DE69231705T2

DE69231705T2 - Gag-Env Fusion-Antigen aus HIV

Info

Publication number: DE69231705T2
Application number: DE69231705T
Authority: DE
Inventors: Atsuo Nakata; Atsushi Saito; Hideo Sinagawa
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 2001-10-18
Anticipated expiration: 2012-12-03
Also published as: DE69231705D1; BR9204851A; KR940000117A; EP0572737A2; EP0572737B1; US5834267A; ATE199394T1; KR0143977B1; CN1079509A; CA2084386C; EP0572737A3; US5576421A; CA2084386A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein HIV-Antigen (HIV = human immunodeficiency virus; humanes Immunschwächevirus). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein im wesentlichen reines HIV-Antigen, das ein HIV- Gag-Env-Fusionsprotein enthält, das aus einer speziellen Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus einer speziellen Env-Sequenz verschmolzen ist, wobei das Antigen nicht nur eine ausgezeichnete HIV- Antigenität aufweist, sondern auch in einer Menge erhalten werden kann, die bisher noch nicht erreicht wurde, und sie betrifft auch ein Verfahren zu dessen Herstellung. Das HIV-Antigen der vorliegenden Erfindung ist als Wirkstoff für ein Diagnosereagens, einen Impfstoff, ein Antikörperpräparat und ein therapeutisches Mittel gegen AIDS (acquired immune deficiency syndrome) geeignet.

Diskussion des Standes der Technik

Wie in der Technik wohlbekannt ist, ist die Anzahl der AIDS-Patienten in einer geometrischen Folge gestiegen, seit 1981 über den ersten AIDS-Patienten berichtet wurde. Im April 1992 betrug die Gesamtzahl der AIDS-Patienten bereits etwa 500 000. Obwohl in der ganzen Welt ausgedehnte und intensive Forschungen über die Prävention und medizinische Behandlung der Krankheit erfolgten, sind keine unfehlbaren präventiven und therapeutischen Verfahren in praktischer Anwendung. Die globale Ausbreitung von AIDS ohne jegliche unfehlbaren präventiven und therapeutischen Verfahren ist heute ein Problem, das die gesamte Welt erschüttert. Andererseits wurde das AIDS-Virus 1983 zum ersten Mal isoliert und identifiziert, und seit damals wurde die AIDS-Forschung in ihren grundlegenden wie auch klinischen Aspekten auf dem Gebiet der Virologie aktiv (siehe Nature, 326, 435-436, 1987). Als Ergebnis wurden bei der Diagnose von AIDS bemerkenswerte Fortschritte gemacht, und immundiagnostische Reagentien zur Verwendung bei der Diagnose sowie Verfahren zu deren Herstellung werden rasch verbessert. AIDS-Viren wurden aus Menschen, Affen und Katzen isoliert. Von diesen wird das aus Menschen isolierte Virus als "human immunodeficiency virus" (humanes Immunschwächevirus; HIV) bezeichnet. HIV wird grob in HIV-1 und HIV-2 eingeteilt. HIV-1 breitet sich weltweit aus, d. h. in den USA, Europa, Zentralafrika und zahlreichen anderen Ländern der Erde, während sich HIV-2 hauptsächlich nur in Westafrika ausbreitet. HIV ist ein sphärisches Virus mit einem Durchmesser von 100 bis 140 nm, das eine Virusmembran (Env) aufweist (komplexes Virus). Die Env besteht aus einem Transmembranprotein (gp41) und 70 bis 80 Peplomeren (gp120), die stäbchenförmige Ausstülpungen bilden, welche jeweils einen Durchmesser von 15 nm und eine Höhe von etwa 9 nm haben und die sich in der Oberfläche des Viruspartikels befinden. Im Nucleocapsid des Viruspartikels bilden zwei einzelsträngige RNA-Moleküle des viralen Genoms einen Komplex mit Reverser Transcriptase und Strukturproteinen als virale Kernstruktur, in der sich Primer-tRNA befindet. Das virale Genom hat eine Länge von mehr als 9 kb und besteht aus etwa 10 verschiedenen Genen. Im wesentlichen besteht das virale Genom aus den folgenden drei Hauptgenen, die für die viralen Komponenten codieren, welche für die Vermehrung des Virus wesentlich sind:
(1) gag-Gen (gag = gruppenspezifisches Antigen), das für p55 codiert, bei dem es sich um ein Vorläuferprotein von drei Typen von Strukturproteinen p17, p24 und p15 des viralen Nucleocapsids handelt;
(2) pol-Gen (pol = Polymerase), das für einen Vorläufer von drei verschiedenen Enzymen codiert, und zwar Protease, Reverse Transcriptase und Integrase; sowie
(3) env-Gen (env = Virusmembran), das für gp160 codiert, bei dem es sich um einen Vorläufer von zwei Typen von Glycoproteinen handelt, gp120 und gp41, die die Virusmembran bilden.
Diese Gene sind in der Reihenfolge gag·pol...env in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende des viralen Genoms angeordnet.
Die übrigen ungefähr sieben anderen Gene, sogenannte Hilfsgene, spielen vermutlich eine Rolle bei der Steuerung der Infektion, der Vermehrung, der Reifung des HIV und der Entwicklung der Krankheit.
Verschiedene HIV-Antigene und Enzyme, die wesentlich für die Grundlagenstudien über AIDS und für die Entwicklung und Erzeugung therapeutischer Mittel, von Diagnostika und Impfstoffen sind, können durch Kultivieren von HIV erzeugt werden. Bei der Kultivierung von HIV besteht jedoch die Gefahr einer fatalen biologischen Gefährdung. Daher wurden verschiedene Studien durchgeführt und Versuche gemacht, um eine Technik für die Herstellung solcher Antigene und Enzyme in großer Menge ohne Kultivierung von HIV zu entwickeln. Zum Beispiel wurden in Bezug auf die Gene gag und pol verschiedene HIV-Antigene und -Enzyme, wie die Gag-Proteine p17, p24 und p15 (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-117289) und Produkte des pol-Gens, z. B. Protease, Reverse Transcriptase und Integrase (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 2- 265481), erfolgreich in hoher Ausbeute hergestellt, und zwar durch eine Technik, die in der Lage ist, die Gene in E. coli zu exprimieren und das erzeugte Protein zu prozessieren, und einige der Antigene und Enzyme wurden einer praktischen Verwendung zugeführt.
Andererseits ist in Bezug auf die Expression des env-Gens von HIV die hocheffiziente Expression des env-Gens allein äußerst schwierig im Vergleich zu den Genen gag und pol, obwohl der Grund dafür noch nicht geklärt wurde. Daher wird das env-Gen von HIV in vielen Fällen in chimärischer Form mit einem Fremd-Gen exprimiert, wodurch das Env-Peptid als Protein entsteht, bei dem das Env-Peptid mit einem Fremd-Peptid fusioniert ist. Es ist zum Beispiel bekannt, das env-Gen in chimärischer Form mit einem Poliovirus-Gen zu exprimieren, so dass ein Fusionsprotein entsteht, bei dem das Env-Peptid mit einem Poliovirus- Antigenpeptid fusioniert ist (siehe Journal of Virology, 65, 2875-2883, 1991). Es ist auch bekannt, das env-Gen in chimärischer Form mit einem gag-Gen mittels des E.-coli-Expressionsplasmids pEV-vrfzu exprimieren, so dass ein Gag-Env- Fusionsprotein entsteht, bei dem das Env-Peptid mit dem Gag-Peptid fusioniert ist (Analytical Biochemistry, 161, 370-379, 1987). In diesen Fällen ist ein Peptid, das von einem Fremd-Gen oder einem Struktur-Gen codiert wird, welches sich in einem Expressionsplasmid stromabwärts eines Promotors befindet, an seinem C- Terminus mit dem Env-Peptid fusioniert. Wenn das Env-Peptid mit einem Fremd- Peptid fusioniert ist, weist das Env-Peptid bei einer Reaktion mit Testserum meistens keine Spezifität auf. Daher ist das Env-Peptid, das mit einem Fremd- Peptid fusioniert ist, hinsichtlich Qualität und Zuverlässigkeit zur Verwendung als HIV-Antigen schlechter als ein reines HIV-Antigen. Weiterhin zeigt das Env- Peptid, das mit einem Fremd-Peptid fusioniert ist, keine gute Produktionsausbeute.
Es ist vorstellbar, ein Fusionsprotein an der Verbindungsstelle des Env-Peptids und eines Fremd-Peptids zu spalten, um das Fremd-Peptid zu entfernen. Mit diesem Verfahren ist es jedoch nicht möglich, das gewünschte Env-Peptid in einer fremdpeptidfreien, reinen Form in hoher Ausbeute und kostengünstig zu erhalten.
Andererseits ist es auch bekannt, das Env-Peptid als Gag-Env-Fusionsprotein zu exprimieren, das aus einem Gag-Peptid besteht, das mit dem Env-Peptid fusioniert ist (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 1-179687; Virology, 180, 811-813, 1991; Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 307 149; und Analytical Biochemistry, 161, 370-379, 1987). Die Ausbeute des herkömmlichen Gag-Env-Fusionsproteins ist jedoch meistens schlecht, so dass die Produktionskosten hoch sind. Weiterhin hat ein solches Gag-Env-Fusionsprotein meistens eine schlechte Antigenität, so dass seine Zuverlässigkeit als HIV- Antigen gering ist.
Die herkömmlichen HIV-Antigene sind also insofern von Nachteil, als sie eine schlechte Qualität, Zuverlässigkeit und Produktivität haben. Daher besteht unter praktischen und kommerziellen Gesichtspunkten ein großer Wunsch nach einem rteuen HIV-Antigen, das diese Probleme nicht aufweist, und die Entwicklung eines solchen neuen HIV-Antigens ist in der Technik eine Aufgabe von hoher Dringlichkeit.
Wie bereits erwähnt, wird das Env-Peptid herkömmlicherweise in einer relativ großen Menge als Fusionsprotein hergestellt, bei dem das Env-Peptid mit einem Fremd-Peptid fusioniert ist, aber das herkömmlicherweise erhaltene Env-Peptid als Fusionsprotein weist in einer Antigen-Antikörper-Reaktion meistens keine Spezifität auf, so dass das Fusionsprotein hinsichtlich Qualität und Zuverlässigkeit zur Verwendung als HIV-Antigen unbefriedigend ist. Ein solches Fusionsprotein ist für die praktische Diagnose von AIDS ungeeignet. Es sei weiterhin darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung durch Überwindung des schweren Problems des Standes der Technik erreicht wurde, dass selbst dann, wenn das gag-Gen und das env-Gen miteinander fusioniert sind und mit herkömmlichen gentechnischen Methoden exprimiert werden, kein Gag-Env-Fusionsprotein, das als HIV-Antigen in hohem Maße zuverlässig wäre, in hoher Ausbeute hergestellt werden kann.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfinder haben ausgedehnte und intensive Untersuchungen durchgeführt, um die oben genannten Probleme zu lösen, indem sie ein neues HIV-Antigen entwickelten. Als Ergebnis ist es den Erfindern gelungen, ein neues HIV-Antigen zu entwickeln, das eine ausgezeichnete Qualität, Zuverlässigkeit und Produktivität aufweist und somit unter praktischen und kommerziellen Gesichtspunkten äußerst vorteilhaft ist. Insbesondere haben die Erfinder unerwarteterweise herausgefunden, dass ein spezielles, im wesentlichen reines HIV-Antigen, das ein Gag-Env-Fusionsprotein umfasst (wobei das Gag-Env-Fusionsprotein aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus eines Env-Peptids fusioniert ist, wobei das Fusionsprotein eine Sequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gag(308-406) und Env(512-611) bzw. Gag(121-406) und Env(512-611), wie sie hier definiert sind, besteht), nicht nur eine ausgezeichnete Antigenität aufweist, sondern auch in einer Ausbeute erzeugt werden kann, die so hoch ist, wie sie herkömmlicherweise nicht erreicht werden konnte.
Weiterhin haben die Erfinder bei dem Vorgang des Entwerfens des oben genannten HIV-Antigens der vorliegenden Erfindung, das ein spezielles Gag-Env- Fusionsprotein enthält, unerwarteterweise gefunden, dass als HIV-Antigen das Gag-Protein, das man durch Exprimieren des gag-Gens erhält, das für die gesamte Aminosäuresequenz des Gag-Proteins als unreifes Protein codiert, insofern vorteilhaft ist, als es nicht nur ein breites Spektrum der Reaktivität gegenüber HIV-Antikörpern zeigt, sondern auch in Antigen-Antikörper-Reaktionen eine starke Reaktivität aufweist, im Vergleich zu den Gag-Proteinen, p17, p24 und p15, bei denen es sich um reife Proteine handelt und die herkömmlicherweise als geeignete Antigene zur Verwendung bei der Diagnose von AIGS bekannt sind.
Auf der Grundlage dieser neuen Ergebnisse wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Die obigen sowie weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen in Verbindung mit den Begleitzeichnungen hervorgehen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

