JP4805511B2 - Hivに対する免疫応答における改善、または免疫応答に関する改善 - Google Patents
Hivに対する免疫応答における改善、または免疫応答に関する改善 Download PDFInfo
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Description
(発明の分野)
本発明は、ヒト被験体において抗HIV免疫応答(特に細胞媒介性応答)を惹起するために設計された免疫原、この免疫原をコードする核酸分子、この免疫原および/またはこの核酸分子を含む組成物に関し、そしてヒト被験体において抗HIV免疫応答(特に細胞媒介性応答)を誘導するための方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
効果的なヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチンの開発は、現在の後天性免疫不全症候群(AIDS)研究の主要な目的の1つである。HIV感染を処置するための、予防的かつ強力な薬物の組み合わせにおける進歩にかかわらず、毎日、16,000人が感染していると推計される。新しい感染の90%以上が開発途上国において生じており、ここには現在の医学的発展はすぐには適用されないか、または経済的に手が届かない。これらの国にとって最も望ましいのは有効で入手し易いHIVワクチンの開発である。AIDSワクチンが可能になり得るという期待が現在、科学者の間で大きくなっている(McMichael&Hanke 1999 Nat.Med.5,612〜614;Gold 1999 IAVI Report 4,1〜2、8〜9、15〜16および18頁)。
【0003】
理想的な予防用ワクチンは、曝露後にウイルスが身体内で決して検出されないように、殺菌的な免疫を誘導しなければならない。しかし、これはおそらく非現実的な目標である。むしろ、達成可能な目的は、限局的かつ一過性のウイルス複製を生じ、その後ウイルスが検出不能になり、疾患の兆候も他の個体への伝染もない、ワクチン誘導免疫であり得る。あるいは、可能性として首尾よいワクチンは、AIDSへの進行および伝染の両方とも完全にまたは実質的に防ぐ、検査の際ウイルスをかなり低いレベルに少なくとも維持する免疫応答を誘導し得る。殺菌的な免疫を誘導するために、予防用ワクチンは、体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を惹起する必要があるだろう。HIVが、単離されそして配列決定されてから、中和抗体(nAb)を誘導するエピトープに基づく(エピトープベースの)ワクチンを開発するにはかなりの労力を要した。しかし、これは、非常に困難であることが証明されている(HeilmanおよびBaltimore 1998 Nat.Med.4(4 Suppl.)532〜534)。実験的HIV株に対するnAbを誘導するのにはいくつかの成功例が報告されているが(Bermanら、1990 Nature 345、622〜625;Fultzら、1992 Science 256、1687〜1690)、主な単離物を中和することは非常に困難であった(Trkolaら、1998 J.Virol.72,1876〜1885;Haynes 1996 Lancet 34,933〜937)。最初の15年間の相対的な失敗に関する説明は、コアgp120の結晶構造によって提供された。コアgp120は複数の機構を示し、これによってHIVはnAbの効率的な誘導を妨害する(Wyattら、1998 Nature 393、705〜711;Kwongら、1998 Nature 393、638〜659)。これらの困難の結果、多くのワクチンの設計者の注目は、細胞傷害性Tリンパ球によって(優先的に)媒介される、細胞媒介性免疫応答の誘導に移った。
【0004】
細胞傷害性リンパ球(CTL)は、通常CD8+細胞であり、そして少なくとも2つの異なる方法で器官の防御に加わる;CTLは、ウイルス感染細胞を殺傷し;そしてCTLは、種々のサイトカインおよびケモカインを分泌してウイルス複製の抑制に直接または間接的に寄与する。ワクチン接種後のCTL媒介性防御は、循環中に存在するCTLのレベルに依存し得、そしておそらく、複製サイクルの後期に発現されるタンパク質(構造タンパク質)ではなく、初期に発現されるタンパク質(調節性タンパク質)に特異的である。
【0005】
CD8+T細胞応答の誘導および維持は、CD4+Tリンパ球(ヘルパーT細胞)によって得られる「ヘルプ(助け)」を必要とする。いくつかのHIV感染個体では、高レベルのHIV特異的ヘルパー応答が検出されている。
【0006】
強力なCD8+T細胞応答の誘導のための方法の同定により、HIV感染の過程を形成する際のそのT細胞の役割を研究するためのツールが提供され、有効なHIVワクチンへの進歩が刺激され得る。以前には、マウス、マカク、およびヒトのCTLによって認識される一連の部分的に重複するエピトープとして、プロトタイプのHIVワクチンが構築された。これは、ヒトに用いるのに安全かつ受容可能なワクチンビヒクルによって、DNAベクターおよび改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA)ベクターによって送達された(Hankeら、1998 Vaccine 16,426〜435;Hankeら、1998 J.Gen.Virol.79,83〜90)。マウスでは、CTLの誘導の最も強力なプロトコールは、DNAプライミングとその後のMVAブースト(ブースティング)(すなわち、関連ポリペプチドをコードする核酸でマウスをプライミングし、その後、この関連のエピトープを発現する改変ワクシニアウイルスAnkara(「MVA」)ベクターをこのマウスにブーストすること)であることが見出された(Hankeら、1998 Vaccine 16,439〜445;Schneiderら、1998 Nat.Med.4,397〜402)。
【0007】
WO 98/56919は、「プライム−ブースト(prime−boost)」ワクチン接種ストラテジーを開示する。このストラテジーには、以下(i)薬学的に受容可能なキャリアとともに、標的抗原の1つ以上のT細胞エピトープの供給源を含む組成物を用いたプライミング、および(ii)標的抗原の1つ以上のT細胞エピトープ(プライミング組成物のT細胞エピトープと同じである少なくとも1つのT細胞エピトープを含む)の供給源を含む組成物を用いたブーストが挙げられる。
【0008】
