tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 4500 aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac caaagcttac 4560 gcgttagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 4620 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 4680 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 4740 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 4800 tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 4860 agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 4920 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 4980 ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 5040 aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 5100 gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt gaaccgtcag atccgctaga 5160 gatatcgggc cactgcagga aacgatatgg gctgaatacg gatccgtatt cagcccatat 5220 cgtttctcta gaaataaaat atctttattt tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt 5280 g 5281 <210> 8 <211> 37735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 taaggatccc atcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg 60 gggtggagtt tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg 120 cggaagtgtg atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg 180 acgtttttgg tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg 240 atgttgtagt aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga 300 ataagaggaa gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat actgctagag 360 atctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 420 agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat 480 tgggtactgg ccacaggagc ttggcccatt gcatacgttg tatccatatc ataatatgta 540 catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat tgactagtta 600 ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 660 ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 720 aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 780 ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 840 gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 900 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 960 gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 1020 aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 1080 tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 1140 ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 1200 acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctgactc tagcctagct 1260 ctgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 1320 agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 1380 gactctctct gcctattggt ctattttccc acccttaggc tgctggtctg agcctaggag 1440 atctctcgag gtcgacggta tcgatgggta ccgccaccat gtttgttttt ctcgtactcc 1500 tgcccctggt ttcctcccaa tgtgtcaatc tgactacccg gacccaactt cctcccgcct 1560 acaccaattc ctttacccga ggtgtttact acccagacaa agtgttcagg tcatccgtcc 1620 tccatagtac ccaagacctc ttcctccctt ttttttctaa cgttacctgg tttcacgcta 1680 ttcacgttag cggcaccaac ggcaccaaaa gattcgataa ccccgtactg ccgttcaacg 1740 acggggtata ttttgcctct actgaaaaat caaacatcat acgcggatgg atctttggga 1800 ctaccctgga ctcaaaaact cagtccctgc tgattgtgaa taacgctacc aacgtggtga 1860 tcaaagtctg tgaattccag ttttgcaacg atccttttct cggcgtttat tatcacaaaa 1920 ataacaaatc ctggatggag agcgagttcc gggtgtactc ctccgcgaat aattgcacct 1980 tcgaatatgt gtctcagcca ttcctcatgg acctcgaggg gaagcagggc aattttaaga 2040 atctgcgaga attcgtgttc aagaatatag acggttactt caagatttac tccaaacaca 2100 ccccgattaa cctggttagg gacttgcctc agggcttttc tgcattggag cccctcgtgg 2160 acctcccaat cggcataaac attacaagat ttcagacttt gcttgcattg cacaggagct 2220 atttgacacc cggcgattct tcttccggat ggaccgctgg agcagctgct tattacgtgg 2280 gctatctgca gcctcgaacc tttcttttga agtacaacga aaatggaact atcaccgatg 2340 cagttgactg cgccctggac cccctgtccg aaactaagtg cacgctcaaa agtttcacag 2400 tagagaaggg gatataccag actagcaatt tccgcgttca gccaaccgaa agtatagtgc 2460 gctttcctaa tataactaac ctgtgtcctt tcggggaagt gtttaacgcc actagattcg 2520 cttccgtcta cgcctggaat agaaagagga tctcaaattg cgttgctgac tatagtgttt 2580 tgtacaattc cgcctctttc tcaaccttca aatgttacgg ggtgagccct accaaactga 2640 acgacctgtg ctttacaaac gtatacgccg acagctttgt tatcagagga gacgaggttc 2700 gccagattgc tccgggtcag acaggcaaga ttgctgatta taattacaaa ctgcccgacg 2760 actttacagg atgtgtgatc gcgtggaaca gtaacaatct tgactcaaag gttgggggta 2820 attataatta tctttaccgg ctgttcagaa aaagcaattt gaaacccttc gaaagggaca 2880 tatccaccga gatctatcag gccgggtcca ctccatgcaa tggtgtggaa ggttttaatt 2940 gctacttccc attgcagtct tatggattcc aaccaaccaa tggcgtaggc taccagccgt 3000 atcgcgttgt cgtgctcagc ttcgagctgc tccacgcccc cgcgaccgta tgcggtccta 3060 agaagtccac caatcttgtt aagaacaagt gtgtaaactt taactttaac gggctgaccg 3120 ggaccggcgt tctgactgaa tctaacaaaa aattcctgcc tttccagcag ttcggccgcg 3180 atattgctga caccactgac gctgtaagag accctcagac ccttgaaatt ctcgatatca 3240 caccttgcag ctttgggggc gtgtccgtca tcactccagg aactaacaca agcaaccagg 3300 tggcagtgtt gtaccaggat gttaattgta ccgaggtgcc agtggccatc cacgccgatc 3360 aattgacacc tacctggagg gtttacagca cagggtccaa tgtttttcag acaagagccg 3420 gatgtctgat cggtgccgag catgtcaaca attcctacga gtgtgatatc cccattggtg 3480 cgggaatttg tgcatcatat cagacccaga ctaatagccc aagaagagct agatccgtcg 3540 ctagtcaatc catcattgca tatacaatgt ccctgggagc tgagaattca gtcgcgtatt 3600 caaacaattc cattgctatt cctactaatt tcactatctc cgtcacgacc gagatcctgc 3660 cagtttccat gactaagact tctgttgact gcaccatgta tatctgtggc gatagcaccg 3720 agtgcagtaa tctgcttctg cagtacggct ccttctgcac acaactcaat cgagcactga 3780 ccggtattgc agttgagcag gacaagaaca cacaggaggt ctttgcacag gtcaaacaaa 3840 tttacaaaac cccccccata aaagactttg gtgggttcaa cttcagccaa atcctcccag 3900 atcccagcaa gccctccaaa agatccttca tcgaagacct tttgttcaat aaggtaaccc 3960 tggccgacgc aggcttcatc aaacaatatg gcgattgcct tggagacatt gctgcgcgcg 4020 atttgatctg tgctcagaaa tttaacggtt tgaccgtgct gcccccactt ctgactgatg 4080 agatgatagc acagtatact tctgctcttc tggcaggaac aatcacttcc gggtggacct 4140 ttggcgctgg tgcagcactg caaatcccct tcgcaatgca aatggcctac cgattcaatg 4200 gtattggtgt tacccagaac gtgctctatg agaatcagaa actcatcgcc aatcagttca 4260 atagcgctat tggcaagatt caggattccc tcagctctac cgccagcgct ctggggaagc 4320 tccaggacgt ggtgaaccaa aatgctcaag cgctcaatac ccttgtgaaa cagctcagct 4380 ccaattttgg cgcaattagc agcgttctga atgatattct gtcccggctg gacaaggtag 4440 aagcagaagt ccagatcgac aggctgatca ccgggcggtt gcagagtctc cagacctatg 4500 tcacacaaca gctgatccgc gccgccgaga tcagggcttc cgctaacctg gccgccacta 4560 agatgtccga atgcgtgttg gggcagagta agcgggtcga cttttgcggg aagggatacc 4620 atctgatgag cttccctcag tctgcacccc acggagtagt gttcctccac gtcacatatg 4680 tgcccgctca ggaaaagaat ttcacaaccg cacctgctat ctgtcacgac ggcaaggccc 4740 actttcctag agaaggagtt ttcgtatcta acggcaccca ctggttcgtg acacagcgga 4800 acttttacga gcctcagatt ataactacgg acaacacttt cgtgtcaggc aactgtgacg 4860 tggtgattgg gatcgtgaac aacacagtct acgacccatt gcagcccgag ttggactcct 4920 tcaaagagga gcttgataag tatttcaaga accatacctc tcccgacgtg gacctggggg 4980 acattagcgg catcaatgca tccgttgtga atatccagaa agaaatcgat aggctgaatg 5040 aggtcgcaaa aaatcttaat gagtcactga ttgatctgca ggaactcggc aaatatgagc 5100 agtatattaa gtggccgtgg tacatatggc tcggctttat cgccggtctg attgccatcg 5160 tgatggtgac cattatgctg tgttgtatga caagctgctg ttcatgtctc aaaggatgct 5220 gctcctgcgg tagctgctgt aagttcgatg aagacgacag tgagcccgtg ctcaaaggag 5280 tgaaactcca ctacacataa cgatcgacgc gtagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc 5340 cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 5400 gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 5460 ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 5520 acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca 5580 aagcttgcgg ccgcgcccag caccccaagg cggccaacgc caaaactctc cctcctcctc 5640 ttcctcaatc tcgctctcgc tctttttttt tttcgcaaaa ggaggggaga gggggtaaaa 5700 aaatgctgca ctgtgcggcg aagccggtga gtgagcggcg cggggccaat cagcgtgcgc 5760 cgttccgaaa gttgcctttt atggctcgag cggccgcggc ggcgccctat aaaacccagc 5820 ggcgcgacgc gccaccaccg ccgagaccct gcaggccgcc accatgtccg ataacggccc 5880 ccagaatcag agaaacgctc cccgcatcac gttcggcgga ccaagtgaca gcacaggcag 5940 taaccagaac ggagaacgct ccggtgctcg ctccaagcag cgacggccgc aagggcttcc 6000 caacaatacc gccagctggt ttacggctct gacccaacac gggaaagaag atcttaaatt 6060 ccccaggggc cagggcgtcc ctatcaatac taactccagc ccggatgatc agataggcta 6120 ctatagacgc gctacccgac ggatacgagg gggggacggc aaaatgaagg acctttcccc 6180 ccggtggtat ttctattact tgggcaccgg accagaagcc ggactgcctt acggcgctaa 6240 caaagacgga ataatctggg ttgcgacgga gggcgccctg aatacaccta aagaccatat 6300 cggcacaaga aatcctgcta acaatgccgc gattgtgctc cagctgcctc agggaaccac 6360 gctgcctaaa gggttttacg ctgaggggtc aagggggggg agtcaagcgt ctagtaggtc 6420 atcctctcgc tctcgcaata gttcccggaa ctcaacccca ggcagcagca gaggaacctc 6480 tcccgcacgg atggctggca atgggggaga tgctgccctt gctctccttc tgctggatcg 6540 ccttaaccag ctcgaatcaa agatgtctgg aaaaggtcag cagcagcaag gccagaccgt 6600 gacaaagaag agtgcagctg aagctagtaa aaagccacgc caaaaacgga ccgcaactaa 6660 ggcatataac gtaacacagg ccttcggcag aagaggtcca gaacaaacac agggaaactt 6720 tggcgatcaa gagctgatta gacagggcac agattacaaa cactggccac agatcgcgca 6780 gtttgcacca agcgcctctg cattcttcgg gatgagtcgg attgggatgg aagtcactcc 6840 atccgggacc tggcttacct acacaggggc aataaaactc gacgacaaag acccaaactt 6900 taaagatcag gtcatcctgc tgaataaaca catcgatgcc tacaaaactt tccccccaac 6960 cgaaccaaag aaagacaaga aaaaaaaggc agacgaaacg caagcgctcc ctcagcgcca 7020 gaagaagcag cagaccgtta cactgttgcc agcagcagat ctggatgatt tttccaagca 7080 gcttcaacag agtatgtcaa gcgctgacag cactcaggct tgaggcgcgc cgctgaccga 7140 taaataaaat atctttattt tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gacgcgttag 7200 ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 7260 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 7320 gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 7380 ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 7440 tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 7500 gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 7560 ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 7620 tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 7680 ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 7740 gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct agagatatcg 7800 ggccactgca ggaaacgata tgggctgaat acggatccgt attcagccca tatcgtttct 7860 ctagaaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga 7920 tagtactaac atacgctctc catctcgagc ctaagcttgt cgactcgaag atctgggcgt 7980 ggttaagggt gggaaagaat atataaggtg ggggtcttat gtagttttgt atctgttttg 8040 cagcagccgc cgccgccatg agcaccaact cgtttgatgg aagcattgtg agctcatatt 8100 tgacaacgcg catgccccca tgggccgggg tgcgtcagaa tgtgatgggc tccagcattg 8160 atggtcgccc cgtcctgccc gcaaactcta ctaccttgac ctacgagacc gtgtctggaa 8220 cgccgttgga gactgcagcc tccgccgccg cttcagccgc tgcagccacc gcccgcggga 8280 ttgtgactga ctttgctttc ctgagcccgc ttgcaagcag tgcagcttcc cgttcatccg 8340 cccgcgatga caagttgacg gctcttttgg cacaattgga ttctttgacc cgggaactta 8400 atgtcgtttc tcagcagctg ttggatctgc gccagcaggt ttctgccctg aaggcttcct 8460 cccctcccaa tgcggtttaa aacataaata aaaaaccaga ctctgtttgg atttggatca 8520 agcaagtgtc ttgctgtctt tatttagggg ttttgcgcgc gcggtaggcc cgggaccagc 8580 ggtctcggtc gttgagggtc ctgtgtattt tttccaggac gtggtaaagg tgactctgga 8640 tgttcagata catgggcata agcccgtctc tggggtggag gtagcaccac tgcagagctt 8700 catgctgcgg ggtggtgttg tagatgatcc agtcgtagca ggagcgctgg gcgtggtgcc 8760 taaaaatgtc tttcagtagc aagctgattg ccaggggcag gcccttggtg taagtgttta 8820 caaagcggtt aagctgggat gggtgcatac gtggggatat gagatgcatc ttggactgta 8880 tttttaggtt ggctatgttc ccagccatat ccctccgggg attcatgttg tgcagaacca 8940 ccagcacagt gtatccggtg cacttgggaa atttgtcatg tagcttagaa ggaaatgcgt 9000 ggaagaactt ggagacgccc ttgtgacctc caagattttc catgcattcg tccataatga 9060 tggcaatggg cccacgggcg gcggcctggg cgaagatatt tctgggatca ctaacgtcat 9120 agttgtgttc caggatgaga tcgtcatagg ccatttttac aaagcgcggg cggagggtgc 9180 cagactgcgg tataatggtt ccatccggcc caggggcgta gttaccctca cagatttgca 9240 tttcccacgc tttgagttca gatgggggga tcatgtctac ctgcggggcg atgaagaaaa 9300 cggtttccgg ggtaggggag atcagctggg aagaaagcag gttcctgagc agctgcgact 9360 taccgcagcc ggtgggcccg taaatcacac ctattaccgg ctgcaactgg tagttaagag 9420 agctgcagct gccgtcatcc ctgagcaggg gggccacttc gttaagcatg tccctgactc 9480 gcatgttttc cctgaccaaa tccgccagaa ggcgctcgcc gcccagcgat agcagttctt 9540 gcaaggaagc aaagtttttc aacggtttga gaccgtccgc cgtaggcatg cttttgagcg 9600 tttgaccaag cagttccagg cggtcccaca gctcggtcac ctgctctacg gcatctcgat 9660 ccagcatatc tcctcgtttc gcgggttggg gcggctttcg ctgtacggca gtagtcggtg 9720 ctcgtccaga cgggccaggg tcatgtcttt ccacgggcgc agggtcctcg tcagcgtagt 9780 ctgggtcacg gtgaaggggt gcgctccggg ctgcgcgctg gccagggtgc gcttgaggct 9840 ggtcctgctg gtgctgaagc gctgccggtc ttcgccctgc gcgtcggcca ggtagcattt 9900 gaccatggtg tcatagtcca gcccctccgc ggcgtggccc ttggcgcgca gcttgccctt 9960 ggaggaggcg ccgcacgagg ggcagtgcag acttttgagg gcgtagagct tgggcgcgag 10020 aaataccgat tccggggagt aggcatccgc gccgcaggcc ccgcagacgg tctcgcattc 10080 cacgagccag gtgagctctg gccgttcggg gtcaaaaacc aggtttcccc catgcttttt 10140 gatgcgtttc ttacctctgg tttccatgag ccggtgtcca cgctcggtga cgaaaaggct 10200 gtccgtgtcc ccgtatacag acttgagagg cctgtcctcg agcggtgttc cgcggtcctc 10260 ctcgtataga aactcggacc actctgagac aaaggctcgc gtccaggcca gcacgaagga 10320 ggctaagtgg gaggggtagc ggtcgttgtc cactaggggg tccactcgct ccagggtgtg 10380 aagacacatg tcgccctctt cggcatcaag gaaggtgatt ggtttgtagg tgtaggccac 10440 gtgaccgggt gttcctgaag gggggctata aaagggggtg ggggcgcgtt cgtcctcact 10500 ctcttccgca tcgctgtctg cgagggccag ctgttggggt gagtactccc tctgaaaagc 10560 gggcatgact tctgcgctaa gattgtcagt ttccaaaaac gaggaggatt tgatattcac 10620 ctggcccgcg gtgatgcctt tgagggtggc cgcatccatc tggtcagaaa agacaatctt 10680 tttgttgtca agcttggtgg caaacgaccc gtagagggcg ttggacagca acttggcgat 10740 ggagcgcagg gtttggtttt tgtcgcgatc ggcgcgctcc ttggccgcga tgtttagctg 10800 cacgtattcg cgcgcaacgc accgccattc gggaaagacg gtggtgcgct cgtcgggcac 10860 caggtgcacg cgccaaccgc ggttgtgcag ggtgacaagg tcaacgctgg tggctacctc 10920 tccgcgtagg cgctcgttgg tccagcagag gcggccgccc ttgcgcgagc agaatggcgg 10980 tagggggtct agctgcgtct cgtccggggg gtctgcgtcc acggtaaaga ccccgggcag 11040 caggcgcgcg tcgaagtagt ctatcttgca tccttgcaag tctagcgcct gctgccatgc 11100 gcgggcggca agcgcgcgct cgtatgggtt gagtggggga ccccatggca tggggtgggt 11160 gagcgcggag gcgtacatgc cgcaaatgtc gtaaacgtag aggggctctc tgagtattcc 11220 aagatatgta gggtagcatc ttccaccgcg gatgctggcg cgcacgtaat cgtatagttc 11280 gtgcgaggga gcgaggaggt cgggaccgag gttgctacgg gcgggctgct ctgctcggaa 11340 gactatctgc ctgaagatgg catgtgagtt ggatgatatg gttggacgct ggaagacgtt 11400 gaagctggcg tctgtgagac ctaccgcgtc acgcacgaag gaggcgtagg agtcgcgcag 11460 cttgttgacc agctcggcgg tgacctgcac gtctagggcg cagtagtcca gggtttcctt 11520 gatgatgtca tacttatcct gtcccttttt tttccacagc tcgcggttga ggacaaactc 11580 ttcgcggtct ttccagtact cttggatcgg aaacccgtcg gcctccgaac ggtaagagcc 11640 tagcatgtag aactggttga cggcctggta ggcgcagcat cccttttcta cgggtagcgc 11700 gtatgcctgc gcggccttcc ggagcgaggt gtgggtgagc gcaaaggtgt ccctgaccat 11760 gactttgagg tactggtatt tgaagtcagt gtcgtcgcat ccgccctgct cccagagcaa 11820 aaagtccgtg cgctttttgg aacgcggatt tggcagggcg aaggtgacat cgttgaagag 11880 tatctttccc gcgcgaggca taaagttgcg tgtgatgcgg aagggtcccg gcacctcgga 11940 acggttgtta attacctggg cggcgagcac gatctcgtca aagccgttga tgttgtggcc 12000 cacaatgtaa agttccaaga agcgcgggat gcccttgatg gaaggcaatt ttttaagttc 12060 ctcgtaggtg agctcttcag gggagctgag cccgtgctct gaaagggccc agtctgcaag 12120 atgagggttg gaagcgacga atgagctcca caggtcacgg gccattagca tttgcaggtg 12180 gtcgcgaaag gtcctaaact ggcgacctat ggccattttt