JP2017512499A - モザイクｈｉｖ−１配列およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｔ細胞応答を誘導するように設計されたモザイクＨＩＶ１遺伝子を対象とする。

Description

発明の分野

本出願は、２０１４年３月２５日出願の米国特許出願第６１／９６９，９５４号の優先権の利益を主張する。この出願の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれる。

本発明は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＨＩＶ／ＡＩＤＳ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｄｅｓｉｇｎの助成金ＵＭ１−ＡＩ１００６４５の下に、ＮＩＨ、ＮＩＡＩＤ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳからの政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。

本発明は、ウイルス感染の処置または予防のための組成物、方法、およびキットを提供する。ここに記載される多価（たとえば、２価）免疫原性組成物および方法は、ワクチンを接種された対象における細胞性免疫応答の多様性、幅、および深さを増大させることができる、計算上最適化されたＨＩＶ−１ポリペプチドおよびこれをコードする核酸配列を組み込む。

発明の背景

ウイルスに対する細胞性免疫応答を誘発するワクチンは、ウイルス感染を効果的に処置または予防するために、包括的なウイルス多様性を反映しなければならない。たとえば、強くて多様なＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞応答の開始は、おそらく、効果的なＨＩＶ−１ワクチンにとって重要である。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、ヒトにおける遅い疾患進行と相関し、そしてヒト以外の霊長類のワクチン接種モデルにおけるＣＴＬ応答の重要性は、よく確立されている。非常に可変的なエンベロープ（Ｅｎｖ）は、ＨＩＶに対する中和抗体にとって主要な標的であり、そしてワクチン抗原もまた、この抗体応答を誘発するように修正されることを要することとなる一方、Ｔ細胞ワクチン成分は、より保存されたタンパク質を標的として、交差反応する可能性が高い応答の引き金となることができる。しかし、最も保存されたＨＩＶ−１タンパク質ですら、変動が問題となるほど十分に多様である。

効果的なＨＩＶワクチンの設計は、多面性のあるチャレンジである。ワクチンは、好ましくは、本来の感染に対する免疫応答が、ウイルスを除外する（Ｎａｂｅｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９４５〜１９４７（２００２））ことも、重複感染から防御する（Ａｌｔｆｅｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ ４２０：４３４〜４３９（２００２））こともできない不全にもかかわらず、感染を予防することができる、または、感染が起これば、ウイルスの複製を最小限度に制御することができる免疫応答を誘発する。ベクター、免疫化プロトコル、およびアジュバントが最適化され（Ｎａｂｅｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１９４５〜１９４７（２００２））、多様な範囲の循環ウイルスに対する交差反応を起こし得る応答を刺激することができる抗原と組み合わされた（Ｇａｓｃｈｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４〜２３６０（２００２）、Ｋｏｒｂｅｒら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５８：１９〜４２（２００１））強力なワクチンが必要とされている。インフルエンザワクチンの学者が十年間直面してきた問題は、ＨＩＶ−１によって引き起こされるチャレンジを明らかにしており：ヒトインフルエンザ株は互いからの抗原性ドリフト分岐（antigenic drift diverge）を年間およそ１〜２％受けており、それでもなおワクチン抗原は多くの場合、交差反応性のＢ細胞の応答を毎年毎年誘発することができないことにより、当代の（contemporary）株を連続的に監視して、ワクチンを数年ごとにアップデートすることが必要となる（Ｋｏｒｂｅｒら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５８：１９〜４２（２００１））。対照的に、共循環する個々のＨＩＶ−１株は、比較的保存されたタンパク質において互いと２０％以上、そしてエンベロープタンパク質において最大３５％異なることがある（Ｇａｓｃｈｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４〜２３６０（２００２）、Ｋｏｒｂｅｒら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５８：１９〜４２（２００１））。

地域的ＨＩＶ−１蔓延におけるウイルス多様性の様々な程度が、ワクチン設計戦略にとって潜在的に有用なヒエラルキーを提供する。ある地理的領域では、多くの既知のＨＩＶ−１亜型、またはクレードが共循環して、包括的な多様性を再現し（たとえば、コンゴ民主共和国（ＭｏｋｉｌｉおよびＫｏｒｂｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ １１（Ｓｕｐｐｌ．１）：６６〜７５（２００５））；他では、２つの亜型およびそれらの組換え体によって支配され（たとえば、ウガンダ（Ｂａｒｕｇａｈａｒｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：４１３２〜４１３９（２００５）））、そして他では、単一の亜型による（たとえば、南アフリカ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １９：１３３〜１４４（２００３）））。単一の亜型蔓延が支配的なエリアですら、広範なクレード内多様性に対処しなければならない（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １９：１３３〜４４（２００３））が、海外旅行が地理的差異をさらにぼやけさせると予想することができるので、すべての国が、包括的なワクチンから利益を得るであろう。

ある側面において、本発明は、図１のモザイクポリペプチドのいずれか１つ、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む組成物を提供する。ある態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、Ｔ細胞応答を誘導する構成要素として、ＨＩＶ−１に対する体液性応答を誘導する免疫原をさらに含む免疫原性組成物中に含まれる。

ある側面において、本発明は、図１の２個のモザイクポリペプチド、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸の二価セットを含む組成物であって、２個のモザイクポリペプチドのセットが、同じウイルス遺伝子産物に対応する、組成物を提供する。図１の２個のモザイクポリペプチド、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸の二価セットを含む組成物であって、２個のモザイクポリペプチドのセットが、同じウイルスの遺伝子産物である、組成物。

ある側面において、組成物は、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．１、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む。ある側面において、組成物は、Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．１、Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む。ある側面において、組成物は、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む。ある側面において、組成物は、Ｐｏｌ．Ｍｏｓ．２．１、Ｐｏｌ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む。ある側面において、組成物は、Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む。ある側面において、組成物は、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．１、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．２、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む。

本発明の組成物は、Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。本発明の組成物は、Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．１、Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。本発明の組成物は、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．１、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。本発明の組成物は、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。

本発明の組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。

ある態様において、組成物は、体液性応答を誘発するのに適した免疫原、たとえば、限定されないが、ＨＩＶ１エンベロープをさらに含む。

ある側面において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の量を、そのような誘導をもたらすのに十分な量投与することを含む方法を提供する。ある態様において、本発明の方法は、体液性応答を誘発するのに適した免疫原、たとえば、限定されないが、ＨＩＶ１エンベロープを投与することをさらに含む。ある態様において、免疫原は、伝染体始祖ＨＩＶ１エンベロープである。ある態様において、エンベロープは、米国特許出願第６１／９５５，４０２号に記載されるＣＨ５０５エンベロープ、またはその組合せである。この出願の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれる。ある態様において、体液性応答は、ＨＩＶ１抗体であり、抗体は、ウイルスを中和する。

ある態様において、本発明の組成物および方法は、核酸の代わりにポリペプチドを含む。ある態様において、本発明の組成物および方法は、核酸とポリペプチドの組合せを含む。

図１は、２０１３年９月のＬｏｓ Ａｌａｍｏｓのデータベースアラインメントに基づいて、Ｔ細胞モザイク設計ツール（米国特許第７９５１３７７号参照）を用いて、ＨＩＶタンパク質ごとのＭグループの２モザイクペア（出現順に配列番号１〜１８）を示す。

