WO2007102326A1 - アデノウイルス５型／３５型ベクターとワクシニアウイルスｍｖａベクターとの併用による強力な免疫誘導 - Google Patents

アデノウイルス５型／３５型ベクターとワクシニアウイルスｍｖａベクターとの併用による強力な免疫誘導 Download PDF

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recombinant viral
structural gene
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Masaru Shimada
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    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an anti-HIV comprising a combination of a recombinant virus vector vaccine using an adenochimeric virus type 5 and Z35 type vector and a recombinant virus vector ⁇ ctin using a vaccinia virus MVA vector.
  • drugs Regarding drugs.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HAART Highly Active Anti-retrovial Therapy
  • Non-Patent Document 1 By replacing the fiber of adenovirus type 5 with one derived from adenovirus type 35, the present inventors are effective in patients with a neutralizing antibody against adenovirus type 5 and a vaccine with low liver damage.
  • Patent document 1 non-patent [0005] The effectiveness of vaccines using modified vaccinia virus Ankara (MVA) as another viral vector has been reported (Non-Patent Documents 3-5).
  • Japanese Literature 1 Vogels R et al. Replication-deficient human adenovirus type 35 vecto rs for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of pre existing adenovirus immunity. J Virol 2003; 77: 82b3— 8271.
  • Non-Patent Document 2 K-Q Xin et al., Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777
  • Non-Patent Document 3 Robinson, H. et al., Nat. Med. 5: 526-534, 1999
  • Non-Patent Document 4 Amara, R.R.et al., Science 292: 69-74, 2001
  • Non-Patent Document 5 Amara, R.R. et al., Virology 343 (2005) 246-255
  • Patent Document 1 International Publication No. WO 2005/052165 Pamphlet
  • An object of the present invention is to provide an effective and inexpensive anti-HIV drug.
  • the inventors of the present invention have described a recombinant virus vector in which an HIV structural gene is inserted into a chimeric virus in which an adenovirus (Ad) type 5 fiber is replaced with an Ad35 type-derived fiber, and a modified virus vector. It was found that a powerful immune response could be induced by immunizing a viral ankara in combination with a recombinant viral vector containing the HIV structural gene. By using different viral vectors, it is possible to reduce the production of antibodies against each virus and to produce a highly immunogenic vaccine with few side reactions.
  • Ad adenovirus
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the HIV structural gene is inserted into a chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35, and the structural gene of HIV is inserted into the modified viral vector Ankara.
  • An anti-HIV drug characterized by comprising a combination with an inserted recombinant viral vector.
  • HIV structural gene force The anti-HIV drug according to claim 1 or 2, which is an env gene and / or a gag gene.
  • the anti-HIV drug according to (4) which is a HIV replication control gene force rev gene.
  • Adenovirus type 5 fiber is replaced with a virus derived from adenovirus type 35.
  • the HIV structural gene is inserted into a chimeric virus, and the HIV structural gene is present in a modified silkworm virus ankara.
  • Adenovirus type 5 fiber is replaced with a virus derived from adenovirus type 35, and the HIV structural gene is inserted into the recombinant viral vector and the modified vaccinia virus Ankara.
  • a method for the treatment and / or prevention of HIV infection comprising administering to a subject an effective amount for treatment and / or prevention of a recombinant viral vector into which is inserted.
  • Recombinant viral vectors or modified cells in which the HIV structural gene is inserted into adenovirus type 5 fiber substituted with a virus derived from adenovirus type 35 Recombinant virus vector in which HIV structural gene is inserted into quasi-virus ankara The method according to (10), wherein the subject is first immunized with one and then boosted with the other (10).
  • a recombinant virus vector in which the HIV structural gene is inserted into a chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35, and a modified vaccinia Use in combination with a recombinant viral vector in which the HIV structural gene is inserted into the viral ankara.
  • FIG. 1 shows a schedule for immunizing mice with a recombinant viral vector.
  • Figure 2 Shows the results of pentamer assembly. This is the result of examining the strength of the ability to induce cellular immunity for each vaccine schedule by measuring the proportion of CD8 + T cells with specific TCR.
  • Figure 3 Shows the results of ICCS assembly. This is the result of examining the strength of the cellular immunity induction ability for each vaccine schedule by measuring the proportion of CD8 + T cells that produce IFN- ⁇ by stimulation with antigenic peptides.
  • FIG. 4 shows the results of in vivo CTL assay. This is the result of examining the strength of the cell-mediated immunity induction ability for each vaccine schedule by measuring the survival rate of target cells presenting the transferred antigenic peptide.
  • FIG. 5 shows a schedule for immunizing monkeys with a recombinant viral vector.
  • the present invention includes a recombinant viral vector in which the HIV structural gene is inserted into a chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35, and the HIV structural gene is inserted into a modified vaccinia virus Ankara.
  • the present invention provides an anti-HIV drug characterized by comprising a combination with a recombinant virus vector.
  • Adenovirus type 5 is preferably non-proliferating. If the recombinant viral vector is non-proliferating, it will not proliferate in vivo after administration and is highly safe. Non-proliferative adenovirus type 5 includes those in which the early gene E1 has been removed and those in which the early genes E1 and E3 have been removed.
  • a gene encoding a fiber protein derived from adenovirus type 35 may be used.
  • the gene encoding the fiber protein derived from adenovirus type 35 and its amino acid sequence are known (Mei, YF et al, Virology 206 (1), 686-689, 1995; Dmitry M. et al, J. Virology, Mar. 2000, vol. 74, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1; Stone, D. et al., Virology, 2003, Vol. 309, 152-156).
  • Fiber protein consists of a shaft and a knob.
  • the fiber protein derived from adenovirus type 35 may be wild-type or mutant. Such mutants include one or several (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1) amino acid sequences of fiber protein derived from adenovirus type 35 (wild type).
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acid residues are deleted, substituted and Z or added, and has the same adhesion to target cells as a fiber protein derived from adenovirus type 35 Can be mentioned.
  • it is encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with a gene encoding fiber protein derived from adenovirus type 35 (wild type), and has the same adhesion to target cells as fiber protein derived from adenovirus type 35.
  • Stringent conditions can be determined by those skilled in the art. Examples of stringent conditions include a condition of reacting at 65 ° C for 12 hours in a solution containing 6 X SSPE, 2 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 0.1 mg / ml salmon testis DNA. .
  • the gene encoding the mutant can be obtained, for example, by site-directed mutagenesis.
  • a gene encoding a fiber protein derived from adenovirus type 35 (hereinafter sometimes referred to as "fiber gene”) is obtained by a known method using a PCR method or the like based on known gene information. Can do.
  • a gene fragment near the adenovirus type 5 fiber gene was connected to both ends of the fiber gene derived from adenovirus type 35.
  • adenovirus type 5 fiber is derived from adenovirus type 35 by homologous recombination.
  • a chimeric virus is generated that replaces the above.
  • Such chimeric viruses are commercially available (pRHSP 5/35 in the Ad generation kit sold by Avior Therapeutics Inc) and are available.
  • HIV structural genes to be inserted into a chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35 include gag gene, pol gene, and env gene.
  • HIV replication control genes that can be inserted into a chimeric virus as needed include the rev gene and the tat gene.
  • Two types of HIV are known, HIV-1 and -2, and HIV-1 is a force that is transmitted worldwide. HIV-2 is ubiquitous in West Africa.
  • the HIV structural gene and replication control gene may be those of any HIV, but are preferably those of HIV-1.
  • the HIV structural gene inserted into the chimeric virus (if necessary, the HIV replication control gene) may be inserted so as to be expressed in the host cell.
  • the gag gene is a gene encoding the core protein of HIV.
  • the pol gene is a gene encoding HIV reverse transcriptase.
  • the env gene is a gene encoding an HIV envelope protein.
  • HIV-1 and -2 may be different from the envelope protein V, and may be a type of HIV envelope protein.
  • HIV-1 is an envelope protein of any subtype that can be classified into subtypes A to J, K, etc., depending on the amino acid sequence of the envelope protein.
  • the rev gene is a gene encoding a rev protein that has the effect of stabilizing the unspliced viral mRNA and transferring the mRNA encoding the viral structural protein to the cytoplasm.
  • the tat gene is a gene encoding a tat protein that causes transcriptional activity of a virus as a transactivity factor.
  • HIV structural genes and replication control genes may be wild-type or mutant.
  • the mutant gene is one or several (preferably 1 to 30, more preferably 1 to: L0, more preferably 1 to 4) in the amino acid sequence of the protein encoded by the wild type gene.
  • a protein encoding a protein having the same function as that of a protein encoded by a wild-type gene which is a protein having an amino acid sequence ability in which 5 amino acid residues are deleted, substituted and Z or added. Examples thereof include DNA that encodes a protein that has a function similar to that of a protein encoded by a wild-type gene and that has been hybridized under stringent conditions with the type gene.
  • Hybridization can be easily performed by those skilled in the art according to a known method such as Molecular Cloning 2 ⁇ Edt., Old bpnng Harbor Laboratory Press (1989). Also, stringent terms The matter can be determined by those skilled in the art. Examples of stringent conditions include, for example, a condition of reacting at 65 ° C for 12 hours in a solution containing 6 X SSPE, 2 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 0.1 mg / ml salmon testis DNA. . Mutant genes can be obtained, for example, by site-directed mutagenesis.
