ES2189185T5 - Reactivos para vacunacion que generan una respuesta inmunitaria de los linfocitos t cd8. - Google Patents

Reactivos para vacunacion que generan una respuesta inmunitaria de los linfocitos t cd8. Download PDF

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Abstract

Se describen nuevos procedimientos y reactivos para vacunación que generan una respuesta inmune de células T CD8 contra la malaria y otros antígenos tales como antígenos virales y tumorales. Se describen nuevos regímenes de vacunación que emplean una composición de cebado y una composición de refuerzo, comprendiendo la composición de refuerzo un vector del virus de la viruela que no se replica o con la replicación defectuosa que lleva al menos un epítopo de células T CD8 que también está presente en la composición de cebado.

Description

Reactivos para vacunación que generan una respuesta inmunitaria de los linfocitos T CD8.
La presente invención se refiere a la generación de una respuesta inmunitaria protectora del linfocito T CD8+ contra antígenos diana utilizando diferentes composiciones de sensibilización y de refuerzo como fuentes de epítopos de linfocitos T CD8+.
Introducción
Un problema general en vacunología ha sido la incapacidad para generar grandes cantidades de linfocitos T CD8 por inmunización. Esto ha impedido el desarrollo de vacunas contra varias enfermedades incluyendo el paludismo.
El paludismo por Plasmodium falciparum ocasiona centenares de millones de infecciones de paludismo cada año y es responsable de 1 a 2 millones de muertes anualmente. El desarrollo de una vacuna eficaz contra el paludismo es por lo tanto una prioridad principal para la salud pública global. Un conjunto considerable de investigación inmunológica durante los últimos veinte años ha conducido a la identificación tanto de candidatos de antígenos de vacunas procedentes del parásito como de mecanismos inmunológicos en el huésped que existen probablemente para proteger contra la infección y la enfermedad. Sin embargo, a pesar de este avance todavía no existen medios de vacunación contra la infección por paludismo que se hayan mostrado eficaces en las pruebas de campo.
Un problema principal ha sido la identificación de un medio de producir una respuesta inmunitaria en los individuos vacunados para proteger contra la infección y la enfermedad. Por tanto, aunque se sabe que muchos antígenos del paludismo pueden ser útiles en la vacunación contra el paludismo, el problema ha sido cómo liberar tales antígenos o sus fragmentos conocidos como epítopos, que son reconocidos por las células del sistema inmunitario, de manera que producen una respuesta inmunitaria suficientemente fuerte de un determinado tipo.
Se ha sabido desde hace muchos años que es posible proteger individuos inmunizándoles con dosis muy grandes de esporozoítos de paludismo irradiados transmitidas por picaduras de mosquitos infectados. Aunque éste es un procedimiento completamente inusual de vacunación en masa ha proporcionado un modelo para analizar las respuestas inmunitarias que pueden estar mediando en la inmunidad protectora contra la infección por esporozoítos (Nardin y Nussenzweig 1993).
Una cantidad considerable de investigaciones realizadas durante la última década o con anterioridad, ha indicado que una principal respuesta inmunitaria protectora contra la etapa pre-eritrocítica inicial de P. falciparum está mediada por linfocitos T de tipo CD8+ve (linfocitos T CD8+). Tales células se ha demostrado que median en la protección directamente en modelos de ratón de infección por paludismo (Nardin y Nussenzweig 1993). Tales linfocitos T se han identificado en individuos expuestos en la naturaleza al paludismo y en voluntarios inmunizados con esporozoítos irradiados (Hill et al. 1991; Aidoo et al. 1995; Wizel et al. 1995). Existe mucha evidencia indirecta de que tales linfocitos T CD8+ son protectores contra la infección y la enfermedad del paludismo en seres humanos (Lalvani et al. 1994).
Los linfocitos T CD8+ pueden funcionar de más de una manera. La función mejor conocida es la destrucción o la lisis de células diana que llevan antígeno de péptido en el contexto de una molécula MHC de clase I. Por tanto estas células se denominan con frecuencia linfocitos T citotóxicos (CTL). Sin embargo, otra función, quizás de mayor relevancia protectora en las infecciones de paludismo es la capacidad de los linfocitos T CD8+ para segregar interferón gamma (IFN-\gamma). Por consiguiente los análisis de la actividad lítica y de liberación de IFN-\gamma son ambos útiles en la medición de una respuesta inmunitaria del linfocito T CD8+. En el paludismo estos linfocitos CD8+ve pueden proteger destruyendo el parásito en la etapa inicial intrahepática de la infección del paludismo antes de que se produzcan algunos síntomas de la enfermedad (Seguin et al. 1994).
El agente del paludismo mortal humana, P. falciparum infecta un número limitado de especies de huésped: seres humanos, chimpancés y algunas especies de monos del nuevo mundo. El mejor modelo no humano de paludismo es el chimpance debido a que esta especie está intimamente relacionada con los seres humanos y la infección en la etapa del hígado se observa consecuentemente a diferencia de en los huéspedes del mono (Thomas et al. 1994). Debido al coste y a la disponibilidad limitada de chimpancés la mayoría de los estudios de paludismo en laboratorio se llevan a cabo en ratones, utilizando las especies de paludismo de roedor P. berghei o P. yoelii. Estos últimos dos modelos están bien estudiados y se ha demostrado en ambos que los linfocitos CD8+ve representan un papel clave en la inmunidad protectora contra la exposición a esporozoítos.
Los estudios anteriores han evaluado una gran variedad de medios para inducir respuestas de linfocitos T CD8+ contra el paludismo. Varios de éstos han mostrado algún nivel de respuesta de los linfocitos T CD8+ y protección parcial contra la infección de paludismo en los modelos de roedor (p. ej.: Li et al. 1993; Sedegah et al. 1994; Lanar et al. 1996). Sin embargo, no se ha demostrado anteriormente ningún medio eficaz de inmunizar con vacunas de subunidad mediante la producción de niveles suficientemente elevados de linfocitos T CD8+ para proteger eficazmente contra la infección por esporozoíto del paludismo.
\newpage
En los últimos años se han buscado respuestas inmunitarias mejoradas generadas para vacunas potenciales varíando los vectores utilizados para administrar el antígeno. Existe evidencia de que en algunos casos las respuestas del anticuerpo se mejoran utilizando dos vectores diferentes administrados secuencialmente como sensibilización y repuesto. Una variedad de combinaciones de sensibilización y repuesto se han probado en diferentes regímenes potenciales de vacuna.
Leong et al. (Vaccines 1995, 327-331) describen la inmunización del ratón en primer lugar en ADN expresando el antígeno de hemaglutinina de la gripe (HA) y a continuación con un vector recombinante de viruela aviar que expresa HA. Se ha obtenido un aumento de la respuesta del anticuerpo después del refuerzo.
Richmond et al. (Virology 1997, 230: 265-274) describen los intentos para aumentar los anticuerpos neutralizantes contra HIV-1 env utilizando sensibilización con ADN y refuerzo con virus de vacuna recombinante. Se observaron sólamente bajos niveles de respuestas de anticuerpo con este régimen de sensibilización-repuesto y los resultados se consideraron decepcionantes.
Fuller et al. (Vaccine 1997, 15: 924-926 e Immunol. Cell Biol. 1997, 75: 389-396) describen un aumento de las respuestas del anticuerpo en la inmunización por ADN de macacos, utilizando una inmunización por refuerzo con virus de replicación de vacuna recombinante. Sin embargo, esto no se traduce en un aumento de eficacia protectora ya que se observó una mayor reducción en la masa vírica y en la atenuación de la pérdida de linfocitos T CD4 en los animales con dosis de sensibilización y de refuerzo de ADN.
Hodge et al. (Vaccine 1997, 15: 759-768) describe la producción de respuestas del linfocito T linfoproliferante en un modelo de ratón para cáncer utilizando antígeno carcinoembriónico humano (CEA) expresado en un virus recombinante de viruela aviar (ALVAC). Los autores sensibilizaron una respuesta inmunitaria con CEA-virus de vacuna competente de replicación recombinante de las cepas Wyeth o WR y reforzaron la respuesta con CEA-ALVAC recombinante. Esto condujo a un aumento en la proliferación de los linfocitos T pero no dió como resultado un aumento en la eficacia protectora si se compara con tres inmunizaciones recombinantes de tipo natural (100% de protección), tres inmunizaciones con ALVAC-CEA recombinantes (70% de protección) o sensibilización con WR seguido de dos inmunizaciones ALVAC-CEA (63% de protección).
Por lo tanto algunos estudios de la combinación heteróloga sensibilización-refuerzo han hallado algún incremento de anticuerpos y respuestas linfoproliferantes pero ningún efecto significativo sobre la eficacia protectora en un modelo animal. Los linfocitos T CD8 no se midieron en estos estudios. El incremento limitado de respuesta de anticuerpo probablemente refleja simplemente el hecho de que los anticuerpos en el inmunógeno de sensibilización reducirán con frecuencia la inmunogenicidad de una segunda inmunización con el mismo inmunógeno, mientras que administrando un refuerzo con un vehículo diferente se superará en parte este problema. Este mecanismo no es de esperar que esté afectado significativamente por el orden de inmunización.
Li et al. (1993) proporcionaron la evidencia de que un régimen de inmunización heterólogo de sensibilización-refuerzo puede afectar las respuestas del linfocito T CD8. Ellos describieron la eficacia de la protección parcial inducida en ratones frente a la exposición a esporozoítos de paludismo administrando dos vectores víricos vivos, un virus de gripe replicante recombinante seguido de un virus de vacuna replicante recombinante que codifica un epítopo de paludismo. La inversión del orden de inmunización condujo a la pérdida de toda la eficacia protectora y los autores sugirieron que ésta puede estar relacionada con la infección de las células del hígado por la vacuna, dando como resultado la localización de CTL en el hígado para proteger contra las etapas hepatocíticas de los parásitos del paludismo.
Rodrigues et al. (J. Immunol. 1994, 4636-4648) describen ratones de inmunización con dosis repetidas de un virus de gripe recombinante que expresa un epítopo de linfocito B inmunodominante de la proteína del circumesporozoito (CS) malárico seguido de un refuerzo con virus de vacuna recombinante. La utilización de una cepa de vacuna de tipo natural y de una cepa de vacuna atenuada pero competente en replicación en el refuerzo proporcionó niveles muy similares de protección parcial. Sin embargo la cepa atenuada pero competente en replicación fue un poco menos inmunógena para la sensibilización de los linfocitos T CD8 que para la cepa de la vacuna de tipo natural.
Murata et al. (J. Immunol. 1996, 173: 96-107) expusieron el aumento de las respuestas de los linfocitos T CD8 después de la sensibilización con virus de gripe recombinante de replicación y del refuerzo con una cepa de replicación de virus de vacuna y sugirieron que la protección parcial observada en los dos estudios iniciales fue atribuible a este aumento de producción de linfocito T CD8.
Por lo tanto estos tres estudios proporcionan conjuntamente evidencia de que una inmunización por refuerzo con un virus de vacuna recombinante de replicación puede aumentar en algún grado la produción de los linfocitos T CD8 seguida de sensibilización con un virus de gripe recombinante de replicación. Sin embargo, existen dos limitaciones a estos descubrimientos desde el punto de vista de su utilidad potencial. En primer lugar, la inmunogenicidad inducida sólo fue suficiente para conseguir la protección parcial contra el paludismo y aún esto era dependiente de una inmunización por sensibilización inmunógena en gran medida con un virus de gripe recombinante de replicación poco común. En segundo lugar, debido a los potenciales efectos secundarios potenciales y documentados al utilizar estos virus de replicación como inmunógenos estos vectores recombinantes no son adecuados para utilización humana general como vacunas.
El virus Ankara de vacuna modificado (MVA) es una cepa de virus de vacuna que no se replica en la mayoría de tipos de células, incluyendo los tejidos humanos normales. MVA se obtuvo mediante pases en serie > 500 veces en fibriplastos de embrión de pollito (CEF) de material procedente de una lesión de viruela en un caballo en Ankara, Turquia (Mayr et al. 1975). Se demostró que la alteración en la replicación todavía era capaz de producir inmunidad protectora contra las infecciones del virus de la viruela veterinaria (Mayr 1976). Se utilizó MVA como una vacuna humana en las etapas finales de la campaña de erradicación de la viruela, que se administró por vía intracutánea, subcutánea e intramuscular a > 120.000 individuos en Alemania del sur. No se registraron efectos secundarios significativos, a pesar del destino deliberado de la vacunación a grupos de alto riesgo tales como aquellos con eczema (Mayr et al. 1978; Stickl et al. 1974; Mahnel et al. 1994). La seguridad de MVA refleja la falta de virulencia del virus en modelos animales, incluyendo ratones irradiados y la administración intracraneal siguiente a ratones neonatos. La no replicación de MVA se ha correlacionado con la producción de placas blancas proliferantes en las membranas corioalantoideas de pollito, con la infección abortiva de células no aviares y con la presencia de seis deleciones genómicas que totalizan aproximadamente 30 kb (Meyer et al. 1991). La falta de virulencia de MVA se ha atribuido en parte a deleciones que afectan a los genes K1L y C7L del segmento huésped, aunque la replicación vírica limitada tiene lugar todavía en células TK-143 humanas y en células CV-1 de mono verde africano (Altenburger et al. 1989). La reparación del gen K1L sólamente repara en parte el segmento del huésped MVA (Sutter et al. 1994). La limitación del segmento del huésped parece tener lugar durante la mutación de la partícula vírica, con sólo viriones inmaduros que se observan en las células HeLa humanas por microscopía electrónica (Sutter et al. 1992). El último bloque en la replicación vírica no evita la expresión eficaz de los genes recombinantes en MVA. El MVA recombinante que expresa la nucleoproteína de la gripe, la hemaglutinina de la gripe y las proteínas SIV han demostrado ser inmunógenos y proporcionar grados variables de protección en modelos animales, aunque esto nunca se ha atribuido a los linfocitos T CD8+ solos (Sutter et al. 1994, Hirsch et al. 1995; Hirsch et al. 1996). El MVA recombinante se considera un candidato prometedor de vacuna humana debido a estas propiedades de seguridad e inmunogenicidad (Moss et al. 1995). El MVA recombinante que contiene ADN que codifica antígenos extraños se describe en la patente US nº 5.185.146 (Altenburger).
Los poxvirus han desarrollado estrategias para la evasión de la respuesta inmunitaria del huésped que incluyen la producción de proteínas segregadas que funcionan como receptores solubles para el factor de necrosis tumoral, IL-1\beta, interferón (IFN)-\alpha/\beta e IFN-\gamma, que normalmente tienen secuencia similar a la del dominio extracelular de los receptores de citoquina celular (Symons et al. 1995; Alcami et al. 1995; Alcami et al. 1992). El receptor descrito más recientemente de esta naturaleza es un receptor de quimiocina (Graham et al. 1997). Estos receptores víricos inhiben o subvierten generalmente una respuesta inmunitaria apropiada del huésped y su presencia se relaciona con un aumento de patogenicidad. El receptor II-1\beta es una excepción: su presencia disminuye la respuesta febril del huésped y aumenta la supervivencia del huésped ante la infección (Alcami et al. 1996). Se ha descubierto que MVA carece de receptores funcionales de citoquina para el interferón \gamma, interferón \alpha\beta, el factor de necrosis tumoral y las quimiocinas CC, pero no posee el receptor IL-1\beta potencialmente beneficioso. MVA es la única cepa conocida de vacuna que posee este perfil receptor de citoquina, que teóricamente le hace más seguro y más inmunógeno que otros poxvirus. Otra cepa segura y con replicación alterada de vacuna conocida como NYVAC está descrita totalmente en Tartaglia et al. (Virology 1992, 188: 217-232).