In den Begleitzeichnungen gilt:

Die Fig. 1-(1) bis 1-(2) zeigen die gesamte Aminosäuresequenz des Gag- Proteins, das in dem gesamten Bereich des gag-Gens codiert ist, das im Plasmid pNL4-3 enthalten ist, welches das gesamte HIV-1-Genom enthält; und
die Fig. 2-(1) bis 2-(3) zeigen die gesamte Aminosäuresequenz des Env- Proteins, das in dem gesamten Bereich des env-Gens codiert ist, das im Plasmid pNL4-3 enthalten ist, welches das gesamte HIV-1-Genom enthält.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein im wesentlichen reines HIV-Antigen bereitgestellt, das ein Gag-Env-Fusionsprotein enthält, wobei das Gag-Env-Fusionsprotein aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C- Terminus mit dem N-Terminus eines Env-Peptids verschmolzen ist.
In dem HIV-Antigen der vorliegenden Erfindung hat das Fusionsprotein eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gag(308-406) und Env(512-611) bzw. Gag(121-406) und Env(512-611) besteht, wobei sich die Zahlen für Gag auf Aminosäurereste in der in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigten Aminosäuresequenz des Gag-Proteins beziehen und sich die Zahlen für Env auf Aminosäurereste in der in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigten Aminosäuresequenz des Env-Proteins beziehen.
In der vorliegenden Erfindung sind der Bereich der Aminosäuresequenz jedes der verschiedenen Gag-Peptide und der Bereich der Aminosäuresequenz jedes der verschiedenen Env-Peptide in Klammern angegeben, wie oben erwähnt wurde. In Bezug auf das Gag-Peptid ist jede der in den Klammern angegebenen Zahlen die Aminosäurepositionsnummer in der gesamten Aminosäuresequenz des Gag- Proteins von HIV, die in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigt ist, und in Bezug auf das Env-Peptid ist jede der in den Klammern angegebenen Zahlen die Aminosäurepositionsnummer in der gesamten Aminosäuresequenz des Env-Proteins von HIV, die in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigt ist.
Wenn nichts anderes angegeben ist, bedeuten in der vorliegenden Erfindung das linke Ende bzw. das rechte Ende der Aminosäuresequenz eines Peptids oder Proteins den N-Terminus bzw. den C-Terminus. In der Aminosäuresequenz bedeutet Asp einen Asparaginsäurerest, Glu bedeutet einen Glutaminsäurerest, Lys bedeutet einen Lysinrest, Arg bedeutet einen Argininrest, His bedeutet einen Histidinrest, Asn bedeutet einen Asparaginrest, Gln bedeutet einen Glutaminrest, Ser bedeutet einen Serinrest, Thr bedeutet einen Threoninrest, Tyr bedeutet einen Tyrosinrest, Cys bedeutet einen Cysteinrest, Trp bedeutet einen Tryptophanrest, Phe bedeutet einen Phenylalaninrest, Gly bedeutet einen Glycinrest, Ala bedeutet einen Alaninrest, Val bedeutet einen Valinrest, Leu bedeutet einen Leucinrest, Ile bedeutet einen Isoleucinrest, Pro bedeutet einen Prolinrest, und Met bedeutet einen Methioninrest.
Im HIV-Antigen der vorliegenden Erfindung, das das oben definierte Gag-Env- Fusionsprotein enthält, ist der Anteil des Env-Peptids die durch Env (512-611) dargestellte Aminosäuresequenz.
In der vorliegenden Erfindung besteht das Gag-Peptid des Gag-Env-Fusionsproteins aus einem Gag-Peptid, das eine durch Gag (308-406) oder Gag (121- 406) dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
Das Gag-Env-Fusionsprotein des HIV-Antigens der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung gentechnischer Methoden nach einem Verfahren hergestellt werden, das folgendes umfasst: das Ligasieren eines env-Gens, das für das oben genannte spezielle Env-Peptid codiert, welches wenigstens ein Epitop eines HIV- Antigens enthält, mit einem gag-Gen, das für das oben genannte spezielle Gag- Peptid codiert, stromabwärts des gag-Gens, so dass man ein rekombinantes DNA-Molekül erhält, das ein gag-env-Fusionsgen umfasst, und das Exprimieren des gag-env-Fusionsgens. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde durch die Expression des oben genannten speziellen gag-env-Fusionsgens zum ersten Mal ein neues HIV-Antigen erzeugt, das eine ausgezeichnete Antigenität aufweist und daher zum Nachweis von HIV-Antikörpern mit äußerst hoher Genauigkeit geeignet ist. Das HIV-Antigen der vorliegenden Erfindung ist auch insofern von Vorteil, als das Antigen in einer so hohen Ausbeute erhalten werden kann, wie sie herkömmlicherweise nicht erreichbar war.
Das Gag-Env-Fusionsprotein des HIV-Antigens der vorliegenden Erfindung reagiert mit allen Seren der getesteten HIV-Träger, und daher ist das Gag-Env- Fusionsprotein des HIV-Antigens der vorliegenden Erfindung nicht nur als Antigen für die Herstellung eines Diagnosereagens, sondern auch als aktiver Bestandteil für einen HIV-Impfstoff äußerst nützlich.
Wie bereits erwähnt, wurde über die Eignung verschiedener Typen partieller Peptide des Gag-Proteins berichtet (siehe zum Beispiel die Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-117289). Über die Eignung des gesamten Gag-Proteins (p55), d. h., von dessen gesamter Aminosäuresequenz, wurde jedoch noch nicht berichtet. Der Grund dafür, dass über die Eignung des Gag-Proteins p55 noch nicht berichtet wurde, liegt darin, dass p55 ein äußerst instabiles unreifes Protein ist, das im Laufe der Bildung von HIV-Teilchen gebildet wird und gewöhnlich sofort eine Prozessierung erfährt, so dass es sich in die reifen Proteine p17, p24 und p15 differenziert. Herkömmlicherweise war es völlig unvorstellbar, ein solches unreifes Protein als HIV-Antigen zu verwenden. Wie in Schritt 2 des später beschriebenen Beispiels 2 gezeigt wird, haben die Erfinder p55, p17, p24 und p15 durch DNA-Rekombinationstechniken erzeugt und Vergleiche zwischen p55, p17, p24 und p15 in Bezug auf ihre Reaktivität mit Antikörpern in von HIV- Trägern stammenden Seren angestellt. Als Ergebnis wurde überraschend gefunden, dass von diesen Proteinen p55 die größte Reaktivität gegenüber HIV- Antikörpern aufweist und dass die Mindestmenge an p55, die zum Nachweis von Antikörpern notwendig ist, kleiner ist als bei den oben genannten reifen Gag- Proteinen. Das heißt, das Gag-Protein p55 kann auch allein als effektives Antigen für die Diagnose von AIDS verwendet werden. Wenn das Gag-Protein p55 in Form eines Gemischs mit dem oben genannten Gag-Env-Fusionsprotein verwendet wird, ist weiterhin die Zuverlässigkeit der Reaktivität gegenüber HIV- Antikörpern erhöht.
Entsprechend wird in einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ein HIV- Antigen bereitgestellt, das ein Gemisch aus dem HIV-Antigen, das das oben genannte Gag-Env-Fusionsprotein enthält, und einem HIV-Gag-Protein umfasst, welches aus der durch Gag (1-500) dargestellten Aminosäuresequenz besteht, bei der es sich um die gesamte Aminosäuresequenz des Gag-Proteins handelt, die in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigt ist, wobei in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) jede der in Klammern angegebenen Zahlen die Aminosäurepositionsnummer ist.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher beschrieben. Im wesentlichen können die HIV-Antigene der vorliegenden Erfindung gemäß den folgenden Schemata I bis III hergestellt werden.

Schema I. Bestimmung eines Bereichs eines Env-Proteins, das Reaktivität gegenüber einem HIV-Antikörper aufweist:

Verschiedene env-Genfragmente werden einzeln mit einem stark exprimierten Gen, wie dem IacZ-Gen, stromabwärts desselben fusioniert, so dass verschiedene Bereiche des env-Gens einzeln in chimärischer Form mit z. B. dem IacZ-Gen exprimiert werden, so dass Env-Peptide als Fusionsproteine entstehen, die jeweils aus dem jeweiligen Env-Peptid und einem LacZ-Protein (β-Galactosidase) bestehen. Dann werden diese Expressionsprodukte einer immunologischen Reaktion mit einer großen Anzahl von Seren von AIDS-Patienten, asymptomatischen HIV-Trägern (AC) und Patienten mit dem AIDS-verwandten Komplex (ARC) unterzogen, wodurch der Epitopbereich des Env-Proteins identifiziert wird, wobei der Epitopbereich dadurch definiert ist, dass er eine starke spezifische Reaktivität gegenüber den Seren aufweist.