本発明は、とりわけ、ヒトにおいてHIV特異的応答を惹起するのに有用であり得る免疫原を供給することが目的である。本明細書において言及される全ての書類および刊行物は参考として本明細書に援用される。
【0009】
(発明の要旨)
第1の局面において、本発明は、ヒト被験体への投与に適した滅菌形態の免疫原を提供し、この免疫原は、HIVのgagタンパク質の少なくとも1部分;および複数のアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドを含み、ここで、このgagタンパク質は、HIVクレード由来であるか、または1つ以上のHIVクレードのコンセンサス配列を有し、そしてp17およびp24の少なくとも1部を含み、この複数のアミノ酸配列の各配列は、HIVタンパク質のヒトCTLエピトープを含み、そしてここで、複数のHIVタンパク質が、合成ポリペプチド中に提示され、このCTLエピトープは、目的の1つ以上のHIVクレードに対して免疫応答を刺激するように選択されている。
【0010】
本発明の目的に関して「滅菌」は、ウイルス、細菌、真菌、酵母、クラミジア、マイコプラズマ、および上記のいずれかの胞子(特に、ヒトにおいて病原性である胞子)が一般的にないことをいう。しかし、免疫原は、ヒト被験体においてgagタンパク質および/または合成ポリペプチドを発現するために機能する、1つ以上の特定の公知の微生物(例えば、ウイルスまたは細菌)ベクターを含み得る。このようなベクターは、当業者に周知であり、そして例えば、アノデウイルスおよびポックスウイルスのようなウイルス(これらは、ヒトにおいて本来非病原性であるか、またはヒトにおいてこれらを非病原性にさせるための遺伝子操作もしくは他の改変に供されている)が挙げられる。特に好ましいのは、ワクチンウイルス、特に、改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA)である。他の特定の好ましいウイルスベクターとしては、セムリキ森林ウイルス(SFV)およびシンドビスウイルスが挙げられる(Smerdon & Liljestron 2000,Gene Ther.Regul.1,1−31を参照のこと)。適切な細菌ベクターとしては、BCG、およびサルモネラ種の弱毒化菌株(特に、下痢疾患のためのワクチンとして開発されたサルモネラの「ダブルアロ(double aro)」変異体)、および赤痢菌属が挙げられる(Shataら、2000 Mol.Med.Today 6,66−71を参照のこと)。
【0011】
免疫原を産生するのに有用であり得る他の発現系としては、タバコモザイクウイルス(TMV)発現ベクター(Palmerら、1999 Arch.Viol.144,1345−60)およびブルータングウイルスのNS1細管(Adlerら、1998 Med.Microbiol.Immunol.(Berl.)187,91−96)が挙げられる。
【0012】
用語「合成」は、本明細書中に使用される場合、その全体が、任意の天然に存在するHIV単離体中に存在しないポリペプチドをいうことが意図される。用語「合成」は、ポリペプチドが、固相ペプチド合成の従来の化学技術によって必ず合成されることを示すとは、意図されない。「合成」は1つの可能性を示すが、一般的に、ポリペプチドは合成ペプチドをコードする適切な核酸分子から転写および/または翻訳によって合成されることが、好ましい。このような合成方法は当業者に周知であり、そして本発明の一部を形成しない。
【0013】
gagタンパク質(またはその一部分)および合成ポリペプチドは、何れかの方法で単一実体上で連結されることが好ましい。例えば、ウイルスベクターは、このgagタンパク質および合成ポリペプチドの両方を、免疫原の別の成分として発現し得る。あるいは、この免疫原の両方の成分は、互いにかまたは共通のキャリア実体(例えば、リポソーム、ISCOMまたは分子)に、共有結合的に結合または連結され得る。好ましい実施形態において、この免疫原のgagタンパク質および合成ポリペプチド成分の両方は、単一ポリペプチドまたは融合タンパク質として存在する。このような融合タンパク質において、gagタンパク質および合成ポリペプチドは、本質的に提示される唯一の成分であり得る。あるいは、融合タンパク質は、他のHIV抗原(またはその部分)に対応し得るかまたは他の供給源由来であり得る他の成分を含み得る。従って、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、合成ポリペプチドに実質的に隣接した(すなわち、10未満の介入アミノ酸残基)gagタンパク質の一部分を含む。他の実施形態において、gagタンパク質の一部分および合成ポリペプチドは、1つ以上の介入成分によって分離され得(すなわち、10以上の介入アミノ酸残基)、これは、代表的に、1つ以上のさらなるHIV抗原を含む。
【0014】
免疫原が全gagタンパク質アミノ酸配列を含まないことがまた、一般的に好ましい。代表的に、55%と95%との間のgagタンパク質が存在し、好ましくは65%と85%との間、最も好ましくは約75%のgagタンパク質が存在する。
【0015】
野生型HIV gagタンパク質は、p17、p24およびp15と呼ばれる3つの部分からなることが、公知である。これらは、p17をN末端に有する単一ポリタンパク質として感染細胞中で合成される。通常、HIV感染細胞において、p17のN末端は、ミリスチル化されている。
【0016】
免疫原のgag部分が、p17およびp24の少なくとも一部を含むことが望ましいが、一般的に、p17成分が、何れかの方法でミリスチル化を回避するように改変されることが好ましい。好都合なことに、これは、免疫原中のp17成分およびp24成分の順序を逆転することによって達成され得、その結果、p17は、もはや遊離N末端ではなく、従って、ミリスチル化され得ない。本発明者らは、本方法が、免疫原由来のペプチドの、被験体の免疫系への提示効率を改善し得ると考える。
【0017】
免疫原のgagタンパク質成分は、一般的に、少なくとも1つの、Tヘルパー細胞のHLA クラスII拘束ペプチドエピトープを含み、そして好ましくは、多数のこのようなエピトープを含む(好ましくはこの結果、多数の異なるHLA クラスII拘束対立遺伝子が、gag成分において提示される)。gagタンパク質成分はまた、代表的に、1つ以上のCTL HLA クラスI拘束ペプチドエピトープを含む。
【0018】
免疫原の合成ポリペプチド成分は、好都合なことに、ひも状形態のCTLエピトープをとり、各々は、約8〜12アミノ酸の各配列によって示されるか、またはこれらの各配列内に含まれる。望ましくは、エピトープの少なくともいくらか(好ましくはほとんど)は、部分的に重複している(その結果、1つのエピトープの1つ以上のアミノ酸はまた、隣接エピトープの配列内に含まれる)。いくつかの「非エピトープ」アミノ酸配列は、隣接エピトープ間に存在し得るが、これは、一般的に回避される。
