MXPA02006379A

MXPA02006379A - Mejoriasen o relacionadas con la respuesta inmune a vih.

Info

Publication number: MXPA02006379A
Application number: MXPA02006379A
Authority: MX
Inventors: Tomas Hanke
Original assignee: Medical Res Council
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2004-06-21
Also published as: ATE457996T1; PT1240186E; EP1240186A2; JP2003518931A; HK1058048A1; AU2208901A; DK1240186T3; CN1213068C; CN1434831A; WO2001047955A2; JP4805511B2; ES2341429T3; BR0016510A; WO2001047955A3; AU784679B2; DE60043856D1; EP1240186B1; CY1110917T1; US20030108562A1; CA2392877C

Abstract

Se describe un inmunogeno en forma esteril adecuado para administracion a un sujeto humano, el inmunogeno comprende: al menos una porcion de la proteina gag de VIH, dicha proteina gag siendo a partir de una clada de VIH o teniendo una secuencia consenso para una o mas cladas de VIH, y comprendiendo al menos partes de p17 y p24; y un polipeptido sintetico que comprende una pluralidad de secuencia de aminoacidos, cada secuencia comprendiendo une epitope CLT de humano de una proteina VIH, y en donde una pluralidad de proteinas VIH estan representadas en el polipeptido sintetico, dichos epitopes CLT siendo seleccionados para estimular una respuesta inmune a una o mas cladas de VIH de interes.

Description

MEJORIAS EN O RELACIONADAS CON LA RESPUESTA INMUNE A VIH CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a un inmunógeno diseñado para producir una respuesta inmune anti-VIH en o sujeto humano (especialm|ente una respuesta mediada por célula), una molécula de ácido nucleico |que codifica al inmunógeno, composiciones que comprende el inmunógeno y|o la molécula de ácidos nucleicos, y a un método para inducir una respuesta inmune anti-VIH (especialmente una respuesta mediada por célula) en un sujeto humano.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El desarrollo de vacunas efectivas para virus I de inmunodeficiencia de humano (VIH) es uno de los objetivos principales én la investigación actual realizada sobre síndrome de inmunodeficiencia (SIDA). A pesar del progreso en la prevención y en la combinación de fármacos poderosos para tratar la infección de VIH, aproximadamente 16,000 personas se infectan cada día. Más del 90% de las infecciones recientes ocurren en países en desarrollo para los cuales el avance en la investigación médica no se aplica inmediatamente o no es accesible. La mejor esperanza para estos países es el desarrollo de una vacuna para VIH efectiva, accesible.

Actualmente hay un optimismo en crecimiento entre los científicos con respecto a que una vacuna para el SIDA puede ser posible (McMichael y Hanke 1999 Nat. ed. 5, 612-614; Gold 1999 IAVI Report 4, pp 1-2, 8-9, 15-16 y 18). Una vacuna profiláctica ideal debe inducir una inmunidad esterilizante, de manera que después de la exposición, el virus nunca será detectado en el cuerpo. Sin embargo, esto es probablemente un objetivo poco real. Más bien, un objetivo que es posible alcanzar puede ser una inmunidad inducida por vacunas que resulta en una replicación limitada y transitoria del virus, después de lo cual el virus se vuelve indetectable, no hay signos de enfermedad y no se transmite a otros individuos. Alternativamente, una vacuna potencialmente exitosa puede inducir respuestas inmunes que al menos mantienen el virus en monitoreo a niveles tan bajos, que tanto la progresión del SIDA como la transmisión se previene completamente o substancialmente. Para inducir la inmunidad esterilizante, una vacuna prosiga pica puede necesitar producir tanto respuestas inmunes humorales como respuestas inmunes mediadas por célula. Desde que el VIH se aisló y secuenció, ha habido un esfuerzo considerable para desarrollar vacunas basadas en la cubierta que inducen anticuerpos neutralizantes (nAb). Sin embargo, esto ha demostrado ser excesivamente difícil (Heilman y Baltimore 1998 Nat. Med. 4 (Supl.) 532-534). Aunque se ha reportado algunos éxitos para inducir nAb en contra de cepas de VIH de laboratorio (Berman et al., 1990 Nature 345, 622-625; Fultz et al., 1992 Science 256, 1687-1690), ha sido extremadamente difícil neutralizar los aislados primarios (Trkola et al., 1998 J. Virol. 72, 1876-1885; Haynes 1996 Lancet 34, 933-937). Una explicación de los errores relativos en los primeros quince años se ha provisto por la estructura cristalina de la gp 12 del núcleo, la cual revela mecanismos múltiples por medio de los cuales el VIH previene la inducción eficiente de nAb (Wyatt et al, 1998 Nature 393, 705-711 ; Kwong et al., 1998 Nature 393, 638-659). Como resultado de estos estudios, el énfasis de muchos diseños de vacuna se ha cambiado a la inducción de respuestas inmunes mediadas por célula, las cuales están mediadas (predominantemente) por linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son usualmente células CD8+ y participan en la defensa del organismo en al menos dos modos diferentes: éstas eliminan a las células infectadas por virus; y secretar una variedad de citosinas y quimocinas que directamente o indirectamente contribuyen a la supresión de la replicación del virus. La protección mediada por CTL después de la vacunación puede depender de los niveles de CTL presentes en la circulación y, tal vez, específicamente para proteínas expresadas tempranamente (proteínas reguladoras) más que tardías (proteínas estructurales) en el ciclo de replicación. La inducción y mantenimiento de la respuesta de células T CD8+ requiere "ayuda" provista por los linfocitos T CD4+ (células T ayudadoras). En algunos individuos infectados con VIH, los altos niveles de respuesta de células ayudadoras específicas para VIH han sido detectados. La identificación de métodos para la inducción de respuestas fuertes de células T CD8+ proveen herramientas para estudiar su papel(es) para darle forma al curso de la infección de VIH y puede estimular el progreso hacia una vacuna efectiva para VIH. Previamente, una vacuna prototipo para VIH se construyó como una extensión de epítopes que se sobreponen de manera parcial reconocidos por CTL de murino, de macaco y de humano, la cual se administró mediante vehículos de vacunas que fueron seguros y aceptables para uso en humanos, un vector de ADN y un vector de virus Ankara de vacuna modificado (MVA) (Hanke et al., 1998 Vaccine 16, 426-435; Hanke et al., 1998 J. Gen. Viral. 79, 83-90). En los ratones, el protocolo más potente para inducción de CTL se encontró que es cebado con ADN seguido por un refuerzo de MVA (Hanke et al., 1998 Vaccine 16, 439-445; Schneider et al, 1998 Nat. Med. 4, 397-402) es decir, los ratones cebados con ácido nucleico que codifica el polipéptido relevante, seguido por refuerzo de los ratones mediante inoculación con un vector de virus Ankara de vacuna modificado ("MVA") que expresa los epítopes relevantes. WO 98/56919 describe una estrategia de vacunación mediante "refuerzo de cebado", que implica (i) cebar con una composición que comprende una fuente de uno o más epítopes de células T de un antígeno blanco, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptables, y (ii) reforzar con una composición que comprende una fuente de uno o más epítopes de ¦ ¦¿ tftlÍTlTlI i.í células T del antígeno blanco, incluyendo al menos un epítope de célula T que es el mismo que un epítope de célula T de la composición de cebado. La presente invención tiene por objetivo, entre otros, proveer inmunógenos los cuales pueden ser útiles para producir una respuesta específica a VIH como un epítope de célula T de la composición de cebado.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un primer aspecto la invención provee un ¡nmunógeno en forma estéril adecuado para la administración a un sujeto humano, el ¡nmunógeno comprendiendo: al menos una porción de la proteína gag de VIH, dicha proteína gag siguiendo a partir de una ciada de VIH o teniendo una secuencia consenso para una o más ciadas de VIH, y comprendiendo al menos parte de p17 y p24; y un polipéptido sintético que comprende una pluralidad de secuencia de aminoácidos, cada secuencia comprendiendo un epítope CTL de humano de una proteína VIH, y en donde una pluralidad de proteínas VIH están representadas en el polipéptido sintético, dichos epítopes CTL siendo seleccionados para estimular una respuesta inmune a una o más ciadas de VIH de interés. Para los propósitos de la presente invención "estéril" se refiere a la ausencia general de virus, bacterias, hongos, levaduras, clamidia, micoplasma, y esporas de cualesquiera de los anteriores (especialmente microbios patogénicos en humanos). Sin embargo, el ¡nmunógeno puede comprender uno o más vectores microbianos conocidos específicos (por ejemplo virus o bacterias) los cuales sirven para expresar la proteína gag y/o polipéptido sintético en un sujeto humano. Dichos vectores se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, virus tales como adenovirus y virus de enfermedades infecciosas los cuales inherentemente no son patogénicos en humanos cuán sido sometidos a manipulación genética, otras modificaciones para volverlos no patogénicos en humanos. Particularmente preferidos son los virus de vacunas, especialmente los virus de vacuna Ankara modificados ( VA). Otros vectores virales específicos preferidos incluyen virus Semliki Forest (SFV) y virus Sindbis (véase Smerdon y Liljestróm 2000, Gene Ther. Regul. 1 , 1-31). Los vectores bacterianos adecuados incluyen BCG, y cepas atenuadas de Salmonella Spp. (Especialmente mutantes "doble aro" de Salmonella los cuales han sido desarrollados como vacunas para enfermedades diarreicas), y Shigella (véase Shata et al., 2000 Mol. Med. Today 6, 66-71 ). Otros sistemas de expresión, los cuales pueden ser útiles para producir el inmunógeno incluyen un vector de expresión de virus del mosaico del tabaco (TMV) (Palmer et al., 1999 Aren. Virol. 144, 1345-60) y virus bluetongue de túbulos NS1 (Adler et al., 1998 Med. Microbiol. Immunol. (Berl.) 187, 91-96). El término "sintético" como se utiliza en la presente invención, se pretende que se refiera a un polipéptido del cual no está, en su totalidad, presente en ningún aislado de VIH que ocurre de manera natural. El término "sintético" los pretende que indique que el polipéptido necesariamente se sintetiza mediante técnicas de química convencional en síntesis de péptidos en fase sólida. Mientras que esto representa solamente una posibilidad, generalmente se prefiere que el polipéptido se sintetiza mediante transcripción y/o traducción a partir de una molécula de ácido nucleico apropiada que codifica el polipéptido sintético. Dichos métodos de síntesis son bien conocidos por los expertos en la técnica y no forman parte de la invención. Se prefiere que la proteína gag (o porción de la misma) y el polipéptido sintético estén unidos de alguna manera en una entidad única. Por ejemplo, un vector viral puede expresar tanto la proteína gag como el polipéptido sintético como componentes separados del ¡nmunógeno. Alternativamente, ambos componentes del ¡nmunógeno pueden estar covalentemente acoplados o conjugados entre sí o a una entidad que actúa como vehículo (tal como un liposoma, ISCOM o molécula). En modalidades preferidas, tanto la proteína gag como los componentes del polipéptido sintético del ¡nmunógeno están presentes en un polipéptido particular o proteína de fusión. En dicha proteína de fusión, la proteína gag y el polipéptido sintético pueden ser esencialmente los únicos componentes presentes. Alternativamente la proteína de fusión puede comprender otros componentes los cuales pueden corresponder a otros antígenos VIH (o porciones del mismo), o pueden dedicarse a partir de otras fuentes. Por lo tanto, en algunas modalidades, el polipéptido comprende una porción de la proteína gag substancialmente adyacente al polipéptido sintético (es decir con menos de 10 residuos de aminoácidos que intervienen). En otras modalidades, la porción de la proteína gag y el polipéptido sintético pueden separarse mediante uno o más componentes que intervienen (es decir con diez o más residuos de aminoácidos que intervienen), los cuales típicamente comprenderán uno o más antígenos adicionales de VIH. También se prefiere generalmente que el inmunógeno no contenga la secuencia de aminoácidos completa de la proteína gag. Típicamente entre 55 y 95% de la proteína gag estará presente, preferiblemente entre 65 y 85%, más preferiblemente aproximadamente 75%. La proteína gag de VIH de tipo silvestre se sabe que consiste de tres porciones denominadas p17, p24 y p15. Esta se sintetiza en células infectadas como una sola poliproteína, con p17 en el N-terminal. Normalmente, en las células infectadas con VIH, el N-terminal de p 7 está miristilado. Es deseable que la porción gag del inmunógeno comprenda al menos parte de p17 y p24, pero generalmente se prefiere que el componente p17 este modificados de alguna manera para prevenir la miristilación. Convenientemente esto puede lograrse mediante la reversión del orden de los componentes p 7 y p24 en el inmunógeno, de manera que p17 ya no está en un N-terminal libre y por lo tanto no puede ser miristilada. Los inventores que en que esto puede mejorar la eficiencia de la presentación de los péptidos, derivados a partir del inmunógeno, a un sistema inmune del sujeto.