  • the structural gene and the replication control gene of HIV can be obtained by a known method using a PCR method or the like based on known gene information.
  • the HIV structural gene inserted into the chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35 is an anti-HIV drug when inserted into the chimeric virus.
  • the entire region or a part of the region may be used.
  • the HIV structural gene (if necessary, the HIV replication control gene) may be inserted at a certain site of the chimeric virus as long as it does not adversely affect the life cycle of the chimeric virus. It may be inserted at any site corresponding to adenovirus type 5 sites 22-5790.
  • HIV structural genes if necessary, HIV replication control genes
  • these genes and then the poly A gene downstream of a promoter motor such as the CMV promoter or CAG promoter.
  • the expression cassette may further include a replication origin, a drug resistance gene such as an ampicillin resistance gene (a marker indicating that the target gene has been introduced), and the like.
  • a recombinant viral vector in which the structural gene of HIV is inserted into a chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35 should be prepared using a commercially available kit. You can also. For example, in Example 1 described below, a procedure for preparing a recombinant virus vector using an Ad generation kit sold by Avior Thera peutics, Inc. is described, and is therefore referred to. [0026] Recombinant viral vectors in which the structural gene of HIV is inserted into a chimeric virus in which the fiber of adenovirus type 5 is replaced with that derived from adenovirus type 35 are extremely strong. HIV-specific cellular immune responses Can be evoked. In addition, toxicity to the liver is reduced and affinity to rod cells is improved.
  • the modified vaccinia virus ankara is preferably non-proliferative. If the recombinant viral vector is non-proliferating, it will not grow in vivo after administration and is highly safe.
  • Non-propagating vaccinia virus Ankara is a strain obtained by repeated passaging and selection many times. For example, Amara, RR et al, Science 292: 69-74 (2001); Amara, RR et al, J. Viol. 76: 7625-7631 (2002); Robinson, H. et al "Nat. Med. 5: 526-534 (1999).
  • HIV structural genes to be inserted into the modified vaccinia virus Ankara include those described above.
  • HIV replication control genes that can be inserted as needed may include those described above.
  • the HIV structural gene (and, if necessary, the replication control gene) is inserted into a modified quix virus ankara for expression in the host cell.
  • the HIV structural gene inserted into the modified vaccinia virus Ankara (if necessary, the replication control gene), as long as it is effective as an anti-HIV drug when inserted into the modified vaccinia virus Ankara It may or may not be part of it.
  • the structural gene of HIV may be inserted at any site in the modified vaccinia virus ankara, as long as it does not adversely affect the life cycle of the modified vaccinia virus ankara!
  • the thymidine kinase (TK) gene site It is good to be inserted into.
  • Recombinant viral vectors in which the HIV structural gene is inserted into a modified vaccinia virus Ankara are known, Amara, R.R. et al., Science 292: 69-74 (2001); Amara, R.
  • the recombinant virus vector may be dissolved in a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc., and sterilized by filtration with a filter or the like, if necessary, and then administered to a subject by injection.
  • a buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • This solution also contains additives (eg, inactivators, preservatives, adjuvants , Emulsifier, etc.) may be added.
  • the recombinant viral vector can be administered intravenously, intramuscularly, peritoneally, subcutaneously, intradermally, or may be administered nasally or orally.
  • the dose, frequency and frequency of administration of the recombinant viral vector vary depending on the subject's symptoms, age, body weight, administration method, dosage form, etc., but usually, for example, 10 9 to 10 13 virus particles per adult
  • a recombinant virus vector or a modified vaccinia virus ankara in which an HIV structural gene is inserted into a chimeric virus in which an adenovirus type 5 fiber is replaced with an adenovirus type 35 fiber.
  • One of the recombinant viral vectors with the HIV structural gene inserted into the V is the first immunization of the subject, followed by a booster immunization with the other.
  • the initial immunization is preferably a recombinant adenochimeric virus vector or a recombinant vaccinia virus ankara! /, Or may be offset! /.
  • the interval between the initial immunization and the booster immunization is suitably about 1 to 3 months, and preferably about 2 months.
  • a single booster is not effective enough, it should be further boosted by one or more booster immunizations at intervals of about 1 to 3 months, preferably about 2 months. It is good to do.
  • the same type of recombinant viral vector may be used, or different types of recombinant viral vectors may be used.
  • the present invention is not limited to this administration method.
  • the modified vaccinia virus Ankara the HIV structural gene is inserted, and the recombinant viral vector may be administered at the same time.
  • the thread-replaceable virus vector may be further used in combination with a reverse transcriptase inhibitor and Z or a protease inhibitor.
  • reverse transcriptase inhibitors include azidothymidine (AZT), didanosine (ddl), lambidine (3TC), nevirapine (NVP), and the like.
  • Professional Examples of thease inhibitors include indinavir (IDV), saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), nelfinavir (NFV), and tenofovir (PMPA). Those used in Highly Active Anti-retroviral Therapy (HAART) are preferred.
  • reverse transcriptase inhibitors examples include azidothymidine (AZT), didanosine (ddl), lambmidine (3TC), nevirapine (NVP) and the like.
  • protease inhibitors include indinavir (IDV), saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), and nelfinavir (NFV). Those used in Highly Active Anti-retroviral Therapy (HAART) are preferred.
  • a reverse transcriptase inhibitor and a Z or protease inhibitor may be administered to a subject at least once before, after or simultaneously with administration of the recombinant viral vector.
  • the reverse transcriptase inhibitor and Z or protease inhibitor are administered about 1 to 3 months, preferably about 2 months before the administration of the recombinant virus vector.
  • the doses of reverse transcriptase inhibitor and Z or protease inhibitor are the “Anti-HIV Therapeutic Guidelines” (FY2003, Ministry of Health, Labor and Welfare's Grant-in-Aid for Scientific Research on AIDS Research Research Group on the Development of Medical System for HIV Infectious Diseases 2004 (March) is recommended.
  • adenovirus type 5 Recombinant virus vector in which HIV structural gene is inserted into a chimeric virus in which the fiber is replaced with adenovirus type 35 (for example, 10 9 to 10 13 virus particles once).
  • a recombinant viral vector in which the HIV structural gene is inserted into a modified quasi-virus ankara is administered (for example, 10 8 to 10 1Q pfo once). If the effect is determined to be insufficient, repeat administration of the recombinant viral vector.
  • the recombinant virus vector may be used in combination with other vaccines such as a DNA vaccine.
  • other vaccines are administered to the subject at least once before, after, or concurrently with the administration of the recombinant viral vector.
  • Other vaccines include DNA vaccines containing the rev and env genes of HIVIIIB, a subtype B HIV strain (pCAGrev / en V, Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5: 609-617 ) And the like.
  • the dose of DNA vaccine is suitably 5-30 mg, preferably 10-20 mg.
  • a schedule start administration of reverse transcriptase inhibitor and z or protease inhibitor (eg, tenofovir 20-30 mg / kg / day once a day) 0, 1 month, 2 months later, DNA Vaccine was administered by intramuscular injection (for example, pCAGrev / env 5-30 mg), and one month after the completion of DNA-cutin administration, the fiber of adenovirus type 5 was replaced with one derived from adenovirus type 35 Recombinant viral vector in which the HIV structural gene is inserted into the chimeric virus is administered (for example, once in the amount of 10 9 to 10 13 viral particles), and then one month later, the modified vaccinia virus Ankara is infected with HIV. Recombinant viral vector in which the structural gene is inserted is administered (for example, once in an amount of 10 8 to 10 1Q pfo). If the effect is determined to be insufficient, repeat administration of the recombinant viral vector.
  • z or protease inhibitor eg,
  • the anti-HIV drug of the present invention which has two types of recombinant viral vectors, can be expected to be effective as a vaccine for HIV treatment and further as a preventive vaccine.
  • E3-deficient non-proliferating adenovirus type 5 fiber is replaced with one derived from adenovirus type 35, and subtype B HIV strain HIVIIIB rev gene and env gene are introduced. It was constructed using an Ad generation kit (Avior Therapeutics Inc., Seattle, WA, USA) (Shayakhmetov DM, et al, J. Virol. 2000; 74: 2567-2583). Briefly, CAG promoter ⁇ HIV rev / env gpl60-polyA, 5.2k bp
  • Sall / Pstl fragment was isolated from pCAGrev / env (Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5: 609-617) o Adenovirus type 5 (Ad5) 22-342 site, 3523- A shuttle plasmid (pLHSP) containing the 5790 site, E. coli ori, and ampicillin metabolite gene was obtained from Avior Therapeutics Inc. (Seattle, WA, USA). A blunt-ended 5.2 kbp fragment was subcloned into the blunt-ended EcoRI site of pLHSP to generate a pLHSP-HIV shuttle plasmid.