【0019】
隣接エピトープ間の非エピトープアミノ酸配列は、好ましくは20アミノ酸残基未満、より好ましくは10残基未満、そして最も好ましくは1〜5アミノ酸残基である。このような非エピトープアミノ酸配列が、合成ポリペプチドの発現レベルを最適化するかまたはその免疫原性を最適化するリンカー、スペーサーなどを含み得ることは明らかである。
【0020】
従って、1つの極端な実施形態において、合成ポリペプチド中のヒトCTLエピトープの全ては、重複し得、そして他の極端な場合、全てのエピトープは、少なくともいくつかの非エピトープアミノ酸配列によってその隣接物と分離され得る。一般的に、少なくとも50%のヒトCTLエピトープが重複することが、好ましい。
【0021】
重複エピトープに加えて、合成ポリペプチドは、少なくともいくつかの「隣接エピトープ」を含み得る。用語、隣接エピトープは、重複していないが、いずれの介在非エピトープアミノ酸配列によっても分離されていないエピトープをいう。
【0022】
従って、好ましい実施形態において、合成ポリペプチドは、異なるHIVタンパク質の小さな(代表的に約10〜20アミノ酸残基)フラグメントが継ぎ合わされたモザイクを含み、このフラグメントは、代表的に、1、2または3つの既知の隣接および/または重複ヒトCTLエピトープを含む。多数のフラグメントが同じHIVタンパク質由来の合成ポリペプチド中に存在する場合、このフラグメントは、代表的に、タンパク質の不連続部分から選択され、その結果、合成ポリペプチドが特定のHIVタンパク質の20〜25より多く連続するアミノ酸残基に対応する配列を含む可能性は低い。一般的に、合成ポリペプチドは、任意のヒトCTLエピトープを含むことが既知ではないHIVタンパク質の部分を本質的に省くように設計される。
【0023】
多数の異なるHIVタンパク質が、好ましくは、合成ポリペプチド中で示される。合成ポリペプチドは、任意のHIV抗原中に存在するエピトープを含み得るが、好ましくは、以下:p24;pol;gp41;gpl20;およびnefのうちの1つ以上に存在する少なくとも1つのエピトープを含む。1つの好ましい実施形態において、合成ポリペプチドは、上述のHIVタンパク質の各々に存在する少なくとも1つのCTLエピトープを含む。合成ポリペプチドは、さらに、以下のHIVタンパク質:vpr、vpu、vif(そして特に)tatおよびrevの各々に存在する少なくとも1つのCTLエピトープを含み得る。
【0024】
用語「ヒトCTLエピトープ」は、本明細書中に使用される場合、エピトープが由来するタンパク質の起源に対して言及されるのではなく、エピトープが少なくとも一部分のヒト集団のCTLによって認識され応答されることを示すことが、理解される。代表的に、ヒトCTLエピトープは、世界中のヒト集団のうちの、少なくとも0.01%、好ましくは0.1%、およびより好ましくは少なくとも1%によって認識される。
【0025】
1つの好ましい実施形態において、免疫原は、代表的に、ヒト免疫系によって一般的に認識されるenvタンパク質由来の任意のエピトープを除外する。最近使用される診断試験は、HIV env特異的免疫応答の検出に基づき、これは、env成分を免疫原から排除することによって、ウイルスでの感染から生じる免疫応答と免疫原での接種から生じる免疫応答との間を区別することが可能である。
【0026】
1つの実施形態において、合成ポリペプチド中に存在するCTLエピトープは、HIVクレードAに対する免疫応答が生成されるように選択される。しかし、好ましくは、合成ポリペプチドは、十分に大きく、そしてCTLエピトープは、異なるHIVクレードに対して交差反応する免疫応答が刺激されるように適切に選択される。これは、異なるHIVクレード間で保存される1つ以上のCTLエピトープを排除することによって好都合に達成され得る。いくつかのこのようなエピトープは、当業者に公知である(以下の表1を参照のこと)。
【0027】
好ましい実施形態において、免疫原は、1つ以上の実験室試験哺乳動物(例えば、マウスおよび/またはマカクザル)によって認識される少なくとも1つのエピトープ(好都合には、CTLエピトープ)を含む。このようなエピトープは、合成ポリペプチド内に容易に組込まれ得る。この種類のエピトープの含有は、実験室試験哺乳動物(例えば、マウスまたはサル)を用いる力価アッセイにおいてアッセイされる、異なるバッチの免疫原の品質、再現および/または安定を可能にする。このようなエピトープの例としては、アミノ酸配列 ACTPYDINQML(配列番号1;サル免疫不全ウイルス由来のドミナントエピトープ、SIV、gag p27を含み、アカゲザルCTLによって認識される)およびRGPGRAFVTI(配列番号2;HIV envタンパク質由来のH−2Dd−拘束CTLマウスエピトープ)が挙げられる。
【0028】
合成ポリペプチドへの含有に適した約23個のヒトCTLエピトープの列挙は、表1に示される。この列挙は網羅的ではない。好ましい免疫原は、このようなヒトCTLエピトープの少なくとも10個、より好ましくは少なくとも15個、最も好ましくは少なくとも20個を含む。好ましい実施形態において、表1に列挙される23個のヒトCTLエピトープの各々は、合成ポリペプチド中に示され、必要に応じて、マカクエピトープおよびマウスエピトープ(これらもまた、表1に列挙される)と一緒に示される。
【0029】
望ましくは、免疫原は、小さなタグまたはマーカーをさらに含み得る。このようなタグまたはマーカーは、免疫原中に存在する異質物質の量を最小化するために、可能な限り小さくあるべきである。好都合なタグまたはマーカーは、免疫原の発現の検出および/または免疫原の量の定量を可能にする。適切なタグとしては、モノクローナル抗体Pkによって認識されるエピトープが挙げられる(Hankeら、1992 J.Gen.Virol.73、653−660)。
【0030】
本発明の免疫原は、好都合なことに、ワクチン組成物を提供するために他の物質と混合される。例えば、ワクチン組成物は、1つ以上の以下:アジュバント(例えば、alum)、リポソーム、または免疫促進複合体(ISCOM)をさらに含み得る。ワクチンはまた、一般的に、滅菌希釈剤、賦形剤またはキャリア(例えば、生理学的に受容可能な液体(例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝化整理食塩水溶液))を含む。ワクチンは、液体として存在し得るか、またはより好ましくは、凍結乾燥固体(これは、投与前に生理学的受容可能な液体中に懸濁されるかまたは溶解される)として存在し得る。