Se ha reconocido hace tiempo que los virus vivos poseen algunas propiedades atractivas como vectores de vacuna recombinante incluyendo una gran capacidad para los antígenos extraños y bastante buena inmunogenicidad para las respuestas inmunitarias celulares (Ellis 1988 new technologies for making vaccines. En: Vaccines. Editores: Plotkin S A y Mortimer E A. W. B. Saunders, Filadelfia, página 568; Woodrow G. C. 1977. En: New Generation Vacciness 2ª edición. Editores: Levine M. M., Woodrow G. C., Kaper J. B., Cobon G., página 33). Esto ha conducido a intentos para atenuar la virulencia de tales vectores vivos de varias maneras que incluyen reducir su capacidad de replicación (Tartaglia J. et al. 1992 Virology 188: 217-232). Sin embargo tal reducción en la replicación reduce la cantidad de antígeno producido por el virus y de este modo sería de esperar que reduzca la inmunogenicidad de la vacuna. Realmente se ha demostrado anteriormente que la atenuación de las cepas de vacuna replicantes conduce a algunas reducciones sustanciales de las respuestas del anticuerpo (Lee M. S. et al., 1992 J. Virology 66: 2617-2630). De forma similar se observó en un estudio con conejos que el vector de la viruela aviar no replicante era menos inmunógeno para la producción de anticuerpos y menos protector que una cepa de vacuna natural no replicante (Taylor J. et al. 1991 Vaccine 9: 190-193).
Se han descrito los protocolos diversificados de sensibilización y de refuerzo utilizando virus de vacuna recombinante y virus de viruela aviar recombinante no replicante para aumentar la inmunidad de los linfocitos T y las respuestas antitumorales (Hodge J. et al. 1997 Vaccine 15 (617): 759-768.
Se ha dado a conocer que las cepas de poxvirus no replicantes y las de replicación alterada proporcionan vectores que dan un efecto de refuerzo sumamente bueno a una respuesta de CTL sensibilizada. De forma notable, este efecto es significativamente más fuerte que un efecto de refuerzo mediante poxvirus naturales. El efecto se observa con antígenos de paludismo y otros, tales como los antígenos víricos y tumorales, y es protector como se demuestra en experimentos de exposición en ratones y primates no humanos. Se ha observado protección completa en lugar de parcial de la exposición a esporozoítos con el nuevo régimen de inmunización.
Un objetivo de la presente invención consiste en identificar un medio eficaz de inmunización contra el paludismo. Es además un objetivo de la presente invención identificar medios de inmunización contra otras enfermedades en las que las respuestas de los linfocitos T CD8+ representan un papel protector. Tales enfermedades incluyen pero no se limitan a la infección y a la enfermedad producidas por los virus HIV, herpes común, herpes zoster, hepatitis C, hepatitis B, gripe, virus de Epstein-Barr, sarampión, dengue y HTLV-1; por la bacteria Mycobacterium tuberculosis y Listeria sp.; y por los parásitos protozoarios Toxoplasma y Trypanosona; y determinadas formas de cáncer, p. ej.: melanoma, cáncer de mama y cáncer de colon.
Se describe en la presente memoria un procedimiento nuevo de inmunización que generó concentraciones muy elevadas de linfocitos T CD8+ y se observó que era capaz de producir la protección completa sin precedentes contra la exposición al esporozoíto P. berghei. Se probó el mismo planteamiento en primates superiores y se observó que era muy inmunógeno también en esta especie, y se observó que produce protección parcial contra la exposición a P. falciparum. Se ha demostrado asimismo la producción de respuestas inmunitarias protectoras en dos modelos de ratón adicionales de infección vírica y de cáncer.
Se demuestra además que el nuevo régimen de inmunización que se describe en la presente memoria es también eficaz para generar respuestas fuertes de linfocitos T CD8+ contra epítopos de HIV. Una evidencia considerable indica que la generación de tales respuestas de los linfocitos T CD8+ se puede esperar que sea útil en la inmunización profiláctica o terapéutica contra esta infección y enfermedad vírica (Gallimore et al. 1995; Ada 1996). Se demuestra que se pueden generar repuestas fuertes de linfocitos T CD8+ contra epítopos procedentes tanto del HIV como del paludismo utilizando un epítopo que se ensarta con secuencias de estos microorganismos. El éxito en generar aumento de inmunogenicidad tanto contra HIV como contra los epítopos de paludismo y además contra liposomas epítopos de la gripe y del tumor, indican que este nuevo régimen de inmunización puede ser eficaz generalmente contra muchos patógenos infecciosos y también en enfermedades no infecciosas en las que la generación de una respuesta fuerte de los linfocitos T CD8+ puede ser válida.
Un descubrimiento inesperado es la grandísima eficacia de los agentes no replicantes tanto en la sensibilización como especialmente en el refuerzo de una respuesta de linfocitos T CD8+. En general, la inmunogenicidad de la producción de linfocitos T CD8+ mediante vectores víricos replicantes vivos se ha observado anteriormente que es mayor que para los agentes no replicantes o para los vectores afectados por la replicación. Esto es lo que sería de esperar de una mayor cantidad de antígeno producida por agentes que se pueden replicar en el huésped. En la presente memoria sin embargo se descubre que la mayor inmunogenicidad y eficacia protectora se observa sorprendentemente con vectores no replicantes. El último tiene una ventaja añadida para la vacunación en que son en general más seguros para utilizar en seres humanos que los vectores replicantes.
La presente invención proporciona la utilización de
(i)
una composición de sensibilización que comprende una fuente de uno o más epítopos de linfocitos T CD8+ del antígeno diana, en la que la fuente de los epítopos de linfocitos T CD8+ es un vector no vírico o un vector vírico de replicación alterada o no replicante, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
(ii)
una composición de refuerzo que comprende una fuente de uno o más epítopos de linfocitos T CD8+ del antígeno diana, que comprende por lo menos un epítopo de linfocitos T CD8+ que es el mismo que un epítopo de linfocitos T CD8+ de la composición de sensibilización, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ es un vector de poxvirus recombinante de replicación alterada o no replicante, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable;
para la producción de un kit de vacunación contra una enfermedad causada por un patógeno o contra el cáncer en la que las respuestas de los linfocitos T CD8+ desempeñan un rol protector, en la que el kit genera una respuesta inmune de los linfocitos T CD8+ protectora contra por lo menos un antígeno diana de dicho patógeno o cáncer;
con la condición de que si la fuente de epítopos en (i) es un vector vírico, el vector vírico en (ii) es obtenido a partir de un virus diferente al virus en (i).
En otro aspecto la invención proporciona un segmento de epítopo recombinante que comprende los epítopos de linfocitos T CD8+ de las secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 y 34, y que comprende además los epítopos de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 26, 28, 36, 38 y 40.
En otro aspecto la invención proporciona una partícula análoga al virus Ty recombinante que comprende el segmento de epítopo descrito anteriormente, para la inmunización de un animal contra el paludismo.
En otro aspecto la invención proporciona un plásmido de ADN recombinante o un poxvirus recombinante de replicación alterada o no replicante que codifica el segmento de epítopo como se ha descrito anteriormente, para la inmunización de un animal contra el paludismo.
En otro aspecto la invención proporciona un poxvirus de replicación alterada que codifica el antígeno TRAP de P. falciparum, para la inmunización de un animal contra el paludismo, en el que el virus es la cepa de vacuna que consiste en virus modificado Ankara (MVA).
En otro aspecto la invención proporciona un segmento de epítopo recombinante que comprende los epítopos de linfocitos T CD8+ de las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 42 a 64.
En otro aspecto la invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende un antígeno proteico de P. falciparum entero o sustancialmente entero y un segmento de dos o más epítopos de linfocitos T CD8+ de paludismo seleccionados de entre las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 y 34.
La invención resulta útil para la preoducción de un kit para generar una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8+ contra por lo menos un antígeno diana, administrando por lo menos una dosis del componente (i), seguido de por lo menos una dosis del componente (ii) del equipo según la invención.
Preferentemente, la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en (i) en el procedimiento según la invención es un vector no vírico o un vector vírico no replicante o con replicación alterada, aunque se pueden utilizar vectores víricos replicantes.
En una forma de realización preferida de la invención, la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de sensibilización es un ácido nucleico, que puede ser ADN ó ARN, en particular un plásmido de ADN recombinante. El ADN ó el ARN puede estar empaquetado, por ejemplo en un lisosoma o puede estar en forma libre.
En otra forma de realización preferida de la invención, la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de sensibilización es un péptido, polipéptido, proteína, poliproteína o una partícula que comprende dos o más epítopos de linfocitos T CD8+, presente en un segmento recombinante de epítopos de linfocito T CD8+ o en un antígeno diana. Las poliproteínas comprenden dos o más proteínas que pueden ser iguales o preferentemente diferentes, unidas conjuntamente. Especialmente preferida en esta forma de realización es una partícula proteínica recombinante tal como una partícula análoga al virus Ty (VLP) (Burns et al. Molec. Biotechnol. 1994, 1: 137-145).
Preferentemente, la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de refuerzo es un vector consistente en virus de vacuna tal como MVA ó NYVAC. El más preferido es el virus ankara modificado (MVA) por la cepa de vacuna o una cepa procedente de éste. Las alternativas a los vectores de vacuna incluyen los vectores avipox tales como los vectores de viruela aviar o de viruela del canario. Especialmente adecuado como vector avipox es una cepa de viruela del canario conocida como ALVAC (disponible en el comercio como Kanapox) y cepas procedentes de ésta.
Los genomas del poxvirus pueden llevar una gran cantidad de información genética heteróloga. Otros requisitos para los vectores víricos para utilización en las vacunas incluyen buena inmunogenicidad y seguridad. MVA es una cepa de vacuna con replicación alterada con un buen registro de seguridad. En la mayoría de los tipos celulares y de los tejidos humanos normales, MVA no se replica, se observa replicación limitada de MVA en unos pocos tipos de células transformadas tales como las células BHK21. Se ha demostrado actualmente, mediante los resultados descritos en la presente memoria, que el MVA recombinante y otras cepas no replicantes o con replicación alterada son sorprendente y significativamente mejores que los vectores convencionales de vacunas recombinantes para la generación de una respuesta protectora del linfocitos T CD8+, cuando se administran en una composición de refuerzo después de la sensibilización con un plásmido de ADN, de un Ty-VLP recombinante o de un adenovirus recombinante.
Será evidente que las cepas del virus de las vacunas procedentes de MVA, o las cepas desarrolladas independientemente que tienen las propiedades de MVA que hacen a MVA particularmente adecuado para utilizar en una vacuna, serán asimismo adecuadas para utilizar en la invención.
El MVA que contiene un segmento de epítopos insertado (MVA-HM, que se describe en los Ejemplos) se ha depositado en la Colección Europea de Cultivos Celulares animales, CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, R.U. bajo el registro nº V97060511 el 5 de junio de 1997.
El término "no replicante" o "con replicación alterada" tal como se utiliza en la presente memoria significa incapaz de replicación en cualquier extensión significativa en la mayoría de las células normales de mamífero o en las células normales humanas. Los virus que son no replicantes o con replicación alterada pueden haber llegado a ser de este modo de forma natural (es decir pueden ser aislados como tales de la naturaleza) o artificialmente p. ej.: mediante reproducción in vitro o mediante manipulación genética, por ejemplo deleción de un gen que es crítico para la replicación. Existirá generalmente uno o pocos tipos celulares en los que los virus se puedan desarrollar, tales como las células CEF para MVA.
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La replicación de un virus se mide generalmente de dos maneras:
1)
síntesis de ADN y
2)
valoración vírica. Más exactamente, el término "no replicante o con replicación alterada" tal como se utiliza en la presente memoria y tal como se aplica a los medios con poxvirus, virus que satisfacen alguno o ambos de los siguientes criterios:
1)
presenta una reducción 1 log (10 veces) en la síntesis del ADN comparado con la cepa Copenhagen del virus de la vacuna en células MRC-5 (línea celular humana);
2)
presenta una reducción 2 log en la valoración vírica en células HELA (línea celular humana) comparado con la cepa Copenhagen del virus de vacuna.
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Ejemplos de poxvirus que están incluidos en esta difinición son MVA, NYVAC y los virus avipox, mientras que un virus que está excluido de la definición es la cepa M7 de la vacuna atenuada.
Los vectores víricos alternativos preferidos para utilización en la composición de sensibilización según la invención comprenden una variedad de virus diferentes, genéticamente inhabilitados a fin de ser no replicantes o con replicación alterada. Tales virus incluyen por ejemplo adenovirus no replicantes tales como mutantes por deleción E1. La inhabilitación genética de los virus para producir vectores no replicantes o con replicación alterada ha sido extensamente descrita en la bibliografía (p. ej.: McLean et al. 1994).
Otros vectores víricos adecuados para utilización en la composición de sensibilización son los vectores basados en el virus del herpes y en el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) (Davies et al. 1996). Los vectores bacterianos adecuados para sensibilizar incluyen el BCG recombinante y Salmonella recombinante y Salmonella transformada con ADN de plásmido (Darji A. et al. 1997 Cell 91: 765-775).
Los vectores no víricos alternativos adecuados para utilizar en la composición de sensibilización incluyen péptidos terminados en lípido conocidos como lipopéptidos, péptidos unidos a proteínas portadoras tales como KLH o como proteínas de fusión o mediante enlace químico, antígenos completos con adyuvante y otros sistemas similares. Adyuvantes tales como QS21 ó SBAS2 (Stoute J. A. et al. 1997 N. Engl. J. Medicine 226: 86-91) se pueden utilizar como proteínas, péptidos o ácidos nucleicos para aumentar la producción de respuestas de linfocitos T. A veces se hace referencia a estos sistemas como "inmunógenos" en lugar de "vectores", pero en la presente memoria son vectores en el sentido que llevan los epítopos de linfocitos T CD8+ relevantes.