tctggggtga tgcagtagaa 12240 ggtaagcggg tcttgttccc agcggtccca tccaaggttc gcggctaggt ctcgcgcggc 12300 agtcactaga ggctcatctc cgccgaactt catgaccagc atgaagggca cgagctgctt 12360 cccaaaggcc cccatccaag tataggtctc tacatcgtag gtgacaaaga gacgctcggt 12420 gcgaggatgc gagccgatcg ggaagaactg gatctcccgc caccaattgg aggagtggct 12480 attgatgtgg tgaaagtaga agtccctgcg acgggccgaa cactcgtgct ggcttttgta 12540 aaaacgtgcg cagtactggc agcggtgcac gggctgtaca tcctgcacga ggttgacctg 12600 acgaccgcgc acaaggaagc agagtgggaa tttgagcccc tcgcctggcg ggtttggctg 12660 gtggtcttct acttcggctg cttgtccttg accgtctggc tgctcgaggg gagttacggt 12720 ggatcggacc accacgccgc gcgagcccaa agtccagatg tccgcgcgcg gcggtcggag 12780 cttgatgaca acatcgcgca gatgggagct gtccatggtc tggagctccc gcggcgtcag 12840 gtcaggcggg agctcctgca ggtttacctc gcatagacgg gtcagggcgc gggctagatc 12900 caggtgatac ctaatttcca ggggctggtt ggtggcggcg tcgatggctt gcaagaggcc 12960 gcatccccgc ggcgcgacta cggtaccgcg cggcgggcgg tgggccgcgg gggtgtcctt 13020 ggatgatgca tctaaaagcg gtgacgcggg cgagcccccg gaggtagggg gggctccgga 13080 cccgccggga gagggggcag gggcacgtcg gcgccgcgcg cgggcaggag ctggtgctgc 13140 gcgcgtaggt tgctggcgaa cgcgacgacg cggcggttga tctcctgaat ctggcgcctc 13200 tgcgtgaaga cgacgggccc ggtgagcttg aacctgaaag agagttcgac agaatcaatt 13260 tcggtgtcgt tgacggcggc ctggcgcaaa atctcctgca cgtctcctga gttgtcttga 13320 taggcgatct cggccatgaa ctgctcgatc tcttcctcct ggagatctcc gcgtccggct 13380 cgctccacgg tggcggcgag gtcgttggaa atgcgggcca tgagctgcga gaaggcgttg 13440 aggcctccct cgttccagac gcggctgtag accacgcccc cttcggcatc gcgggcgcgc 13500 atgaccacct gcgcgagatt gagctccacg tgccgggcga agacggcgta gtttcgcagg 13560 cgctgaaaga ggtagttgag ggtggtggcg gtgtgttctg ccacgaagaa gtacataacc 13620 cagcgtcgca acgtggattc gttgatatcc cccaaggcct caaggcgctc catggcctcg 13680 tagaagtcca cggcgaagtt gaaaaactgg gagttgcgcg ccgacacggt taactcctcc 13740 tccagaagac ggatgagctc ggcgacagtg tcgcgcacct cgcgctcaaa ggctacaggg 13800 gcctcttctt cttcttcaat ctcctcttcc ataagggcct ccccttcttc ttcttctggc 13860 ggcggtgggg gaggggggac acggcggcga cgacggcgca ccgggaggcg gtcgacaaag 13920 cgctcgatca tctccccgcg gcgacggcgc atggtctcgg tgacggcgcg gccgttctcg 13980 cgggggcgca gttggaagac gccgcccgtc atgtcccggt tatgggttgg cggggggctg 14040 ccatgcggca gggatacggc gctaacgatg catctcaaca attgttgtgt aggtactccg 14100 ccgccgaggg acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg 14160 tctaaccagt cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggcggcgg 14220 tcggggttgt ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga 14280 cggcggatgg tcgacagaag caccatgtcc ttgggtccgg cctgctgaat gcgcaggcgg 14340 tcggccatgc cccaggcttc gttttgacat cggcgcaggt ctttgtagta gtcttgcatg 14400 agcctttcta ccggcacttc ttcttctcct tcctcttgtc ctgcatctct tgcatctatc 14460 gctgcggcgg cggcggagtt tggccgtagg tggcgccctc ttcctcccat gcgtgtgacc 14520 ccgaagcccc tcatcggctg aagcagggct aggtcggcga caacgcgctc ggctaatatg 14580 gcctgctgca cctgcgtgag ggtagactgg aagtcatcca tgtccacaaa gcggtggtat 14640 gcgcccgtgt tgatggtgta agtgcagttg gccataacgg accagttaac ggtctggtga 14700 cccggctgcg agagctcggt gtacctgaga cgcgagtaag ccctcgagtc aaatacgtag 14760 tcgttgcaag tccgcaccag gtactggtat cccaccaaaa agtgcggcgg cggctggcgg 14820 tagaggggcc agcgtagggt ggccggggct ccgggggcga gatcttccaa cataaggcga 14880 tgatatccgt agatgtacct ggacatccag gtgatgccgg cggcggtggt ggaggcgcgc 14940 ggaaagtcgc ggacgcggtt ccagatgttg cgcagcggca aaaagtgctc catggtcggg 15000 acgctctggc cggtcaggcg cgcgcaatcg ttgacgctct agcgtgcaaa aggagagcct 15060 gtaagcgggc actcttccgt ggtctggtgg ataaattcgc aagggtatca tggcggacga 15120 ccggggttcg agccccgtat ccggccgtcc gccgtgatcc atgcggttac cgcccgcgtg 15180 tcgaacccag gtgtgcgacg tcagacaacg ggggagtgct ccttttggct tccttccagg 15240 cgcggcggct gctgcgctag cttttttggc cactggccgc gcgcagcgta agcggttagg 15300 ctggaaagcg aaagcattaa gtggctcgct ccctgtagcc ggagggttat tttccaaggg 15360 ttgagtcgcg ggacccccgg ttcgagtctc ggaccggccg gactgcggcg aacgggggtt 15420 tgcctccccg tcatgcaaga ccccgcttgc aaattcctcc ggaaacaggg acgagcccct 15480 tttttgcttt tcccagatgc atccggtgct gcggcagatg cgcccccctc ctcagcagcg 15540 gcaagagcaa gagcagcggc agacatgcag ggcaccctcc cctcctccta ccgcgtcagg 15600 aggggcgaca tccgcggttg acgcggcagc agatggtgat tacgaacccc cgcggcgccg 15660 ggcccggcac tacctggact tggaggaggg cgagggcctg gcgcggctag gagcgccctc 15720 tcctgagcgg cacccaaggg tgcagctgaa gcgtgatacg cgtgaggcgt acgtgccgcg 15780 gcagaacctg tttcgcgacc gcgagggaga ggagcccgag gagatgcggg atcgaaagtt 15840 ccacgcaggg cgcgagctgc ggcatggcct gaatcgcgag cggttgctgc gcgaggagga 15900 ctttgagccc gacgcgcgaa ccgggattag tcccgcgcgc gcacacgtgg cggccgccga 15960 cctggtaacc gcatacgagc agacggtgaa ccaggagatt aactttcaaa aaagctttaa 16020 caaccacgtg cgtacgcttg tggcgcgcga ggaggtggct ataggactga tgcatctgtg 16080 ggactttgta agcgcgctgg agcaaaaccc aaatagcaag ccgctcatgg cgcagctgtt 16140 ccttatagtg cagcacagca gggacaacga ggcattcagg gatgcgctgc taaacatagt 16200 agagcccgag ggccgctggc tgctcgattt gataaacatc ctgcagagca tagtggtgca 16260 ggagcgcagc ttgagcctgg ctgacaaggt ggccgccatc aactattcca tgcttagcct 16320 gggcaagttt tacgcccgca agatatacca taccccttac gttcccatag acaaggaggt 16380 aaagatcgag gggttctaca tgcgcatggc gctgaaggtg cttaccttga gcgacgacct 16440 gggcgtttat cgcaacgagc gcatccacaa ggccgtgagc gtgagccggc ggcgcgagct 16500 cagcgaccgc gagctgatgc acagcctgca aagggccctg gctggcacgg gcagcggcga 16560 tagagaggcc gagtcctact ttgacgcggg cgctgacctg cgctgggccc caagccgacg 16620 cgccctggag gcagctgggg ccggacctgg gctggcggtg gcacccgcgc gcgctggcaa 16680 cgtcggcggc gtggaggaat atgacgagga cgatgagtac gagccagagg acggcgagta 16740 ctaagcggtg atgtttctga tcagatgatg caagacgcaa cggacccggc ggtgcgggcg 16800 gcgctgcaga gccagccgtc cggccttaac tccacggacg actggcgcca ggtcatggac 16860 cgcatcatgt cgctgactgc gcgcaatcct gacgcgttcc ggcagcagcc gcaggccaac 16920 cggctctccg caattctgga agcggtggtc ccggcgcgcg caaaccccac gcacgagaag 16980 gtgctggcga tcgtaaacgc gctggccgaa aacagggcca tccggcccga cgaggccggc 17040 ctggtctacg acgcgctgct tcagcgcgtg gctcgttaca acagcggcaa cgtgcagacc 17100 aacctggacc ggctggtggg ggatgtgcgc gaggccgtgg cgcagcgtga gcgcgcgcag 17160 cagcagggca acctgggctc catggttgca ctaaacgcct tcctgagtac acagcccgcc 17220 aacgtgccgc ggggacagga ggactacacc aactttgtga gcgcactgcg gctaatggtg 17280 actgagacac cgcaaagtga ggtgtaccag tctgggccag actatttttt ccagaccagt 17340 agacaaggcc tgcagaccgt aaacctgagc caggctttca aaaacttgca ggggctgtgg 17400 ggggtgcggg ctcccacagg cgaccgcgcg accgtgtcta gcttgctgac gcccaactcg 17460 cgcctgttgc tgctgctaat agcgcccttc acggacagtg gcagcgtgtc ccgggacaca 17520 tacctaggtc acttgctgac actgtaccgc gaggccatag gtcaggcgca tgtggacgag 17580 catactttcc aggagattac aagtgtcagc cgcgcgctgg ggcaggagga cacgggcagc 17640 ctggaggcaa ccctaaacta cctgctgacc aaccggcggc agaagatccc ctcgttgcac 17700 agtttaaaca gcgaggagga gcgcattttg cgctacgtgc agcagagcgt gagccttaac 17760 ctgatgcgcg acggggtaac gcccagcgtg gcgctggaca tgaccgcgcg caacatggaa 17820 ccgggcatgt atgcctcaaa ccggccgttt atcaaccgcc taatggacta cttgcatcgc 17880 gcggccgccg tgaaccccga gtatttcacc aatgccatct tgaacccgca ctggctaccg 17940 ccccctggtt tctacaccgg gggattcgag gtgcccgagg gtaacgatgg attcctctgg 18000 gacgacatag acgacagcgt gttttccccg caaccgcaga ccctgctaga gttgcaacag 18060 cgcgagcagg cagaggcggc gctgcgaaag gaaagcttcc gcaggccaag cagcttgtcc 18120 gatctaggcg ctgcggcccc gcggtcagat gctagtagcc catttccaag cttgataggg 18180 tctcttacca gcactcgcac cacccgcccg cgcctgctgg gcgaggagga gtacctaaac 18240 aactcgctgc tgcagccgca gcgcgaaaaa aacctgcctc cggcatttcc caacaacggg 18300 atagagagcc tagtggacaa gatgagtaga tggaagacgt acgcgcagga gcacagggac 18360 gtgccaggcc cgcgcccgcc cacccgtcgt caaaggcacg accgtcagcg gggtctggtg 18420 tgggaggacg atgactcggc agacgacagc agcgtcctgg atttgggagg gagtggcaac 18480 ccgtttgcgc accttcgccc caggctgggg agaatgtttt aaaaaaaaaa aagcatgatg 18540 caaaataaaa aactcaccaa ggccatggca ccgagcgttg gttttcttgt attcccctta 18600 gtatgcggcg cgcggcgatg tatgaggaag gtcctcctcc ctcctacgag agtgtggtga 18660 gcgcggcgcc agtggcggcg gcgctgggtt ctcccttcga tgctcccctg gacccgccgt 18720 ttgtgcctcc gcggtacctg cggcctaccg gggggagaaa cagcatccgt tactctgagt 18780 tggcacccct attcgacacc acccgtgtgt acctggtgga caacaagtca acggatgtgg 18840 catccctgaa ctaccagaac gaccacagca actttctgac cacggtcatt caaaacaatg 18900 actacagccc gggggaggca agcacacaga ccatcaatct tgacgaccgg tcgcactggg 18960 gcggcgacct gaaaaccatc ctgcatacca acatgccaaa tgtgaacgag ttcatgttta 19020 ccaataagtt taaggcgcgg gtgatggtgt cgcgcttgcc tactaaggac aatcaggtgg 19080 agctgaaata cgagtgggtg gagttcacgc tgcccgaggg caactactcc gagaccatga 19140 ccatagacct tatgaacaac gcgatcgtgg agcactactt gaaagtgggc agacagaacg 19200 gggttctgga aagcgacatc ggggtaaagt ttgacacccg caacttcaga ctggggtttg 19260 accccgtcac tggtcttgtc atgcctgggg tatatacaaa cgaagccttc catccagaca 19320 tcattttgct gccaggatgc ggggtggact tcacccacag ccgcctgagc aacttgttgg 19380 gcatccgcaa gcggcaaccc ttccaggagg gctttaggat cacctacgat gatctggagg 19440 gtggtaacat tcccgcactg ttggatgtgg acgcctacca ggcgagcttg aaagatgaca 19500 ccgaacaggg cgggggtggc gcaggcggca gcaacagcag tggcagcggc gcggaagaga 19560 actccaacgc ggcagccgcg gcaatgcagc cggtggagga catgaacgat catgccattc 19620 gcggcgacac ctttgccaca cgggctgagg agaagcgcgc tgaggccgaa gcagcggccg 19680 aagctgccgc ccccgctgcg caacccgagg tcgagaagcc tcagaagaaa ccggtgatca 19740 aacccctgac agaggacagc aagaaacgca gttacaacct aataagcaat gacagcacct 19800 tcacccagta ccgcagctgg taccttgcat acaactacgg cgaccctcag accggaatcc 19860 gctcatggac cctgctttgc actcctgacg taacctgcgg ctcggagcag gtctactggt 19920 cgttgccaga catgatgcaa gaccccgtga ccttccgctc cacgcgccag atcagcaact 19980 ttccggtggt gggcgccgag ctgttgcccg tgcactccaa gagcttctac aacgaccagg 20040 ccgtctactc ccaactcatc cgccagttta cctctctgac ccacgtgttc aatcgctttc 20100 ccgagaacca gattttggcg cgcccgccag cccccaccat caccaccgtc agtgaaaacg 20160 ttcctgctct cacagatcac gggacgctac cgctgcgcaa cagcatcgga ggagtccagc 20220 gagtgaccat tactgacgcc agacgccgca cctgccccta cgtttacaag gccctgggca 20280 tagtctcgcc gcgcgtccta tcgagccgca ctttttgagc aagcatgtcc atccttatat 20340 cgcccagcaa taacacaggc tggggcctgc gcttcccaag caagatgttt ggcggggcca 20400 agaagcgctc cgaccaacac ccagtgcgcg tgcgcgggca ctaccgcgcg ccctggggcg 20460 cgcacaaacg cggccgcact gggcgcacca ccgtcgatga cgccatcgac gcggtggtgg 20520 aggaggcgcg caactacacg cccacgccgc caccagtgtc cacagtggac gcggccattc 20580 agaccgtggt gcgcggagcc cggcgctatg ctaaaatgaa gagacggcgg aggcgcgtag 20640 cacgtcgcca ccgccgccga cccggcactg ccgcccaacg cgcggcggcg gccctgctta 20700 accgcgcacg tcgcaccggc cgacgggcgg ccatgcgggc cgctcgaagg ctggccgcgg 20760 gtattgtcac tgtgcccccc aggtccaggc gacgagcggc cgccgcagca gccgcggcca 20820 ttagtgctat gactcagggt cgcaggggca acgtgtattg ggtgcgcgac tcggttagcg 20880 gcctgcgcgt gcccgtgcgc acccgccccc cgcgcaacta gattgcaaga aaaaactact 20940 tagactcgta ctgttgtatg tatccagcgg cggcggcgcg caacgaagct atgtccaagc 21000 gcaaaatcaa agaagagatg ctccaggtca tcgcgccgga gatctatggc cccccgaaga 21060 aggaagagca ggattacaag ccccgaaagc taaagcgggt caaaaagaaa aagaaagatg 21120 atgatgatga acttgacgac gaggtggaac tgctgcacgc taccgcgccc aggcgacggg 21180 tacagtggaa aggtcgacgc gtaaaacgtg ttttgcgacc cggcaccacc gtagtcttta 21240 cgcccggtga gcgctccacc cgcacctaca agcgcgtgta tgatgaggtg tacggcgacg 21300 aggacctgct tgagcaggcc aacgagcgcc tcggggagtt tgcctacgga aagcggcata 21360 aggacatgct ggcgttgccg ctggacgagg gcaacccaac acctagccta aagcccgtaa 21420 cactgcagca ggtgctgccc gcgcttgcac cgtccgaaga aaagcgcggc ctaaagcgcg 21480 agtctggtga cttggcaccc accgtgcagc tgatggtacc caagcgccag cgactggaag 21540 atgtcttgga aaaaatgacc gtggaacctg ggctggagcc cgaggtccgc gtgcggccaa 21600 tcaagcaggt ggcgccggga ctgggcgtgc agaccgtgga cgttcagata cccactacca 21660 gtagcaccag tattgccacc gccacagagg gcatggagac acaaacgtcc ccggttgcct 21720 cagcggtggc ggatgccgcg gtgcaggcgg tcgctgcggc cgcgtccaag acctctacgg 21780 aggtgcaaac ggacccgtgg atgtttcgcg tttcagcccc ccggcgcccg cgccgttcga 21840 ggaagtacgg cgccgccagc gcgctactgc ccgaatatgc cctacatcct tccattgcgc 21900 ctacccccgg ctatcgtggc tacacctacc gccccagaag acgagcaact acccgacgcc 21960 gaaccaccac tggaacccgc cgccgccgtc gccgtcgcca gcccgtgctg gccccgattt 22020 ccgtgcgcag ggtggctcgc gaaggaggca ggaccctggt gctgccaaca gcgcgctacc 22080 accccagcat cgtttaaaag ccggtctttg tggttcttgc agatatggcc ctcacctgcc 22140 gcctccgttt cccggtgccg ggattccgag gaagaatgca ccgtaggagg ggcatggccg 22200 gccacggcct gacgggcggc atgcgtcgtg cgcaccaccg gcggcggcgc gcgtcgcacc 22260 gtcgcatgcg cggcggtatc ctgcccctcc ttattccact gatcgccgcg gcgattggcg 22320 ccgtgcccgg aattgcatcc gtggccttgc aggcgcagag acactgatta aaaacaagtt 22380 gcatgtggaa aaatcaaaat aaaaagtctg gactctcacg ctcgcttggt cctgtaacta 22440 ttttgtagaa tggaagacat caactttgcg tctctggccc cgcgacacgg ctcgcgcccg 22500 ttcatgggaa actggcaaga tatcggcacc agcaatatga gcggtggcgc cttcagctgg 22560 ggctcgctgt ggagcggcat taaaaatttc ggttccaccg ttaagaacta tggcagcaag 22620 gcctggaaca gcagcacagg ccagatgctg agggataagt tgaaagagca aaatttccaa 22680 caaaaggtgg tagatggcct ggcctctggc attagcgggg tggtggacct ggccaaccag 22740 gcagtgcaaa ataagattaa cagtaagctt gatccccgcc ctcccgtaga ggagcctcca 22800 ccggccgtgg agacagtgtc tccagagggg cgtggcgaaa agcgtccgcg ccccgacagg 22860 gaagaaactc tggtgacgca aatagacgag cctccctcgt acgaggaggc actaaagcaa 22920 ggcctgccca ccacccgtcc catcgcgccc atggctaccg gagtgctggg ccagcacaca 22980 cccgtaacgc tggacctgcc tccccccgcc gacacccagc agaaacctgt gctgccaggc 23040 ccgaccgccg ttgttgtaac ccgtcctagc cgcgcgtccc tgcgccgcgc cgccagcggt 23100 ccgcgatcgt tgcggcccgt agccagtggc aactggcaaa gcacactgaa cagcatcgtg 23160 ggtctggggg tgcaatccct gaagcgccga cgatgcttct gatagctaac gtgtcgtatg 23220 tgtgtcatgt atgcgtccat gtcgccgcca gaggagctgc tgagccgccg cgcgcccgct 23280 ttccaagatg gctacccctt cgatgatgcc gcagtggtct tacatgcaca tctcgggcca 23340 ggacgcctcg gagtacctga gccccgggct ggtgcagttt gcccgcgcca ccgagacgta 23400 cttcagcctg aataacaagt ttagaaaccc cacggtggcg cctacgcacg acgtgaccac 23460 agaccggtcc cagcgtttga cgctgcggtt catccctgtg gaccgtgagg atactgcgta 23520 ctcgtacaag gcgcggttca ccctagctgt gggtgataac cgtgtgctgg acatggcttc 23580 cacgtacttt gacatccgcg gcgtgctgga caggggccct acttttaagc cctactctgg 23640 cactgcctac aacgccctgg ctcccaaggg tgccccaaat ccttgcgaat gggatgaagc 23700 tgctactgct cttgaaataa acctagaaga agaggacgat gacaacgaag acgaagtaga 23760 cgagcaagct gagcagcaaa aaactcacgt atttgggcag gcgccttatt ctggtataaa 23820 tattacaaag gagggtattc aaataggtgt cgaaggtcaa acacctaaat atgccgataa 23880 aacatttcaa cctgaacctc aaataggaga atctcagtgg tacgaaacag aaattaatca 23940 tgcagctggg agagtcctaa aaaagactac cccaatgaaa ccatgttacg gttcatatgc 24000 aaaacccaca aatgaaaatg gagggcaagg cattcttgta aagcaacaaa atggaaagct 24060 agaaagtcaa gtggaaatgc aatttttctc aactactgag gcagccgcag gcaatggtga 24120 taacttgact cctaaagtgg tattgtacag tgaagatgta gatatagaaa ccccagacac 24180 tcatatttct tacatgccca ctattaagga aggtaactca cgagaactaa tgggccaaca 24240 atctatgccc aacaggccta attacattgc ttttagggac aattttattg gtctaatgta 24300 ttacaacagc acgggtaata tgggtgttct ggcgggccaa gcatcgcagt tgaatgctgt 24360 tgtagatttg caagacagaa acacagagct ttcataccag cttttgcttg attccattgg 24420 tgatagaacc aggtactttt ctatgtggaa tcaggctgtt gacagctatg atccagatgt 24480 tagaattatt gaaaatcatg gaactgaaga tgaacttcca aattactgct ttccactggg 24540 aggtgtgatt aatacagaga ctcttaccaa ggtaaaacct aaaacaggtc aggaaaatgg 24600 atgggaaaaa gatgctacag aattttcaga taaaaatgaa ataagagttg gaaataattt 24660 tgccatggaa atcaatctaa atgccaacct gtggagaaat ttcctgtact ccaacatagc 24720 gctgtatttg cccgacaagc taaagtacag tccttccaac gtaaaaattt ctgataaccc 24780 aaacacctac gactacatga acaagcgagt ggtggctccc gggctagtgg actgctacat 24840 taaccttgga gcacgctggt cccttgacta tatggacaac gtcaacccat ttaaccacca 24900 ccgcaatgct ggcctgcgct