【0031】
免疫原をヒト被験体に投与する方法は、当業者に明らかである。このような方法としては、特に、筋内注射、皮下注射、または注射針のない注入デバイスによる皮膚を介した送達が挙げられる。あるいは、ワクチン(特に、細菌ベクター(弱毒化サルモネラまたは赤痢菌属種)を含むワクチン)が、経口的、鼻腔内的または任意の他の適切な経路で提供され得る。免疫原の適切な用量は、代表的に1〜500mg、代表的に10〜100mgであり得、免疫原の大きさ、レシピエントの体重などに依存する。適切な用量は、必要である場合、異なる用量の免疫原が提供される異なる群の被験体を用いた日常的な試行錯誤、および最適な用量サイズを決定するためにアッセイされる免疫原に対する被験体の免疫応答によって確認され得る。被験体の免疫応答は、従来の免疫学的技術(例えば、被検体の血液サンプルから得られた末梢血リンパ球を用い、ペプチドパルスまたはウイルス感染されたクロム標識標的細胞に対して行うクロム放出アッセイ)によってアッセイされ得る。
【0032】
第2の局面において、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子を提供し、この融合タンパク質は、上記の本発明の第1の局面に従って、免疫原を含む。
【0033】
核酸分子は、好ましくは、ヒト被験体への投与に適した単離された滅菌形態である。核酸分子は、好ましくは「ヒト化され」、すなわち、HIVによって使用されるコドンの代わりに、特定のアミノ酸をコードするコドン(このコドンは、高度に発現されるヒト遺伝子中で頻繁に使用される)を使用する(Andreら、1998 J.Virol.72、1497−1503)。
【0034】
望ましくは、核酸分子は、ベクター内に含まれ、免疫原をコードする配列は、ヒト細胞において活性なプロモーター配列に作動可能に連結される。好都合なことに、このプロモーターは、強いウイルスプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)由来のプロモーター)である。好ましくは、このベクターはまた、ヒト細胞において機能的であるエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む。理想的には、安定性を最大にするために、ベクターは、ベクターの所望されない複製を回避するために、ヒト細胞中で機能的ないずれの複製起点も含むべきではない。
【0035】
ベクターは、被験体に、基本的に「裸の」核酸(好ましくはDNA)として単離体で投与され得るか、あるいは、送達手段(例えば、ウイルス、細菌、リポソーム、または金で覆われた粒子など)内にパッケージングされ得る。1つの適切な送達手段は、改変ワクシニアウイルスAnkara(MVA)であり:免疫原の遺伝子またはオープンリーディングフレーム(ORF)は、MVAの例えば、チミジンキナーゼ座位に挿入され得る。
【0036】
ベクターが、免疫原をコードする核酸を含み得ること(従って、核酸は、本発明の第2の局面に従う)、およびベクターがまた、本発明の第1の局面に従って、ポリペプチド免疫原をその表面または内部に保有し得ることは、当業者によって理解される。
【0037】
裸の核酸として投与されても送達手段内にパッケージングされるとしても、投与された核酸の少なくともいくらかは、被験体の細胞に侵入し、転写され(必要な場合)そして翻訳され、その被験体において免疫原のインサイチュ合成をもたらし、この被験体は次いで、この免疫原に対する免疫応答を発生する。
【0038】
免疫原調製物それ自身を用いる場合、免疫原をコードする核酸は、多数の公知の経路(例えば、皮下注射もしくは筋内注射、経口送達、または注射針なしの注入器手段による皮膚を通した送達)のいずれかによってヒト被験体に投与され得る。注射針なしの注入デバイスによる投与の特定の例は、WO 97/34652およびWO 97/48485に開示される。核酸の適切な用量は、10μg〜10mg、代表的に100μg〜1mgであり得、核酸分子の大きさ、投与経路、レシピエントの体重などに依存する。また、日常的な試行錯誤(本教示の利益を用いて)によって、当業者は、核酸の最適用量を決定し得る。
【0039】
DNAの動物組織への好首尾な送達は、カチオン性リポソームによって[Watanabeら、Mol.Reprod.Dev.38:268−274(1994);Sharkeyら、WO 96/20013]、裸のDNAの、動物の筋組織への直接的な注射によって[Robinsonら、Vacc.11:957−960(1993);Hoffmanら、Vacc.12:1529−1533;(1994);Xiangら、Virol.199:132−140(1994);Websterら、Vacc.12:1495−1498(1994);Davisら、Vacc.12:1503−1509(1994);およびDavisら、Hum.Molec.Gen.2:1847−1851(1993)]、および胚によって[Naitoら、Mol.Reprod.Dev.39:153−161(1994);およびBurdonら、Mol.Reprod.Dev.33:436−442(1992)]、または「遺伝子銃」技術を用いたDNAの皮内注射によって[Johnstonら、Meth.Cell Biol.43:353−365(1994)]達成されている。
【0040】
DNAベースのワクチン接種に関して、裸のプラスミドDNAの注射による送達によって、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導することに対する、マウスモデルにおける可能性が示された。しかし、大きな動物において、ワクチン接種のためにDNA送達を用いることは、大量のDNAを必要とすること、または抗原に対する寛容を発生するための潜在能力を有する抗原の持続性の発現を誘導することによって妨害されている。Berglundは、真核生物発現カセット中に組換えセムリキ森林ウイルス(SFV)レプリコンを有するαウイルスDNA発現ベクターを含むプラスミドDNAをマウスに注射することによって、免疫応答を誘導または増強する戦略を報告した[Berglundら、Nature Biotechnol.16:562−565(1998)]。真核生物発現カセットは、SFVレプリコンの一次核転写物の発現を制御した。このSFVレプリコン転写物(異種抗原をコードする)は、細胞質に輸送され、そして自己コードされる(self−encoded)SFVレプリカーゼ複合体によって増幅される。この増幅されたRNAレプリコンは、異種抗原をコードするmRNAの高レベルの産生を導く。類似の結果が、Poloおよび彼らのグループによって記載された[Poloら、Nature Biotechnol.16:517−518(1998);Hariharanら、J.Virol.72:950−958(1998)]。両方のグループは、強い免疫応答が、少量の投入プラスミドDNAを用いて誘導され得ることを見出した。