Los epítopos de los linfocitos T CD8+ bien presentes en, o codificados por las composiciones de sensibilización y de refuerzo, pueden estar provistas en una variedad de formas diferentes, tal como un segmento recombinante de uno, dos o más epítopos, o en el contexto del antígeno diana natural, o en una combinación de éstos. Los epítopos de linfocito T CD8+ se han identificado y se pueden encontrar en la bibliografía, para muchas enfermedades diferentes. Es posible diseñar segmentos de epítopos para generar la respuesta del linfocito T CD8+ contra cualquier antígeno seleccionado que contenga tales epítopos. Ventajosamente, los epítopos en un segmento con muchos epítopos están unidos conjuntamente sin intervinir secuencias de modo que se evita este innecesario material de ácido nucleico y/o aminoácido. Además de los epítopos de linfocitos T CD8+, puede ser preferible incluir uno o más epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores, para aumentar la respuesta inmunitaria generada por el segmento de epítopo. Son especialmente adecuados los epítopos de los linfocitos T cooperadores que son activos en individuos de diferentes tipos de HLA, por ejemplo los epítopos T cooperadores procedentes de tétanos (contra los que la mayoría de los individuos estarán ya sensibilizados). Una combinación útil de tres epítopos T cooperadores se emplea en los ejemplos descritos en la presente memoria. Puede ser también útil incluir epítopos de linfocitos B para estimular las respuestas de linfocitos B y la producción de anticuerpos.
Las composiciones de sensibilización y de refuerzo descritas pueden comprender ventajosamente un adyuvante. En particular, una composición de sensibilización que comprende un vector de plásmido con ADN puede comprender asimismo el factor estimulante de la colonia con macrófago granulocito (GM-CSF) o un plásmido que le codifica, al actuar como adyuvante; los efectos beneficiosos se aprecian utilizando GM-CSF en forma de polipéptido.
Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden emplear como vacunas terapéuticas o profilácticas. Si la inmunización profiláctica o terapéutica es la más apropiada generalmente dependerá de la naturaleza de la enfermedad. Por ejemplo, se prevé que el cáncer estará inmunizado terapéuticamente bastante antes de que se haya diagnosticado, mientras que las vacunas anti-paludismo se utilizarán preferentemente, aunque no necesariamente como profiláctico.
Las composiciones descritas en la presente memoria según la invención se pueden administrar mediante una variedad de vías diferentes. Determinadas vías pueden estar favorecidas para determinadas composiciones, tal como las que resultan de la generación de una respuesta más eficaz, o como las que son menos probables que produzcan efectos secundarios, o como las que son más fáciles de administrar. Se ha demostrado que la presente invención es eficaz en la administración mediante cañón de genes, bien sobre lechos dorados o como polvo.
Según otros aspectos adicionales, en la presente memoria se describe:
-
la utilización de un vector consistente en poxvirus recombinante no replicante o con replicación alterada para la producción de un medicamento para reforzar una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8+;
-
la utilización de un vector de MVA para la producción de un medicamento para reforzar una respuesta inmunitaria de linfocitos T CD8+;
-
un medicamento para reforzar una respuesta de linfocitos T CD8+ contra por lo menos un antígeno o epítopo diana, que comprende una fuente de uno o más epítopos de linfocitos T CD8+ del antígeno diana, en el que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ es un vector consistente en poxvirus recombinante no replicante o con replicación alterada, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
-
las composiciones de sensibilización y/o refuerzo descritas en la presente memoria, en forma de partícula adecuada para administrar mediante cañón de genes; y el procedimiento de inmunización que comprenden la administración de las composiciones por medio de un cañón de genes.
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Formulaciones como ejemplo y protocolos de inmunización
Formulación 1
Composición de sensibilización
1 mg/ml de plásmido con ADN en PBS
Composición de refuerzo
MVA recombinante, 10^{8} ffu en PBS
Protocolo: Administrar dos dosis de 1 mg de composición de sensibilización, i.m., a las 0 y 3 semanas seguido de dos dosis de refuerzo por vía intradérmica a las 6 y 9 semanas.
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Formulación 2
Composición de sensibilización
500 \mug de Ty-VLP en PBS
Composición de refuerzo
MVA, 10^{8} ffu en PBS
Protocolo: Administrar dos dosis de composición de sensibilización, i.m., a las 0 y 3 semanas, a continuación 2 dosis de refuerzo a las 6 y 9 semanas. Para tratamiento del tumor, se administra i.v. MVA como una de las vías más eficaces.
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Formulación 3
Composición de sensibilización
500 \mug de proteína + adyuvante (QS-21)
Composición de refuerzo
MVA recombinante, 10^{8} ffu en PBS
Protocolo: Administrar dos dosis de composición de sensibilización a las 0 y 3 semanas y 2 dosis de refuerzo i.d. a las 6 y 9 semanas.
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Formulación 4
Composición de sensibilización
Vector de adenovirus, 10^{9} pfu en PBS
Composición de refuerzo
MVA recombinante, 10^{8} ffu en PBS
Protocolo: Administrar por vía intradérmica una o dos dosis de composición de sensibilización, a las 0 y 3 semanas y 2 dosis de refuerzo i.d. a las 6 y 9 semanas.
Las dosis y protocolos anteriores se pueden variar para optimizar la protección. Las dosis se pueden administrar entre, por ejemplo, 1 a 8 semanas por separado en lugar de 2 semanas por separado.
La invención se describirá a continuación además mediante los ejemplos siguientes.
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Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y procedimientos Generación de los segmentos de epítopo
El segmento de epítopo de paludismo se construyó de una serie de casetes que codifica cada una tres epítopos como se muestra en la Tabla 1, con las posiciones de la enzima de restricción en cada extremo de la casete. Cada casete se construyó a partir de cuatro oligonucleótidos sintéticos que se hibridaron conjuntamente, se ligaron en un vector de clonación y a continuación se secuenciaron para comprobar que no se habían introducido errores. Las casetes individuales se unieron a continuación conjuntamente tal como se requiere. La zona BamHI en el extremo 3' de la casete C se fusionó a la zona BglII en el extremo 5' de la casete A, destruyendo ambas zonas de la enzima de restricción y codificando un intercalador de dos aminoácidos (GS) entre las dos casetes. Las casetes B, D y H se unieron a continuación al segmento de igual forma. Un segmento más largo que contiene CABDHFE se construyó asimismo de la misma forma.
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TABLA 1 Epítopos CTL del segmento del paludismo (M)
1 
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Tabla 1. Secuencias incluidas en el segmento del epítopo de paludismo. Cada casete está constituida por los epítopos mostrados anteriormente, sin secuencia adicional entre los epítopos dentro de una casete. Se añadió una zona BglII al extremo 5' y una zona BamHI en el extremo 3', de modo que la unión BamHI/BglII, entre casetes en un segmento de epítopo, codifica a GS. Todos los epítopos proceden de antígenos de P. falciparum excepto pb9 (P. berghei), BCG (M. tuberculosis) y TT (Tétanos). Las secuencias de aminoácido y de ADN mostradas en la tabla tienen SEC ID n^{os}: 1 a 40 en el orden en que aparecen.
La Figura 1 muestra la construcción utilizada para expresar Ty-VLP con la casete CABDHFE del epítopo de paludismo. Los epítopos CTL proceden de STARP de P. falciparum (proteína rica en treonina de esporozoíto y asparagina) (st), LSA-1 (antígeno 1 de la etapa del hígado) (1s), CSP (proteína de circumesporozoito) (cp), TRAP (proteína adhesiva relacionada con la trombospondina) (tr), LSA-3 (antígeno 3 de la etapa del hígado) (Ia) y Exp-1 (proteína 1 exportada) (ex). Los epítopos cooperadores proceden de la proteína CS de P. falciparum, del antígeno de 38Kd de M. tuberculosis y del toxoide del tétanos. NANP es el epítopo del anticuerpo procedente de CS y AM es el motivo de la adhesión procedente de la TRAP de P. falciparum (Muller et al. 1993). La longitud del segmento completo es de 229 aminoácidos tal como se muestra en la tabla de 1 leyenda, con la secuencia de aminoácidos:
200
El segmento del epítopo HIV se sintetizó también por hibridación de oligonucleótidos. Por último los segmentos del epítopo del HIV y de paludismo se fusionaron uniendo la zona BamHI en el extremo 3' de los epítopos de HIV con la zona Bg/II en el extremo 5' de las casetes CAB para formar el segmento HM (Tabla 2)
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TABLA 2
3 
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Tabla 2 Secuencias de epítopos procedentes de HIV ó SIV contenidas en el segmento del epítopo H y reunidas como se muestra en la Figura 2. Los aminoácidos de la tabla tienen las SEC ID n^{os}: 42 a 64 en el orden en que aparecen.
La Figura 2 muestra un croquis esquemático de las proteínas H, M y HM. Los modelos de barras en las representaciones esquemáticas de las proteínas de poliepítopo indican el origen de las secuencias (véase tablas 1 y 2). Las posiciones de los epítopos individuales y de sus restricciones MHC están representadas sobre y bajo las proteínas. Pb es el único epítopo procedente de la proteína de P. berghei. Todos los demás epítopos en la proteína M se originan a partir de proteínas P. falciparum: proteína de cs -circumesporozoito, st - STARP, ls - LSA-1 y la proteína tr - TRAP.BCG de 38 kDa de M. tuberculosis; la toxina del tétanos - TT.
Para la vacuna antitumoral se generó un segmento del epítopo que contiene epítopos CTL, similar a la del paludismo y al segmento del epítopo de HIV. En este segmento del epítopo tumoral publicado se fusionaron conjuntamente los epítopos CTL murinos para crear el segmento del epítopo tumoral con la secuencia de aminoácidos: MLPYLGWLVF-AQHPNAELL-KHYLFRNL-SPSYVYHQF-IPNPLLGLD [SEC ID nº: 65]. Los epítopos CTL demuestran aquí que se fusionaron conjuntamente. El primer aminoácido metionina fue introducido para iniciar la traslación.
Partículas análogas al virus Ty (VLP)
Se introdujo el segmento del epítopo que contiene la casete CABDH en un vector con expresión de levadura para construir una fusión en el marco de lectura con C-terminal en la proteína TyA. Cuando TyA o las proteínas de fusión de TyA se expresan en levadura a partir de este vector, la proteína forma espontáneamente, partículas análogas al virus que se pueden purificar a partir del citoplasma de la levadura mediante centrifugación con gradiente de sacarosa. Se prepararon Ty-VPL recombinantes de esta manera y se dializaron contra PBS para eliminar la sacarosa antes de la inyección (véase Layton et al. 1996)
Adenovirus
En este estudio se utilizó adenovirus recombinante con replicación defectuosa con una deleción de los genes de E1 (McGrory et al. 1988). El Adenovirus expresó \beta-galactosidasa de E. coli bajo el control de un promotor de CMV IE. Para inmunizaciones, se administraron por vía intradérmica 10^{7} pfu de virus en el lóbulo de la oreja.
Péptidos
Los péptidos se adquirieron en Research Genetics (USA), se disolvieron en 10 mg/ml de DMSO (Sigma) y se diluyeron además en 1 mg/ml de PBS. Los péptidos que comprenden los epítopos de CTL que se utilizaron en los experimentos descritos en la presente memoria se relacionan en la Tabla 3.
TABLA 3 Secuencia de epítopos del péptido de CTL
4
Las secuencias de aminoácido en la Tabla 3 tienen SEC ID n^{os}: 66 al 73, en el orden en que aparecen en la Tabla.
Construcciones de ADN con plásmido
Se utilizaron numerosos vectores diferentes para construir vacunas de ADN. El plásmido pTH contiene el promotor IE del CMV con el intrón A, seguido de un policonector para permitir la introducción de las secuencias de codificación del antígeno y la secuencia de terminación de la transcripción de la hormona de crecimiento bovina. El plásmido lleva el gen de resistencia a la ampicilina y tiene capacidad de replicación en el E. coli pero no en las células de mamíferos. Esto se utilizó para construir vacunas de ADN que expresan cada uno de los siguientes antígenos: TRAP de P. berghei, CS de P. berghei, TRAP de P. falciparum, LSA-1 de P. falciparum (278 aminoácidos del terminal C sólamente), conteniendo el segmento del epítopo casetes CABDH y el segmento del epítopo de HM (epítopos de HIV seguidos de casetes CAB). El plásmido pSG2 es similar al pTH excepto para el gen con resistencia al antibiótico. En pSG2 el gen con resistencia al antibiótico de pTH se ha sustituido por un gen con resistencia a la canamicina. pSG2 se utilizó para construir vacunas de ADN que expresan los siguientes antígenos: PbCSP de P. berghei, un segmento del epítopo tumoral de ratón, el segmento del epítopo que contiene casetes CABDH y el segmento del epítopo de HM. El plásmido V1J-NP expresa la nucleoproteína de la gripe bajo el control de un promotor IE del CMV. Los plásmidos CMV-TRAP y CMV-LSA-1 son similares a pTH.TRAP y pTH.LSA-1 pero no contienen intrón A del promotor del CMV. Los plásmidos RSV.TRAP y RSV.LSA-1 contienen el promotor de RSV, la secuencia de terminación de la transcripción de SV40 y son resistentes a la tetraciclina. Para la producción de CTL específico para la \beta-galactosidasa se utilizó el plásmido pcADN3/His/LacZ (Invitrogen). Todas las vacunas de ADN se prepararon a partir de la cepa DH5\alpha de E. coli utilizando columnas de purificación de plásmido Qiagen.
Generación de virus de vacuna recombinantes
Se construyeron MVA recombinantes por primera vez clonando la secuencia del antígeno en un vector lanzadera con un promotor vírico tal como el plásmido pSC11 (Chakrabarti et al. 1985; Morrison et al. 1989), CS de P. berghei y TRAP de P. falciparum, la nucleoproteína de la gripe y el HM y el segmento del poliepítopo del epítopo tumoral del ratón se expresaron cada uno utilizando el promotor P7.5 (Mackett et al. 1984), y TRAP de P. berghei se expresó utilizando el promotor sintético fuerte (SSP; Carroll et al. 1995). Los vectores lanzadera, pSC11 ó pMCO3 se utilizaron a continuación para transformar las células infectadas con MVA natural de modo que las secuencias víricas que flanquean al promotor, la secuencia que codifica al antígeno y el gen marcador se podrían volver a combinar con el MVA y producir recombinantes. Los virus recombinantes expresan el gen marcador (\beta-glucuronidasa ó \beta-galactosidasa) permitiendo la identificación de placas que contienen virus recombinante. Los recombinantes se purificaron en placas repetidamente antes de la utilización en inmunizaciones. La vacuna de NYVAC-PbCSP recombinante se describió anteriormente (Lanar et al. 1996). La cepa natural o Western Reserve (WR) de vacuna recombinante que codifica a PbCSP se describió anteriormente (Satchidanandam et al. 1991).
Células y medio de cultivo
Se cultivaron células murinas y células B de chimpancé y de macaco (BCL) transformadas por el virus de Epstein-Barr en RPMI complementado con suero de ternero fetal (FCS) inactivado por calor al 10%. Se volvieron a estimular esplenocitos con los péptidos indicados (concentración final 1 \mug/ml) en medio MEM con FCS al 10%, glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina, 2-mercaptoetanol 50 \muM y Hepes 10 mM pH 7,2 (Gibco, R.U.).
Animales
Se adquirieron en Harlan Olac (Shaws Farm, Blackthorn, R.U.) ratones de las cepas indicadas, de 6 a 8 semanas de edad. Los chimpancés H1 y H2 se estudiaron en el Biomedical Primate Research Centre en Rijswick, Holanda. Los macacos se estudiaron en la Universidad de Oxford.