詳細な説明

ここで示されるのは、包括的な循環［ＨＩＶ−１メイン（Ｍ）グループ］における、共通のＢおよびＣ亜型、またはすべてのＨＩＶ−１変異体のいずれかについて最適化された、Ｔリンパ球応答に集中する多価ワクチン抗原セットの設計である。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、直接、感染したウイルス産生宿主細胞を殺すが、これは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子によって感染細胞表面上に提示されるウイルスタンパク質フラグメント（エピトープ）を介して認識することによるものである。ヘルパーＴ細胞応答は、免疫応答の変化に富む側面を、サイトカインの放出を介して制御する。両方とも、ＨＩＶ−１ワクチンにとって重要である可能性がある：ＣＴＬ応答は、疾患進行を減速させる際に関係してきた（Ｏｘｅｎｉｕｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８９：１１９９〜２０８（２００４））；ヒト以外の霊長類におけるワクチン誘発細胞免疫応答が、病原性ＳＩＶまたはＳＨＩＶの制御を助けて、チャレンジ後の疾患の可能性を低下させる（Ｂａｒｏｕｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：４８６〜９２（２０００））；そしてＣＤ８＋Ｔ細胞の実験的な枯渇により、ＳＩＶ感染アカゲザルにおいてウイルス血症が増大する（Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８５７〜６０（１９９９））。さらに、ＣＴＬエスケープ突然変異は、疾患進行を伴う（Ｂａｒｏｕｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７７：７３６７〜７５（２００３））ので、潜在的エスケープ経路を遮断するワクチン刺激記憶応答は貴重であり得る。

非常に可変的なＥｎｖタンパク質は、ＨＩＶに対する中和抗体にとって主要な標的である；免疫防御が、Ｂ細胞とＴ細胞応答の両方をおそらく必要とすることとなるので（ＭｏｏｒｅおよびＢｕｒｔｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：７６９〜７１（２００４））、Ｅｎｖワクチン抗原もまた、抗体応答を誘発するように別個に最適化されることを要することとなる。Ｔ細胞指向性ワクチン成分は、対照的に、より保存されたタンパク質を標的とすることができるが、最も保存されたＨＩＶ−１タンパク質ですら、変動が問題となるほど十分に多様である。人工中心配列ワクチンアプローチ（たとえば、すべてのアミノ酸が複数の配列において見出されるコンセンサス配列、または祖先配列の最尤再構築（maximum likelihood reconstruction）（Ｇａｓｃｈｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４〜６０（２００２）、Ｇａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１５４〜６３（２００５）、Ｄｏｒｉａ−Ｒｏｓｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１２１４〜２４（２００５）、Ｗｅａｖｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、印刷中））が前途有望である；それでもやはり、集中化された株ですら、限られた範囲のＨＩＶ−１変異体しか提供せず、コンセンサスベースの試薬は、多くの自己Ｔ細胞応答を検出することができない（Ａｌｔｆｅｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：７３３０−４０（２００３））。

単一アミノ酸変化により、エピトープがＴ細胞サーベイランスを逃れることができる；多くのＴ細胞エピトープが、１つ以上の位置にてＨＩＶ−１株間で異なるため、任意の単一ワクチン抗原に対する潜在的応答が限られる。一部の変化が、広く、亜型間の交差反応性に影響を及ぼすが、特定の突然変異がエスケープをもたらすかどうかは、特異的なエピトープ／Ｔ細胞の組合せによって決まる（Ｎｏｒｒｉｓら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：３１５〜２５（２００４））。複数の変異体を多価ワクチン中に含むことは、より広い範囲の循環変異体に対する応答を可能にすることができ、そしてまた、共通のエスケープ変異体に対して免疫系をプライムすることもできる（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１２４３〜５６（２００４））。ある１つのＴ細胞受容体からのエスケープが、また別の１つに感受性である変異体を生じさせ得る（Ａｌｌｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１２９５２〜６０（２００５）、Ｆｅｅｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：７５２４〜３０（２００５））ので、エピトープ変異体に対するポリクローナル応答を刺激することは有益であり得る（Ｋｉｌｌｉａｎら，Ａｉｄｓ １９：８８７〜９６（２００５））。プロセシング（Ｍｉｌｉｃｉｃら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：４６１８〜２６（２００５））またはＨＬＡ結合（Ａｍｍａｒａｎｏｎｄら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２１：３９５〜７（２００５））を阻害するエスケープ突然変異は、直接、特異性が異なるＴ細胞によって対抗され得ないが、重なり合うエピトープに対する応答が、これらのエスケープ経路の一部でも遮断することができる。

本発明は、「モザイク」（最適化）タンパク質（またはこのタンパク質をコードする遺伝子）を含む多価ワクチンに関する。ある態様において、ワクチン組成物は、ＨＩＶ１遺伝子（複数）のいずれか１つ、またはそれらの任意の組合せを含む。候補ワクチン抗原は、ウイルスタンパク質のインプットセット中に潜在的Ｔ細胞エピトープの最大数を含むように最適化された、ｋ複合タンパク質のカクテル（ｋは、カクテル中の配列変異体の数である）であってもよい。ある態様において、ｋ＝２である。モザイクは、天然の配列から設計される：それは、天然のタンパク質に似ており、最も共通した形態の潜在的エピトープを含む。ＣＤ８＋エピトープが、連続し、かつ典型的には９個のアミノ酸長であるので、モザイクのセットは、天然の配列における九量体（９マー）の「範囲」によってスコア化され得る（同様の長さのフラグメントもまたよく表される）。少なくとも３回見出されない９マーは、排除され得る。設計モザイク（最適化ポリペプチド）のこの戦略は、非常に多価の多ペプチドワクチンによって達成される多様性範囲のレベルを提供するが、重要な利点がある：それは、インタクトなタンパク質または遺伝子としてのワクチン送達を可能にし、循環株に関連しない、低頻度の、または天然でないエピトープを排除し、そしてそのインタクトなタンパク質抗原は、本来の感染の場合のように処理される可能性が高い。

本発明は、合成ウイルスタンパク質（その配列は、循環ウイルス配列の稀でない短いストレッチの最大範囲を提供する）を含む抗原の多価セットが、良好なワクチン候補を構成するという具現化に由来する。本発明は、インプットとして提供された天然のタンパク質配列の任意のセットのフラグメントのモザイク混合物としての多価抗原のそのようなセットを生じさせる「遺伝的アルゴリズム」戦略を提供する。ＨＩＶの文脈では、ある態様において、タンパク質Ｇａｇが、そのような抗原の候補である。ある態様において、タンパク質ＧａｇおよびＮｅｆが、そのような抗原の候補である。範囲を拡張するために、他の態様において、Ｐｏｌおよび／またはＥｎｖが用いられてもよい。本発明は、これらのタンパク質について最適化されたモザイクセットをさらに提供する。