  • pLHSP shuttle plasmid
  • This p LHSP-HIV shuttle plasmid is linearized with Pad, and El, E3-deficient chimeric Ad5 / 35 genome and They were also transfected into human embryonic kidney (HEK293) cells by calcium precipitation to produce recombinant virus Ad5 / 35IIIBenv.
  • the El, E3-deficient chimeric Ad5 / 35 genome is a chimeric shuttle plasmid (pR HSP 5/35) in which the fiber gene of adenovirus type 5 is replaced with the fiber gene derived from adenovirus type 35.
  • Ad generation kit Avior Therapeutics Inc., Seattle, WA, USA.
  • Recombinant virus Ad5 / 35IIIBenv was grown in HEK293 cells and purified by repeating the Cs C1 method (Lieber A. et al., J. Virol. 1996; 70: 8944- 8960) twice.
  • Non-proliferative cocoon virus ankara expressing HIV env (MVAIIIBenv) (Amara, RR. Et al "Science 292: 69-74 (2001); Amara, RR et al" J. Viol. 76: 7625- 7631 ( 2002); Robinson, H. et al., Nat. Med. 5: 526-534 (1999)) was provided by Dr. Moss (Laboratory of Viral Diseases, National Institutes of Health, MD).
  • mice Female BALB / c mice (8 weeks old; H-2D d ) were purchased from Japan SLC Inc., Shizuoka, Shizuoka-ken, Japan. After initial immunization of mice with 5xl0 9 vp / ad of Ad5 / 35IIIBenv (in PBS) by im administration, 5xl0 9 vp / mouse Ad5 / 35IIIBenv (in PBS) or lxlO 6 pfo / mouse MV at 4 weeks Booster immunization was performed by im administration with AIIIBenv (in PBS) (Fig. 1). Six weeks after the first immunization, blood was collected from the mice, and the following pentamers (Asjali N.
  • a group that did not receive initial or booster immunization (Negative Control), a group immunized with Ad5 / 35inBenv without the first immunization, a group immunized with MVAIII Benv without the first immunization, or a group immunized with MVAIIIBenv for the first and booster .
  • a pentamer is a pentamer of a complex of a target antigen peptide and a major histocompatibility antigen (MHC).
  • MHC major histocompatibility antigen
  • Leukocytes separated from the spleen of the mouse were suspended in a buffer (PBS containing 3% FCS (usual fetal serum) and 0.1% sodium azide), and normal mouse serum (final concentration 4%) was added. Blocking was performed for a minute. Next, a FITC-labeled anti-mouse CD8a antibody (Ly-2) (PharMingen) was added and allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes. After washing with buffer, PE-labeled pentamer (H-2 Dd / pl8 (RGPGRAFVTI) -MHC complex pentamer) (Prolmmune, Oxford) was added and incubated at 37 ° C for 15 minutes. After washing, it was suspended in a fixative (4% formaldehyde-containing PBS) and allowed to stand at 4 ° C for 10 minutes, and then analyzed by flow cytometry.
  • a buffer PBS containing 3% FCS (usual fetal serum) and 0.1% sodium azide
  • Intracellular cytokine staining is a method for investigating antigen-specific intracellular cytoplasmic in-producing cells (intracellular cytokine staining (ICCS) method.
  • ICCS Intracellular cytokine staining
  • leukocytes are isolated from the spleen of an immunized mouse and antigen peptide (for example, Cultivated for 24 hours in the presence of HIV pl8 peptide), then bind the produced cyto force-in to a fluorescently labeled antibody and detect it with FACS.In this experiment, we detected CD8 positive and IFN- ⁇ producing cells. The incidence of antigen-specific killer T cells that produce IFN- ⁇ in response to an antigenic peptide was estimated.
  • Leukocytes isolated from mouse spleen were suspended in RPMI medium supplemented with 10 ⁇ g / ml HIV V3 peptide (NNTRKRIQRGP GRAFVTIGKIGN) and incubated at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, the cells were washed with buffer (3% FCS (usual fetal serum), PBS containing 0.1% azinatorium), normal mouse serum (final concentration 4%) was added, and the mixture was blocked at 4 ° C for 15 minutes. Performed. Next, PE-labeled anti-mouse CD8 antibody (Ly-2) (PharMingen) was added and allowed to stand at 4 ° C for 20 minutes.
  • CFSE 5- or 6- (N-Succinimidyloxycarbonyl) -3 ', 6'- ⁇ , ⁇ '-diacetylfluorescein.
  • the spleen cells were stained with 1/10 concentration of CFSE, mixed, and injected into the tail vein of the immunized mouse. After 24 hours, mouse blood or spleen cells were flushed by flow cytometry to examine how many cells with pl8 peptide were killed. The detailed procedure is as follows.
  • CTL target cells Leukocytes from which the spleen strength of non-immunized mice was also separated were used as CTL target cells. A part of leukocytes was incubated at 37 ° C for 1 hour in a medium containing 10 ⁇ g / ml HIV V3 peptide (RGPGRAFVTI) to obtain peptide-pulsed target cells. In addition, some of the target cells were left untreated and had no peptide pulses. Next, peptide-pulsed target cells were labeled with 5 M CSFE and non-pulsed target cells with 0.5 ⁇ M CFSE. After washing with PBS, these two types of target cells were mixed, immunized with vaccines, and 5 ⁇ 10 6 cells were intravenously administered to mice. Target cell administration power 24 hours after administration Mouse power The spleen was removed and white blood cells were isolated. The leukocytes were analyzed by flow cytometry, and the survival rate of the target cells was measured. The final value calculation method is
  • % [1- (number of non-pulsed target cells in non-immunized mouse spleen / number of peptide pulse target cells) / (number of non-pulsed target cells in immune mouse spleen / number of peptide pulse target cells)] xl00
  • Figure 2 shows the results of the pentamer assembly. Immunization was carried out according to the schedule shown in FIG. 1, and the strength of immunity induced in each administration schedule was analyzed by measuring the number of antigen-specific CD8 + T cells. The values in the figure indicate (HIV peptide pl8-specific CD 8+ T cells) / (total CD8 + T cells) xlOO (%).
  • Ad5 / 35IIIBenv has a stronger ability to induce HIV peptide-specific immunity than MVAIIIBenv, and both Ad5 / 35IIIBenv and MVAIIIBenv induce a stronger specific immune response than single administration by two immunizations. It became clear. Furthermore, among the tests performed this time, Ad5 / 35IIIBenv was used for the first immunization and MVAIIIBenv was used for the booster immunization schedule, and the highest proportion of HIV peptide pl8-specific CD8 + T cells were obtained. This schedule was used as a vaccine. It was suggested that the most effective.
  • FIG. 1 The results of the ICCS assembly are shown in FIG.
  • Fig. 1 By immunizing with the schedule shown in Fig. 1 and measuring the proportion of CD8 + T cells that produce IFN- ⁇ by stimulation with HIV V3 peptide (NNTRKR IQRGPGRAFVTIGKIGN), the strength of immunity induced in each administration schedule is measured. Analyzed. The values in the figure indicate (CD8 + T cells producing IFN- ⁇ upon stimulation with HIV V3 peptide) / (total CD8 + T cells) xlOO.
  • Ad5 / 35IIIBenv has a stronger ability to induce HIV peptide-specific immunity than MVAIIIBenv, and both Ad5 / 35IIIBenv and MVAIIIBenv are stronger than single doses due to two immunizations, similar to the results of Pentama Atssey. It became clear that a specific immune response was induced. Among the tests performed this time, IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells stimulated by HIV V3 peptide appeared at the highest rate due to the immunization schedule using Ad5 / 35IIIBenv for primary immunization and MVAIIIBenv for booster immunization. It was suggested that the most effective as.
  • FIG. Immunization is carried out according to the schedule shown in Fig. 1, and the strength of immunity induced in each administration schedule is expressed as HIV V3 peptide (RGP GRAFVTI) was analyzed by measuring the survival rate of the presented target cells.
  • Ml represents non-pulse target cells
  • M2 represents peptide pulse target cells.
  • CTL activity [1-(number of non-pulsed target cells in non-immune mouse spleen / number of peptide pulse target cells) / (number of non-pulse target cells in immune mouse spleen / number of peptide pulse target cells)] ⁇ 100 (%) is indicated.
  • Ad5 / 35IIIBenv has a higher ability to induce HIV peptide-specific immunity than MVAIII Benv, as in the results of Pentama Atssey and ICCS Atsey.
  • the highest CTL activity was induced by an immune schedule using Ad5 / 35inBenv for the first immunization and MVAIIIBenv for the booster, suggesting that this schedule is the most effective as a vaccine. .
  • BHK21 cells American Type culture Collection, The Global Bioresource Center, Manassas, VA20108, USA
  • wild-type MVA provided by Dr. Bernard Moss
  • lipofectamin Invitrogen, Carisbad, CA92008, USA
  • Recombinant MVA virus was purified with Sucrose (Wako, Tokyo, Japan).
  • Ad5 / 35 vector expressing SIVenv and SIVgag SIVenv (GenBank No. AAA4 7632.1) and SIVgag gene (GenBank No.AAA47637.1) (Dr. Thomas C Friedrich, Wise onSin Primate Research Center, Madison, WI 53706 USA) and Ad5 / 35 vectors expressing SIVenv and SIVgag genes in HEK293 cells (American) in the same manner as in Example 1 (paragraph [0036]). (Type Culture Collection, The Global Biocenter Center, Manassas, VA20108, USA).