【0041】
あるいは、DNAを動物に送達する、従来の送達方法の不利益を克服する方法は、発現される遺伝子をコードする真核生物発現カセットを有する細菌DNAベクターを含む、弱毒化された侵襲性細菌を投与することによる方法である。例えば、Powellらの米国特許第5,877,159号は、豊富な感染を確立することも疾患を引き起こすこともなく動物細胞に侵入し得、これによって、動物細胞によって発現され得る抗原をコードする真核生物発現カセットを導入するための生きた細菌を記載している。
【0042】
第3の局面において、本発明は、ヒト被験体において抗HIV免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、本発明の第1の局面に従う免疫原もしくは本発明の第2の局面に従う核酸分子を調製する工程;およびこの免疫原もしくは核酸分子を被験体に投与する工程を包含する。
【0043】
好都合なことには、本方法は、免疫原および核酸分子の両方を投与することを含む。特に、この方法は、好ましくは、核酸分子の1回以上の投与(「プライミング」)、続いて適切な間隔での(例えば、1週間〜4ヶ月)免疫原の1回以上の投与(「ブースト」)を含む。ブーストは、例えば、免疫原および/または免疫原をコードする核酸分子を含む、複製コンピテント(例えば、弱毒化ウイルスまたは細菌)または非複製ベクターを投与することによって実施され得る。好ましくは、ブーストは、MVAウイルス粒子の一部として免疫原を投与することによって達成され、この粒子は、免疫原をコードする核酸を有利に含み得る。
【0044】
好ましい実施形態において、この方法の実施は、被験体において防御免疫応答の生成をもたらし、この結果、(この被験体が、引き続きHIV感染に曝露されても)この被験体は、HIV感染と関連するAIDSの症状を発生しない。
【0045】
第4の局面において、本発明は、ヒト被験体におけるHIV感染を予防または処置するための医薬の調製における、本発明の第1の局面に従う免疫原および/または本発明の第2の局面に従う核酸の使用を提供する。
【0046】
第5の局面において、本発明は、図8Aに示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。好都合なことに、この核酸は、図8Bに示されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは本質的にこれらからなる。
【0047】
第6の局面において、本発明は、図8Aに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【0048】
第5の局面の核酸および/または第6の局面のポリペプチドは、本発明の別の局面に関連して記載されるように、免疫原/ワクチン組成物に使用され得、従ってこのような免疫原およびワクチンは、本発明の範囲内であると考えられ、そして上記のようなベクターなど(特に、MVA)を含み得る。第7の局面において、本発明はさらに、ヒト被験体における抗HIV免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、被験体に、本発明の第5の局面に従う核酸および/または本発明の第6の局面に従うポリペプチドを投与する工程を包含する。最後に、本発明は、ヒト被験体におけるHIV感染を予防または処置するための医薬の調製における、本発明の第5の局面に従う核酸および/または本発明の第6の局面に従うポリペプチドの使用を提供する。
【0049】
(実施例)
(実施例1)
この実施例は、CD4+ヘルパーおよびCD8+エフェクターTリンパ球の協調的な作用により媒介される細胞免疫応答の誘導に注がれるワクチンにおいての使用のための免疫原に関する。HIVAと命名された免疫原(Hanke & McMichael Nat.Med.6951−955)は、ケニア、ナイロビで第III相有効性試験が行なわれることが計画された。図1Aは、HIVAを含む種々の免疫源の概略図である。HIVAは、HIV−1クレードA(ナイロビでの顕著なHIVクレード)の配列に由来し、そして約73%が一列の25の部分的に重複するCTLエピトープと融合されたgagタンパク質からなる。HIVAのgagドメインは、ウイルスgag p17−p24−p15ポリタンパク質に対して逆向きの順序で、p24およびp17を含む。この再配置は、p17のN末端のミリストイル化を防ぎ、組換えタンパク質を細胞膜に向かわせ、従ってクラスI主要組織適合複合体(MHC)提示に必要なペプチドの効果的な分解を防止し得る。
【0050】
図1Bは、HIVA免疫原のアミノ酸配列(配列番号26)を示す。この遺伝子を構築するために用いられる制限エンドヌクレアーゼ部位に対応するアミノ酸は、太字で示される(BamHIに対応するGS、KpnIに対応するGT、およびEcoRIに対応するEF)。
【0051】
gagドメインのアミノ酸配列は、HIV−1クレードAのタンパク質データベースコンセンサス配列から得られた(Korberら、「Human retroviruses and AIDS;a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences」1997)。利用可能なケニア株(Kenyan strain)配列の非存在下で、アミノ酸クレードAへの強い優先度を有さない領域は、ウガンダ単離体(Ugandan isolates)の方に偏っていた。HIV−1 gagタンパク質は、重要なMHCクラスI拘束エピトープだけでなく、CD4+Tヘルパー細胞を刺激するクラスII拘束エピトープも含有した。
【0052】