El componente de la proteína gag del inmunógeno generalmente comprenderá al menos una célula T ayudadora, HLA clase II restringida, epítope peptídico y preferiblemente comprende una pluralidad de dichos epítopes (preferiblemente de tal manera que un número de alelos diferentes HLA Clase II restringidos están representados en el componente gag). El componente de la proteína gag comprenderá también típicamente uno o más epítopes peptídicos CTL HLA Clase I restringidos. El componente polipeptídico sintético del inmunógeno convenientemente tomará la forma de una extensión de epítopes CTL, cada uno representado por, o continuado con, una secuencia respectiva de aproximadamente 8-12 aminoácidos. Deseable mente al menos algunos (preferiblemente la mayoría) de los epítopes se sobrepondrán parcialmente (de tal manera que uno o más aminoácidos de un epítope también están contenidos dentro de la secuencia de un epítope adjunto). Algunas secuencia de aminoácidos "no epítopes" pueden presentarse entre los epítopes contiguos, pero esto generalmente se evita. La secuencia de aminoácidos no epitópicas entre epítopes contiguos preferiblemente es menor de 20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente menor que 10 residuos, y más preferiblemente 1-5 residuos de aminoácidos. Será aparente que dichas secuencia de aminoácidos no epitópicas puede comprender adaptadores, espaciadores y similares los cuales optimizan los niveles de expresión del polipéptido sintético u optimizan su inmunogenicidad.

Por lo tanto en una modalidad extrema, todos los epítopes CTL de humano en el polipéptido sintético pueden sobreponerse y, en el otro extremo, cada epítope puede separarse a partir de sus epítopes contiguos mediante al menos una secuencia de aminoácidos no epitópica. Generalmente se prefiere que al menos 50% de los epítopes CTL de humano no se sobrepongan. Además de los epítopes sobrepuestos, el polipéptido sintético puede comprender al menos algunos "epítopes adyacentes". El término epítopes adyacentes se refiere a epítopes los cuales no se sobreponen pero los cuales no están separados por ninguna secuencia de aminoácidos no epitópicas que intervenga. Por lo tanto en modalidades preferidas el polipéptido sintético comprende un mosaico reconstruido junto a partir de fragmentos pequeños (típicamente aproximadamente 10-20 residuos de aminoácidos) de diferentes proteínas VIH, cuyos fragmentos típicamente comprenderán uno, dos o tres epítopes CTL adyacentes conocidos y/o epítopes CTL sobrepuestos de humano. En donde una pluralidad de fragmentos está presente en el polipéptido sintético a partir de la misma proteína VIH, los fragmentos típicamente han sido seleccionados a partir de porciones discontinuas de la proteína, de manera que no es probable que el polipéptido sintético comprenda una secuencia que corresponda a más de 20-25 residuos de aminoácidos consecutivos de una proteína VIH particular. Generalmente el polipéptido sintético se diseña de manera que esencialmente no omite aquellas porciones de las proteínas VIH que no se sabe que contengan ningún epítope CTL de humano. Una pluralidad de diferentes proteínas VIH preferiblemente estará representada en el polipéptido sintético. El polipéptido sintético puede contener epítopes presentes en cualquier antígeno de VIH, pero preferiblemente comprenderá al menos un epítope presente en uno o más de los siguientes: p24, pol; gp41 ; gp120; y nef. En una modalidad referida, el polipéptido sintético comprende al menos un epítope CTL presente en cada una de las proteínas de VIH anteriormente mencionadas. El polipéptido sintético puede comprender adicionalmente al menos un epítope CTL presente en cada una de las siguientes proteínas VIH: vpr, vpu, vif (y especialmente) tat y rev. Se entenderá que el término "epítope CTL de humano", se utilicen la presente invención no se refiere al origen de la proteína a partir de la cual deriva el epítope, sino que indica que el epítope se reconoce y responde mediante el CTL al menos una porción de la población humana. Típicamente un epítope CTL de humano será reconocido por al menos 0.01%, preferiblemente 0.1%, y más preferiblemente al menos uno por ciento de la población humana mundial. En una modalidad particular, el inmunógeno excluye específicamente cualquier epítope a partir de la proteína env que generalmente se reconoce por el sistema inmune de humano. 'Las probable diagnóstico más utilizadas actualmente se basan en la detección de una respuesta inmune específica a env de VIH, de manera que mediante la exclusión de los componentes env a partir el inmunógeno es posible distinguir entre respuestas inmunes generadas a partir de la infección con el virus y la inoculación con el inmunógeno. En una modalidad, los epítopes CTL presentes en el polipéptido sintético se seleccionan de manera que se generará una respuesta a ciada A de VIH. Sin embargo preferiblemente, el polipéptido sintético es lo suficientemente grande, y los epítopes CTL se seleccionan apropiadamente, de tal manera que se estimulará una respuesta inmune la cual es reactiva de manera cruzada en contra de diferentes ciadas de VIH. Esto puede lograrse convenientemente al incluir uno o más epítopes CTL los cuales están conservados entre diferentes ciadas de VIH. Varios de dichos epítopes se conocen por los expertos en la técnica (véase cuadro 1 a continuación). En una modalidad referida, el inmunógeno comprende al menos un epítope (convenientemente un epítope CTL) el cual se reconoce por uno o más mamíferos prueba de laboratorio, (por ejemplo ratón y/o mono). Dicho epítope puede incorporarse fácilmente dentro del polipéptido sintético. La inclusión de un epítope de este tipo permite que se mantenga la calidad, de reproductibilidad y/o estabilidad de diferentes lotes del inmunógeno a ser evaluado en un ensayo potencial utilizando el mamífero prueba de laboratorio (tal como un ratón o mono macaco). Los ejemplos de dichos epítopes incluyen la secuencia de aminoácidos ACTPYDINQML (Seq. ID No. 1 ; que contiene un epítope dominante derivado a partir del virus de inmunodef ¡ciencia de simio, SIV, gag, p27, reconocido por el mono macaco rhesus CTL) y RGPGRAFVT1 (Seq. ID. No. 2; un epítope de ratón de CTL restringido por H-2Dd derivado a partir de proteína env de VIH). Una lista de aproximadamente 23 epítopes de CTL de humano para inclusión en el polipéptido sintético se muestra en el cuadro 1. La lista no es exhaustiva. Un inmunógeno preferido comprenderá al menos 10 de dichos epítopes CTL de humano, más preferiblemente al menos 15, más preferiblemente al menos 20. En una modalidad particular cada uno de los 23 epítopes CTL de humano listados en el cuadro 1 estará representado en el polipéptido sintético, ocasionalmente junto con los epítopes de macaco y de murino también listados en el cuadro 1. De manera deseable el inmunógeno puede comprender adicionalmente una marca pequeña o marcador. Dicha marca o marcador debe ser tan pequeño como sea posible, con el objeto de minimizar la cantidad de material externo presente en el inmunógeno. Una marca o marcador conveniente permite la detección de la expresión y/o cuantificación de la cantidad de inmunógeno. Las marcas adecuadas incluyen epítopes reconocidos por el anticuerpo monoclonal Pk (Hanke et al., 1992 J. Gen. Virol. 73, 653-660). El inmunógeno de la invención convenientemente estará mezclado con otras sustancias con el objeto de proveer una composición de vacuna. Por ejemplo, una composición de vacuna puede comprender adicionalmente uno o más de los siguientes: un adyuvante (por ejemplo, alumbre), liposoma, o complejo ¡nmunoestimulante (ISCOM). Una vacuna generalmente comprenderá un diluyente estéril, excipiente o vehículo, tal como un líquido fisiológicamente aceptable (por ejemplo solución salina o solución salina amortiguada con fosfato). La vacuna puede estar presente 5 como un líquido, más preferiblemente, como un sólido secado mediante congelamiento, el cual se suspende o se disuelve en un líquido fisiológicamente aceptable antes de la administración. Los métodos de administración del inmunógeno a un sujeto ' humano) a los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, en particular, 10 inyección intramuscular, inyección subcutánea, o administración a través de la piel mediante un dispositivo de inyección sin aguja. Alternativamente, las vacunas (especialmente aquellas que comprenden vectores bacterianos por ejemplo Salmonella o Shigella spp. atenuadas) pueden ser dadas oralmente, intradermalmente conveniente cualquier otra ruta adecuada. Una dosis 15 adecuada de inmunógeno típicamente será de 1 a 500 mg, típicamente de 10 a 100 mg, dependiendo del tamaño del inmunógeno, la masa corporal del recipiente, etcétera. Una dosis adecuada puede, es necesario, ser averiguada mediante rutina de ensayo y error con diferentes grupos de sujetos a los que se les dan diferentes dosis de inmunógeno, y la respuesta inmune de los 20 sujetos al inmunógeno ensayado con el objeto determinar el tamaño de la dosis óptima. La respuesta inmune de los sujetos puede evaluar se mediante técnicas inmunológicas convencionales (por ejemplo ensayo de liberación de cromo, utilizando linfocitos de sangre periférica obtenidos a partir de muestras sanguínea de sujetos, actuando sobre células blanco marcadas con cromo infectadas con virus pulsadas con el péptido). En un segundo aspecto, la invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, la proteína de fusión 5 comprendiendo un inmunógeno de conformidad con el primer aspecto de la invención definido anteriormente. La molécula de ácido nucleico preferiblemente está en forma * aislada, estéril, adecuada para administración a un sujeto humano. La * molécula de ácido nucleico preferiblemente está "humanizada" es decir, 10 emplea codones para codones particulares de aminoácidos, cuyos codones frecuentemente se utilizan en genes de humano que se expresan altamente (Andre et al., 1998 J. Virol. 72, 1497-1503), en lugar de aquellos cordones utilizados por VIH. De manera deseable la molécula de ácido nucleico está 15 contenida dentro de un vector, la secuencia codificante del inmunógeno estando operativamente unida a una secuencia promotora activa en células de humano. De manera conveniente el promotor es un promotor viral fuerte tal como el promotor a partir del citomegalovirus de humano (CMV). El vector preferiblemente también comprenderá un potenciador y señales de 20 poliadenilación, las cuales son funcionales en las células de humano. Idealmente el vector no debe contener ningún origen de replicación funcional en células de humano, para prevenir la replicación no deseable el vector.