  • SIV is a monkey immunodeficiency virus, and its classification, nature, route of infection, and onset are the same as HIV, so it is used as a monkey model of HIV!
  • Immunized monkey lymphocytes were stimulated with SIVenv and SIVgag pooled peptides (AIDS research and Reference Reagent Program, National Institutes of Health, Roc vilie, MD20850, UbA) for 24 hours.
  • the number of cells secreting IFN- ⁇ was measured by ELISpot method (Xin et al, Gene Ther. 2005, 12: 1769-1777.).
  • IFN- ⁇ -ELISpot The result of IFN- ⁇ -ELISpot is shown in FIG.
  • SIV-specific I FN- ⁇ -secreting lymphocytes were 470 cells per 10 6 cells, whereas with Ad5 / 35 vaccine, the number of cells was more than tripled. It increased to (1708 cells / 10 6 cells).
  • Ad5 / 35 vaccine the combination of the MVA vaccine and the Ad5 / 35 vaccine can provide a high and immune effect that cannot be obtained with a single vaccine administration, and preventive and therapeutic effects on SIV and HIV. I could expect.
  • the anti-HIV drug of the present invention allows effective treatment for the eradication of HIV. Noh.

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Abstract

　有効かつ安価な抗HIV薬を提供する。 　アデノウイルス5型のファイバーをアデノウイルス35型由来のものに置換したキメラウイルスにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターと、修飾ワクシニアウイルスアンカラにHIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイルスベクターとの組み合せからなることを特徴とする抗HIV薬。

Description

明 細 書
アデノウイルス 5型 Z35型ベクターとワクシニアウィルス MVAベクターと の併用による強力な免疫誘導
技術分野
[0001] 本発明は、アデノキメラウィルス 5型 Z35型ベクターを利用した組換えウィルスべク ターワクチンとワクシニアウィルス MVAベクターを利用した組換えウィルスベクターヮ クチンとを併用することを特徴とする抗 HIV薬に関する。
背景技術
[0002] ヒト免疫不全ウィルス (HIV)が同定されてから 20年余りが経過している力 未だに完 全なる治療法は確立されて 、な 、。
初の抗 HIV薬としてアジドチミジン (AZT)が開発された後、次々に新しい抗 HIV薬が 開発され、 1995年、複数の抗 HIV薬を併用する HAART(Highly Active Anti-retrovial Therapy)が開始され、先進国ではエイズによる死亡者は激減した。
[0003] しかし、この治療法では、抗 HIV薬の投与を中止すると、 2〜3週間後には HIVが再 増殖してくる。また、薬剤耐性ウィルスも次々と現れ、これらに対応するために更に新 しい抗 HIV薬が必要になってくる。さらに、患者は、生涯、薬剤の投与を続けなくては ならず、それにかかる医療費も莫大なものである。
従って、有効かつ安価な治療法が求められている。
[0004] 一方で、エイズに対するワクチンが開発されてきた。現在、世界で知られて!/、るワク チンの中で、アデノウイルス 5型ベクターを利用したワクチンは免疫原性が非常に強 いワクチンである力 アデノウイルス 5型に対する中和抗体を持つ患者が多ぐこのよ うな患者にぉ 、てはあまり強 、免疫誘導能ができな 、こと、アデノウイルス 5型は肝障 害性が非常に強いため、大量に投与することができないなどの問題があった (非特許 文献 1)。本発明者らは、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来の ものに置換することによって、アデノウイルス 5型に対する中和抗体を持つ患者にも有 効で、かつ肝障害性が低いワクチンを作製することに成功した (特許文献 1、非特許 [0005] 他のウィルスベクターとして、修飾ワクシニアウィルスアンカラ (MVA (modified vacci nia virus Ankara) )を利用したワクチンの有効性が報告されて ヽる（非特許文献 3〜5
) o
しかし、異なる組換えウィルスベクターワクチンの併用に関する報告はな 、。
[0006] 特干文献 1： Vogels R et al. Replication-deficient human adenovirus type 35 vecto rs for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of pre existing adenovirus immunity. J Virol 2003; 77: 82b3— 8271.
非特許文献 2 : K- Q Xin et al., Gene Therapy (2005) 12, 1769-1777
非特許文献 3 : Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534, 1999
非特許文献 4 :Amara, R.R.et al., Science 292:69-74, 2001
非特許文献 5 :Amara, R.R. et al., Virology 343 (2005) 246-255
特許文献 1：国際公開第 WO 2005/052165号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、有効かつ安価な抗 HIV薬を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、アデノウイルス (Ad) 5型のファイバーを Ad35型由来のものに置換し たキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターと修 飾ヮクチ-ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルス ベクターを組み合わせて免疫することにより、これまでにない強力な免疫反応を誘導 できることを見出した。異なるウィルスベクターを用いることにより、各々のウィルスに 対する抗体産生を軽減でき、副反応が少なぐ免疫原性の極めて高いワクチンを作 製できる。
[0009] 本発明の要旨は以下の通りである。
(1)アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラ ウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターと、修飾ヮクシ ユアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクター との組み合せカゝらなることを特徴とする抗 HIV薬。 (2)アデノウイルス 5型及び修飾ワクシニアウィルスアンカラが非増殖型である（1)記 載の抗 HIV薬。
(3) HIVの構造遺伝子力 env遺伝子及び/又は gag遺伝子である請求項 1又は 2に記 載の抗 HIV薬。
[0010] (4)組換えウィルスベクターの少なくとも 1つに、さらに、 HIVの複製制御遺伝子が挿 入されて!、る（1)〜（3)の!、ずれかに記載の抗 HIV薬。
(5) HIVの複製制御遺伝子力rev遺伝子である（4)記載の抗 HIV薬。
(6)アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラ ウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターと、修飾ヮクシ ユアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクター と力 なるキットである請求項 1〜5のいずれかに記載の抗 HIV薬。
[0011] (7)アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラ ウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクター又は修飾ワク シニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクタ 一の ヽずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する請求項 6記載 の抗 HIV薬。
(8)さらに、逆転写酵素阻害剤及び Z又はプロテアーゼ阻害剤を含む（1)〜（7)の V、ずれかに記載の抗 HIV薬。
(9)組換えウィルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも 1回、逆 転写酵素阻害剤及び Z又はプロテアーゼ阻害剤が被験者に投与される (8)記載の 抗 HIV薬。
(10)アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメ ラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターと、修飾ワク シニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクタ 一とを治療及び/又は予防に有効な量で被験者に投与することを含む、 HIV感染の 治療及び/又は予防方法。
(11)アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメ ラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクター又は修飾ヮ クシ-ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されて ヽる組換えウィルスベクタ 一のいずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する（10)記載の方 法。
(12)初回免疫と追加免疫の間隔が 1〜3か月程度である（11)記載の方法。
(13)初回免疫と追加免疫の間隔が 2か月程度である（ 12)記載の方法。
(14)抗 HIV薬の製造における、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型 由来のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えゥ ィルスべクタ一と、修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されて V、る組換えウィルスベクターとの組み合せの使用。
発明の効果
[0012] 2種類の組換えウィルスベクターを組み合わせて免疫することにより、各々の組換え ウィルスベクター単独で免疫した場合と比較して、著しく高 ヽ免疫反応を誘導させる ことができた。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2006-061007の明 細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]組換えウィルスベクターでマウスを免疫するスケジュールを示す。
[図 2]ペンタマ一アツセィの結果を示す。特異的 TCRを有する CD8+T細胞の割合を測 定することにより、ワクチンスケジュールごとの細胞性免疫誘導能の強さを検討した結 果である。
[図 3]ICCSアツセィの結果を示す。抗原ペプチドの刺激によって IFN- γを産生する C D8+T細胞の割合を測定することにより、ワクチンスケジュールごとの細胞性免疫誘導 能の強さを検討した結果である。
[図 4]in vivo CTLアツセィの結果を示す。移入した抗原ペプチドを提示する標的細胞 の生存率を測定することにより、ワクチンスケジュールごとの細胞性免疫誘導能の強 さを検討した結果である。
[図 5]組換えウィルスベクターでサルを免疫するスケジュールを示す。
[図 6]MVAワクチンの初回免疫及び Ad5/35ワクチンの追加免疫後の細胞性免疫応 答を示す。ァカゲザルを MVAワクチンで初回免疫した。 2力月後 Ad5/35ワクチンで追 加免疫した。 IFN- γ -ELISpotアツセィは初回と追加免疫後 2週間後に行った。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換 したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターと、 修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィル スベクターとの組み合せカゝらなることを特徴とする抗 HIV薬を提供する。