本発明の遺伝的アルゴリズム戦略は、インプットデータセットとして、一般的な集団から、アラインされていないタンパク質配列を用いるので、「アラインメント独立」である長所を有する。それは、自然界に見出されるタンパク質に似た人工モザイクタンパク質を生じさせる。小動物モデルにおけるコンセンサス抗原の成功により、これがうまく機能することが示唆される。９マーが、ここに記載される研究の焦点である。しかしながら、異なる長さのペプチドが、意図される標的に応じて選択されてもよい。本発明のアプローチに従えば、（たとえば）自然界において存在しない、または非常に稀である９マーが排除されてもよい。これは、コンセンサス配列に対する向上である。なぜなら、後者は、約９マー（（たとえば）自然界において見出されたことがなく、そして、天然の株に対して、ほぼ必ず、（たとえば）その株に固有の約９マーを含有する）を含有することがあるからである。遺伝的アルゴリズムに用いられる適応度の定義は、最も「フィットした」多価カクテルが、集団における９マーのすべてのうちの最も良い範囲（完全なマッチの最も高い画分）を与えるモザイク株の組合せであり、かつ９マーが集団において不在でも稀でもないという制約がつくことである。

本発明のモザイクタンパク質セットは、様々なインプットデータセットに対して最適化されてもよい。これにより、現在のデータの使用が、Ｔ細胞の観点から、亜型の長所または領域特異的なワクチンを評価することができる。

本発明の、タンパク質／ポリペプチド／ペプチド、およびこれらをコードする核酸（「免疫原」）は、当該技術において周知である技術を用いて、医薬的に許容可能なキャリアおよび／またはアジュバントと共に組成物中に製剤化されてもよい。投与の適切な経路として、全身性の（たとえば、筋肉内または皮下の）、経口の、膣内の、直腸内の、そして鼻腔内のものが挙げられる。本発明の免疫原は、当業者に周知である方法を用いて、化学的に合成かつ精製されてもよい。免疫原は、周知の組換えＤＮＡ技術によって合成されてもよい。

本発明の免疫原をコードする核酸は、たとえば、コード配列が裸のＤＮＡとして投与されるＤＮＡワクチンの成分として用いられてもよいし、またはたとえば、免疫原をコードするミニ遺伝子がウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列は、たとえば、マイコバクテリウムにおいて、組換えキメラアデノウイルスにおいて、または組換え弱毒化水疱性口内炎ウイルスにおいて、発現されてもよい。コード配列はまた、たとえば、複製もしくは非複製アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、弱毒化マイコバクテリウム結核ベクター、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属カルメットゲラン（ＢＣＧ）ベクター、ワクシニアもしくは修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、別の水痘ウイルスベクター、組換えポリオおよび他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属種細菌ベクター、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属種細菌ベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクター、セムリキ森ウイルスベクター、またはタバコモザイクウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列はまた、たとえば、活性があるプロモータ、たとえばＣＭＶプロモータを有するＤＮＡプラスミドとして発現されてもよい。他の生きたベクターもまた、本発明の配列を発現するのに用いられてもよい。ある態様において、本発明の核酸は、発現ベクターまたは送達機構のために最適化される。本発明の免疫原の発現は、好ましくはヒト細胞における発現を最適化するコドンおよびプロモータを用いて、患者自身の細胞において、免疫原をコードする核酸の、その細胞中への導入によって、誘導されてもよい。ＤＮＡワクチンを製造して用いる方法の例が、米国特許第５，５８０，８５９号、５，５８９，４６６号、および５，７０３，０５５号において開示されている。コドン最適化法の例が、Ｈａａｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：３１５〜３２４（１９９６）およびＡｎｄｒｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４９７〜１５０３（１９９８）において記載されている。

アジュバント、またはその他免疫原性効果を高めるために投与されるものが、本発明の組成物中に含まれてもよいことが理解されるであろう。適切なアジュバントの例として、ＴＬＲアゴニスト、たとえば、限定されないが、ＴＬＲ−９アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ならびにＴＬＲ−７、８および９のアゴニストの組合せが挙げられる。他の態様において、アジュバントはミョウバンである。アジュバントは、油および水エマルジョンの形態をとってもよい。スクアレンアジュバントが用いられてもよい。適切なアジュバントとして、たとえば、限定されないが、タンパク質または核酸免疫化に適した、ミョウバン、ポリＩＣ、ＭＦ−５９、または他のスクアレンベースのアジュバント、ＡＳＯＩＢ、または他のリポソームベースのアジュバントが挙げられる。ある態様において、ＴＬＲアゴニストがアジュバントとして用いられる。一部の態様において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニスト、たとえば、限定されないが、ＧＬＡ／ＳＥである。他の態様において、免疫寛容を壊すアジュバントが、免疫原性組成物中に含まれる。一部の態様において、アジュバントは、ＴＬＲ７もしくはＴＬＲ７／８アゴニスト、ＴＬＲ−９アゴニスト、またはそれらの組合せである。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２９１６４号参照。本発明はまた、アゴニストの任意の適切な組合せを企図する。

本発明の組成物は、医薬的に許容可能な送達系において、免疫学的に有効な量の、本発明の免疫原、またはこれをコードする核酸配列を含む。本組成物は、ウイルス感染（たとえばＨＩＶ感染症）の予防および／または処置に用いることができる。先に示されるように、本発明の組成物は、ワクチン組成物中にルーチン的に提供される、アジュバント、乳化剤、医薬的に許容可能なキャリア、または他の成分を用いて製剤化することができる。最適な製剤が、当業者によって容易に設計され得、即放および／または徐放のための、そして全身性の免疫の誘導および／または局所化された粘膜免疫の誘導のための製剤を含んでもよい（たとえば、製剤は、鼻腔内、膣内、または直腸内投与用に設計されてもよい）。先に述べられるように、本発明の組成物は、皮下、鼻腔内、経口、筋肉内、または他の非経口もしくは腸内経路を含む任意の都合の良い経路によって投与することができる。免疫原は、単回用量または複数回用量として投与されてもよい。最適の免疫化スケジュールが、当業者によって容易に決定され得、そして患者、組成物、および求められる効果によって変化してもよい。

本発明は、本発明の免疫原、および／またはこれをコードする核酸、および／または先に示されるように発現された免疫原の直接的な使用を企図する。たとえば、免疫原をコードするミニ遺伝子が、プライムおよび／またはブーストとして用いられてもよい。

ある側面において、本発明は、ここで開示されるすべてのアミノ酸配列、およびこれをコードする核酸配列（およびそのようなコード配列と相補的な核酸）を含む。他の側面において、本発明は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫原性組成物のＴ細胞成分としてアミノ酸および／または核酸配列を投与することを含む方法を対象とする。ある態様において、誘導された免疫応答は、ウイルス感染の危険性を低下させる。他の態様において、誘導された免疫応答は、ウイルス感染を処置する、たとえば、限定されないが、ウイルス負荷を低下させる。