Schema II Herstellung eines Gaq-Env-Fusionsproteins in großer Menge und Bestätigung von dessen Reaktivität mit HIV-Antikörpern:

Mit verschiedenen env-Genfragmenten, die für die partiellen Env-Peptide codieren, welche Epitopbereiche enthalten, und die im obigen Schema I identifiziert wurden, und mit verschiedenen gag-Genfragmenten, die für Gag-Peptide codieren, wird das folgende Verfahren durchgeführt, um ein Gag-Env-Fusionsprotein zu identifizieren, das sowohl unter dem Gesichtspunkt einer Verbesserung der Produktivität (Ausbeute) als auch der Antigenität wünschenswert ist. Im einzelnen wird mit verschiedenen Kombinationen von env-Genfragmenten und gag-Genfragmenten ein env-Genfragment mit einem gag-Gen stromabwärts desselben fusioniert, und unter der Kontrolle eines Promotors wird das env-Gen in chimärischer Form mit dem gag-Gen exprimiert, so dass ein Env-Peptid als- Gag-Env-Fusionsprotein entsteht.
Von dem Gag-Env-Fusionsprotein, das in der größten Menge erzeugt wird, wird die Reaktivität des Gag-Env-Fusionsproteins gegenüber HIV-Antikörpern bestimmt.

Schema III. Bestätigung der Reaktivität des Gag-Proteins p55, das die gesamte Aminosäuresequenz eines Gag-Proteins aufweist:

In derselben Weise wie im obigen Schema II werden das Gag-Protein p55 und die Gag-Peptide p17, p24 und p15 erzeugt und einzeln einer immunologischen Reaktion mit Seren von HIV-Trägern unterzogen, und die Reaktivitäten von p55, p17, p24 und p15 gegenüber den Seren werden miteinander verglichen, wodurch bestätigt wird, dass p55 sowohl in bezug auf die Reaktivität als auch auf die HIV-Nachweisquote am aktivsten ist.
Im folgenden werden die Techniken beschrieben, die für die praktische Durchführung der oben genannten Schemata I bis III erforderlich sind.

(1) Herstellung von cDNA-Fragmenten, die das gag-Gen und/oder das env-Gen von HIV enthalten:

Jeweils der gesamte Bereich oder ein Fragment des gag-Gens und des env-Gens kann verwendet werden. Der gesamte Bereich oder das Fragment wird in einen Vektor für starke Expression eingefügt, so dass das Leseraster des Einschubs mit dem des Vektors übereinstimmt. Da das HIV-Genom aus RNA besteht, ist es bei der Durchführung der Genexpression unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken notwendig, die oben genannten HIV-Gene in komplementäre cDNA-Fragmente umzuwandeln. Die cDNA-Fragmente können aus dem Provirusgenom, das in ein Chromosom einer Wirtszelle integriert wird, oder aus einer klonierten extrachromosomalen zirkulären DNA hergestellt werden. Alternativ dazu können die cDNA-Fragmente auch durch Screening einer cDNA = Bibliothek erhalten werden, die mit einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendungvon Reverser Transcriptase aufgebaut wurde, wobei das aus HIV-Viruspartikeln extrahierte RNA-Genom als Matrize verwendet wird. Bei den oben genannten Verfahren zur Herstellung von cDNA-Fragmenten ist es jedoch notwendig, hochgefährliches HIV direkt zu handhaben. Unter dem Gesichtspunkt der Verhinderung einer biologischen Gefährdung ist es nicht vorzuziehen, HIV direkt zu handhaben. Um nicht nur die durch HIV verursachten Probleme der biologischen Gefährdung zu vermeiden, sondern auch Arbeit bei der Herstellung von cDNA- Fragmenten zu sparen, wird dementsprechend empfohlen, bekannte und etablierte cDNA-Klone von HIV-Genen zu verwenden. Über Operationen zum Untersuchen von HIV-Genen, wie Genklonierung, Herstellung einer Restriktionskarte und Bestimmung von Nucleotidsequenzen sind viele Berichte von Forschern auf der ganzen Welt erschienen. Um Sicherheit und Effizienz zu gewährleisten, ist es wünschenswert, die Ergebnisse dieser veröffentlichten Studien zu nutzen. Zum Beispiel können Plasmide wie pNL3-1, pNL3-2 und pNL4-3 verwendet werden, bei denen es sich allesamt um genomische Klone von HIV-1-Proviren handelt, die vom National Institute of Health, USA, erhältlich sind (wegen pNL3-1 und pNL3-2, siehe Journal of Virology, 59, 284-291, 1986; und wegen pNL4-3, siehe die GenBank-Datei HIVNL43). Weiterhin wurden unter Verwendung des Plasmids pNL4-3 Mikroorganismen hergestellt und hinterlegt, die verschiedene Plasmide enthalten, welche einen Teilbereich des HIV-1-Genoms tragen. Im einzelnen sind diese hinterlegten Mikroorganismen E. coli JM109/ pCV91, das das Plasmid pCV91 enthält, welches einen zentralen Bereich eines gag-pol-Fusionsgens aufweist (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP-3195), E. coli JM109/pNLH122, das das Plasmid pNLH122 enthält, welches die 5'-Hälfte eines gag-Gens aufweist (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP-3196), E. coli JM109/pTG581, das das Plasmid pTG581 enthält, welches den gesamten Bereich des gag-Gens aufweist (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP- 3927), E. coli JM109/pNS210, das das Plasmid pNS210 enthält, welches den gesamten Bereich des env-Gens aufweist (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP-3920), E, coli JM109/pTE192, das das Plasmid pTE192 enthält, welches eine cDNA aufweist, die für den Env(512-611)-Bereich des Env-Proteins codiert (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP- 3925), sowie 5 coli JM109/pGE33, das das Plasmid pGE33 enthält, welches eine cDNA aufweist, die für ein Gag-Env-Fusionsprotein codiert, das aus Gag(308- 406) und Env(512-611) besteht (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP-3923). Die Herstellung von cDNA-Fragmenten aus diesen Klonen kann nach herkömmlichen Verfahren erfolgen. Zum Beispiel wird ein gewünschtes DNA-Fragment mit Restriktionsenzymen aus den oben genannten Klonen herausgespalten und mit der Technik der Phenolextraktion, Chloroformbehandlung, Ethanolfällung oder dergleichen gereinigt. Die zur Spaltung der DNA zu verwendenden Restriktionsenzyme können auf der Grundlage der Restriktionskarten der einzelnen Klone in geeigneter Weise gewählt werden.

(2) Aufbau von Plasmiden für die Expression des gag-Gens, des env-Gens und des gag-env-Fusionsgens sowie die Herstellung von Transformanten, in die solche Plasmide eingeschleust wurden:

Das nach dem obigen Verfahren hergestellte HIV-Gen-cDNA-Fragment wird nach herkömmlichen Verfahren mit einem stark exprimierten Gen auf einem Plasmid oder einem Vektor für die direkte Expression eines klonierten Gens fusioniert, z. B. unter Verwendung von T4-DNA-Ligase, so dass ein HIV-Gen-Expressionsplasmid aufgebaut wird. In der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Plasmid" als bequeme Bezeichnung verwendet und bedeutet im wesentlichen ein Replikon, das das HIV-Gen exprimiert.
Entsprechend können für den Aufbau solcher Expressionsplasmide herkömmliche und kommerziell erhältliche Vektoren für die Expression eingesetzt werden.
Beispiele für geeignete Vektoren sind die Plasmidvektor-pSN508-Reihe aus der Familie der Enterobakterien (siehe US-Patent Nr. 4,703,005), der Plasmidvektor pJM105 aus Hefe (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 62-286930), die rlasmidvektor-pBH103-Reihe aus Hefe (siehe Japanische Offenlegurrg§schrift Nr. 63-22098), ein Vektor in Form eines attenuierten Varicella-Virus (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 53-41202), ein Vektor in Form eines attenuierten Virus der Marek-Krankheit (siehe Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 334 530), Plasmidvektoren aus Escherichia coli, wie die pUR290- Reihe einschließlich pUR290, 291 und 292 (siehe EMBO Journal, 2, 1791-1794, 1983), pSN5182 (siehe Journal of Bacteriology, 157, 909-917, 1984) sowie die pT7-Reihe (siehe Proceedings of the National Academy of Sciences USA 82, 1074-1078, 1985).
Beim Aufbau eines Expressionsvektors ist es wichtig, das obige Gen unter die Kontrolle eines starken Promotors einzusetzen und zu ligasieren und das Gen mit einem Gen zu fusionieren, das eine Expression in großer Menge gewährleistet. Wenn zum Beispiel der obige Vektor der pUR290-Reihe verwendet wird, wird das obige Gen vorzugsweise stromabwärts des IacZ-Gens damit fusioniert. Wenn pSN5182 verwendet wird, wird das Gen vorzugsweise stromabwärts des pstS- Gens fusioniert. Wenn pT7-7 der obigen pT7-Reihe verwendet wird, wird das Gen vorzugsweise in eine Multiklonierungsstelle stromabwärts des T7-Promotors einkloniert.
pT7-7 ist besonders gut für die Expression des gag-Gens, env-Gens und des gag-env-Fusionsgens von HIV geeignet, und sein T7-Promotor ist ein äußerst starker Promotor. Daher ist es in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, pT7-7 zu verwenden.
Bei der Insertion und Ligasierung des Gens ist es erforderlich, dass das mit einem Restriktionsenzym gespaltene Plasmid mit BAP (bakterieller Alkalischer Phosphatase) vorbehandelt wird, um eine Phosphatgruppe zu entfernen, wodurch seine Selbstligasierung verhindert wird, und dass das Leseraster des Gens auf dem Plasmid und das des eingesetzten Gens so angeordnet sind, dass sie miteinander übereinstimmen, um eine effiziente Translation zu gewährleisten. Das heißt, die Expression des HIV-Gens in großer Menge ist dadurch garantiert, dass man das HIV-Gen so in ein stark exprimiertes Gen einsetzt, dass das Leseraster des HIV-Gens mit dem des stark exprimierten Gens übereinstimmt. Die oben genannte Übereinstimmung der Leseraster kann mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Enzymen, wie Restriktionsenzymen, Nuclease Bal31 und Mungbohnen-Nuclease, erreicht werden.
Eine geeignete Wirtszelle, in die der oben aufgebaute Expressionsvektor eingeschleust werden soll, um eine Transformante zu erhalten, sollte aus empfindlichen Wirtszellen ausgewählt werden, die eine Replikation und Expression der Gene auf dem Expressionsvektor erlauben, und insbesondere aus Zellen, in die der aufgebaute Expressionsvektor leicht eingeschleust und in denen er leicht nachgewiesen werden kann. Wenn zum Beispiel der oben genannte Vektor der pSN-Reihe als Expressionsvektor verwendet wird, wird vorzugsweise der Escherichia-coli-Stamm C75 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugriffsnummer 10191) als Wirtsbakterium eingesetzt, da die durch Einschleusung des obigen Vektors erhaltene Transformante selektiert werden kann, indem man ihre Wirkstoffresistenz als Marker verwendet. Wenn Vektoren der pUR290-Reihe und der pT7-Reihe eingesetzt werden, werden folgende Wirte verwendet: Escherichia-coli-Stamm UT481 (siehe Journal of Bacteriology, 163(1), 376-384, 1985), Escherichia-coli-Stamm BL21 (DE3) (siehe Journal of Molecular Biology, 189(1), 113-130, 1986), Escherichia-coli- Stamm JM109 (DE3) (siehe Journal of Molecular Biology, 189(1), 113-130, 1986; und Gene, 33(1), 103-119, 1985) sowie Escherichia-cofi-Stamm JM103 (siehe Nucleic Acids Research, 9, 309-321, 1981). Diese werden vorzugsweise verwendet, da die durch die Einführung der Vektoren erhaltene Transformante unter Verwendung der Ampicillin-Resistenz als Marker selektiert werden kann.
Die Einschleusung eines Expressionsvektors in solche Wirtszellen, wie sie oben genannt sind, kann nach herkömmlichen Verfahren erfolgen, wie dem Verfahren, bei dem Kaliumchlorid verwendet wird (siehe Journal of Molecular Biology, 53, 154-162, 1970). Die Transformanten, in die ein Expressionsplasmid eingeschleust ist, das das gag-Gen, env-Gen oder das gag-env-Fusionsgen trägt, werden aus Kolonien genommen, die positiv auf den oben genannten Marker reagieren. Anschließend wird die DNA des Expressionsvektors aus den selektierten Transformantenkolonien extrahiert, mit einem Restriktionsenzym abgebaut und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um die Größe deseingesetzten DNA-Fragments zu bestimmen. Die Kolonie, in der die Anwesenheit des DNA-Fragments des Gens bestätigt wurde, wird als transformanter Klon für die Expression des HIV-Gens eingesetzt.