El vector puede ser administrado al sujeto en aislamiento, como ácido nucleico esencialmente "desnudo" (preferiblemente ADN), o puede ser empaquetado dentro de modos de administración, tales como un virus, bacterias, liposomas, o partículas cubiertas con oro y similares. Un modo de administración adecuado es el virus Ankara de vaccinia modificado (MVA): el gen del inmunógeno o marco de lectura abierto (ORF) puede insertarse dentro de MVA, por ejemplo, en el locus de timidin cinasa. Se apreciará por los expertos en la técnica que un vector puede comprender un ácido nucleico que codifica un inmunógeno (el ácido nucleico del mismo estando de conformidad con el segundo aspecto de la invención), y que el vector también puede poseer, en su superficie o internamente, el polipéptido inmunógeno de conformidad con el primer aspecto de la invención. Ya sea que se administre como ácido nucleico desnudo, o empaquetado dentro de un modo de administración, al menos algo del ácido nucleico administrado entra a las células de los sujetos y se transcribe (si es necesario) y se traduce, resultando en la síntesis in situ del inmunógeno en el sujeto, el cual desarrolla entonces una respuesta inmune al inmunógeno. Como con la preparación inmunogénica per se, un ácido nucleico que codifica el inmunógeno puede ser administrado a un sujeto humano mediante cualquiera de varias rutas conocidas por ejemplo inyección subcutánea o intramuscular, administración oral, o administración a través de la piel por medios de inyección sin aguja. Los ejemplos particulares de administración mediante dispositivos de inyección sin aguja se describen en WO 97/34652 y WO 97/48485. Una dosis adecuada de ácido nucleico puede ser a partir de 10 µ9 a 10 mg, típicamente a partir de 100 a 1 mg, dependiendo del tamaño de la molécula de ácido nucleico, ruta de administración, masa corporal del recipiente, etcétera. De nuevo, una rutina de ensayo y error (con el beneficio de las enseñanzas actuales) capacitará a los expertos de la técnica para determinar una dosis óptima del ácido nucleico. La administración exitosa del ADN al tejido animal se ha logrado mediante liposomas catiónicos [Watanabe et al., Mol. Reprod. Dev. 38: 268-274 (1994); Sharkey et al., WO 96/20013], inyección directa de ADN desnudo dentro de tejido muscular de animal [Robinson et al., Vacc. 11: 957-960 (1993); Hoffman et al., Vacc. 12: 1529-1533; (1994); Xiang et al., Virol. 199: 132-140 (1994); Webster et al., Vacc. 12: 1495-1498 (1994); Davies et al., Vacc. 12: 1503-1509 (1994); y Davies et al., Hum. Molec. Gen. 2: 1847-1851 (1993)], y embriones [Naito et al., Mol. Reprod. Dev. 39: 153-161 (1984); y Burdon et al., Mol. Reprod. Dev. 33: 436-442 (1992)], o una inyección intradermal de ADN utilizando la tecnología de "pistola de genes" [Johnston et al. , Meth Cell Biol. 43: 353-35 (1994)]. Para la vacunación basada en ADN, la administración mediante inyección de ADN plasmídico desnudo ha mostrado potencial en modelos de ratón para inducir tanto respuestas inmunes humorales como celulares. Sin embargo, en los animales más grandes, el uso de la administración de ADN para vacunación ha sido impedido por el requerimiento de grandes cantidades de ADN o la introducción de expresión persistente de un antígeno con el potencial para desarrollar tolerancia al antígeno. Berglund reportó una estrategia para inducir o mejorar una respuesta inmune mediante la inyección de ratones con un ADN plasmídico que contiene un vector de expresión de ADN de alfavirus que tiene un replicón recombinante del virus Semliki Forest (SFV) en un cásete de expresión de eucarionte [Berglund et al., Nature Biotechnol. 16: 562-565 (1998)]. El cásete de expresión de eucarionte controló la expresión de la transcripción nuclear primaria del replicón SFV. Este transcrito del replicón SFV, que codifica en la antígeno heterologo, se transportó al citoplasma y se amplificó mediante el complejo replicasa SFV auto-codificado. El replicón de ARN amplificado lleva a un elevado nivel de producción de un ARNm que codifica el antígeno heterologo. Resultados similares fueron descritos por Polo y su grupo [Polo et al., Nature Biotechnol. 16: 517-518 (1998); Hariharan et al., J. Viral. 72: 950-958 (1998)]. Ambos grupos encontraron que la respuestas inmunes fuertes pueden ser inducidas utilizando la contribución de cantidades pequeñas de ADN plasmídico. Alternativamente, un método para administrar ADN a los animales que superar las desventajas de los métodos de administración convencionales es mediante la administración atenuada, de bacterias invasivas que contienen un vector de ADN bacteriano que tiene un cásete de expresión eucarionte que codifica el gen a ser expresado. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5, 877, 159 a Powell et al., describen bacterias vivas que pueden invadir células animales sin establecer una infección productiva u ocasionar enfermedad a las mismas introduciendo un cásete de expresión eucarionte que codifica un antígeno capaz de ser expresado por la células animales. El tercer aspecto de la invención provee un método de 5 estimulación de una respuesta inmune anti-VIH en un sujeto humano, el método comprende preparar un inmunógeno de conformidad con el primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico de conformidad con el segundo aspecto de la invención; y administrar dicho inmunógeno, molécula * de ácido nucleico al sujeto. 10 De manera conveniente, el método comprende la administración tanto del inmunógeno como de la molécula de ácido nucleico. En particular, el método preferiblemente comprende una o más administraciones de la molécula de ácido nucleico ("cebar") seguido a un intervalo adecuado (por ejemplo una semana a cuatro meses) por una o más administraciones del 15 inmunógeno ("refuerzo"). El refuerzo puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la administración de un vector competente de replicación (por ejemplo virus o bacteria atenuada) o vector no replicante que comprende al inmunógeno y/o una molécula de ácido nucleico que codifica al inmunógeno. Preferiblemente el refuerzo se logra mediante la administración del 20 inmunógeno como parte de una partícula viral MVA, cuya partícula puede comprender ventajosamente un ácido nucleico que codifica al inmunógeno. En modalidades preferidas, el desempeño del método resultó en la generación en el sujeto de una respuesta inmune protectora de tal manera que, a pesar de que sujeto se exponga subsecuentemente a infección por VIH, el sujeto no desarrollará los síntomas de SIDA asociados con la infección por VIH. En un cuarto aspecto la invención provee el uso de un inmunógeno de conformidad con el primer aspecto de la invención y/o un ácido nucleico de conformidad con el segundo aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar infección por VIH en un sujeto humano. En un quinto aspecto, la invención provee una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestran la figura 8A. Convenientemente el ácido nucleico comprende o consiste esencialmente de la secuencia nucleotídica mostrado en la figura 8D. En un sexto aspecto, la invención provee un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestran la figura 8A. El ácido nucleico del quinto aspecto y/o el polipéptido del sexto aspecto pueden utilizarse en composiciones inmunes/de vacunas como se describe en relación con los otros aspectos de la invención, y dichos inmunógenos y vacunas se consideran por consiguiente dentro del alcance de la invención, y puede comprender vectores etc. (especialmente MVA) como se menciona anteriormente. La invención además provee, en un séptimo aspecto, un método de estimulación de una respuesta inmune anti-VIH en un sujeto humano, el método comprendiendo la administración al sujeto de un ácido nucleico de conformidad con el quinto aspecto de la invención y/o un '??? l i i L¿¿- L ¦ i it tfi--r H. im polipéptido de conformidad con el sexto aspecto de la invención. Finalmef^e, la invención provee el uso de un ácido nucleico de conformidad con el quinto aspecto de la invención y/o un polipéptido de conformidad con el sexto aspecto de la invención en la preparación de medicamento para prevenir o tratar infección por VIH en un sujeto humano. La invención ahora se describirá mediante ejemplos ilustrativos y con referencia a los dibujos anexos, en donde: La figura 1A es una representación esquemática de los inmunógenos, VIH A, VIH TA y VIH eT de conformidad con la invención; y un inmunógeno PPA; La figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos del inmunógeno VIH A (Seq. ID. No. 26); La figura 2A muestra la secuencia nucleotídica (Seq. ID No. 27) de un ácido nucleico (denominado "gen VIH A") que codifica al inmunógeno VIH A; La figura 2B es una representación esquemática del método utilizado para construir el gen VIH A; La figura 3 es una representación esquemática de una molécula de vector de ADN (pTHr. VIH A) de conformidad con la invención, y el método de su construcción; La figura 4 es una micrografía que muestra la detección ¡nmunofluorescente de la expresión de VIH A mediante células de ratón después de la transfección con pTHr. VIH A; Las figura 5A, B y C son gráficas de muestran los resultados del análisis de liberación de cromo utilizando esplenocitos obtenidos a partir de ratones inoculados con una molécula de ADN o un inmunógeno de conformidad con la invención; La figura 6A muestra la secuencia de aminoácidos del inmunógeno VIH TA (Seq. ID. No. 28); La figura 6B muestra la secuencia nucleotídica (Seq. ID. No. 29) de una molécula de ácido nucleico que codifica el inmunógeno VIH TA; La figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos (Seq. ID. No. 30) del polipéptido tat en el inmunógeno VIH AeT; La figura 7B muestra la secuencia nucleotídica (Seq. ID. No. 31 ) de una molécula de ácido nucleico que codifica el inmunógeno VIH AeT; La figura 8A muestra la secuencia de aminoácidos (Seq. ID. No. 32) del inmunógeno PPA el 40 de conformidad con el sexto aspecto de la invención; y La figura 8B muestra la secuencia nucleotídica (Seq. ID. No. 33) de una molécula de ácido nucleico (de conformidad con el quinto aspecto de la invención) que codifica el inmunógeno PPA.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Este ejemplo se refiere a un inmunógeno para uso en una vacuna que se enfoca en la inducción de respuestas inmunes celulares mediadas por un una acción concertada de linfocitos T ayudadoras CD4+ y linfocitos T efectores CD8+. El inmunógeno, designado VIH A (Hanke y McMicheal Nat. Med. 6, 951- 955), se diseñó a un ensayo de eficiencia fase III en Nairobi, Kenya. La figura 1A es una representación esquemática de varios inmunógenos, incluyendo VIH A. VIH A deriva a partir de la secuencia de VIH-1 ciada A, la ciada VIH predominante en Nairobi y consiste aproximadamente 73% de la proteína gag fusionada a una extensión de 25 epítopes CTL parcialmente sobrepuestos. El dominio gag de VIH A contiene p24 y p17 en una orden inverso a la poliproteína viral gag p17-p24-p15. Este rearreglo previene la miristilación del N- terminal de p17, el cual podría dirigir la proteína recombinante a la membrana celular, previniendo así la degradación eficiente hacia péptidos necesaria para la presentación del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I. La figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos (Seq. ID. No. 26) del inmunógeno VIH A. los aminoácidos correspondientes a los sitios de endonucleasas de restricción utilizados para ensamblar el gen se muestran en negritas (GC- corresponde a BamHI, GT corresponde a Kpnl y EF corresponde a EcoRI). La secuencia de aminoácidos del dominio gag se derivó a partir de la secuencia de consenso de la base de datos de la proteína de VIH A ciada A (Korber et al., "Human retroviruses and AIDS; a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences" 1997). En la ausencia de las secuencias de la cepa de Kenia disponible, las regiones sin una preferencia fuerte de ciada A de aminoácidos tuvieron una predisposición a favor de los aislados de Uganda. La proteína gag de VIH-1 contenían no solamente los epítopes importantes de MHC clase I, sino también los epítopes restringidos de la clase II los cuales estimulan a las células T ayudadoras CD4+. El C-terminal de la proteína VIH A se diseñó como un polipéptido sintético de epítope multi-CTL. Los epítopes CTL incluidos en VIH A se reconocieron por CTL en pacientes infectados con las cepas de VIH-1 ciada A que circulan en Kenia, fueron de 8 a 10 aminoácidos largas, y se originaron a partir de las proteínas gag, pol, nef, o env (Rowland-Jones et al., 1988 J. Clin. Invest. 102, 1758- 1765; Dorrell et al., 1999 J. Virol. 73, 1708- 1714). Muchos de estos epítopes son inmunodominantes y se conservan relativamente entre las otras ciadas de VIH-1 (cuadro 1) (y por lo tanto deben ser capaces de producir una respuestas inmune la cual reaccioné de manera cruzada con virus VIH de ciadas diferentes a la ciada A). Estos actualmente están presentados por dirigir uno de alelos HLA diferentes, los cuales incluyen tanto los alelos de África a frecuentes así como los alelos comunes en la mayoría de las poblaciones étnicas. Ha sido estimado que los epítopes seleccionados óptimamente por los nueve alelos HLA más comunes podrían abarcar a la población general sin importar su descendencia étnica (Sydney et al., 1996 Immunol. Today 17, 261- 266). Por lo tanto, dado que la mayoría de los donantes infectados con VIH realizan una respuestas CTL a gag p17/p24, cada vacuna podría tener el potencial para resultar en el menos dos o tres epítopes CTL presentes en la proteína VIH A. El polipéptido sintético de VIH A también comprende los epítopes SIV gag y VIH env reconocidos por CTL de macaco y murino, respectivamente, de manera que la calidad, reproductibilidad y estabilidad de los lotes clínicos podrían evaluarse fácilmente en un ensayo potencial de ratón (o de macaco si es necesario). Un epítope Pk al anticuerpo monoclonal (Hanke et al., 1992 J. Gen. Viral. 73, 653- 660) se añadió al C- terminal del VIH A para facilitar la detección de la proteína de tamaño total y la estimación del nivel de expresión. No hay razón para creer que los tres epítopes no-HLA representan un riesgo saludable para los individuos vacunados.