ある側面において、本発明は、２０１３年９月のＬｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベースアラインメントに基づいて、ＨＩＶタンパク質ごとのＭグループモザイクペアを提供する。ここに記載される二価モザイクは、Ｔ細胞応答のために設計されている。ある態様において、これらは、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物および方法において、Ｔ細胞成分として含まれる。ＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞は、おそらく、ＨＩＶ−１特異的ワクチン応答にとって重要である：ＣＴＬ応答は、ヒトにおける遅い疾患進行と相関し（Ｏｘｅｎｉｕｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８９：１１９９〜１２０８（２００４））、そしてヒト以外の霊長類のワクチン接種モデルにおけるＣＴＬ応答の重要性は、よく確立されている。ワクチン誘発細胞免疫応答は、病原性ＳＩＶまたはＳＨＩＶの制御を助けて、病原性ウイルスによるチャレンジ後の疾患の可能性を低下させる（Ｂａｒｏｕｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：４８６〜４９２（２０００））。ＣＤ８＋Ｔ細胞の一時的な枯渇により、ＳＩＶ感染したアカゲザルにおいてウイルス血症が増大する（Ｓｃｈｍｉｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８５７〜８６０（１９９９））。さらに、エスケープ突然変異の進化は、疾患進行を伴ったことから、ＣＴＬ応答が、インビボウイルス複製の制約を助ける（Ｂａｒｏｕｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：７３６７〜７３７５（２００３））ので、潜在的エスケープ経路を遮断することができるワクチン刺激記憶応答は価値があり得ることが示される。非常に可変的なエンベロープ（Ｅｎｖ）が、ＨＩＶに対する中和抗体にとって主要な標的であり、そしてワクチン抗原もまた、この抗体応答を誘発するように修正されることを要することとなる（ＭｏｏｒｅおよびＢｕｒｔｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：７６９〜７７１（２００４））一方、Ｔ細胞ワクチン成分は、より保存されたタンパク質を標的として、交差反応する可能性が高い応答の引き金となることができる。しかし、最も保存されたＨＩＶ−１タンパク質ですら、変動が問題となるほど十分に多様である。人工の中心配列ワクチンアプローチ、コンセンサスおよび祖先配列（Ｇａｓｃｈｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２３５４〜２３６０（２００２）、Ｇａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１５４〜１１６３（２００５）、Ｄｏｒｉａ−Ｒｏｓｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７９：１１２１４〜１１２２４（２００５））（これらは、本質的に、株間の「差異を分割する」）は、望みを示し、応答を刺激して、天然の株ワクチンと比較して交差反応性を高める（Ｇａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１５４〜１１６３（２００５））（ＬｉａｏらおよびＷｅａｖｅｒら，投稿中）。それでもやはり、中心株ですら、ＨＩＶ多様性の範囲を非常に限られた程度にしかカバーせず、コンセンサスベースのペプチド試薬は、多くの自己ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を検出することができない（Ａｌｔｆｅｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：７３３０〜７３４０（２００３））。

単一アミノ酸置換が、Ｔ細胞エスケープを媒介することができる。そして、多くのＴ細胞エピトープにおける１個以上のアミノ酸がＨＩＶ−１株間で異なるので、いずれか１個のワクチン抗原に対する応答の潜在的有効性は限定される。一部の変化が、広く、クレード間の交差反応性に影響を及ぼし得るが、特定の突然変異がＴ細胞交差反応性を減弱させることとなるかどうかは、エピトープおよびＴ細胞特異的である（Ｎｏｒｒｉｓら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２０：３１５〜３２５（２００４））。より多くの変異体を多価ワクチン中に含むことは、より広い範囲の循環変異体に対する応答を可能にすることができる。それはまた、共通のエスケープ変異体に対して免疫系をプライムすることもできる（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１２４３〜１２５６（２００４））。ある１つのＴ細胞受容体からのエスケープが、また別の１つに感受性である変異体を生じさせ得る（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１４５５〜１４６６（２００４））ので、エピトープ変異体に対するポリクローナル応答を刺激することは有益であり得る（Ｋｉｌｌｉａｎら，ＡＩＤＳ １９：８８７〜８９６（２００５））。プロセシング（Ｍｉｌｉｃｉｃら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：４６１８〜４６２６（２００５））またはＨＬＡ結合（Ａｍｍａｒａｎｏｎｄら，ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ２１：３９５〜３９７（２００５））を阻害する免疫エスケープ関与アベニューは、エピトープ提示を予防し、そしてそのような場合、エスケープ変異体は、特異性が異なるＴ細胞によって対抗され得ない。しかしながら、重なり合うエピトープを認識するＴ細胞の存在は、場合によっては、これらのエスケープ経路すらも遮断することが可能である。

ある側面において、本発明は、ワクチンの成分としての、二価モザイクＨＩＶポリペプチド、およびこれをコードする核酸配列を提供し、モザイクは、ＨＩＶに対するＣＤ４およびＣＤ８応答に最適な範囲を提供して、伝染時のウイルス感染Ｔ細胞およびマクロファージの除外を促進し、かつＢ細胞免疫原ワクチンによる抗体誘導を手助けする最適Ｔ細胞の誘導を促進するように設計されている。

二価モザイクＨＩＶ遺伝子は、ＤＮＡプライム、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）レジメンとして、または複数の免疫化ＤＮＡもしくはｍＲＮＡとして投与されてもよい。ある態様において、核酸配列は、宿主細胞、たとえば哺乳類細胞、ｒＢＣＧ細胞、ウイルスベクター、または他の任意の適切な発現系における最適発現のために最適化されたコドンである。

ヌクレオチドベースのワクチンは、実質的に任意のタンパク質抗原に対して免疫化する、順応性のあるベクターフォーマットを提供する。現在では、遺伝的ワクチン接種の２つの型が、試験に利用可能である（ＤＮＡおよびｍＲＮＡ）。

ある側面において、本発明は、免疫原がＤＮＡとして送達される免疫原性組成物を用いることを企図する。Ｇｒａｈａｍ ＢＳ，Ｅｎａｍａ ＭＥ，Ｎａｓｏｎ ＭＣ，Ｇｏｒｄｏｎ ＩＪ，Ｐｅｅｌ ＳＡ，ら（２０１３）ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ａ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｆｔｅｒ ｒＡｄ５ Ｂｏｏｓｔ ｉｎ ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ５９３４０，９頁参照。免疫応答、つまりＴ細胞と体液性の両応答を誘発するようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡとしての核酸の送達のための種々の技術が、当該技術において知られており、かつ開発中である。ある態様において、ＤＮＡは裸のＤＮＡとして送達されてもよい。ある態様において、ＤＮＡは遺伝子ガンによる送達用に製剤化される。ある態様において、ＤＮＡは、エレクトロポレーションによって、またはニードルフリーな注射技術、たとえば、限定されないが、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）装置によって、投与される。

ある態様において、ＤＮＡはベクター中に挿入される。ＤＮＡは、哺乳類細胞における発現に適したベクターを用いて送達される。ある態様において、このモザイクをコードする核酸は、発現のために最適化されている。ある態様において、ＤＮＡは最適化されており、たとえば、コドンが、発現のために最適化されている。ある態様において、核酸は、ベクターおよび／または哺乳類細胞における発現のために最適化されている。非限定的な態様において、これらは、細菌に由来するベクター、アデノウイルスベースのベクター、ｒアデノウイルス（Ｂａｒｏｕｃｈ ＤＨ，ら Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６：３１９〜２３，２０１０）、組換えマイコバクテリウム（すなわち、ｒＢＣＧまたはスメグマ菌（Ｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ））（Ｙｕ，ＪＳら Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：８８６〜０９３，２００７；ｉｂｉｄ １３：１２０４〜１１，２００６）、およびベクターの組換えワクシニア型（Ｓａｎｔｒａ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６：３２４〜８，２０１０）、たとえば、限定されないが、ＡＬＶＡＣ、複製（Ｋｉｂｌｅｒ ＫＶら，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２５６７４，２０１１ ｎｏｖ ９．）および非複製（Ｐｅｒｒｅａｕ Ｍら Ｊ．ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５：９８５４〜６２，２０１１）ＮＹＶＡＣ、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、アデノ随伴ウイルス、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）レプリコン、単純ヘルペスウイルスベクター、および他の適切なベクターである。