アデノウイルス 5型は非増殖型であることが好まし 、。組換えウィルスベクターが非 増殖型であると、投与後に生体内で増殖せず、安全性が高い。非増殖型アデノウイ ルス 5型としては、初期遺伝子 E1が除去されたもの、初期遺伝子 E1及び E3が除去さ れたちのを挙げることができる。
[0015] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換するには、 アデノウイルス 35型由来のファイバー蛋白をコードする遺伝子を用いるとよい。アデノ ウィルス 35型由来のファイバー蛋白をコードする遺伝子及びそのアミノ酸配列は公知 である（Mei, Y.F. et al, Virology 206(1), 686-689, 1995; Dmitry M. et al, J. Virolo gy, Mar.2000, vol.74, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1; Stone, D. et al., Virology, 2003, Vol.309, 152-156)。ファイバー蛋白は、 shaftと knobから構成され る。アデノウイルス 35型由来のファイバー蛋白は野生型であっても変異体であっても よい。このような変異体としては、アデノウイルス 35型由来のファイバー蛋白（野生型） のアミノ酸配列において、 1個若しくは数個（好ましくは、 1〜30個、より好ましくは 1〜 10個、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸残基が欠失、置換及び Z又は付加された アミノ酸配列からなる蛋白質であって、アデノウイルス 35型由来のファイバー蛋白と同 様の標的細胞への接着性を有する蛋白質を挙げることができる。また、アデノウィル ス 35型由来のファイバー蛋白（野生型)をコードする遺伝子とストリンジェントな条件下 でハイブリダィズする DNAにコードされ、かつアデノウイルス 35型由来のファイバー 蛋白と同様の標的細胞への接着性を有する蛋白質であってもよ 、。ハイブリダィゼー シヨンは公知の方法、例えば、 Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Labo ratory Press (1989)などの基本書に従い、当業者であれば容易に行うことができる。 また、ストリンジェントな条件は当業者であれば決定できる。ストリンジェントな条件とし ては、例えば、 6 X SSPE、 2 Xデンハルト溶液、 0.5%SDS、 0.1 mg/mlサケ精巣 DNAを 含む溶液中で 65°C、 12時間反応させるという条件を挙げることができる。変異体をコ ードする遺伝子は、例えば、部位特異的突然変異誘発法などにより得ることができる
[0016] アデノウイルス 35型由来のファイバー蛋白をコードする遺伝子（以下、「ファイバー 遺伝子」と言うこともある）は、公知の遺伝子情報に基づいて、 PCR法などを利用する 公知の方法により得ることができる。
[0017] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換するには、 例えば、アデノウイルス 35型由来のファイバー遺伝子の両端にアデノウイルス 5型の ファイバー遺伝子近傍の遺伝子断片を接続した DNAをアデノウイルス 5型とともに宿 主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞由来の 293細胞（HEK293) )にトランスフエクシヨンす ると、相同組換えにより、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来の ものに置換したキメラウィルスが生成する。このようなキメラウィルスは、市販されてお り（Avior Therapeutics Incが販売する Ad generation kit中の pRHSP 5/35)、入手可能 である。
[0018] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラゥ ィルスに挿入する HIVの構造遺伝子としては、 gag遺伝子、 pol遺伝子、 env遺伝子を 挙げることができる。さらに、必要に応じて、キメラウィルスに HIVの複製制御遺伝子を 挿入してもよぐ HIVの複製制御遺伝子としては、 rev遺伝子、 tat遺伝子を挙げること ができる。 HIVには、 HIV-1と- 2の 2種類が知られており、 HIV-1は全世界的な規模で 伝播している力 HIV-2は西アフリカに偏在している。 HIVの構造遺伝子及び複製制 御遺伝子は、いずれの HIVのものであってもよいが、 HIV-1のものであることが好まし い。キメラウィルスに挿入された HIVの構造遺伝子 (必要に応じて、 HIVの複製制御遺 伝子）は、宿主細胞中で発現するように挿入されるとよい。
[0019] gag遺伝子は、 HIVのコアタンパク質をコードする遺伝子である。
pol遺伝子は、 HIVの逆転写酵素をコードする遺伝子である。 env遺伝子は、 HIVのエンベロープ蛋白をコードする遺伝子である。 HIV-1と- 2では エンベロープ蛋白に違 、が見られる力 V、ずれのタイプの HIVのエンベロープ蛋白 であってもよい。また、 HIV-1は、エンベロープ蛋白のアミノ酸配列の違いより、サブタ ィプ A〜J、 Kなどに分類される力 いずれのサブタイプのエンベロープ蛋白であって ちょい。
[0020] rev遺伝子は、ウィルス mRNAのうちスプライシングされていないものを安定化し、ゥ ィルス構造タンパク質をコードする mRNAを細胞質に移送する作用を持つ revタンパク 質をコードする遺伝子である。
tat遺伝子は、トランス活性ィ匕因子としてウィルスの転写活性ィ匕を起す tatタンパク質 をコードする遺伝子である。
[0021] HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子の配列及びそれがコードするアミノ酸配列 は公知である（Goa, F" et al" J. Virol.70(3), 1651-1667(1996); Ratner, L.， et al" N ature 313(6000), 277-284(1985); Jounai, N. et al., J. Gene Med., 5, 609—617(2003); Kim, F.M., et al., J. Virol.69(3), 1775-1761(1995); Rodenburg, CM., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 17(2), 161—168(2001); Gao, F.， et al., J. Virol. 72(7), 5680— 5698(1998); Gao, F. et al., J. Virology 70(10), 7013—7029(1996))。また、 NCBIなど のジーンバンクからも遺伝子情報を入手できる（U51190, K03455, U39362, AF28622 4, U88822, U51188) 0
[0022] HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子は野生型であっても変異型であってもよ 、 。変異型遺伝子としては、野生型遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列にお いて、 1個若しくは数個（好ましくは、 1〜30個、より好ましくは 1〜： L0個、さらに好まし くは 1〜5個）のアミノ酸残基が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列力もな る蛋白質であって、野生型遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を有するタン パク質をコードする遺伝子、野生型遺伝子とストリンジェントな条件下でノ、イブリダイ ズし、かつ野生型遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を有するタンパク質を コードする DNAなどを挙げることができる。ハイブリダィゼーシヨンは公知の方法、例 ば、 Molecular Cloning 2ηα Edt., し old bpnng Harbor Laboratory Press (1989)など の基本書に従い、当業者であれば容易に行うことができる。また、ストリンジェントな条 件は当業者であれば決定できる。ストリンジェントな条件としては、例えば、 6 X SSPE、 2 Xデンハルト溶液、 0.5%SDS、 0.1 mg/mlサケ精巣 DNAを含む溶液中で 65°C、 12時 間反応させるという条件を挙げることができる。変異型遺伝子は、例えば、部位特異 的突然変異誘発法などにより得ることができる。
[0023] HIVの構造遺伝子及び複製制御遺伝子は、公知の遺伝子情報に基づ!/、て、 PCR 法などを利用する公知の方法により得ることができる。
アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラゥ ィルスに挿入される HIVの構造遺伝子 (必要に応じて、複製制御遺伝子）は、キメラゥ ィルスに挿入されたときに抗 HIV薬としての効果が得られる限り、その領域の全部で あっても、一部であってもよい。
[0024] HIVの構造遺伝子 (必要に応じて、 HIVの複製制御遺伝子）は、キメラウィルスのラ ィフサイクルに悪影響を及ぼさない限り、キメラウィルスの ヽかなる部位に挿入されて もよいが、例えば、アデノウイルス 5型の 22〜5790部位に相当するいずれかの部位に 挿入されるとよい。 HIVの構造遺伝子 (必要に応じて、 HIVの複製制御遺伝子）をキメ ラウィルスに挿入するには、例えば、 CMVプロモーター、 CAGプロモーターなどのプ 口モーターの下流に、これらの遺伝子、次いでポリ A遺伝子を含む発現カセットを用 意し、その両端にアデノウイルス 5型と同じ遺伝子 (例えば、アデノウイルス 5型の 22-3 42部位に相当する DNAと 3523-5790部位に相当する DNA)を接続し、これをキメラゥ ィルスとともに宿主細胞（例えば、 HEK293細胞）にトランスフエタトすると、相同組換え により、 HIVの構造遺伝子 (必要に応じて、 HIVの複製制御遺伝子）が挿入されたキメ ラウィルスが生成する。発現カセットには、さらに、複製起点、アンピシリン耐性遺伝 子などの薬剤耐性遺伝子（目的の遺伝子が導入されたことを示すマーカー)などが 含まれているとよい。
[0025] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラゥ ィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターは、市販されて いるキットを用いて作製することもできる。例えば、後述の実施例 1には、 Avior Thera peutics, Incが販売する Ad generation kitを用いて組換えウィルスベクターを作製する 手順が説明されて 、るので参照された 、。 [0026] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラゥ ィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターは、非常に強 ヽ HIV特異的細胞性免疫反応を惹起することができる。また、肝臓に対する毒性が軽 減され、榭状細胞への親和性も向上する。
修飾ワクシニアウィルスアンカラは非増殖型であることが好まし ヽ。組換えウィルス ベクターが非増殖型であると、投与後に生体内で増殖せず、安全性が高い。非増殖 型ワクシニアウィルスアンカラは、継代 ·選択を多数回繰り返すことで得られた株であ り、例えば、 Amara, R.R. et al, Science 292:69—74 (2001); Amara, R.R. et al, J.Viol. 76:7625-7631 (2002); Robinson, H. et al" Nat. Med. 5:526-534 (1999)などに記載さ れている。
[0027] 修飾ワクシニアウィルスアンカラに挿入する HIVの構造遺伝子としては、前述したも のを挙げることができる。さら〖こ、必要に応じて、 HIVの複製制御遺伝子を挿入しても よぐ HIVの複製制御遺伝子としては、前述したものを挙げることができる。 HIVの構 造遺伝子 (必要に応じて、複製制御遺伝子）は、宿主細胞中で発現するように修飾ヮ クシ-ァウィルスアンカラに挿入されるとょ 、。修飾ワクシニアウィルスアンカラに挿入 される HIVの構造遺伝子 (必要に応じて、複製制御遺伝子）は、修飾ワクシニアウィル スアンカラに挿入されたときに抗 HIV薬としての効果が得られる限り、その領域の全部 であっても、一部であってもよい。
[0028] HIVの構造遺伝子は、修飾ワクシニアウィルスアンカラのライフサイクルに悪影響を 及ぼさない限り、修飾ワクシニアウィルスアンカラの 、かなる部位に挿入されてもよ!ヽ 力 例えば、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子部位に挿入されるとよい。
修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイ ルスベクターは公知であり、 Amara, R.R. et al., Science 292:69-74 (2001); Amara, R.