accgctcaat gttgctgggc aatggtcgct atgtgccctt 24960 ccacatccag gtgcctcaga agttctttgc cattaaaaac ctccttctcc tgccgggctc 25020 atacacctac gagtggaact tcaggaagga tgttaacatg gttctgcaga gctccctagg 25080 aaatgaccta agggttgacg gagccagcat taagtttgat agcatttgcc tttacgccac 25140 cttcttcccc atggcccaca acaccgcctc cacgcttgag gccatgctta gaaacgacac 25200 caacgaccag tcctttaacg actatctctc cgccgccaac atgctctacc ctatacccgc 25260 caacgctacc aacgtgccca tatccatccc ctcccgcaac tgggcggctt tccgcggctg 25320 ggccttcacg cgccttaaga ctaaggaaac cccatcactg ggctcgggct acgaccctta 25380 ttacacctac tctggctcta taccctacct agatggaacc ttttacctca accacacctt 25440 taagaaggtg gccattacct ttgactcttc tgtcagctgg cctggcaatg accgcctgct 25500 tacccccaac gagtttgaaa ttaagcgctc agttgacggg gagggttaca acgttgccca 25560 gtgtaacatg accaaagact ggttcctggt acaaatgcta gctaactata acattggcta 25620 ccagggcttc tatatcccag agagctacaa ggaccgcatg tactccttct ttagaaactt 25680 ccagcccatg agccgtcagg tggtggatga tactaaatac aaggactacc aacaggtggg 25740 catcctacac caacacaaca actctggatt tgttggctac cttgccccca ccatgcgcga 25800 aggacaggcc taccctgcta acttccccta tccgcttata ggcaagaccg cagttgacag 25860 cattacccag aaaaagtttc tttgcgatcg caccctttgg cgcatcccat tctccagtaa 25920 ctttatgtcc atgggcgcac tcacagacct gggccaaaac cttctctacg ccaactccgc 25980 ccacgcgcta gacatgactt ttgaggtgga tcccatggac gagcccaccc ttctttatgt 26040 tttgtttgaa gtctttgacg tggtccgtgt gcaccagccg caccgcggcg tcatcgaaac 26100 cgtgtacctg cgcacgccct tctcggccgg caacgccaca acataaagaa gcaagcaaca 26160 tcaacaacag ctgccgccat gggctccagt gagcaggaac tgaaagccat tgtcaaagat 26220 cttggttgtg ggccatattt tttgggcacc tatgacaagc gctttccagg ctttgtttct 26280 ccacacaagc tcgcctgcgc catagtcaat acggccggtc gcgagactgg gggcgtacac 26340 tggatggcct ttgcctggaa cccgcactca aaaacatgct acctctttga gccctttggc 26400 ttttctgacc agcgactcaa gcaggtttac cagtttgagt acgagtcact cctgcgccgt 26460 agcgccattg cttcttcccc cgaccgctgt ataacgctgg aaaagtccac ccaaagcgta 26520 caggggccca actcggccgc ctgtggacta ttctgctgca tgtttctcca cgcctttgcc 26580 aactggcccc aaactcccat ggatcacaac cccaccatga accttattac cggggtaccc 26640 aactccatgc tcaacagtcc ccaggtacag cccaccctgc gtcgcaacca ggaacagctc 26700 tacagcttcc tggagcgcca ctcgccctac ttccgcagcc acagtgcgca gattaggagc 26760 gccacttctt tttgtcactt gaaaaacatg taaaaataat gtactagaga cactttcaat 26820 aaaggcaaat gcttttattt gtacactctc gggtgattat ttacccccac ccttgccgtc 26880 tgcgccgttt aaaaatcaaa ggggttctgc cgcgcatcgc tatgcgccac tggcagggac 26940 acgttgcgat actggtgttt agtgctccac ttaaactcag gcacaaccat ccgcggcagc 27000 tcggtgaagt tttcactcca caggctgcgc accatcacca acgcgtttag caggtcgggc 27060 gccgatatct tgaagtcgca gttggggcct ccgccctgcg cgcgcgagtt gcgatacaca 27120 gggttgcagc actggaacac tatcagcgcc gggtggtgca cgctggccag cacgctcttg 27180 tcggagatca gatccgcgtc caggtcctcc gcgttgctca gggcgaacgg agtcaacttt 27240 ggtagctgcc ttcccaaaaa gggcgcgtgc ccaggctttg agttgcactc gcaccgtagt 27300 ggcatcaaaa ggtgaccgtg cccggtctgg gcgttaggat acagcgcctg cataaaagcc 27360 ttgatctgct taaaagccac ctgagccttt gcgccttcag agaagaacat gccgcaagac 27420 ttgccggaaa actgattggc cggacaggcc gcgtcgtgca cgcagcacct tgcgtcggtg 27480 ttggagatct gcaccacatt tcggccccac cggttcttca cgatcttggc cttgctagac 27540 tgctccttca gcgcgcgctg cccgttttcg ctcgtcacat ccatttcaat cacgtgctcc 27600 ttatttatca taatgcttcc gtgtagacac ttaagctcgc cttcgatctc agcgcagcgg 27660 tgcagccaca acgcgcagcc cgtgggctcg tgatgcttgt aggtcacctc tgcaaacgac 27720 tgcaggtacg cctgcaggaa tcgccccatc atcgtcacaa aggtcttgtt gctggtgaag 27780 gtcagctgca acccgcggtg ctcctcgttc agccaggtct tgcatacggc cgccagagct 27840 tccacttggt caggcagtag tttgaagttc gcctttagat cgttatccac gtggtacttg 27900 tccatcagcg cgcgcgcagc ctccatgccc ttctcccacg cagacacgat cggcacactc 27960 agcgggttca tcaccgtaat ttcactttcc gcttcgctgg gctcttcctc ttcctcttgc 28020 gtccgcatac cacgcgccac tgggtcgtct tcattcagcc gccgcactgt gcgcttacct 28080 cctttgccat gcttgattag caccggtggg ttgctgaaac ccaccatttg tagcgccaca 28140 tcttctcttt cttcctcgct gtccacgatt acctctggtg atggcgggcg ctcgggcttg 28200 ggagaagggc gcttcttttt cttcttgggc gcaatggcca aatccgccgc cgaggtcgat 28260 ggccgcgggc tgggtgtgcg cggcaccagc gcgtcttgtg atgagtcttc ctcgtcctcg 28320 gactcgatac gccgcctcat ccgctttttt gggggcgccc ggggaggcgg cggcgacggg 28380 gacggggacg acacgtcctc catggttggg ggacgtcgcg ccgcaccgcg tccgcgctcg 28440 ggggtggttt cgcgctgctc ctcttcccga ctggccattt ccttctccta taggcagaaa 28500 aagatcatgg agtcagtcga gaagaaggac agcctaaccg ccccctctga gttcgccacc 28560 accgcctcca ccgatgccgc caacgcgcct accaccttcc ccgtcgaggc acccccgctt 28620 gaggaggagg aagtgattat cgagcaggac ccaggttttg taagcgaaga cgacgaggac 28680 cgctcagtac caacagagga taaaaagcaa gaccaggaca acgcagaggc aaacgaggaa 28740 caagtcgggc ggggggacga aaggcatggc gactacctag atgtgggaga cgacgtgctg 28800 ttgaagcatc tgcagcgcca gtgcgccatt atctgcgacg cgttgcaaga gcgcagcgat 28860 gtgcccctcg ccatagcgga tgtcagcctt gcctacgaac gccacctatt ctcaccgcgc 28920 gtacccccca aacgccaaga aaacggcaca tgcgagccca acccgcgcct caacttctac 28980 cccgtatttg ccgtgccaga ggtgcttgcc acctatcaca tctttttcca aaactgcaag 29040 atacccctat cctgccgtgc caaccgcagc cgagcggaca agcagctggc cttgcggcag 29100 ggcgctgtca tacctgatat cgcctcgctc aacgaagtgc caaaaatctt tgagggtctt 29160 ggacgcgacg agaagcgcgc ggcaaacgct ctgcaacagg aaaacagcga aaatgaaagt 29220 cactctggag tgttggtgga actcgagggt gacaacgcgc gcctagccgt actaaaacgc 29280 agcatcgagg tcacccactt tgcctacccg gcacttaacc taccccccaa ggtcatgagc 29340 acagtcatga gtgagctgat cgtgcgccgt gcgcagcccc tggagaggga tgcaaatttg 29400 caagaacaaa cagaggaggg cctacccgca gttggcgacg agcagctagc gcgctggctt 29460 caaacgcgcg agcctgccga cttggaggag cgacgcaaac taatgatggc cgcagtgctc 29520 gttaccgtgg agcttgagtg catgcagcgg ttctttgctg acccggagat gcagcgcaag 29580 ctagaggaaa cattgcacta cacctttcga cagggctacg tacgccaggc ctgcaagatc 29640 tccaacgtgg agctctgcaa cctggtctcc taccttggaa ttttgcacga aaaccgcctt 29700 gggcaaaacg tgcttcattc cacgctcaag ggcgaggcgc gccgcgacta cgtccgcgac 29760 tgcgtttact tatttctatg ctacacctgg cagacggcca tgggcgtttg gcagcagtgc 29820 ttggaggagt gcaacctcaa ggagctgcag aaactgctaa agcaaaactt gaaggaccta 29880 tggacggcct tcaacgagcg ctccgtggcc gcgcacctgg cggacatcat tttccccgaa 29940 cgcctgctta aaaccctgca acagggtctg ccagacttca ccagtcaaag catgttgcag 30000 aactttagga actttatcct agagcgctca ggaatcttgc ccgccacctg ctgtgcactt 30060 cctagcgact ttgtgcccat taagtaccgc gaatgccctc cgccgctttg gggccactgc 30120 taccttctgc agctagccaa ctaccttgcc taccactctg acataatgga agacgtgagc 30180 ggtgacggtc tactggagtg tcactgtcgc tgcaacctat gcaccccgca ccgctccctg 30240 gtttgcaatt cgcagctgct taacgaaagt caaattatcg gtacctttga gctgcagggt 30300 ccctcgcctg acgaaaagtc cgcggctccg gggttgaaac tcactccggg gctgtggacg 30360 tcggcttacc ttcgcaaatt tgtacctgag gactaccacg cccacgagat taggttctac 30420 gaagaccaat cccgcccgcc taatgcggag cttaccgcct gcgtcattac ccagggccac 30480 attcttggcc aattgcaagc catcaacaaa gcccgccaag agtttctgct acgaaaggga 30540 cggggggttt acttggaccc ccagtccggc gaggagctca acccaatccc cccgccgccg 30600 cagccctatc agcagcagcc gcgggccctt gcttcccagg atggcaccca aaaagaagct 30660 gcagctgccg ccgccaccca cggacgagga ggaatactgg gacagtcagg cagaggaggt 30720 tttggacgag gaggaggagg acatgatgga agactgggag agcctagacg aggaagcttc 30780 cgaggtcgaa gaggtgtcag acgaaacacc gtcaccctcg gtcgcattcc cctcgccggc 30840 gccccagaaa tcggcaaccg gttccagcat ggctacaacc tccgctcctc aggcgccgcc 30900 ggcactgccc gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc actggaacca gggccggtaa 30960 gtccaagcag ccgccgccgt tagcccaaga gcaacaacag cgccaaggct accgctcatg 31020 gcgcgggcac aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac tgtgggggca acatctcctt 31080 cgcccgccgc tttcttctct accatcacgg cgtggccttc ccccgtaaca tcctgcatta 31140 ctaccgtcat ctctacagcc catactgcac cggcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca 31200 cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg 31260 cggcagcagc aggaggagga gcgctgcgtc tggcgcccaa cgaacccgta tcgacccgcg 31320 agcttagaaa caggattttt cccactctgt atgctatatt tcaacagagc aggggccaag 31380 aacaagagct gaaaataaaa aacaggtctc tgcgatccct cacccgcagc tgcctgtatc 31440 acaaaagcga agatcagctt cggcgcacgc tggaagacgc ggaggctctc ttcagtaaat 31500 actgcgcgct gactcttaag gactagtttc gcgccctttc tcaaatttaa gcgcgaaaac 31560 tacgtcatct ccagcggcca cacccggcgc cagcacctgt tgtcagcgcc attatgagca 31620 aggaaattcc cacgccctac atgtggagtt accagccaca aatgggactt gcggctggag 31680 ctgcccaaga ctactcaacc cgaataaact acatgagcgc gggaccccac atgatatccc 31740 gggtcaacgg aatacgcgcc caccgaaacc gaattctcct ggaacaggcg gctattacca 31800 ccacacctcg taataacctt aatccccgta gttggcccgc tgccctggtg taccaggaaa 31860 gtcccgctcc caccactgtg gtacttccca gagacgccca ggccgaagtt cagatgacta 31920 actcaggggc gcagcttgcg ggcggctttc gtcacagggt gcggtcgccc gggcagggta 31980 taactcacct gacaatcaga gggcgaggta ttcagctcaa cgacgagtcg gtgagctcct 32040 cgcttggtct ccgtccggac gggacatttc agatcggcgg cgccggccgc tcttcattca 32100 cgcctcgtca ggcaatccta actctgcaga cctcgtcctc tgagccgcgc tctggaggca 32160 ttggaactct gcaatttatt gaggagtttg tgccatcggt ctactttaac cccttctcgg 32220 gacctcccgg ccactatccg gatcaattta ttcctaactt tgacgcggta aaggactcgg 32280 cggacggcta cgactgaatg ttaagtggag aggcagagca actgcgcctg aaacacctgg 32340 tccactgtcg ccgccacaag tgctttgccc gcgactccgg tgagttttgc tactttgaat 32400 tgcccgagga tcatatcgag ggcccggcgc acggcgtccg gcttaccgcc cagggagagc 32460 ttgcccgtag cctgattcgg gagtttaccc agcgccccct gctagttgag cgggacaggg 32520 gaccctgtgt tctcactgtg atttgcaact gtcctaaccc tggattacat caagatcctc 32580 tagttaatgt caggtcgcct aagtcgatta actagagtac ccggggatct tattcccttt 32640 aactaataaa aaaaaataat aaagcatcac ttacttaaaa tcagttagca aatttctgtc 32700 cagtttattc agcagcacct ccttgccctc ctcccagctc tggtattgca gcttcctcct 32760 ggctgcaaac tttctccaca atctaaatgg aatgtcagtt tcctcctgtt cctgtccatc 32820 cgcacccact atcttcatgt tgttgcagat gaagcgcgca agaccgtctg aagatacctt 32880 caaccccgtg tatccatatg acacggaaac cggtcctcca actgtgcctt ttcttactcc 32940 tccctttgta tcccccaatg ggtttcaaga gagtccccct ggggtactct ctttgcgcct 33000 atccgaacct ctagttacct ccaatggcat gcttgcgctc aaaatgggca acggcctctc 33060 tctggacgag gccggcaacc ttacctccca aaatgtaacc actgtgagcc cacctctcaa 33120 aaaaaccaag tcaaacataa acctggaaat atctgcaccc ctcacagtta cctcagaagc 33180 cctaactgtg gctgccgccg cacctctaat ggtcgcgggc aacacactca ccatgcaatc 33240 acaggccccg ctaaccgtgc acgactccaa acttagcatt gccacccaag gacccctcac 33300 agtgtcagaa ggaaagctag ccctgcaaac atcaggcccc ctcaccacca ccgatagcag 33360 tacccttact atcactgcct caccccctct aactactgcc actggtagct tgggcattga 33420 cttgaaagag cccatttata cacaaaatgg aaaactagga ctaaagtacg gggctccttt 33480 gcatgtaaca gacgacctaa acactttgac cgtagcaact ggtccaggtg tgactattaa 33540 taatacttcc ttgcaaacta aagttactgg agccttgggt tttgattcac aaggcaatat 33600 gcaacttaat gtagcaggag gactaaggat tgattctcaa aacagacgcc ttatacttga 33660 tgttagttat ccgtttgatg ctcaaaacca actaaatcta agactaggac agggccctct 33720 ttttataaac tcagcccaca acttggatat taactacaac aaaggccttt acttgtttac 33780 agcttcaaac aattccaaaa agcttgaggt taacctaagc actgccaagg ggttgatgtt 33840 tgacgctaca gccatagcca ttaatgcagg agatgggctt gaatttggtt cacctaatgc 33900 accaaacaca aatcccctca aaacaaaaat tggccatggc ctagaatttg attcaaacaa 33960 ggctatggtt cctaaactag gaactggcct tagttttgac agcacaggtg ccattacagt 34020 aggaaacaaa aataatgata agctaacttt gtggaccaca ccagctccat ctcctaactg 34080 tagactaaat gcagagaaag atgctaaact cactttggtc ttaacaaaat gtggcagtca 34140 aatacttgct acagtttcag ttttggctgt taaaggcagt ttggctccaa tatctggaac 34200 agttcaaagt gctcatctta ttataagatt tgacgaaaat ggagtgctac taaacaattc 34260 cttcctggac ccagaatatt ggaactttag aaatggagat cttactgaag gcacagccta 34320 tacaaacgct gttggattta tgcctaacct atcagcttat ccaaaatctc acggtaaaac 34380 tgccaaaagt aacattgtca gtcaagttta cttaaacgga gacaaaacta aacctgtaac 34440 actaaccatt acactaaacg gtacacagga aacaggagac acaactccaa gtgcatactc 34500 tatgtcattt tcatgggact ggtctggcca caactacatt aatgaaatat ttgccacatc 34560 ctcttacact ttttcataca ttgcccaaga ataaagaatc gtttgtgtta tgtttcaacg 34620 tgtttatttt tcaattgcag aaaatttcaa gtcatttttc attcagtagt atagccccac 34680 caccacatag cttatacaga tcaccgtacc ttaatcaaac tcacagaacc ctagtattca 34740 acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct ttctccccgg ctggccttaa 34800 aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt tatattccac acggtttcct 34860 gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc gggcagctca cttaagttca 34920 tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac ttgcggttgc ttaacgggcg 34980 gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata atcgtgcatc aggatagggc 35040 ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg ccgctccgtc ctgcaggaat 35100 acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc ccgcagcata aggcgccttg 35160 tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc agcacagtaa ctgcagcaca 35220 gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct gtatccaaag ctcatggcgg 35280 ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag gtagattaag tggcgacccc 35340 tcataaacac gctggacata aacattacct cttttggcat gttgtaattc accacctccc 35400 ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac caccatccta aaccagctgg 35460 ccaaaacctg cccgccggct atacactgca gggaaccggg actggaacaa tgacagtgga 35520 gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat gatatcaatg ttggcacaac 35580 acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc ctcccgcgtt agaaccatat 35640 cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac actgcaggga agacctcgca 35700 cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg cagcagcgga tgatcctcca 35760 gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg atccctactg tacggagtgc 35820 gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc aaatggaacg ccggacgtag 35880 tcatatttcc tgaagcaaaa ccaggtgcgg gcgtgacaaa cagatctgcg tctccggtct 35940 cgccgcttag atcgctctgt gtagtagttg tagtatatcc actctctcaa agcatccagg 36000 cgccccctgg cttcgggttc tatgtaaact ccttcatgcg ccgctgccct gataacatcc 36060 accaccgcag aataagccac acccagccaa cctacacatt cgttctgcga gtcacacacg 36120 ggaggagcgg gaagagctgg aagaaccatg tttttttttt tattccaaaa gattatccaa 36180 aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac gcgctcccct ccggtggcgt ggtcaaactc 36240 tacagccaaa gaacagataa tggcatttgt aagatgttgc acaatggctt ccaaaaggca 36300 aacggccctc acgtccaagt ggacgtaaag gctaaaccct tcagggtgaa tctcctctat 36360 aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa ataattctca tctcgccacc ttctcaatat 36420 atctctaagc aaatcccgaa tattaagtcc ggccattgta aaaatctgct ccagagcgcc 36480 ctccaccttc agcctcaagc agcgaatcat gattgcaaaa attcaggttc ctcacagacc 36540 tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca aaaataccgc gatcccgtag gtcccttcgc 36600 agggccagct gaacataatc gtgcaggtct gcacggacca gcgcggccac ttccccgcca 36660 ggaaccatga caaaagaacc cacactgatt atgacacgca tactcggagc tatgctaacc 36720 agcgtagccc cgatgtaagc ttgttgcatg ggcggcgata taaaatgcaa ggtgctgctc 36780 aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa gaaagcacat cgtagtcatg ctcatgcaga 36840 taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca gaaaaagaca ccatttttct ctcaaacatg 36900 tctgcgggtt tctgcataaa cacaaaataa aataacaaaa aaacatttaa acattagaag 36960 cctgtcttac aacaggaaaa acaaccctta taagcataag acggactacg gccatgccgg 37020 cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat taaaaagcac caccgacagc tcctcggtca 37080 tgtccggagt cataatgtaa gactcggtaa acacatcagg ttgattcaca tcggtcagtg 37140 ctaaaaagcg accgaaatag cccgggggaa tacatacccg caggcgtaga gacaacatta 37200 cagcccccat aggaggtata acaaaattaa taggagagaa aaacacataa acacctgaaa 37260 aaccctcctg cctaggcaaa atagcaccct