ある側面において、本発明は、免疫原が、適切な製剤中のＤＮＡまたはＲＮＡとして送達される、免疫原性組成物を用いることを企図する。ＤＮＡまたはＲＮＡを用いること、または核酸分子と他の実体の複合体を用いることを企図する種々の技術が、免疫化において用いられてもよい。ある態様において、ＤＮＡまたはＲＮＡが、ブロックコポリマー（両親媒性ブロックコポリマー７０４）と共に製剤化された低用量抗原コードＤＮＡからなるナノ粒子として投与される。Ｃａｎｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１ ５４巻ｊ １１５〜１２１；Ａｒｎａｏｔｙら，Ｃｈａｐｔｅｒ １７ ｉｎ Ｙｖｅｓ Ｂｉｇｏｔ（編），Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８５９巻，２９３〜３０５頁（２０１２）；Ａｒｎａｏｔｙら（２０１３）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３ ８月；２８８（７〜８）：３４７〜６３参照。免疫原性巨大分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）送達のための、Ｎａｎｏｔａｘｉ（登録商標）と呼ばれるナノキャリア技術が開発中である。たとえば、ＩｎＣｅｌｌＡｒｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ参照。

ここに記載されるのは、ＨＩＶ−１エンベロープの核およびアミノ酸配列である。ある態様において、記載されるＨＩＶ−１エンベロープ配列は、ｇｐ１６０ｓである。ある態様において、記載されるＨＩＶ−１エンベロープ配列は、ｇｐ１２０ｓである。他の配列として、たとえば、限定されないが、両方とも切断されている、そして切断されていないｇｐ１４５ｓ、ｇｐ１４０ｓ、ｇｐ１５０ｓ、ｇｐ４１ｓがあり、これらは核酸およびアミノ酸ｇｐ１６０配列から容易に得られる。ある態様において、核酸配列は、宿主細胞、たとえば哺乳類細胞、ｒＢＣＧ細胞、または他の任意の適切な発現系における最適発現のために最適化されたコドンである。

ある態様において、本発明に従うエンベロープ設計は、Ｎ末端にて残基（たとえば、５〜１１、５、６、７、８、９、１０または１１個のアミノ酸）の欠失を伴う。デルタＮ末端設計について、４個またはさらに少数の残基から、１４個またはさらに多数の残基にまで及ぶアミノ酸残基が欠失している。これらの残基は、成熟（通常、ＣＸで終わるシグナルペプチド（Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい））と「ＶＰＶＸＸＸＸ…」との間にある。一例としてのＣＨ５０５ Ｔ／Ｆ Ｅｎｖの場合には、８個のアミノ酸（以下の配列において、イタリック体にされ、かつ下線が引かれている）が欠失した：
ＭＲＶＭＧＩＱＲＮＹＰＱＷＷＩＷＳＭＬＧＦＷＭＬＭＩＣＮＧＭＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫＥＡＫＴＴＬＦＣＡＳＤＡＫＡＹＥＫＥＶＨＮＶＷＡＴＨＡＣＶＰＴＤＰＮＰＱＥ…（エンベロープ配列の残りが、「…」と示される）。他の態様において、ＣＨ５０５ Ｔ／Ｆエンベロープについて記載されるデルタＮ−設計は、他のＣＨ５０５エンベロープのデルタＮ−設計を製造するのに用いることができる。ある態様において、本発明は、一般に、Ｎ末端単純ヘルペスｇＤタグがｇｐ１２０のＮ末端のアミノ酸と置換されておらず、ＨＩＶリーダー配列（または他のリーダー配列）を有し、そして元の約４個から約２５個の、たとえば１１個の、エンベロープのＮ末端のアミノ酸がない（たとえばｇｐ１２０）、免疫原ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、またはｇｐ１４０に関する。国際公開第２０１３／００６６８８号、たとえば１０〜１２頁参照。この公報の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれる。

エンベロープのＮ末端アミノ酸の欠失の一般的な戦略は、二量体とは対照的に、主に単量体である、哺乳類細胞において発現されるタンパク質、たとえばｇｐｌ２０ｓをもたらすので、市販のｇｐ１２０ Ｅｎｖワクチン生産の生産およびスケーラビリティ問題を解決する。他の態様において、Ｎ末端のアミノ酸欠失は、エンベロープの免疫原性を増大させる。

ある態様において、本発明は、エンベロープ配列、アミノ酸配列、および対応する核酸を提供し、Ｖ３ループは、以下のＶ３ループ配列ＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＧＰＧＱＴＦＹ ＡＴＧＤＩＩＧＮＩＲＱＡＨで置換されている。Ｖ３ループのこの置換は、産物切断を低下させ、ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質産生中のタンパク質収率を向上させる。

ある側面において、本発明は、免疫原が組換えタンパク質として送達される免疫原性組成物を用いることを企図する。免疫化に用いるのに適した組換えタンパク質の種々の生産および精製法が、当該技術において知られている。

免疫原性組成物はまた、タンパク質ブーストとして、種々の核酸プライム（たとえば、ウイルスまたは細菌ベクター中で発現されるＤＮＡとして送達されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ）と組み合わせて投与されてもよい。

タンパク質および核酸の投与量は、当業者によって容易に決定され得る。核酸の単回用量は、数ナノグラム（ｎｇ）から数マイクログラム（μｇ）またはミリグラムの単回免疫原性核酸に及んでもよい。組換えタンパク質用量は、数μｇマイクログラムから数百マイクログラムまたはミリグラムの単回免疫原性ポリペプチドに及んでもよい。

投与：組成物は、種々の経路の投与に適した組成物を与えるために、既知の技術を用いて、適切なキャリアと共に製剤化されてもよい。ある態様において、組成物は、筋肉内（ＩＭ）、皮下、静脈内、経鼻、粘膜経路を介して送達される。

組成物は、免疫化に適した組成物を与えるために、技術を用いて、適切なキャリアおよびアジュバントと共に製剤化されてもよい。組成物はアジュバント、たとえば、限定されないが、ミョウバン、ポリＩＣ、ＭＦ−５９、またはタンパク質もしくは核酸免疫化に適した、他のスクアレンベースのアジュバント、ＡＳＯＩＢ、もしくは他のリポソームベースのアジュバントを含んでもよい。ある態様において、ＴＬＲアゴニストがアジュバントとして用いられる。他の態様において、免疫寛容を壊すアジュバントが、免疫原性組成物中に含まれる。

二価モザイクゲノムセットにおけるいずれかの遺伝子、またはそれらの組合せが、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘導する方法において用いられてもよい。ある態様において、本発明は、エンベロープとＧａｇおよびＶｉｆモザイク遺伝子との組合せを企図する。