R. et al., J.Viol.76:7625-7631 (2002); Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534 (19
99)などの文献に記載の方法により調製することができる。
[0029] 組換えウィルスベクターは、例えば、 PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水など に溶解し、必要に応じてフィルターなどで濾過滅菌した後、注射により被験者に投与 されるとよい。また、この溶液には、添加剤（例えば、不活化剤、保存剤、アジュバント 、乳化剤など)などを添加してもよい。組換えウィルスベクターは、静脈、筋肉、腹腔、 皮下、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。
[0030] 組換えウィルスベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、 体重、投与方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり 109〜 1013ウィルス粒子、好ましくは 10u〜1012ウィルス粒子のアデノウイルス 5型のファイバ 一をアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が 挿入されている組換えウィルスベクターと、成人一人当たり 108〜101Q pfo、好ましくは 1 09〜1010 pfoの修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る 組換えウィルスベクターを、少なくとも 1回、所望の効果が持続する頻度で投与すると よい。
[0031] 本発明の一態様において、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由 来のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウイ ルスベクター又は修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されて V、る組換えウィルスベクターの 、ずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追 加免疫する。初回免疫は、組換えアデノキメラウィルスベクター又は組換えワクシニア ウィルスアンカラの!/、ずれでしてもよ!/、が、糸且換えアデノキメラウィルスベクターでする ことが好ましい。初回免疫と追加免疫の間隔は、 1〜3か月程度が適当であり、 2か月 程度が好ましい。また、 1回の追加免疫で十分な効果が得られな力つた場合には、さ らに、 1〜3か月程度、好ましくは 2か月程度の間隔をあけて、 1回以上の追加免疫を するとよい。追加免疫を 2回以上行う場合には、同じ種類の組換えウィルスベクターを 用いてもよいし、異なる種類組換えウィルスベクターを用いてもよい。本発明はこの投 与方法に限定されるわけではなぐアデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 3 5型由来のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されてヽる組換 えウィルスベクターと修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入され て 、る組換えウィルスベクターとを同時に投与してもよ 、。
[0032] 糸且換えウィルスベクターは、さらに、逆転写酵素阻害剤及び Z又はプロテアーゼ阻 害剤と組み合わせて用いてもよい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン (AZT) 、ジダノシン (ddl)、ラブミジン (3TC)、ネビラピン (NVP)などを挙げることができる。プロ テアーゼ阻害剤としては、インジナビル (IDV)、サキナビル (SQV)、リトナビル (RTV)、ネ ルフイナビル (NFV)、テノフォビル (PMPA)などを挙げることができる。高活性抗レトロウ ィルス療法（Highly Active Anti- retroviral Therapy(HAART))に用いられているもの が好ましい。逆転写酵素阻害剤としては、アジドチミジン (AZT)、ジダノシン (ddl)、ラブ ミジン (3TC)、ネビラピン (NVP)などを挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤として は、インジナビル (IDV)、サキナビル (SQV)、リトナビル (RTV)、ネルフィナビル (NFV)な どを挙げることができる。高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Anti-retroviral Therapy(HAART))に用いられているものが好ましい。組換えウィルスベクターの投与 前、投与後又は投与と同時に、少なくとも 1回、逆転写酵素阻害剤及び Z又はプロテ ァーゼ阻害剤を被験者に投与するとよい。例えば、組換えウィルスベクター投与の 1 〜3か月程度、好ましくは 2か月程度前に、逆転写酵素阻害剤及び Z又はプロテア ーゼ阻害剤を投与する。逆転写酵素阻害剤及び Z又はプロテアーゼ阻害剤の投与 量は、「抗 HIV治療ガイドライン」（平成 15年度厚生労働省科学研究費補助金エイズ 対策研究事業 HIV感染症の医療体制の整備に関する研究班 2004年 3月）の記載に 準じるものであるとよい。具体的な投与スケジュールの一例として、逆転写酵素阻害 剤及び Z又はプロテアーゼ阻害剤の投与（例えば、テノフォビル 20〜30mg/kg/dayを 1日 1回）開始 1か月後に、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来 のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィル スベクターを投与し (例えば、 109〜1013ウィルス粒子を 1回）、その 2か月後に、修飾ヮ クシ-ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されて ヽる組換えウィルスベクタ 一を投与する (例えば、 108〜101Q pfoを 1回)。効果が不十分であると判定された場合 には、組換えウィルスベクターの投与を繰り返す。
また、組換えウィルスベクターは、 DNAワクチンなどの他のワクチンと組み合せて用 いてもよい。例えば、組換えウィルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、 少なくとも 1回、他のワクチンを被験者に投与する。他のワクチンとしては、サブタイプ Bの HIV株である HIVIIIBの rev遺伝子と env遺伝子を含む DNAワクチン（pCAGrev/en V, Jounai N. et al.， J. Gene Med. 2003; 5: 609- 617)などを挙げることができる。 DNA ワクチンの投与量は、 5〜30 mgが適当であり、 10〜20 mgが好ましい。具体的な投与 スケジュールの一例として、逆転写酵素阻害剤及び z又はプロテアーゼ阻害剤の投 与（例えば、テノフォビル 20〜30 mg/kg/dayを 1日 1回）開始 0、 1か月、 2か月後に、 DNAワクチンを筋肉内注射にて投与し（例えば、 pCAGrev/envを 5〜30 mg)、 DNAヮ クチン投与終了から 1か月後に、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35 型由来のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて ヽる組換え ウィルスベクターを投与し（例えば、 109〜1013ウィルス粒子の量で 1回）、さらにその 1 か月後に、修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組 換えウィルスベクターを投与する（例えば、 108〜101Q pfoの量で 1回)。効果が不十分 であると判定された場合には、組換えウィルスベクターの投与を繰り返す。
[0034] 2種類の組換えウィルスベクター力 なる本発明の抗 HIV薬は、 HIV治療用、さらに は予防用ワクチンとしての有効性が期待できる。
実施例
[0035] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
[0036] 〔実施例 1〕
実,験方法及び材料
組換えベクター
El, E3欠損非増殖型アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のも のに置換し、かつサブタイプ Bの HIV株である HIVIIIBの rev遺伝子及び env遺伝子を 導入した糸且換えウイノレスを Ad generation kit (Avior Therapeutics Inc., Seattle, WA, USA)(Shayakhmetov D.M., et al, J. Virol. 2000; 74: 2567- 2583)を用いて構築した。 簡単に説明すると、 CAGプロモータ^ HIV rev/env gpl60- polyAを含む、 5.2k bp
IIIB
の Sall/Pstl断片を pCAGrev/envから単離した（Jounai N. et al., J. Gene Med. 2003; 5:609-617) oアデノウイルス 5型（Ad5)の 22- 342部位、 3523- 5790部位、 E.coli ori、及 びアンピシリン而 ί性遺伝子を含むシャトルプラスミド (pLHSP)を Avior Therapeutics Inc .(Seattle, WA, USA)から得た。 pLHSPの平滑末端化した EcoRI部位に平滑末端化し た 5.2k bp断片をサブクローユングし、 pLHSP-HIVシャトルプラスミドを生成した。この p LHSP-HIVシャトルプラスミドを Padで直鎖状にし、 El, E3欠損キメラ Ad5/35ゲノムとと もにカルシウム沈殿法でヒト胎児腎 (HEK293)細胞にトランスフエタトし、組換えウィル ス Ad5/35IIIBenvを生成した。