Inmunizaciones
Las inmunizaciones del ADN del plásmido de ratones se realizaron mediante inmunización intramuscular del ADN en el músculo tibial bajo anestesia. El músculo de ratón se pretrató algunas veces con 50 \mul de cardiotoxina 1 mM (Latoxan, Francia) 5 a 9 días antes de la inmunización tal como describió Davis et al. (1993), pero la presencia o ausencia de tal pretratamiento no se observó que tenga ningún efecto significativo sobre la inmunogenicidad o sobre la eficacia protectora. La inmunización con MVA de ratones se realizó mediante inmunización intramuscular (i.m.), intravenosa (en la vena lateral de la cola) (i.v.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o subcutánea (s.c.). La inmunización con ADN y MVA del plásmido de los chimpancés H1 y H2 se realizó bajo anestesia mediante inmunización intramuscular de los músculos de la pierna. Para estas inmunizaciones del chimpancé se administró el ADN del plásmido junto con 15 microgramos de GM-CSF humano como adyuvante. La administración de MVA recombinante a los chimpancés se efectuó mediante inmunización intramuscular bajo supervisión veterinaria. El GM-CSF humano recombinante se adquirió en Sandoz (Camberley, R.U.). Para las inmunizaciones con ADN de plásmido que utilizan un cañón de genes, el ADN se precipitó sobre partículas doradas. Para la administración intradérmica, se utilizaron dos tipos diferentes de cañones de genes, el dispositivo de Acell y el de Oxford Bioscience (PowderJect Pharmaceuticals, Oxford, R.U.).
Análisis ELISPOT
Se cuantificaron los linfocitos T CD8+ en los bazos de ratones inmunizados sin reestimulación in vitro utilizando los epítopos indicados y el análisis ELISPOT tal como describió Miyahara et al. (1993). En resumen, se recubrieron placas de nitrocelulosa de 96 pocillos (Miliscreen MAHA, Millipore, Bedford R.U.) con 15 \mug/ml del anticuerpo R4 monoclonal de interferón-\gamma anti-ratón (EACC) en 50 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de incubación toda la noche a 4ºC se lavaron los pocillos una vez con PBS y se taparon durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 \mul de RPMI con FCS al 10%. Los esplenocitos de ratones inmunizados se volvieron a poner en suspensión en 1 \times 10^{7} células/ml y se colocaron por duplicado en los pocillos recubiertos de anticuerpo y se diluyeron en serie. Se añadió péptido a cada pocillo hasta una concentración final de 1 \mug/ml. Se utilizaron pocillos adicionales sin péptido como referencia para dependencia del péptido de la secrección de interferón-\gamma. Después de la incubación a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 12 a 18 horas se lavaron las placas 6 veces con PBS y agua. Los pocillos se incubaron a continuación durante 3 horas a temperatura ambiente con una solución de 1 \mug/ml de anticuerpo XMG1.2 monoclonal de interferón-\gamma anti-ratón biotinilado (Pharmingen, CA, USA) en PBS. Después de lavados adicionales con PBS, se añadió 50 \mul de una solución de 1 \mug/ml de polímero de fosfatasa alcalino con estreptavidina (Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se desarrollaron las manchas añadiendo 50 \mul de la solución del sustrato conjugado alcalino de fosfatasa (Biorad, Hercules, CA, USA). Después de la apareción de las manchas se detuvo la reacción mediante lavado con agua. Se determinó el número de manchas con la ayuda de un estereomicroscopio.
Se realizaron análisis ELISPOT en los linfocitos de la sangre periférica del chimpancé utilizando un procedimiento muy similar que emplea el análisis y los reactivos desarrollados para detectar linfocitos T CD8 (Mabtech, Estocolmo).
Análisis de CTL
Se realizaron análisis de CTL utilizando células diana marcadas con cromo tal como se indicó y células cultivadas de bazo de ratón como células efectoras tal como describió Allsopp et al. (1996). Se realizaron análisis de CTL utilizando células de chimpancé o de macaco tal como describieron Hill et al. (1992) para la detección de CTL humano utilizando líneas celulares autólogas transformadas por EBV, de chimpancé o de macaco B, como células diana.
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Exposición a P. berghei
Se expusieron ratones a 2000 (BALB/c) ó a 200 (C57BL/6) esporozoítos de la cepa ANKA de P. berghei en 200 \mul de RPMI mediante inoculación intravenosa tal como describió (Lanar et al. 1996). Estos esporozoítos se disecaron a partir de las glándulas salivares de mosquitos Anopheles stephensi mantenidas a 18ºC durante 20 a 25 días después de alimentar en ratones infectados. La infección de paludismo en la etapa sanguinea, que indica una insuficiencia de la inmunización, se detectó observando la aparición de formas anulares de P. berghei en frotis de sangre teñida con Giemsa tomados a los 5 a 12 días después de la exposición.
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Exposición a P. falciparum
Se expusieron los chimpancés a 20.000 esporozoítos de P. falciparum de la cepa NF54 disecada a partir de las glándulas salivares de mosquitos Anopheles gambiae, mediante inoculación intravenosa bajo anestesia. Se examinaron al microscopio muestras de sangre de estos chimpancés cada día a partir del día 5 después de la exposición y de cultivo parásito, para detectar la aparición de bajos niveles de parásitos de P. falciparum en la sangre periférica.
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Exposiciones tumorales a P815
Se expusieron ratones a 1 \times 10^{5} células P815 en 200 \mul de PBS por inoculación intravenosa. Se controló la supervivencia en los animales.
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Exposiciones al virus de gripe
Se expusieron ratones a 100 unidades de hemaglutinante (HA) de virus A/PR/8/34 de la gripe por inoculación intranasal. Después de la exposición se pesaron los animales cada día y se controló la supervivencia.
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Determinación de CTL específico para el péptido utilizando tetrámeros
Se construyeron complejos tetrámeros constituidos por una cadena pesada de Mamu-A*01 y microglobulina \beta_{2} tal como describió Ogg et al. (1998). La codificación del ADN para la porción extracelular sin líder de la cadena pesada de clase I de MHC de Mamu-A*01 se amplió con RCP procedente de ADNc utilizando MamuNdel con sensibilizador en 5': 5'-CCT GAC TCA GAC CAT ATG GGC TCT CAC TCC ATG [SEC ID nº: 74] y sensibilizador en 3': 5'-GTG ATA AGC TTA ACG ATG ATT CCA CAC CAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG GGA TCC CTC CCA TCT CAG GGT GAG GGG C [SEC ID nº: 75]. El primer sensibilizador contenía una zona de restricción Nde/, el último incluía una zona HindIII y codificaba el péptido del sustrato BirA de la enzima de bioinilación. Los productos de la RCP se digirieron con Nde/ y HindIII y se unieron en las mismas posiciones del policonector del vector de expresión bacteriana pGMT7. El gen del mono rhesus que codifica la microglobulina \beta_{2} sin líder se amplificó por RCP a partir del clon del ADNc utilizando sensibilizadores B2MBACK: 5'-TCA GAC CAT ATG TCT CGC TCC GTG GCC [SEC ID nº: 76] y B2MFOR: 5'-TCA GAC AAG CTT TTA CAT GTC TCG ATC CCA C [SEC ID nº: 77] y asimismo se clonó en las posiciones NdeI y HindIII de pGMT7. Ambas cadenas se expresaron en la cepa BL-21 de E. coli, se purificaron de los cuerpos de inclusión, se replegaron en presencia del péptido CTPYDINQM [SEC ID nº: 54], se biotinilaron utilizando la enzima BirA (Avidity) y se purificaron con FPLC y en columnas de intercambio iónico con monoQ. Se estimó la cantidad de complejos MHC-péptido replegados biotinilados mediante un análisis ELISA, en el que los complejos monoméricos se capturaron en primer lugar mediante anticuerpos monoclonales W6/32 sensibles a la conformación y se detectaron mediante estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) seguido de sustrato colorimétrico para AP. La formación de complejos tetrámeros se produjo mediante la adición de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (PE) (ExtrAvidin; Sigma) a los monómeros biotinilados replegados en una relación molar del péptido con MHC: PE-estreptavidina de 4:1. Los complejos se guardaron en la oscuridad a 4ºC. Estos tetrámeros se utilizaron para analizar la frecuencia de Mamu-A*01/linfocitos T CD8+ específicos para gag en linfocitos de sangre periférica (PBL) de macacos inmunizados.
Ejemplo 2 Estudios de inmunogenicidad en ratones
Los estudios anteriores de la producción de CTL contra epítopos en la proteína de circumesporozoito (CS) de Plasmodium berghei y Plasmodium yoelii han demostrado niveles variables de producción de CTL con diferentes sistemas de administración. Se ha expuesto la protección parcial con ADN de plásmido (Sedegah et al. 1994), con virus de gripe reforzado por el virus replicante de vacuna (Li et al. 1991), con adenovirus (Rodrigues et al. 1997) y con sistemas de administración de partículas (Schodel et al. 1994). La inmunización de ratones por vía intramuscular con 50 microgramos de un plásmido que codifica la proteína CS produjo niveles moderados de linfocitos CD8+ y actividad de CTL en los bazos de estos ratones después de una sola inyección (Figuras 3, 4).
Para comparación se inyectaron grupos de ratones BALB/c (n = 5) por vía intravenosa con 10^{6} ffu/pfu de virus de vacuna recombinante de diferentes cepas (WR, NYVAC y MVA) que expresan todas a CSP de P. berghei. Se midieron las frecuencias de los linfocitos T CD8+ específicos para el péptido 10 días después mediante un análisis ELISPOT. MVA.PbCSP produjeron 181 +/- 48, NYVAK 221 +/- 27 y WR 94 +/- 19 (media +/- desviación estándar) linfocitos T CD8+ específicos para el péptido por millón de esplenocitos. Estos resultados demuestran que sorprendentemente los virus de vacuna con replicación alterada son superiores a las cepas replicantes en la sensibilización de una respuesta de linfocitos T CD8+. Se ha intentado a continuación reforzar estas respuestas de linfocitos T CD8+ moderado inducidas mediante sensibilización con ADN o MVA de plásmido utilizando vectores homólogos o heterólogos. Se observó un bajo nivel de linfocitos T CD8+ después de dos inmunizaciones con vacuna de ADN recombinante de CS sola, con la vacuna con MVA recombinante sola o con el MVA recombinante seguido de ADN recombinante (Figura 3). Se observó una cantidad mucho más elevada de linfocitos T CD8+ al reforzar la respuesta inmunitaria sensibilizada por ADN con MVA recombinante. En un segundo experimento que utiliza diez ratones por grupo, se confirmó el aumento de inmunogenicidad de la secuencia ADN/MVA: ADN/MVA 856 +/- 201; MVA/ADN 168 +/- 72; MVA/MVA 345 +/- 90; ADN/ADN 92 +/- 46. Por consiguiente la secuencia de una primera inmunización con un plásmido recombinante que codifica la proteína CS seguido por una segunda inmunización con el virus MVA recombinante proporcionó los niveles más elevados de respuesta de los linfocitos T CD8+ después de la inmunización.
La Figura 3 muestra los datos de ELISPOT de los linfocitos T CD8 del paludismo siguiendo diferentes regímenes de inmunización. Los resultados se muestran como el número de linfocitos T específicos para el péptido por millón de esplenocitos. Se inmunizaron ratones bien con ADN del plásmido con PbCSP o con el virus MVA con PbCSP o combinaciones de los dos tal como se muestra en el eje X, con intervalos de dos semanas y el número de esplenocitos específicos para el epítopo de paludismo pb9 analizado dos semanas después de la última inmunización. Cada punto representa un número de células formadoras de manchas (SFC) medido en un determinado ratón. La cantidad mayor de linfocitos T CD8+ se produjo mediante sensibilización con el ADN del plásmido y mediante refuerzo con le virus MVA recombinante. Esto fue más inmunógeno que el orden inverso de inmunización (MVA/ADN), dos inmunizaciones con ADN (ADN/ADN) o dos inmunizaciones con MVA (MVA/MVA). Esto fue asimismo más inmunógeno que las inmunizaciones con ADN y con MVA administradas simultáneamente (ADN + MVA 2w), que una inmunización con ADN (ADN 4w) o una inmunización con MVA administrada en el punto del tiempo inicial o final (MVA 2w y MVA 4w).
La Figura 4 demuestra que el ELISPOT de linfocitos T CD8 del paludismo y las cantidades de CTL se refuerzan sustancialmente mediante una inmunización con MVA recombinante seguida de sensibilización con un ADN de plásmido que codifica al mismo antígeno. A y C. Se midieron las respuestas de los linfocitos T CD8+ en ratones BALB/c utilizando el análisis ELISPOT de \gamma-interferón en esplenocitos recientes incubados durante 18 h con el péptido SYIPSAEKI [SEC ID nº: 67] limitado por K^{d} de la CSP de P. berghei y el péptido TPHPARIGL [SEC ID nº: 69] limitado por L^{d} de la \beta-galactosidasa de E. coli. Obsérvese que los recuentos de ELISPOT se presentan en escala logarítmica. B y D. Se analizaron también los esplenocitos del mismo ratón en análisis convencionales de liberación de ^{51}Cr a una relación efector:diana de 100:1 y 6 días de reestimulación in vitro con los mismos péptidos (1 \mug/ml).
Se inmunizaron los ratones con ADN de plásmido que expresa a CSP y a TRAP de P. berghei, a PbCSP solo, al casete del epítopo de paludismo incluyendo el epítopo de CTL de P. berghei (pTH.M marcado), o \beta-galactosidasa. Los niveles ELISPOT y de CTL medidos en ratones, 23 días después de una inmunización con ADN se muestran en A y B respectivamente. Se realizaron los mismos análisis con animales que recibieron además 1 \times 10^{7} ffu de MVA recombinante que expresan al/a los mismo(s) antígeno(s) dos semanas después de la inmunización principal. Los niveles ELISPOT y de CTL en estos animales se muestran en C y D respectivamente. Cada barra representa los datos de un animal individual.
Se emprendieron asimismo estudios de la inmunogenicidad del segmento HM del epítopo que comprenden tanto epítopos de HIV como de paludismo simultáneamente. Utilizando este segmento del epítopo se generaron de nuevo los niveles más elevados de linfocitos T CD8+ y de CTL en el bazo al utilizar una inmunización con vacuna de ADN seguida de una inmunización con una vacuna de MVA recombinante (Tabla 4, Figura 5).
TABLA 4
5
La Tabla 4 muestra los resultados de los análisis ELISPOT realizados para medir los niveles de linfocitos T CD8+ específicos para epítopos de HIV y de paludismo siguiendo diferentes regímenes de inmunización con ADN y MVA de plásmido tal como se indica. Los números son las células formadoras de manchas por millón de esplenocitos. El segmento del epítopo HM se ilustra en la Figura 2. Se utilizaron ratones BALB/c en todos los casos. El epítopo de paludismo fue pb9 como en la Figuras 2 y 3. El epítopo de HIV fue RGPGRAFVTI [SEC ID nº: 51]. Las dosis de inmunización fueron 50 \mug de ADN de plásmido ó 10^{7} unidades formadoras del foco (ffu) de MVA recombinante. Todas las inmunizaciones fueron intramusculares. El intervalo entre las inmunizaciones 1 y 2 fue de 14 a 21 días en todos los casos.