ある態様において、最適ＨＩＶワクチンは、抗体誘導を手助けする最適Ｔ細胞のための二価モザイクＴ細胞成分を含むこととなるだけでなく、広域中和抗体を誘導するワクチン免疫原、たとえば、ＣＤ４結合部位広域中和抗体の誘導のためのＥｎｖのＣＨ５０５スワーム（swarm）（米国特許出願第６１／９５５，４０２号。この出願の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれ、たとえば、その中で開示されるすべての配列、実施例におけるすべてのエンベロープ選択である）も含むであろう。本発明のモザイクＴ細胞免疫原と共投与され得る他のスワームワクチンは、Ｖ３グリカンｍａｂの誘導のためのＥｎｖのスワーム（たとえば、ＣＨ６９４由来の配列、米国特許出願第６１／８８３，５６１号、たとえば図１０。この出願の全内容は、その全体が参照によってここに組み込まれる）、Ｖ３グリカンｍＡｂを誘導するためのＣＨ８４８エンベロープ、およびＣＤ４結合部位ｍＡｂを誘導するためのＥｎｖのスワーム（たとえば、米国特許出願第６１／８８４，０１４号に開示されるＣＨ１７５４エンベロープから選択されるエンベロープ配列。この出願の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれる）であってもよい。

たとえば、組み合わせたＴおよびＢ細胞ワクチンは、遺伝的プライムとして投与されてもよく、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとして発現されるモザイク二価ワクチン遺伝子は、タンパク質、ＤＮＡ、ｍＲＮＡのいずれかとしてのＣＨ５０５ Ｅｎｖと共投与される、または水痘ウイルスベクター、たとえば修飾ワクシニアアンカラまたはＮＹＶＡＣにおいて発現される。

複数種の抗体の誘導のために、ＣＨ５０５ ｅｎｖが、ＣＨ８４８ Ｅｎｖと組み合わされてよく、Ｂ細胞免疫原が、ＣＤ４結合部位およびＶ３グリカン部位抗体を誘導することができる。ＣＨ５０５ Ｅｎｖはまた、Ｎ１５６およびＮ１６０グリカンを有し、かつＶ１Ｖ２ ｂｎＡｂ ＰＧ９に結合する。しかしながら、ＰＧ９未変異共通祖先は、ＣＨ５０５ Ｅｎｖに結合しないが、合成Ｖ２ペプチドグリカンは、ＰＧ９ ＵＣＡに結合する（Ａｌａｍ，ＰＮＡＳ １１０：１８２１４〜９，２０１３）。このように、同時に、ＣＤ４結合部位抗体を（ＣＨ５０５ Ｅｎｖで）、Ｖ３グリカン抗体を（ＣＨ８４８連続Ｅｎｖで）、そしてＶ１Ｖ２グリカン抗体を（Ｖ２ペプチドグリカンでプラムさせて、ＣＨ５０５ Ｅｎｖでブーストすることで）刺激するために、当業者は、ｂｎＡｂの３つの特異性を誘導することができる多成分免疫原を想定してもよい。ｂｎＡｂの、少なくとも１を超える特異性を誘導することは、Ｔ／Ｆウイルスのエスケープを妨げるのに重要であろう。

以下の非限定的な実施例において本発明をさらに記載する。

［実施例］
例１
以前に記載された遺伝的アルゴリズム（米国特許第７９５１３７７号、実施例１。この出願の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれる）、および２０１３年９月のＨＩＶ配列データベース（ＵＲＬ：ｈｉｖ−ｄｏｔ−ｌａｎｌ−ｄｏｔ−ｇｏｖ）を用いて、ＨＩＶタンパク質ごとに最適化した、一組の二価配列を設計した（図１）。これらの分析を実行するのに用いたコードは：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｔ１０／ｐｕｂ／ｂｔｌｋ／ｍｏｓａｉｃｓにて入手可能である。ある態様において、これらの配列を、種々のワクチン接種スケジュールにおける免疫原性組成物の使用に適するように修飾することができる。ある態様において、修飾は、Ｅｎｖにおける切断／融合活性を除外すること、Ｐｏｌにおける触媒活性を除外すること、Ｎｅｆにおけるミリスチル化部位を除外することを含む。他の態様において、本発明は、限定されないが、ＧａｇＮｅｆ、ＧａｇＰｏｌ、もしくはＧａｇＰｏｌＮｅｆ；ＧａｇＶｉｆ、もしくはＧａｇＶｉｆＥｎｖ、またはＨＩＶ遺伝子の他の任意の組合せを含む融合構築物の構築を提供する。

例２
本発明の二価Ｍグループモザイク設計、たとえば、モザイクエンベロープを、Ｍコンセンサス配列および／または最適天然クレードＣ（またはクレードＢ）配列と比較することができる。Ｍコンセンサスエンベロープ配列（ＣＯＮ−Ｓ）は、世界中の循環ウイルスのコンセンサスを表す合成配列を表す。２価Ｍモザイク配列を、図１に記載する。最適天然クレードＣ配列は、特性が最も「コンセンサス様」である、実際のクレードＣ ＨＩＶ−１ウイルス由来の天然に存在する配列である。細胞の免疫幅は、任意の適切なアッセイによってアッセイすることができる。一態様において、それは、包括的な潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドセットから、応答ペプチドの数を評価することによって、判断することができる。ＰＴＥペプチドは、包括的なＨＩＶ−１配列の８５％超を表し、ＮＩＨから自由に入手可能である。

抗原が、たとえばＮＹＶＡＣベクター中の、ＤＮＡとして、動物、たとえばヒト以外の霊長類に送達される一態様において、本発明の二価モザイク設計は、ＰＥＴペプチドの、コンセンサスおよび最適天然配列の幅／数および深さ／多様性によって測定される免疫原性に優る性能を示すこととなる。

例３
効果的な予防ＨＩＶ−１ワクチンの開発に対する主要な障害の１つが、ウイルスに対する広域中和抗体（ｂｎＡｂ）を誘導するチャレンジである。ｂｎＡｂの誘発がチャレンジングであるいくつかの理由があり、これらとして、ウイルスエンベロープの立体構造、潜在的に有用な抗体応答の抑制に至り得る、保存エピトープによる宿主抗原の分子模倣、ならびに可変ドメインにおける高レベルの体細胞突然変異および複雑な成熟経路の要件が挙げられる［１〜３］。ＨＩＶ−１感染個体の最大２５％が、感染後２〜４年で検出されるｂｎＡｂを発現することが示された。現在まで、すべてのｂｎＡｂは、通常でない抗体形質：高レベルの体細胞突然変異、宿主抗原による自己反応性、および長重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）（すべての形質は、宿主免疫調節機構によって制御または修飾される）の１以上を有する。ゆえに、典型的なワクチン接種の単回のプライムおよびブーストが、ｂｎＡｂを誘導可能であるのに十分でなかろう；むしろ、慢性的感染個体においてｂｎＡｂ誘導を模倣するには、おそらく長期間にわたる、Ｅｎｖ免疫原による連続した免疫化を要することとなるという仮説が出された［４］。