HIVAタンパク質のC末端は、マルチCTLエピトープの合成ポリペプチドとして設計された。HIVAに含まれるCTLエピトープは、ケニアで蔓延するHIV−1クレードA株で感染された患者のCTLにより認識され、8〜10アミノ酸長であり、そしてgag、pol、nef、またはenvタンパク質から生じた(Rowland−Jonesら、1998 J.Clin.Invest.102、1758−1765;Dorrellら、1999 J.Virol.73、1708−1714)。これらのエピトープの多くは、免疫優性であり、そして他のHIV−1クレード間で比較的保存されている(表1)(したがって、クレードA以外のクレードのHIVウイルスと交差反応する免疫応答を惹起し得る)。これらは、異なる17のHLA対立遺伝子により提示され、アフリカ人に頻出する対立遺伝子ならびにほとんどの民族集団に共通の対立遺伝子の両方を含む。9つの共通のHLA対立遺伝子により提示される最適に選択されたエピトープは、民族の血統とは無関係な一般的な集団を網羅し得ると推定された(Sydneyら、1996 Immunol.Today 17、261−266)。従って、大部分のHIV感染ドナーがgag p17/p24に対するCTLの応答をなす場合、ワクチン接種を受けた各人は、HIVAタンパク質に存在する少なくとも2または3のCTLエピトープに応答し得る能力を有するはずである。
【0053】
HIVA合成ポリペプチドはまた、それぞれマカクおよびマウスCTLに認識されるSIV gagおよびHIV envエピトープを含むので、その結果、臨床バッチの質、再現性、および安定性は、マウス(または必要な場合はマカク)力価アッセイにおいて容易に評価され得た。モノクローナル抗体エピトープPk(Hankeら、1992 J.Gen.Virol.73、653−660)を、全長タンパク質の容易な検出および発現レベルの評価のためにHIVAのC末端に付加した。3つの非HLAエピトープが、ワクチン接種を受けた個体の健康を害すると考える理由はない。
【0054】
【表1】
【0055】
a−エピトープは、ポリエピトープ中で見られる順番で列挙されている(配列番号3−25、1、2)。
b−特有のエピトープ配列が、配列決定されたHIVクレード単離体の約50%(小文字)または90%(大文字)に存在する。
c−「=」は、エピトープがN末端クレードA gagドメインに存在することを示す。
d−それぞれN末端およびC末端のAlaおよびLeuに隣接するSIV gag p27由来の優性エピトープは、アカゲザルマカクCTLに認識された。そしてこれは、アカゲザルマカクの力価の研究に用いられ得る。
e−マウスMHCクラスIにより提示されたCTLエピトープを、マウス力価アッセイのために用いた。
【0056】
「プライム/ブースト(prime/boost)」プロトコル(プライミングは、核酸の投与により達成された)を用いることを意図していたので、ヒト細胞におけるHIVAの発現を増大させるためにHIVA免疫原をコードする核酸の配列を設計することが望ましかった。第一に、最初のメチオニンコドンからの有効な翻訳開始を確実にするために、HIVAオープンリーディングフレーム(ORF)の前に12ヌクレオチド長のKozakコンセンサス配列を置いた(Kozak 1987 Nucl.Acids Res.15、8125−8148)。第二に、ほとんどのHIV−1由来のコドンを、ヒト高発現遺伝子で頻繁に用いられるコドンと置換することにより、得られたmRNAの翻訳を最適化した(Andreら、1988、上述)。HIVA ORFは、1,608塩基対長の二本鎖DNA HindIII−XbaIフラグメントの一部である(図2Aは、HIVA ORFを含むHindIII−XbaIインサートのヌクレオチオド配列を示す;配列番号27)。図2Aにおいて、部分的なPCR産物を構築するために用いられたエンドヌクレアーゼ部位が含まれる(ヌクレオチド1−6=HindIII;319−324=BamHI;712−717=KpnI;1135−1140=EcoRI;および1603−1608=XbaI)。
【0057】
プラスミドDNAを標準的なプロトコル(Sambrookら「Molecular Cloning.A Laboratory Manual」第二版;Cold Spring Harbor)を用いて調製および処理した。HIVA遺伝子を、インビトロで(図2Bに示されるように)4分割で構築した。それぞれの部分を、70−90塩基長の重複する正または負のオリゴデオキシヌクレオチド鎖から組み立てることにより調製した。この合成オリゴデオキシヌクレオチドを、EconoPureTM Kit(Perkin Elmer)を用い、製造者の説明書に従って精製し、PCR構築に続いてアニールおよび連結した。PCR産物をそれぞれの工程の後にゲル精製して、予定の固有の末端制限エンドヌクレアーゼ部位を有するフラグメントを得た。これらの4つの産物をクローニングおよび配列決定し、そしてこれらを連結して完全なHIVA遺伝子を生成した。次いでHIVA遺伝子を、後述するように、pTHr構築物およびMVAワクチンベクターに挿入した。
【0058】
(pTHrベクター)
直接的な遺伝子転移のためのベクターpTHrを、機能的エレメントの数、したがって投与されるために必要なDNAの量を最小にする目的をもって設計した。
【0059】
pTHの構築は、以前に記載されていた(Hankeら、1998 Vaccine 16、426−435)。これには、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)株AD169ゲノムの発現に有効なエンハンサー/プロモーター/イントロンAカセットを含む(Whittleら、1987 Protein Eng.1、499−505;Bebbington 1991 Methods 2、136−145)。このプロモーター領域の後に、pRc/CMV(Invitrogen)由来ポリリンカーおよびウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。形質転換された細菌にアンピシリン耐性を与えるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子および原核生物の二本鎖DNA複製起点ColE1は、共にプラスミドpUC19に由来する。pTHは、哺乳動物中で複製するための起点を含まない。pTHポリリンカーへのHIVA DNAの挿入後、MluI部位とDraI部位との間のβ−ラクタマーゼ遺伝子フラグメントを除去し、そして得られた構築物pTHr.HIVA(図3)を、Cobra Pharmaceuticals Ltd.(Keele、UK)により開発されたリプレッサー−滴定系(この系により、プラスミド中に抗生物質耐性遺伝子が存在する必要性なしに、プラスミドを保有する細菌が選択される(Williamsら、1998 Nucl.Acids Res.26、2120−2124))を用いて細菌中で増殖させた。したがって、DNAワクチン接種は、ワクチン接種を受けたヒトに多量の抗生物質耐性遺伝子のコピーを導入しない。pTHr.HIVA構築物は、図3で図解により説明される(CMV e/p/i=ヒトCMV エンハンサー/プロモーター/イントロンAカセット;BGHpA=ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル;ColE1=細菌でのdsDNA複製起点;矢印の頭の記号は、リプレッサー結合配列を示す)。