cccgctccag aacaacatac agcgcttcca 37320 cagcggcagc cataacagtc agccttacca gtaaaaaaga aaacctatta aaaaaacacc 37380 actcgacacg gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa agggccaagt gcagagcgag 37440 tatatatagg actaaaaaat gacgtaacgg ttaaagtcca caaaaaacac ccagaaaacc 37500 gcacgcgaac ctacgcccag aaacgaaagc caaaaaaccc acaacttcct caaatcgtca 37560 cttccgtttt cccacgttac gtcacttccc attttaagaa aactacaatt cccaacacat 37620 acaagttact ccgccctaaa acctacgtca cccgccccgt tcccacgccc cgcgccacgt 37680 cacaaactcc accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt atatt 37735 <210> 9 <211> 35706 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 taaggatccc atcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg 60 gggtggagtt tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg 120 cggaagtgtg atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg 180 acgtttttgg tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg 240 atgttgtagt aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga 300 ataagaggaa gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat actgctagag 360 atctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 420 agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat 480 tgggtactgg ccacaggagc ttggcccatt gcatacgttg tatccatatc ataatatgta 540 catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat tgactagtta 600 ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 660 ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 720 aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 780 ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 840 gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 900 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 960 gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 1020 aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 1080 tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 1140 ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 1200 acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctgactc tagcctagct 1260 ctgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 1320 agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 1380 gactctctct gcctattggt ctattttccc acccttaggc tgctggtctg agcctaggag 1440 atctctcgag gtcgacggta tcgatgggta ccgccaccat gtttgttttt ctcgtactcc 1500 tgcccctggt ttcctcccaa tgtgtcaatc tgactacccg gacccaactt cctcccgcct 1560 acaccaattc ctttacccga ggtgtttact acccagacaa agtgttcagg tcatccgtcc 1620 tccatagtac ccaagacctc ttcctccctt ttttttctaa cgttacctgg tttcacgcta 1680 ttcacgttag cggcaccaac ggcaccaaaa gattcgataa ccccgtactg ccgttcaacg 1740 acggggtata ttttgcctct actgaaaaat caaacatcat acgcggatgg atctttggga 1800 ctaccctgga ctcaaaaact cagtccctgc tgattgtgaa taacgctacc aacgtggtga 1860 tcaaagtctg tgaattccag ttttgcaacg atccttttct cggcgtttat tatcacaaaa 1920 ataacaaatc ctggatggag agcgagttcc gggtgtactc ctccgcgaat aattgcacct 1980 tcgaatatgt gtctcagcca ttcctcatgg acctcgaggg gaagcagggc aattttaaga 2040 atctgcgaga attcgtgttc aagaatatag acggttactt caagatttac tccaaacaca 2100 ccccgattaa cctggttagg gacttgcctc agggcttttc tgcattggag cccctcgtgg 2160 acctcccaat cggcataaac attacaagat ttcagacttt gcttgcattg cacaggagct 2220 atttgacacc cggcgattct tcttccggat ggaccgctgg agcagctgct tattacgtgg 2280 gctatctgca gcctcgaacc tttcttttga agtacaacga aaatggaact atcaccgatg 2340 cagttgactg cgccctggac cccctgtccg aaactaagtg cacgctcaaa agtttcacag 2400 tagagaaggg gatataccag actagcaatt tccgcgttca gccaaccgaa agtatagtgc 2460 gctttcctaa tataactaac ctgtgtcctt tcggggaagt gtttaacgcc actagattcg 2520 cttccgtcta cgcctggaat agaaagagga tctcaaattg cgttgctgac tatagtgttt 2580 tgtacaattc cgcctctttc tcaaccttca aatgttacgg ggtgagccct accaaactga 2640 acgacctgtg ctttacaaac gtatacgccg acagctttgt tatcagagga gacgaggttc 2700 gccagattgc tccgggtcag acaggcaaga ttgctgatta taattacaaa ctgcccgacg 2760 actttacagg atgtgtgatc gcgtggaaca gtaacaatct tgactcaaag gttgggggta 2820 attataatta tctttaccgg ctgttcagaa aaagcaattt gaaacccttc gaaagggaca 2880 tatccaccga gatctatcag gccgggtcca ctccatgcaa tggtgtggaa ggttttaatt 2940 gctacttccc attgcagtct tatggattcc aaccaaccaa tggcgtaggc taccagccgt 3000 atcgcgttgt cgtgctcagc ttcgagctgc tccacgcccc cgcgaccgta tgcggtccta 3060 agaagtccac caatcttgtt aagaacaagt gtgtaaactt taactttaac gggctgaccg 3120 ggaccggcgt tctgactgaa tctaacaaaa aattcctgcc tttccagcag ttcggccgcg 3180 atattgctga caccactgac gctgtaagag accctcagac ccttgaaatt ctcgatatca 3240 caccttgcag ctttgggggc gtgtccgtca tcactccagg aactaacaca agcaaccagg 3300 tggcagtgtt gtaccaggat gttaattgta ccgaggtgcc agtggccatc cacgccgatc 3360 aattgacacc tacctggagg gtttacagca cagggtccaa tgtttttcag acaagagccg 3420 gatgtctgat cggtgccgag catgtcaaca attcctacga gtgtgatatc cccattggtg 3480 cgggaatttg tgcatcatat cagacccaga ctaatagccc aagaagagct agatccgtcg 3540 ctagtcaatc catcattgca tatacaatga tgtccgataa cggcccccag aatcagagaa 3600 acgctccccg catcacgttc ggcggaccaa gtgacagcac aggcagtaac cagaacggag 3660 aacgctccgg tgctcgctcc aagcagcgac ggccgcaagg gcttcccaac aataccgcca 3720 gctggtttac ggctctgacc caacacggga aagaagatct taaattcccc aggggccagg 3780 gcgtccctat caatactaac tccagcccgg atgatcagat aggctactat agacgcgcta 3840 cccgacggat acgagggggg gacggcaaaa tgaaggacct ttccccccgg tggtatttct 3900 attacttggg caccggacca gaagccggac tgccttacgg cgctaacaaa gacggaataa 3960 tctgggttgc gacggagggc gccctgaata cacctaaaga ccatatcggc acaagaaatc 4020 ctgctaacaa tgccgcgatt gtgctccagc tgcctcaggg aaccacgctg cctaaagggt 4080 tttacgctga ggggtcaagg ggggggagtc aagcgtctag taggtcatcc tctcgctctc 4140 gcaatagttc ccggaactca accccaggca gcagcagagg aacctctccc gcacggatgg 4200 ctggcaatgg gggagatgct gcccttgctc tccttctgct ggatcgcctt aaccagctcg 4260 aatcaaagat gtctggaaaa ggtcagcagc agcaaggcca gaccgtgaca aagaagagtg 4320 cagctgaagc tagtaaaaag ccacgccaaa aacggaccgc aactaaggca tataacgtaa 4380 cacaggcctt cggcagaaga ggtccagaac aaacacaggg aaactttggc gatcaagagc 4440 tgattagaca gggcacagat tacaaacact ggccacagat cgcgcagttt gcaccaagcg 4500 cctctgcatt cttcgggatg agtcggattg ggatggaagt cactccatcc gggacctggc 4560 ttacctacac aggggcaata aaactcgacg acaaagaccc aaactttaaa gatcaggtca 4620 tcctgctgaa taaacacatc gatgcctaca aaactttccc cccaaccgaa ccaaagaaag 4680 acaagaaaaa aaaggcagac gaaacgcaag cgctccctca gcgccagaag aagcagcaga 4740 ccgttacact gttgccagca gcagatctgg atgatttttc caagcagctt caacagagta 4800 tgtcaagcgc tgacagcact caggcttgac gatcggatat cgctagcgta ccggcggccg 4860 ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 4920 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4980 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 5040 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 5100 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccaaagc 5160 ttacgcgtta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 5220 gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 5280 cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 5340 tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 5400 catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 5460 gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 5520 gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 5580 tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 5640 aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 5700 aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc 5760 tagagatatc gggccactgc aggaaacgat atgggctgaa tacggatccg tattcagccc 5820 atatcgtttc tctagaaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt 5880 gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatctcgag cctaagcttg tcgactcgaa 5940 gatctgggcg tggttaaggg tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg 6000 tatctgtttt gcagcagccg ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt 6060 gagctcatat ttgacaacgc gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg 6120 ctccagcatt gatggtcgcc ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac 6180 cgtgtctgga acgccgttgg agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac 6240 cgcccgcggg attgtgactg actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc 6300 ccgttcatcc gcccgcgatg acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac 6360 ccgggaactt aatgtcgttt ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct 6420 gaaggcttcc tcccctccca atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg 6480 gatttggatc aagcaagtgt cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc 6540 ccgggaccag cggtctcggt cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag 6600 gtgactctgg atgttcagat acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca 6660 ctgcagagct tcatgctgcg gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg 6720 ggcgtggtgc ctaaaaatgt ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt 6780 gtaagtgttt acaaagcggt taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat 6840 cttggactgt atttttaggt tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt 6900 gtgcagaacc accagcacag tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga 6960 aggaaatgcg tggaagaact tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc 7020 gtccataatg atggcaatgg gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc 7080 actaacgtca tagttgtgtt ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg 7140 gcggagggtg ccagactgcg gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc 7200 acagatttgc atttcccacg ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc 7260 gatgaagaaa acggtttccg gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag 7320 cagctgcgac ttaccgcagc cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg gctgcaactg 7380 gtagttaaga gagctgcagc tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat 7440 gtccctgact cgcatgtttt ccctgaccaa atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga 7500 tagcagttct tgcaaggaag caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat 7560 gcttttgagc gtttgaccaa gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac 7620 ggcatctcga tccagcatat ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc 7680 agtagtcggt gctcgtccag acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc 7740 gtcagcgtag tctgggtcac ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg 7800 cgcttgaggc tggtcctgct ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc 7860 aggtagcatt tgaccatggt gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc 7920 agcttgccct tggaggaggc gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc 7980 ttgggcgcga gaaataccga ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg 8040 gtctcgcatt ccacgagcca ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc 8100 ccatgctttt tgatgcgttt cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg 8160 acgaaaaggc tgtccgtgtc cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt 8220 ccgcggtcct cctcgtatag aaactcggac cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc 8280 agcacgaagg aggctaagtg ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc 8340 tccagggtgt gaagacacat gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag 8400 gtgtaggcca cgtgaccggg tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt 8460 tcgtcctcac tctcttccgc atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc 8520 ctctgaaaag cgggcatgac ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat 8580 ttgatattca cctggcccgc ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa 8640 aagacaatct ttttgttgtc aagcttggtg gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc 8700 aacttggcga tggagcgcag ggtttggttt ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg 8760 atgtttagct gcacgtattc gcgcgcaacg caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc 8820 tcgtcgggca ccaggtgcac gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg 8880 gtggctacct ctccgcgtag gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag 8940 cagaatggcg gtagggggtc tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag 9000 accccgggca gcaggcgcgc gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc 9060 tgctgccatg cgcgggcggc aagcgcgcgc tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc 9120 atggggtggg tgagcgcgga ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct 9180 ctgagtattc caagatatgt agggtagcat cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa 9240 tcgtatagtt cgtgcgaggg agcgaggagg tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc 9300 tctgctcgga agactatctg cctgaagatg gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc 9360 tggaagacgt tgaagctggc gtctgtgaga cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag 9420 gagtcgcgca gcttgttgac cagctcggcg gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc 9480 agggtttcct tgatgatgtc atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg 9540 aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa 9600 cggtaagagc ctagcatgta gaactggttg acggcctggt aggcgcagca tcccttttct 9660 acgggtagcg cgtatgcctg cgcggccttc cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg 9720 tccctgacca tgactttgag gtactggtat ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc 9780 tcccagagca aaaagtccgt gcgctttttg gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca 9840 tcgttgaaga gtatctttcc cgcgcgaggc ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc 9900 ggcacctcgg aacggttgtt aattacctgg gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg 9960 atgttgtggc ccacaatgta aagttccaag aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat 10020 tttttaagtt cctcgtaggt gagctcttca ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc 10080 cagtctgcaa gatgagggtt ggaagcgacg aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc 10140 atttgcaggt ggtcgcgaaa ggtcctaaac tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg 10200 atgcagtaga aggtaagcgg gtcttgttcc cagcggtccc atccaaggtt cgcggctagg 10260 tctcgcgcgg cagtcactag aggctcatct ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc 10320 acgagctgct tcccaaaggc ccccatccaa gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag 10380 agacgctcgg tgcgaggatg cgagccgatc gggaagaact ggatctcccg ccaccaattg 10440 gaggagtggc tattgatgtg gtgaaagtag aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc 10500 tggcttttgt aaaaacgtgc gcagtactgg cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg 10560 aggttgacct gacgaccgcg cacaaggaag cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc 10620 gggtttggct ggtggtcttc tacttcggct gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg 10680 ggagttacgg tggatcggac caccacgccg cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc 10740 ggcggtcgga gcttgatgac aacatcgcgc agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc 10800 cgcggcgtca ggtcaggcgg gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg 10860 cgggctagat ccaggtgata cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct 10920 tgcaagaggc cgcatccccg cggcgcgact acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg 10980 ggggtgtcct tggatgatgc atctaaaagc ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg 11040 ggggctccgg acccgccggg agagggggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga 11100 gctggtgctg cgcgcgtagg ttgctggcga acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa 11160 tctggcgcct ctgcgtgaag acgacgggcc cggtgagctt gaacctgaaa gagagttcga 11220 cagaatcaat ttcggtgtcg ttgacggcgg cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg 11280 agttgtcttg ataggcgatc tcggccatga actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc 11340 cgcgtccggc