(3) Herstellung eines LacZ-(β-Galactosidase)-Env-Fusionsproteins in großer Menge:

Nach dem unter dem obigen Punkt (2) gezeigten Verfahren kann die Expression eines LacZ-Env-Fusionsproteins in großer Menge durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Expression von Fusionsproteinen in großer Menge erfolgen, indem man env-Genfragmente (in Tabelle 1 gezeigt), die für eine Vielzahl von Env-Peptiden codieren, welche unten unter Punkt (5) gezeigt sind, in pUR290, pUR291 oder pUR292 einkloniert. Beim LacZ-Env-Fusionsprotein ist es möglich, dass die β-Galactosidase (LacZ) mit Seren von einigen asymptomatischen HIV- Trägern und nicht infizierten Personen reagiert und dadurch eine falsche positive Reaktion zeigt. Wenn jedoch zum Beispiel Testseren nach herkömmlichen Verfahren so vorbehandelt werden, dass sie Anti-LacZ-Antikörper in den Seren mit LacZ-Protein voradsorbieren, oder die LacZ-Einheit des Fusionsproteins mit Anti-LacZ-Antikörpern maskiert wird, kann die oben genannte falsch positive Reaktion unterdrückt werden, so dass die Verwendung des LacZ-Env-Fusionsproteins als Antigen für die Diagnose von AIDS ermöglicht wird.

(4) Bestätigung der Expression des gag-Gens, env-Gens und des gag-env- Fusionsgens in transformanten Klonen:

Die Bestätigung der Genexpression durch transformante Klone, die oben unter Punkt (2) erhalten wurden, kann durch Analysieren eines Rohextrakts transformanter Klone nach einem herkömmlichen Verfahren erfolgen, wie Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) und Western-Blotting. Der Rohextrakt kann nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem die Bakterienzellen nach Kultivierung der Transformanten in einem herkömmlichen Medium durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit gesammelt und dann mit Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2-Mercaptoethanol behandelt werden; anschließend erfolgt eine Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit, um den Überstand aufzufangen. Der Überstand wird einer SDS-PAGE unterzogen, um ihn dadurch in Proteinbanden zu fraktionieren. Die fraktionierten Banden werden mit CBB (Coommassie- Brillant-Blau) angefärbt, um dadurch zu bestätigen, ob eine Expression in großer Menge erreicht wurde oder nicht. Wenn das Western-Blotting-Verfahren eingesetzt wird, kann die Bestätigung der Expression in großer Menge nach dem folgenden Verfahren gemäß herkömmlichen Methoden erfolgen, wobei man Materialien verwendet, die aus einer Vielzahl kommerziell erhältlicher Materialien ausgewählt sind: Der oben genannte Rohextrakt wird einer SDS-PAGE unterzogen. Die resultierenden fraktionierten Proteinbanden werden unter Verwendung einer Transblotting-Zelle auf eine Nitrocellulosemembran oder eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Die Membran wird in eine Gelatinelösung oder eine Magermilchlösung eingetaucht, wodurch die Membran blockiert wird. Wenn die Proben auf der zu untersuchenden Membran zum Beispiel Genexpressionsprodukte von HIV sind, werden sie danach einer Primärreaktion mit Serum von asymptomatischen HIV-Trägern unterzogen. Dann werden die Proben abgespült und danach weiterhin einer Sekundärreaktion mit einem Peroxidasekonjugierten Anti-Human-IgG-Antikörper unterzogen. Dann werden die Proben abgespült und danach gefärbt, wobei man eine Wasserstoffperoxidlösung und ein Färbemittel verwendet, um Banden nachzuweisen, die spezifisch mit Seren von HIV-Trägern reagieren; dadurch wird die Expression des gag-Gens, des env- Gens und des gag-env-Fusionsgens von HIV in den oben genannten Klonen bestätigt.

(5) Bestimmung eines Teilbereichs eines Env-Peptids, der Epitope enthält, die reaktiv gegenüber HIV-Antikörpern sind:

Die Bestimmung kann zum Beispiel unter Verwendung der Reaktivität des oben unter Punkt (3) beschriebenen LacZ-Env-Fusionsproteins nach dem oben unter Punkt (4) beschriebenen Western-Blotting-Verfahren erreicht werden. Mit diesem Verfahren wurde gefunden, dass von dem Env-Protein der gesamten Aminosäuresequenz, die in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigt ist, Teilbereiche, die reaktiv gegenüber HIV-Antikörpern sind, solche umfassen, die die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:
Env(14-244), Env(14-437),
Env(14-611), Env(175-363),
Env(224-510), Env(244-611),
Env(244-434), Env(244-437),
Env(244-772), Env(244-826),
Env(437-510), Env(437-611),
Env(437-722), Env(437-826),
Env(512-611), Env(512-699),
Env(610-722), Env(510-826) und
Env(721-826).
Von den oben genannten Aminosäuresequenzen wurden die folgenden Aminosäuresequenzen, die eine besonders starke Reaktivität gegenüber HIV- Antikörpern aufweisen, als Sequenzen identifiziert, die Epitope des Env-Proteins enthalten:
Env(14-244), Env(244-434),
Env(244-510), Env(512-611),
Env(512-699), Env(610-722) und
Env(721-826).
Wie oben erwähnt, wird in der vorliegenden Erfindung von den Epitopenbereichen dieser 7 Aminosäuresequenzen die durch Env(512-611) dargestellte Aminosäuresequenz unter dem Gesichtspunkt eingesetzt, dass man eine ausgezeichnete Antigenität und Produktivität eines Gag-Env-Fusionsproteins als HIV- Antigen der vorliegenden Erfindung erreicht.

(6) Bestimmung eines Gag-Peptids, das für den Aufbau eines Gag-Env-Fusionsproteins bevorzugt ist:

In einem Gag-Env-Fusionsprotein wird ein Gag-Peptid anstelle von LacZ als Träger verwendet, der eine Erzeugung eines Env-Peptids in hoher Ausbeute bewirkt. Daher ist bei einem Gag-Peptid die Produktivität wichtiger als die Antigenität. Daher wird nach dem Aufbau eines Expressionsvektors für ein gag- Gen gemäß zum Beispiel dem oben unter Punkt (2) beschriebenen Verfahren die Produktivität eines Gag-Peptids in derselben Weise wie oben unter Punkt (4) durch SDS-PAGE bestimmt.
Es hat sich gezeigt, dass Gag-Peptide, die erfolgreich zur Erzeugung eines Gag- Env-Fusionsproteins in hoher Ausbeute verwendet werden können, durch die folgenden Aminosäuresequenzen dargestellt werden:
Gag(1-119), Gag(1-132), Gag(1-154),
Gag(1-210), Gag(1-309), Gag(1-405),
Gag(1-406), Gag(1-437), Gag(1-500),
Gag(121-405), Gag(121-406),
Gag(121-437), Gag(308-405),
Gag(308-406), Gag(308-435),
Gag(308-436), Gag(308-437) und
Gag(308-500).
Von diesen ist Gag(308-437) eine der Aminosäuresequenzen, die in E.-coli- Zellen am stärksten angereichert werden, und somit ist sie geeignet, um die hohe Ausbeute eines Gag-Env-Fusionsproteins in der vorliegenden Erfindung zu gewährleisten. Als Gag-Peptid des Gag-Env-Fusionsproteins wird am meisten bevorzugt ein Peptid eingesetzt, das eine durch Gag(308-406) oder Gag(121-406)- dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

(7) Herstellung eines Gag-Env-Fusionsproteins:

Ein bevorzugtes Gag-Env-Fusionsprotein besteht aus einem Gag-Peptid, das oben unter Punkt (6) ausgewählt wurde, und einem Env-Peptid, das oben unter Punkt (5) ausgewählt wurde. Ein Plasmid, das ein solches Fusionsprotein exprimiert, kann zum Beispiel aufgebaut werden, indem man ein Gen, das für ein oben unter Punkt (5) beschriebenes Env-Peptid codiert, in ein Plasmid einsetzt, das ein Gag-Peptid allein exprimiert, wobei das Gag-Peptid oben unter Punkt (6) beschrieben ist, oder in ein gag-Gen-haltiges Plasmid einsetzt, das nach dem oben unter den Punkten (1) und (2) beschriebenen Verfahren zum Beispiel aus einem gag-pol-Fusionsgen hergestellt wurde. Die Fusion eines gag- Gens und eines env-Gens erfolgt so, dass das Leseraster des eingesetzten env- Gens mit dem des gag-Gens auf dem Expressionsplasmid übereinstimmt. Dies kann mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Enzymen, wie Restriktionsenzymen, Nuclease Bal31 und Mungbohnen-Nuclease, erreicht werden. Bei dieser Operation können ein Gag-Peptid und ein Env-Peptid über eine Verknüpfung, die aus mehreren Aminosäureresten besteht, miteinander fusioniert werden. Es ist in der Technik wohlbekannt, dass als Ergebnis der obigen Operation im allgemeinen eine solche Verknüpfung in Fusionsproteine eingebaut wird. Dadurch wird die Antigenität des Gag-Env-Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigt. Dementsprechend sollten der Ausdruck "Gag-Env- Fusionsprotein, das aus einem Gag-Peptid und einem Env-Peptid besteht" und ähnliche Ausdrücke so verstanden werden, dass sie auch ein Gag-Env-Fusionsprotein mitumfassen, das aus einem Gag-Peptid, einem Env-Peptid und einer gegebenenfalls dazwischen vorhandenen Verknüpfung besteht. Die Bestätigung der Expression in großer Menge kann genauso erfolgen, wie es oben unter Punkt (4) beschrieben ist.