ｂｎＡｂの制御に関与する宿主免疫調節機構を回避するプロセスが、Ｂ細胞系統免疫原設計と呼ばれ、未変異共通祖先（ＵＣＡ：unmutated common ancestor）またはｂｎＡｂクローン系統の生殖系列遺伝子のＢ細胞受容体との高い親和性を有する連続Ｅｎｖ免疫原が選択される［４］。ｂｎＡｂをインビトロで実際に生じさせるＥｎｖの進化経路から、ここに記載するように、免疫化用のＥｎｖを、結合のためにランダムにピックアップしてもよいし、選択してもよい。Ｌｉａｏおよび共同研究者らは、最近、血清転換時から血漿ｂｎＡｂ誘導の発現までのＨＩＶ−１とＣＤ４結合部位ｂｎＡｂの共進化を記載しており、これによって、このＣＤ４結合部位ｂｎＡｂ型の生成の原因となる経路をマッピングする機会が示された［５］。著者らは、単一の伝染／始祖ウイルス（transmitted/founder virus）が、ｂｎＡｂ ＵＣＡに結合することが可能であることを示し、そして、おそらく、ｂｎＡｂ系統の刺激体である始祖ウイルスの一連の進化エンベロープタンパク質を同定した。ゆえに、この研究は、所望のＢ細胞応答を駆動させることができ、そして広域かつ強力な中和抗体の発現を誘導することができる天然由来のウイルスエンベロープを用いてワクチン接種する機会のあるＨＶＴＮを示す。ヒト抗体レパートリーが多様である一方、Ｂ細胞系統の少数の型しかｂｎＡｂ発現に至ることができないこと、そしてこれらの系統がいくつかの個体の全体にわたって類似することが見出された［６、７］。ゆえに、一個体由来のＥｎｖの使用が、その他に一般化することとなるというのがもっともらしい。

ワクチン接種を受けた者において広域中和抗体を誘発するチャレンジに対処するこのコンセプトシートのアプローチは、ＨＩＶ感染した個体において、ＣＤ４結合部位ｂｎＡｂクローン系統を誘導した多数の多様なウイルス間で、その個体から連続組換えＥｎｖを製造することによってＥｎｖ免疫原を選択することと、このＥｎｖをワクチン接種に用いることとを含む。ゆえに、Ｂ細胞系統ワクチン戦略は、既知のｂｎＡｂ系統の、未変異の祖先および中間の祖先に基づいて、免疫原を設計することを含む。候補ワクチンは、伝染／始祖ウイルスエンベロープを用いて、最初に、ｂｎＡｂ系統の初めのステージを刺激し、そして続いて、進化したＥｎｖ変異体によりブーストさせて、親和性成熟およびｂｎＡｂ活性に必要とされる高レベルの体細胞突然変異を再現することができる。このような戦略の目的は、選択的に、所望のｂｎＡｂ経路を駆動させることである。

Ｌｉａｏらは、ＣＨＡＶＩ ＣＨ５０５ ｂｎＡｂ個体において、ＣＨ１０３ ＣＤ４結合部位ｂｎＡｂ系統が、最初に自己中和抗体活性を発現した系統メンバーから始めてから、変異ＣＨ５０５ Ｅｎｖとして、ｂｎＡｂ活性を呈することを実証した。ゆえに、ｂｎＡｂ発現の第１の工程は、伝染／始祖ウイルスを中和する能力の発現である。

コンセプトにおいて、発明者らがトライアル１で用いることを提案するＣＨ５０５伝染／始祖（Ｔ／Ｆ）ウイルスを、アカゲザルにおいて試験した；３回の免疫化の後、それは、１突然変異のみを有する、Ｔ／Ｆウイルスおよび初期（４週目）のＴ／Ｆ変異体を中和する血漿抗体を誘導した。また、ＣＨ５０５ Ｔ／Ｆ Ｅｎｖ免疫化アカゲザルにおける記憶Ｂ細胞のフロー表現型分析は、ＲＳＣ３ ３７１変異体タンパク質ではなくＥｎｖタンパク質ＲＳＣ３に結合する抗原特異的記憶Ｂ細胞の存在を実証し［８］、Ｂ細胞がＣＤ４結合部位ｂｎＡｂ系統を開始したことを強く示している。

ある態様において、用いたＣＨ５０５ウイルスは、ＣＨ５０５ Ｔ／Ｆの代わりにｗ００４．０３である。

広域中和抗体はおそらく、単一のＥｎｖによって誘導されることはなく、多価ランダムＥｎｖ（たとえばＨＶＴＮ ５０５）の混合物ですら、ｂｎＡｂを誘導しそうにない。むしろ、ｂｎＡｂ系統のＵＣＡが、最初のｂｎＡｂ系統成熟を経験する引き金となり、その後、連続免疫原を用いて、所望の系統を完全に拡張するように、免疫原が設計されなければならない。提案したトライアルは、ｂｎＡｂの複数の特異性を駆動させるような免疫原の最適セットを開発するためのこのコンセプトを試験する多くの実験的臨床トライアルの始まりを表すこととなる。ＨＶＴＮは、この努力の最前線にあることとなる。

コンセプトは、個体間の少数のｂｎＡｂモチーフの収束により、複数の個体におけるＣＤ４結合部位系統の駆動に適用可能である。アジュバントは、ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有するＧＳＫ ＡＳ０１Ｅアジュバントとなろう。他の適切なアジュバントを用いてもよい。このアジュバントは、ＧＳＫによって、類似するアジュバントＡＳ０１Ｂと同じくらい強力であるが、ワクチン抗原としてＨＢｓＡｇを用いると反応原性がより低いことが示された［Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓら，ＩＡＢＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，９］。

スキーマトライアル（ＨＩＶエンベロープの連続用量（たとえば米国特許出願第６１／９５５，４０２号参照。この出願の内容は、その全体が参照によってここに組み込まれ、たとえばその中で開示されるすべての配列、実施例におけるすべてのエンベロープ選択、および二価モザイクである）：ＮＨＰ研究；健常なヒト対象による臨床トライアル

スキーマトライアル（ＨＩＶエンベロープおよび二価モザイクの連続用量）：ＮＨＰ研究；健常なヒト対象による臨床トライアル
注釈：Ｔ／Ｆ＝伝染／始祖タンパク質；スワーム＝Ｔ／Ｆ、５３、７８、および１００の混合物；含まれる実例タンパク質用量、用量設定研究によって知ることとなる実際の総用量。

産物：ＣＨ５０５ＴＦ：ＡＳ０１Ｅによる伝染／始祖ＨＩＶ ｇｐ１２０；ＣＨ５０５ｗ５３．１：ＡＳ０１Ｅによる５３週目ＨＩＶ ｇｐ１２０；ＣＨ５０５ｗ７８．３３：ＡＳ０１Ｅによる７８週目ＨＩＶ ｇｐ１２０；ＣＨ５０５ｗ１００．６：ＡＳ０１Ｅによる１００週目ＨＩＶ ｇｐ１２０
ＤＮＡモザイク：モザイクＥｎｖで構成される二価ワクチン。Ｍｏｓ．２．１およびＥｎｖ．Ｍｏｓ．２．１は、包括的な範囲のために最適化している。図１参照。すべてｇｐ１６０ Ｅｎｖタンパク質を発現する。ここに記載される他の任意の適切なモザイクをトライアルに用いることができる。

プラセボ：注射用の塩化ナトリウム。

統計的考察
発生およびサンプルサイズの計算：トライアル＃２への補充は、クレードＢが支配的なクレードである地域において、ＨＩＶ感染症の危険性が低い、１８から５０歳の６０人の健常なＨＩＶ非感染成人を標的とすることとなる。登録者は、第１の研究ワクチン接種の受入れが同時発生的となるので、すべての参加者が、いくらかの安全性データを提供することとなる。しかしながら、免疫原性分析について、種々の理由、たとえば、初期の研究からの参加者の終結、試料の出荷問題、または処理した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の低い細胞生存度のために、データが欠けている可能性がある。２００５年６月以降に登録を始めた１１人のフェーズ１および１人のフェーズ２ａ ＨＶＴＮトライアル由来の免疫原性データ（２０１１年６月現在のデータ）は、ミッシングデータの割合について、１０％が妥当な予想であることを示す。この理由のために、以下のサンプルサイズの計算は、登録参加者の１０％が、一次免疫原性エンドポイントのデータを欠いていることを説明する。