tcgctccacg gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg 11400 agaaggcgtt gaggcctccc tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat 11460 cgcgggcgcg catgaccacc tgcgcgagat tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt 11520 agtttcgcag gcgctgaaag aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga 11580 agtacataac ccagcgtcgc aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct 11640 ccatggcctc gtagaagtcc acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg 11700 ttaactcctc ctccagaaga cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa 11760 aggctacagg ggcctcttct tcttcttcaa tctcctcttc cataagggcc tccccttctt 11820 cttcttctgg cggcggtggg ggagggggga cacggcggcg acgacggcgc accgggaggc 11880 ggtcgacaaa gcgctcgatc atctccccgc ggcgacggcg catggtctcg gtgacggcgc 11940 ggccgttctc gcgggggcgc agttggaaga cgccgcccgt catgtcccgg ttatgggttg 12000 gcggggggct gccatgcggc agggatacgg cgctaacgat gcatctcaac aattgttgtg 12060 taggtactcc gccgccgagg gacctgagcg agtccgcatc gaccggatcg gaaaacctct 12120 cgagaaaggc gtctaaccag tcacagtcgc aaggtaggct gagcaccgtg gcgggcggca 12180 gcgggcggcg gtcggggttg tttctggcgg aggtgctgct gatgatgtaa ttaaagtagg 12240 cggtcttgag acggcggatg gtcgacagaa gcaccatgtc cttgggtccg gcctgctgaa 12300 tgcgcaggcg gtcggccatg ccccaggctt cgttttgaca tcggcgcagg tctttgtagt 12360 agtcttgcat gagcctttct accggcactt cttcttctcc ttcctcttgt cctgcatctc 12420 ttgcatctat cgctgcggcg gcggcggagt ttggccgtag gtggcgccct cttcctccca 12480 tgcgtgtgac cccgaagccc ctcatcggct gaagcagggc taggtcggcg acaacgcgct 12540 cggctaatat ggcctgctgc acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa 12600 agcggtggta tgcgcccgtg ttgatggtgt aagtgcagtt ggccataacg gaccagttaa 12660 cggtctggtg acccggctgc gagagctcgg tgtacctgag acgcgagtaa gccctcgagt 12720 caaatacgta gtcgttgcaa gtccgcacca ggtactggta tcccaccaaa aagtgcggcg 12780 gcggctggcg gtagaggggc cagcgtaggg tggccggggc tccgggggcg agatcttcca 12840 acataaggcg atgatatccg tagatgtacc tggacatcca ggtgatgccg gcggcggtgg 12900 tggaggcgcg cggaaagtcg cggacgcggt tccagatgtt gcgcagcggc aaaaagtgct 12960 ccatggtcgg gacgctctgg ccggtcaggc gcgcgcaatc gttgacgctc tagcgtgcaa 13020 aaggagagcc tgtaagcggg cactcttccg tggtctggtg gataaattcg caagggtatc 13080 atggcggacg accggggttc gagccccgta tccggccgtc cgccgtgatc catgcggtta 13140 ccgcccgcgt gtcgaaccca ggtgtgcgac gtcagacaac gggggagtgc tccttttggc 13200 ttccttccag gcgcggcggc tgctgcgcta gcttttttgg ccactggccg cgcgcagcgt 13260 aagcggttag gctggaaagc gaaagcatta agtggctcgc tccctgtagc cggagggtta 13320 ttttccaagg gttgagtcgc gggacccccg gttcgagtct cggaccggcc ggactgcggc 13380 gaacgggggt ttgcctcccc gtcatgcaag accccgcttg caaattcctc cggaaacagg 13440 gacgagcccc ttttttgctt ttcccagatg catccggtgc tgcggcagat gcgcccccct 13500 cctcagcagc ggcaagagca agagcagcgg cagacatgca gggcaccctc ccctcctcct 13560 accgcgtcag gaggggcgac atccgcggtt gacgcggcag cagatggtga ttacgaaccc 13620 ccgcggcgcc gggcccggca ctacctggac ttggaggagg gcgagggcct ggcgcggcta 13680 ggagcgccct ctcctgagcg gcacccaagg gtgcagctga agcgtgatac gcgtgaggcg 13740 tacgtgccgc ggcagaacct gtttcgcgac cgcgagggag aggagcccga ggagatgcgg 13800 gatcgaaagt tccacgcagg gcgcgagctg cggcatggcc tgaatcgcga gcggttgctg 13860 cgcgaggagg actttgagcc cgacgcgcga accgggatta gtcccgcgcg cgcacacgtg 13920 gcggccgccg acctggtaac cgcatacgag cagacggtga accaggagat taactttcaa 13980 aaaagcttta acaaccacgt gcgtacgctt gtggcgcgcg aggaggtggc tataggactg 14040 atgcatctgt gggactttgt aagcgcgctg gagcaaaacc caaatagcaa gccgctcatg 14100 gcgcagctgt tccttatagt gcagcacagc agggacaacg aggcattcag ggatgcgctg 14160 ctaaacatag tagagcccga gggccgctgg ctgctcgatt tgataaacat cctgcagagc 14220 atagtggtgc aggagcgcag cttgagcctg gctgacaagg tggccgccat caactattcc 14280 atgcttagcc tgggcaagtt ttacgcccgc aagatatacc atacccctta cgttcccata 14340 gacaaggagg taaagatcga ggggttctac atgcgcatgg cgctgaaggt gcttaccttg 14400 agcgacgacc tgggcgttta tcgcaacgag cgcatccaca aggccgtgag cgtgagccgg 14460 cggcgcgagc tcagcgaccg cgagctgatg cacagcctgc aaagggccct ggctggcacg 14520 ggcagcggcg atagagaggc cgagtcctac tttgacgcgg gcgctgacct gcgctgggcc 14580 ccaagccgac gcgccctgga ggcagctggg gccggacctg ggctggcggt ggcacccgcg 14640 cgcgctggca acgtcggcgg cgtggaggaa tatgacgagg acgatgagta cgagccagag 14700 gacggcgagt actaagcggt gatgtttctg atcagatgat gcaagacgca acggacccgg 14760 cggtgcgggc ggcgctgcag agccagccgt ccggccttaa ctccacggac gactggcgcc 14820 aggtcatgga ccgcatcatg tcgctgactg cgcgcaatcc tgacgcgttc cggcagcagc 14880 cgcaggccaa ccggctctcc gcaattctgg aagcggtggt cccggcgcgc gcaaacccca 14940 cgcacgagaa ggtgctggcg atcgtaaacg cgctggccga aaacagggcc atccggcccg 15000 acgaggccgg cctggtctac gacgcgctgc ttcagcgcgt ggctcgttac aacagcggca 15060 acgtgcagac caacctggac cggctggtgg gggatgtgcg cgaggccgtg gcgcagcgtg 15120 agcgcgcgca gcagcagggc aacctgggct ccatggttgc actaaacgcc ttcctgagta 15180 cacagcccgc caacgtgccg cggggacagg aggactacac caactttgtg agcgcactgc 15240 ggctaatggt gactgagaca ccgcaaagtg aggtgtacca gtctgggcca gactattttt 15300 tccagaccag tagacaaggc ctgcagaccg taaacctgag ccaggctttc aaaaacttgc 15360 aggggctgtg gggggtgcgg gctcccacag gcgaccgcgc gaccgtgtct agcttgctga 15420 cgcccaactc gcgcctgttg ctgctgctaa tagcgccctt cacggacagt ggcagcgtgt 15480 cccgggacac atacctaggt cacttgctga cactgtaccg cgaggccata ggtcaggcgc 15540 atgtggacga gcatactttc caggagatta caagtgtcag ccgcgcgctg gggcaggagg 15600 acacgggcag cctggaggca accctaaact acctgctgac caaccggcgg cagaagatcc 15660 cctcgttgca cagtttaaac agcgaggagg agcgcatttt gcgctacgtg cagcagagcg 15720 tgagccttaa cctgatgcgc gacggggtaa cgcccagcgt ggcgctggac atgaccgcgc 15780 gcaacatgga accgggcatg tatgcctcaa accggccgtt tatcaaccgc ctaatggact 15840 acttgcatcg cgcggccgcc gtgaaccccg agtatttcac caatgccatc ttgaacccgc 15900 actggctacc gccccctggt ttctacaccg ggggattcga ggtgcccgag ggtaacgatg 15960 gattcctctg ggacgacata gacgacagcg tgttttcccc gcaaccgcag accctgctag 16020 agttgcaaca gcgcgagcag gcagaggcgg cgctgcgaaa ggaaagcttc cgcaggccaa 16080 gcagcttgtc cgatctaggc gctgcggccc cgcggtcaga tgctagtagc ccatttccaa 16140 gcttgatagg gtctcttacc agcactcgca ccacccgccc gcgcctgctg ggcgaggagg 16200 agtacctaaa caactcgctg ctgcagccgc agcgcgaaaa aaacctgcct ccggcatttc 16260 ccaacaacgg gatagagagc ctagtggaca agatgagtag atggaagacg tacgcgcagg 16320 agcacaggga cgtgccaggc ccgcgcccgc ccacccgtcg tcaaaggcac gaccgtcagc 16380 ggggtctggt gtgggaggac gatgactcgg cagacgacag cagcgtcctg gatttgggag 16440 ggagtggcaa cccgtttgcg caccttcgcc ccaggctggg gagaatgttt taaaaaaaaa 16500 aaagcatgat gcaaaataaa aaactcacca aggccatggc accgagcgtt ggttttcttg 16560 tattcccctt agtatgcggc gcgcggcgat gtatgaggaa ggtcctcctc cctcctacga 16620 gagtgtggtg agcgcggcgc cagtggcggc ggcgctgggt tctcccttcg atgctcccct 16680 ggacccgccg tttgtgcctc cgcggtacct gcggcctacc ggggggagaa acagcatccg 16740 ttactctgag ttggcacccc tattcgacac cacccgtgtg tacctggtgg acaacaagtc 16800 aacggatgtg gcatccctga actaccagaa cgaccacagc aactttctga ccacggtcat 16860 tcaaaacaat gactacagcc cgggggaggc aagcacacag accatcaatc ttgacgaccg 16920 gtcgcactgg ggcggcgacc tgaaaaccat cctgcatacc aacatgccaa atgtgaacga 16980 gttcatgttt accaataagt ttaaggcgcg ggtgatggtg tcgcgcttgc ctactaagga 17040 caatcaggtg gagctgaaat acgagtgggt ggagttcacg ctgcccgagg gcaactactc 17100 cgagaccatg accatagacc ttatgaacaa cgcgatcgtg gagcactact tgaaagtggg 17160 cagacagaac ggggttctgg aaagcgacat cggggtaaag tttgacaccc gcaacttcag 17220 actggggttt gaccccgtca ctggtcttgt catgcctggg gtatatacaa acgaagcctt 17280 ccatccagac atcattttgc tgccaggatg cggggtggac ttcacccaca gccgcctgag 17340 caacttgttg ggcatccgca agcggcaacc cttccaggag ggctttagga tcacctacga 17400 tgatctggag ggtggtaaca ttcccgcact gttggatgtg gacgcctacc aggcgagctt 17460 gaaagatgac accgaacagg gcgggggtgg cgcaggcggc agcaacagca gtggcagcgg 17520 cgcggaagag aactccaacg cggcagccgc ggcaatgcag ccggtggagg acatgaacga 17580 tcatgccatt cgcggcgaca cctttgccac acgggctgag gagaagcgcg ctgaggccga 17640 agcagcggcc gaagctgccg cccccgctgc gcaacccgag gtcgagaagc ctcagaagaa 17700 accggtgatc aaacccctga cagaggacag caagaaacgc agttacaacc taataagcaa 17760 tgacagcacc ttcacccagt accgcagctg gtaccttgca tacaactacg gcgaccctca 17820 gaccggaatc cgctcatgga ccctgctttg cactcctgac gtaacctgcg gctcggagca 17880 ggtctactgg tcgttgccag acatgatgca agaccccgtg accttccgct ccacgcgcca 17940 gatcagcaac tttccggtgg tgggcgccga gctgttgccc gtgcactcca agagcttcta 18000 caacgaccag gccgtctact cccaactcat ccgccagttt acctctctga cccacgtgtt 18060 caatcgcttt cccgagaacc agattttggc gcgcccgcca gcccccacca tcaccaccgt 18120 cagtgaaaac gttcctgctc tcacagatca cgggacgcta ccgctgcgca acagcatcgg 18180 aggagtccag cgagtgacca ttactgacgc cagacgccgc acctgcccct acgtttacaa 18240 ggccctgggc atagtctcgc cgcgcgtcct atcgagccgc actttttgag caagcatgtc 18300 catccttata tcgcccagca ataacacagg ctggggcctg cgcttcccaa gcaagatgtt 18360 tggcggggcc aagaagcgct ccgaccaaca cccagtgcgc gtgcgcgggc actaccgcgc 18420 gccctggggc gcgcacaaac gcggccgcac tgggcgcacc accgtcgatg acgccatcga 18480 cgcggtggtg gaggaggcgc gcaactacac gcccacgccg ccaccagtgt ccacagtgga 18540 cgcggccatt cagaccgtgg tgcgcggagc ccggcgctat gctaaaatga agagacggcg 18600 gaggcgcgta gcacgtcgcc accgccgccg acccggcact gccgcccaac gcgcggcggc 18660 ggccctgctt aaccgcgcac gtcgcaccgg ccgacgggcg gccatgcggg ccgctcgaag 18720 gctggccgcg ggtattgtca ctgtgccccc caggtccagg cgacgagcgg ccgccgcagc 18780 agccgcggcc attagtgcta tgactcaggg tcgcaggggc aacgtgtatt gggtgcgcga 18840 ctcggttagc ggcctgcgcg tgcccgtgcg cacccgcccc ccgcgcaact agattgcaag 18900 aaaaaactac ttagactcgt actgttgtat gtatccagcg gcggcggcgc gcaacgaagc 18960 tatgtccaag cgcaaaatca aagaagagat gctccaggtc atcgcgccgg agatctatgg 19020 ccccccgaag aaggaagagc aggattacaa gccccgaaag ctaaagcggg tcaaaaagaa 19080 aaagaaagat gatgatgatg aacttgacga cgaggtggaa ctgctgcacg ctaccgcgcc 19140 caggcgacgg gtacagtgga aaggtcgacg cgtaaaacgt gttttgcgac ccggcaccac 19200 cgtagtcttt acgcccggtg agcgctccac ccgcacctac aagcgcgtgt atgatgaggt 19260 gtacggcgac gaggacctgc ttgagcaggc caacgagcgc ctcggggagt ttgcctacgg 19320 aaagcggcat aaggacatgc tggcgttgcc gctggacgag ggcaacccaa cacctagcct 19380 aaagcccgta acactgcagc aggtgctgcc cgcgcttgca ccgtccgaag aaaagcgcgg 19440 cctaaagcgc gagtctggtg acttggcacc caccgtgcag ctgatggtac ccaagcgcca 19500 gcgactggaa gatgtcttgg aaaaaatgac cgtggaacct gggctggagc ccgaggtccg 19560 cgtgcggcca atcaagcagg tggcgccggg actgggcgtg cagaccgtgg acgttcagat 19620 acccactacc agtagcacca gtattgccac cgccacagag ggcatggaga cacaaacgtc 19680 cccggttgcc tcagcggtgg cggatgccgc ggtgcaggcg gtcgctgcgg ccgcgtccaa 19740 gacctctacg gaggtgcaaa cggacccgtg gatgtttcgc gtttcagccc cccggcgccc 19800 gcgccgttcg aggaagtacg gcgccgccag cgcgctactg cccgaatatg ccctacatcc 19860 ttccattgcg cctacccccg gctatcgtgg ctacacctac cgccccagaa gacgagcaac 19920 tacccgacgc cgaaccacca ctggaacccg ccgccgccgt cgccgtcgcc agcccgtgct 19980 ggccccgatt tccgtgcgca gggtggctcg cgaaggaggc aggaccctgg tgctgccaac 20040 agcgcgctac caccccagca tcgtttaaaa gccggtcttt gtggttcttg cagatatggc 20100 cctcacctgc cgcctccgtt tcccggtgcc gggattccga ggaagaatgc accgtaggag 20160 gggcatggcc ggccacggcc tgacgggcgg catgcgtcgt gcgcaccacc ggcggcggcg 20220 cgcgtcgcac cgtcgcatgc gcggcggtat cctgcccctc cttattccac tgatcgccgc 20280 ggcgattggc gccgtgcccg gaattgcatc cgtggccttg caggcgcaga gacactgatt 20340 aaaaacaagt tgcatgtgga aaaatcaaaa taaaaagtct ggactctcac gctcgcttgg 20400 tcctgtaact attttgtaga atggaagaca tcaactttgc gtctctggcc ccgcgacacg 20460 gctcgcgccc gttcatggga aactggcaag atatcggcac cagcaatatg agcggtggcg 20520 ccttcagctg gggctcgctg tggagcggca ttaaaaattt cggttccacc gttaagaact 20580 atggcagcaa ggcctggaac agcagcacag gccagatgct gagggataag ttgaaagagc 20640 aaaatttcca acaaaaggtg gtagatggcc tggcctctgg cattagcggg gtggtggacc 20700 tggccaacca ggcagtgcaa aataagatta acagtaagct tgatccccgc cctcccgtag 20760 aggagcctcc accggccgtg gagacagtgt ctccagaggg gcgtggcgaa aagcgtccgc 20820 gccccgacag ggaagaaact ctggtgacgc aaatagacga gcctccctcg tacgaggagg 20880 cactaaagca aggcctgccc accacccgtc ccatcgcgcc catggctacc ggagtgctgg 20940 gccagcacac acccgtaacg ctggacctgc ctccccccgc cgacacccag cagaaacctg 21000 tgctgccagg cccgaccgcc gttgttgtaa cccgtcctag ccgcgcgtcc ctgcgccgcg 21060 ccgccagcgg tccgcgatcg ttgcggcccg tagccagtgg caactggcaa agcacactga 21120 acagcatcgt gggtctgggg gtgcaatccc tgaagcgccg acgatgcttc tgatagctaa 21180 cgtgtcgtat gtgtgtcatg tatgcgtcca tgtcgccgcc agaggagctg ctgagccgcc 21240 gcgcgcccgc tttccaagat ggctacccct tcgatgatgc cgcagtggtc ttacatgcac 21300 atctcgggcc aggacgcctc ggagtacctg agccccgggc tggtgcagtt tgcccgcgcc 21360 accgagacgt acttcagcct gaataacaag tttagaaacc ccacggtggc gcctacgcac 21420 gacgtgacca cagaccggtc ccagcgtttg acgctgcggt tcatccctgt ggaccgtgag 21480 gatactgcgt actcgtacaa ggcgcggttc accctagctg tgggtgataa ccgtgtgctg 21540 gacatggctt ccacgtactt tgacatccgc ggcgtgctgg acaggggccc tacttttaag 21600 ccctactctg gcactgccta caacgccctg gctcccaagg gtgccccaaa tccttgcgaa 21660 tgggatgaag ctgctactgc tcttgaaata aacctagaag aagaggacga tgacaacgaa 21720 gacgaagtag acgagcaagc tgagcagcaa aaaactcacg tatttgggca ggcgccttat 21780 tctggtataa atattacaaa ggagggtatt caaataggtg tcgaaggtca aacacctaaa 21840 tatgccgata aaacatttca acctgaacct caaataggag aatctcagtg gtacgaaaca 21900 gaaattaatc atgcagctgg gagagtccta aaaaagacta ccccaatgaa accatgttac 21960 ggttcatatg caaaacccac aaatgaaaat ggagggcaag gcattcttgt aaagcaacaa 22020 aatggaaagc tagaaagtca agtggaaatg caatttttct caactactga ggcagccgca 22080 ggcaatggtg ataacttgac tcctaaagtg gtattgtaca gtgaagatgt agatatagaa 22140 accccagaca ctcatatttc ttacatgccc actattaagg aaggtaactc acgagaacta 22200 atgggccaac aatctatgcc caacaggcct aattacattg cttttaggga caattttatt 22260 ggtctaatgt attacaacag cacgggtaat atgggtgttc tggcgggcca agcatcgcag 22320 ttgaatgctg ttgtagattt gcaagacaga aacacagagc tttcatacca gcttttgctt 22380 gattccattg gtgatagaac caggtacttt tctatgtgga atcaggctgt tgacagctat 22440 gatccagatg ttagaattat tgaaaatcat ggaactgaag atgaacttcc aaattactgc 22500 tttccactgg gaggtgtgat taatacagag actcttacca aggtaaaacc taaaacaggt 22560 caggaaaatg gatgggaaaa agatgctaca gaattttcag ataaaaatga aataagagtt 22620 ggaaataatt ttgccatgga aatcaatcta aatgccaacc tgtggagaaa tttcctgtac 22680 tccaacatag cgctgtattt gcccgacaag ctaaagtaca gtccttccaa cgtaaaaatt 22740 tctgataacc caaacaccta cgactacatg aacaagcgag tggtggctcc cgggctagtg 22800 gactgctaca ttaaccttgg agcacgctgg tcccttgact atatggacaa cgtcaaccca 22860 tttaaccacc accgcaatgc tggcctgcgc taccgctcaa tgttgctggg caatggtcgc 22920 tatgtgccct tccacatcca ggtgcctcag aagttctttg ccattaaaaa cctccttctc 22980 ctgccgggct catacaccta cgagtggaac ttcaggaagg atgttaacat ggttctgcag 23040 agctccctag gaaatgacct aagggttgac ggagccagca ttaagtttga tagcatttgc 23100 ctttacgcca ccttcttccc catggcccac aacaccgcct ccacgcttga ggccatgctt 23160 agaaacgaca ccaacgacca gtcctttaac gactatctct ccgccgccaa catgctctac 23220 cctatacccg ccaacgctac caacgtgccc atatccatcc cctcccgcaa ctgggcggct 23280 ttccgcggct gggccttcac gcgccttaag actaaggaaa ccccatcact gggctcgggc 23340 tacgaccctt attacaccta ctctggctct ataccctacc tagatggaac cttttacctc 23400 aaccacacct ttaagaaggt ggccattacc tttgactctt ctgtcagctg gcctggcaat 23460 gaccgcctgc ttacccccaa cgagtttgaa attaagcgct cagttgacgg ggagggttac 23520 aacgttgccc agtgtaacat gaccaaagac tggttcctgg tacaaatgct agctaactat 23580 aacattggct accagggctt ctatatccca gagagctaca aggaccgcat gtactccttc 23640 tttagaaact tccagcccat gagccgtcag gtggtggatg atactaaata caaggactac 23700 caacaggtgg gcatcctaca ccaacacaac aactctggat ttgttggcta ccttgccccc 23760 accatgcgcg aaggacaggc ctaccctgct aacttcccct atccgcttat aggcaagacc 23820 gcagttgaca gcattaccca gaaaaagttt ctttgcgatc gcaccctttg gcgcatccca 23880 ttctccagta actttatgtc catgggcgca ctcacagacc tgggccaaaa ccttctctac 23940 gccaactccg cccacgcgct agacatgact