(8) Herstellung eines Gag-Proteins oder eines Gag-Env-Fusionsproteins durch Kultivieren einer Transformanten, die in Bezug auf die Expression des gag-Gens oder eines gag-env-Fusionsgens bestätigt wurde:

Zum Beispiel können die folgenden Schritte unternommen werden. Zur Herstellung einer Transformanten-Startkultur, die für die Erzeugung eines Proteins in großer Menge kultiviert werden soll, wird die Transformante, wenn es sich zum Beispiel um EL coli handelt, 12 bis 35 Stunden lang bei 30 bis 40ºC in LB- Medium kultiviert, bis die Zelldichte von E. coli 2 · 10&sup9; bis 8 · 10&sup9; Zellen/ml erreicht. Anschließend werden 1 bis 10 Liter der Startkultur in 1000 Liter frisches LB-Medium eingeimpft, und dann erfolgt eine zweistufige Kultur, die aus Vorkultur und Nachkultur besteht. Der Zweck der Vorkultur besteht darin, Startkulturzellen zu vermehren und den Expressionsvektor zu replizieren, und die Vorkultur wird 1 bis 24 Stunden lang bei 10 bis 40ºC, vorzugsweise 2 bis 12 Stunden lang bei 15 bis 37ºC, durchgeführt. Im Falle von E, coli wird die Vorkultur zum Beispiel abgebrochen, wenn die Zelldichte von 5 coli eine OD&sub6;&sub0;&sub0; nm von 0,1 bis 2,0 erreicht hat. Nach dem Abbruch der Vorkultur wird die resultierende Kultur einer Nachkultur unterzogen. Die Nachkultur ist unter streng kontrollierten Bedingungen durchzuführen, bei denen die Transcription und Translation eines in einen Expressionsvektor einklonierten Gens gewährleistet sind und gleichzeitig eine zufällige Zersetzung und Inaktivierung von durch Translation erzeugten Genprodukten durch in Wirtszellen vorhandene proteolytische Enzyme vermieden werden kann. Die Nachkultur wird vorzugsweise bei einer niedrigeren Temperatur durchgeführt als die Vorkultur. Die Nachkultur kann 1 bis 40 Stunden lang bei 10 bis 40ºC, vorzugsweise 3 bis 35 Stunden lang bei 15 bis 37ºC, durchgeführt werden. Unter Berücksichtigung der Eigenschaften des verwendeten Expressionsvektors können zu Beginn der Nachkultur weiterhin zur Förderung und Induktion der Expression eine Unterversorgung mit Phosphat im Kulturmedium, die Zugabe eines Induktors [wie IPTG (Isopropyl-β- D-thiogalactopyranosid)] zur Kultur und dergleichen durchgeführt werden. Bei der Durchführung der obigen zweistufigen Kultur werden das Gag-Protein oder das Gag-Env-Fusionsprotein im allgemeinen in einer Ausbeute von etwa 1 bis 50 mg pro Liter Kultur erzeugt. Von den verschiedenen Kombinationen von Gag- Peptiden und Env-Peptiden, wie sie bereits erwähnt wurden, sind die Fusionsproteine, die in hoher Ausbeute erzeugt werden können und eine besonders hohe Antigenität aufweisen, Gag-Env-Fusionsproteine mit Aminosäuresequenzen, die dargestellt werden durch:
Gag(308-406)-Env(512-611) bzw.
Gag (121-406)-Env(512-611)

(9) Reinigung des Gag-Proteins und des Gag-Env-Fusionsproteins, die in hoher Ausbeute erzeugt wurden:

Dies kann erreicht werden, indem man herkömmliche Verfahren in Kombination verwendet. Zum Beispiel kann die Reinigung von Proteinen mit einer geeigneten Kombination der folgenden Verfahren erfolgen: (a) Gewinnung transformierter Zellen durch Verwendung eines Fällungsmittels, Zentrifugation, Filtration usw.; (b) Herstellung eines Rohextrakts durch Aufschluss transformierter Zellen durch Verwendung von Ultraschallbehandlung, Druck/Vakuum-Behandlung, eines Homogenisators usw.; (c) Reinigung durch Adsorption und Desorption mit Kieselsäure oder einer Aktivkohle, Aussalzen, Fällung aus einem organischen Lösungsmittel usw. sowie hoher Reinigungsgrad durch Fraktionierung unter Verwendung von Ultrazentrifugation, Säulenchromatographie, Elektrophorese usw.; und (d) Reinigung durch Adsorption und Desorption mit Kieselsäure oder Aktivkohle und Fraktionierung durch Dichtegradientenzentrifugation (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 63-297).
Dementsprechend wird in noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen HIV-Gag-Env- Fusionsproteins bereitgestellt, das aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus einer Env-Sequenz verschmolzen ist, wobei das Fusionsprotein eine Sequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:
Gag(308-406) und Env(512-611); und
Gag(121-406) und Env(S12-611);
wobei sich die Zahlen für Gag auf Aminosäurereste in der in den Figaren 1-(1) bis 1-(2) gezeigten Aminosäuresequenz des Gag-Proteins beziehen und sich die Zahlen für Env auf Aminosäurereste in der in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigten Aminosäuresequenz des Env-Proteins beziehen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Ligasieren einer Desoxyribonucleinsäure, die das Fusionsprotein codiert, mit einem replizierbaren Expressionsvektor, so dass man eine replizierbare rekombinante DNA enthält, die den replizierbaren Expressionsvektor sowie operabel darin eingefügt die genannte Desoxyribonucleinsäure umfasst;
(b) Transformieren von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen mit der replizierbaren rekombinanten DNA unter Bildung von Transformanten;
(c) Selektieren der Transformanten gegenüber nicht transformierten prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen;
(d) Kultivieren der Transformanten unter Bildung eines HIV-Gag-Env-Fusionsproteins; und
(e) Isolieren des HIV-Gag-Env-Fusionsproteins aus den kultivierten Transformanten.
Vorzugsweise ist der Expressionsvektor von Vektoren der pT7-Reihe oder der pUR290-Reihe abgeleitet. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Expressionsvektor um pT7-7.
Der bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Expressionsvektor kann in einer Form bereitgestellt werden, in der er in einem verschlossenen kleinen Gefäß, wie in einer Ampulle oder einem Gläschen, enthalten ist, oder in einer Form, in der er in eine Wirtszelle eingebaut ist.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekornbinantes DNA-Molekül bereitgestellt, das zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und das einen replizierbaren Expressionsvektor umfasst, in den eine Desoxyribonucleinsäuresequenz eingesetzt ist, die ein HIV-Gag-Env-Fusionsprotein codiert, das aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus der Env-Sequenz verschmolzen ist, wobei das Fusionsprotein eine Sequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:
Gag(308-406) und Env(512-611); und
Gag(121-406) und Env(512-611);
wobei sich die Zahlen für Gag auf Aminosäurereste in der in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigten Aminosäuresequenz des Gag-Proteins beziehen und sich die Zahlen für Env auf Aminosäurereste in der in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigten Aminosäuresequenz des Env-Proteins beziehen.
Vorzugsweise wird der Expressionsvektor aus solchen ausgewählt, die von Vektoren der pT7-Reihe oder der pUR290-Reihe abgeleitet sind. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem Expressionsvektor um pT7-7.
Das Gag-Protein und das Gag-Env-Fusionsprotein, die unter Verwendung des rekombinanten DNA-Moleküls der vorliegenden Erfindung in großer Menge hergestellt wurden, können einzeln oder in Kombination in Form einer Flüssigkeit oder eines getrockneten Pulvers oder in einer auf einem Filter oder einer Membran adsorbierten Form in ein kleines Gefäß, wie eine Ampulle oder ein Gläschen, gefüllt und verschlossen werden. Wenn das Antigen der vorliegenden Erfindung in flüssiger Form vorliegt, kann ein vorbestimmtes Volumen entnommen und verwendet werden. Wenn das Antigen in getrockneter Form vorliegt, wird das Antigen zur Rekonstitution in destilliertem Wasser gelöst, so dass das Volumen wieder dem ursprünglichen Volumen vor der Trocknung entspricht, und dann kann ein vorbestimmtes Volumen entnommen und verwendet werden. Wenn das Antigen in einer auf einem Filter oder einer Membran adsorbierten Form vorliegt, wird das Antigen mit einer geeigneten Lösung hydratisiert und verwendet.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Reagens für die Diagnose von AIDS (acquired immune deficiency syndrome) durch eine immunologische Reaktion bereitgestellt, das eine Menge des ein Gag-Env- Fusionsprotein und/oder ein Gag-Protein enthaltenden HIV-Antigens der vorliegenden Erfindung umfasst, welche eine immunologische Reaktion bewirkt.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff gegen AIDS (acquired immune deficiency syndrome) bereitgestellt, der eine effektive immunogene Menge des ein Gag-Env-Fusionsprotein und/oder ein Gag- Protein enthaltenden HIV-Antigens der vorliegenden Erfindung und wenigstens ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans, Verdünnungsmittel oder Vehikel umfasst.
Die Dosis des Impfstoffs für Erwachsene für eine einzige Verabreichung kann im allgemeinen etwa 0,001 bis 1000 ug betragen.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken sollen.

Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung

Beispiel 1

Schritt 1 (Aufbau von Plasmiden, die LacZ-Env-Fusionsproteine exprimieren können)

Der HIV-1-Provirus-DNA-Klon pNL4-3 (siehe Journal of Virology, 59, 284-291, 1986; GenBank-Datei HIVNL43; welcher Klon pNL4-3 beim National Institute of Health, USA, erhältlich ist) wird mit EcoRI und XhoI abgebaut und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, wobei man ein DNA-Fragment von 3,1 kb erhält [Nucleotidnummer 5743-8887 gemäß der GenBank-Datei HIVNL43]. Das erhaltene DNA-Fragment wird in das Plasmid pHSG398 einkloniert, das mit EcoRI und SalI abgebaut und mit BAP behandelt wurde, so dass man das Plasmid pNS210 erhält. Das erhaltene Plasmid pNS210 wird mit KpnI abgebaut und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, wobei man ein DNA-Fragment von 2,55 kb erhält. Das gewonnene DNA-Fragment wird mit HaeIII abgebaut und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, wobei man ein HaeIII-DNA-Fragment von etwa 570b erhält [Nucleotidnummer 7834- 8400 gemäß der GenBank-Datei HIVNL43]. Das erhaltene DNA-Fragment wird in das Plasmid pUC9 einkloniert, das mit HincII abgebaut und mit BAP behandelt wurde, so dass man das Plasmid pEH22 erhält, Das erhaltene Plasmid pEH22 wird mit BamHI und PstI abgebaut, wobei man ein DNA-Fragment von etwa 580b erhält, und das erhaltene DNA-Fragment wird in das Plasmid pUR292 (siehe EMBO Journal, 2, 1791-1794, 1983) einkloniert, das mit BamHI und PstI gespalten wurde, so dass man das Plasmid pAS182 erhält (siehe Tabelle 1). Das erhaltene Plasmid pAS182 wird mit Hindill abgebaut und dann selbstligasiert, so dass man das Plasmid pAS192 erhält (siehe Tabelle 1). Die erhaltenen Plasmide pAS182 und pAS192 exprimieren die Fusionsproteine LacZ-Env (512-699) bzw. LacZ-Env (512-611). Außer den obigen Plasmiden werden noch 15 weitere Typen von Plasmiden aufgebaut, die verschiedene Typen von LacZ-Env-Fusionsproteinen exprimieren (siehe Tabelle 1).