La Figura 5 demuestra que las respuestas inducidas por CTL en ratones BALB/c en el paludismo y en epítopos de HIV por varios regímenes de inmunización que emplean ADN de plásmido y MVA recombinante. Se inmunizaron ratones por vía intramuscular tal como se describió en la leyenda de la Tabla 3 y en los procedimientos. Se observaron grandes concentraciones de CTL (> 30% de lisis específica a la relación efector/diana de 25:1) tanto en los epítopos de paludismo como en los de HIV sólamente después de sensibilización con ADN del plásmido y del refuerzo con el MVA recombinante. El antígeno utilizado en este experimento es el segmento del epítopo de HIV-paludismo. El MVA recombinante se denomina MVA. HM y el ADN del plásmido que expresan a este segmento del epítopo se denomina pTH.HM. Se muestran los niveles de lisis específica para varias relaciones efector a diana. Éstos se determinaron después de 5 días de reestimulación in vitro de esplenocitos con los dos péptidos pb9 y RGPGRAFVTI [SEC ID nº: 51].
La comparación de numerosos sistemas de administración para la producción de CTL fue expuesta por Allsopp et al. (1996). Tanto las partículas análogas al virus Ty recombinante (Ty-VLP) como los péptidos de paludismo terminados en lípido proporcionaron correcta producción de CTL pero los Ty-VLP fueron mejores porque necesitaron sólamente una sola dosis de inmunización para correcta producción de CTL. No obstante, tal como se muestra en la presente memoria incluso dos dosis de partículas Ty dejaron de inducir protección significativa frente a la exposición a esporozoítos (Tabla 7, línea 1). La inmunización con un virus de vacuna Ankara recombinante modificado que codifica la proteína del circumesporozoito de P. berghei también genera buenos niveles de CTL. Sin embargo, se consigue un nivel mucho más elevado de respuesta de los linfocitos T CD8+ mediante una primera inmunización con el Ty-VLP seguida de una segunda inmunización con la vacuna CS de MVA (Tabla 5).
TABLA 5
6
Tabla 5 Resultados de análisis ELISPOT y de CTL realizados para medir las concentraciones de linfocitos T CD8+ específicos en el epítopo pb9 de paludismo siguiendo diferentes regímenes de inmunización de Ty-VLP y virus de MVA recombinante tal como se indica. Los datos de CTL y ELISPOT proceden de diferentes experimentos. Se miden las concentraciones de ELISPOT (manchas por millón de esplenocitos) en células no reestimuladas y la actividad de CTL, se indican como lisis específica en una relación efector a diana de 40:1, en células reestimuladas con péptido pb9 in vitro durante 5 a 7 días. Ambos representan concentraciones medias de tres ratones. Se utilizaron ratones BALB/c en todos los casos. Las dosis de inmunización fueron 50 \mug de Ty-VLP ó 10^{7} ffu (unidades formadoras de focos) de MVA recombinante. Todas las inmunizaciones fueron intramusculares. El intervalo entre las inmunizaciones 1 y 2 fue de 14 a 21 días. MVA.HM incluye las casetes CAB.
Sensibilización de una respuesta inmunitaria con ADN administrado mediante cañón de genes y refuerzo con MVA recombinante Inmunogenicidad y exposición
Se investigó la utilización de un cañón de genes para administrar ADN de plásmido por vía intradérmica y sensibilizar de este modo una respuesta inmunitaria que se podría reforzar con MVA recombinante. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c con el régimen siguiente:
I)
Tres inmunizaciones mediante cañón de genes con pTH.PbCSP (4 mg por inmunización) a intervalos de dos semanas
II)
Dos inmunizaciones mediante cañón de genes seguidas de i.v. con MVA dos semanas más tarde
III)
Una inmunización intramuscular con ADN seguida de i.v. con MVA dos semanas más tarde.
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Se analizó la inmunogenicidad de estos tres regímenes de inmunización utilizando análisis ELISPOT. La frecuencia más elevada de linfocitos T específicos se observó con dos inmunizaciones por cañón de genes seguidas de un refuerzo con MVA i.v. y de la inyección intramuscular de ADN seguida de un refuerzo con MVA i.v. (Figura 6).
La Figura 6 muestra los resultados de los análisis ELISPOT realizados para medir las concentraciones de linfocitos T CD8+ específicos para el epítopo pb9 de paludismo siguiendo diferentes regímenes de inmunización. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c (n = 3) como se indica (g.g. = cañón de genes). El tiempo entre todas las inmunizaciones fue de 14 días. Se realizaron análisis ELISPOT dos semanas después de la última inmunización.
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Producción de CTL en el mismo antígeno en diferentes cepas de ratón
Se realizaron dos series de experimentos para estudiar el problema de si el efecto de refuerzo, descrito anteriormente en ratones BALB/c con dos epítopos SYIPSAEKI [SEC ID nº: 67] de CTL procedente de CSP de P. berghei y de RGPGRAFVTI [SEC ID nº: 68] procedente de HIV, es un fenómeno universal. Las respuestas de CTL a la nucleoproteína de la gripe se estudiaron en cinco cepas consanguíneas de ratón. En un primer experimento se estudiaron tres epítopos de CTL murinos publicados procedentes de la nucleoproteína de la gripe (véase Tabla 3). Se utilizaron ratones de tres haplotipos H-2 diferentes, BALB/c y DBA/2 (H-2^{d}), C57BL/6 y 129 (H-2^{b}); CBA/J (H-2^{k}). Se inmunizó una serie de animales dos veces en intervalos de dos semanas con el plásmido V1J-NP que codifica la nucleoproteína de la gripe. Otra serie de animales idénticos se sensibilizó con V1J-NP y dos semanas más tarde se reforzó por vía intravenosa con 10^{6} ffu de MVA.NP, que expresa al virus NP de la gripe. Los niveles de CTL en ratones individuales se determinaron mediante un análisis de liberación de ^{51}Cr con esplenocitos reestimulados por péptido. Como se muestra en la Figura 7, el régimen de inmunización de sensibilización con ADN/reforzado con MVA produjo niveles de lisis superiores en todas las cepas de ratón analizadas y es superior a las dos inyecciones de ADN.
La Figura 7 muestra las respuestas de CTL frente al NP de la gripe en diferentes cepas de ratón. Se inmunización dos veces ratones de diferentes cepas dos semanas por separado con una vacuna V1J-NP con ADN que codifica la nucleoproteína de la gripe (círculos blancos) o se sensibilizaron con la misma vacuna de ADN y dos semanas más tarde se reforzó con MVA recombinante que expresa la nucleoproteína del virus de la gripe (círculos negros). Dos semanas después de la última inmunización se volvieron a estimular in vitro los esplenocitos con los péptidos respectivos (Tabla 3). Se determinó la actividad de CTL mediante un análisis estándar de liberación de ^{51}Cr con células diana emparejadas con MHC de clase I.
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Producción de CTL en antígenos diferentes en diferentes cepas de ratón
Se investigó además el efecto de refuerzo con MVA sobre las repuestas inmunitarias sensibilizadas con ADN de plásmido, utilizando diferentes antígenos y diferentes cepas consanguíneas de ratón. Se inmunizaron ratones de diferentes cepas con antígenos diferentes utilizando dos inmunizaciones con ADN y se compararon con inmunizaciones con ADN/MVA. Los antígenos utilizados fueron galactosidasa de E. coli, el segmento del epítopo paludismo/HIV, un segmento del epítopo tumoral murino y TRAP de P. falciparum. Comparados las dos inmunizaciones con ADN el régimen de sensibilización con ADN/refuerzo con MVA produjo niveles superiores de CTL en todas las cepas diferentes de ratón y en las combinaciones de antígeno probadas (Figura 8).
La Figura 8 muestra la respuestas CTL frente a diferentes antígenos producidas en diferentes cepas consanguíneas de ratón. Se inmunizaron ratones con dos inmunizaciones de vacuna con ADN dos semanas por separado (círculos blancos) o se sensibilizaron con una vacuna de ADN y dos semanas más tarde se reforzó con un MVA recombinante que expresa al mismo antígeno (círculos negros). Las cepas y los antígenos fueron: C57BL/6; TRAP de P. falciparum en A. DBA/2; \beta-galactosidasa de E. coli en B. BALB/c; actividad del segmento CTL del epítopo HM contra el péptido de paludismo (pb9) en C. DBA/2; actividad del segmento CTL del epítopo HM contra el pb9 en D. BALB/c; actividad del segmento CTL del epítopo HM contra el péptido HIV en E. DBA/2; actividad del segmento CTL del epítopo HM contra el péptido HIV en F. BALB/c; actividad del segmento CTL del epítopo tumoral contra el péptido procedente de P1A en G. DBA/2; actividad del segmento CTL del epítopo tumoral contra el péptido procedente de P1A en H. Las secuencias de los epítopos del péptido se muestran en la Tabla 3. Cada curva muestra los datos para un ratón en particular.
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Los esporozoítos pueden sensibilizar eficazmente una respuesta inmunitaria que es reforzable mediante MVA
Los seres humanos que viven en áreas endémicas de paludismo están expuestos continuamente a inoculaciones de esporozoítos. Los CTL específicos del paludismo se encuentran en bajos niveles en estos individuos expuestos en la naturaleza. Para estudiar el problema de si bajos niveles de repuestas de CTL inducidos por esporozoítos se pueden reforzar con MVA, se inmunizaron ratones BALB/c con esporozoítos de P. berghei irradiados (para prevenir la infección por paludismo) y se reforzaron con MVA. Dos semanas más tarde de la última inmunización se volvieron a estimular esplenocitos y se probó la actividad lítica. Dos inyecciones con 50 ó 300 + 500 esporozoítos produjeron niveles muy bajos o indetectables de lisis. El refuerzo con MVA produjo niveles elevados de CTL específico para el péptido. El MVA solo produjo únicamente niveles moderados de lisis. (Figura 9).
La Figura 9 demuestra que las respuestas de CTL sensibilizados con esporozoíto están sustancialmente reforzadas mediante MVA. Se inmunizaron ratones con dos dosis bajas (50 + 50) de esporozoítos irradiados en A; con dos dosis elevadas (300 + 500) de esporozoítos en B; se administraron dosis de refuerzo a ratones con MVA. PbCSP después de bajas dosis de sensibilización con esporozoíto en D; sensibilización con esporozoíto a altas dosis en E. Respuestas de CTL después de la inmunización con MVA. PbCSP se muestran en C.
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Adenovirus recombinantes como agentes de sensibilización
El régimen de inmunización de sensibilización-refuerzo se ha ejemplificado utilizando ADN de plásmido y Ty-VLP recombinante como agente de sensibilización. En la presente memoria se proporciona un ejemplo utilizando adenovirus no replicantes como agentes de sensibilización. Se utilizó adenovirus recombinante con replicación incompleta que expresa a \beta-galactosidasa de E. coli (Adeno-GAL). Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c con ADN de plásmido seguido de MVA o con adenovirus seguido de MVA. Todos los sistemas de administración de antígeno utilizados codificaron la \beta-galactosidasa de E. coli. Sensibilizando una respuesta de CTL con ADN de plásmido o adenovirus y administrando un refuerzo con MVA se producen niveles similares de CTL (Figura 10).
La Figura 10 muestra las repuestas de CTL sensibilizados mediante ADN de plásmido o adenovirus recombinante y reforzados con MVA. Se sensibilizaron grupos de ratones BALB/c (n = 3) con ADN de plásmido A o con adenovirus recombinante que expresa a \beta-galactosidasa B. Se administró ADN de plásmido por vía intramuscular, MVA por vía intravenosa y adenovirus por vía intradérmica. Se volvieron a estimular los esplenocitos con péptido TPHPARIGL [SEC ID nº: 69] dos semanas después de la última inmunización. Se probó la actividad de CTL con células P815 pulsadas por péptido.
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La inmunogenicidad del régimen de sensibilización con ADN-refuerzo con vacuna depende de la competencia de replicación de la cepa del virus de vacuna utilizada
Se probó la estrategia sensibilización-refuerzo utilizando diferentes cepas de virus de vacuna recombinante para determinar si las diferentes cepas con cepas que se diferencian en su competencia de replicación pueden diferir en su capacidad para reforzar una respuesta de CTL sensibilizada con ADN. El refuerzo con virus de vacuna recombinante con replicación defectuosa tales como MVA y NYVAC dieron como resultado la producción de respuestas de CTL más fuertes comparadas con las respuestas de CTL después del refuerzo con la misma dosis de virus de vacuna WR competente en replicación (Figura 11).
La Figura 11 muestra las respuestas de CTL en ratones BALB/c sensibilizados con ADN de plásmido seguido de refuerzo con diferentes virus de vacuna recombinante. Se sensibilizaron animales con 50 \mug/ratón de pTH.PbCSP i.m. y dos semanas más tarde se administraron dosis de refuerzo con cepas diferentes de virus de vacuna recombinante (10^{6} pfu por ratón i.v.) que expresan a PbCSP. Las diferentes cepas de virus de vacuna recombinante fueron MVA en A; NYVAC en B y WR en C. En un experimento adicional se observó la superioridad de las cepas de vacuna con replicación alterada en todas las cepas replicantes. Se sensibilizaron grupos de ratones BALB/c (n = 6) con 50 \mug/animal de pSG2.PbCSP (i.m.) y 10 días más tarde se administraron dosis i.v. con 10^{6} ffu/pfu de MVA, NYVAC y WR recombinantes que expresan a PbCSP. Se determinaron las frecuencias de los linfocitos T CD8+ específicos para el péptido utilizando el análisis ELISPOT. Las frecuencias fueron: MVA 1103 +/- 438, NYVAC 826 +/- 249 y WR 468 +/- 135. Por consiguiente utilizando tanto análisis de CTL como el análisis ELISPOT como medición de la inmunogenicidad del linfocito T CD8, se observó una sorprendente inmunogenicidad sustancialmente mayor de las cepas de vacuna con replicación alterada en comparación con la cepa competente en replicación.
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Utilización de virus recombinantes del canario o de viruela aviar para reforzar las respuestas de linfocitos T CD8+
El virus de la viruela del canario (rCPV) o el virus de la viruela aviar (rFVP) recombinantes se preparan utilizando vectores lanzadera descritos anteriormente (Taylor et al. Virology 1992, 187: 321-328 y Taylor et al. Vaccine 1988, 6: 504-508). La estrategia para estos vectores lanzadera consiste en insertar el gen que codifica la proteína en cuestión precedido de un promotor específico para la vacuna entre las dos zonas adyacentes que están constituidas por secuencias procedentes del genoma del CPV o del FPV. Estas secuencias de flanqueo se seleccionan para evitar la inserción en los genes víricos esenciales. Los CPV o FPV recombinantes se generan mediante recombinación in vivo en líneas celulares aviares opcionales, es decir fibroblastos primarios de embrión de pollo. Cualquier secuencia de proteína de antígenos o segmentos de epítopos se puede expresar utilizando virus de viruela aviar o poxvirus del canario. El CPV o el FPV recombinantes se caracterizan por la expresión de la proteína en cuestión utilizando anticuerpos específicos para el antígeno o incluyendo un epítopo de anticuerpo en el gen recombinante. Los virus recombinantes se desarrollan en CEF primario. Se sensibiliza una respuesta inmunitaria utilizando ADN de plásmido tal como se describió en Materiales y Procedimientos. Esta respuesta inmunitaria sensibilizada con ADN de plásmido se refuerza utilizando 10^{7} ffu/pfu de rCPVr o rFPV inoculado por vía intravenosa, por vía intradérmica o por vía intramuscular. Se controlaron las respuestas de los linfocitos T CD8+ y se llevaron a cabo las exposiciones tal como se describe en la presente memoria.