tttgaggtgg atcccatgga cgagcccacc 24000 cttctttatg ttttgtttga agtctttgac gtggtccgtg tgcaccagcc gcaccgcggc 24060 gtcatcgaaa ccgtgtacct gcgcacgccc ttctcggccg gcaacgccac aacataaaga 24120 agcaagcaac atcaacaaca gctgccgcca tgggctccag tgagcaggaa ctgaaagcca 24180 ttgtcaaaga tcttggttgt gggccatatt ttttgggcac ctatgacaag cgctttccag 24240 gctttgtttc tccacacaag ctcgcctgcg ccatagtcaa tacggccggt cgcgagactg 24300 ggggcgtaca ctggatggcc tttgcctgga acccgcactc aaaaacatgc tacctctttg 24360 agccctttgg cttttctgac cagcgactca agcaggttta ccagtttgag tacgagtcac 24420 tcctgcgccg tagcgccatt gcttcttccc ccgaccgctg tataacgctg gaaaagtcca 24480 cccaaagcgt acaggggccc aactcggccg cctgtggact attctgctgc atgtttctcc 24540 acgcctttgc caactggccc caaactccca tggatcacaa ccccaccatg aaccttatta 24600 ccggggtacc caactccatg ctcaacagtc cccaggtaca gcccaccctg cgtcgcaacc 24660 aggaacagct ctacagcttc ctggagcgcc actcgcccta cttccgcagc cacagtgcgc 24720 agattaggag cgccacttct ttttgtcact tgaaaaacat gtaaaaataa tgtactagag 24780 acactttcaa taaaggcaaa tgcttttatt tgtacactct cgggtgatta tttaccccca 24840 cccttgccgt ctgcgccgtt taaaaatcaa aggggttctg ccgcgcatcg ctatgcgcca 24900 ctggcaggga cacgttgcga tactggtgtt tagtgctcca cttaaactca ggcacaacca 24960 tccgcggcag ctcggtgaag ttttcactcc acaggctgcg caccatcacc aacgcgttta 25020 gcaggtcggg cgccgatatc ttgaagtcgc agttggggcc tccgccctgc gcgcgcgagt 25080 tgcgatacac agggttgcag cactggaaca ctatcagcgc cgggtggtgc acgctggcca 25140 gcacgctctt gtcggagatc agatccgcgt ccaggtcctc cgcgttgctc agggcgaacg 25200 gagtcaactt tggtagctgc cttcccaaaa agggcgcgtg cccaggcttt gagttgcact 25260 cgcaccgtag tggcatcaaa aggtgaccgt gcccggtctg ggcgttagga tacagcgcct 25320 gcataaaagc cttgatctgc ttaaaagcca cctgagcctt tgcgccttca gagaagaaca 25380 tgccgcaaga cttgccggaa aactgattgg ccggacaggc cgcgtcgtgc acgcagcacc 25440 ttgcgtcggt gttggagatc tgcaccacat ttcggcccca ccggttcttc acgatcttgg 25500 ccttgctaga ctgctccttc agcgcgcgct gcccgttttc gctcgtcaca tccatttcaa 25560 tcacgtgctc cttatttatc ataatgcttc cgtgtagaca cttaagctcg ccttcgatct 25620 cagcgcagcg gtgcagccac aacgcgcagc ccgtgggctc gtgatgcttg taggtcacct 25680 ctgcaaacga ctgcaggtac gcctgcagga atcgccccat catcgtcaca aaggtcttgt 25740 tgctggtgaa ggtcagctgc aacccgcggt gctcctcgtt cagccaggtc ttgcatacgg 25800 ccgccagagc ttccacttgg tcaggcagta gtttgaagtt cgcctttaga tcgttatcca 25860 cgtggtactt gtccatcagc gcgcgcgcag cctccatgcc cttctcccac gcagacacga 25920 tcggcacact cagcgggttc atcaccgtaa tttcactttc cgcttcgctg ggctcttcct 25980 cttcctcttg cgtccgcata ccacgcgcca ctgggtcgtc ttcattcagc cgccgcactg 26040 tgcgcttacc tcctttgcca tgcttgatta gcaccggtgg gttgctgaaa cccaccattt 26100 gtagcgccac atcttctctt tcttcctcgc tgtccacgat tacctctggt gatggcgggc 26160 gctcgggctt gggagaaggg cgcttctttt tcttcttggg cgcaatggcc aaatccgccg 26220 ccgaggtcga tggccgcggg ctgggtgtgc gcggcaccag cgcgtcttgt gatgagtctt 26280 cctcgtcctc ggactcgata cgccgcctca tccgcttttt tgggggcgcc cggggaggcg 26340 gcggcgacgg ggacggggac gacacgtcct ccatggttgg gggacgtcgc gccgcaccgc 26400 gtccgcgctc gggggtggtt tcgcgctgct cctcttcccg actggccatt tccttctcct 26460 ataggcagaa aaagatcatg gagtcagtcg agaagaagga cagcctaacc gccccctctg 26520 agttcgccac caccgcctcc accgatgccg ccaacgcgcc taccaccttc cccgtcgagg 26580 cacccccgct tgaggaggag gaagtgatta tcgagcagga cccaggtttt gtaagcgaag 26640 acgacgagga ccgctcagta ccaacagagg ataaaaagca agaccaggac aacgcagagg 26700 caaacgagga acaagtcggg cggggggacg aaaggcatgg cgactaccta gatgtgggag 26760 acgacgtgct gttgaagcat ctgcagcgcc agtgcgccat tatctgcgac gcgttgcaag 26820 agcgcagcga tgtgcccctc gccatagcgg atgtcagcct tgcctacgaa cgccacctat 26880 tctcaccgcg cgtacccccc aaacgccaag aaaacggcac atgcgagccc aacccgcgcc 26940 tcaacttcta ccccgtattt gccgtgccag aggtgcttgc cacctatcac atctttttcc 27000 aaaactgcaa gataccccta tcctgccgtg ccaaccgcag ccgagcggac aagcagctgg 27060 ccttgcggca gggcgctgtc atacctgata tcgcctcgct caacgaagtg ccaaaaatct 27120 ttgagggtct tggacgcgac gagaagcgcg cggcaaacgc tctgcaacag gaaaacagcg 27180 aaaatgaaag tcactctgga gtgttggtgg aactcgaggg tgacaacgcg cgcctagccg 27240 tactaaaacg cagcatcgag gtcacccact ttgcctaccc ggcacttaac ctacccccca 27300 aggtcatgag cacagtcatg agtgagctga tcgtgcgccg tgcgcagccc ctggagaggg 27360 atgcaaattt gcaagaacaa acagaggagg gcctacccgc agttggcgac gagcagctag 27420 cgcgctggct tcaaacgcgc gagcctgccg acttggagga gcgacgcaaa ctaatgatgg 27480 ccgcagtgct cgttaccgtg gagcttgagt gcatgcagcg gttctttgct gacccggaga 27540 tgcagcgcaa gctagaggaa acattgcact acacctttcg acagggctac gtacgccagg 27600 cctgcaagat ctccaacgtg gagctctgca acctggtctc ctaccttgga attttgcacg 27660 aaaaccgcct tgggcaaaac gtgcttcatt ccacgctcaa gggcgaggcg cgccgcgact 27720 acgtccgcga ctgcgtttac ttatttctat gctacacctg gcagacggcc atgggcgttt 27780 ggcagcagtg cttggaggag tgcaacctca aggagctgca gaaactgcta aagcaaaact 27840 tgaaggacct atggacggcc ttcaacgagc gctccgtggc cgcgcacctg gcggacatca 27900 ttttccccga acgcctgctt aaaaccctgc aacagggtct gccagacttc accagtcaaa 27960 gcatgttgca gaactttagg aactttatcc tagagcgctc aggaatcttg cccgccacct 28020 gctgtgcact tcctagcgac tttgtgccca ttaagtaccg cgaatgccct ccgccgcttt 28080 ggggccactg ctaccttctg cagctagcca actaccttgc ctaccactct gacataatgg 28140 aagacgtgag cggtgacggt ctactggagt gtcactgtcg ctgcaaccta tgcaccccgc 28200 accgctccct ggtttgcaat tcgcagctgc ttaacgaaag tcaaattatc ggtacctttg 28260 agctgcaggg tccctcgcct gacgaaaagt ccgcggctcc ggggttgaaa ctcactccgg 28320 ggctgtggac gtcggcttac cttcgcaaat ttgtacctga ggactaccac gcccacgaga 28380 ttaggttcta cgaagaccaa tcccgcccgc ctaatgcgga gcttaccgcc tgcgtcatta 28440 cccagggcca cattcttggc caattgcaag ccatcaacaa agcccgccaa gagtttctgc 28500 tacgaaaggg acggggggtt tacttggacc cccagtccgg cgaggagctc aacccaatcc 28560 ccccgccgcc gcagccctat cagcagcagc cgcgggccct tgcttcccag gatggcaccc 28620 aaaaagaagc tgcagctgcc gccgccaccc acggacgagg aggaatactg ggacagtcag 28680 gcagaggagg ttttggacga ggaggaggag gacatgatgg aagactggga gagcctagac 28740 gaggaagctt ccgaggtcga agaggtgtca gacgaaacac cgtcaccctc ggtcgcattc 28800 ccctcgccgg cgccccagaa atcggcaacc ggttccagca tggctacaac ctccgctcct 28860 caggcgccgc cggcactgcc cgttcgccga cccaaccgta gatgggacac cactggaacc 28920 agggccggta agtccaagca gccgccgccg ttagcccaag agcaacaaca gcgccaaggc 28980 taccgctcat ggcgcgggca caagaacgcc atagttgctt gcttgcaaga ctgtgggggc 29040 aacatctcct tcgcccgccg ctttcttctc taccatcacg gcgtggcctt cccccgtaac 29100 atcctgcatt actaccgtca tctctacagc ccatactgca ccggcggcag cggcagcaac 29160 agcagcggcc acacagaagc aaaggcgacc ggatagcaag actctgacaa agcccaagaa 29220 atccacagcg gcggcagcag caggaggagg agcgctgcgt ctggcgccca acgaacccgt 29280 atcgacccgc gagcttagaa acaggatttt tcccactctg tatgctatat ttcaacagag 29340 caggggccaa gaacaagagc tgaaaataaa aaacaggtct ctgcgatccc tcacccgcag 29400 ctgcctgtat cacaaaagcg aagatcagct tcggcgcacg ctggaagacg cggaggctct 29460 cttcagtaaa tactgcgcgc tgactcttaa ggactagttt cgcgcccttt ctcaaattta 29520 agcgcgaaaa ctacgtcatc tccagcggcc acacccggcg ccagcacctg ttgtcagcgc 29580 cattatgagc aaggaaattc ccacgcccta catgtggagt taccagccac aaatgggact 29640 tgcggctgga gctgcccaag actactcaac ccgaataaac tacatgagcg cgggacccca 29700 catgatatcc cgggtcaacg gaatacgcgc ccaccgaaac cgaattctcc tggaacaggc 29760 ggctattacc accacacctc gtaataacct taatccccgt agttggcccg ctgccctggt 29820 gtaccaggaa agtcccgctc ccaccactgt ggtacttccc agagacgccc aggccgaagt 29880 tcagatgact aactcagggg cgcagcttgc gggcggcttt cgtcacaggg tgcggtcgcc 29940 cgggcagggt ataactcacc tgacaatcag agggcgaggt attcagctca acgacgagtc 30000 ggtgagctcc tcgcttggtc tccgtccgga cgggacattt cagatcggcg gcgccggccg 30060 ctcttcattc acgcctcgtc aggcaatcct aactctgcag acctcgtcct ctgagccgcg 30120 ctctggaggc attggaactc tgcaatttat tgaggagttt gtgccatcgg tctactttaa 30180 ccccttctcg ggacctcccg gccactatcc ggatcaattt attcctaact ttgacgcggt 30240 aaaggactcg gcggacggct acgactgaat gttaagtgga gaggcagagc aactgcgcct 30300 gaaacacctg gtccactgtc gccgccacaa gtgctttgcc cgcgactccg gtgagttttg 30360 ctactttgaa ttgcccgagg atcatatcga gggcccggcg cacggcgtcc ggcttaccgc 30420 ccagggagag cttgcccgta gcctgattcg ggagtttacc cagcgccccc tgctagttga 30480 gcgggacagg ggaccctgtg ttctcactgt gatttgcaac tgtcctaacc ctggattaca 30540 tcaagatcct ctagttaatg tcaggtcgcc taagtcgatt aactagagta cccggggatc 30600 ttattccctt taactaataa aaaaaaataa taaagcatca cttacttaaa atcagttagc 30660 aaatttctgt ccagtttatt cagcagcacc tccttgccct cctcccagct ctggtattgc 30720 agcttcctcc tggctgcaaa ctttctccac aatctaaatg gaatgtcagt ttcctcctgt 30780 tcctgtccat ccgcacccac tatcttcatg ttgttgcaga tgaagcgcgc aagaccgtct 30840 gaagatacct tcaaccccgt gtatccatat gacacggaaa ccggtcctcc aactgtgcct 30900 tttcttactc ctccctttgt atcccccaat gggtttcaag agagtccccc tggggtactc 30960 tctttgcgcc tatccgaacc tctagttacc tccaatggca tgcttgcgct caaaatgggc 31020 aacggcctct ctctggacga ggccggcaac cttacctccc aaaatgtaac cactgtgagc 31080 ccacctctca aaaaaaccaa gtcaaacata aacctggaaa tatctgcacc cctcacagtt 31140 acctcagaag ccctaactgt ggctgccgcc gcacctctaa tggtcgcggg caacacactc 31200 accatgcaat cacaggcccc gctaaccgtg cacgactcca aacttagcat tgccacccaa 31260 ggacccctca cagtgtcaga aggaaagcta gccctgcaaa catcaggccc cctcaccacc 31320 accgatagca gtacccttac tatcactgcc tcaccccctc taactactgc cactggtagc 31380 ttgggcattg acttgaaaga gcccatttat acacaaaatg gaaaactagg actaaagtac 31440 ggggctcctt tgcatgtaac agacgaccta aacactttga ccgtagcaac tggtccaggt 31500 gtgactatta ataatacttc cttgcaaact aaagttactg gagccttggg ttttgattca 31560 caaggcaata tgcaacttaa tgtagcagga ggactaagga ttgattctca aaacagacgc 31620 cttatacttg atgttagtta tccgtttgat gctcaaaacc aactaaatct aagactagga 31680 cagggccctc tttttataaa ctcagcccac aacttggata ttaactacaa caaaggcctt 31740 tacttgttta cagcttcaaa caattccaaa aagcttgagg ttaacctaag cactgccaag 31800 gggttgatgt ttgacgctac agccatagcc attaatgcag gagatgggct tgaatttggt 31860 tcacctaatg caccaaacac aaatcccctc aaaacaaaaa ttggccatgg cctagaattt 31920 gattcaaaca aggctatggt tcctaaacta ggaactggcc ttagttttga cagcacaggt 31980 gccattacag taggaaacaa aaataatgat aagctaactt tgtggaccac accagctcca 32040 tctcctaact gtagactaaa tgcagagaaa gatgctaaac tcactttggt cttaacaaaa 32100 tgtggcagtc aaatacttgc tacagtttca gttttggctg ttaaaggcag tttggctcca 32160 atatctggaa cagttcaaag tgctcatctt attataagat ttgacgaaaa tggagtgcta 32220 ctaaacaatt ccttcctgga cccagaatat tggaacttta gaaatggaga tcttactgaa 32280 ggcacagcct atacaaacgc tgttggattt atgcctaacc tatcagctta tccaaaatct 32340 cacggtaaaa ctgccaaaag taacattgtc agtcaagttt acttaaacgg agacaaaact 32400 aaacctgtaa cactaaccat tacactaaac ggtacacagg aaacaggaga cacaactcca 32460 agtgcatact ctatgtcatt ttcatgggac tggtctggcc acaactacat taatgaaata 32520 tttgccacat cctcttacac tttttcatac attgcccaag aataaagaat cgtttgtgtt 32580 atgtttcaac gtgtttattt ttcaattgca gaaaatttca agtcattttt cattcagtag 32640 tatagcccca ccaccacata gcttatacag atcaccgtac cttaatcaaa ctcacagaac 32700 cctagtattc aacctgccac ctccctccca acacacagag tacacagtcc tttctccccg 32760 gctggcctta aaaagcatca tatcatgggt aacagacata ttcttaggtg ttatattcca 32820 cacggtttcc tgtcgagcca aacgctcatc agtgatatta ataaactccc cgggcagctc 32880 acttaagttc atgtcgctgt ccagctgctg agccacaggc tgctgtccaa cttgcggttg 32940 cttaacgggc ggcgaaggag aagtccacgc ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat 33000 caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt 33060 cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat 33120 aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg caccctgatc tcacttaaat cagcacagta 33180 actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa 33240 gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa 33300 gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt 33360 caccacctcc cggtaccata taaacctctg attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct 33420 aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc tatacactgc agggaaccgg gactggaaca 33480 atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat 33540 gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt 33600 tagaaccata tcccagggaa caacccattc ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg 33660 aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg 33720 atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact 33780 gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac 33840 gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc 33900 gtctccggtc tcgccgctta gatcgctctg tgtagtagtt gtagtatatc cactctctca 33960 aagcatccag gcgccccctg gcttcgggtt ctatgtaaac tccttcatgc gccgctgccc 34020 tgataacatc caccaccgca gaataagcca cacccagcca acctacacat tcgttctgcg 34080 agtcacacac gggaggagcg ggaagagctg gaagaaccat gttttttttt ttattccaaa 34140 agattatcca aaacctcaaa atgaagatct attaagtgaa cgcgctcccc tccggtggcg 34200 tggtcaaact ctacagccaa agaacagata atggcatttg taagatgttg cacaatggct 34260 tccaaaaggc aaacggccct cacgtccaag tggacgtaaa ggctaaaccc ttcagggtga 34320 atctcctcta taaacattcc agcaccttca accatgccca aataattctc atctcgccac 34380 cttctcaata tatctctaag caaatcccga atattaagtc cggccattgt aaaaatctgc 34440 tccagagcgc cctccacctt cagcctcaag cagcgaatca tgattgcaaa aattcaggtt 34500 cctcacagac ctgtataaga ttcaaaagcg gaacattaac aaaaataccg cgatcccgta 34560 ggtcccttcg cagggccagc tgaacataat cgtgcaggtc tgcacggacc agcgcggcca 34620 cttccccgcc aggaaccatg acaaaagaac ccacactgat tatgacacgc atactcggag 34680 ctatgctaac cagcgtagcc ccgatgtaag cttgttgcat gggcggcgat ataaaatgca 34740 aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat 34800 gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc 34860 tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta 34920 aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac 34980 ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag 35040 ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcac 35100 atcggtcagt gctaaaaagc gaccgaaata gcccggggga atacataccc gcaggcgtag 35160 agacaacatt acagccccca taggaggtat aacaaaatta ataggagaga aaaacacata 35220 aacacctgaa aaaccctcct gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca gaacaacata 35280 cagcgcttcc acagcggcag ccataacagt cagccttacc agtaaaaaag aaaacctatt 35340 aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa aagggccaag 35400 tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaaaca 35460 cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc 35520 tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgtta cgtcacttcc cattttaaga aaactacaat 35580 tcccaacaca tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg ttcccacgcc 35640 ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaataagg 35700 tatatt 35706 <210> 10 <211> 1116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln 690 695 700 Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser 705 710 715 720 Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln 725 730 735 Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala 740 745 750 Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly 755 760 765 Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr 770 775 780 Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp 785 790 795 800 Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala 805 810 815 Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr 820 825 830 Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro 835 840 845 Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu 850 855 860 Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser 865 870 875 880 Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro 885 890 895 Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly 900 905 910 Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu 915 920 925 Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr 930 935 940 Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr 945 950 955 960 Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro 965 970 975 Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly 980 985 990 Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala 995 1000 1005 Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro 1010 1015 1020 Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp 1025 1030 1035 Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His 1040 1045 1050 Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp 1055 1060 1065 Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln 1070 1075 1080 Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp 1085 1090 1095 Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser 1100 1105 1110 Thr Gln Ala 1115 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 gaaacgatat gggctgaata cttaagtatt cagcccatat cgtttc 46 <210> 12 <211> 1190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcg cccttagata 60 tcgtcgacgc ccagcacccc aaggcggcca acgccaaaac tctccctcct cctcttcctc 120 aatctcgctc tcgctctttt tttttttcgc aaaaggaggg gagagggggt aaaaaaatgc 180 tgcactgtgc ggcgaagccg gtgagtgagc ggcgcggggc caatcagcgt gcgccgttcc 240 gaaagttgcc ttttatggct cgagcggccg cggcggcgcc ctataaaacc cagcggcgcg 300 acgcgccacc accgccgaga catcgatgat atctaaaggg cgaattcctg cagcccgggg 360 gatccactag tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctgcagaatt 420 cgcccttcag ctgcggatcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 480 ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 540 aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 600 gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat 660 cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc actagtttct agaaataaaa 720 tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tggcggccgc caccgcggtg 780 gagctatcga attcaagctt gtcgactcga agatcctaga ctagtggatc ccccgggctg 840 caggaattcg ccctttagat atcatcgatg tctcggcggt ggtggcgcgt cgcgccgctg 900 ggttttatag ggcgccgccg cggccgctcg agccataaaa ggcaactttc ggaacggcgc 960 acgctgattg gccccgcgcc gctcactcac cggcttcgcc gcacagtgca gcattttttt 1020 accccctctc ccctcctttt gcgaaaaaaa aaaagagcga gagcgagatt gaggaagagg 1080 aggagggaga gttttggcgt tggccgcctt ggggtgctgg gcgtcgacga tatctaaggg 1140 cgaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgacctcgag ggggggcccg 1190 <210> 13 <211> 1757 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcg cccttagata 60 tcgtcgacgc ccagcacccc aaggcggcca acgccaaaac tctccctcct cctcttcctc 120 aatctcgctc tcgctctttt tttttttcgc aaaaggaggg gagagggggt aaaaaaatgc 180 tgcactgtgc ggcgaagccg gtgagtgagc ggcgcggggc caatcagcgt gcgccgttcc 240 gaaagttgcc ttttatggct cgagcggccg cggcggcgcc ctataaaacc cagcggcgcg 300 acgcgccacc accgccgaga catcgatgat atctaaaggg cgaattcctg cagcccgggg 360 gatccactag tctagatgca tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctgcagaatt 420 cgcccttcag ctgcggatcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 480 ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 540 aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 600 gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat 660 cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc actagtttct agaaataaaa 720 tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tggcggccgc caccgcggtg 780 gagctatcga attcaagctt gtcgactcga agatcgtaca caggaagtga caattttcgc 840 gcggttttag gcggatgttg tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt 900 cgcgggaaaa ctgaataaga ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg 960 taatactggt accgggcccc ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt 1020 cgcccttaga tatcgtcgac gcccagcacc ccaaggcggc caacgccaaa actctccctc 1080 ctcctcttcc tcaatctcgc tctcgctctt tttttttttc gcaaaaggag gggagagggg 1140 gtaaaaaaat gctgcactgt gcggcgaagc cggtgagtga gcggcgcggg gccaatcagc 1200 gtgcgccgtt ccgaaagttg ccttttatgg ctcgagcggc cgcggcggcg ccctataaaa 1260 cccagcggcg cgacgcgcca ccaccgccga gacatcgatg atatctaaag ggcgaattcc 1320 tgcagcccgg gggatccact agtctagaac tagtggatcc cccgggctgc aggaattcga 1380 tatcaagctt atcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtacccaat tcgccctata 1440 gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 1500 gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 1560 aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggatcc 1620 gcagctgaag ggcgaattct gcagatatcc atcacactgg cggccgctcg agcatgcatc 1680 tagaaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtggcggccg 1740 ccaccgcggt ggagcta 1757 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 gatggtgctt caagctagta cttaagtact agcttgaagc accatc 46 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gatggtgctt caagctagta cggatccgta ctagcttgaa gcaccatc 48 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 gaaacgatat gggctgaata cggatccgta ttcagcccat atcgtttc 48 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 cctaataatt atcaaaatgt ggatccacat tttgataatt attagg 46 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 cctaataatt atcaaaatgt aattacattt tgataattat tagg 44 <210> 19 <211> 1270 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 19 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro 65 70 75 80 Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser 85 90 95 Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val 115 120 125 Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys 130 135 140 Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala 145 150 155 160 Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu 165 170 175 Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys 180 185 190 Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn 195 200 205 Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val 210 215 220 Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala 225 230 235 240 Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe 260 265 270 Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys 275 280 285 Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr 290 295 300 Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr 305 310 315 320 Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly 325 330 335 Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg 340 345 350 Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser 355 360 365 Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 370 375 380 Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg 385 390 395 400 Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala 405 410 415 Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala 420 425 430 Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr 435 440 445 Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp 450 455 460 Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val 465 470 475 480 Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro 485 490 495 Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe 500 505 510 Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr 515 520 525 Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr 530 535 540 Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln 545 550 555 560 Gln Phe Gly Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro 565 570 575 Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val 580 585 590 Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu 595 600 605 Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp 610 615 620 Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe 625 630 635 640 Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser 645 650 655 Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln 660 665 670 Thr Gln Thr Asn Ser His Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser 675 680 685 Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr 690 695 700 Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Ile Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr 705 710 715 720 Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr 725 730 735 Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln 740 745 750 Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala 755 760 765 Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln 770 775 780 Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser 785 790 795 800 Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu 805 810 815 Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys 820 825 830 Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys 835 840 845 Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp 850 855 860 Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr 865 870 875 880 Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala 885 890 895 Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val 900 905 910 Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile 915 920 925 Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys 930 935 940 Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val 945 950 955 960 Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp 965 970 975 Ile Leu Ala Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg 980 985 990 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln 995 1000 1005 Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 1010 1015 1020 Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp 1025 1030 1035 Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1040 1045 1050 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln 1055 1060 1065 Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys 1070 1075 1080 Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His 1085 1090 1095 Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr 1100 1105 1110 Thr His Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly 1115 1120 1125 Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp 1130 1135 1140 Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser 1145 1150 1155 Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val 1160 1165 1170 Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys 1175 1180 1185 Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr 1190 1195 1200 Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile 1205 1210 1215 Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys 1220 1225 1230 Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly 1235 1240 1245 Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys 1250 1255 1260 Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 20 <211> 1270 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 20 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe 260 265 270 Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys 275 280 285 Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr 290 295 300 Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr 305 310 315 320 Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly 325 330 335 Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg 340 345 350 Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser 355 360 365 Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 370 375 380 Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg 385 390 395 400 Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala 405 410 415 Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala 420 425 430 Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr 435 440 445 Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp 450 455 460 Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val 465 470 475 480 Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro 485 490 495 Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe 500 505 510 Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr 515 520 525 Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr 530 535 540 Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln 545 550 555 560 Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro 565 570 575 Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val 580 585 590 Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu 595 600 605 Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp 610 615 620 Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe 625 630 635 640 Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser 645 650 655 Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln 660 665 670 Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser 675 680 685 Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser Val Ala Tyr 690 695 700 Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr 705 710 715 720 Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr 725 730 735 Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln 740 745 750 Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala 755 760 765 Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln 770 775 780 Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser 785 790 795 800 Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu 805 810 815 Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys 820 825 830 Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys 835 840 845 Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp 850 855 860 Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr 865 870 875 880 Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala 885 890 895 Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val 900 905 910 Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile 915 920 925 Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys 930 935 940 Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val 945 950 955 960 Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp 965 970 975 Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg 980 985 990 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln 995 1000 1005 Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 1010 1015 1020 Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp 1025 1030 1035 Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1040 1045 1050 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln 1055 1060 1065 Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys 1070 1075 1080 Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His 1085 1090 1095 Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr 1100 1105 1110 Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly 1115 1120 1125 Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp 1130 1135 1140 Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser 1145 1150 1155 Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val 1160 1165 1170 Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys 1175 1180 1185 Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr 1190 1195 1200 Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile 1205 1210 1215 Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys 1220 1225 1230 Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly 1235 1240 1245 Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys 1250 1255 1260 Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 21 <211> 846 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 atggacgcca tgaaacgagg cctgtgctgc gtcctcctgc tgtgtggggc agtgttcgtt 60 agtcaccaga agcgaaccgc aatgtttcag gacccccagg aaaggccccg aaaattgccg 120 cagctgtgca ccgagctcca gacaaccatt catgacatca ttctggagtg tgtgtattgt 180 aagcagcagc tgttgaggag ggaggtgtat gacttcgctt ttcgggacgg ttgcattgtt 240 taccgggatg gaaaccctta