Schritt 2 (Erzeugung von LacZ-Env-Fusionsproteinen in großer Menge)

17 Typen von Expressionsvektoren, die in Tabelle 1 gezeigt sind, einschließlich der Plasmide pAS182 und pAS192 werden einzeln in den E.-coli-Stamm JM 103 eingeschleust (siehe Nucleic Acids Research, 9, 309-321, 1981). Die resultierenden E.-coli-Transformanten werden einzeln in 2 ml LB-Medium, das 20 ug/ml Ampicillin enthält, eingeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37ºC inkubiert, so dass man Kulturen erhält. Dann werden jeweils 0,05 bis 0,1 ml der Kulturen in 5 ml LB-Medium, das 20 ug/ml Ampicillin enthält, eingeimpft und dann unter Schütteln bei 37ºC inkubiert. Wenn die Zelldichte eine OD&sub6;&sub0;&sub0; nm von 0,5 erreicht, wird IPT6 bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Kultur gegeben, um dadurch die Expression von Fusionsproteinen zu induzieren. Die Kultur wird 5 Stunden unter Schütteln bei 37ºC inkubiert, und dann werden die E.-coli-Zellen durch Zentrifugation von 1,5 ml der Kultur geerntet. Die geernteten Zellen werden in 120 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert, so dass man eine Suspension erhält. Zu der erhaltenen Suspension werden 60 ul SDS-PAGE- Probenpuffer gegeben, und es wird gut gemischt. Das Gemisch wird 3 Minuten lang auf 100ºC erhitzt und 5 Minuten lang mit 12 000 U/min zentrifugiert, so dass man einen Überstand erhält. 7,5 ul des erhaltenen Überstands werden auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen, um dadurch eine Fraktionierung zu erreichen. Das Gel wird mit CBB angefärbt, um die Erzeugung von Fusionsproteinen zu bestätigen. So wird die Herstellung von 17 Typen von LacZ-Env-Fusionsproteinen in großer Menge bestätigt.

Schritt 3 (Identifizierung von Epitopbereichen, die in Seren von HIV-Trägern von Env-Antikörpern erkannt werden)

Die gesamten Proteine des E.-coli-Stammes JM103, der bei der Herstellung von 17 Typen von LacZ-Env-Fusionsproteinen (siehe Tabelle 1) und des LacZ- Proteins verwendet wurde, werden im wesentlichen in derselben Weise wie in Schritt 2 durch SDS-PAGE fraktioniert und durch Electroblotting auf eine Polyvinylidendiffuoridmembran übertragen. Die Blots werden mit Magermilch (erhältlich von Difco Laboratories, USA) blockiert und einzeln mit den Seren A, B und C, die von drei HIV-Trägern (asymptomatischen HIV-Trägern) entnommen wurden, jeweils getrennt umgesetzt und mit einem Puffer, der 20 mM Tris · HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 0,05% Tween 20 enthielt, auf das 100fache verdünnt. Bevor die Seren verwendet wurden, wurde bestätigt, dass keines der Seren mit LacZ reagiert. Als sekundärer Antikörper wird ein Peroxidase-konjugiertes Ziegen- Anti-Human-IgG (Bio-Rad Laboratories, USA) verwendet. Durch Analysieren der Ergebnisse (siehe Tabelle 2) des Western-Blotting werden zwei, drei bzw. fünf Epitopbereiche, die von in den Seren A, B und C enthaltenen Env-Antikörpern erkannt werden, identifiziert (siehe Tabelle 3). Die Fusionsproteine, die mit allen Seren A, B und C reagieren, sind LacZ-Env-Fusionsproteine, die eine Aminosäuresequenz von Env(512-611) und/oder eine Aminosäuresequenz von Env(721- 826) enthalten.

Schritt 4 (Bewertung der Fusionsproteine LacZ-Env(512-611) und LacZ-Env (721-826) als Antigene für die Diagnose)

Zur Bestätigung der Eignung der Fusionsproteine LacZ-Env(512-611) und LacZ- Env (721-826) als Antigene für die Diagnose wird im wesentlichen in derselben Weise wie in Schritt 3 ein Western-Blotting durchgeführt, wobei Seren von 41 HIV-Trägern (insbesondere 36 asymptomatischen HIV-Trägern, 1 ARC und 4 AIDS-Patienten) verwendet wurden. Die Ergebnisse des Western-Blotting sind in Tabelle 4 gezeigt, zusammen mit denen von 3 asymptomatischen HIV-Trägern von Schritt 3. LacZ-Env(512-611) reagiert mit allen Seren von 44 HIV-Trägern (100%). Andererseits reagiert LacZ-Env(721-826) nur mit 35 von 44 HIV- Trägern (79%). Daher wird davon ausgegangen, dass Env(512-611) als Antigen für die Diagnose geeignet ist. Der Env(721-826)-Bereich kann nicht unabhängig für die Diagnose verwendet werden, aber er wäre in Kombination mit anderen Antigenen nützlich, zum Beispiel mit dem Env(512-611)-Bereich. Seren von 2 von 39 asymptomatischen HIV-Trägern reagieren jedoch schwach mit LacZ (β- Galactosidase), und daher wäre es nicht wünschenswert, das LacZ-Env- Fusionsprotein so, wie es ist, für diagnostische Zwecke zu verwenden. Das LacZ- Env-Fusionsprotein kann jedoch für diagnostische Zwecke verwendet werden, wenn Testseren so vorbehandelt werden, dass sie gemäß dem üblichen Verfahren, wie bereits erwähnt, in den Seren mit LacZ-Protein Anti-LacZ-Antikörper voradsorbieren.

Schritt 5 (Aufbau von Plasmiden, die Env-Proteine unter der Kontrolle des T7- Promotors exprimieren können)

Die synthetischen Oligonucleotide 5'-TATGGCTAÄG-3' und 5'-AATTCTTAGCCA-3' werden assoziiert und in das Plasmid pT7-7 eingefügt, ein Plasmid der pT7-Reihe (siehe Proceedings of the National Academy of Sciences USA 82, 1074-1078, 1985), das zuvor mit NdeI und EcoRI abgebaut wurde, so dass man das Plasmid pT7-7-1 erhielt. Das Plasmid pT7-7-1 ist das Plasmid, das eine Insertion von einem Nucleotid, und zwar einem Adeninrest (A), zwischen der NdeI-Stelle und der EcoRI-Stelle aufweist, bei denen es sich um Multiklonierungsstelten von pT7- 7 handelt. Das Plasmid pT7-7-1 wird mit BamHI und PstI abgebaut, und das durch Abbau des Plasmids pEH22 (siehe Schritt 1) mit BamHI und PstI erhaltene Fragment von etwa 580b wird einkloniert, so dass man das Plasmid pTE182 erhält (siehe Tabelle 5). Anschließend wird das so erhaltene Plasmid pTE182 mit HindIII abgebaut und dann selbstligasiert, so dass man das Plasmid pTE192 erhält (siehe Tabelle 5). Das Plasmid pNS210 (siehe Schritt 1) wird mit NdeI abgebaut und weiterhin mit BglII partiell abgebaut, so dass man ein NdeI-BglII- Fragment erhält (Nucleotidnummer 6399-7611 gemäß der GenBank-Datei HIVNL43]. Das so erhaltene NdeI-BgIII-Fragment wird in das Plasmid pUR292 (siehe Schritt 1) einkloniert, das zuvor mit NdeI und BamHI abgebaut wurde, so dass man das Plasmid pNB21 erhält. Das erhaltene Plasmid pNB21 wird mit BglII und ClaI abgebaut, wobei man ein Fragment von etwa 0,6 kb erhält. Das erhaltene Fragment wird in das Plasmid pT7-7 einkloniert, das zuvor mit BamHI und ClaI abgebaut wurde, so dass man das Plasmid pTE311 erhält (siehe Tabelle 5). Die erhaltenen Plasmide pTE182, pTE192 und pTE311 exprimieren Env (512- 699), Env(512-611) bzw. Env(244-437). Plasmide, die ein Env-Protein unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimieren können, sind in Tabelle 5 gezeigt. Der E.-coli-Stamm BL21 (DE3) wird als Wirt für die Expression verwendet. Die Kultur von E.-coli-Zellen und die Analyse von Proteinen werden im wesentlichen in derselben Weise durchgeführt, wie es in den Schritten 2 und 3 beschrieben ist. Der Anteil der von den Plasmiden pTE182, pTE192 und pTE311 exprimierten Env-Proteine an den gesamten Zellproteinen beträgt nur etwa 1 bis 2%. Dies zeigt, dass es selbst dann, wenn ein Plasmid gewählt wird, schwierig ist, ein Env-Protein allein in einer in der Praxis annehmbaren Ausbeute zu exprimieren.

Schritt 6 (Aufbau von Plasmiden, die Gag-Proteine unter der Kontrolle des T7- Promotors exprimieren können)

Das Plasmid pTG591 (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-147289) wird mit NdeI und BcII abgebaut, wobei man ein Fragment von etwa 1,6 kb erhält. Dieses Fragment wird in die Plasmide pT7-7 und pTE-3a (siehe Methods in Enzymology, 185, 60-89, 1990) einkloniert, die jeweils zuvor mit NdeI und BamHI abgebaut wurden, so dass man die Plasmide pTG581 bzw. pEG581 (siehe Tabelle 6) erhält. Diese Plasmide exprimieren das gag-Gen (p55).
Die Plasmide pTG210, pTG110 und pTG591 (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-117289) werden einzeln mit ApaI und ClaI abgebaut, mit T4-DNA- Polymerase behandelt und selbstligasiert, so dass man die Plasmide pTG210-2, pTG110-2 bzw. pTG561 erhält (siehe Tabelle 6). Diese Plasmide sind in der Lage, Gag(308-405), Gag(121-405) bzw. Gag(1-405) zu exprimieren. Die Plasmide, die Gag-Proteine unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimieren, sind in Tabelle 6 gezeigt. Der E.-coli-Stamm BL21 (DE3) wird als Wirt für die Expression verwendet. Die Kultur von E.-coli-Zellen und die Analyse der erhaltenen Proteine werden im wesentlichen in derselben Weise durchgeführt, wie es in den Schritten 2 und 3 beschrieben ist.