CUADRO 1 Epítopes de célula CD8+ incluidos en la región del poliepítope del polipéptido sintético de VIH A a - Los epítopes se listan (Seq. ID. Nos. 3-25, 1 , 2) en el orden en el cual aparecen en el poliepítope. b- Una secuencia particular de epítope se presentan aproximadamente 50% (letra minúscula) o 90% (letra mayúscula) de las dadas de VIH secuenciadas aisladas. c - "-" indica que los epítopes están presentes en el dominio gag A de la ciada N- terminal. d - Un epítope dominante derivada partir de SIV gag p27 flanqueado por Ala y Leu en su N- y C- terminales, respectivamente, reconocido por CTL de macaco rhesus, el cual puede ser utilizado para estudios potenciales en macacos rhesus. e - Un epítope CTL presentado por una MHC de murino clase I utilizado para el ensayo potencial en ratón. Puesto que sea intentado adoptar un protocolo de "cebado/refuerzo", en el cual el cebado se logra mediante la administración de ácido nucleico, fue deseable diseñar la secuencia del ácido nucleico que codifica al inmunógeno VIH A con el objeto incrementar la expresión de VIH A en células de humano. Primeramente, para asegurar el inicio eficiente de la traducción a partir del primer cordón de metionina, el marco de lectura abierto de VIH A (ORF) fue precedido por una secuencia consenso Kozak de 12 nucleótidos de largo (Kozak 1987 Nucí. Acids Res. 15, 8125- 8148). En segundo lugar, la traducción del ARNm resultante se optimizó mediante la sustitución de la mayoría de los codones derivados de VIH-1 con codones frecuentemente utilizados en genes humanos que se expresan altamente (Andre et al., 1998, citado anteriormente). El ORF de VIH A es una parte de un fragmento de ADN Hindlll-Xbal de doble hebra de 1,608 pares de bases de largo. (La figura 2A muestra la secuencia nucleotídica del inserto Hindlll-Xbal que contiene el ORF de VIH A; Seq. ID No. 27). En la figura 2A, los sitios de endonucleasas utilizados para ensamblar los productos de PCR parciales se incuban (nucleótidos 1-6 = Hindlll; 719- 324 = Bam Hl; 712- 717 = Kpnl; 1135-1140 = EcoRI; y 1603- 1608 = Xbal). El ADN plasmídico se preparó y trató utilizando protocolos estándares (Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" segunda edición; Cold Spring Harbor). El gen VIH A se construyó (como se indica en la figura 2B) in vitro en cuatro partes. Cada parte se preparó mediante ensamblar que de los oligodesoxinucleótidos de la hebra positiva y negativa del 70- 90 pares de bases en longitud. Los oligodesoxinucleótidos sintéticos se purificaron utilizando el equipo EconoPure TM (Perkin Elmer) de conformidad con las instrucciones del fabricante, fijándolo ligándolo, seguido por ensamblaje en PCR. Los productos de PCR se purificaron en el después de cada paso hasta que se obtuvieron los fragmentos esperados con los sitios únicos de endonucleasas de restricción terminal. Estos cuatro productos se clonaron y secuenciaron, y se ligaron juntos para generar el gen VIH A completo. El gen VIH A se insertó entonces dentro de la construcción pTHr y del vector MVA de vacuna, como se describe a continuación.