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Ejemplo 3 Estudios de exposición al paludismo en ratones
Para evaluar la eficacia protectora de los niveles inducidos de la respuesta de linfocitos T CD8+, se expusieron ratones BALB/c ó C57BL/6 inmunizados mediante inyección intravenosa con 2000 ó 200 esporozoítos de P. berghei. Esto condujo a la infección por esporozoítos de las células del hígado. Sin embargo, en presencia de una respuesta de linfocitos T suficientemente fuerte contra el parásito intrahepático no viable, abandonará el hígado y no se detectará ningún parásito en la etapa sanguínea. Por lo tanto se evaluaron al microscopio los frotis de sangre de los ratones expuestos a los parásitos 5 a 12 días después de la exposición.
Ratones BALB/c inmunizados dos veces con una mezcla de dos ADN de plásmido que codifican la proteína CS y el antígeno de TRAP, respectivamente, de P. berghei no se protegieron contra la exposición a esporozoítos. Ratones inmunizados dos veces con una mezcla de virus de MVA recombinante que codifican los mismos dos antígenos no se protegieron frente a la exposición a esporozoítos. Ratones inmunizados en primer lugar con los dos MVA recombinantes y en segundo lugar con los dos plásmidos recombinantes tampoco se protegieron contra la exposición a esporozoitos. Sin embargo, los 15 ratones inmunizados en primer luagar con los dos ADN de plásmido y en segundo lugar con los dos virus de MVA recombinante fueron totalmente resistentes a la exposición a esporozoitos (Tabla 6 A y B).
Para evaluar si la protección observada era debida a una respuesta inmunitaria al antígeno de CS o al de TRAP o a ambos, se inmunizaron a continuación grupos de ratones con cada antígeno por separado (Tabla 6 B). Los 10 ratones inmunizados en primer lugar con el ADN del plásmido de CS y en segundo lugar con el virus MVA de CS se protegieron totalmente contra la exposición a esporozoitos. Se protegieron catorce de los 16 ratones inmunizados en primer lugar con la vacuna del ADN del plásmido TRAP y en segundo lugar con el virus MVA de TRAP contra la exposición a esporozoitos. Por lo tanto el antígeno de CS solo, es totalmente protector cuando se emplea el régimen de inmunización anterior y el antígeno de TRAP es prácticamente protector con el mismo régimen.
La buena correlacción entre el nivel inducido de respuesta de linfocito T CD8+ y el grado de protección observado sugiere fuertemente que la respuesta de CD8+ es responsable de la protección observada. En los experimentos de transferencia adoptiva anteriores se ha demostrado que los clones de linfocitos T CD8+ contra el epítopo principal del linfocito T CD8+ en la proteína CS de P. berghei pueden proteger contra la exposición a esporozoítos. Para determinar si la protección inducida fue realmente mediada por los linfocitos T CD8+ en este epítopo se ha empleado a continuación un ADN de plásmido y un MVA recombinante que codifica sólamente esta secuencia de nueve aminoácidos procedente de P. berghei como parte de un segmento de epítopos (Tabla 6 B). (Todos los demás epítopos procedían de otros microorganismos aparte de P. berghei). La inmunización de 10 ratones en primer lugar con un plásmido que codifica tal segmento de epítopo y en segundo lugar con un MVA recombinante que codifica asimismo un segmento de epítopo con el epítopo CTL de P. berghei condujo a la protección completa de la exposición a esporozoítos (Tabla 6 B). Por consiguiente la respuesta inmunitaria protectora inducida debe ser una respuesta de CTL que se dirige a esta secuencia de péptido nonámero.
TABLA 6 Resultados de experimentos de exposición en ratones utilizando diferentes combinaciones de vacunas de ADN y MVA
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Tabla 6 Resultados de dos experimentos de exposición (A y B) utilizando diferentes regímenes de inmunización de ADN y MVA de plásmido tal como se indica. Se utilizaron ratones BALB/c en todos los casos. Las dosis de inmunización fueron 50 \mug de ADN de plásmido o 10^{6} ffu de MVA recombinante. El intervalo entre las inmunizaciones 1 y 2 fue de 14 a 21 días en todos los casos. Se realizaron exposiciones los 18 a 29 días después de la última inmunización mediante inyección por vía intravenosa de 2000 esporozoítos de P. berghei y se evaluaron los frotis de sangre a los 5, 8 y 10 días después de la exposición. La CSP y TRAP indican el antígeno completo de P. berghei y el "epítopo" indica las casetes de epítopos mostrados en la Tabla 1 que contienen únicamente un epítopo de CTL de nonámero limitado por K^{d} de P. berghei. Obsérvese que en la inmunización B del experimento con el segmento del epítopo solo proporciona el 100% de protección.
Ratones inmunizados dos veces con Ty-VLR recombinantes que codifican a pb9 fueron completamente sensibles a la infección. De manera similar los ratones inmunizados dos veces con el MVA recombinante que codifica la proteína CS completa fueron totalmente sensibles a la infección. Sin embargo, los ratones inmunizados una vez con el Ty-VLP y posteriormente una vez con el MVA recombinante mostraron una reducción del 85% en la incidencia del paludismo cuando se suministraron dosis de refuerzo de MVA que expresa la proteína CS completa, y del 95% cuando se utilizó para administrar MVA que expresa el segmento del epítopo HM que comprende a pb9 (Tabla 7).
TABLA 7 Resultados de experimentos de exposición en ratones utilizando regímenes de inmunización diferentes de Ty-Vpl y MVA
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Tabla 7 Resultados de los experimentos de la exposición utilizando diferentes regímenes de inmunización de Ty-VLP y de MVA tal como se indica. Se utilizaron ratones BALB/c en todos los casos. Las inmunizaciones fueron de 50 \mug de Ty-VLP o de 10^{7} ffu de MVA recombinante administrado por vía intravenosa. El intervalo entre las inmunizaciones 1 y 2 fue de 14 a 21 días en todos los casos. Las exposiciones se llevaron a cabo los 18 a 29 días después de la última inmunización por i.v. de 2000 esporozoítos de P. berghei y los frotis de sangre se evaluaron a los 5, 8 y 10 días después de la exposición. La CSP indica el antígeno de P. berghei completo. Ty-VLP llevan casetes de epítopo CABDH o CABDHFE tal como se describe en la Tabla 1. MVA.HM incluye casetes CAB.
Para determinar si el aumento de inmunogenicidad y de eficacia protectora observado mediante administración de refuerzo con un MVA recombinante es exclusivo para esta cepa de virus de vacuna particular o si es compartido por otras vacunas recombinantes se llevó a cabo el siguiente experimento. Se inmunizaron ratones con la vacuna de ADN que codifica la proteína CS de P. berghei y se administraron dosis de refuerzo con (i) MVA recombinante que codifica este antígeno; (ii) virus de vacuna natural recombinante (cepa Western Reserve) que codifica al mismo antígeno (Satchidanandam et al. 1991), ó (iii) virus NYVAC (COPAK) recombinante (Lanar et al. 1996) que codifica el mismo antígeno del paludismo. El máximo grado de protección se observó al suministrar una dosis de refuerzo mediante el MVA recombinante, 80% (Tabla 8). Un nivel muy bajo de protección (10%) se observó al suministrar una dosis de refuerzo de virus de vacuna recombinante natural y un nivel significativo de protección, 60%, al suministrar una dosis de refuerzo de NYVAC recombinante. Por consiguiente el régimen sensibilización-refuerzo que se describe produce eficacia protectora con cualquier cepa de virus de vacuna no replicante. Tanto el MVA recombinante como NYVAC fueron significativamente mejores (P < 0,05 para cada uno) que la cepa WR recombinante.
TABLA 8 Resultados de los datos de la exposición para ADN reforzado con varias cepas de vacuna recombinantes
9
Tabla 8 Resultados de un experimento de exposición utilizando diferentes regímenes de inmunización de ADN de plásmido y varios recombinantes de vacuna tal como se indica. Se utilizaron ratones BALB/c en todos los casos. Las dosis de inmunización fueron de 50 \mug de ADN de plásmido ó 10^{6} ffu/pfu de MVA recombinante ó 10^{4} ffu/pfu de vacuna natural recombinante (WR) ó 10^{6} ffu/pfu de NYVAC recombinante. Debido a que la cepa WR se replicará en el huésped y en las demás cepas no, en este experimento se utilizó una dosis más baja de WR. El intervalo entre las inmunizaciones 1 y 2 fue de 23 días. Las exposiciones se llevaron a cabo a los 28 días después de la última inmunización mediante inyección intravenosa de 2000 esporozoítos de P. berghei y se evaluaron los frotis de sangre a los 7, 9 y 11 días después de la exposición. La pbCSP indica el antígeno de P. berghei completo y NP el antígeno de nucleoproteína del virus de la gripe (utilizado como antígeno de referencia). La primera inmunización de ratones del grupo A fue con el vector con ADN de plásmido que expresa a beta-galactosidasa pero no al antígeno del paludismo.
En un experimento adicional mostrado en la Tabla 8, se inmunizaron ratones con vacuna de ADN que codifica la proteína CS de P. berghei y se suministró una dosis de refuerzo en (i) MVA recombinante que codifica a este antígeno; (ii) virus de vacuna WR recombinante que codifica al mismo antígeno o (iii) virus de NYVAC (COPAK) recombinante que codifica al mismo antígeno del paludismo, todos a 10^{6} ffu/pfu. Se observó un grado elevado y estadísticamente significativo de protección al suministrar una dosis de refuerzo con NYVAC recombinante (80%) ó MVA recombinante (66%). Se observó un nivel bajo y no significativo de protección (26%) al suministrar una dosis de refuerzo con el virus de vacuna recombinante WR (Tabla 9). El refuerzo con MVA y NYVAC proporcionó cada uno significativamente más protección que el refuerzo con WR (P = 0,03 y P = 0,001 respectivamente). Estos datos reenfatizan que las cepas de poxvirus no replicantes son mejores agentes de refuerzo para inducir grandes niveles de protección.
TABLA 9 Influencia de las diferentes cepas de vacuna recombinante en la protección
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Tabla 9 Resultados de experimentos de exposición utilizando diferentes regímenes de inmunización de ADN de plásmido y recombinantes de vacuna incompetente para replicación como inmunización de refuerzo. Se utilizaron ratones BALB/c en todos los casos. Las dosis de inmunización fueron de 50 \mug de ADN de plásmido ó 10^{6} ffu/pfu de MVA recombinante o vacuna natural recombinante (WR) o NYVAC recombinante. El intervalo entre las inmunizaciones 1 y 2 fue de 23 días. Las exposiciones se llevaron a cabo a los 28 días después de la última inmunización mediante inyección intravenosa de 2000 esporozoítos de P. berghei y se evaluaron los frotis de sangre a los 7, 9 y 11 días después de la exposición. PbCSP indica el antígeno de P. berghei completo y NP el antígeno de la nucleoproteína del virus de la gripe (utilizado como antígeno de referencia). La inmunización de referencia fue con un vector con ADN de plásmido que expresa a beta-galactosidasa seguido de MVA.NP.
Vías alternativas para respuestas inmunitarias de refuerzo con MVA recombinante
La inyección intravenosa de MVA recombinante no es una vía preferida para inmunizar seres humanos y no es factible en inmunizaciones en masa. Por consiguiente se probaron la inmunogenicidad y la eficacia protectora en diferentes vías de refuerzo con MVA.
Se administraron dosis de sensibilización a ratones con ADN de plásmido por vía intramuscular. Dos semanas más tarde se administraron dosis de refuerzo con MVA por las siguientes vías: intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.) e intradérmica (i.d.). Dos semanas después se determinaron estos linfocitos T CD8+ específicos para el péptido de refuerzo mediante un análisis ELISPOT. La vía más eficaz que produjo los niveles más elevados fueron la inoculación i.v. y la i.d. de MVA. Las demás vías proporcionaron respuestas de moderadas a escasas (Figura 12).
La Figura 12 muestra las frecuencias de los linfocitos T CD8+ específicos para el péptido siguiendo diferentes vías de refuerzo con MVA. Los resultados se muestran como el número de células formadoras de manchas (SFC) por millón de esplenocitos. Se administró dosis de sensibilización a ratones con ADN de plásmido y dos semanas más tarde se reforzó con MVA por las vías indicadas. El número de esplenocitos específicos para el péptido SYIPSAEKI [SEC ID nº: 67] se determinó por análisis ELISPOT con INF-\gamma dos semanas después de la última inmunización. Cada barra representa el número medio de SFC de los tres ratones sensibilizados individualmente.
La administración de dosis de refuerzo por vía i.v. se comparó con la vía i.d. y con la i.m. en un experimento de exposición. La vía i.d. proporcionó grandes niveles de protección (80% de protección). En el grupo de animales a los que se administró dosis de refuerzo vía i.m., se protegieron el 50% de los animales. La protección completa se consiguió con el refuerzo de MVA administrado por i.v. (Tabla 10)
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TABLA 10
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Tabla 10 Resultados de experimentos de exposición utilizando diferentes vías de inmunización por refuerzo con MVA. Se administraron dosis de sensibilización a animales por inyección intramuscular de ADN de plásmido y dos semanas más tarde se administró un refuerzo con el MVA recombinante indicado (10^{6} ffu/ratón) por las vías indicadas. Se sensibilizaron los ratones 16 días después de la última inmunización con 2000 esporozoítos de P. berghei y se identificó la parasitemia en la etapa sanguínea a los 8 y 10 días después de la exposición. El epítopo indica el segmento HM de polipéptido.
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Rutas alternativas de sensibilización con ADN: Utilización de un cañón de genes para administrar dosis de sensibilización a linfocitos T CD8+ específicos para el péptido
La administración mediante cañón de genes se describe con detalle, por ejemplo en Eisenbraun et al. DNA Cell Biol. 1993, 12: 791-797 y Degano et al. Vaccine 1998, 16: 394-398.