安全性に関するサンプルサイズの計算：それを超えると少なくとも１事象がおそらく観察されるであろう真の事象率、および、それを下回ると事象がおそらく観察されないであろう真の事象率によって、ＳＡＥを同定する研究の能力を表すことができる。具体的に、各ワクチン試験群（ｎ＝１２）において、そのような真の事象率が１７．５％以上であるならば、少なくとも１事象を観察する見込みが９０％である；そして、真の率が０．８％以下であるならば、事象を観察しない見込みが９０％である。組み合わせた全ワクチン試験群（ｎ＝３６）において、そのような真の事象率が６．２％以上であるならば、少なくとも１事象を観察する見込みが９０％である；そして、真の率が０．２％以下であるならば、事象を観察しない見込みが９０％である。

免疫原性に関するサンプルサイズの計算：抗体エンドポイントを扱うために、分析は、記述的に、結合応答陽性コールレート（binding response positivity call rate）を要約して、比較ごとに、比較あたり２．５％の第一種過誤率の両側ウィルコクソン順位和検定を用いて、ｇｐ１２０タンパク質のパネルに対するＩｇＧ結合Ａｂ応答の大きさおよび幅の優位性を試験する。グループあたり１２人のワクチン接種を受けた者のサンプルサイズは、平均非ゼロ応答間の１．８２の標準偏差（ＳＤ）の真の差異を検出する８０％の力を、そして２．０４ ＳＤの真の差異を検出する９０％の力を与えることとなる。これらの計算は、１０％の追跡不能（loss-to-follow-up）率および（９４％の）応答率がＨＶＴＮ ０８８ワクチンレシピエントにおいて観察されたと仮定する。同じアプローチを用いて、パネルにおける各個人のｇｐ１２０抗原に対するＩｇＧ結合Ａｂ応答の大きさの優位性を試験することとする。

例３の引用文献：
1. Mascola JR, Haynes BF. HIV-1 neutralizing antibodies: understanding nature's pathways. Immunol Rev 2013;254:225-44.
2. Verkoczy L, Kelsoe G, Moody MA, Haynes BF. Role of immune mechanisms in induction of HIV-1 broadly neutralizing antibodies. Curr Opin Immunol 2011;23:383-90.
3. Verkoczy L, Chen Y, Zhang J, Bouton-Verville H, Newman A, Lockwood B, Scearce RM, Montefiori DC, Dennison SM, Xia SM, Hwang KK, Liao HX, Alam SM, Haynes BF. Induction of HIV-1 broad neutralizing antibodies in 2F5 knock-in mice: selection against membrane proximal external region-associated autoreactivity limits T-dependent responses. J Immunol 2013;191:2538-50.
4. Haynes BF, Kelsoe G, Harrison SC, Kepler TB. B-cell-lineage immunogen design in vaccine development with HIV-1 as a case study. Nat Biotechnol 2012;30:423-33.
5. Liao HX, Lynch R, Zhou T, Gao F, Alam SM, Boyd SD, Fire AZ, Roskin KM, Schramm CA, Zhang Z, Zhu J, Shapiro L, Mullikin JC, Gnanakaran S, Hraber P, Wiehe K, Kelsoe G, Yang G, Xia SM, Montefiori DC, Parks R, Lloyd KE, Scearce RM, Soderberg KA, Cohen M, Kamanga G, Louder MK, Tran LM, Chen Y, Cai F, Chen S, Moquin S, Du X, Joyce MG, Srivatsan S, Zhang B, Zheng A, Shaw GM, Hahn BH, Kepler TB, Korber BT, Kwong PD, Mascola JR, Haynes BF. Co-evolution of a broadly neutralizing HIV-1 antibody and founder virus. Nature 2013;496:469-76.
6. Morris L, Chen X, Alam M, Tomaras G, Zhang R, Marshall DJ, Chen B, Parks R, Foulger A, Jaeger F, Donathan M, Bilska M, Gray ES, Abdool Karim SS, Kepler TB, Whitesides J, Montefiori D, Moody MA, Liao HX, Haynes BF. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One 2011;6:e23532.
7. Zhou T, Zhu J, Wu X, Moquin S, Zhang B, Acharya P, Georgiev IS, Altae-Tran HR, Chuang GY, Joyce MG, Do KY, Longo NS, Louder MK, Luongo T, McKee K, Schramm CA, Skinner J, Yang Y, Yang Z, Zhang Z, Zheng A, Bonsignori M, Haynes BF, Scheid JF, Nussenzweig MC, Simek M, Burton DR, Koff WC, Mullikin JC, Connors M, Shapiro L, Nabel GJ, Mascola JR, Kwong PD. Multidonor analysis reveals structural elements, genetic determinants, and maturation pathway for HIV-1 neutralization by VRC01-class antibodies. Immunity 2013;39:245-58.
8. Lynch RM, Tran L, Louder MK, Schmidt SD, Cohen M, Dersimonian R, Euler Z, Gray ES, Abdool KS, Kirchherr J, Montefiori DC, Sibeko S, Soderberg K, Tomaras G, Yang ZY, Nabel GJ, Schuitemaker H, Morris L, Haynes BF, Mascola JR. The Development of CD4 Binding Site Antibodies During HIV-1 Infection. J Virol 2012;86:7588-95.
9. Leroux-Roels I, Koutsoukos M, Clement F, Steyaert S, Janssens M, Bourguignon P, Cohen K, Altfeld M, Vandepapeliere P, Pedneault L, McNally L, Leroux-Roels G, Voss G. Strong and persistent CD4+ T-cell response in healthy adults immunized with a candidate HIV-1 vaccine containing gp120, Nef and Tat antigens formulated in three Adjuvant Systems. Vaccine 2010;28:7016-24.

Claims (14)

1. 図１のモザイクポリペプチドのいずれか１つ、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む組成物。
2. 図１の２個のモザイクポリペプチド、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸の二価セットを含む組成物であって、２個のモザイクポリペプチドの前記セットが、同じウイルス遺伝子産物に対応する、組成物。
3. Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．１、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
4. Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．１、Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
5. Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
6. Ｐｏｌ．Ｍｏｓ．２．１、Ｐｏｌ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
7. Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
8. Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．１、Ｇａｇ．Ｍｏｓ．２．２、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｖｉｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをコードする核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
9. Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．１、Ｎｅｆ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
10. Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．１、Ｅｎｖ．Ｍｏｓ．２．２、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
11. アジュバントをさらに含む、請求項１〜１０に記載の組成物。
12. 体液性応答を誘発するのに適したＨＩＶ−１免疫原をさらに含む、請求項１〜１０に記載の組成物。
13. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物の量を、そのような誘導をもたらすのに十分な量投与することを含む方法。
14. 前記組成物が、体液性応答を誘発するのに適した免疫原、たとえば、限定されないが、ＨＩＶ１エンベロープをさらに含む、請求項１２に記載の方法。

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