El vector pTHr. Un vector pTHr para una transferencia directa de gen se diseñó con el objetivo de minimizar el número de elementos funcionales y por lo tanto la cantidad de ADN requerida para ser administrada. La construcción de pTH se describió previamente (Hanke et al., 1998 Vaccine 16, 426- 435). Esta contiene un cassette de expresión eficiente del potenciador/promotor/intrón A del genoma AD169 de la cepa de citomegalovirus de humano (hCMV) (Whittle et al., 1989 Protein Eng. 1 , 499-505; Bebbington 1991 Methods 2, 136- 145). La región del promotor está seguida por el poliadaptador derivado de pRc/CMV (Invitrogen) y la señal de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento de bovino. El gen de ß-lactamasa que contiene resistencia a ampicilina a las bacterias transformadas y un origen de replicación del ADN de doble hebra procarionte Co1E1 derivados ambos a partir del plásmido pUC19. pTH lo contiene un origen para la replicación en las células de mamífero. Después de la inserción del ADN de VIH A dentro del poliadaptador pTH, el fragmento del gen de la ß- lactamasa entre los sitios Mlul y Dral se removió y la construcción resultante pTHr.VIH A (figura 3) se propagó en bacterias utilizando el sistema de titulación mediante represor desarrollado por Cobra Pharmaceuticals Ltd. (keele, UK), el cual selecciona las bacterias que portan el plásmido sin la necesidad de la presencia de un gen de resistencia antibióticos en el plásmido (Williams et al., 1998 Nucí. Acids Res. 26, 2120- 2124). Por lo tanto, la vacunación con ADN no introduce dentro de la vacuna de humano grandes números de copias de un gen de resistencia antibiótico. La construcción de pTHr.VIH A esta ilustrada esquemáticamente en la figura 3 (CMV e/p/i = cassette potenciador /promotor/intrón A de CMV de humano; BGHpA = señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento de bovino; Co1E1 = origen de la replicación de dsDNA en bacterias; los símbolos de cabezas de flechas denotan secuencias de unión al represor). Las células 293T (y los fibroblastos de embrión de pollo [CEF] se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco) suplementado con 10% de suero de murino fetal (FBS; Gibco); L-glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina. Las células cultivaron en una incubadora humidificada con CO2 al 5% a 37°C. Las células 293T se transfectaron transitoriamente con pTHr.VIH A utilizando el método de DEAE-dextrán-cloroquina (Hanke et al., 1998 Vaccine 16, 426- 435). Brevemente, 2.5 x 05 células 293T se crecieron sobre cubreobjetos en cajas de cultivo de tejidos de seis pozos durante toda la noche. Al siguiente día, las células se transfectaron con 5 gramos por pozo de ADN. Después de 48 horas, las células transfectadas se fijaron, sus membranas de permeabilizan y se utilizó el mAb SV5-P-k seguido por anticuerpos anti-murino conjugados con FITC para detectar las proteínas recombinantes expresadas. Una micrografía que ilustra los resultados del espécimen se muestra la figura 4. La figura muestra tres células transfectadas y una célula no transfectada con señal de fondo (izquierda superior). El refuerzo se logró mediante la administración de un vector MVA que expresa el inmunógeno VIH A. MVA es un virus de vacuna atenuado seguro para aplicación clínica, el cual casi ha perdido su capacidad para replicarse en células de humano (Mayr et al., 1975 Infection 105, 6- 14). El uso de MVA como un vehículo de vacuna y sus características las cuales lo hacen una elección atractiva entre los vectores atenuados de virus de enfermedades infecciosas (véase, por ejemplo Sutter et al., 1994 Vaccine 12, 1032- 1040; y Moss et al., 1996 Adv. Exp. Med. Biol. 397, 7- 13) ha sido descrito extensivamente. El gen de VIH A se ligó dentro del plásmido pSC11 , el cual dirige el gen dentro del locus de timidin cinasa del MVA (Carroll y Moss 1995 Biotechniques 19, 352- 356). Los almacenamientos en masa de MVA recombinantes se crecieron sobre CEF primarios obtenidos a partir de los huevos de una bandada específica libre de patógenos. MVA se purificó mediante centrifugación de extractos citoplásmicos a través de una almohadilla de sucrosa 36% (p/v) en un rotor Beckman SW28 a 13,500 rpm por 80 minutos. Tomando ventaja del gen de ß-galactosidasa co-insertado, los títulos del virus de almacenamiento se determinaron a partir del número de placas azules después de la incubación de las monocapas de células infectadas con el sustrato apropiado. Ensayo de potencia de la vacuna. Las potencias del ADN y los vectores MVA se evaluaron en grupos de ratones Balb/6 tomando ventaja de la presencia del epítope restringido por H-2Dd (Takahashi et al., 1993 Int. Immunol .5, 849- 857). Para la vacuna de ADN de pTHr.VIH A, lo ratones se inyectaron con una aguja ya sea intramuscularmente con 100 µg de ADN o se inmunizaron dos veces 3 semanas aparte intradermalmente con un total de 2 µ9 de ADN utilizando el dispositivo de administración de genes Dermal XR de PowderJect Vaccines Inc. (Madison, Wl, EUA). Los ratones sacrificaron 10 o 21 días después de la última inmunización. Los pasos a partir de los ratones inmunizados se promovieron y se presionaron individualmente a través de un colador de células (Falcon) utilizando una jeringa de 2 mi con émbolo de goma. Los esplenocitos se lavaron y se dividieron en dos mitades. Una mitades se congeló para análisis de tetrámero y la segunda mitad se suspendió en 5 mi en medio para linfocito (R10, HEPES 20 mM y ß-mercaptoetanol 15 mM) y se estimularon in vitro mediante incubación con 2 g/ml del péptido RGPGRAFVTI (Seq. ID. No. 2) en una incubadora humidificada con CO2 al 5% a 37°C por 5 días. Las células detectoras se diluyeron dos veces en pozos con fondo en forma de U (placas de 96 pozos; Costar) iniciando con una relación 100:1 del efector al blanco. Cinco miles de células blanco P815 marcadas con 51Cr en un medio sin o suplementado con el péptido 10"6 M se añadieron entonces a los efectores y se incubaron a 37°C por 5 horas. Las liberaciones de cromo espontáneas y totales se estimaron a partir de los pozos, en los cuales las células blanco se mantuvieron en medio solo o con Tritón X-100 a 5%, respectivamente. El porcentaje específico de lisis se calculó como [(liberación de la muestra- liberación espontánea)/(liberación total- liberación espontánea)] x 100. La liberación espontánea fue menor que 5% del total de c.p.m.

Los resultados de los ensayos típicos se muestran en las figuras 5A-C, las cuales son gráficas de % de lisis específica en contra de la relación Efector: Blanco. La figura 5A muestra resultados a partir de esplenocitos obtenidos de ratones inmunizados una vez con 100 µg de ADN de pTHr.VIH A. La figura 5B resultados a partir de ratones inmunizados dos veces intradermalmente con ADN de pTHr.VIH A. La figura 5C muestra resultados obtenidos a partir de ratones inmunizados intramuscular mente con 107 pfu de MVA.VIH A. En cada una de las figuras 5A-5C, cada línea representa un ratón particular. La lisis de los blancos pulsados con el péptido se denota por símbolos rellenos, los blancos no pulsados por símbolos abiertos. Ambos modos de administración del vector pTHr.VIH A fueron altamente inmunogénicos e indujeron altas actividades citolíticas en todos animales inmunizados (véase figuras 5A y B). Similarmente, una inyección única intramuscular con aguja de 107 unidades formadoras de placa de MVA-VIH A produjo en todas los vacunados actividades líticas fuertes específicas del péptido medidas después de la re-estimulación de un cultivo (figura 5C).

EJEMPLO 2 Se prepararon construcciones adicionales de ácido nucleico las cuales codificaban para inmunógenos de poliproteína basados en VIH A, pero que comprendían componentes antigénicos adicionales de VIH. Estas construcciones adicionales y sus inmunógenos codificados se denominaron VIHTA y VIHAeT, como se muestra la figura 1A. También se muestra una construcción/inmunógeno denominada PPA. Es ADN relevante/secuencias de aminoácidos se muestran en las figuras 6 A/B- 8A/B respectivamente, aunque la figura 7A muestra solamente esa porción de la secuencia de aminoácidos en VIH A eT (atribuible a tat) la cual es adicional a la de VIH A. (Nótese que la secuencia de los sitios Hindlll y Xbal en los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADN no se muestren las figuras 6B, 7B y 8B). Las construcciones se prepararon de manera similar a la descrita anteriormente para VIH A. VIHTA y VIHAeT comparten el mismo diseño racional con VIH A, pero adicionalmente incluyendo la secuencia de tat de la dada A de VIH-1 , expresada ya sea como parte de una proteína de fusión con gag y el polipéptido sintético poliepitópico, (en el caso de VIHTA, la secuencia tat esta posicionada entre gag y el polipéptido sintético), o ya sea que está presente en la misma construcción pero se expresa como en un polipéptido separado (en el caso de VIHAeT), en virtud de la inclusión de un sitio interno de entrada al ribosomas (IRES). Cada una de las moléculas de ácido nucleico pueden ser utilizadas para inmunizar sujetos, de manera similar a la descrita anteriormente en relación con el ADN de VIH A. De manera similar, las moléculas pueden ser introducidas dentro de vectores apropiados, especialmente MVAP de nuevo como se describió anteriormente en el ejemplo 1 , y el vector resultante utilizado para inmunizar sujetos.