Schritt 7 (Aufbau von Plasmiden, die Gag-Env-Fusionsproteine unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimieren können)

Das Plasmid pAS192 (siehe Schritt 1) wird mit BamHI abgebaut, mit T4-DNA- Polymerase behandelt und mit ClaI abgebaut und anschließend einer Agarose- Gelelektrophorese unterzogen. Aus dem Agarose-Gel wird ein Fragment von etwa 310b gewonnen. Dieses Fragment wird in das Plasmid pTG210 (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-117289) einkloniert, das zuvor mit ApaI abgebaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit ClaI abgebaut wurde, so dass man das Plasmid pGE33 erhält (siehe Tabelle 7). Das erhaltene Plasmid pGE33 wird mit HindIII abgebaut und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Aus dem Agarose-Gel wird ein Fragment von etwa 600b gewonnen.
Dieses Fragment wird in die Plasmide pTG110 und pTG591 (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-117289) einkloniert, die jeweils zuvor mit HindIII abgebaut und mit BAP behandelt wurden, so dass man die Plasmide pGE1133 bzw. pGE5633 erhält (siehe Tabelle 7). Die erhaltenen Plasrrikte pGE33, pGE1133 und pGE5633 exprimieren die Fusionsproteine Gag(308-406)-Env(512- 611), Gag(121-406)-Env(512-611) bzw. Gag(1-406)-Env(512-611).
Die Nucleotidsequenz zwischen der BamHI-Stelle und der HindIII-Stelle der Multiklonierungsstellen des Plasmids pT7-7-1 (siehe Schritt S) wird durch die des Plasmids pUR292 (siehe Schritt 1) ersetzt, so dass man das Plasmid pT7-29-1 erhält. Das erhaltene pT7-29-1 wird mit BamHI abgebaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und selbstligasiert, so dass man das Plasmid pT7-29-14 erhält. Das oben genannte Plasmid pGE33 wird mit Hindill abgebaut, wobei man ein Fragment von etwa 0,6 kb erhält, und dieses Fragment wird in das Plasmid pT7-29-14 einkloniert, das zuvor mit Hindill abgebaut und mit BAP behandelt wurde, so dass man das Plasmid pGE2133 erhält.
Das Plasmid pAS182 (siehe Schritt 1) wird mit BamHI und ClaI abgebaut, wobei man ein Fragment von etwa 590b erhält. Dieses Fragment wird in die Plasmide pGE2133 und pGE1133 einkloniert, die jeweils zuvor mit BamHI und ClaI abgebaut wurden, so dass man die Plasmide pGE218 bzw. pGE118 erhält (siehe Tabelle 7). Die Plasmide pGE218 und pGE118 exprimieren die Fusionsproteine Gag(308-406)-Env(512-699) bzw. Gag(121-406)-Env(512-699).
Das Plasmid pT7-7 (siehe Schritt S) wird mit BglII abgebaut, mit T4-DNA- Polymerase behandelt und selbstligasiert, so dass man das Plasmid pT7-7 (BglIIx) erhält. Das Plasmid pTG210 (siehe Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4- 117289) wird mit NdeI und ClaI abgebaut, wobei man ein Fragment von etwa 1 kb erhält. Dieses Fragment wird in das Plasmid pT7-7 (BglIIx) einkioniert, das zuvor mit NdeI und ClaI abgebaut wurde, so dass man das Plasmid pTG210X erhält.
Das Plasmid pAS192 (siehe Schritt 1) wird mit BamHI und ClaI abgebaut, wobei man ein Fragment von etwa 310b erhält. Dieses Fragment wird in das Plasmid pTG210X einkloniert, das zuvor mit BglII und ClaI abgebaut wurde, so dass man das Plasmid pGE31 erhält (siehe Tabelle 7). Das Plasmid pGE31 exprimiert das Fusionsprotein Gag(308-437)-Env(512-611).
Plasmide, die Gag-Env-Fusionsproteine unter der Kontrolle des T7-Promotors exprimieren, sind in Tabelle 7 gezeigt. Der E.-co/i-Stamm BL21 (DE3) wird als Wirt für die Expression verwendet. Die Kultur von 5 -coli-Zellen, um die Erzeugung eines Fusionsproteins in großer Menge zu erreichen, und die Analyse des Proteins werden im wesentlichen in derselben Weise wie in den Schritten 2 und 3 durchgeführt.
Die gesamten Zellproteine der 5 -coli-Zellen, die die in Tabelle 7 gezeigten Fusionsproteine erzeugten, werden durch SDS-PAGE fraktioniert, und die Gele werden mit CBB angefärbt. Durch Scannen des Gels mit einem Densitometer werden die Anteile der erzeugten Fusionsproteine an den gesamten Zellproteinen gemessen. Den größten Anteil machen die Fusionsproteine aus, die von den Plasmiden pGE33, pGE218 und pGE31 exprimiert werden, und zwar etwa 20%.

Schritt 8 (Bestätigung der Reaktivität von Gag-Env-Fusionsprotein gegenüber HIV-Antikörpern)

Die in Schritt 7 aufgebauten Plasmide pGE33, pGE31 und pGE218 exprimieren im E.-coli-Stamm BL21 (DE3) große Mengen an Gag-Env-Fusionsproteinen. Von diesen Fusionsproteinen ist das Protein, das in einer besonders großen Menge erzeugt wird, das Fusionsprotein Gag(308-406)-Env(512-611), das von pGE33 exprimiert wird. Um die Eignung dieses Fusionsproteins als Antigen für die Diagnose zu bestätigen, wird die Reaktion zwischen dem Fusionsprotein und den Seren, die jeweils von 41 HIV-Trägern (36 asymptomatischen HIV-Trägern, 1 ARC und 4 AIDS-Patienten) entnommen wurden, mit herkömmlichem Western- Blotting im wesentlichen in derselben Weise untersucht, wie es in den Schritten 2 und 3 beschrieben ist (siehe Tabelle 8). Als Ergebnis findet man, dass in allen 41 Trägern Env-Antikörper nachgewiesen werden können, so dass die Eignung des Fusionsproteins als Antigen für die Diagnose gewährleistet ist.

Schritt 9 (Reinigung des Fusionsproteins Gag(308-406)-Env(512-611)

250 ml einer Kultur des E.-coli-Stammes BL21 (DE3), der das Fusionsprotein Gag(308-406)-Env(512-611) in großer Menge erzeugt hat, wird 10 Minuten lang einer Zentrifugation mit 5000 U/min unterzogen, um dadurch die E.-coli-Zellen zu ernten. Die geernteten Zellen werden in 10 ml eines Puffers suspendiert, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthält, und die resultierende Suspension wird einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um dadurch die Zellen aufzuschließen. Wenn das resultierende Lysat 30 Minuten lang mit 19 000 U/min zentrifugiert wird, ist das Gag-Env-Fusionsprotein im Sediment enthalten. Der Überstand wird verworfen, und das Sediment wird in 10 ml eines Puffers suspendiert, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mM 2- Mercaptoethanol enthält. Zu der erhaltenen Suspension werden 5 ml SDS-PAGE- Probenpuffer (für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) gegeben, gut gemischt und 5 Minuten lang auf 100ºC erhitzt. Das erhitzte Gemisch wird 5 Minuten lang mit 12 000 U/min zentrifugiert, und 2 ml (pro Charge) des resultierenden Überstands werden auf ein SDS-PAGE-Gel einer Model 491 PrepCell (erhältlich von Bio-Rad Laboratories, USA) aufgetragen, um eine Elektrophorese mit 40 mA durchzuführen. Eine Chromatographie erfolgt mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min und in einer Fraktionsgröße von 2,5 ml/Fraktion, um dadurch eine Peakfraktion aufzufangen, die das Gag-Env- Fusionsprotein enthält.
Die Peakfraktion wird auf etwa das 20fache konzentriert, und das resultierende Konzentrat wird einer SDS-PAGE unterzogen, und anschließend wird mit CBB angefärbt.
Als Ergebnis findet man, dass das Fusionsprotein hochgereinigt ist und keine anderen Proteinbanden beobachtet werden.
Aus einem Liter E.-coli-Kultur werden etwa 5 mg gereinigtes Gag(308-406)- Env(512-611)-Fusionsprotein erhalten.

Schritt 10 (Eignung des gereinigten Gag-Env-Fusionsproteins als Antigen für die Diagnose)

Das in Schritt 9 erhaltene Präparat des gereinigten Gag(308-406)-Env(512- 611)-Fusionsproteins wird verdünnt, und die Verdünnung wird auf eine Polyvinylidendifluoridmembran getüpfelt, so dass man Dots des Fusionsproteins in Mengen von 10, 20, 40, 80, 160 und 320 ng erhält. Die Dots werden einzeln mit Magermilch blockiert und mit Seren von jeweils 55 HIV-Trägern (insbesondere 50 asymptomatischen HIV-Trägern, 1 ARC und 4 AIDS-Patienten) und von 84 nichtinfizierten Individuen (gesunden Individuen) umgesetzt, wobei die Seren mit einem Puffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 0,05% Tween 20 enthält, auf das 100fache verdünnt wurden. Peroxidase-konjugiertes Ziegen- Anti-Human-IgG (erhältlich von Bio-Rad Laboratories, USA) wird als sekundärer Antikörper verwendet, und die Farbreaktion wird nach dem üblichen Verfahren durchgeführt. Ergebnisse des obigen Dot-Blottings sind in Tabelle 9 gezeigt.
Eine Menge von bereits 20 ng des Fusionsproteins reagiert spezifisch mit allen Seren von 55 HIV-Trägern, und selbst eine Menge von 5 ng des Fusionsproteins reagiert spezifisch mit allen Seren von den HIV-Trägern mit Ausnahme von 2 asymptomatischen HIV-Trägern. Zwischen immerhin 320 ng des Fusionsproteins und den Seren von 84 gesunden Individuen wird weder eine spezifische Reaktion noch eine unspezifische Reaktion beobachtet. Anhand dieser Ergebnisse wird geschlossen, dass das gereinigte Fusionsprotein eine äußerst hohe Spezifität und ein breites Spektrum der Seroreaktivität aufweist, wodurch die Eignung des Proteins als Antigen für die Diagnose gewährleistet ist.