Los experimentos de exposición al paludismo en ratón descritos hasta la fecha utilizando ADN de plásmido para sensibilizar una respuesta inmunitaria utilizó inyección intramuscular de ADN de plásmido. La administración intradérmica de ADN de plásmido utilizando un dispositivo biolítico es otra vía para sensibilizar respuestas específicas de CTL. El ADN de plásmido se recubre de partículas doradas y se administra por vía intradérmica mediante un cañón de genes. Se inmunizaron grupos de ratones (n = 10) tres veces con intervalos de dos semanas solo con el cañón de genes (4 \mug/inmunización), se inmunizó dos veces mediante cañón de genes seguido de un MVA por vía intravenosa. Se administró una dosis de refuerzo de PbCSP o se inmunizó por vía intramuscular con 50 \mug de pTH.PbCSP y dos semanas más tarde se administró un refuerzo de MVA.PbCSP por vía intramuscular. Dos semanas después de la última inmunización se sensibilizaron los animales con 2000 esporozoítos para evaluar la eficacia protectora de cada régimen de inmunización. En el grupo que recibió el refuerzo de MVA intravenoso, después de dos inmunizaciones con cañón de genes uno de cada diez animales desarrolló parasitemia en la etapa sanguínea (90% de protección). Se observó protección completa al administrar dosis de sensibilización de ADN por vía intramuscular seguida de dosis de refuerzo i.v. con MVA. Se infectaron siete de cada 10 animales que se inmunizaron tres veces con el cañón de genes. (30% de protección) (Tabla 11).
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TABLA 11
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Tabla 11 Resultados de experimentos de exposición comparando diferentes vías de sensibilización con ADN (por vía intradérmica mediante cañón de genes frente a inyección con aguja intramuscular). Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c (n = 10) tal como se indica. En cada inmunización con cañón de genes se administró por vía intraepidérmica 4 \mug de ADN de plásmido. Para la inmunizaciones i.m. se inyectaron 50 \mug de ADN de plásmido. Veinte días después de la última inmunización se sensibilizaron los ratones como se describió anteriormente.
Ratones C57BL/6 muy sensibles están protegidos
Los ratones C57BL/6 son muy sensibles a la exposición a esporozoítos de P. berghei. Se inmunizaron ratones C57BL/6 utilizando el régimen de sensibilización-refuerzo con ADN-MVA con antígenos PbCSP y PbTRAP pre-eritrocíticos y se sensibilizaron con 200 ó 1000 esporozoítos infecciosos por ratón. (Doscientos esporozoítos corresponden a más del doble de la dosis necesaria para producir infección en esta cepa). Los diez ratones sensibilizados con 200 esporozoítos presentaron inmunidad estéril. Incluso en el grupo sensibilizado con 1000 esporozoítos, se protegió el 60% de los ratones (Tabla 12). Todos los ratones C57BL/6 sin tratamiento previo fueron inyectados después de la exposición.
TABLA 12 Protección de ratones C57BL/6 a partir de la exposición a esporozoítos
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Tabla 12 Resultados de un experimento de exposición utilizando ratones C57BL/6. Se inmunizaron animales con PbCSP y PbTRAP utilizando ADN seguido de régimen sensibilización-refuerzo con MVA. Catorce días más tarde, se sensibilizaron los ratones con esporozoítos de P. berghei y tal como se indica.
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Ejemplo 4 Eficacia protectora del régimen de sensibilización con ADN/refuerzo con MVA en dos modelos adicionales de enfermedad en ratones
Siguiendo estudios de inmunogenicidad, se determinó la eficacia protectora del régimen de sensibilización con ADN/refuerzo con MVA en dos modelos de exposición murina adicionales. Los dos modelos de exposición fueron el modelo tumoral P815 y el modelo de exposición al virus A de la gripe. En ambos sistemas de modelo el CTL ha demostrado mediar la protección.
Exposiciones tumorales P815
Se inmunizaron grupos de ratones DBA/2 (n = 10) con una combinación de ADN seguida de MVA que expresa un segmento de epítopo tumoral o el segmento del epítopo HM. Dos semanas después de la última inmunización se administró por vía intravenosa a los ratones 10^{5} células P815. Después de esta exposición se controló en los ratones regularmente el desarrollo de indicios relacionados con el tumor y la supervivencia.
La Figura 13 muestra la tasa de supervivencia de los dos grupos de ratones. Sesenta días después de la exposición ocho de cada diez ratones estaban vivos en el grupo inmunizado con el segmento del epítopos tumorales. En el grupo inmunizado con el segmento dell epítopo HM sólamente sobrevivieron 2 animales. Este resultado es estadísticamente significativo: 2/10 frente a 8/10 chi-cuadrado = 7,2. P = 0,007. El comienzo de la muerte en los grupos de animales inmunizados con el segmento del epítopo tumoral se retrasa en comparación con los grupos inmunizados con el segmento del epítopo HM.
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Exposiciones al virus de la gripe
Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c con tres inmunizaciones mediante cañón de genes con ADN de plásmido, dos inyecciones intramusculares de ADN de plásmido, una inyección i.m. de ADN seguida de una i.v. de refuerzo con MVA.NP o de dos inmunizaciones mediante cañón de genes seguidas de una i.v. de refuerzo con MVA.NP. El ADN de plásmido y el MVA recombinante expresaron la nucleoproteína del virus de la gripe. Dos semanas después de la última inmunización se administró por vía intranasal a los ratones 100 HA de virus A/PR/8/34 de gripe. Se controló la supervivencia en los animales cada día después de la exposición.
Se observó la protección completa en los siguientes grupos de animales:
\bullet
dos inmunizaciones mediante cañón de genes con ADN seguidas de una i.v. de refuerzo con MVA.NP,
\bullet
una inyección i.m. de ADN seguida de una i.v. de refuerzo con MVA.NP,
\bullet
dos inyecciones i.m. de ADN.
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En el grupo de animales inmunizados tres veces mediante cañón de genes, sobrevivió el 71% de los animales (5/7) y esta diferencia con relación al grupo de referencia no fue estadísticamente significativa (P > 0,05). En el grupo sin tratamiento previo sobrevivió el 25% de los animales (Figura 14) y este grupo se diferenció de forma significativa (P < 0,05) para los dos grupos totalmente protegidos.
La Figura 14 muestra los resultados de un experimento de exposición al virus de la gripe. Se inmunizaron ratones BALB/c tal como se indica. GG = inmunizaciones mediante cañón de genes, im = inyección intramuscular, iv = inyección intravenosa. La supervivencia de los animales se controló cada día después de la exposición.
En unos segundos grupos experimentales se inmunizaron i.v. 10 ratones BALB/c con MVA.NP solo, tres veces mediante cañón de genes, dos veces mediante cañón de genes seguido de un refuerzo con MVA.NP y dos inyecciones i.m. de V1J-NP seguido de un refuerzo con MVA.NP. Dos semanas después de la última inmunización se administró a los ratones 100 unidades de HA de virus A/PR/8/34.
Se observó una protección completa y estadísticamente significativa en los siguientes grupos de animales:
\bullet
dos inmunizaciones mediante cañón de genes seguidas de un refuerzo con MVA.NP,
\bullet
dos inyecciones i.m. de V1J-NP seguidas de un refuerzo con MVA.NP.
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En el grupo que recibe una i.v. de MVA.NP, sobrevivieron el 30% (3 de cada 10) de los animales. En el grupo inmunizado con una vacuna de ADN administrada tres veces mediante cañón de genes, se protegieron el 70% de los animales, pero esta protección no fue significativamente diferente de los controles sin tratamiento previo. En este experimento de exposición el 40% (4 de cada 10) de los animales sin tratamiento previo sobrevivió a la exposición.
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Ejemplo 5 Estudios de inmunogenicidad en primates no humanos Inmunogenicidad y eficacia protectora del régimen sensibilización-refuerzo en primates no humanos
Para demostrar que la fuerte inmunogenicidad del régimen de sensibilización con ADN/refuerzo con MVA observado en los ratones se traduce en una fuerte inmunogenicidad en los monos, se ensayó el régimen en macacos. La vacuna consistió en un segmento de epítopos de CTL procedentes de secuencias de HIV y SIV (Figura 2), en ADN o MVA de plásmido, ADN.H y MVA.H indicados respectivamente. La utilización de epítopos de CTL definidos en un segmento de poliepítopo permite probar los CTL específicos para SIV en macacos. Debido a la restricción MHC de clase I de los péptidos antigénicos, se identificó en los macacos su haplotipo MHC de clase I y se seleccionaron los animales positivos a Mamu-A*01 para los experimentos descritos.
\newpage
Se inmunizaron tres animales (CYD, DI y DORIS) siguiendo este régimen de inmunización:
semana 0
ADN (8 \mug, i.d., cañón de genes)
semana 8
ADN (8 \mug, i.d., cañón de genes)
semana 17
MVA (5 \times 10^{8} pfu, i.d.)
semana 22
MVA (5 \times 10^{8} pfu, i.d.)
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Se extrajo sangre procedente de cada animal las semanas 0, 2, 5, 8, 10, 11, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24 y 25 del experimento. Se controló la producción de CTL en los animales utilizando dos procedimientos diferentes. Los PBMC aislados de cada extracción sanguínea se volvieron a estimular in vitro con un péptido codificado en el segmento del epítopo y se determinó su capacidad para reconocer células diana autólogas cargadas de péptido en un análisis de citotoxicidad por liberación de cromo. Además, los PBMC recién aislados se tiñeron para los linfocitos T CD8+ específicos para el antígeno utilizando tetrámeros.
Después de dos inmunizaciones mediante cañón de genes se detectaron niveles muy bajos de CTL utilizando la tinción del tetrámero (Figura 15). Dos semanas después del primer refuerzo con MVA, los tres animales desarrollaron CTL específicos para el péptido detectados mediante teñido con tetrámero (Figura 15). Esto quedó reflejado mediante la detección de respuestas moderadas de CTL siguiendo la reestimulación in vitro (Figura 16, semana 19). El segundo refuerzo con MVA.H produjo niveles muy elevados de CD8+, linfocitos T específicos para el antígeno (Figura 15) y asimismo niveles muy elevados de linfocitos T específicos para el péptido (Figura 16, semana 23).
La Figura 15 muestra la detección de los linfocitos T CD8+ limitados por MHC de clase I específicos para SIV utilizando tetrámeros. Se inmunizaron tres macacos positivos a Mamu-A*A01 con ADN de plásmido (cañón de genes) seguido de refuerzo con MVA tal como se indicó. Se identificaron las frecuencias de Mamu-A*A01/linfocitos T positivos con CD8 doble siguiendo el análisis FACS. Cada barra representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos para el epítopo de Mamu-A*01/gag en el punto de tiempo indicado. Un porcentaje de linfocitos T CD8 corresponde aproximadamente 5000/10^{6} linfocitos de sangre periférica. Por lo tanto los niveles de linfocitos T CD8 específicos para el epítopo en la sangre periférica de estos macacos son por lo menos tan elevados como los niveles observados en los bazos de ratones inmunizados y protegidos en los estudios de paludismo.
La Figura 16 muestra la producción de CTL en macacos siguiendo la inmunización con ADN/MVA. Se aislaron PBMC de tres macacos diferentes (CYD, DI y DORIS) las semanas 18, 19 y 23 y se volvieron a estimular con péptido CTPYDINQM [SEC ID nº: 54] in vitro. Después de dos reestimulaciones con el péptido CTPYDINQM [SEC ID nº: 54] se probó la actividad lítica de los cultivos en células diana autólogas pulsadas por péptido. Se observó fuerte actividad de CTL.
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Ejemplo 6 Inmunogenicidad en estudios de exposición en chimpancés
Para demostrar que un régimen similar de inmunización inicial con ADN de plásmido y posterior inmunización con MVA recombinante puede ser efectivo frente al paludismo de Plasmodium falciparum en primates superiores se llevó a cabo una inmunización y un estudio de exposición en dos chimpancés. El chimp H1 recibió una inmunización inicial con 500 \mug de un plásmido que expresa TRAP de Plasmodium falciparum procedente del promotor CMV sin intrón A, CMV-TRAP. El chimp H2 recibió la misma dosis de CMV-LSA-1, que expresa la porción C-terminal del gen LSA-1 de P. falciparum. Ambos chimpancés recibieron tres inmunizaciones más durante los siguientes 2 meses, pero con tres plásmidos en cada inmunización. H1 recibió CMV-TRAP como anteriormente, más pTH-TRAP, que expresa a TRAP utilizando el promotor de CMV con intrón A, que conduce a un nivel superior de expresión. H1 recibió además RSV-LSA-1, que expresa la porción C-terminal de LSA-1 procedente del promotor RSV. H2 recibió CMV-LSA-1, pTH-LSA-1 y RSV-TRAP en la segunda, tercera y cuarta inmunizaciones. La dosis de cada plásmido fue siempre de 500 \mug.
Se descubrió posteriormente que los plásmidos de RSV no expresaban los antígenos contenidos dentro de ellos, por eso H1 sólamente se inmunizó con plásmidos que expresan TRAP y H2 con plásmidos que expresan LSA-1.
Durante y después de estas inmunizaciones con ADN se realizaron ensayos de respuestas inmunitarias celulares en varios puntos de tiempo, siendo realizado el últim0 ensayo a los tres meses después de la cuarta inmunización con ADN, pero no se detectaron linfocitos T específicos para el paludismo en los análisis por ELISPOT o en los análisis de CTL de linfocitos T CD8+.
Ambos animales se inmunizaron posteriormente con tres dosis de 10^{8} ffu de un virus de MVA recombinante que codifica el antígeno de TRAP de P. falciparum durante un periodo de 6 semanas. Precisamente antes y también después de la tercera inmunización con MVA recombinante las respuestas del linfocito T al antígeno de TRAP fueron detectables en ambos chimpancés utilizando un análisis ELISPOT para la proteína TRAP completa unida a lechos de látex. Este análisis detecta tanto las respuestas del linfocito T CD4+ como las del CD8+. Las respuestas específicas de T CD8+ se investigaron con un segmento de péptidos cortos de 8 a 11 aminoácidos en ambos chimpancés inmunizados. Tal análisis de respuestas de linfocito T CD8+ indicó que los linfocitos T CD8+ eran detectables sólamente en el chimpancé H1. El epítopo diana de estos linfocitos T CD8+ fue un péptido de 11 aminoácidos procedente de TRAP, de tr57, o de la secuencia KTASCGVWDEW [SEC ID nº: 78]. Estos linfocitos T CD8+ de H1 tenían actividad lítica contra las células diana autólogas pulsadas con el péptido tr57 y contra las células diana autólogas infectadas con el virus PfTRAP-MVA recombinante. Se detectó una gran frecuencia del precursor de estos linfocitos T CD8+ específicos de aproximadamente 1 por 500 linfocitos en la sangre periférica de este chimpancé H1 utilizando un análisis ELISPOT dos meses después de la inmunización final con MVA. No se detectó claramente ninguna respuesta de linfocito T CD8+ específica en el chimpancé H2, que no fue sensibilizado con un ADN de plásmido que expresa a TRAP.