La significancia de la diversidad genética entre VIH individuales aisladas y su implicación para diseño de vacuna ha sido debatida por largo tiempo. La ciada predominante de VIH-1 en Europa y Norteamérica es la de ciada B, la cual también es la más estudiada. En África central y África del este, la cepa VIH-1 predominantemente circulante es ciada A, mientras que dada C es dominante en América del Sur, India y China. Generalmente, un diseño de vacuna específico para ciada requiere una consideración más cuidadosa para la inducción de nAb que para CTL. Aunque hay algunas diferencias importantes inter-clada en los epítopes CTL, muchos epítopes están conservados parcialmente a través de las ciadas debido a las restricciones en estructura/función. Sin embargo, para facilitar la interpretación de los estudios de eficiencia, las vacuna deben intentar coincidir con las cepas locales prevalentes en la población de ensayo con el criterio de que cualquier método exitoso puede ser adaptado para otras dadas y la protección cruzada no se logra.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medical Research Council International Aids Vaccine Initiative University of Nairobi <120> Mejorías en o Relacionadas con la respuesta inmune a VIH <130> MJL/C1248 ' 1/M <140> <141> <160> 33 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia de simio <400> 1 Ala Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gln Met Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 2 Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr lie 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 3 Ala Leu Lys His Arg Ala Tyr Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 4 Pro Pro lie Pro Val Gly Glu lie Tyr i 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 5 Gly Glu lie Tyr Lys Arg Trp lie lie 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 6 Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 7 Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 8 Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 9 Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 10 Ala lie Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 11 lie Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 12 Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 13 Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 14 Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 15 Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 16 Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 17 Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 18 Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 19 Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 20 Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu i 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 21 lie Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 22 lie Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 23 His Pro Asp lie Val lie Tyr Gln Tyr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 24 Val lie Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu 1 5 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Virus de inmunodeficiencia humana <400> 25 Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 527 < 12> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: polipéptido quimérico <400> 26 Met Pro lie Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser 1 5 10 15 Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val lie Glu Glu Lys Ala Phe 20 25 30 Ser Pro Glu Val lie Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn lie Val Gly Gly His Gln Ala 50 55 60 Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr lie Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp 65 70 75 80 Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro lie Pro Pro Gly Gln Met 85 90 95 Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp lie Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln 100 105 110 Glu Gln lie Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro lie Pro Val Gly Asp 115 120 125 lie Tyr Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys lie Val Arg Met 130 135 140 Tyr Ser Pro Val Ser lie Leu Asp lie Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro 145 150 155 160 Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln 165 170 175 Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln 180 185 190 Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser lie Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro 210 215 220 Gly His Lys Ala Arg Val Leu Gly Thr Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu 225 230 235 240 Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly 245 250 255 Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu 260 265 270 Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Ser Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly 275 280 285 Cys Gln Gln lie Met Glu Gln Leu Gln Ser Ala Leu Lys Thr Ser Glu 290 295 300 Glu Leu Lys Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His 305 310 315 320 Gln Arg lie Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys lie Glu 325 330 335 Glu lie Gln Asn Lys Ser Lys Gln Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Asp 340 345 350 Thr Gln Ser Ser Ser Lys Val Ser Gln -Asn Tyr Ala Leu Lys His Arg 355 360 365 Ala Tyr Glu Leu Glu Phe Pro Pro lie Pro Val Gly Glu lie Tyr Lys 370 375 380 Arg Trp lie lie Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 385 390 395 400 Arg Ala lie Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys lie Thr Leu Trp Gln Arg 405 410 415 Pro Leu Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Thr Val Tyr 420 425 430 Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met 435 440 445 Th Tyr Lys Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly 450 455 460 Leu lie Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr His Pro Asp lie Val 465 470 475 480 lie Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr 485 490 495 Pro Leu Ala Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn Gln Met Leu Arg Gly Pro 500 505 510 Gly Arg Ala Phe Val Thr lie Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp 515 520 525 <210> 27 <211> 1608 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Polinucleótido Quimérico <400> 27 aagcttcccg ccgccaccat gcccatcgtg cagaacgccc agggccagat gcaccaggcc 60 ctgtcccccc gcaccctgaa cgcctgggtg aaggtgatcg aggagaaggc cttctccccc 120 gaggtgatcc ccatgttctc cgccctgtcc gagggcgcca ccccccagga cctgaacatg 180 atgctgaaca tcgtgggcgg ccaccaggcc gccatgcaga tgctgaagga caccatcaac 240 gaggaggccg ccgagtggga ccgcctgcac cccgtgcacg ccggccccat cccccccggc 300 cagatgcgcg agccccgcgg atccgacatc gccggcacca cctccaccct gcaggagcag 360 atcggctgga tgacctccaa cccccccatc cccgtgggcg acatctacaa gcgctggatc 420 atcctgggcc tgaacaagat cgtacgcatg tactcccccg tgtccatcct ggacatccgc 480 cagggcccca aggagccctt ccgcgactac gtggaccgct tcttcaagac cctgcgcgcc 540 gagcaggcca cccaggaggt gaagaactgg atgaccgaga ccctgctggt gcagaacgcc 600 aaccccgact gcaagtccat cctgcgcgcc ctgggccccg gcgccaccct ggaggagatg 660 atgaccgcct gccagggcgt gggcggcccc ggccacaagg cccgcgtgct gggtaccggc 720 gcccgcgcct ccgtgctgtc cggcggcaag ctggacgcct gggagaagat ccgcctgcgc 780 cccggcggca agaagaagta ccgcctgaag cacctggtgt gggcctcccg cgagctggag 840 cgcttcgccc tgaacccctc cctgctggag accgccgagg gctgccagca gatcatggag 900 cagctgcagt ccgccctgaa gacctccgag gagctgaagt ccctgttcaa caccgtggcc 960 accctgtact gcgtgcacca gcgcatcgac gtgaaggaca ccaaggaggc cctggacaag 1020 atcgaggaga tccagaacaa gtccaagcag aagacccagc aggccgccgc cgacacccag 1080 tcctcctcca aggtgtccca gaactacgcc ctgaagcacc gcgcctacga gctggaattc 1140 cctccaattc ctgtcgggga gatttataaa cggtggatca tttttaggga ttatgtcgat 1200 aggttttata aaacgctcag ggccatcttc cagtcctcca tgaccaagat caccctgtgg 1260 cagcgccccc tggtggagcg ctacctgaag gaccagcagc tgctgaccgt gtactacggc 1320 gtgcccgtgt ggaagcgccc ccaggtgccc ctgcgcccca tgacctacaa ggccgtggac 1380 ctgtcccact tcctgaagga gaagggcggc ctgatcctga aggagcccgt gcacggcgtg 1440 taccaccccg acatcgtgat ctaccagtac atggacgacc tgacccccgg ccccggcgtg 1500 cgctaccccc tggcctgcac cccctacgac atcaaccaga tgctgcgcgg ccccggccgc 1560 gccttcgtga ccatccccaa ccccctgctg ggcctggact gatctaga 1608 <210> 28 <211> 633 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Polipéptido Quimérico <400> 28 Met Pro lie Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser 1 5 10 15 Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val lie Glu Glu Lys Ala Phe 20 25 30 Ser Pro Glu Val lie Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn lie Val Gly Gly His Gln Ala 50 55 60 Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr lie Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp 65 70 75 80 Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro lie Pro Pro Gly Gln Met 85 90 95 Arg Glu Pro Gly Ser Asp lie Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln 105 110 Glu Gln lie Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro lie Pro Val Gly Asp 115 120 125 lie Tyr Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys lie Val Arg Met 130 135 140 Tyr Ser Pro Val Ser lie Leu Asp lie Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro 145 150 155 160 Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln 165 170 175 Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gl 180 185 190 Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser lie Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly 195 200 205 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Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp 625 630 <210> 29 <211> 1914 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Polinucleótido Quimérico cccgccgcca ccatgcccat cgtgcagaac gcccagggcc agatgcacca ggccctgtcc 60 ccccgcaccc tgaacgcctg ggtgaaggtg atcgaggaga aggccttctc ccccgaggtg 120 atccccatgt tctccgccct gtccgagggc gccacccccc aggacctgaa catgatgctg 180 aacatcgtgg gcggccacca ggccgccatg cagatgctga aggacaccat caacgaggag 240 gccgccgagt gggaccgcct gcaccccgtg cacgccggcc ccatcccccc cggccagatg 300 cgcgagcccc gcggatccga catcgccggc accacctcca ccctgcagga gcagatcggc 360 tggatgacct ccaacccccc catccccgtg ggcgacatct acaagcgctg gatcatcctg 420 ggcctgaaca agatcgtgcg catgtactcc cccgtgtcca tcctggacat ccgccagggc 480 cccaaggagc ccttccgcga ctacgtggac cgcttcttca agaccctgcg cgccgagcag 540 gccacccagg aggtgaagaa ctggatgacc gagaccctgc tggtgcagaa cgccaacccc 600 gactgcaagt ccatcctgcg cgccctgggc cccggcgcca ccctggagga gatgatgacc 660 gcctgccagg gcgtgggcgg ccccggccac aaggcccgcg tgctgggtac cggcgcccgc 720 gcctccgtgc tgtccggcgg caagctggac gcctgggaga agatccgcct gcgccccggc 780 ggcaagaaga agtaccgcct gaagcacctg gtgtgggcct cccgcgagct ggagcgcttc 840 gccctgaacc cctccctgct ggagaccgcc gagggctgcc agcagatcat ggagcagctg 900 cagtccgccc tgaagacctc cgaggagctg aagtccctgt tcaacaccgt ggccaccctg 960 tactgcgtgc accagcgcat