Beispiel 2

Schritt 1 (Herstellung von hochgereinigtem Gag-Protein p55)

Eine Kultur der E.-co/i-Transformanten BL21(DE3)/pTG581, die eine große Menge des Gag-Proteins p55 erzeugt hat, wird 10 Minuten lang mit 5000 U/min zentrifugiert, um dadurch die Zellen zu ernten. Die geernteten Zellen werden in einem Phosphatpuffer suspendiert, der 20 mM Natriumphosphat (pH 6,9) und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthält und dessen Volumen 1/50 des Volumens der oben genannten Kultur beträgt, und die resultierende Suspension wird einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um dadurch die Zellen aufzuschließen. Das resultierende Lysat wird 60 Minuten lang mit 19 000 U/min zentrifugiert, wobei man einen Überstand erhält, der p55 enthält. Der Überstand wird mit einer zu 20% gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat behandelt, so dass man einen Niederschlag erhält. Der erhaltene Niederschlag wird in einem Phosphatpuffer gelöst, wie er oben definiert wurde, der jedoch 8 M Harnstoff enthält. Die resultierende Lösung wird durch eine Säule mit S-Sepharose (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) gegeben, die mit demselben Puffer, wie er oben erwähnt ist, äquilibriert wurde. Die Elution erfolgt mit dem Puffer, der mit Natriumchlorid in einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M versetzt wurde, wobei man p55-Fraktionen erhält. Die erhaltenen p55- Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden gegen einen Phosphatpuffer dialysiert, wie er oben definiert ist, der jedoch 300 mM Natriumchlorid enthält, und anschließend wird 20 Minuten lang mit 19 000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird durch eine Säule mit Heparin- Sepharose CL-6B (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) gegeben, die mit dem oben definierten Phosphatpuffer äquilibriert wurde. Die Elution erfolgt mit dem Puffer, der mit Natriumchlorid in einem Konzentrationsgradienten von 0 bis 1 M versetzt wurde, wobei man p55- Fraktionen erhält. Die erhaltenen p55-Fraktionen werden vereinigt und dann konzentriert. Zu dem resultierenden Konzentrat gibt man einen Probenpuffer für SDS-PAGE, und es wird gut gemischt. Das Gemisch wird auf ein SDS-PAGE-Gel in einer PrepCell aufgetragen. Die Chromatographie erfolgt unter denselben Bedingungen, wie sie in Schritt 9 von Beispiel 1 beschrieben sind. Die resultierende p55-Fraktion wird auf etwa die 20fache Konzentration konzentriert, und das resultierende Konzentrat wird einer SDS-PAGE unterzogen, und anschließend wird mit CBB angefärbt. Man findet, dass p55 hochgereinigt ist und keine anderen Proteinbanden beobachtet werden.

Schritt 2 (Reaktivität der Gag-Proteine p17, p24 und p15 und des gesamten Gag-Proteins, p55, gegenüber Seren von HIV-Trägern, wobei die Gag-Proteine von 5 co/i in großen Mengen erzeugt und hochgereinigt wurden)

Die hochgereinigten HIV-1-Gag-Proteine p17, p24, p15 (siehe WO 91/18990) und p55 (siehe Schritt 1 von Beispiel 2) werden im wesentlichen in derselben Weise, wie es in Schritt 10 von Beispiel 1 beschrieben ist, einzeln auf eine Polyvinylidendifluoridmembran getüpfelt, und getrennt mit Seren von 40 HIV- Trägern (insbesondere 35 asymptomatischen HIV-Trägern, 1 ARC und 4 AIDS- Patienten) und von 10 nichtinfizierten Individuen (gesunden Individuen) umgesetzt. Eine Serumreaktion und eine Farbreaktion werden im wesentlichen in derselben Weise durchgeführt, wie es in Schritt 10 von Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 10 gezeigt. Die Gag- Proteine p17, p24 und p15 weisen spezifische Antikörper in 92,5% (37/40), 87,5% (35/40) bzw. 85% (34/40) der Träger nach. Das Gag-Protein p55 reagiert spezifisch mit allen Seren von 40 HIV-Trägern, und die Reaktionen sind stärker als diejenigen von p17, p24 und p15. Es wird insbesondere darauf hingewiesen, dass p55 mit dem Serum von einem asymptomatischen HIV-Träger reagiert, das mit keinem der Gag-Proteine p17, p24 und p15 reagiert. Das Gag- Protein, das die schwächste Reaktivität zeigt, ist p15.
Bei den Gag-Proteinen p17, p24 und p55 ist die Reaktivität gegenüber Seren von ARC- und AIDS-Patienten schwächer als gegenüber Seren von asymptomatischen HIV-Trägern. Dieses Phänomen wird bei p15 nicht beobachtet. Bei allen 10 gesunden Individuen erfolgt keine Reaktion.
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, dass das Gag-Protein p55 als Gag- Antigen für ein Screening nach HIV-Infektion am besten geeignet ist. Tabelle 1. Plasmide für die Expression von LacZ-Env-Fusionsproteine
* Nucleotidsequenz und Nucleotidnummer sind im Einklang mit der GenBank- Datei HIVNL43.
** Die Zahlen in Klammern zeigen Aminosäurenummern, gezählt ab dem N- Terminus des Env-Proteins (gp160). Tabelle 2. Anhand von Western-Blotting gezeigte Reaktivität von LacZ-Env- Fusionsproteinen gegenüber Seren von drei asymptomatischen HIV-1-Trägern Tabelle 3. Identifizierte Epitopbereiche auf dem Env-Protein Tabelle 4. Nachweis von Env-Antikörpern in Seren von HIV-1-Trägern Tabelle 5. Plasmide für die Expression von Env-Proteinen von HIV-1
* Nucleotidsequenz und Nucleotidnummer sind im Einklang mit der GenBank- Datei HIVNL43.
** Die Zahlen in Klammern zeigen Aminosäurenummern, gezählt ab dem N- Terminus des Env-Proteins (gp160).
Selbst wenn ein geeignetes Plasmid gewählt wird, findet man, dass die Expression des Env-Proteins allein in einer in der Praxis annehmbaren Ausbeute schwierig ist. Tabelle 6. Plasmide für die Expression von Gag-Proteinen von HIV-1
* Nucleotidsequenz und Nucleotidnummer sind im Einklang mit der GenBank- Datei HIVNL43.
** Die NdeI-Stelle wird durch in-vitro-Mutagenese am Startcodon des gag-Gens eingeführt.
*** Die Zahlen in Klammern zeigen Aminosäurenummern, gezählt ab dem N- Terminus des Gag-Proteins (p55).
**** Das Stopcodon wird am ersten Codon von p24 eingeführt, was zur Expression von p17 führt. Tabelle 7. Plasmide für die Expression von Gag-Env-Fusionsproteinen Tabelle 8. Western-Blotting eines Gag-Env-Fusionsproteins mit Seren von HIV-1- Trägern Tabelle 9. Reaktivität des gereinigten Gag-Env-Fusionsprotein gegenüber Seren von HIV-1-Trägern und nichtinfizierten Personen
-: Mit 320 ng eines gereinigten Fusionsproteins findet keine Reaktion statt.
+, ++, +++: Mit wenigstens 20 ng, wenigstens 10 ng bzw. wenigstens 5 ng des gereinigten Fusionsproteins findet eine Reaktion statt. Tabelle 10. Reaktivität der Gag-Proteine gegenüber Serumantikörpern von HIV- 1-Trägern (A) Nachweis von Anti-p55-Antikörpern in den Seren von HIV-1-Trägern (B) Nachweis von Anti-p17-Antikörpern in den Seren von HIV-1-Trägern (C) Nachweis von Anti-p24-Antikörpern in den Seren von HIV-1-Trägern (D) Nachweis von Anti-p15-Antikörpern in den Seren von HIV-1-Trägern

Claims

1. Im wesentlichen reines HIV-Antigen, das ein HIV-Gag-Env-Fusionsprotein enthält, das aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus einer Env-Sequenz verschmolzen ist, wobei das Fusionsprotein eine Sequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:

Gag(308-406) und Env(512-611); und

Gag(121-406) und Env(512-611);

wobei sich die Zahlen für Gag auf Aminosäurereste in der in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigten Aminosäuresequenz des Gag-Proteins beziehen und sich die Zahlen für Env auf Aminosäurereste in der in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigten Aminosäuresequenz des Env-Proteins beziehen.

2. HIV-Antigen, das das HIV-Antigen gemäß Anspruch 1 sowie ein HIV-Gag- Protein enthält, das aus der durch Gag(1-500) dargestellten Aminosäuresequenz besteht, bei der es sich um die gesamte in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigte Aminosäuresequenz des Gag-Proteins handelt.

3. Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen reinen HIV-Gag-Env- Fusionsproteins, das aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus einer Env-Sequenz verschmolzen ist, wobei das Fusionsprotein eine Sequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:

Gag(308-406) und Env(512-611); und

Gag(121-406) und Env(512-611);

wobei sich die Zahlen für Gag auf Aminosäurereste in der in den Fig. 1-(1) bis 1-(2) gezeigten Aminosäuresequenz des Gag-Proteins beziehen und sich die Zahlen für Env auf Aminosäurereste in der in den Fig. 2-(1) bis 2-(3) gezeigten Aminosäuresequenz des Env-Proteins beziehen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Ligasieren einer Desoxyribonucleinsäure, die das Fusionsprotein codiert, mit einem replizierbaren Expressionsvektor, so dass man eine replizierbare rekombinante DNA enthält, die den replizierbaren Expressionsvektor sowie operabel darin eingefügt die genannte Desoxyribonucleinsäure umfasst;

(b) Transformieren von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen mit der replizierbaren rekombinanten DNA unter Bildung von Transformanten;

(c) Selektieren der Transformanten gegenüber nicht transformierten prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen;

(d) Kultivieren der Transformanten unter Bildung eines HIV-Gag-Env- Fusionsproteins; und

(e) Isolieren des HIV-Gag-Env-Fusionsproteins aus den kultivierten Transformanten.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Expressionsvektor von den Vektoren der pT7-Reihe oder der pUR290-Reihe abgeleitet ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Expressionsvektor, der von den Vektoren der pT7-Reihe abgeleitet ist, um pT7-7 handelt.

6. Rekombinantes DNA-Molekül, das zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist und das einen replizierbaren Expressionsvektor umfasst, in den eine Desoxyribonucleinsäuresequenz eingesetzt ist, die ein HIV-Gag- Env-Fusionsprotein codiert, das aus einer Gag-Sequenz besteht, die an ihrem C-Terminus mit dem N-Terminus der Env-Sequenz verschmolzen ist, wobei das Fusionsprotein eine Sequenz hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:

Gag(308-406) und Env(512-611); und

Gag(121-406) und Env(512-611);

7. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 6, wobei der Expressionsvektor von den Vektoren der pT7-Reihe oder der pUR290-Reihe abgeleitet ist.

8. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem Expressionsvektor, der von den Vektoren der pT7-Reihe abgeleitet ist, um pT7-7 handelt.

9. Reagens für die Diagnose von AIDS (acquired immune deficiency syndrome) durch eine immunologische Reaktion, das eine Menge des HIV- Antigens gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst, welche eine immunologische Reaktion bewirkt.

10. Impfstoff gegen AIDS (acquired immune deficiency syndrome), der eine effektive immunogene Menge des HIV-Antigens gemäß Anspruch 1 oder 2 und wenigstens ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans, Verdünnungsmittel oder Vehikel umfasst.