Dos meses después se realizó la tercera exposición de inmunización con PfTRAP-MVA de H1 y H2 con 20.000 esporozoítos, un número que anteriormente se ha observado que proporciona fehacientemente infección detectable en la etapa sanguínea en chimpancés, 7 días después de la exposición (Thomas et al. 1994 y datos no publicados). Se realizó la exposición a la cepa NF54 de Plasmodium falciparum. Esto es importante debido a que la secuencia de TRAP en el ADN de plásmido y en el MVA recombinante procede de la cepa T9/96 de P. falciparum que tiene numerosas diferencias de aminoácidos en el alelo TRAP de NF54 (Robson et al. 1990). Por lo tanto, esta exposición a esporozoítos se llevó a cabo mejor con una cepa heteróloga que con una homóloga de parásito. En los parásitos del chimpancé H2 fueron detectables en la sangre periférica tal como era de esperar 7 días después de la exposición a esporozoítos utilizando detección del cultivo de parásito in vitro. Sin embargo, en H1 se retrasó durante tres días la aparición de parásitos de la etapa sanguínea en el cultivo procedente de las muestras sanguíneas del día 7, de acuerdo con algún efecto protector inmunitario contra la infección de la etapa en el hígado. En los estudios del candidato anterior de las vacunas del paludismo en los seres humanos un retraso en la aparición de los parásitos en la sangre periférica se ha estimado que corresponde a una reducción sustancial en la densidad de parásitos en el hígado (Davis et al. 1989). Por lo tanto el chimpancé H1, inmunizado en primer lugar con ADN de plásmido TRAP de P. falciparum y posteriormente con el mismo antígeno expresado mediante un virus de MVA recombinante presentó una fuerte respuesta al linfocito T CD8+ y una evidencia de alguna protección a partir de la exposición a esporozoítos heterólogos.
Exposición
Estos ejemplos demuestran un nuevo régimen de inmunización contra el paludismo que produce grandes concentraciones de linfocitos T CD8+ protectores en modelos de roedor de infección por paludismo humano. Asimismo se demuestra una protección completa sin precedentes contra la exposición a esporozoítos utilizando subunidades de vacunas (36 de cada 36 ratones protegidos en la Tabla 6 utilizando sensibilización con ADN y refuerzo con MVA con el epítopo de CS que contienen las vacunas). La producción de respuestas inmunitarias protectoras utilizando el régimen de sensibilización con ADN/refuerzo con MVA se demostró en dos modelos de ratón adicionales del modelo A de la gripe por infección vírica y de cáncer (modelo tumoral P815). De forma más importante para las vacunas para utilización en seres humanos este régimen de inmunización es también inmunógeno en gran medida para los linfocitos T CD8+ en primates. Se produjeron fuertes CTL específicos para SIV-gag en 3 de cada 3 macacos con ADN y MVA de plásmido que expresan segmentos de epítopo. Los niveles producidos son comparables a los observados en animales infectados por SIV. Los datos procedentes de estos estudios en chimpancés indican que el mismo régimen de inmunización puede producir una fuerte respuesta de linfocitos T CD8+ contra P. falciparum en primates superiores con alguna evidencia de protección contra la exposición al esporozoíto de P. falciparum.
Se ha expuesto anteriormente que los Ty-VLP producen niveles satisfactorios de respuestas de linfocito T CD8+ contra el paludismo del roedor de P. berghei (Allsopp et al. 1995) pero esta construcción sola no es protectora. Se ha observado que la inmunización posterior con MVA recombinante refuerza la respuesta de los linfocitos T CD8+ muy sustancialmente y genera un nivel elevado de protección (Tabla 7).
No se ha evaluado anteriormente la eficacia en los virus de MVA recombinante tal como las vacunas contra el paludismo. El MVA recombinante solo no fue significativamente protector ni fue sensibilizador con el MVA recombinante después de una segunda inmunización con ADN de plásmido recombinante. Sin embargo, una segunda inmunización con el MVA recombinante después de una inmunización inicial con Ty-VLP o con ADN de plásmido proporcionó niveles impresionantes de protección. Se ha utilizado satisfactoriamente virus de MVA no recombinante para vacunar miles de seres humanos contra la viruela y parece que presenta un perfil de seguridad excelente. Las bases moleculares del aumento de la seguridad y de la inmunogenicidad de esta cepa de virus de vacuna están siendo aclaradas mediante estudios moleculares detallados (Meyer et al. 1991; Sutter et al. 1994).
El ADN de plásmido se ha probado anteriormente como vacuna contra el paludismo para el paludismo del roedor P. yoelii. Se observan altos niveles de protección, pero no completos en algunas cepas, pero en otras cepas de ratones observa poca o ninguna protección incluso después de múltiples inmunizaciones (Doolan et al. 1996). Aunque se ha propuesto ADN de plásmido como un procedimiento de inmunización contra P. falciparum, no se ha obtenido éxito anteriormente. La evidencia proporcionada en la presente memoria es la primera evidencia al demostrar que este ADN de plásmido de que se puede utilizar en un régimen de inmunización para producir inmunidad protectora contra el parásito P. falciparum del paludismo humano.
Un régimen similar de inmunización al régimen demostrado en la presente memoria se puede esperar que produzca inmunidad protectora útil contra P. falciparum en seres humanos. Debería observarse que cinco de las construccones de vacuna empleadas en estos estudios para producir inmunidad protectora en roedores o en chimpancés contienen secuencias de P. falciparum y por lo tanto se podrian utilizar para inmunización humana contra P. falciparum. Éstas son: 1. La vacuna de ADN del plásmido TRAP de P. falciparum. 2. El virus MVA recombinante de TRAP de P. falciparum. 3. El Ty-VLP que codifica un segmento de epítopos de numerosos epítopos de P. falciparum, así como el epítopo simple de CTL de P. berghei. 4. El ADN de plásmido que codifica el mismo segmento de epítopos que 3. 5. El MVA recombinante que codifica el segmento mayor de epítopos de HM incluyendo muchos de los epítopos de paludismo en 3 y 4. De forma similar, los ADN y MVA de plásmido que codifican epítopos de HIV para moléculas humanas de clase I se podrían utilizar en un inmunización profiláctica o terapéutica contra la infección por HIV.
Estos estudios han proporcionado evidencia manifiesta de que un nuevo régimen de inmunización secuencial que emplea un poxvirus con replicación alterada o sin replicación como refuerzo es capaz de producir una fuerte respuesta protectora en los linfocitos T CD8+ contra el parásito del paludismo. Estos ejemplos demuestran claramente un aumento sorprendente y sustancial de las respuestas y de la protección del linfocito T CD8+ comparados con las cepas replicantes de los poxvirus. Debido a que no existe ninguna razón para creer que la inmunogenicidad de los epítopos de linfocito T CD8+ procedente del parásito del paludismo se diferenciaría sustancialmente de los epítopos del linfocito T CD8+ en otros antígenos, es de esperar que el régimen de inmunización descrito en la presente memoria se demostrará eficaz en la generación de respuestas del linfocito T CD8+ válidas contra otras enfermedades. La etapa crítica en este régimen de inmunización es la utilización de poxvirus recombinantes sin replicación o con replicación alterada para reforzar una respuesta de CTL preexistente. Se ha demostrado que las respuestas de CTL se pueden sensibilizar utilizando diferentes sistemas de administración de antígeno tal como una vacuna i.d. e i.m. de ADN, un Ty-VLP recombinante, un adenovirus recombinante y esporozoítos irradiados. Esto se basa en los datos presentados sobre la generación de una respuesta de linfocito T CD8+ contra HIV, el virus de la gripe y tumores. Varios ejemplos conocidos de otras enfermedades contra la que es importante la respuesta inmunitaria del linfocito T CD8+ son los siguientes: infección y enfermedad causadas por los virus HIV, herpes simple, herpes zoster, hepatitis C, hepatitis B, gripe, virus de Epstein-Barr, sarampión, dengue y HTLV-1; por las bacterias Mycobacterium tuberculosis y Listeria sp., y por los parásitos protozoarios Toxoplasma y Trypanosoma. La producción de respuestas protectoras de CTL contra el virus A de la gripe se ha demostrado en la Figura 14. Además, es de esperar que el régimen de inmunización descrito en la presente memoria sea válido para la inmunización contra formas de cáncer en las que las respuestas del linfocito T CD8+ desempeña un papel protector. En la Figura 13 se muestra la producción de respuestas protectoras de CTL utilizando el régimen de sensibilización con ADN y de refuerzo con MVA contra los tumores. Ejemplos específicos en seres humanos comprenden el melanoma, el cáncer de mama y el cáncer de colon.
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INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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NOMBRE: ISIS INNOVATION LIMITED
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CALLE: 2 SOUTH PARK ROAD
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CIUDAD: OXFORD
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CÓDIGO POSTAL (ZIP): OX1 3UB
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS Y REACTIVOS PARA VACUNACIÓN
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NÚMERO DE SECUENCIAS: 78
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FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
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TIPO DE MEDIO: Disquete
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SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
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DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: NÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/GB 98/01681
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DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9711957.2
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FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-JUN-1997
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
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(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador del ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..33
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..30
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..48
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..60
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..27
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..48
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..42
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "epítopo codificador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
SITUACIÓN: 1..42
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 229 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
54
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 42
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 44
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 44:
58 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 45:
59 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 46
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 46:
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 47:
61 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 48
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 48:
62 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 49:
63 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 50
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 50:
64 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 51
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 51:
65 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 52
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 52:
66 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 53:
67 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 54
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 54:
68 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 55:
69 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 56
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 56:
70 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 57:
71 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 58
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 58:
72 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 59:
73 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 60
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 60:
74 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 61:
75 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 62
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 62:
76 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 63:
77 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 64
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 64:
78 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 65:
79 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 66
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 66:
80 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 67:
81 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 68
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 68:
82 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 69:
83 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 70:
84 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 71:
85 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 72
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 72:
86 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 73:
87 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 74
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "sensibilizador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGACTCAG ACCATATGGG CTCTCACTCC ATG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "sensibilizador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
88 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "sensibilizador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGACCATA TGTCTCGCTC CGTGGCC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 77
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "sensibilizador de ADN sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGACAAGC TTTTACATGT CTCGATCCCA C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 78
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
PROPIEDADES DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
89

Claims (28)

1. Utilización de
(i)
una composición de sensibilización que comprende una fuente de uno o más epítopos de linfocitos T CD8+ del antígeno diana, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ es un vector no vírico o un vector vírico con replicación alterada o no replicante, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable; y
(ii)
una composición de refuerzo que comprende una fuente de uno o más epítopos de linfocitos T CD8+ del antígeno diana, incluyendo por lo menos un epítopo de linfocitos T CD8+ que es idéntico a un epítopo de linfocitos T CD8+ de la composición de sensibilización, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ es un vector poxvirus recombinante no replicante o con replicación alterada, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable;
para la producción de un kit de vacunación contra una enfermedad causada por un patógeno o contra el cáncer en la que las respuestas de linfocitos T CD8+ desempeñan un rol protector, en la que el kit genera una respuesta inmunológica de linfocitos T CD8+ protectora contra por lo menos un antígeno diana de dicho patógeno o cáncer;
con la condición de que si la fuente de epítopos en (i) es un vector vírico, el vector vírico en (ii) procede de un virus diferente que el virus en (i).
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de sensibilización consiste en ADN o ARN.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la que la fuente de epítopos en la composición de sensibilización es un plásmido con ADN recombinante.
4. Utilización según la reivindicación 2 ó 3, que comprende además GM-CSF como adyuvante para la composición de sensibilización.
5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de sensibilización codifica el antígeno diana.
6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que la fuente de epítopos en la composición de sensibilización codifica un epítopo único de linfocitos T CD8+ o un segmento recombinante de dos o más epítopos de linfocitos T CD8+.
7. Utilización según la reivindicación 1, en la que la fuente de epítopos en la composición de sensibilización es un péptido, polipéptido, proteína, poliproteína o una partícula que comprende dos o más epítopos de linfocitos T CD8+, presentes en un segmento recombinante de epítopos de linfocitos T CD8+ o en un antígeno diana.
8. Utilización según la reivindicación 7, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de sensibilización es una partícula proteica recombinante tal como una partícula análoga al virus Ty.
9. Utilización según la reivindicación 1, en la que la fuente de epítopos en la composición de sensibilización es un vector de adenovirus recombinante no replicante.
10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de refuerzo es un vector del virus de vacuna recombinante.
11. Utilización según la reivindicación 10, en la que el vector del virus de vacuna recombinante es de la cepa del virus de vacuna consistente en el Virus Ankara Modificado (MVA), o una cepa derivada de éste.
12. Utilización según la reivindicación 10, en la que el vector del virus de vacuna recombinante es de la cepa NYVAC.
13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la fuente de epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de refuerzo es la viruela aviar o ALVAC.
14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para generar una respuesta inmunitaria protectora contra un patógeno del paludismo tal como el Plasmodium falciparum.
15. Utilización según la reivindicación 14, en la que los epítopos de linfocitos T CD8+ en, o codificados por, la composición de sensibilización comprenden uno o más epítopos de paludismo seleccionados de entre las secuencias de aminoácidos de las SEC ID n^{os} 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 y 34.
16. Utilización según la reivindicación 15, en la que los epítopos de linfocitos T CD8+ en la composición de sensibilización comprenden la totalidad de dichos epítopos del paludismo.
17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para generar una respuesta inmunitaria contra el HIV.
18. Utilización según la reivindicación 17, en la que los epítopos de linfocitos T CD8+ en, o codificados por, la composición de sensibilización comprenden uno o más epítopos de HIV seleccionados de entre las secuencias de aminoácidos de las SEC ID n^{os} 42 a 64.
19. Utilización según la reivindicación 18, en la que los epítopos de linfocitos T CD8+ en, o codificados por, la composición de sensibilización comprenden la totalidad de dichos epítopos del HIV.
20. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición de sensibilización comprende una proteína o partícula recombinante que comprende por lo menos un epítopo o antígeno del patógeno o del cáncer, y la composición de refuerzo comprende un vector MVA recombinante que codifica el mismo epítopo o antígeno.
21. Segmento de epítopos recombinantes que comprende los epítopos de los linfocitos T CD8+ de las secuencias de aminoácidos SEC ID n^{os} 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 y 34, y que comprende además los epítopos de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID n^{os} 26, 28, 36, 38 y 40.
22. Partícula análoga al virus Ty recombinante, que comprende el segmento de epítopos según la reivindicación 21, para inmunizar un animal contra el paludismo.
23. Plásmido con ADN recombinante o poxvirus recombinante no replicante o con replicación alterada que codifica el segmento de epítopos según la reivindicación 21, para inmunizar un animal contra el paludismo.
24. Poxvirus de replicación alterada que codifica el antígeno de P. falciparum TRAP, para la inmunización de un animal contra el paludismo, en el que el virus es la cepa de vacuna consistente en el Virus Ankara Modificado (MVA).
25. Poxvirus recombinante según la reivindicación 23, en el que el virus es la cepa de vacuna consistente en el Virus Ankara Modificado (MVA).
26. Segmento de epítopos recombinantes que comprende los epítopos de linfocitos T CD8+ de las secuencias de aminoácidos de SEC ID n^{os} 42 a 64.
27. Polipéptido recombinante que comprende un antígeno proteico completo o sustancialmente completo de P. falciparum y un segmento de dos o más epítopos de linfocitos T CD8+ del paludismo seleccionados de entre las secuencias de aminoácidos de SEC ID n^{os} 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 y 34.
28. Polipéptido recombinante según la reivindicación 27, en el que el antígeno proteico completo o sustancialmente completo es el TRAP.
ES98928434T 1997-06-09 1998-06-09 Reactivos para vacunacion que generan una respuesta inmunitaria de los linfocitos t cd8. Expired - Lifetime ES2189185T5 (es)

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