cgacgtgaag gacaccaagg aggccctgga caagatcgag 1020 gagatccaga acaagtccaa gcagaagacc cagcaggccg ccgccgacac ccagtcctcc 1080 tccaaggtgt cccagaacta cgccctgaag caccgcgcct acgagctgga attcatggcc 1140 acaaccatgg accccgtgga ccccaacctg gagccctgga accaccccgg ctcccagccc 1200 accacccccg gctccaagtg ctactgcaag gtgtgctgct accactgccc cgtgtgcttc 1260 ctgaacaagg gcctgggcat ctcctacggc cgcaagaagc gccgccagcg ccgcggcacc 1320 ccccagtcca acaaggacca ccagaacccc atccccaagc agcccatccc ccagacccag 1380 ggcatctcca ccggtcccaa ggagtccaag aagaaggtgg agtccaagac cgagaccgac 1440 cccgaggaat tccctccaat tcctgtcggg gagatttata aacggtggat catttttagg 1500 gattatgtcg ataggtttta taaaacgctc agggccatct tccagtcctc catgaccaag 1560 atcaccctgt ggcagcgccc cctggtggag cgctacctga aggaccagca gctgctgacc 1620 gtgtactacg gcgtgcccgt gtggaagcgc ccccaggtgc ccctgcgccc catgacctac 1680 aaggccgtgg acctgtccca cttcctgaag gagaagggcg gcctgatcct gaaggagccc 1740 gtgcacggcg tgtaccaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgaccccc 1800 ggccccggcg tgcgctaccc cctggcctgc accccctacg acatcaacca gatgctgcgc 1860 ggccccggcc gcgccttcgt gaccatcccc aaccccctgc tgggcctgga ctga 1914 210> 30 211> 104 12> PRT 213> Secuencia Artificial 220> 223> Descripción de Secuencia Artificial: Polipéptido Quimérico <400> 30 Met Ala Thr Thr Met Asp Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn 1 5 10 15 His Pro Gly Ser Gln Pro Thr Thr Pro Gly Ser Lys Cys Tyr Cys Lys 20 25 30 Val Cys Cys Tyr His Cys Pro Val Cys Phe Leu Asn Lys Gly Leu Gly 35 40 45 lie Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Gly Thr Pro Gln 50 55 60 Ser Asn Lys Asp His Gln Asn Pro lie Pro Lys Gln Pro lie Pro Gln 65 70 75 80 Thr Gln Gly lie Ser Thr Gly Pro Lys Glu Ser Lys Lys Lys Val Glu 85 90 95 Ser 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aagcagccca tcccccagac ccagggcatc tccaccggcc ccaaggagtc caagaagaag 2460 gtggagtcca agaccgagac cgaccccgag taa 2493 <210> 32 <211> 1445 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Polipéptido Quimérico <400> 32 Met Pro lie Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser 1 5 10 15 Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val lie Glu Glu Lys Ala Phe 20 25 30 Ser Pro Glu Val lie Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn lie Val Gly Gly His Gln Ala 50 55 60 Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr lie Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp 65 70 75 80 Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro lie Pro Pro Gly Gln Met 85 90 95 Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp lie Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln 100 105 110 Glu Gln lie Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro lie Pro Val Gly Asp 115 120 125 lie Tyr Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys lie Val Arg Met 130 135 140 Tyr Ser Pro Val Ser lie Leu Asp lie Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro 145 150 155 160 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Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser lie Val Gly Trp Pro Glu Val 995 1000 1005 Arg Glu Arg lie Arg Gln Thr Pro Thr Ala Ala Arg Glu Arg Thr Arg 1010 1015 1020 Gln Ala Pro Thr Ala Ala Lys Val Gly Ala Val Ser Gln Asp Leu Asp 1025 1030 1035 1040 Lys His Gly Ala Val Ser Ser Asn Val Asn His Pro Ser Cys Ala Trp 1045 1050 1055 Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Glu Leu Leu Asp 1060 1065 1070 Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Asp lie Asn Leu Pro Gly Lys 1075 1080 1085 Trp Lys Pro Lys Met lie Gly Gly lie Gly Gly Leu lie Lys Val Lys 1090 1095 1100 Gln Tyr Asp Gln lie Leu lie Glu lie Cys Gly Lys Lys Ala lie Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn lie lie Gly Arg Asn Met 1125 1130 1135 Leu Thr Gln lie Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro lie Ser Pro lie Glu 1140 1145 1150 Thr Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys 1155 1160 1165 Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys lie Lys Ala Leu Thr Glu lie Cys 1170 1175 1180 Ala Asp Met Glu Lys Glu Gly Lys lie Ser Lys lie Gly Pro Glu Asn 1185 1190 1195 1200 Pro Tyr Asn Thr Pro lie Phe Ala lie Lys Lys Lys Gln Ser Thr Lys 1205 1210 1215 Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp 1220 1225 1230 Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly lie Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys 1235 1240 1245 Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val 1250 1255 1260 Pro Leu Asp Glu Ser Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr lie Pro Ser 1265 1270 1275 1280 Thr Asn Asn Glu Thr Pro Gly Val Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro 1285 1290 1295 Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro lie Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys lie 1300 1305 1310 Leu Glu Pro Phe Arg Ser Lys Asn Pro Asp lie Val lie Tyr Gln Tyr 1315 1320 1325 Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu lie Gly Gln His Arg 1330 1335 1340 Thr Lys lie Glu Glu Leu Arg Ala His Leu Leu Ser Trp Gly Phe lie 1345 1350 1355 1360 Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly 1365 1370 1375 Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro lie Glu Leu Pro 1380 1385 1390 Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp lie Gln Lys Leu Val Gly Lys 1395 1400 1405 Leu Asn Trp Ala Ser Gln lie Tyr Ala Cys Thr Pro Tyr Asp lie Asn 1410 1415 1420 Gln Met Leu Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr lie Pro Asn Pro 1425 1430 1435 1440 Leu Leu Gly Leu Asp 1445 <210> 33 <211> 4350 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Polinucleótido Quimérico <400> 33 cccgccgcca ccatgcccat cgtgcagaac gcccagggcc agatgcacca ggccctgtcc 60 ccccgcaccc tgaacgcctg ggtgaaggtg atcgaggaga aggccttctc ccccgaggtg 120 atccccatgt tctccgccct gtccgagggc gccacccccc aggacctgaa catgatgctg 180 aacatcgtgg gcggccacca ggccgccatg cagatgctga aggacaccat caacgaggag 240 gccgccgagt gggaccgcct gcaccccgtg cacgccggcc ccatcccccc cggccagatg 300 cgcgagcccc gcggatccga catcgccggc accacctcca ccctgcagga gcagatcggc 360 tggatgacct ccaacccccc catccccgtg ggcgacatct acaagcgctg gatcatcctg 420 ggcctgaaca agatcgtgcg catgtactcc cccgtgtcca tcctggacat ccgccagggc 480 cccaaggagc ccttccgcga ctacgtggac cgcttcttca agaccctgcg cgccgagcag 540 gccacccagg aggtgaagaa ctggatgacc gagaccctgc tggtgcagaa cgccaacccc 600 gactgcaagt ccatcctgcg cgccctgggc cccggcgcca ccctggagga gatgatgacc 660 gcctgccagg gcgtgggcgg ccccggccac aaggcccgcg tgctgggtac cggcgccegc 720 gcctccgtgc tgtccggcgg caagctggac gcctgggaga agatccgcct gcgccccggc 780 ggcaagaaga agtaccgcct gaagcacctg gtgtgggcct cccgcgagct ggagcgcttc 840 gccctgaacc cctccctgct ggagaccgcc gagggctgcc agcagatcat ggagcagctg 900 cagtccgccc tgaagacctc cgaggagctg aagtccctgt tcaacaccgt ggccaccctg 960 tactgcgtgc accagcgcat cgacgtgaag gacaccaagg aggccctgga caagatcgag 1020 gagatccaga acaagtccaa gcagaagacc cagcaggccg ccgccgacac ccagtcctcc 1080 tccaaggtgt cccagaacta cgccctgaag caccgcgcct acgagctgga attcggcatc 1140 aaggtgaagc agctgtgcaa gctgctgcgc ggcgccaagg ccctgaccga catcgtgacc 1200 ctgaccgagg aggccgagct ggagctggcc gagaaccgcg agatcctgaa ggaccccgtg 1260 cacggcgtgt actacgaccc ctccaaggac ctgatcgccg agatccagaa gcagggccag 1320 gaccagtgga cctaccaaat ctaccaggag cccttcaaga acctgaagac cggcaagtac 1380 gcccgcaagc gctccgccca gaccaacgac gtgaagcagc tggccgaggt ggtgcagaag 1440 gtggtgatgg agtccatcgt gatctggggc aagaccccca agttccgcct gcccatccag 1500 aaggagacct gggagacctg gtggatggac tactggcagg ccacctggat tcccgagtgg 1560 gagttcgtga acaccccacc cctggtgaag ctgtggtatc agctggagaa ggaccccatc 1620 gccggcgccg agaccttcta cgtggacggc gccgccaacc gcgagaccaa gctgggcaag 1680 gccggctacg tgaccgaccg gggccgccag aaggtggtgt ccctgaccga gaccaccaac 1740 cagaagaccg agctgcacgt catccacctg gccctgcagg actccggctc cgaggtgaac 1800 atcgtgaccg actcccagta cgccctgggc atcatccagg cccagcccga cagatctgac 1860 cccgtggacc ccaacctgga gccctggaac caccccggct cccagcccac cacccccggc 1920 tccaagtgct actgcaaggt gtgctgctac cactgccccg tgtgcttcct gaacaagggc 1980 ctgggcatct cctacggccg caagaagcgc cgccagcgcc gcggcacccc ccagtccaac 2040 aaggaccacc agaaccccat ccccaagcag cccatccccc agacccaggg catctccacc 2100 ggccccaagg agtccaagaa gaaggtggag tccaagaccg agaccgaccc cgaggacgcc 2160 ggccgctccg gcaactccga cgaggagctg ctgaaggcca tccgcatcat caagatcctg 2220 taccagtcca acccctaccc caagcccaag ggctcccgcc aggcccgcaa gaaccgccgc 2280 cgccgctggc gcgccggcca gcgccagatc gactccctgt ccgagcgcat cctgtccacc 2340 tgcctgggcc gccccgccga gcccgtgccc ctgcagctgc cccccctgga gctggactgc 2400 tccgaggact gcggcacctc cggcacccag cagtcccagg gcgccgagac cggcgtgggc 2460 cgcccccagg tgtccgtgga gtcctccgcc gtgctgggct ccggcaccaa ggagggtacc 2520 gtgcgccccc aggtgcccct gcgccccatg acctacaagg ccgccttcga cctgtccttc 2580 tttctgaagg agaagggcgg cctggacggc ctgatctact ccaagaagcg ccaggagatc 2640 ctggacctgt gggtgtacca cacccagggc tacttccccg actggcagaa ctacaccccc 2700 ggccccggca tccgctaccc cctgaccttc ggctggtgct tcaagctggt gcccgtggac 2760 cccgacgagg tggaggaggc caccggcggc gagaacaact ccctgctgca ccccatctgc 2820 cagcacggca tggacgacga ggagaaggag accctgcgct ggaagttcga ctcctccctg 2880 gccctgaagc accgcgcccg cgaactccac cccgagtcct acaaggactg cccccagatc 2940 accctgtggc agcgccccct ggtgaccaag atcggcggcc agaagacgcg tggcggcaag 3000 tggtccaagt cctccatcgt gggctggccc gaggtgcgcg agcgcatccg ccagaccccc 3060 accgccgccc gcgagcgcac ccgccaggcc cccaccgccg ccaaggtggg cgccgtgtcc 3120 caggacctgg acaagcacgg cgccgtgtcc tccaacgtga accacccctc ctgcgcctgg 3180 ctggaggccc aggaagagga agaggtgggc ttccccgagc tcctggacac cggcgccgac 3240 gacaccgtgc tggaggacat caacctgccc ggcaagtgga agcccaagat gatcggcggc 3300 atcggcggct tgatcaaggt gaagcagtac gaccagatcc tgatcgaaat ctgcggcaag 3360 aaggccatcg gcaccgtgct ggtgggcccc acccccgtga acatcatcgg ccgcaacatg 3420 ctgacccaga tcggctgcac cctgaacttc cccatctccc ccatcgagac cgtgcccgtg 3480 aagctgaagc ccggcatgga cggccccaag gtgaagcagt ggcccctgac cgaggagaag 3540 atcaaggccc tgaccgaaat ctgcgccgac atggagaagg agggcaagat cagtaagatc 3600 ggccccgaga acccctacaa cacccccatc ttcgccatca agaagaagca gtccaccaag 3660 tggcgcaagc tggtggactt ccgcgagctg aacaagcgca cccaggactt ctgggaggtg 3720 cagctgggca tcccccaccc cgccggcctg aagaagaaaa agtccgtgac cgtgctggac 3780 gtgggcgacg cctacttctc cgtgcccctg gacgagtcct tccgcaagta caccgccttc 3840 accatcccct ccaccaacaa cgagaccccc ggcgtgcgct accagtacaa cgtgctgccc 3900 cagggctgga agggatcccc catcttccag tcctccatga ccaagatcct ggagcccttc 3960 cgctccaaga accccgacat cgtgatctac cagtacatgg acgacctgta cgtgggctcc 4020 gacctggaga tcggccagca ccgcaccaag atcgaggagc tgcgcgccca cctgctgtcc 4080 tggggcttca tcacccccga caagaagcac cagaaggagc cccccttcct gtggatgggc 4140 tacgagctgc accccgacaa gtggaccgtg cagcccatcg agctgcccga gaaggactcc 4200 tggaccgtga acgacatcca gaagctggtg ggcaagctga actgggcctc ccaaatctac 4260 gcctgcaccc cctacgacat caaccagatg ctgcgcggcc ccggccgcgc cttcgtgacc 4320 atccccaacc ccctgctggg cctggactag 4350