なお、 El, E3欠損キメラ Ad5/35ゲノムは、アデノウイルス 5型のファイバー遺伝子が アデノウイルス 35型由来のファイバー遺伝子に置換されたキメラシャトルプラスミド (pR HSP 5/35)であり、 Ad generation kit (Avior Therapeutics Inc., Seattle, WA, USA)中 に用意されている。組換えウィルス Ad5/35IIIBenvは HEK293細胞中で増殖させ、 Cs C1法（Lieber A. et al., J. Virol. 1996; 70:8944- 8960)を 2回繰り返して精製した。ウイ ルスの全濃度を 260 nm(OD )の光学濃度から、式 1 OD =lxl012 vp/mlを用いて計
260 260
异した。
HIV envを発現する非増殖型ヮクチ-ァウィルスアンカラ (MVAIIIBenv) (Amara, R.R . et al" Science 292:69-74 (2001); Amara, R.R. et al" J.Viol.76:7625- 7631 (2002); Robinson, H. et al., Nat. Med. 5:526-534 (1999))は Dr. Moss(Laboratory of Viral Di seases, National Institutes of Health, MD)力ら提供された。
[0037] 動物の免疫
メス BALB/cマウス（8週令； H— 2Dd)は Japan SLC Inc., Shizuoka, Shizuoka— ken, Jap anから購入した。 5xl09 vp/匹の Ad5/35IIIBenv(PBS中）で i.m.投与にてマウスを初回 免疫した後、 4週目に 5xl09 vp/匹の Ad5/35IIIBenv (PBS中）又は lxlO6 pfo/匹の MV AIIIBenv (PBS中）で i.m.投与にて追加免疫した（図 1)。初回免疫後 6週目にマウスか ら採血し、後述のペンタマ一アツセィ（Anjali N. et al" J. Virol. 2005, Vol.79, No.22, p.14161-14168)、 ICCSアツセィ（Elzbieta T. et al" The Journal of Immunology, 2002 , 169:5347— 5357)、 in vivo CTLアツセィ（Michael S. et al., The Journal of Immunolog y, 2005, 174:7986-7994)を行った（図 1)。また、初回免疫も追加免疫もしない群（Ne gative Control)、初回免疫無で Ad5/35inBenvで免疫した群、初回免疫無で MVAIII Benvで免疫した群、 MVAIIIBenvで初回及び追加免疫した群も用意した。
[0038] ペンタマ一アツセィ
ペンタマ一とは、 目的の抗原ペプチドと主要組織適合性抗原 (MHC)の複合体の 5 量体である。このペンタマ一をマウスの脾臓力 分離した白血球と反応させると、抗原 特異的なレセプターを有する T細胞のみと結合するため、抗原特異的な T細胞を検 出することができる。本実験では、リンパ球細胞表面上の HIV特異的 T細胞レセプタ 一をフィコエリスリン（PE)標識ペンタマ一で染色し、次にフルォレセインイソチォシァ ネート (FTIC)標識 CD8抗体によって染色し FACSを行うことで、ペンタマ一陽性かつ C D8陽性細胞を検出し、白血球中における抗原特異的キラー T細胞の割合を測定又 は推定する。詳細な手順は以下の通りである。
マウスの脾臓力も分離した白血球をバッファー（3%FCS (ゥシ胎児血清）、 0.1%ァ ジ化ナトリウム含有 PBS)に懸濁し、正常マウス血清 (終濃度 4%)を加え 4°Cにて 15分間 ブロッキングを行なった。次に FITCラベル抗マウス CD8a抗体 (Ly-2)(PharMingen)を 添加し、 4°Cで 30分間静置した。バッファーで洗浄した後、 PEラベルペンタマ一（H-2 Dd/pl8(RGPGRAFVTI) - MHC複合体五量体）（Prolmmune,オックスフォード)を添カロ し、 37°Cで 15分間インキュベートした。洗浄後、固定液 (4%ホルムアルデヒド含有 PBS )に懸濁し 4°Cで 10分間静置し、その後フローサイトメトリーによる解析を行なった。
ICCSアツセィ
抗原特異的な細胞内サイト力イン産生細胞を調べるため、細胞内サイトカインを染 色する (intracellular cytokine staining (ICCS》アツセィ方法である。まず、免疫マウス の脾臓から白血球を分離し、抗原ペプチド (例えば、 HIVの pl8ペプチド)存在下で 24 時間培養する。その後、産生されたサイト力インを蛍光標識抗体と結合させ、 FACSで 検出する。本実験では、 CD8陽性かつ IFN- γ産生細胞を検出し、抗原ペプチドに反 応して IFN- γを産生する抗原特異的キラー T細胞の出現率を推定した。詳細な手順 は以下の通りである。
マウスの脾臓から分離した白血球を、 10 μ g/ml HIV V3ペプチド（NNTRKRIQRGP GRAFVTIGKIGN)添加 RPMI培地に懸濁し、 37°Cで 24時間インキュベーションした。 インキュベーション後、細胞をバッファー（3%FCS (ゥシ胎児血清）、 0.1%アジィ匕ナトリ ゥム含有 PBS)で洗浄し、正常マウス血清 (終濃度 4%)を加え 4°Cにて 15分間ブロッキン グを行なった。次に PEラベル抗マウス CD8抗体（Ly-2) (PharMingen)を添加し 4°Cに て 20分間静置した。洗浄後、 Cytofix/ CytoPerm Plusキット（PharMingen)を用いて膜 透過処理を行い、その後 FITCラベル抗マウス IFN- γ抗体（PharMingen)を添加し、 4 °Cにて 30分間静置した。洗浄後、フローサイトメトリーによる解析を行なった。 [0040] in vivo CTLアツセィ
正常マウスの脾細胞に HIVの pl8ペプチドをパルスして、 CFSE(5- or 6- (N- Succini midyloxycarbonyl)- 3' ,6'- Ο,Ο'- diacetylfluorescein)で染めた。また、ノ レスして 、な ぃ脾細胞を 1/10の濃度の CFSEで染め、 2つを混ぜ、免疫したマウスの尾静脈に注入 した。 24時間後、マウスの血液又は脾細胞をフローサイトメトリーで流し、 pl8ペプチド のつ ヽた細胞をどれだけ殺したかを調べた。詳細な手順は以下の通りである。
非免疫マウスの脾臓力も分離した白血球を CTL標的細胞とした。白血球の一部を 1 0 μ g/ml HIV V3ペプチド（RGPGRAFVTI)を含む培地にて 37°Cで 1時間インキュべ ートし、ペプチドパルスされた標的細胞とした。また一部は無処理のままペプチドパ ルスしていない標的細胞とした。次に、ペプチドパルスされた標的細胞を 5 M CSFE 、非パルス標的細胞を 0.5 μ M CFSEでラベルした。 PBSで洗浄した後これら 2種類の 標的細胞を混合し、あら力じめワクチンを投与し免疫したマウスに 5 X 106細胞静脈投 与した。標的細胞投与力 24時間後に投与マウス力 脾臓を摘出し、白血球を分離 した。この白血球をフローサイトメトリーによって解析し、標的細胞の生存率を測定し た。最終的な値の算出方法は、
%=[1- (非免疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)/ (免 疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数 )]xl00
である。
[0041] ¾
ペンタマ一アツセィの結果を図 2に示す。図 1に示したスケジュールで免疫し、それ ぞれの投与スケジュールにお 、て誘導される免疫能の強さを、抗原特異的 CD8+T細 胞の数を測定することによって解析した。図中の値は、（HIVペプチド pl8特異的な CD 8+T細胞)/ (全 CD8+T細胞） xlOO (%)を示す。
[0042] 上段左； Negative Controlの脾細胞中では、全 CD8+T細胞中の pl8特異的 CD8+T 細胞の割合は 0.07%であった。上段中； Ad5/35IIIBenvを単回投与した群では 8.64% であった。上段右； MVAIIIBenvを単回投与した群では 2.79%であった。下段左； MV AIIIBenvを 2度免疫した群では 5.84%であった。下段中； Ad5/35IIIBenvを 2度免疫し た群では、 10.66%であった。下段右； 0週目〖こ MVAIIIBenv, 4週目に Ad5/35IIIBenv を免疫した群では、 21.26%であった。
[0043] 以上より、 Ad5/35IIIBenvは MVAIIIBenvと比べ HIVペプチド特異的免疫誘導能が強 く、また Ad5/35IIIBenv、 MVAIIIBenvいずれも 2回免疫により単回投与と比べより強い 特異的免疫反応が誘導されることが明らかになった。さらに、今回行なった中では初 回免疫に Ad5/35IIIBenv、追加免疫に MVAIIIBenvを用 、る免疫スケジュールにより 最も高 、割合の HIVペプチド pl8特異的な CD8+T細胞が得られ、このスケジュールが ワクチンとして最も有効性が高 、ことが示唆された。
[0044] ICCSアツセィの結果を図 3に示す。図 1に示したスケジュールで免疫し、それぞれ の投与スケジュールにおいて誘導される免疫能の強さを、 HIV V3ペプチド（NNTRKR IQRGPGRAFVTIGKIGN)刺激により IFN- γ産生する CD8+T細胞の割合を測定する ことによって解析した。図中の値は、 (HIV V3ペプチド刺激により IFN- γを産生する C D8+T細胞)/ (全 CD8+T細胞） xlOOを示す。
[0045] 上段左； Negative Controlの脾細胞中では、全 CD8+T細胞中の HIV V3ペプチド刺 激により IFN- γを産生する CD8+T細胞の割合は 0.75±0.07%であった。上段中； Ad 5/35ΠIBenvを単回投与した群では2.87±0.52%でぁった。上段右； MVAIIIBenvを単 回投与した群では 0.99 ±0.25%であった。下段左； MVAIIIBenvを 2度免疫した群で は 1.86±0.14%であった。下段中； Ad5/35IIIBenvを 2度免疫した群では 5.00± 1.46 %であった。下段右； 0週目に MVAIIIBenv, 4週目に Ad5/35IIIBenvを免疫した群では 8.86 ± 1.77%であった。
[0046] 以上よりペンタマ一アツセィの結果と同様、 Ad5/35IIIBenvは MVAIIIBenvと比べ HIV ペプチド特異的免疫誘導能が強ぐまた Ad5/35IIIBenv、 MVAIIIBenvいずれも 2回免 疫により単回投与と比べより強い特異的免疫反応が誘導されることが明らかになった 。今回行なった中では、初回免疫に Ad5/35IIIBenv、追加免疫に MVAIIIBenvを用い る免疫スケジュールにより、最も高い割合で HIV V3ペプチド刺激による IFN- γ産生 C D8+T細胞が出現し、このスケジュールがワクチンとして最も有効性が高 、ことが示唆 された。