【0060】
293細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞[CEF]を、10%ウシ胎仔血清(FBS;Gibco);2mM L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDulbecco’s改変Eagle’s培地(DMEM;Gibco)中で維持した。細胞を、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO2中で培養した。293T細胞を、DEAE−デキストラン−クロロキン法(Hankeら、1998、Vaccine 16、426−435)を用いて、pTHr.HIVAで一時的にトランスフェクトした。簡単にいうと、2.5×105個の293T細胞を、6ウェル組織培養プレートのカバーガラス上で一晩培養した。翌日、細胞を5g/ウェルのDNAを用いてトランスフェクトした。48時間後、トランスフェクトした細胞を固定し、これらの膜を透過化処理し、そしてSV5−P−k mAb、続いて抗マウスFITC結合抗体を用い、発現された組換えタンパク質を検出した。
【0061】
標本の結果を示す顕微鏡写真を図4に示す。この図は、3つのトランスフェクトされた細胞および1つのバックグラウンドのトランスフェクトされなかった細胞(左上)を示す。
【0062】
追加免疫(ブースト)は、HIVA免疫原を発現するMVAベクターを投与することにより、達成された。MVAは、臨床適用に安全な弱毒化されたワクシニアウイルスであり、ヒト細胞で複製する能力をほとんど失っている(Mayrら、1975 Infection 105、6−14)。ワクチンビヒクルとしてのMVAの使用および弱毒化ポックスウイルスベクターの中から魅力的な選択をさせたその特徴(例えば、Sutterら、1994 Vaccine 12、1032−1040;およびMossら、1996 Adv.Exp.Med.Biol.397、7−13)は、広範に記載されている。
【0063】
HIVA遺伝子を、プラスミドpSC11に連結し、親のMVAのチミジンキナーゼ遺伝子座内にこの遺伝子を向かわせた(Carroll & Moss 1995 Biotechniques 19、352−356)。この組換えMVAのバルクストックを、主に、特定病原体フリーの一群の卵から得られたCEFで増殖した。MVAを、Beckman SW28ローターを用い、36%(w/v)スクロースクッションを通じた細胞質抽出物の遠心分離(13,500rpm、80分間)により精製した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を同時挿入した利点を生かし、ウイルスストックの力価を、感染細胞の単層を適切な基質と共にインキュベートした後のブループラークの数から決定した。
【0064】
(ワクチン力価アッセイ)
DNAおよびMVAの力価を、H−2Dd−拘束エピトープの存在という利点を有するBalb/cマウスの集団で試験した(Takahashiら、1993 Int.Immunol.5、849−857)。pTHr.HIVA DNAワクチンについて、マウスを筋肉内に100μgのDNAを針注射したか、またはPowderJect Vaccines Inc.(Madison、WI、USA)のDermal XR遺伝子送達デバイスを用い、合計2μgのDNAを用いて3週間間隔で2回経皮内で免疫した。最後の免疫の10日後または21日後にマウスを屠殺した。免疫されたマウス由来の脾臓を回収し、そして2mlシリンジラバープランジャーを用いて細胞濾過器(Falcon)を通して個々に圧縮した。この脾細胞を洗浄し、そして二分割した。第1の半分をテトラマー分析のために凍結し、そして第2の半分を5mlのリンパ球培地(R10、20mM HEPESおよび15mM β−メルカプトエタノール)に懸濁し、そしてインビトロで、2μg/mlのRGPGRAFVTI(配列番号2)ペプチドを用いて、5% CO2、37℃の加湿インキュベーターで5日間再刺激した。
【0065】
エフェクター細胞を、U型底面ウェル(96ウェルプレート;Costar)上で、エフェクター:標的の比が100:1から始めて2倍希釈した。次いで、10−6Mペプチドを含まないかまたは補給された培地中の5,000個の51C標識P815標的細胞を、エフェクターに加え、そして37℃で5次間インキュベートした。自然発生の遊離およびクロム遊離の総量をウェルから評価した。標的細胞は、それぞれ単独でかまたは5% Triton X−100を含む培地中で維持された。特異的な溶解のパーセンテージを、[(サンプルの遊離−自発的な遊離)/(総遊離−自発的な遊離)]×100のように計算した。自発的な遊離は、総c.p.mの5%未満であった。
【0066】
代表的なアッセイの結果を図5A−Cに示す。この図は、エフェクター:標的比に対する溶解比(%)のグラフである。図5Aは、100μgのpTHr.HIVA DNAを用いて1回免疫されたマウスから得られた脾細胞の結果を示す。図5Bは、pTHr.HIVA DNAを用いて経皮内で2回免疫されたマウスから得られ結果を示す。図5Cは、107 pfuのMVA.HIVAを用いて経皮内で免疫されたマウスから得られた結果を示す。図5A〜5Cのそれぞれにおいて、それぞれの線は単一のマウスを表わす。ペプチドパルスされた標的の溶解は、黒塗りの記号により、パルスされていない標的は、白抜きの記号により示される。
【0067】
pTHr.HIVAベクター送達の両方の様式は、すべての免疫された動物において高い免疫原性を有し、そして高い細胞溶解活性を誘導した(図5A & Bを参照のこと)。同様に、MVA.HIVAの107個のプラーク形成ユニットの1回の筋肉内針注射は、すべてのワクチンを接種した人において、培養再刺激後に測定された強いペプチド特異的な溶解活性を誘発した(図5C)。
【0068】
(実施例2)