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 5 1.- Un inmunógeno en forma estéril adecuado para administración a un sujeto humano, el inmunógeno comprendiendo: al menos una porción de la proteína gag de VIH, dicha proteína gag siendo a partir de una ciada de VIH o teniendo una secuencia consenso para una o más ciadas de VIH, y comprendiendo al menos parte de p17 y p24; y un polipéptido 10 sintético que comprende una pluralidad de secuencia de aminoácidos, cada secuencia comprendiendo un epítope CTL de humano de una proteína VIH, y en donde una pluralidad de proteínas VIH están representadas en el polipéptido sintético, dichos epítopes CTL siendo seleccionados para estimular una respuesta inmune a una o más ciadas de VIH de interés. ^, 15 2.- El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha última porción de la proteína gag y el polipéptido sintético están representados como una proteína de fusión. 3. - El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el 55-95% de la secuencia de aminoácidos de 20 la proteína gag está presente en la porción de gag. 4. - El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque el 65- 85% de la secuencia de aminoácidos de la proteína gag está presente la porción de gag. 5. - El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de lás reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha al menos parte de p17 esta modificada para prevenir la miristilación N- terminal. 6. - El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las 5 reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque al menos parte de los epítopes CTL de humano presentes en el polipéptido sintético se sobreponen. 7. - El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque al menos 50% de los epítopes CTL de humano 10 presentes en el polipéptido sintético se sobreponen. 8. - El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque al menos parte de los epítopes CTL de humano presentes en el polipéptido sintético son adyacentes. ^ 15 9.- El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque al menos parte de los epítopes CTL de humano están separados por una secuencia de aminoácidos no epitópica. 10 - El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las 20 reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque comprende al menos un epítope el cual es reconocido por uno o más mamíferos prueba de laboratorio. 11. - El ¡nmunógeno de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha epítope reconocido por uno o más mamíferos prueba de laboratorio es un epítope CTL. 12. - El ¡nmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido sintético comprende al menos 10 de los epítopes CTL de humano identificados en SEQ ID NOS: 1 a 25. 13. - El ¡nmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido sintético comprende al menos 15 de los epítopes CTL de humano identificados en SEQ ID NOS: 1 a 25. 14. - El ¡nmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido sintético comprende al menos 20 de los epítopes CTL de humano identificados en SEQ ID NOS: 1 a 25. 15. - El ¡nmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido sintético comprende al menos 23 de los epítopes CTL de humano identificados en SEQ ID NOS: 1 a 25. 16.- Un ¡nmunógeno VIH para un sujeto humano que comprende al menos una porción de una proteína gag, dicha proteína gag siendo a partir de una ciada de VIH de interés o que tiene una secuencia consenso de una ciada de VIH de interés, y en donde dicha porción comprende al menos partes 20.- El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dicha ciada de interés se selecciona a partir el grupo que consiste de ciada A, B, C, D, E, F, G, y H de VIH. 5 21.- El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha ciada de interés es ciada A de VIH. 22. - El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 20, ^ caracterizado además porque dicha ciada de interés es ciada B de VIH. 23. - El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 20, 10 caracterizado además porque dicha ciada de interés es ciada C de VIH. 24. - El inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque dichos epítopes CTL de humano incluyen al menos un epítope a partir de cada una de las « proteínas de VIH nef, p24, p17, pol, gp41 y gp120. *c 15 25.- El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dichos epítopes de CTL de humano incluyen al menos un epítope a partir de cada una de las proteínas de VIH nef, p24, p17, pol, gp41, gp120, tat, y rev. 26.- El inmunógeno de conformidad con la reivindicación 24, 20 caracterizado además porque dichos epítopes CTL de humano incluyen al menos un epítope a partir de cada una de las proteínas de VIH nef, p24, p17, pol, gp41 , gp120, tat, rev, ypr, vpu y vif. 27. - Una molécula dé ácido nucleico que codifica un inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes. 28. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el inmunógeno se codifica como una proteína de fusión. 29. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizada además porque comprende la secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO: 27. 30. - Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 27, 28 ó 29. 31. - El vector particular de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende un inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-26. 32. -EI uso de un inmunógeno como se reclama en cualesquiera de la reivindicaciones 1-26 y/o una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 27-29, y/o una partícula modificada de vacuna de virus Ankara (MVA) que codifica y/o contiene un inmunógeno como se reclama en la reivindicaciones 1-26, en la preparación de un medicamento para evitar o tratar infección de HIV o para estimular una respuesta autoinmune anti-HIV en un sujeto humano. 33 - El uso como se reclama en la reivindicación 32, en donde la molécula de ácido nucléico es administrable una o más veces en una cantidad suficiente para iniciar una respuesta inmune a dicho inmunógeno, y la MVA es . JL administrable una o más veces en una cantidad suficiente para incrementar una respuesta inmune a pociones comunes de dichos inmunógenos. 34. - Una bacteria que comprende un inmunógeno de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-26, o que comprende 5 una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 27- 29. 35. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 34, « caracterizada además porque es un patógeno atenuado adecuado para administración a un sujeto humano. 10 36.- Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 32. 37.- Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos mostrada en A SEQ ID NO. 32. j 15 38.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizada además porque comprende la secuencia nucleotídica mostrada en SEQ ID NO. 33. 39.- Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 32. 20 40.- Un polipéptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 32. 41. - Un vector particulado que comprende la secuencia de ácido nucleicos de conformidad con la reivindicación 36 ó 37 y/o el polipéptido de conformidad con la reivindicación 39 o 40. 42. - El uso de una molécula de ácido nucleico como se reclama 5 en la reivindicación 36 ó 37 y/o un polipéptido de conformidad con la reivindicación 39 ó 40, en la preparación de un medicamento para evitar o tratar infección de HIV o para estimular una respuesta inmune anti-HIV en un sujeto humano.. ?