cgccgtttgc gataaatgtc tgaagttcta tagcaaaatt 300 agtgaatata ggcattattg ctactcactg tacggaacca cactggaaca gcagtataac 360 aaacccctgt gcgaccttct gattaggtgc attaattgtc agaaaccgct gtgcccagag 420 gaaaagcagc gccatcttga caagaaacag agattccata acatccgggg cagatggact 480 ggacgctgca tgtcttgttg tcgctcctca aggacgagac gggccgcggc tgccaggaag 540 aaacgtagga tgcccggcga taccccgaca ctgcacgaat atatgctgga cctccaaccc 600 gagacgacag atctgtacgg ttacgagcaa ctgaacgact cctccgagga agaagacgaa 660 atcgacgggc ccgcaggtca ggcagcacct gaccgcgccc actacaatat tgtcaccttt 720 tgctgcaaat gtgactccac actccgacgt tgtgttcaat caacccacgt ggatattcga 780 actctggagg atcttctgat gggaaccctg ggtattgtat gccccatctg cagccaaaaa 840 ccatag 846 <210> 22 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro 20 25 30 Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr 35 40 45 Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu 50 55 60 Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Gly Cys Ile Val 65 70 75 80 Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe 85 90 95 Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile 115 120 125 Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg 130 135 140 His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr 145 150 155 160 Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Arg Lys Lys Arg Arg Met Pro Gly Asp Thr Pro Thr Leu His 180 185 190 Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr 195 200 205 Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro 210 215 220 Ala Gly Gln Ala Ala Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 225 230 235 240 Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Arg Cys Val Gln Ser Thr His 245 250 255 Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile 260 265 270 Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro 275 280 <210> 23 <211> 2166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 atggacgcca tgaaacgagg cctgtgctgc gtcctcctgc tgtgtggggc agtgttcgtt 60 agtcaccaga agcgaaccgc aatgtttcag gacccccagg aaaggccccg aaaattgccg 120 cagctgtgca ccgagctcca gacaaccatt catgacatca ttctggagtg tgtgtattgt 180 aagcagcagc tgttgaggag ggaggtgtat gacttcgctt ttcgggacgg ttgcattgtt 240 taccgggatg gaaaccctta cgccgtttgc gataaatgtc tgaagttcta tagcaaaatt 300 agtgaatata ggcattattg ctactcactg tacggaacca cactggaaca gcagtataac 360 aaacccctgt gcgaccttct gattaggtgc attaattgtc agaaaccgct gtgcccagag 420 gaaaagcagc gccatcttga caagaaacag agattccata acatccgggg cagatggact 480 ggacgctgca tgtcttgttg tcgctcctca aggacgagac gggccgcggc tgccaggaag 540 aaacgtagga tgcccggcga taccccgaca ctgcacgaat atatgctgga cctccaaccc 600 gagacgacag atctgtacgg ttacgagcaa ctgaacgact cctccgagga agaagacgaa 660 atcgacgggc ccgcaggtca ggcagcacct gaccgcgccc actacaatat tgtcaccttt 720 tgctgcaaat gtgactccac actccgacgt tgtgttcaat caacccacgt ggatattcga 780 actctggagg atcttctgat gggaaccctg ggtattgtat gccccatctg cagccaaaaa 840 ccaggctccg gcgagggcag gggaagtctt ctaacatgcg gggacgtgga ggaaaatccc 900 ggcccaatgt ccgataacgg cccccagaat cagagaaacg ctccccgcat cacgttcggc 960 ggaccaagtg acagcacagg cagtaaccag aacggagaac gctccggtgc tcgctccaag 1020 cagcgacggc cgcaagggct tcccaacaat accgccagct ggtttacggc tctgacccaa 1080 cacgggaaag aagatcttaa attccccagg ggccagggcg tccctatcaa tactaactcc 1140 agcccggatg atcagatagg ctactataga cgcgctaccc gacggatacg agggggggac 1200 ggcaaaatga aggacctttc cccccggtgg tatttctatt acttgggcac cggaccagaa 1260 gccggactgc cttacggcgc taacaaagac ggaataatct gggttgcgac ggagggcgcc 1320 ctgaatacac ctaaagacca tatcggcaca agaaatcctg ctaacaatgc cgcgattgtg 1380 ctccagctgc ctcagggaac cacgctgcct aaagggtttt acgctgaggg gtcaaggggg 1440 gggagtcaag cgtctagtag gtcatcctct cgctctcgca atagttcccg gaactcaacc 1500 ccaggcagca gcagaggaac ctctcccgca cggatggctg gcaatggggg agatgctgcc 1560 cttgctctcc ttctgctgga tcgccttaac cagctcgaat caaagatgtc tggaaaaggt 1620 cagcagcagc aaggccagac cgtgacaaag aagagtgcag ctgaagctag taaaaagcca 1680 cgccaaaaac ggaccgcaac taaggcatat aacgtaacac aggccttcgg cagaagaggt 1740 ccagaacaaa cacagggaaa ctttggcgat caagagctga ttagacaggg cacagattac 1800 aaacactggc cacagatcgc gcagtttgca ccaagcgcct ctgcattctt cgggatgagt 1860 cggattggga tggaagtcac tccatccggg acctggctta cctacacagg ggcaataaaa 1920 ctcgacgaca aagacccaaa ctttaaagat caggtcatcc tgctgaataa acacatcgat 1980 gcctacaaaa ctttcccccc aaccgaacca aagaaagaca agaaaaaaaa ggcagacgaa 2040 acgcaagcgc tccctcagcg ccagaagaag cagcagaccg ttacactgtt gccagcagca 2100 gatctggatg atttttccaa gcagcttcaa cagagtatgt caagcgctga cagcactcag 2160 gcttga 2166 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25

Claims (72)

  1. 키메라 아데노바이러스 발현 벡터(chimeric adenoviral expression vector)에 있어서, 발현 카세트(expression cassette)를 포함하며, 상기 발현 카세트는,
    항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 및
    SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고,
    상기 항원 폴리펩티드는 SARS-CoV2 단백질이 아닌 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드는 암 항원인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  5. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드는 병원체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 균류, 또는 기생 생물인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  7. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드는 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus)(HPV) 항원이며, 선택적으로 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 22를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 비시스트로닉(bicistronic) 또는 멀티시스트로닉(multicistronic) 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  10. 제8항에 있어서, 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site: IRES), 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skipping element), 또는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산 사이에 위치하는 푸린 난할 부위(furin cleavage site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 발현 카세트는 리보솜 스키핑 요소를 포함하며, 상기 리보솜 스키핑 요소는 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A 펩티드(F2A), 말 비염(equine rhinitis) A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스(cytoplasmic polyhedrosis virus) 2A 펩티드(BmCPV 2A), 그리고 B. 모리(mori)의 플라세리 바이러스(flacherie virus) 2A 펩티드(BmIFV 2A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 펩티드를 인코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 T2A 펩티드를 인코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 결합되고, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 제2 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 각기 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 CMV 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 베타-액틴(beta-actin) 프로모터이거나, 상기 제1 프로모터는 베타-액틴 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 톨-유사(Toll-like) 수용체-3(TLR-3)을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  21. 제20항에 있어서, 상기 TLR-3 작용제는 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 키메라 아데노바이러스 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 운반체를 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 대상 내의 항원 폴리펩티드를 향한 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 있어서, 포유동물 대상에 대해 면역원성으로 유효한 양의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 키메라 아데노바이러스 발현 벡터를 상기 대상에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 투여의 루트는 경구, 비강 내, 또는 점막인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 투여의 루트는 정제를 삼키는 것에 의한 경구 전달인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 대상의 폐포 세포, 흡수성 장세포, 섬모세포, 배상 세포, 곤봉체 세포들 및/또는 기도 기저 세포 내에 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 키메라 폴리뉴클레오티드에 있어서, 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는,
    상기 항원 폴리펩티드가 SARS-CoV-2 단백질이 아닌 조건에서 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 및
    SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  33. 제30항, 제31항, 또는 제32항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드는 암 항원인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  34. 제30항, 제31항, 또는 제32항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드는 병원체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 병원체는 바이러스, 박테리아, 균류, 또는 기생 생물인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  36. 제30항, 제31항, 또는 제32항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드는 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원이며, 선택적으로 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 22를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항원 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  39. 제37항에 있어서, 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 내부 리보솜 유입점(IRES), 리보솜 스키핑 요소, 또는 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산 사이에 위치하는 푸린 난할 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  41. 제40항에 있어서, 상기 발현 카세트는 리보솜 스키핑 요소를 포함하며, 상기 리보솜 스키핑 요소는 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스 2A 펩티드(BmCPV 2A), 그리고 B. 모리의 플라세리 바이러스 2A 펩티드(BmIFV 2A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스 폴리펩티드를 인코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  43. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 제1 프로모터에 작동 가능하게 결합되며, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 제2 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터 각기 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  45. 제43항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 CMV 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 베타-액틴 프로모터이거나, 상기 제1 프로모터는 베타-액틴 프로모터이고, 상기 제2 프로모터는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  46. 제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  47. 제46항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  48. 제30항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 폴리뉴클레오티드는 톨-유사 수용체-3(TLR-3)을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서, 상기 TLR-3 작용제는 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 폴리뉴클레오티드.
  51. 제30항 내지 제50항 중 어느 한 항의 키메라 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  52. 대상 내에 면역 반응을 유도하는 방법에 있어서, 상기 대상에 제51항의 발현 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 대상인 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제30항 내지 제50항 중 어느 한 항의 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 제52항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  56. 키메라 아데노바이러스 발현 벡터에 있어서, 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 발현 구조체를 포함하며, 상기 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉 발현 구조체는,
    SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산; 및
    SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  57. 제56항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  58. 제57항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 4의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  59. 제56항, 제57항, 또는 제58항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질은 SEQ ID NO: 1과 적어도 90%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  60. 제59항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 3의 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비시스트로닉 구조체는 프로모터에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  63. 제61항에 있어서, 상기 SARS-CoV2-N 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산의 5' 위치에 있는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 내부 리보솜 유입점(IRES), 리보솜 스키핑 요소, 또는 상기 SARS-CoV-2 S 단백질을 인코딩하는 핵산 및 상기 SARS-CoV-2 N 단백질을 인코딩하는 핵산 사이에 위치하는 푸린 난할 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  65. 제64항에 있어서, 상기 발현 카세트는 리보솜 스키핑 요소를 포함하며, 상기 리보솜 스키핑 요소는 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다면체병 바이러스 2A 펩티드(BmCPV 2A), 그리고 B. 모리의 플라세리 바이러스 2A 펩티드(BmIFV 2A)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 펩티드를 인코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 T2A 펩티드를 인코딩하는 서열인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  67. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  69. 제68항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 아데노바이러스 발현 벡터는 톨-유사 수용체-3(TLR-3)을 인코딩하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 상기 TLR-3 작용제는 dsRNA를 인코딩하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
  72. 제71항에 있어서, 상기 TLR-3 작용제를 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 18로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 아데노바이러스 발현 벡터.
KR1020237029040A 2021-02-01 2022-01-31 키메라 아데노바이러스 벡터들 KR20240027571A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163144339P 2021-02-01 2021-02-01
US63/144,339 2021-02-01
PCT/US2021/035930 WO2021248017A2 (en) 2020-06-05 2021-06-04 Chimeric adenoviral vectors
USPCT/US2021/035930 2021-06-04
PCT/US2022/014599 WO2022165360A2 (en) 2021-02-01 2022-01-31 Chimeric adenoviral vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240027571A true KR20240027571A (ko) 2024-03-04

Family

ID=82653898

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237029040A KR20240027571A (ko) 2021-02-01 2022-01-31 키메라 아데노바이러스 벡터들

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240093234A1 (ko)
EP (1) EP4284814A2 (ko)
JP (1) JP2024505249A (ko)
KR (1) KR20240027571A (ko)
AU (1) AU2022212276A1 (ko)
CA (1) CA3210242A1 (ko)
WO (1) WO2022165360A2 (ko)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023528446A (ja) * 2020-06-05 2023-07-04 バクサート インコーポレイテッド キメラアデノウイルスベクター
US11130787B2 (en) * 2020-06-11 2021-09-28 MBF Therapeutics, Inc. Alphaherpesvirus glycoprotein d-encoding nucleic acid constructs and methods

Also Published As

Publication number Publication date
CA3210242A1 (en) 2022-08-04
WO2022165360A3 (en) 2022-09-01
JP2024505249A (ja) 2024-02-05
WO2022165360A2 (en) 2022-08-04
EP4284814A2 (en) 2023-12-06
AU2022212276A1 (en) 2023-08-17
US20240093234A1 (en) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2189185T5 (es) Reactivos para vacunacion que generan una respuesta inmunitaria de los linfocitos t cd8.
KR101971808B1 (ko) 인간 면역 결핍 바이러스 감염에 대한 방어 면역을 유도하기 위한 방법 및 조성물
KR101253363B1 (ko) 개선된 아데노바이러스 벡터 및 그것의 용도
US8728485B2 (en) Peptide library obtained from multi-clade chimeric immunogens derived from highly conserved regions of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) consensus proteome
EA021391B1 (ru) Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор
KR20150118131A (ko) 안정화된 사람 면역결핍 바이러스 (ｈｉｖ) 외피 (ｅｎｖ) 삼량체 백신 및 이의 사용 방법
KR20220016137A (ko) 변형된 아데노바이러스
JP7269285B2 (ja) Ｒｓｖおよびノロウイルス抗原の小腸送達のための製剤
KR20220041844A (ko) Hiv 항원 및 mhc 복합체
Billaut-Mulot et al. Interleukin-18 modulates immune responses induced by HIV-1 Nef DNA prime/protein boost vaccine
KR20220115554A (ko) 액체 형태의 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 제제(변이체)
KR20230046313A (ko) 다중에피토프 백신 카세트
CN117083289A (zh) 嵌合腺病毒载体
DK2477652T3 (en) Immunization strategy for the prevention of infection H1Ni
KR20230006825A (ko) 전염성 질병 항원 및 백신
WO2019018724A1 (en) METHODS FOR SAFE INDUCTION OF MULTICLADED CROSS-IMMUNITY AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN HUMAN BEINGS
Wang et al. Cellular immune responses to helper-free HSV-1 amplicon particles encoding HIV-1 gp120 are enhanced by DNA priming
KR20240027571A (ko) 키메라 아데노바이러스 벡터들
RU2743962C1 (ru) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме (варианты)
Promkhatkaew et al. Prime-boost vaccination using recombinant Mycobacterium bovis BCG and recombinant vaccinia virus Dis harboring HIV-1 CRF01-AE gag in mice: Influence of immunization routes
EP1687022A2 (en) Renta: an hiv immunogen and uses thereof
NZ730841B2 (en) Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection
NZ767061B2 (en) Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection
NZ767061A (en) Methods and compositions for inducing protective immunity against human immunodeficiency virus infection