[0047] in vivo CTLアツセィの結果を図 4に示す。図 1に示したスケジュールで免疫し、それ ぞれの投与スケジュールにおいて誘導される免疫能の強さを、 HIV V3ペプチド (RGP GRAFVTI)提示標的細胞の生存率を測定することにより解析した。図中 Mlは非パル ス標的細胞、 M2はペプチドパルス標的細胞を示している。図中の値は、 CTL活性 =[1 - (非免疫マウス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)/ (免疫マウ ス脾臓内非パルス標的細胞数/ペプチドパルス標的細胞数)] χ100 (%)を示す。
[0048] 上段左； Negative Controlの CTL活性は 0%である。上段中； Ad5/35IIIBenvを単回 投与した群では CTL活性は 61.1 ± 5.4%であった。上段右； MVAIIIBenvを単回投与 した群では 46.0 ±3.0%であった。下段左； MVAIIIBenvを 2度免疫した群では 47.7 ±2 .6%であった。下段中；Ad5/35ΠIBenvを2度免疫した群では73.1 ±6.0%でぁった。 下段右； 0週目〖こ MVAIIIBenv, 4週目に Ad5/35IIIBenvを免疫した群では 84.5± 1.4% であった。
[0049] 以上よりペンタマ一アツセィ、 ICCSアツセィの結果と同様、 Ad5/35IIIBenvは MVAIII Benvと比べ HIVペプチド特異的免疫誘導能が強 、ことが明らかになった。今回行な つた中では、初回免疫に Ad5/35inBenv、追加免疫に MVAIIIBenvを用いる免疫スケ ジュールにより、最も高い CTL活性が誘導され、このスケジュールがワクチンとして最 も有効性が高 、ことが示唆された。
[0050] 〔実施例 2〕
組 えベクター
SIVenvと SIVgagを発現する MVAワクチンの作成法： SIVenv(GenBank No. AAA4763 2.1)と SIVgag遺伝子（GenBank No.AAA47637.1) (Dr. Thomas C Friedrich, Wisconsin national Primate Research Center, Madison, WI 53706 USAから提供された)を MVA ウィルスのシャツトルベクター（pLW44) (Dr.Bernard Moss, LVD, AID, NIH, Bethes da, MD 20892-0445 USAから提供された。 PNAS 101:6641-46, 2004)の Sall/Pstlサイ トに揷入した。できたベクターを野生株 MVA (Dr. Bernard Mossから手供された）に感 染させた BHK21細胞（American Type culture Collection, The Global Bioresource C enter, Manassas, VA20108, USA )に lipofectamin (Invitrogen, Carisbad, CA92008, U SA)で導入した。組み換え MVAウィルスを Sucrose (Wako,東京、日本）で精製した。
SIVenvと SIVgagを発現する Ad5/35ベクターの作成法： SIVenv (GenBank No. AAA4 7632.1)と SIVgag遺伝子（GenBank No.AAA47637.1) (Dr. Thomas C Friedrich, Wise onsin national Primate Research Center, Madison, WI 53706 USAから提供された)を 用い、実施例 1と同様の方法 (段落 [0036])で SIVenvと SIVgag遺伝子を発現する Ad5/ 35ベクタ一を HEK293細胞（American Type culture Collection, The Global Bioresour ce Center, Manassas, VA20108, USA )で作成及び精製した。
SIVはサルの免疫不全ウィルスであり、 SIVウィルスの分類、性質、感染経路、発症 などは HIVと同じなので、 HIVのサルモデルとして使われて!/、る。
[0051] 動物の免疫（図 5)
109pfoの SIVenvと SIVgagを発現する MVAワクチン（上述）で 5匹ァカゲサル (中国軍 事医学科学院実験動物センターから購入)を初回免疫した。 2ヶ月後、 1012粒子の SI Venvと SIVgagを発現する Ad5/35ワクチン（上述）で追加免疫した。細胞性免疫（IFN- γ -ELISpot)を MVAワクチンと Ad5/35ワクチンでの免疫 2週間後に測定した。
[0052] 細朐件免疫 (IFN- - ELISDot)の測定
免疫したサルのリンパ球を SIVenvと SIVgagプールペプチド（AIDS research and Ref erence Reagent Program, National Institutes of Health, Roc vilie, MD20850, UbA) で 24時間刺激した。 IFN- γ分泌する細胞数を ELISpot法で測定した (Xin et al, Gen e Ther. 2005, 12:1769-1777.)。
[0053] ¾
IFN- γ -ELISpotの結果を図 6に示す。 MVAワクチンでの免疫により、 SIV特異的な I FN- γ -分泌リンパ球は 470個/ 106細胞であつたのに対して、 Ad5/35ワクチンでのブ ストによりその細胞数は三倍以上に増えた（1708個/ 106細胞)。以上のことから、 M VAワクチンと Ad5/35ワクチンとを組合せて投与することにより、単独のワクチン投与 では得られな ヽ高 、免疫効果が得られることが SIVおよび HIVに対する予防効果と治 療効果が期待できた。
[0054] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
[0055] 2種類の組換えウィルスベクターを併用することにより、 HIVに対して強力な免疫反 応を誘導することができる。本発明の抗 HIV薬は、 HIV撲滅のために有効な治療を可 能とする。

Claims

請求の範囲
[1] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラウイ ルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターと、修飾ヮクシ- ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターと の組み合せカゝらなることを特徴とする抗 HIV薬。
[2] アデノウイルス 5型及び修飾ワクシニアウィルスアンカラが非増殖型である請求項 1記 載の抗 HIV薬。
[3] HIVの構造遺伝子力 env遺伝子及び/又は gag遺伝子である請求項 1又は 2に記載の 抗 HIV薬。
[4] 組換えウィルスベクターの少なくとも 1つに、さらに、 HIVの複製制御遺伝子が挿入さ れて 、る請求項 1〜3の!、ずれかに記載の抗 HIV薬。
[5] HIVの複製制御遺伝子力rev遺伝子である請求項 4記載の抗 HIV薬。
[6] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラウイ ルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターと、修飾ヮクシ- ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターと 力 なるキットである請求項 1〜5のいずれかに記載の抗 HIV薬。
[7] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラウイ ルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクター又は修飾ヮクシ- ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターの Vヽずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する請求項 6記載の抗 HIV薬。
[8] さらに、逆転写酵素阻害剤及び Z又はプロテアーゼ阻害剤を含む請求項 1〜7のい ずれかに記載の抗 HIV薬。
[9] 組換えウィルスベクターの投与前、投与後又は投与と同時に、少なくとも 1回、逆転 写酵素阻害剤及び Z又はプロテアーゼ阻害剤が被験者に投与される請求項 8記載 の抗 HIV薬。
[10] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラウイ ルスに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る組換えウィルスベクターと、修飾ヮクシ- ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターとを 治療及び/又は予防に有効な量で被験者に投与することを含む、 HIV感染の治療及 び/又は予防方法。
[11] アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来のものに置換したキメラウイ ルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクター又は修飾ヮクシ- ァウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィルスベクターの Vヽずれか一方で被験者を初回免疫した後、他方で追加免疫する請求項 10記載の方 法。
[12] 初回免疫と追加免疫の間隔が 1〜3か月程度である請求項 11記載の方法。
[13] 初回免疫と追加免疫の間隔が 2か月程度である請求項 12記載の方法。
[14] 抗 HIV薬の製造における、アデノウイルス 5型のファイバーをアデノウイルス 35型由来 のものに置換したキメラウィルスに HIVの構造遺伝子が挿入されている組換えウィル スベクターと、修飾ワクシニアウィルスアンカラに HIVの構造遺伝子が挿入されて 、る 組換えウィルスベクターとの組み合せの使用。
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