さらに、HIVAに基くが、HIV抗原の構成成分をさらに含むポリタンパク質免疫原をコードする核酸構築物を調製した。これらのさらなる構築物およびこれらのコードされた免疫原を、HIVTAおよびHIVAeTと呼び、これを図1Aに示す。PPAと呼ばれる構築物/免疫原もまた示される。関連のDNA/アミノ酸配列を、それぞれ図6A/B−8A/Bに示すが、図7Aは、HIVTAのアミノ酸配列に付加的なHIVAeTのアミノ酸配列のその部分(tatに起因する)のみを示す(このDNA配列の5’および3’末端のHindIII部位およびXbaI部位の配列は図6B、7B、および8Bに示されていないことに注意)。この構築物をHIVAについて上述されたものと同様の様式で調製した。
【0069】
HIVTAおよびHIVAeTは、HIVAと同じ設計上の根拠を共有するが、HIV−1クレードA tat配列をさらに含み、これは内部リボソーム侵入部位(IRES)の含有により、gagおよびポリエピトープの合成ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現される(HIVTAの場合、tat配列は、gagと合成ポリペプチドとの間に位置する)か、または、同じ構築物に存在するが、別々のポリペプチドとして発現される(HIVAeTの場合)のいずれかである。
【0070】
それぞれの核酸分子は、HIVA DNAに関して上述されたものと同様の様式で、免疫対象として用いられ得る。同様に、この分子は、適切なベクター(特にMVA、繰り返すと、これは実施例1で上述されている)に導入され得、そして得られたベクターは、被験体を免疫するために用いられる。個々のHIV単離体およびワクチン設計についてのその関連の間の遺伝的な多様性の重要性が、長く示されてきた。欧州および北米における優性なHIV−1クレードはクレードBであり、これはまた最も研究されているクレードである。中央アフリカおよび東アフリカにおいて、優性な蔓延しているHIV−1株はクレードAであり、一方、クレードCは南アフリカ、インドおよび中国で蔓延している。一般に、クレード特異的なワクチンの設計は、CTLについてよりもnAbの誘導についてより注意深い考慮を要求する。CTLエピトープにおいていくつかの重要なクレード間の相違が存在するが、多くのエピトープは、構造/機能の制限に一部起因して、クレード間で保存されている。しかし、有効性研究の解釈を容易にするために、交差防御が達成されない場合、任意の首尾良いアプローチを他のクレードについて採用し得るという観点で、ワクチンが、試験した集団内で蔓延する地域の株に適合するように試みるべきである。
【0071】
ここで本発明は、実例によりそして添付の図面に関してさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1Aは、本発明に関連する免疫原HIVA、HIVTA、およびHIVAeT;ならびに免疫原PPAの概略図である。
【図1B】 図1Bは、HIV A免疫原のアミノ酸配列(配列番号26)を示す。
【図2A】 図2Aは、HIVA免疫原をコードする核酸(「HIVA遺伝子」と呼ばれる)のヌクレオチド配列(配列番号27)を示す。
【図2B】 図2Bは、HIVA遺伝子を構築するために用いる方法の概略図である。
【図3】 図3は、本発明に関連するDNAベクター分子(pTHr.HIVA)およびその構築方法の概略図である。
【図4】 図4は、pTHr.HIVAを用いたトランスフェクション後のマウス細胞によるHIVA発現の免疫蛍光検出を示す顕微鏡写真である。
【図5】 図5は、本発明に関連するDNA分子または免疫原を用いて接種されたマウスから得られた脾細胞を用いるクロム遊離アッセイの結果を示すグラフである。
【図6A】 図6Aは、HIVTA免疫原のアミノ酸配列(配列番号28)を示す。
【図6B】 図6Bは、HIVTA免疫原をコードする核酸分子のヌクレオチド配列(配列番号29)を示す。
【図7A】 図7Aは、HIVAeT免疫原中に存在するtatポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号30)を示す。
【図7B】 図7Bは、HIVAeT免疫原をコードする核酸分子のヌクレオチド配列(配列番号31)を示す。
【図8A】 図8Aは、本発明の6番目の局面に関連するPPA免疫原のアミノ酸配列(配列番号32)を示す。
【図8B】 図8Bは、PPA免疫原をコードする(本発明の5番目の局面に関連する)核酸分子のおヌクレオチド配列(配列番号33)を示す。
【配列表】
Claims (15)
- 配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む免疫原。
- 配列番号32に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- ヒト被験体に対する投与に適切な無菌形態の免疫原であって、以下の構造の一つ:
(a)NH2−p24−p17−CTLポリペプチド−COOH;
(b)NH2−p24−p17−tat−CTLポリペプチド−COOH;
(c)NH2−p24−p17−CTLポリペプチド−tat−COOH;または
(d)NH2−p24−p17−Cpol−rev−tat−nef−Npol−CTLポリペプチド−COOH;
の合成ポリペプチドを含み、前記CTLポリペプチドが表1に同定されるヒトCTLエピトープの少なくとも10個を含む、免疫原。 - p17がN末端ミリスチル化を阻害するように改変されている、請求項3に記載の免疫原。
- 前記合成ポリペプチドに存在する前記ヒトCTLエピトープの少なくともいくつかが重複している、請求項3に記載の免疫原。
- 前記合成ポリペプチドに存在する前記ヒトCTLエピトープの少なくとも50%が重複している、請求項3に記載の免疫原。
- 前記合成ポリペプチドに存在する前記ヒトCTLエピトープの少なくともいくつかが隣接している、請求項3に記載の免疫原。
- 前記ヒトCTLエピトープの少なくともいくつかが、非エピトープ性アミノ酸配列によって分離されている、請求項3に記載の免疫原。
- 1つ以上の実験室試験哺乳動物によって認識される少なくとも1つのエピトープを含む、請求項3に記載の免疫原。
- 前記1つ以上の実験室試験哺乳動物によって認識されるエピトープがCTLエピトープである、請求項9に記載の免疫原。
- 前記合成ポリペプチドが、表1に同定されるヒトCTLエピトープの少なくとも15個を含む、請求項3に記載の免疫原。
- 前記合成ポリペプチドが、表1に同定されるヒトCTLエピトープの少なくとも20個を含む、請求項3に記載の免疫原。
- 前記合成ポリペプチドが、表1に同定されるヒトCTLエピトープの少なくとも23個を含む、請求項3に記載の免疫原。
- 請求項3に記載の免疫原を含む細菌。
- ヒト被験体に対する投与に適切な弱毒化病原である、請求項14に記載の細菌。
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